ES2250119T3 - Procedimientos y medios para la perfusion extracorporal de organos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de perfusión extracorporal de un órgano de mamífero, siendo el órgano distinto de un corazón al que se le deja latir, cuyo procedimiento incluye bombear flujo de entrada de sangre arterial al órgano para mantener la presión fisiológica y flujo variable en la arteria del órgano y bombear flujo de salida venoso desde el órgano para mantener la presión fisiológica en la vena de salida del órgano, mientras se permite que el órgano autorregule el flujo sanguíneo a través de sí mismo para conseguir un flujo arterial fisiológico.

Description

Procedimientos y medios para la perfusión extracorporal de órganos.

La presente invención se refiere a la perfusión de órganos, en particular a la perfusión extracorporal de órganos, ya sean humanos o no humanos, por ejemplo porcinos, y ya sean no transgénicos o transgénicos. Se dispone un aparato y procedimientos de funcionamiento de dicho aparato para la perfusión para dar soporte a la viabilidad y función de un órgano tal como el hígado, generalmente fuera del cuerpo. Esto permite la conservación o la resurrección del órgano antes de un trasplante, por ejemplo mientras se prepara el destinatario de un trasplante, el mantenimiento de órganos para su uso en un estudio experimental de la fisiología hígado aislado, y el tratamiento de pacientes que padecen una disfunción orgánica.

La invención se basa en los resultados inesperados de los inventores relativos a la autorregulación del flujo sanguíneo en un órgano. Ventajosamente, de acuerdo con la presente invención se proporciona sangre a un órgano, tal como un hígado, bajo presión fisiológica pero sin forzar el flujo sanguíneo a cualquier velocidad particular. Al órgano se le permite que autorregule el flujo sanguíneo. (Puede permitirse que salga cualquier flujo sanguíneo excedente.) También ventajosamente, puede mantenerse la presión de salida de un órgano perfundido (vena cava en un hígado). Las apariencias histológicas de hígados perfundidos utilizando la invención se encuentran incluidas dentro de los límites normales después de 72 horas. Esto representa un adelanto importante respecto a las técnicas conocidas, cuyos problemas datan de hace mucho tiempo.

La perfusión del hígado aislado se ha estudiado durante más de 90 años (Bernard C., C. R. Acad. Sci. 1855; 41: 461). Sin embargo, se ha llevado a cabo mucho trabajo de perfusión del hígado aislado experimental con soluciones no sanguíneas en modelos roedores con el fin de evaluar distintos aspectos de la función hepática (Gores y otros, Hepatology, 1986; 6: 511-7). La aplicación clínica de la perfusión del hígado ex vivo como medio para dar soporte a pacientes con insuficiencia hepática aguda se estudió exhaustivamente a finales de los años sesenta y a principios de los años setenta (Eiseman y otros, Annals of Surgery, 1965, 329-345; Eiseman, Ann. Roy. Coll. Surg. Engl. 1965; 38: 329-349; Watts y otros., British Medical Journal, 1967; 341-345; Abouna, The Lancet, 1968,1216-1218; Abouna y otros, Brit. J. Surg., 1969; 56: 223-225; Condon y otros, The American Journal of Surgery, 1970; 119: 147-154; Abouna otros, Lancet, 1970; 391-396; Lempinen y otros, Scandinavian Journal of Gastroenterology, 1971; 6: 377-383; Chalstrey y otros, British Medical Journal, 1971; 58: 522-524; Hickman y otros, Scand. J. Gastroent., 1971; 6: 563-568; Parbhoo y otros, Lancet, 1971; 659-665; Abouna y otros, Surgery, 1972; 71: 537-546; Abouna y otros, Surgery Obstetrics and Gynaecology, 1973; 137: 741-752; Abouna y otros, Trasplantation, 1974; 18: 395-408). Sin embargo esta técnica cayó en desuso entre finales de los años setenta y principios de los noventa, debido a la aparición de otros tratamientos, en particular el satisfactorio trasplante de hígado.

Más recientemente ha habido un resurgimiento del interés en la perfusión extracorporal del hígado (Fair y otros, AASLD, 1993, A899; Fox y otros, American Journal of Gastroenterology, 1993; 88: 1876-1881; Chari y otros, NEJM, 1994; 331: 234-237). Esto ha dado lugar a perfeccionamientos en la tecnología del bypass cardiopulmonar, lo cual también ha llevado a la oxigenación de la membrana extracorporal exitosa, y a desarrollos en ingeniería genética, lo que ha dado lugar a la producción de cerdos transgénicos resistentes al rechazo hiperagudo (Cozzi y otros, Nature Medicine, 1995; 1: 964-966). La modificación genética de la regulación de la activación de complemento ha anulado la inmediata reacción inmunológica entre especies previamente discordantes.

Aunque el uso de órganos de especies concordantes presenta mayores ventajas inmunológicas, existen importantes restricciones prácticas. La disponibilidad de hígados humanos es limitada y los que están disponibles deben utilizarse para el trasplante clínico. El uso de órganos de primates no humanos plantea importantes problemas, si bien se han utilizado órganos de babuinos con éxito. Existe una mayor preocupación en relación a la zoonosis de los primates; también, la mayoría de primates no humanos no logran el tamaño necesario para que sean eficaces en el reemplazo del órgano humano.

Se sabe que el mecanismo efector crítico en el rechazo hiperagudo entre especies discordantes es la activación de la cascada del complemento (Platt y otros: Role of Natural Antibody-Antigen in Xenotransplantation. In: Xenotransplantation. Cooper y otros, eds. Berlín: Springer, 1997; 17-23). La activación del complemento normalmente se suprime por la presencia de proteínas superficiales de células específicas de la especie, reguladores de la actividad del complemento (Liszewski y otros, Adv. Immunol. 1996; 61: 201-283). Recientemente, una colonia de cerdos transgénicos para uno de dichos reguladores ha producido el factor de la aceleración del decaimiento humano (hDAF) (Cozzi y White, Nat. Med. 1995; 1: 964-966). Existen indicios de que los corazones y los riñones de estos animales, trasplantados en primates, no son rechazados de manera hiperaguda y se comportan como si se tratase de una especie armoniosa (Schmoeckel y otros, Trasplant. Proc. 1997; 29: 3157-3158). Por lo tanto, los cerdos transgénicos proporcionan una fuente de órganos "concordantes".

Estos factores han estimulado diversos grupos para volver a explorar la posibilidad de dar soporte a pacientes con insuficiencia hepática con hígados porcinos extracorporales. El éxito del trasplante de órganos también ha estimulado el interés en la utilización de la perfusión extracorporal como medio para la conservación y la resurrección de órganos de donantes marginales (Schon y otros, 8º Congreso de la European Society for Organ Transplantation, 1997, Abstract TRP4).

Una importante limitación de estudios anteriores ha sido la corta duración de la perfusión, no más de 24 horas (Neuhaus y otros, Int. J. Artif. Organs, 1993; 16: 729-739).

WO99/15011 describe un aparato diseñado específicamente para su uso en la perfusión de un corazón, y circuitos adaptados para su uso con otros órganos: riñón, hígado, páncreas y pulmones. Los aparatos propuestos para el riñón, el hígado o los pulmones no son capaces de permitir ninguna autorregulación del flujo por el órgano. La figura 8 y el texto que acompaña, por ejemplo, propone un aparato para la perfusión del hígado en el que el fluido va a ser bombeado de entrada y de salida a la misma presión, obligando al órgano a tomar la sangre que se le proporciona. El aparato cardíaco que se propone (figura 5) sería inapropiado para su uso en cualquier otro órgano. En funcionamiento normal, la sangre es bombeada al corazón y no hay posibilidad de autorregulación, por parte del corazón, del flujo a través del mismo. Opcionalmente, cuando el sistema ha de ser utilizado para la perfusión de un corazón que late (no un corazón caliente, no latiente), los autores emplean un exceso desde la entrada a la aorta. En una realización opcional de WO99/15011, si debe dejarse latir un corazón, aunque el documento no lo describe, un corazón en esa situación se le habría dejado autorregular el flujo sanguíneo a través del mismo. Esta realización opcional en WO99/15011 representa una anticipación accidental que ha sido renunciada desde la reivindicación 1 de acuerdo con G2/03.

US5807737 describe un aparato de perfusión del corazón que controla y fuerza el mantenimiento de la presión. El corazón debe tomar toda la presión forzada hacia el mismo por medio del circuito bombeado.

EP0376763 describe un aparato de perfusión en el que el flujo sanguíneo se bombea al órgano y el flujo sanguíneo sale directamente a un recipiente. La bomba impone el flujo de entrada hacia el órgano, mientras que la presión arterial presentada al órgano variará con la resistencia interna del órgano.

En un aspecto, la presente invención dispone un aparato de perfusión de órganos de mamíferos que, al conectarlo a la arteria de entrada y la vena de salida de un órgano de mamífero, seleccionado del grupo que consiste en hígado, riñón, páncreas, e intestino delgado proporciona un circuito de fluido para el flujo sanguíneo a través del órgano, en cuyo circuito existe, preferiblemente en el orden siguiente, un canal de salida para la conexión a la vena de salida del órgano, una bomba de salida de velocidad regulable para mantener la presión fisiológica en la vena de salida del órgano, un oxigenador y un intercambiador de calor, y un canal de entrada para la conexión a una arteria de entrada del órgano, comprendiendo el circuito, además, un dispositivo para mantener la presión fisiológica y el flujo variable en la arteria de entrada del órgano mientras se deja que el órgano autorregule el flujo sanguíneo a través de sí mismo para lograr el flujo arterial fisiológico.

En otro aspecto en el que el órgano es un hígado, la presente invención dispone un aparato de perfusión de hígados de mamíferos que, al conectarlo a la vena cava, la arteria hepática y la vena portal de un hígado de mamífero proporciona un circuito de fluido para el flujo sanguíneo a través del hígado, en cuyo circuito existe, preferiblemente en el orden siguiente, un canal de salida para la conexión a la vena cava, una bomba de salida de velocidad regulable para mantener la presión fisiológica en la vena cava, un oxigenador y un intercambiador de calor, y un canal de bifurcación que divide el circuito a los canales de entrada para la conexión a la arteria hepática y la vena portal, comprendiendo el circuito, además, un dispositivo para mantener la presión fisiológica en la arteria hepática y el flujo fisiológico en la vena portal mientras se permite que el hígado, cuando se conecta al aparato, autorregule el flujo sanguíneo a través de la arteria y autorregule la presión en la vena portal.

El citado aparato mantiene un circuito para el flujo sanguíneo. Al circuito puede unirse un individuo, preferiblemente un humano. La circulación del individuo puede conectarse al circuito a través de unas cánulas dispuestas en las venas mayores (colocadas a través de cirugía abierta o percutáneamente). El flujo de salida del individuo es retornado al circuito de perfusión en un punto anterior al órgano. La entrada al individuo es de sangre que ha pasado a través del órgano y se ha oxigenado. A modo de ejemplo con referencia al circuito del aparato de perfusión que se muestra en la figura 1, la conexión a un paciente puede ser en un punto posterior a la abrazadera de compuerta indicada en la derivación mostrada en las figuras conduciendo al recipiente, con el retorno desde el paciente conduciendo al recipiente. Tal como se indica, el soporte de órganos extracorporales de humanos se ha practicado durante muchos años, para los expertos en la técnica son bien conocidas técnicas y precauciones que se deben tomar en la conexión de los pacientes al aparato de perfusión extracorporal. Por ejemplo, es normal suministrar prostaciclina y heparina, y permitir evacuar la bilis del hígado. Un circuito puede incluir adicionalmente uno o más medidores de caudal y uno o más medidores de presión.

Considerando que anteriormente la perfusión extracorporal u órganos tales como los hígados se ha basado en una selección arbitraria de flujo o bien de presión (en la vena portal para un hígado), éstos no han variado de manera independiente.

La presente invención permite el mantenimiento de niveles fisiológicos tanto de flujo como de presión. Los inventores han observado que en el hígado la presión portal está relacionada directamente con la presión de la vena cava inferior y que el flujo portal (en lugar de la presión) está relacionado directamente con la presión aplicada desde el recipiente venoso portal (en realizaciones preferidas la altura del recipiente venoso portal sobre el hígado donde la sangre se suministra desde ahí por gravedad). El hígado responde al aumento de presión portal mediante una reducción de la resistencia vascular portal, manteniendo la presión portal constante.

En el circuito de la invención, el flujo de salida del órgano es bombeado para que se mantenga la presión fisiológica, por ejemplo variando la velocidad de bombeo, en la vena pertinente, que para el hígado es la vena cava. El flujo de entrada fisiológico pueden conseguirse mediante el ajuste de la presión de suministro, por ejemplo, la vena portal para el hígado. En una realización preferida de la presente invención, el flujo portal fisiológico se obtiene mediante el ajuste de la altura del recipiente portal sobre el hígado. La presente invención permite el establecimiento de niveles normales no sólo de presión portal sino también de flujo portal. El flujo de entrada arterial a un hígado perfundido de acuerdo con la invención puede establecerse a una presión fisiológica, determinándose el caudal por medio de la resistencia vascular del hígado.

El principio general de la invención, como aplicable a una variedad de órganos, es establecer la presión del flujo de entrada a un nivel fisiológico, con un caudal de flujo variable que depende de la resistencia vascular del órgano, permitiendo que se produzca la autorregulación fisiológica.

El circuito empleado en aspectos de la invención tal como se ejemplifica respecto al hígado comprende, además, un dispositivo para mantener la presión fisiológica en la arteria hepática y el flujo fisiológico en la vena portal mientras se permite que el hígado, cuando se encuentra conectado al aparato, autorregule el flujo sanguíneo a través de la arteria y autorregule la presión en la vena portal. Dicho dispositivo puede incluir un recipiente para la recogida de exceso de sangre resultante de la autorregulación por el hígado de flujo en la arteria hepática, y dicho recipiente puede ser para el suministro de sangre al canal de entrada para la conexión a la vena portal del hígado. El suministro de sangre a la vena portal de un hígado cuando se conecta al aparato puede ser desde el recipiente bajo la fuerza de la gravedad.

Convenientemente, la presión del flujo de entrada puede regularse mientras se permite la autorregulación de la velocidad del flujo de entrada disponiendo un tubo de bifurcación que permita la evacuación desde la conexión a la entrada al vaso sanguíneo. La resistencia de la derivación de evacuación de la bifurcación puede alterarse mediante una oclusión parcial, por ejemplo por apriete, para el ajuste de la presión a la entrada al órgano. La autorregulación del flujo por el órgano conduce a una evacuación de exceso de sangre al recipiente. Modos alternativos de obtener el mismo resultado incluyen un controlador automatizado que fije la presión dentro de unos parámetros predeterminados pero que permita el flujo variable en respuesta a la autorregulación por el órgano. En el caso de un hígado, dicho sistema puede utilizar dos bombas, una para proporcionar un flujo arterial hepático a presión constante/flujo variable, y uno para llenar el recipiente venoso portal a baja presión.

En otro aspecto, la presente invención dispone un procedimiento para accionar un aparato de perfusión de órganos. El aparato puede tener los componentes que aquí se identifican. Una realización de un procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención aplicado a un hígado puede ser un procedimiento que haga funcionar el aparato para la perfusión de un hígado de mamífero conectado a la vena cava, la arteria hepática y la vena portal de un hígado de mamífero en el que el aparato proporcione un circuito de fluido para el flujo sanguíneo a través del hígado, incluyendo el procedimiento regular la velocidad de bombeo del flujo de salida para mantener la presión fisiológica en la vena cava, regular presión de suministro al canal de entrada conectado a la arteria hepática para mantener la presión fisiológica en la arteria hepática y el flujo fisiológico en la vena portal, y permitir que el hígado autorregule el flujo sanguíneo a través de la arteria y autorregule la presión en la vena portal.

Otro aspecto dispone un procedimiento de perfusión extracorporalmente de un órgano de mamífero, siendo el órgano distinto de un corazón al que se le deja latir, cuyo procedimiento incluye el bombeo de flujo sanguíneo arterial de entrada al órgano para mantener la presión fisiológica y el flujo variable en la arteria del órgano y el bombeo de flujo venoso de salida desde el órgano para mantener la presión fisiológica en la vena de salida del órgano, mientras se permite que el órgano autorregule el flujo sanguíneo a través de sí mismo para conseguir un flujo arterial fisiológico. El órgano puede seleccionarse del grupo que consiste en hígado, riñón, páncreas e intestino delgado.

Si el órgano es un hígado, un procedimiento de acuerdo con la invención puede incluir la regulación del flujo de la vena portal y el bombeo de flujo sanguíneo de salida del hígado para mantener la presión fisiológica en la vena cava del hígado, mientras se permite que el hígado autorregule la presión portal.

Otro aspecto de la invención dispone un procedimiento para mantener la viabilidad de un órgano de mamífero, en cuyo procedimiento el órgano es perfundido de acuerdo con un procedimiento tal como el que se describe. La perfusión de acuerdo con la presente invención permite el mantenimiento de la viabilidad de un órgano tal como un hígado durante por lo menos aproximadamente 72 horas, preferiblemente por lo menos aproximadamente 96 horas, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 120 horas.

La ejemplificación experimental de realizaciones de la presente invención que se incluyen a continuación se refiere a la perfusión de hígados. A la luz de los resultados de los inventores, es científicamente razonable suponer que el aparato y los procedimientos de la invención son eficaces cuando se aplican a otros órganos, tales como riñones, páncreas o intestino delgado. La perfusión de un órgano con una única entrada (tal como un riñón) implicará un circuito modificado con el retorno del recipiente hacia la entrada de la bomba. El exceso de flujo sanguíneo puede proporcionarse a la arteria del órgano a una presión fija mientras se disponen medios de salida para cualquier flujo sanguíneo que se encuentre en exceso respecto al requerido por el órgano. Alternativamente, el flujo arterial puede proporcionarse por medio de una bomba a un caudal variable con una presión arterial fija.

Un órgano perfundido de acuerdo con la presente invención pueden ser humano o no humano, y puede ser no transgénico o transgénico. Los órganos no humanos pueden ser modificados para aumentar la compatibilidad con la conexión a un humano y/o la perfusión con sangre humana. Un ejemplo de modificación que se utiliza con éxito para aumentar la concordancia de órganos no humanos, especialmente órganos porcinos, es la modificación transgénica, tal que los órganos expresan el factor de aceleración del decaimiento del componente del complemento humano (hDAF) (véase, por ejemplo, Cozzi y White, y Schmoeckel y otros, supra).

La sangre utilizada en la perfusión puede ser humana o no humana, por ejemplo porcina para un órgano porcino, y esto puede depender del objetivo de la perfusión.

Un órgano humano será perfundido generalmente con sangre humana. Si el órgano se va a conectar a un sujeto humano, la sangre será humana y será necesario que sea antigenicamente compatible respecto al ABO. Un órgano no humano, por ejemplo un órgano de cerdo, puede ser perfundido con sangre pertinente no humana (por ejemplo, de cerdo), o sangre humana por ejemplo si el órgano se modifica de la manera que se ha descrito anteriormente (por ejemplo, transgénico para hDAF).

Preferiblemente la sangre es citrada. Los inventores han encontrado que la función de los hígados perfundidos con sangre citrada es notablemente superior a los perfundidos con sangre heparinizada. El citrato es un substrato metabólico importante del hígado.

En un circuito de perfusión del hígado de acuerdo con la invención, el fluido que escapa del órgano, incluyendo la ascitis, se hace circular preferiblemente de retorno al hígado, preferiblemente a través de la vena portal o, si no, a través de la arteria hepática. Esto tiene la ventaja de mantener el volumen vascular, y también de retener proteínas del plasma que probablemente se perderían si la ascitis se substituyera por soluciones coloides/cristaloides.

El aparato de acuerdo con la invención puede incluir un canal para la recogida del fluido que escapa del órgano y su transporte al recipiente de sangre de entrada.

Preferiblemente la perfusión es una "perfusión caliente", es decir, a una temperatura fisiológica, generalmente de 37ºC para un órgano humano y 39ºC para un órgano de cerdo.

Preferiblemente, un hígado para su uso en la presente invención se conserva con citrato hipertónico, en lugar de la actual solución de conservación del trasplante de hígado normal (Universidad de Wisconsin) a base de lactobionato. La solución de conservación se enjuaga fuera del hígado inmediatamente antes de que comience la perfusión.

Otra ventaja de un circuito de perfusión de acuerdo con la presente invención se deriva del hecho de que cuando dicho circuito se conecta a un paciente, la circulación del paciente se conecta al recipiente del circuito y, por lo tanto, la velocidad de perfusión del paciente puede ser diferente de la de perfusión extracorporal de los órganos.

Los inventores también han encontrado que la perfusión de un hígado de porcino, ya sea normal o modificado genéticamente, con sangre humana da lugar a la extracción de glóbulos rojos humanos por las células Kupffer del hígado. Para fines de aplicación clínica, el bloqueo de esta función de las células de Kupffer, por ejemplo mediante la ablación de las células, permite una perfusión a largo plazo sin un consumo excesivo de glóbulos rojos. La función de las células de Kupffer puede ser bloqueada/ablada por el tratamiento del animal donante antes de la extracción del órgano o mediante el tratamiento del órgano con clodrinate o gadolinio, o inmunoglobulina o lisis de inmunoglobulina/complemento, o utilizando cualquier tecnología apropiada disponible para los expertos en la técnica.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se dispone un procedimiento para reducir el consumo de glóbulos rojos por un órgano no humano en la perfusión con sangre humana, comprendiendo el procedimiento la aplicación al órgano de un tratamiento de bloqueo o ablación de la función de las células de Kupffer antes de la exposición del órgano a la circulación humana o la perfusión con sangre humana, en el cual se utiliza una técnica de perfusión de acuerdo con otros aspectos de la presente invención.

Otros aspectos y realizaciones de la presente invención serán claros para los expertos en la técnica a la vista de la ejemplificación experimental que sigue con referencia a las figuras.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 ilustra un aparato de perfusión de acuerdo con una realización de la invención, conectado a un hígado.

La figura 2 muestra los parámetros hemodinámicos durante la perfusión extracorporal del hígado tal como se describe en el Ejemplo 1 que sigue:

La figura 2a muestra el flujo total según se mide saliendo del hígado a través de la vena cava inferior, y la presión de la VCI medida en la confluencia de venas hepáticas.

La figura 2b muestra el flujo portal según se mide entrando al hígado a través de la vena portal, y la presión portal medida controlando la línea en la vena portal.

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La figura 2c muestra el flujo de la arteria hepática calculado como la diferencia entre flujo total y portal, y la presión de la arteria hepática medida como presión de línea arterial directa.

La figura 3 muestra los parámetros metabólicos durante la perfusión extracorporal del hígado tal como se describe en el Ejemplo 1 medido por gasometría sanguínea arterial (CIBA Corning, 288 Blood Gas System),

La figura 3a muestra la gama de pH normal de referencia de 7,35 a 7,45, y el exceso de base de -2 a 2 mEq.

La figura 3b muestra la gama de potasio normal de referencia de 3,5 a 4,6 mmol/L, y calcio ionizado de 1,13 a 1,3 mmol/L.

La figura 4 muestra indicadores de la función sintética durante la perfusión extracorporal del hígado.

La figura 4a muestra los niveles de urea frente a los niveles de creatinina expresados en escalas de eje de ordenadas clínicamente relevantes.

La figura 4b muestra la actividad del complemento medida mediante análisis CH50 utilizando una oveja RBC. Los datos se expresan simplemente como un porcentaje de las unidades de CH50 del plasma justo antes de la perfusión del hígado.

La figura 4c muestra niveles de factor V medidos sustituyendo sangre humana deficiente en factor V y expresados como un porcentaje de los niveles de factor V humanos normales.

La figura 5 muestra indicadores de lesión y función hepática durante la perfusión extracorporal del hígado.

La figura 5a muestra niveles de ALT (SGPT) (margen humano normal hasta 50 U) y niveles de fosfatasa alcalina (margen humano normal 30-135 U).

La figura 5b muestra la producción de bilis medida como ml de bilis producida por hora y bilirrubina total expresada en \mumol/L (margen humano normal hasta 17 \mumol/L).

La figura 5c muestra el consumo de oxígeno calculado mediante la ecuación de Fick y expresado como ml O_{2}/min/hígado.

La figura 6 muestra parámetros metabólicos durante la perfusión extracorporal del hígado tal como se describe en el Ejemplo 2 según se mide mediante gasometría sanguínea arterial.

La figura 6a muestra el margen de referencia humano normal para un exceso de base que es de -2,5 a 2,5 mEq.

La figura 6b muestra el margen de referencia humano normal para potasio que es de 3,5 a 4,6 mmol/L.

La figura 7 muestra la producción de bilis medida como ml de bilis producida por hora y la bilirrubina total expresada en \mumol/L (margen humano normal hasta 17 \mumol/L).

La figura 7a muestra un hígado de porcino transgénico hDAF perfundido con sangre humana.

La figura 7b muestra un hígado de porcino no transgénico perfundido con sangre humana.

La figura 7c muestra un hígado de porcino no transgénico perfundido con sangre porcina.

La figura 8 muestra un hemograma completo que se realizó utilizando un contador Coulter (T660) regulado para la medición de sangre porcina. Transgénico representa hígados porcinos transgénicos hDAF perfundidos con sangre humana, No transgénico representa hígados de porcino salvaje perfundidos con sangre humana y aloperfusión representa hígados de porcino salvaje perfundidos con sangre porcina.

La figura 8a muestra un recuento de plaquetas, (X 10^{9}/L).

La figura 8b muestra recuentos de células nucleadas (X10^{9}/L).

La figura 8c muestra hematocrito (expresado como porcentaje de hematocritos de partida de la sangre antes de empezar la perfusión extracorporal).

La figura 9a muestra urea medida a través una de técnica de laboratorio clínico normal. Transgénico frente a Normal, p= NS.

La figura que 9b muestra la actividad del complemento medida utilizando un análisis funcional por lisis de glóbulos rojos de oveja y la determinación de CH50. Los resultados se expresan como porcentaje de CH50 presente antes de la perfusión del hígado (sangre de imprimación). Transgénico frente a Normal, p=NS.

La figura 9c muestra la actividad del factor V medida utilizando un análisis funcional mediante la reconstitución del suero humano deficiente en factor V. Los resultados se expresan como porcentaje de suero humano normal. Transgénico frente a Normal, p= NS.

La figura 10 muestra un exceso de base durante el soporte y rescate del hígado, indicando un rápido rechazo después de que cesara la perfusión.

Ejemplo 1 Perfusión extracorporal de hígados de cerdo Donante de sangre

En estos estudios se utilizaron cerdos blancos grandes (35 - 70 kg), cinco como donantes de hígado y cinco como donantes de sangre. Todos los animales fueron tratados de acuerdo con la Animal Protection Act., 1986 del Reino Unido. Los cerdos donantes de sangre fueron medicados previamente con 10 mg/kg de ketamina (Willows Francis Veterinary, Ketaset) y 1 mg/kg de midazolam (Roche, Hypnovel) IM, seguido de anestesia de halotano. La vena yugular exterior fue canulada, se proporcionaron 15.000 U de heparina por vía intravenosa y la sangre fue recogida en bolsas citradadas por drenaje por gravedad hasta que cesó la circulación. La sangre se utilizó inmediatamente o se almacenó a 4ºC y se utilizó dentro de una semana de la recogida.

Hígado donante

Los animales fueron medicados previamente tal como se ha indicado anteriormente, se canuló una vena de la oreja y se indujo anestesia utilizando 4 mg/kg de propofol por vía intravenosa (Zeneca, Diprivan). El animal fue entubado utilizando un tubo endotraqueal extendido. Se utilizó oximetría de pulso a través de una sonda de cola para seguir la oxigenación y se midió el CO_{2} end-tidal. Tras la entubación, se situó una cánula de calibre 14 para permitir la sustitución de fluido durante la hepatectomía. La anestesia se mantuvo con propofol IV (10 mg/kg/hr) en todo el procedimiento. En la línea media se realizó una incisión. El conducto de la bilis se dividió y se identificaron los vasos hepáticos y se aislaron de manera estándar. El hígado fue disecado hasta que se conectó al donante por sus fijaciones vasculares. Durante todo este procedimiento, se prestó una atención meticulosa a la hemostasis para minimizar la posterior pérdida de sangre en el circuito extracorporal heparinizado. Se proporcionaron 20.000 unidades de heparina por vía intravenosa y se dejó circular. La aorta infrarenal fue canulada con una cánula de calibre 20 (Bard), y se conectó a un sistema cerrado que contenía una solución de Eurocollins fría (Baxter, Soltran,). La vena portal fue canulada con una cánula de calibre 24 (Bard) de manera similar y la perfusión comenzó con una solución de Eurocollins fría a través de la vena portal y la aorta por gravedad a medida que la vena cava inferior (VCI) suprahepática se dividía en el pericardio.

Tras la perfusión de 2 litros de solución Eurocollins fría a través del hígado, el hígado se extrajo extirpando un corte de diafragma alrededor de la VCI suprahepática, dividiendo la arteria hepática en el eje celíaco, la VCI infrahepática a nivel de las venas renales, y la vena portal a nivel de la vena esplénica. Mientras se continuaba con la perfusión portal, el hígado se extrajo del animal y se dispuso en un recipiente a baja temperatura. El remanente diafragmático fue suturado con proleno 3.0 para asegurar la hemostasis.

La VCI suprahepática fue canulada con una cánula de calibre 28 (Bard) con su orificio posicionado a nivel de las venas hepáticas. La vena cava inferior fue canulada con una cánula de control de presión Fr (Portex) al igual que la vena portal a través de un afluente. La arteria hepática fue canulada con una cánula 10 Fr (Jostra). Las presiones arteriales se midieron directamente desde la extremidad arterial del circuito. El control continuo de la presión se consiguió empleando un transductor (Viggo-Spectramed, Haemodynamic Monitoring Set) y un monitor digital (Datex, AS/3). El conducto de la bilis fue canulado con un tubo en T silástico de calibre 14 con el extremo abierto del tubo en T colocado en un dispositivo de recogida para controlar la producción de bilis.

Circuito de Perfusión

Mientras se llevaba a cabo la preparación del trabajo de banco del hígado, el aparato de perfusión (véase Figura 1) se montó y se le dio una capa de 1.500 c.c. de sangre de cerdo donante. El circuito de perfusión consistía en un oxigenador (oxigenador de membrana pediátrico Jostra M15), una bomba centrífuga (bomba centrífuga Medtronic BP50), un recipiente (recipiente de estructura blanda Jostra 800 ml), tubos (Medtronic, PVC, de 1/4 y 3/16 pulgadas de diámetro interior (DI) con conectores Medtronic de policarbonato), una abrazadera de compuerta, transductores de presión (transductores de presión triples Baxter) y sondas de flujo (2 Medtronic DP 38P). El oxigenador se conectó a un intercambiador de calor para mantener la temperatura de la sangre a 39ºC (temperatura normal para un cerdo).

Durante la preparación del circuito se ajustó el pH, paCO_{2} y Ca^{2+} para que se encontrasen dentro del margen fisiológico normal. En general, el circuito de perfusión se completó con 9,2 mmol de CaCl_{2}, 20 mmol de bicarbonato de sodio y 7.000 unidades de heparina. Una vez que se optimizó la sangre en el circuito, se obtuvo entonces una muestra para un hemograma completo, electrólitos, urea, creatinina, pruebas de la función hepática (LFT), bilirrubina total, y se recogió plasma y se guardó en nitrógeno líquido para otros análisis.

Antes de la conexión del hígado al circuito de perfusión, se enjuagó la solución de Eurocollins a partir de la circulación portal utilizando 1 litro de solución de infusión coloidal (Behring, Haemaccel). Esto también permitió una completa exclusión de aire del hígado y las cánulas. El hígado se dispuso en una bolsa intestinal y después se suspendió en suero fisiológico en una cámara de perfusión estéril. Se colocaron dos tubos de plástico blando en la parte más dependiente de la bolsa intestinal. Estos tubos se conectaron entonces al recipiente a través de una bomba Imed (Imed, Gemini PC-4) para recircular cualquier ascitis producida. El hígado se conectó al aparato de perfusión imprimado evitando que quedase aire (figura 1).

La perfusión se ejecutó a una velocidad de 1-2 litros/min (total) con 100-400 ml/min a través de la arteria hepática. La presión arterial se mantuvo a 80-100 mmHg (media) y la presión de la VCI a 0-3 mmHg. La presión de la VCI y arterial se reguló a través de la velocidad de la bomba y el flujo portal a mediante de la altura del recipiente.

Perfusión del hígado

Tras del comienzo de la perfusión, se obtuvieron muestras de sangre arterial y venosa a 1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 hora, 2 horas, 4 horas, y después cada 4 horas hasta el final de la perfusión. Las muestras de sangre se analizaron inmediatamente mediante un análisis de gas sanguíneo (CIBA Corning, 288 Blood Gas System). El flujo de oxígeno y el flujo de aire al oxigenador se regularon para mantener el paO_{2} entre 14-20 kPa y el paCO_{2} entre 3,5-6 kPa.

Las muestras de sangre se analizaron después para un hemograma completo, electrólitos, urea, creatinina, LFTs y bilirrubina total. El plasma se guardó en nitrógeno líquido para un análisis posterior del complemento y componentes de coagulación.

El consumo de oxígeno se calculó utilizando el principio de Fick mediante la siguiente ecuación:

Contenido en O_{2}= 1,39 ([Hgb] en g/dl) (O_{2} en %) + 0,0031 (pO_{2})

Cada gramo de hemoglobina es capaz de transportar 1,39 ml de O_{2} y la cantidad de O_{2} disuelto es función lineal del PO_{2} (0,0031 ml/dl sangre/mm HgPO_{2}). Establecer el consumo de oxígeno del hígado es complicado debido al hecho de que el hígado tiene un suministro de sangre portal. Por lo tanto, es necesario saber el contenido de O_{2} de la arteria hepática, la vena portal y la vena hepática. En este sistema hepático aislado, el PaO_{2} de la vena portal y la arteria hepática es el mismo y por consiguiente el consumo de oxígeno del hígado puede calcularse como sigue:

Consumo de O_{2} = (PO_{2} arteria hepática - PO_{2} VCI) (Flujo Total)

Inmediatamente antes de la perfusión del hígado con sangre, se inició una infusión de prostaciclina (Glaxo Wellcome, Flolan) a 4 mg/hr; además, se realizó una infusión de heparina a 500 U/hr y se reguló para mantener ACT> 300 sec. Una vez que se inició la perfusión del hígado, se proporcionó nutrición parenteral. Se realizó una infusión de una mezcla que contenía 500 ml de una solución de nutrición parenteral total estándar (Kabi Pharmacia), 50 ml de una emulsión de lípidos al 10% (Clintec, IVELIP), 10 ml de oligoelementos (Pharmacia & Upjohn, Additrace), 1 vial de multivitaminas (Clintec, Cernevit), y 72 unidades de insulina (Novo Nordisk Pharmaceuticals, Ltd., Human Actrapid) a 7 ml/hr durante toda la perfusión de 72 horas. Se proporcionó glucosa o insulina adicional para mantener la glucosa dentro de un margen de 4-10 mmol/l según se determina a través de un análisis por stick de glucosa en sangre (máquina Boehringer-Mannheim, Accutrend y sticks BM-Accutest). Al principio de la perfusión y cada 24 horas después de la misma al circuito se añadió 1 g de cefotaxima (Roussel, Claforan).

La perfusión del hígado cesó de manera electiva a 72 horas y se enviaron muestras del hígado para una evaluación histológica. Se cortaron muestras aleatorias del hígado y se congelaron para una evaluación inmunohistoquímica y se fijaron en formalina para la tinción de hematoxilina y eosina.

Análisis de muestras

Se analizaron muestras de suero de sueros cerdo para la producción del complemento mediante análisis de CH50 (Harrison R. Complement technology. In: Weir D. M., Herzenberg L. A., Blackwell C., eds. Handbook or Experimental Inmunology, 4th Edition, Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1986,: 39.1-39.49). Brevemente, se lavaron glóbulos rojos de oveja (SRBC) tres veces en un diluyente de fijación del complemento (ICN Biomedicals. Inc.), diluido en un 10%, y se recubrieron con anticuerpo SO-16 durante 30 minutos en hielo. Se añadieron 25 \mul de una solución de SRBC recubierta con SO-16 al 1% a cada cavidad de una placa de microtitulación de 96 cavidades. Se examinaron muestras de suero desde puntos temporales variables durante la perfusión del hígado comenzando con una dilución 1:10 y diluido en serie a 1:4 por triplicado a través de la placa de microtitulación. Los valores de CH50 se calcularon tal como describe Harrison (Harrison R. Complement Technology. En: Weir D. M., Herzenberg, L. A., Blackwell C., eds. Handbook of Experimental Inmunolgy, 4ª Edición, Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1986: 39.1-39.49). Existía una variabilidad en los valores de CH50 en la sangre de imprimación (sangre de porcino antes de la perfusión a través del hígado) entre los experimentos pero valores consistentes en los experimentos; por consiguiente, todos los valores se expresan como porcentaje de imprimación.

Los niveles de factor V se midieron utilizando una máquina Organon Teknika MD180 y consumibles de Organon para un ensayo de factor V a base de PT (para anular los efectos de anticoagulación de la heparina). El tiempo de la protrombina se midió utilizando la misma técnica. Los electrolitos, las LFTs, la bilirrubina total, la creatinina, y la urea fueron medidos utilizando procedimientos clínicos estándar. Los hemogramas completos incluyendo hemoglobina, hematocrito, recuento de glóbulos blancos, y recuento de plaquetas se obtuvieron empleando un contador Coulter (T660) regulado para la medida de sangre porcina.

Resultados

En cinco experimentos, que duraron 72 horas cada uno, el flujo hepático total medio era de 1,99 l/min (s. d. 0,21) a una presión media de la VCI de 2,06 mmHg (s. d. 3,0) (figura 2A). El flujo portal medio era de 1,75 l/min (s. d. 0,21) a una presión media de 7,22 mm/Hg (s. d. 2,3) (figura 2B). El flujo arterial medio era de 0,24 l/min (s. d. 0,18) a una presión media de 90,3 mm/Hg (s. d. 9,5) (Figura 2C).

La función metabólica se evaluó midiendo el pH, HCO_{3-}, K^{+}, exceso de base y el consumo de oxígeno. El control del pH, HCO_{3-}, y el exceso de base demostraba esencialmente el equilibrio ácido base normal durante toda la perfusión (figura 3A). De manera similar, el K^{+} permaneció en niveles fisiológicos durante toda la perfusión (figura 3B).

Como índice de función hepática sintética, se evaluaron los niveles de urea, complemento y factor V y los resultados se ilustran en las figuras 4A, 4B y 4C. El nivel de urea medio para los 5 experimentos era de 2,92 mmol/L (s. d. 0,55) al principio de la perfusión y de 45,4 mmol/L (s. d. 6,0) al final. Esto está en contraste con el nivel de creatinina que aumentó de 100 mmol/L (s. d 18,32) a 136,8 mmol/L (s. d. 36,22). Esto implica que el aumento de urea es el resultado de la síntesis al contrario que la hemoconcentración. Se produjo un aumento progresivo de la actividad del complemento tal que durante 72 horas se encontró en un promedio de un 383,2% del nivel inicial (s. d. 111,1). En cambio, los niveles de factor V permanecieron relativamente constantes, empezando con un nivel medio de un 408,4% (s. d 125,5) y terminando con una cantidad similar a 72 horas de un 343% (s. d 171,5).

La lesión del hígado fue evaluada midiendo el nivel de alanina transferasa (ALT) de las enzimas del hígado y fosfatasa alcalina (Alk. Phos.). Al cabo de 72 horas de perfusión el nivel de ALT había variado de 62,4 unidades/L (s. d. 10,1) a 51,4 unidades/L (s. d 8,9) (figura 5A). Los niveles de fosfatasa alcalina cayeron durante el periodo de perfusión de 136,5 unidades/litro (s. d. 17,0) a 70,2 unidades/litro (s. d 12,9) a 72 horas. Los niveles de bilirrubina permanecieron bajos pero se elevaron durante la perfusión, variando de 0,4 mmol/L (s. d. 0,8) a 32 mmol/L (s. d. 28,2) (figura 5B). Este aumento de bilirrubina estaba asociado a una reducción del flujo de bilis y la formación de barro biliar (figura 5B). Por lo general, el barro biliar hizo necesaria una irrigación intermitente del árbol biliar para permitir un drenaje biliar adecuado.

El consumo de oxígeno demostró un pico inicial que cayó a un nivel valle en 8 horas donde permaneció durante el resto de la perfusión (figura 5C). El consumo de oxígeno medio a 1 minuto para los 5 experimentos fue de 36,2 ml/min (s. d. 3,37) y en 8 horas éste fue de 9,6 ml/min (s. d. 4,06).

En todos los cinco experimentos hubo una buena conservación del hígado sin una variación global de la arquitectura. Hubo unas pocas zonas de necrosis pericentral que se apreció en dos hígados pero en general las apariencias eran indicativas de una excelente viabilidad. Tres hígados mostraron zonas de una ligera hemorragia septal. Cuatro hígados mostraron indicios de edema, tres moderados y uno severo. Hubo congestión sinusoidal presente en todos los especimenes examinados, lo que suponía un 5-10% de lóbulos en dos casos, un 20-25% de lóbulos en dos casos y un 40% de lóbulos en el resto del hígado. La dilatación de la vena central estaba presente en todos menos un hígado, lo que suponía un 25-50% de venas centrales. En todos los hígados examinados hubo presente una hiperplasia de células Kupffer. En cuatro de cinco hígados hubo bilis espesada presente en los conductos de bilis. Dos hígados tuvieron infiltrados de células mononucleares difusamente dentro del tabique fibroso mientras los tres hígados restantes no los mostraron.

Discusión

La técnica empleada para la perfusión extracorporal del hígado de acuerdo con la presente invención pudo mantener una buena función y estructura durante por lo menos 72 horas en el órgano perfundido aislado. La perfusión del hígado aislado no se ha descrito anteriormente para períodos mayores de 24 horas (Neuhaus y otros, Int. J. Artif. Organs, 1993; 16: 729-739). Los investigadores anteriores normalmente ponían fin a la perfusión como resultado de una acidosis progresiva, hiperkalemia y crecientes presiones portales. Por esta razón la invención representa un importante adelanto en la perfusión del hígado.

Los investigadores anteriores de la perfusión del hígado aislado de animales grandes han afirmado que han mantenido los parámetros hemodinámicos fisiológicos. Sin embargo, los presentes inventores han encontrado que si las bombas se controlaban para mantener la presión fisiológica arterial, portal y de la VCI, el flujo sanguíneo no se mantenía a niveles fisiológicos. El flujo hepático total era mayor y la relación entre el flujo venoso portal y el flujo arterial hepático fue mayor (7: 1) que el descrito in vivo (3: 1). El aumento del flujo sanguíneo fue a través de la vena portal. Una revisión de la literatura no proporciona ninguna evidencia convincente de que algún investigador anterior haya mantenido flujos hepáticos y presiones normales de manera sincronizada. El trabajo de los inventores muestra que la presión portal está autorregulada e influenciada por la presión de la VCI.

Hay que indicar la capacidad del hígado perfundido aislado para mantener el equilibrio ácido base y el nivel de potasio en este circuito. Esto está en desacuerdo con la experiencia de otros (Mets y otros, Journal of Hepatology 1993; 17: 3-9; Adham y otros, Transpl. Int., 1997; 10: 299-311) y puede estar relacionado con una serie de factores incluyendo el mantenimiento de la microestructura del hígado y también la provisión de un de substrato metabólico. Otros investigadores han encontrado necesario incorporar una membrana de diálisis en el circuito para evitar el desarrollo de acidosis e hiperkalemia (Schon y otros, Trasplantation Proceedings 1993; 25: 3239-3243). Como que la restauración del pH normal y el mantenimiento del potasio es un dato clínico característico de una buena función en un hígado recién trasplantado, esto proporciona otra evidencia de la excelente función de los hígados perfundidos de acuerdo con la presente invención.

Aunque podría suponerse razonablemente que el consumo de oxígeno es una medida de la función del hepatocito, éste cayó de manera consistente durante el curso de la perfusión. Esto está en contraste con otros indicadores de la función hepática, en particular la actividad sintética. Sin embargo, los valores iniciales obtenidos para el consumo de oxígeno están relacionados con números derivados in vivo por una serie de autores (Mathisen y Omland, Scand J Gastroent 25,: 1265-1273,1990; Rasmussen y otros, Eur J Surg 159: 201-7, 1993; Lindberg y Clowes, Jr., J Surg Research 31: 156-64, 1981; Imamura, Surgery, Gynaecology and Obstetrics 141: 27, 1975; Tygstrup y otros, Scan J Gastroent Suppl 9: 131-138, 1971 y p139-148; Mets y otros, Journal of Hepatology 1993; 17: 3-9). En esta situación experimental el hígado es desnervado y no queda expuesto a los estímulos hormonales normales a los cuales está sometido in vivo. Es posible que el hígado esté relativamente inactivo en esta situación que puede explicar el nivel relativamente bajo del consumo de oxígeno observado. En soporte a esta hipótesis, se observó de manera consistente una aguda elevación transitoria del consumo de oxígeno cuando se añadieron bolus de insulina intermitentes al circuito. La producción de bilis en este sistema de perfusión extracorporal alcanzó un máximo de 12,8 ml/hora, aproximadamente la mitad del observado in vivo. La producción de bilis disminuía con el tiempo y la bilis espesada se observó macroscópicamente en todos los hígados e histológicamente en cuatro de cinco experimentos. Esto puede reflejar un consumo de substrato (incluyendo sales de bilis), una pérdida de estímulos hormonales o nerviosos y/o un drenaje biliar inadecuado con acumulación de barro biliar (aunque la fosfatasa alcalina no aumentó). Los niveles de suero bilirrubina permanecieron bajos durante las primeras 24 horas de perfusión y empezaron a subir de manera concomitante con la caída de la producción de la bilis.

Los indicadores enzimáticos de lesión del hepatocito no se elevaron durante la perfusión. Utilizando el mismo ensayo, estos enzimas son substancialmente elevados en un modelo porcino de insuficiencia hepática aguda utilizado por nuestro grupo. Esto sugiere que existe una buena conservación de la viabilidad del hepatocito a pesar de la obstrucción biliar y el aumento de la bilirrubina.

La demostración de la síntesis de la proteína proporcionó otra prueba de la función hepatocelular. Las figuras 4A, 4B y 4C muestran el indicio de una continuada función sintética a lo largo de las 72 horas de perfusión. Es interesante indicar que al parecer la producción del complemento no era regulada por un mecanismo de realimentación en el hígado, sino que parecía continuar a una velocidad constante acumulándose en el plasma del circuito aislado (figura 4B). Los mecanismos que regulan la producción del complemento por el hígado siguen sin comprenderse bien. En cambio, la actividad del Factor V permanecía en un nivel relativamente constante a lo largo del periodo de perfusión de 72 horas. La importancia de los distintos modelos apreciada en el equilibrio de la síntesis y el consumo por estas dos proteínas es poco clara.

Mientras que 3 de 5 hígados no mostraron necrosis, las pocas zonas de necrosis apreciadas eran de localización pericentral, lo que sugiere una lesión isquémica, pero esto no era suficiente para provocar un aumento de los niveles de ALT o fosfatasa alcalina. Existía una consistente evidencia de edema, congestión sinusoidal y dilatación de la vena central. Estos resultados pueden sugerir un drenaje venoso inadecuado a pesar de las presiones de la VCI fisiológicas.

Tras un primer fallo en la perfusión en experimentos preliminares, se utilizó prostaciclina de manera rutinaria. De este modo, aunque el papel de la prostaciclina no se ha investigado de manera rigurosa, creemos que su uso es deseable en la perfusión del hígado. Es incierto si es la actividad vasodilatadora o anti-plaqueta de la prostaciclina lo que proporciona los efectos beneficiosos en esta situación. Sin embargo, un agente que imite una u otra de estas actividades, o las dos, pueden ser útiles en lugar de la prostaciclina.

Ejemplo 2 Perfusión extracorporal de hígados de cerdo transgénico hDAF con sangre humana

El aparato de perfusión y la técnica empleados en el Ejemplo 1 se utilizó para la perfusión de hígados de porcino transgénico para la proteína reguladora del complemento, el factor de la aceleración del decaimiento humano (hDAF), cuando es perfundido con sangre humana sana y fresca. Se estudiaron tres grupos experimentales: aloperfusiones (hígados de cerdo normal perfundidos con sangre de cerdo) y xenoperfusiones de hígados de cerdo tanto no modificados como transgénicos hDAF con sangre humana.

La aloperfusión produjo el mantenimiento de una buena función y estructura histológica durante períodos de por lo menos 72 horas. Las xenoperfusiones también se llevaron a cabo durante períodos de 72 horas pero, a diferencia de la aloperfusión, fueron marcadas por una disminución progresiva de hematocrito de la sangre circulante. Un examen histológico demostró una necrosis irregular pero la mayoría de los lóbulos era normales. La función hepática eficaz se demostró tanto en perfusión normal como transgénica.

Se estudiaron tres grupos con 5 experimentos en cada grupo.

Grupo A: Aloperfusiones, hígados de porcino normal perfundido con sangre de cerdo.

Grupo B: Xenoperfusiones, hígados de porcino normal (no transgénico) perfundidos con sangre humana.

Grupo C: Xenoperfusiones transgénicas, hígados de porcino transgénicos perfundidos con sangre humana.

En cada grupo se aplicó el mismo protocolo experimental.

Los hígados de cerdo donantes se prepararon como en el Ejemplo 1. La sangre humana se obtuvo de donantes voluntarios y se utilizó en 4 horas de donación.

El circuito de perfusión (Figura 1) se utilizó como en el Ejemplo 1.

La perfusión se detuvo electivamente a 72 horas o antes si se consideraba que se había producido una insuficiencia hepática -pH <7.0, una rápida elevación de potasio o un aumento de la presión portal. En este momento se tomaron múltiples muestras del hígado tanto para una evaluación inmunohistoquímica como tinción de hematoxilina y eosina.

Se analizaron muestras de suero para la producción del complemento mediante análisis de CH50. El factor V se midió utilizando un análisis basado en el tiempo de protrombina (Organon Teknika MD180). El tiempo de protrombina también se midió. Se midió electrólitos, pruebas de la función hepática bioquímicas, creatinina, y urea utilizando procedimientos clínicos estándar. Se realizó un análisis de hemograma completo utilizando un contador Coulter (T660) regulado para la medición de sangre de porcino.

Resultados

En la Tabla 1 que sigue se muestran los datos de flujo y presión para los tres grupos.

Estos resultados han sido analizados empleando una prueba T de dos colas (Tabla 2). No se encontró ninguna diferencia importante para el flujo portal o total entre las xenoperfusiones transgénicas y no transgénicas. Sin embargo, las aloperfusiones mostraron flujos total y portal significativamente más elevados que las xenoperfusiones (p= 0,05, p=0,025). Respecto tanto al flujo arterial como a la presión de la VCI, se apreciaron diferencias importantes entre las xenoperfusiones de control y transgénicas (p= 0,05, p= 0,05). No pudo mostrarse ninguna diferencia importante en el flujo arterial entre cualquiera de los grupos experimentales. Aunque no se apreció ninguna diferencia importante en la presión portal entre las aloperfusiones y las xenoperfusiones transgénicas, se mostraron importantes diferencias entre las xenoperfusiones no transgénicas y tanto aloperfusiones como xenoperfusiones transgénicas (p= 0,01, p= 0,01).

Como medida de la función metabólica el equilibrio ácido-base del circuito se evaluó mediante el pH, el bicarbonato y el exceso de base. El exceso de base refleja solamente el efecto metabólico del hígado perfundido en aislamiento. En todos los tres grupos se corrigió de manera progresiva una acidosis metabólica profunda inicial. Las xenoperfusiones transgénicas se comportaron de manera similar a las aloperfusiones (ninguna diferencia importante), mientras que el ácido-base se corrigió eficazmente en las xenoperfusiones no transgénicas (p= 0,005) (figura 6A). Como medida adicional de la función metabólica hepática se midieron los niveles de potasio. Ambos grupos de xenoperfusión mostraron niveles de potasio significativamente más elevados que las aloperfusiones (p= 0,01, p= 0,05), más marcados después de 48 horas de perfusión (Figura 6B).

El consumo de oxígeno (ml/hora) para los tres grupos se indica en la Tabla 3 que sigue.

Se apreció un modelo consistente en el consumo de oxígeno en ambos grupos de xenoperfusión con una caída inicial seguida de un aumento terminal; este último no se apreció en las aloperfusiones.

La producción de bilis (ml/hora) en los tres grupos se indica en la figura 7.

Aunque no existió ninguna diferencia importante en la producción de bilis entre el grupo de xenoperfusión, éstos produjeron significativamente menos bilis que las aloperfusiones (p= 0,025, 0,05). Los niveles de bilirrubina total se elevaron de manera progresiva en todos los tres grupos. Aunque no hubo ninguna diferencia importante entre las xenoperfusiones (terminando a 138,8 mmol/L y 160,5 mmol/L), el nivel en el grupo de aloperfusión fue significativamente inferior (32 mmol/L) (p= 0,0005, p=0,0005) (Figura 7).

Mientras que el recuento de glóbulos blancos en ambos grupos de xenoperfusión cayó a menos de 1,0 x10^{9}/L en 1 hora, el recuento de glóbulos blancos de >1,0 x 10^{9}/L se mantuvo hasta 52 horas durante las aloperfusiones (no importante) (Figura 8B). El recuento de plaquetas también cayó durante las xenoperfusiones normales y transgénicas, la única diferencia importante se encontraba entre las xenoperfusiones no transgénicas y las aloperfusiones (p= 0,005) (Figura 8A). Existió una reducción progresiva en el hematocrito en todos los tres grupos (Figura 8C). En 72 horas el hematocrito terminal era de un 46,9%, 1,9% y 0,3% (aloperfusión, no transgénico, transgénico). Se mostraron diferencias estadísticamente importantes entre todos los 3 grupos (Figura 8C).

Los hígados transgénicos sintetizaron significativamente más urea que los hígados no transgénicos (p= 0,01) (Figura 9A). El grupo de aloperfusión sintetizó significativamente menos urea que cualquier grupo de xenoperfusión (p= 0,025, p= 0,0005). Demostrando que esto se debía a la síntesis en lugar de la hemoconcentración, los niveles de creatinina mostraron como máximo una concentración de 1,7 veces en las 72 horas de perfusión.

La actividad del factor V medida en la aloperfusión fue de aproximadamente un 400%; esto se mantuvo durante todo período de perfusión (Figura 9B). Ambos grupos de xenoperfusión mostraron unos niveles del factor V iniciales de un 100% aumentando con el tiempo a un 200% y un 324% respectivamente. No hubo ninguna diferencia importante entre el grupo de xenoperfusión; no es apropiado comparar los grupos de aloperfusión y xenoperfusión ya que los valores iniciales eran diferentes y el análisis requiere un cálculo del área por debajo la curva.

La actividad del complemento se muestra en la Figura 9C. Todos los tres grupos muestran una disminución inicial de la actividad del complemento seguida de un aumento. A 72 horas, el grupo de aloperfusión tenía una actividad del complemento de un 382% (respecto al nivel de partida), las xenoperfusiones no transgénicas un 27% y las xenoperfusiones transgénicas un 88%. Se mostró una diferencia estadísticamente importante entre todos los grupos.

Se midieron los niveles de alanina transaminasa terminal de 51,4 unidades/L, 115 unidades/L y 128 unidades/L en aloperfusión, grupos no transgénicos y transgénicos, respectivamente. Aunque no hubo ninguna diferencia estadísticamente importante entre los grupos de xenoperfusión, el grupo de aloperfusión mostró niveles significativamente inferiores que cualquier grupo de xenoperfusión (p= 0,0005, 0,005). En todos los tres grupos, los niveles de fosfatasa alcalina disminuyó con el tiempo con xenoperfusiones transgénicas que mostraban unos niveles no transgénicos significativamente inferiores (39 unidades/litro frente a 28 unidades/litro a 72 horas) (p= 0,005). No es apropiado comparar la aloperfusión con las xenoperfusiones ya que el nivel de fosfatasa alcalina normal en sangre de porcino es dos veces el de la sangre humana.

En el grupo transgénico se apreció necrosis en todos los hígados. En tres hígados la necrosis era poco uniforme, lo que suponía un 10-30% de los hígados, en uno la necrosis era subcapsular, lo que suponía un 5% de los hígados y en uno había necrosis difusa, lo que suponía un 80% de los hígados. No pudo determinarse ningún modelo consistente de lesión hepática. Debido a la importante necrosis en uno de los hígados, no fue posible otro análisis histológico. En los cuatro hígados restantes, se apreció dilatación sinusoidal en 3, dilatación central en 2, y edema septal en uno. Hubo bilis espesada presente en los conductos de bilis intralobulares de todos los cuatro hígados. Hubo endotelitis presente en uno de los cuatro hígados. Existió hemorragia presente en los linfáticos de uno de los hígados. Hubo hipertrofia de células de Kupffer presente en todos los hígados con una importante tinción de Perl de hierro
intracelular.

En el grupo no transgénico se apreció hemorragia en todos los hígados, pero quedaba clara la necrosis fuera de las zonas hemorrágicas. La hemorragia implicó parénquima hepático en todos los hígados, lo que implicaba hemorragia septal y sinusoidal en cuatro hígados, mientras que era más destacada en la zona subcapsular en un hígado. Todos los hígados mostraron dilatación sinusoidal con glóbulos rojos retenidos en sinusoides, 2 hígados presentaban indicios de dilatación de la vena central, y cuatro de cinco hígados presentaban edema septal. Ninguno de los hígados tubo bilis espesada. Un hígado presentó una ligera endotelitis. Existió una muy ligera hipertrofia de células de Kupffer y una mínima tinción de Perl de hierro intracelular en 4 de cinco hígados.

En conjunto, sólo se apreció hemorragia sinusoidal y de tejido conjuntivo en los hígados no transgénicos. En estos hígados no transgénicos existía relativamente poca necrosis parenquimatosa o acumulación de hierro. En cambio, el grupo transgénico mostró necrosis coagulante más extensa que en los grupos no transgénicos de aloperfusión y el hierro de las células intra-Kupffer era más destacado. Lamentablemente, un análisis inmunohistoquímico de secciones congeladas de estos experimentos no fue interpretable.

Discusión

Los experimentos descritos en el Ejemplo 2 demuestran que la invención no es solamente eficaz en aloperfusión (tal como describe el Ejemplo 1) sino también en una xenoperfusión más exigente.

Estos experimentos dan clara prueba de que los hígados de porcino funcionan cuando son perfundidos con sangre humana. Hace mucho tiempo que se ha reconocido que el hígado está relativamente protegido de daños de anticuerpos preformados (Collins y otros, Trasplantation 1994; 58: 1162-1171), raramente se ha notificado un rechazo hiperagudo y el trasplante de hígado se realiza frecuentemente en presencia de una prueba cruzada de linfocitos positiva (Hathaway y otros, Trasplantation 1997; 64: 54-59; Goggins y otros, Trasplantation 1996; 62: 1794-1798).

Cualquier uso del término rechazo hiperagudo requiere definición; las apariencias histológicas de rechazo hiperagudo coinciden con las del rechazo vascular agudo (Platt, ASAIO. J. 1992; 38: 8-16). De este modo, el diagnóstico no requiere solamente aspectos histológicos característicos (microtrombosis y hemorragia) sino también la ausencia de función del órgano en cualquier momento.

En este estudio no se observó rechazo hiperagudo en xenoperfusiones transgénicas o no transgénicas. Esta protección del rechazo hiperagudo puede ser función del propio hígado o de la naturaleza no fisiológica del circuito de perfusión, en particular el limitado volumen de sangre (y los componentes del efector inmunológico) o el uso de heparina. En este contexto hay que indicar que el rechazo hiperagudo se ha mostrado en un modelo del corazón de xenoperfusión ex vivo heparinizado (Dunning y otros., Eur. J. Cardiothorac. Surg. 1994; 8: 204-206).

En un reciente estudio de xenoperfusiones de hígado de porcino ex vivo, la deposición de anticuerpos humanos y componentes del complemento en colaboración con la lesión del tejido se demostró en cuatro horas (Pascher y otros, Trasplantarion 1997; 64: 384-391). De este modo, aunque el hígado está protegido del rechazo hiperagudo, todavía es vulnerable a lesiones mediadas por anticuerpos. Intentos anteriores en la perfusión de hígados porcinos ex vivo en clínica han resultado en un fallo que se suponía que era mediado inmunológicamente (Abouna y otros, Br. J. Surg. 1968; 55: 862). Estas perfusiones se caracterizaron por una presión portal progresivamente creciente y un posterior fallo de perfusión. En cambio, en el presente estudio, tanto en xenoperfusiones transgénicas como no transgénicas las presiones de perfusión portal permanecieron dentro de los límites fisiológicos. La interpretación de la histología en este estudio se ha limitado por el diseño del experimento; sólo se obtuvieron muestras a la terminación del experimento, en cuyo momento se produjo una severa lesión hepática isquémica secundaria al descenso de hematocrito.

A pesar de la ausencia de rechazo hiperagudo en ambos grupos, está claro que la introducción del transgén hDAF tiene algunas consecuencias importantes. Existen importantes diferencias entre los hígados perfundidos transgénicos y no transgénicos respecto a las presiones portal y de la VCI, el flujo arterial, el mantenimiento ácido-base y la síntesis tanto de la urea como del complemento. Se supone por lo tanto que, aunque es insuficiente para destruir el hígado, la inmediata reacción inmunológica mediada por el complemento inició una lesión suficiente como para dañar la microcirculación y dañar la función metabólica y sintética. Puede argumentarse que es probable que este efecto, en un circuito cerrado con mecanismos efectores inmunológicos limitados, sea una subestimación del efecto que provocaría el tratamiento de un paciente en el que el hígado quedaría expuesto a un volumen circulante mucho mayor.

Considerando que respeto a los parámetros expuestos anteriormente los hígados transgénicos se comportaron de manera similar a los hígados aloperfundidos, el análisis de otros parámetros demostró un comportamiento similar entre ambos grupos xenoperfundidos e importantes diferencias del grupo aloperfundido. Éstas incluyen algunos parámetros hemodinámicos, flujo total y portal, niveles de potasio, producción de bilis y niveles de bilirrubina, niveles de transaminasa y consumo de oxígeno terminal. Un análisis de producción de bilis y niveles de bilirrubina puede ser complicado por las considerables diferencias en la descomposición de los glóbulos rojos y las sospechadas complicaciones de formación de barro biliar. También, la reducción de sales de bilis puede ser un factor adicional en la producción de bilis. De manera similar, los niveles de potasio pueden reflejar diferencias en la descomposición de los glóbulos rojos. El rendimiento de ambos grupos xenoperfundidos se deteriora hacia el final de los experimentos de 72 horas; esto se demuestra por los valores de consumo de oxígeno terminal.

Es probable que esto sea, por lo menos en parte, un reflejo de la disminución de hematocritos que conduce a una pérdida de la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre. Esto está relacionado con el mayor nivel de enzimas de transaminasa en estos experimentos lo que podría ser, por lo tanto, una manifestación de isquemia.

Un resultado inesperado de este estudio fue una progresiva reducción del hematocrito, que se percibe en las aloperfusiones, pero muy marcada en el grupo no transgénico y significativamente peor en el grupo transgénico. Aunque el daño mecánico está provocado por la bomba y el circuito (se notó que la hemólisis se producía cuando la sangre circulaba en el aparato de perfusión sin un hígado), esto explica una muy pequeña proporción de pérdida de glóbulos rojos. La mayor parte de la reducción de hematrocito en el grupo de aloperfusión puede explicarse por la dilución, la combinación de un repetido muestreo de sangre y una constante infusión de otros líquidos (prostaciclina, nutrición).

La estimación del hematocrito como porcentaje de imprimación, corrección para los efectos dilucionales, se traduce en valores de: aparato de perfusión solo (93,3%), aloperfusión (85,3%), xenoperfusión no transgénica (3,3%) y xenoperfusión transgénica (0,5%). La diferencia importante entre la aloperfusión y ambos grupos de xenoperfusión sugiere un importante efecto de etiología inmunológica. Se han hecho hipótesis sobre varios posibles mecanismos. Éstos incluyen el efecto de anticuerpos antihumanos porcinos eluidos del hígado o producidos por el mismo. Éstos podrían ser efectivos por opsonización (que da lugar a la eliminación de células de Kupffer) o lisis mediada por el complemento (humano o porcino). El complemento porcino podría activarse directamente a través de la trayectoria alternativa. Finalmente, el sistema retículo endotelial en el hígado podría extraer glóbulos rojos mediante el reconocimiento de diferencias específicas de la especie o bien por daños a los eritrocitos asociados a la bomba. La diferencia importante en los hematocritos terminales entre los grupos transgénicos y no transgénicos no se explica, si bien pueden relacionarse con la mejorada microcirculación en los hígados transgénicos.

Es probable que el efecto sea particularmente marcado en la situación artificial del circuito de perfusión aislado y, de hecho, un cálculo basado en el índice de pérdida de glóbulos rojos sugiere que podría requerirse una transfusión de sangre a razón de menos de una unidad por día si este sistema se emplease en el apoyo extracorporal de un paciente.

Aunque la interpretación inicial de los datos de estos experimentos sugeriría que los hígados xenoperfundidos no funcionan significativamente tan bien como los hígados aloperfundidos, un examen más riguroso sugiere que esto puede ser conducir a error. Es notable que la función del hígado, según se evalúa mediante esos parámetros no afectada directamente por la descomposición de los glóbulos rojos, se mantiene al mismo nivel en la xenoperfusiones (particularmente transgénicas) como en las aloperfusiones. En particular, esto se ilustra por medio de la síntesis del Factor V y los parámetros hemodinámicos. La medida de potasio, iones de hidrógeno, bilirrubina y urea están directamente afectados por la descomposición de los glóbulos rojos. También, los niveles del complemento representan un equilibrio entre la producción y el consumo; un nivel más elevado de consumo es inevitable en las xenoperfusiones.

Está claro que los hígados perfundidos proporcionan una función metabólica y son capaces de la normalización del potasio y el equilibrio ácido-base; éstas son características esenciales de una buena función del hígado tras un trasplante de hígado. Las funciones sintéticas del hígado, aunque potencialmente tienen algún beneficio, pueden ser problemáticas. La síntesis de elevados niveles de complemento porcino puede dar lugar a la lesión de tejidos humanos que no están protegidos por reguladores de complemento específicos de especies apropiadas. Sin embargo, datos preliminares de experimentos recientes sugieren que el suero de las xenoperfusiones no produce lisis de glóbulos rojos humanos frescos in vitro. Existe una potencial incompatibilidad entre las proteínas porcinas y el entorno humano (Lawson y otros, Trasplant. Proc. 1997; 29: 884-885; el Reverdiau-Moalic y otros, Trasplant. Proc. 1996; 28: 643-644). La actividad del Factor V en suero de cerdo normal se mantiene a un nivel cuatro veces el del suero humano cuando se mide utilizando un análisis funcional humano. No se conoce si esto dará lugar a anormalidades de coagulación en la situación clínica. Finalmente, existe alguna evidencia de que puede inducirse una respuesta del anticuerpo a las proteínas porcinas. Bajo ciertas circunstancias, esto puede dar lugar a un fenómeno autoinmunitario (Ortel y otros, Am. J. Hematol. 1994; 45: 128-135).

Estos experimentos demuestran que la perfusión de un hígado de porcino con sangre humana es compatible, por lo menos a medio plazo, con la función comparable a la obtenida utilizando sangre porcina. Existe alguna clara evidencia de un efecto beneficioso de la introducción del transgén hDAF.

Ejemplo 3 Soporte extracorporal de cerdos en lesión hepática aguda

Se indujo lesión hepática aguda en ocho cerdos no transgénicos mediante tratamiento previo con fenobarbitona oral durante 3 días, instilación de tetracloruro de carbono intragástrico y ligadura de la arteria hepática.

Se dejaron recuperar cuatro cerdos del anestésico. Los parámetros de la función hepática (urea y electrólitos, prueba de la función hepática, perfil de coagulación, gases sanguíneos arteriales y amoníaco en suero) se controlaron como lesión hepática aguda desarrollada. La lesión hepática se confirmó de biopsias hepáticas post-mortem.

Cuatro cerdos permanecieron bajo anestesia general durante 12-15 horas tras la ligadura de la arteria hepática antes de conectarse al circuito de perfusión extracorporal del hígado descrito anteriormente. Se controló el estado cardiovascular de la función hepática y los gases sanguíneos arteriales. En todos los cuatro experimentos la duración de la perfusión fue limitada por cuestiones técnicas. Se tomaron muestras post-mortem para evaluar el grado de daño hepático; se tomaron muestras de pulmón y riñón para buscar indicios de fenómenos embólicos secundarios a la perfusión.

Los cuatro cerdos no tratados con perfusión extracorporal del hígado sobrevivieron durante 15,5 \pm 5,2 horas. La lesión hepática aguda se desarrolló en todos los cuatro cerdos: se produjeron aumentos masivos de enzimas hepáticos y una importante elevación de los niveles de amoníaco. La histología demostró una necrosis hepatocelular confluente casi sin quedar ninguna célula del hígado viable.

Los cuatro cerdos tratados con soporte extracorporal al hígado sobrevivieron durante 31, 33, 35 y 52 horas (37,8 \pm 9,6 horas), significativamente más que los cerdos no tratados (p <0,005).

El oxigenador falló después de 24 horas en las primeras dos perfusiones. En las dos perfusiones restantes, para las cuales se utilizó un tipo diferente de oxigenador, un fallo ventilatorio secundario a un taponamiento mucoso en los cerdos necesitó la interrupción de la perfusión del hígado después de 22 y 37 horas de perfusión.

Inmediatamente antes de empezar la perfusión del hígado los cerdos estaban moribundos, con taquicardia extrema (160 \pm 0 latidos por minuto), hipotensión (80/42,5 \pm 0/3,5 mmHg) y acidosis metabólica (pH medio 7,20 \pm 0,12). Tras una hora de perfusión extracorporal del hígado, la acidosis se invirtió, volviendo a un margen fisiológico (pH 7,36 \pm 0,08), y la taquicardia mejoró (127,5 \pm 3,5 latidos por minuto).

Después de detener la perfusión, ambos cerdos se deterioraron rápidamente y murieron en una hora (Figura 10).

TABLA 1

Datos hemodinámicos
	Aloperfusión	No transgénico	Transgénico
	(s. d.)	(s. d.)	(s. d.)
Flujo total (L/min)	2,01 (0,12)	1,80 (0,27)	1,88 (0,20)
Flujo portal (L/min)	1,75 (0,18)	1,60 (0,24)	1,58 (0,22)
Flujo arterial hepático (mm Hg)	0,237 (0,054)	0,229 (0,094)	0,296 (0,065)
Presión de la VCI (mm Hg)	2,20 (1,04)	2,91 (0,86)	1,64 (0,80)
Presión total (mm Hg)	7,08 (1,2)	11,4 (2,9)	7,23 (2,1)
Presión arterial (mm Hg)	90,3 (2,6)	87,0 (4,1)	89,4 (3,8)

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TABLA 2

Importancia estadística de los datos hemodinámicos
	Aloperfusión frente	Aloperfusión frente	No transgénico
	a no transgénico	a transgénico	frente a transgénico
Flujo total	0,05	0,05	NS
Flujo portal	0,025	0,025	NS
Flujo arterial	NS	NS	0,05
Presión de la VCI	NS	NS	0,05
Presión arterial	NS	NS	NS
Presión portal	0,01	NS	0,01

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TABLA 3

Consumo de Oxígeno (ml O_{2}/min)
	Aloperfusión	No transgénico	Transgénico
5 Minutos	19,1	35,7	42,5
Nivel valle	7,01	10,8	18,8
Nivel terminal	7,01	38,6	64,6

Claims (21)

1. Procedimiento de perfusión extracorporal de un órgano de mamífero, siendo el órgano distinto de un corazón al que se le deja latir, cuyo procedimiento incluye bombear flujo de entrada de sangre arterial al órgano para mantener la presión fisiológica y flujo variable en la arteria del órgano y bombear flujo de salida venoso desde el órgano para mantener la presión fisiológica en la vena de salida del órgano, mientras se permite que el órgano autorregule el flujo sanguíneo a través de sí mismo para conseguir un flujo arterial fisiológico.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el órgano se selecciona del grupo que consiste en hígado, riñón, páncreas e intestino delgado.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que el órgano es un hígado y el procedimiento incluye regular el flujo de la vena portal y bombear flujo de salida de sangre desde el hígado para mantener la presión fisiológica en la vena cava del hígado, mientras se permite que el hígado autorregule la presión portal.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por el hecho de que incluye recoger el fluido que se pierde del hígado y recircular el fluido recogido de nuevo hacia el hígado.

5. Procedimiento para mantener la viabilidad de un órgano de mamífero, en cuyo procedimiento el órgano es perfundido de acuerdo con el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Procedimiento según la reivindicación 4, que comprende mantener la viabilidad del órgano durante por lo menos aproximadamente 72 horas.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado por el hecho de que el órgano es un hígado.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por el hecho de que el hígado es porcino.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado por el hecho de que el hígado de porcino se modifica genéticamente para expresar proteína humana.

10. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por el hecho de que el hígado es humano.

11. Aparato de perfusión de hígados mamíferos que, al conectarlo a la vena cava, la arteria hepática y la vena portal de un hígado de mamífero, proporciona un circuito de fluido para el flujo sanguíneo a través del hígado, en cuyo circuito existe un canal de salida para la conexión a la vena cava, una bomba de salida de velocidad regulable para mantener la presión fisiológica en la vena cava, un oxigenador y un intercambiador de calor, y un canal de bifurcación que divide el circuito en canales de entrada para la conexión a la arteria hepática y la vena portal, comprendiendo el circuito, además, un dispositivo para mantener la presión fisiológica en la arteria hepática y el flujo fisiológico en la vena portal mientras permite que un hígado, cuando se conecta al aparato, autorregule el flujo sanguíneo a través de la arteria y autorregule la presión en la vena portal.

12. Aparato según la reivindicación 11, caracterizado por el hecho de que dicho dispositivo incluye un recipiente para la recogida de exceso de sangre que resulta de la autorregulación por el hígado de flujo en la arteria hepática.

13. Aparato según la reivindicación 12, caracterizado por el hecho de que el recipiente es para el suministro de sangre al canal de entrada para la conexión a la vena portal de un hígado.

14. Aparato según la reivindicación 13, caracterizado por el hecho de que el recipiente es para el suministro de sangre bajo la fuerza de gravedad a la vena portal de un hígado cuando se conecta al aparato.

15. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que incluye un canal para recoger el fluido que se pierde del hígado y transferir el fluido recogido al recipiente.

16. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, que incluye conexiones parar unir la circulación de un mamífero al circuito.

17. Procedimiento para el accionamiento de un aparato de perfusión de hígado de mamífero según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 conectado a la vena cava, la arteria hepática y la vena portal de un hígado de mamífero y proporcionar un circuito de fluido para el flujo sanguíneo a través del hígado, incluyendo el procedimiento regular la velocidad de la bomba de salida para mantener la presión fisiológica en la vena cava, regular la presión del canal de entrada conectado a la arteria hepática para mantener la presión fisiológica en la arteria hepática y regular el flujo en el canal de entrada conectado a la vena portal para mantener el flujo fisiológico en la vena portal, y permitir que el hígado autorregule el flujo sanguíneo a través de la arteria y autorregule la presión en la vena portal.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado por el hecho de que el hígado es de porcino.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado por el hecho de que el hígado de porcino se modifica genéticamente para expresar proteína humana.

20. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado por el hecho de que el hígado es humano.

21. Aparato de perfusión de órganos de mamíferos apropiado para la perfusión de un órgano de mamífero seleccionado del grupo que consiste en hígado, riñón, páncreas e intestino delgado y que, el conectarse a la arteria de entrada y la vena de salida de un órgano de mamífero seleccionado de dicho grupo proporciona un circuito de fluido para el flujo sanguíneo a través del órgano, en cuyo circuito existe un canal de salida para la conexión a la vena de salida del órgano, una bomba de salida de velocidad regulable para mantener la presión fisiológica en la vena de salida del órgano, un oxigenador y un intercambiador de calor, y un canal de entrada para la conexión a una arteria de entrada del órgano, comprendiendo el circuito, además, un dispositivo para mantener la presión fisiológica y el flujo variable en la arteria de entrada del órgano mientras se permite que el órgano autorregule el flujo sanguíneo a través de sí mismo para conseguir el flujo arterial fisiológico.