KR20210150471A

KR20210150471A - 아데노신을 캡슐화하는 리포솜

Info

Publication number: KR20210150471A
Application number: KR1020217036044A
Authority: KR
Inventors: 시데쉬 알. 앵글; 카르멘 코르시울로; 브루스 엔. 크론스테인; 조나단 코프먼
Original assignee: 뉴욕 유니버시티
Priority date: 2019-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2021-12-10
Also published as: CA3136121A1; EP3946368A1; US20230240990A1; US11607386B2; CN114302709A; US20220168223A1; WO2020206314A8; WO2020206314A1; AU2020253613A1; JP2022526417A; EP3946368A4; IL286910A

Abstract

아데노신을 캡슐화하는 리포솜이 제공된다. 리포솜은 스핑고미엘린 또는 스핑고미엘린과 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)의 조합 또는 스핑고미엘린과 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포릴글리세롤(DMPG)의 조합 또는 스핑고미엘린, DMPG 및 DMPC의 조합으로부터 형성될 수 있다. 아데노신을 캡슐화하는 리포솜은 연골 재생을 유도하고/하거나, 골관절염을 치료하고/하거나, 관절 통증을 완화하고/하거나 골관절염과 관련된 진행성 구조적 조직 손상을 둔화, 저지 및/또는 역전시키거나 골관절염, 류마티스 관절염, 급성 통풍 관절염 및/또는 활막염을 치료하는 데 사용될 수 있다. 상기 리포솜은 최대 2주 동안 아데노신을 방출할 수 있다.

Description

아데노신을 캡슐화하는 리포솜

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2019년 4월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/828,916호에 대한 우선권을 주장하며, 그 개시내용은 본원에 포함된다.

골관절염(OA)은 연골 손실과 가장 흔한 유형의 관절염을 특징으로 하는 질병으로, 미국 및 기타 선진국 인구의 거의 10%를 포함하여, 전 세계적으로 1억 5,100만 명의 사람들에게 영향을 미치고 있다. 나이, 과거 외상, 비만 및 유전학(genetics)은 이러한 퇴행성 관절 질환을 발달시키는 위험 요소 중 하나이다. 골관절염의 발병률은 나이가 들수록 증가하고, 그로 인한 통증, 관절 기능 및 이동성(mobility) 상실, 사회적 고립, 및 광범위하게 감소된 삶의 질은 골관절염을 의학적 및 사회적 영향이 큰 병태로 만든다. 골관절염은 모든 관절에 영향을 미칠 수 있지만, 가장 일반적으로 무릎, 엉덩이 및 손에 영향을 미친다. 골관절염의 유병률은 여성(47%)과 남성(40%) 모두 무릎 관절에서 가장 높다. 현재의 치료 옵션은 최적이 아니며 근본적인 문제를 해결하지 못한다. 치료는 비스테로이드성 항염증 약물(예를 들어 이부프로펜), 마약성 진통제, 운동 및 침술의 사용을 포함하여 대부분 완화적이다. FDA는 또한 관절 내(IA) 주사를 통해 전달되는 코르티코스테로이드(항염증제) 및 히알루론산(윤활, 통증 완화)을 포함한 골관절염-특이적 치료법을 승인했다. 이러한 주사제는 증상 완화를 제공하지만, 회복시키는 것은 없다.

퓨린성 시스템은 연골 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. A2A 수용체(A2AR)에서 작용하는 아데노신은 연골세포와 연골 균형을 유지하는 중요한 자가분비 항상성 인자이다. 아데노신은 내생적으로 생성되는 생리학적 조절제로, 이의 세포내 및 세포외 농도는 산소 소비, 세포 스트레스 및 미토콘드리아 기능에 의해 엄격하게 제어된다. 세포외 아데노신은 주로 ATP의 가수분해(주로, 그러나 비배타적으로, 외부효소 CD39 및 CD73에 의한)에서 유래하고, G-단백질-결합 수용체(A1R, A2AR, A2BR 및 A3R)의 활성화를 통해 그 효과를 매개한다. 이러한 아데노신 수용체는 진화적으로 고도로 보존되어 있으며, 이의 발현과 기능도 보존되는 경향이 있다. 아데노신은 염증과 면역 반응을 조절하는 것으로 오랫동안 알려져 왔으며, 이전 연구에서는 조골세포, 파골세포, 및 골수 항상성에서 아데노신과 그 수용체의 중요성이 입증되었다. 이전 연구에서는 아데노신 수용체가, 관련된 특정 수용체(들)가 식별되지 않았지만, 설치류, 말, 소 및 인간 연골세포의 염증 자극에 대한 반응으로 연골세포 생리학 및 병리학도 조절한다고 시사하였다. 내인성 아데노신의 제거(아데노신 디아미나제 첨가에 의한) 또는 A2AR의 차단은 말 연골 외식편에서 연골 퇴행으로 이어지지만, 말 퓨린 대사는 대부분의 종의 림프구, 혈장 및 세포외액에 존재하는 아데노신 디아미나제가 말 림프구 또는 혈청에 존재하지 않기 때문에 다른 종의 대사와 다르다. A3R 자극은 주로 A3R 작용제의 항염증 효과로 인해 화학적으로 유도된 골관절염 모델에서 골관절염 발병을 감소시키는 것으로 보고되었다. 그러나 아데노신의 반감기는 몇 초에 불과하다.

본 발명은 주사용 제형을 제공한다. 또한, 주사용 제형의 제조 및 사용 방법이 개시되어 있다. 주사용 제형은 리포솜과 염수(saline)를 포함하며, 여기서 리포솜은 준안정성(metastable)이고 아데노신을 캡슐화한다.

본 발명의 특징 및 목적을 충분히 이해하기 위해, 첨부된 도면과 함께 취해진 다음의 상세한 설명을 참조해야 한다.
도 1은 RgnA09로부터 형성된 리포솜의 아데노신 보유율을 도시한 것이다.
도 2는 RgnA09로부터 형성된 리포솜 현탁액의 현미경 이미지를 도시한 것이다.
도 3은 RgnA09로부터 형성된 리포솜의 대략적인 직경의 히스토그램을 도시한 것이다.
도 4는 RgnA10으로부터 형성된 리포솜의 아데노신 보유율을 도시한 것이다.
도 5는 RgnA10으로부터 형성된 리포솜 현탁액의 현미경 이미지를 도시한 것이다.
도 6은 RgnA10으로부터 형성된 리포솜의 대략적인 직경의 히스토그램을 도시한 것이다.
도 7은 프리-리포솜 동결건조물 (pre-liposomal lyophilate)을 보여준다.
도 8은 종래 기술의 리포솜 현탁액의 현미경 이미지를 도시한 것이다. 리포솜 현탁액은 상당한 결정화 아데노신의 증거를 포함하며 구형 물체는 오일인 것으로 여겨진다.
도 9는 인캐패시턴스 테스트(incapacitance test)를 사용하여 기록된 통증 데이터를 도시한 것이다.
도 10은 실시예 1에서 단리된 물질의 HPLC 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 11은 도 10에서 단리된 물질의 UV 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 12는 RgnA09 및 RgnA10의 초기 일시 방출을 도시한 것이다.
도 13은 (좌) RgnA09-MLV 및 (우) RgnA10-MLV로부터 24시간에 걸친 아데노신의 방출 동역학을 도시한 것이다.
도 14는 (좌) RgnA09 및 (우) RgnA10을 사용한 60일(6회 주사 후)의 로타로드 통증 시험(rotarod pain test)을 도시한 것이다.
도 15는 6회 주사에 걸쳐 다양한 농도에서 관절 염증에 대한 (A) RgnA09 및 (B) RgnA10의 효과를 도시한 것이다. 투여는 동측 - 대측이었다. 통계: 일원(브라운-포사이스(Brown-Forsythe) 및 웰치(Welch)) 분산분석(ANOVA). 비히클에 대해 ^*P<0.05, 염수에 대해 †P<0.05, 0.3 mg 및 1 mg에 대해 +P<0.05.
도 16은 비히클 또는 3가지 용량의 리포솜 아데노신으로 처리한 후 영향을 받은 래트 경골의 대표적인 사프라닌 O-염색 섹션을 보여준다. 비히클로 처리된 동물에서는 연골 프로테오글리칸의 현저한 감소와 연골 표면의 불규칙성이 있었다. 표면 연골 증가와 함께 RgnA09로 처리된 래트에서 연골 프로테오글리칸의 용량 의존적 개선과 연골의 마모(fraying) 감소가 있었다. RgnA10으로 처리된 래트에서 효과는 연구된 최고 용량(3 mg/ml)으로 처리된 래트의 연골에서 가장 강력했지만, 낮은 복용량에서도 연골의 보존이 관찰되었다.

청구된 주제가 특정 구현예의 관점에서 설명될 수 있지만, 본 명세서에 제시된 모든 이익 및 특징을 제공하지 않은 구현예를 포함하는 다른 구현예도 본 발명의 범위 내에 있다. 다양한 구조, 논리, 및 프로세스 단계 변경은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.

본 명세서에 제공된 모든 범위는, 달리 지시되지 않는 한, 십분의 일 소수점 자리까지의 범위에 속하는 모든 값을 포함한다.

본 발명은 주사용 제형을 제공한다. 또한, 주사용 제형의 제조 및 사용 방법이 개시되어 있다.

일 측면에서, 본 발명은 리포솜 및 염수를 포함하는 주사용 제형을 제공하며, 여기서 리포솜은 아데노신을 캡슐화한다.

리포솜은 i) 스핑고미엘린 또는 ii) 스핑고미엘린 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC) 또는 iii) 스핑고미엘린과 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포릴글리세롤(DMPG)의 조합 또는 iv) 스핑고미엘린, DMPG 및 DMPC의 조합을 포함할 수 있다. 다양한 예에서, 리포솜은 70 내지 100 질량%의 스핑고미엘린을 포함한다. 100 질량% 미만의 스핑고미엘린을 포함하는 리포솜은 30 질량% 이하의(예를 들어, 나머지) DMPC 또는 DMPG 또는 DMPC와 DMPG의 조합을 함께 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 리포솜은 70 내지 99.9 질량%의 스핑고미엘린 및 0.1 내지 30 질량%의(예를 들어, 나머지) DMPC 또는 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포릴글리세롤(DMPG) 또는 DMPC와 DMPG의 조합을 함께 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 리포솜은 75 내지 100 질량%의 스핑고미엘린을 포함한다. 100 질량% 미만의 스핑고미엘린을 포함하는 리포솜은 25 질량% 이하의(예를 들어, 나머지) DMPC 또는 DMPG 또는 DMPC 및 DMPG를 함께 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 리포솜은 75 내지 99.9 질량%의 스핑고미엘린 및 0.1 내지 25 질량%의(예를 들어, 나머지) DMPC 또는 DMPG 또는 DMPC 및 DMPG를 함께 포함한다. 예를 들어, 리포솜은 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 및 99.9 질량%의 스핑고미엘린을 포함할 수 있고, 나머지는 DMPC, DMPG 또는 이들의 조합이다. 질량%는 인지질의 총 질량을 기준으로 한다.

리포솜은 직경 및/또는 평균 직경이 50 nm 내지 150 μm일 수 있으며, 상기 범위는 그 사이의 모든 0.1 nm 값 및 범위(예를 들어, 50 nm 내지 1 μm, 50 nm 내지 750 μm, 50 내지 500 nm, 50 내지 250 nm, 50 내지 100 nm, 100 nm 내지 1 μm, 100 내지 750 nm, 100 내지 500 nm, 100 내지 250 nm, 1 내지 150 μm, 1 내지 100 μm, 1 내지 50 μm, 1 내지 40 μm, 1 내지 30 μm, 1 내지 25 μm, 1 내지 20 μm, 1 내지 10 μm, 1 내지 5 μm)를 포함한다. 예를 들어, 리포솜은 직경 및/또는 평균 직경이 50 nm, 75 nm, 100 nm, 250 nm, 500 nm, 1 μm, 10 μm, 25 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 75 μm, or 100 μm일 수 있다. 일 구현예에서, 리포솜의 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 96, 적어도 97, 적어도 98, 적어도 99, 적어도 99.9, 또는 100%는 직경이 50 nm 내지 1 μm, 50 nm 내지 750 μm, 50 내지 500 nm, 50 내지 250 nm, 50 내지 100 nm, 100 nm 내지 1 μm, 100 내지 750 nm, 100 내지 500 nm, 100 내지 250 nm, 1 내지 150 μm, 1 내지 100 μm, 1 내지 50 μm, 1 내지 40 μm, 1 내지 30 μm, 1 내지 25 μm, 1 내지 20 μm, 1 내지 10 μm, 1 내지 5 μm의 범위이다. 일 구현예에서, 150 μm 초과의 직경을 갖는 리포솜은 없다. 일 구현예에서, 리포솜의 1% 미만은 직경이 150 μm 초과이다. 다양한 구현예에서, 리포솜은 에탄올 주입 방법에 의해 생성될 수 있고, 생성된 리포솜은 다른 방법에 의해 형성된 리포솜보다 작을 수 있다.

아데노신의 방출 이전에, 본 발명의 리포솜은 준안정성일 수 있다. 준안정 리포솜은 전달 부위에서 더 큰 안정성으로 인해 향상된 전달을 제공한다. 준안정 리포솜은 a) 1이 아닌 상대 직경을 가지며(예를 들어, 준안정 리포솜은 완전한 원형 또는 구형 모양을 갖지 않음); b) 막 휨(membrane bending)과 관련된 팽창 응력이 구조적 평형을 향한 리포솜의 경향을 극복할 만큼 충분히 강하지 않을 정도로 충분히 크며; c) 그 사이의 모든 0.1 nm 값 및 범위를 포함하여, 100 nm 내지 150 μm의 가장 긴 선형 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 이러한 리포솜은 그 사이의 모든 0.1℃ 값 및 범위(예를 들어, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45℃)를 포함하여 35 내지 45℃의 온도(예를 들어, 약 40℃ (또는 40℃보다 약간 더 높은 온도))에 (예를 들어, 그 온도를 갖는 저장소와 접촉하여) 노출될 때 더 작은 안정한 형태로 붕괴(예를 들어, 압축 또는 수축)된다. 일 구현예에서, 보다 작은 안정한 리포솜은 50 nm 내지 110 μm의 가장 긴 선형 치수(예를 들어, 직경)를 가지며, 상기 범위는 이들 사이의 모든 0.1 nm 값 및 범위를 포함한다. 또한, 리포솜을 형성하는 하나 이상의 지질의 겔-유체 상 전이를 능가하는 온도로 가열한 후 리포솜에 의해 둘러싸인 부피에 대한 25℃에서 리포솜에 의해 둘러싸인 부피의 비율은 10보다 크다. 친수성 제제를 함유하는 준안정 리포솜은 그 사이의 모든 0.1℃ 값 및 범위(예를 들어, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45℃)를 포함하는 35 내지 45℃(예를 들어, 대략 40℃)에서 붕괴되어 이러한 붕괴(예를 들어, 수축 또는 압축) 시 페이로드(예를 들어, 아데노신)를 방출(예를 들어, 점진적으로 방출)할 수 있다. 준안정 리포솜은 미국 특허 공개 번호 제2016/0263031호에 기재되어 있다(관련 부분은 본원에 참고로 포함됨). 준안정 리포솜은 간단히 리포솜이라고 할 수 있다.

리포솜은 하나 이상의 부형제와 함께 제형화될 수 있다. 제형은 주사용 적용을 위한 액체 또는 겔, 바람직하게는 액체의 형태일 수 있다.

리포솜은 생리학적 pH에서 중성, 음이온성 또는 양이온성일 수 있는 하나 이상의 지질로 형성된다. 지질 유형의 예는 콜레스테롤, 인지질, 리소지질, 리소인지질, 스핑고지질 또는 페길화(PEGylated) 지질과 같은 스테롤 및 지질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 인지질의 탄소 사슬 길이는 C₁₀ 내지 C₂₂ 길이이다. 일 구현예에서, 인지질의 탄소 사슬 길이는 C₁₄ 내지 C₂₀이다. 적합한 지질은 포스파티딜콜린(PC)(예를 들어 계란 PC, 대두 PC) 및 포스파티딜글리세롤을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 포스파티딜콜린의 예는, 예를 들어, 1,2-디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일 포스파티딜콜린(DSPC), 1,2-디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC), 및 1,2-디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC)을 포함한다. 다양한 포스파티딜글리세롤이 사용될 수 있다. 포스파티딜글리세롤의 비제한적인 예는 1,2-디올레오일 포스파티딜글리세롤(DOPG), 1,2-디스테아로일 포스파티딜글리세롤(DSPG), 1,2-디팔미토일 포스파티딜글리세롤(DPPG), 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포릴글리세롤(DMPG)을 포함한다.

일 구현예에서, 인지질은 스핑고미엘린, 또는 DMPC 또는 DMPG, 또는 이들의 조합을 포함한 스핑고미엘린이다. 총 지질 농도는 그 사이의 모든 0.01 mg/mL 값 및 범위를 포함하여 7 내지 12 mg/mL일 수 있다. 일 구현예에서, 총 지질 농도는 8 내지 10 mg/mL이다. 일 구현예에서, 총 지질 농도는 8 mg/mL 또는 10 mg/mL이다. 리포솜이 스핑고미엘린, DMPC, 및 DMPG를 포함하는 구현예에서, DMPC 대 DMPG의 비율은 6:4 내지 8:2이다. 일 구현예에서, DMPC 대 DMPG의 비율은 7:3이다.

리포솜에는 수성 구획이 있다. 수성 구획에는 물과 아데노신이 포함될 수 있다. 아데노신의 농도는 그 사이의 모든 0.01 mg/mL 값 및 범위를 포함하여 0.1 내지 7 mg/mL일 수 있다. 일 구현예에서, 아데노신의 농도는 0.1 내지 4 mg/mL일 수 있다. 일 구현예에서, 아데노신의 농도는 3 mg/mL이다.

준안정 리포솜을 제조하는 방법이 본 명세서에 설명되어 있다. 일 구현예에서, 탈수된 준안정 리포솜은 2:1 mg 인지질 대 mL 물/TBA의 비율로 물/3급-부틸 알코올(TBA) 공용매 시스템에서 인지질, 바람직하게는 스핑고미엘린의 균질한 분산액으로부터 제조된다. 다양한 비율의 물 대 TBA가 사용될 수 있다(예를 들어, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 9:2, 7:2, 5:2, 3:2, 10:3, 8:3, 7:3, 5:3(물:TBA)). 리포솜의 등방성 단상 용액을 동결 건조하여 멸균 바이알에 탈수된 리포솜 분말을 생성한다. 동결 건조 단계는 바이알에서 물과 TBA를 모두 제거한 후 빈 지질 소포 또는 탈수된 리포솜을 남긴다. 물, 생리 식염수 또는 PBS와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가하면, 동결건조된 제품이 자발적으로 크고 준안정적인 리포솜 분산액을 형성한다. TBA에 대한 지질의 비율은 생성된 리포솜 제제의 크기 및 다분산성에 영향을 미치는 중요한 요소이다.

일 구현예에서, 탈수된 준안정 리포솜, 예를 들어, RgnA09는 TBA에 대한 물의 부피비가 1:1인 TBA/물 공용매 시스템에서 복수의 인지질의 분산액을 포함하는 용액으로부터 제조된다. 예를 들어, 인지질 100 mg을 포함하는 용액의 경우, 1:1 부피비의 TBA:물 공용매 시스템 1 내지 50 mL(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 40, 또는 50 mL)가 사용된다. 복수의 인지질은 75% 스핑고미엘린(질량 기준) 및 25% PC/PG 혼합물(질량 기준)의 혼합물일 수 있으며, 여기서 PC/PG 혼합물은 70%(질량 기준) DMPC 및 30%(질량 기준) DMPG(예를 들어, 스핑고미엘린 및 PC/PG 혼합물을 포함하는 전체 복수의 인지질 중, 복수의 인지질 중 70%(질량 기준)는 스핑고미엘린이고, 복수의 인지질 중 17.5%(질량 기준)는 DMPC이고, 7.5%(질량 기준)는 DMPG임)를 포함한다. 복수의 인지질을 포함하는 생성된 용액을 동결 건조하여 멸균 바이알에서 탈수된 리포솜 분말을 생성한다. 이어서, 동결건조물(예를 들어, 탈수된 리포솜 분말)은 아데노신을 포함하는 용액으로 재수화될 수 있다(예를 들어, 100 mg 인지질의 경우, 아데노신을 포함하는 수용액 10 mL(예를 들어, 아데노신을 포함하는 염수 용액, 여기서 아데노신의 농도는 0.1 내지 7 mg/mL(예를 들어, 3 mg/mL)가 동결건조물을 재수화하는 데 사용됨).

일 구현예에서, 탈수된 준안정 리포솜, 예를 들어, RgnA10은 TBA에 대한 물의 부피비가 3:2인 TBA/물 공용매 시스템에서 인지질의 분산액을 포함하는 용액으로부터 제조된다. 예를 들어, 인지질 100mg을 포함하는 용액의 경우, 3:2 부피비의 물:TBA 공용매 시스템 1 내지 50 mL(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 40, 또는 50 mL)가 사용된다. 인지질은 스핑고미엘린일 수 있다. 인지질을 포함하는 생성된 용액은 멸균 바이알에서 탈수된 리포솜 분말을 생성하기 위해 동결 건조된다. 이어서, 동결건조물(예를 들어, 탈수된 리포솜 분말)은 아데노신을 포함하는 용액으로 재수화될 수 있다(예를 들어, 100 mg 인지질의 경우, 아데노신을 포함하는 수용액 10 mL(예를 들어, 아데노신을 포함하는 염수 용액, 여기서 아데노신의 농도는 0.1 내지 7 mg/mL(예를 들어, 3 mg/mL)가 동결건조물을 재수화하는 데 사용됨).

다양한 방법을 사용하여 본 발명의 리포솜을 제조할 수 있다. 예를 들어, 제조 방법에는 에멀젼법, 역상 증발법, 세제 고갈법(detergent depletion method) 및 에탄올 주입법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 다양한 다른 방법이 당 업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 범위 내에 포함된다.

리포솜-아데노신 현탁액은 본 발명의 방법에 의해 제조될 수 있다. 탈수된 리포솜 분말은 아데노신 용액을 첨가하여 수화된 후 혼합된다. 예를 들어, 아데노신 용액 10mL(예를 들어, 염수(예를 들어, 0.9 질량% 염화나트륨(물 1 mL당 NaCl 9 mg) 중 3 mg/mL의 아데노신 용액)을 탈수된 리포솜 분말 100 mg을 함유하는 바이알에 첨가한다. 아데노신을 포함하는 생성된 리포솜은 다중라멜라일 수 있다. 아데노신을 포함하는 리포솜은 그 사이의 모든 0.1 nm 값 및 범위(예를 들어, 50 nm 내지 1 μm, 50 nm 내지 750 μm, 50 내지 500 nm, 50 내지 250 nm, 50 내지 100 nm, 100 nm 내지 1 μm, 100 내지 750 nm, 100 내지 500 nm, 100 내지 250 nm, 1 내지 150 μm, 1 내지 100 μm, 1 내지 50 μm, 1 내지 40 μm, 1 내지 30 μm, 1 내지 25 μm, 1 내지 20 μm, 1 내지 10 μm, 1 내지 5 μm)를 포함하여 50 nm 내지 150 μm의 가장 긴 선형 치수(예를 들어, 직경)를 가질 수 있다.

선택되는 투여량은 원하는 치료학적 효과, 투여 경로, 및 원하는 치료의 지속기간에 따라 달라진다. 일반적으로 매일 0.001 내지 10 mg/kg 체중의 투여량 수준이 포유동물(예를 들어, 개체)에게 투여된다. 일반적으로, 정맥내 주사 또는 주입의 경우, 투여량은 더 낮아질 수 있다.

조성물은 또한 경구, 비경구(근육내, 복강내, 정맥내(IV) 또는 피하 주사), 경피(수동적으로 또는 이온삼투요법 또는 전기천공을 사용하여), 또는 경점막(비강, 질, 직장 또는 설하) 투여 경로에 의해 투여될 수 있으며, 각 투여 경로에 적합한 투여형으로 제형화될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 제형은 개체의 관절 내에 직접 주사된다.

본 발명의 아데노신을 함유하는 준안정 리포솜은 몇 가지 이점을 갖는다. 예를 들어, 준안정 리포솜은 아데노신의 방출을 늦추므로 전달된 아데노신의 생물학적 활성을 연장시키고/시키거나 필요한 투여량을 감소시킨다.

준안정 리포솜 제형의 상이한 크기 투여 단위가 사용될 수 있다. 탈수된 준안정 프리-리포솜 동결건조물의 건조 분말 또는 아데노신 또는 기타 친수성 활성제의 수용액을 함유하는 투여 단위는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 용기에서 재구성될 수 있다. 바람직하게는, 약제학적으로 허용되는 담체는 수성 담체이다. 투여 단위의 적합한 양은 0.1 내지 1 mg, 1 내지 3 mg, 3 내지 10 mg, 10 내지 20 mg 및 20 내지 50 mg을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 투여 단위의 적합한 농도는 0.05 mg/mL 내지 10 mg/mL, 바람직하게는 0.05 mg/mL 내지 5 mg/mL, 더욱 바람직하게는 0.05 mg/mL 내지 3.5 mg/mL를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 주사용 제형은 연골 재생을 유도하고/하거나, 골관절염을 치료하고/하거나, 관절 통증을 완화하고/하거나 치료를 필요로 하는 개체에서 골관절염과 관련된 진행성 구조적 조직 손상을 둔화, 저지 및/또는 역전시키는 데 사용될 수 있다. 일 예로, 개체는 골관절염, 류마티스 관절염, 급성 통풍 관절염 및/또는 활막염을 갖거나 가질 것으로 의심될 수 있다. 연골 재생을 유도하고/하거나, 골관절염을 치료하고/하거나, 관절 통증을 완화하고/하거나 치료를 필요로 하는 개체에서 골관절염과 관련된 진행성 구조적 조직 손상을 둔화, 저지 및/또는 역전시키는 방법은 치료를 필요로 하는 개체에게 본 발명의 주사용 제형을 투여하는 것을 포함한다.

다양한 구현예에서, 개체는 인간 또는 비인간 포유동물이다. 비인간 포유동물의 예에는 소, 돼지, 양 등과 같은 농업용 동물(예를 들어, 농장 동물), 뿐만 아니라 말, 개, 고양이 등과 같은 애완동물, 도우미 동물 또는 스포츠 동물이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 개체의 추가적인 비제한적인 예는 토끼, 래트 및 마우스를 포함한다.

치료가 필요한 개체에게 투여되면, 최대 2주 동안 리포솜에서 아데노신이 방출된다. 일 구현예에서, 주사용 제형의 투여 후, 아데노신은 개체에게 투여한 지 1초 내지 1시간(예를 들어, 1분 내지 1시간) 내에 리포솜에서 방출된다. 일 구현예에서, 아데노신의 적어도 일부(예를 들어, 아데노신의 1 내지 20%)는 개체에게 투여한 지 1분 내지 1시간 이내에 리포솜에서 방출된다. 일 구현예에서, 아데노신의 적어도 일부(예를 들어, 아데노신의 1 내지 20%)는 개체에게 투여한 지 1초, 5초, 10초, 20초, 30초, 40초, 50초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 또는 10분 이내에 방출된다.

주사용 제형은 관절내 주사를 통해 개체의 관절에 투여될 수 있다. 주사용 제형은 1회 이상 주사로 투여될 수 있다. 상기 제형은, 예를 들어, 10일마다 또는 그 이상마다 한 번과 같이 여러 번(예를 들어, 최대 10회) 투여될 수 있다.

본 명세서에 개시된 다양한 구현예 및 실시예에 기재된 방법의 단계는 본 발명의 방법을 수행하기에 충분하다. 따라서, 일 구현예에서, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 방법의 단계의 조합으로 본질적으로 구성된다. 일 구현예에서, 상기 방법은 이러한 단계들로 구성된다.

진술은 본 발명의 다양한 비제한적 예를 설명한다:

진술 1. 염수 및 하나 이상의 리포솜을 포함하는 제형(예를 들어, 주사용 제형)으로서, 하나 이상의 리포솜은 하나 이상의 라멜라(예를 들어, 하나 이상의 다중라멜라 리포솜)를 포함하고, 상기 리포솜 라멜라는 70 내지 100 질량% 스핑고미엘린을 포함하고, 스핑고미엘린이 100 질량% 미만인 경우, 나머지는 (예를 들어, 30 질량% 이하) 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC) 또는 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포릴글리세롤(DMPG)이거나 DMPC와 DMPG를 함께 포함하고, 여기서 상기 리포솜은 (a) 직경이 그 사이의 모든 0.1 nm 값 및 범위(예를 들어, 50 nm 내지 1 μm, 50 nm 내지 750 μm, 50 내지 500 nm, 50 내지 250 nm, 50 내지 100 nm, 100 nm 내지 1 μm, 100 내지 750 nm, 100 내지 500 nm, 100 내지 250 nm, 1 내지 150 μm, 1 내지 100 μm, 1 내지 50 μm, 1 내지 40 μm, 1 내지 30 μm, 1 내지 25 μm, 1 내지 20 μm, 1 내지 10 μm, 1 내지 5 μm)를 포함하여 50 nm 내지 150 μm이고; (b) 상기 리포솜의 수성 구획에 아데노신을 캡슐화하는 것인, 제형. 하나 이상의 리포솜은 직경이 50 nm 내지 100 μm이다. 하나 이상의 리포솜은 직경이 100 nm 내지 150 μm이다.

진술 2. 진술 1에 있어서, 상기 리포솜이 준안정성인 것인, 제형(예를 들어, 주사용 제형).

진술 3. 진술 1에 있어서, 상기 아데노신 또는 이의 일부가 최대 2주 동안 방출되거나 개체의 관절에 투여될 때, 아데노신 또는 이의 일부가 최대 2주 동안 방출되는 것인, 제형(예를 들어, 주사용 제형).

진술 4. 진술 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 부형제를 추가로 포함하는 것인, 제형(예를 들어, 주사용 제형).

진술 5. 진술 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노신 농도가 0.1 내지 7 mg/mL인 것인, 제형(예를 들어, 주사용 제형).

진술 6. 진술 5에 있어서, 상기 아데노신 농도가 0.1 내지 4 mg/mL인 것인, 제형(예를 들어, 주사용 제형).

진술 7. 진술 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, DMPC 및 DMPG의 비율이 6 대 4 내지 8 대 2인 것인, 제형(예를 들어, 주사용 제형).

진술 8. 진술 7에 있어서, DMPC 및 DMPG의 비율이 7:3인 것인, 제형(예를 들어, 주사용 제형).

진술 9. 진술 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 총 지질 농도가 7 내지 12 mg/mL인 것인, 제형(예를 들어, 주사용 제형).

진술 10. 진술 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 리포솜이 그 사이의 모든 0.1℃ 값 및 범위(예를 들어, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45℃)를 포함하여 35 내지 45℃의 온도(예를 들어, 페이로드를 방출하기 위해 대략 40℃)에서 붕괴(예를 들어, 압축 또는 수축)되는 것인, 제형(예를 들어, 주사용 제형).

진술 11. 진술 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노신이 개체의 관절에 투여한 지 1초 내지 1시간 이내에(예를 들어, 1분 내지 1시간 이내에) 방출되는 것인, 제형(예를 들어, 주사용 제형).

진술 12. 진술 11에 있어서, 상기 아데노신의 적어도 일부가 개체의 관절에 투여한 지 1초 내지 1시간 이내에(예를 들어, 1분 내지 1시간 이내에) 방출되는 것인, 제형(예를 들어, 주사용 제형).

진술 13. 진술 11 또는 진술 12에 있어서, 상기 아데노신의 적어도 1 내지 20%가 개체의 관절에 투여한 지 1초 내지 1시간 이내에(예를 들어, 1분 내지 1시간 이내에) 방출되는 것인, 제형(예를 들어, 주사용 제형).

진술 14. 진술 11 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노신의 적어도 일부 또는 아데노신의 적어도 1 내지 20%가 개체의 관절에 투여한 지 1초, 5초, 10초, 20초, 30초, 40초, 50초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분 또는 10분 이내에 방출되고 것인, 제형(예를 들어, 주사용 제형).

진술 15. 진술 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 제형(예를 들어, 주사용 제형)을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 개체에서 연골 재생을 유도하고/하거나 골관절염을 치료하는 방법.

진술 16. 진술 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 제형(예를 들어, 주사용 제형)을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 개체의 관절 통증을 완화시키는 방법.

진술 17. 진술 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 제형(예를 들어, 주사용 제형)을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 개체의 골관절염과 관련된 진행성 구조적 조직 손상을 둔화, 저지 및/또는 역전시키는 방법.

진술 18. 진술 15 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 제형(예를 들어, 주사용 제형)이 관절내 주사를 통해 개체의 관절에 투여되는 것인, 방법.

진술 19. 진술 15 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 주사용 제형이 1회 이상의 주사로 투여되는 것인, 방법.

진술 20. 진술 15 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 주사용 제형은 10일마다 1회씩 여러 번(예를 들어, 최대 10회) 투여되는 것인, 방법.

진술 21. 진술 15 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 개체가 골관절염, 류마티스 관절염, 급성 통풍 관절염 및/또는 활막염을 앓고 있는 것인, 방법.

진술 22. 진술 15 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 개체가 인간 또는 비인간 포유동물인 것인, 방법. 비인간 포유동물의 예에는 소, 돼지, 양 등과 같은 농업용 동물(예를 들어, 농장 동물), 뿐만 아니라 말, 개, 고양이 등과 같은 애완동물, 도우미 동물 또는 스포츠 동물이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 개체의 추가적인 비제한적인 예는 토끼, 래트 및 마우스를 포함한다.

다음의 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된다. 이들은 어떤 식으로든 제한되는 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1

이 실시예는 본 발명의 리포솜에 대한 설명을 제공한다.

아데노신은 반감기가 몇 초에 불과하기 때문에, 상기 연구에 사용된 리포솜-아데노신은 매일 새롭게 만들어졌다. 지질 성분, 용해도 효율성 및 보유 특성을 기반으로 한 일련의 저장 안정성 제형 옵션이 개발 및 평가되었다. 콜레스테롤/안정제를 포함시켜야 하는지 결정하고, 변수를 최적화하였다. 고정된 양의 프리-리포솜 동결건조물을 수화시키기 위해 사용된 아데노신 용액의 양을 감소 또는 증가시킴으로써 증가 또는 감소될 수 있는 총 제형 중 리포솜-결합된 아데노신의 백분율을 측정하였다. 프리-리포솜 동결건조물을 아데노신 용액으로 수화시킴으로써 형성되는 리포솜의 생성된 펠렛에서 아데노신 대 (아데노신 + 지질)의 분율은 사용된 부피가 아니라 용액 내의 아데노신 농도에 의존한다.

모든 제형은 7 mg/ml의 아데노신을 함유하는 물로 수화되었다.

RgnA09(75% 스핑고미엘린, 17.5% DMPC, 7.5% DMPG) 및 RgnA10(100% 스핑고미엘린)의 두 가지 제형을, 시간 경과에 따라 아데노신을 통합하고 방출하는 능력에 대해 평가하기 위해 시험하였다. 리포솜은 인지질 분말 100 mg을 함유하는 멸균 유리 바이알에서 형성되었다. 리포솜을 미리 채워진 플라스틱 주사기로 제공되는 멸균 아데노신 용액(3 mg/ml, 염수 중) 10 mL와 혼합했다. 리포-아데노신 현탁액(100 μL) 샘플을 37℃에서 0시간, 1시간, 2시간, 1일 및 2일, 5일, 7일, 10일 동안 인산염 완충 염수에서 인큐베이션했다. 각 인큐베이션 시간이 종료되면, 샘플을 4℃에서 15분 동안 23,000g에서 원심분리했다. 상청액을 제거하고, 리포솜 펠렛을 0.5% 트리톤-X100을 함유하는 염수 용액에 재현탁시켰다. 남아있는 온전한 리포솜 내의 아데노신 농도를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정량화했다.

도 1 및 4는 두 리포솜 제형에서 아데노신 보유율을 도시한 것이다. RgnA09와 RgnA10 사이에는 유의한 차이가 발견되지 않았다. RgnA09의 경우 시점 0에서 약간 더 높은 보유율이 관찰되었고, 보다 오랜 시점에 보유율 증가가 관찰되었다. 새로 제조된 리포솜 현탁액(시간 0)은 RgnA09 및 RgnA10에 대해 각각 21% 및 19%의 아데노신 보유율을 나타냈다. 인큐베이션 1시간 후 두 제형 모두에서 보유율이 4%로 떨어지고, 시간이 지남에 따라 서서히 감소하여 10일째에 159 μM 및 227 μM의 아데노신에 해당하는 1.4% 및 2%(RgnA09 및 RgnA10 각각)에 도달한다.

이러한 결과는 두 리포솜 제형이 모두 생체 내에서 A2A 아데노신 수용체를 활성화하기에 충분한 농도로 아데노신을 캡슐화하고 느리게 방출시키기 위한 우수한 저장소임을 보여준다.

프리-리포솜 동결건조물은 아데노신과 같은 친수성 약리학적 제제의 농축 용액에서 재수화될 수 있다. 상기 재수화 과정에서, 리포솜의 수성 구획에 상기 친수성 제제를 함유하는 다중라멜라 리포솜 입자가 생성된다. 상기 입자는 대략 30 마이크론의 "대형"이며 준안정성이어서 약 40℃의 하이퍼더믹(hyperthermic) 환경에서 조밀한 형태로 붕괴된다. 그렇지 않으면, 이러한 입자는 인간 무릎의 활막 관절의 활액낭 내와 같이 국소적으로 폐쇄된 구획에 갇힐 때 상기 약리학적 제제를 지속적으로 방출한다. 따라서, 함유된 친수성 제제는 생리학적 환경 내에서 이화 효소로부터 보호된다.

이러한 큰 준안정 다중라멜라 지질 입자를 생성하는 프리-리포솜 동결건조물은 동결건조 전에 지질(적어도 50% 스핑고미엘린 포함) 및 50% 이하의 비스핑고지질 포스파티딜 콜린을 물 - 3급 부틸 알코올(60:40 v/v)의 혼합물에 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)과 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포릴글리세롤(DMPG)을 70 대 30%의 비율로 비스핑고지질로 사용하였다.

실시예 2

이 실시예는 본 발명의 리포솜에 대한 설명을 제공한다.

제공된 리포솜-아데노신의 실험실 제형은 교차 편광 현미경을 사용하여 분석되었다. 그 결과는 도 8에 도시되어 있다.

리포솜 현탁액은, 현미경으로 관찰했을 때, 상당한 결정화된 아데노신의 증거를 보여주었다. 이 리포솜 현탁액은 상당한 리포솜 함량을 포함하지 않을 수 있으며 주로 에멀젼인 것으로 간주된다. 이미지에서 구형 물체는 오일일 가능성이 높다. 이 제형의 성분은 상당한 비율(60%)의 대두유를 함유했는데, 이는 리포솜 제형의 성분은 아니지만 에멀젼의 성분일 수 있다.

수중 아데노신의 용해도는 7 mg/mL로 간주되었다. 실험실 제형은 10 mL의 염수에 300 mg의 아데노신을 첨가해야 했다. 아마도 70 mg의 아데노신만이 용해되어 230mg의 아데노신이 결정 형태로 남게 될 것이다. 에멀젼을 원심분리할 때, 펠렛의 대부분은 결정성 아데노신일 가능성이 높은 것으로 생각된다. 제공된 제형의 펠렛은, 펠렛이 세척될 때마다 아무것도 남지 않을 때까지 크기가 줄어들기 때문에 HPLC에 의해 분석되지 않았다. 이 제형이 사용된 간행물이 검토되었고, 상청액만 HPLC로 분석되었다. 그 간행물은 아데노신의 73%가 리포솜에 남아 있다고 밝혔다. 그러나, 상청액 내 아데노신 농도를 측정하여 펠렛의 양을 추정하였다. 그러나, 이러한 상청액의 HPLC 측정은 70mg의 아데노신이 물에 대한 최대 용해도에 의해 10 mL의 염수에 용해되고, 나머지 230 mg의 아데노신이 펠렛에서 결정화되는 것과 일치한다. 아마도 아데노신으로 형성된 일부 리포솜이 있을 것이지만, 이 제형에서는 그 존재가 불확실하다.

아데노신 포획량을 조사하기 위해 리포솜 아데노신을 준비하기 위한 프리-리포솜 동결건조 기술의 분석이 재개되었다. 이 기술의 장점은 의약품 준비에 이상적인, 안정적이고 멸균된 공정이라는 것이다. 이 기술은 활성제의 존재하에 멸균 프리-리포솜 동결건조물의 재구성을 포함한다. 프리-리포솜 동결건조물의 사진은 도 7에 도시되어 있다.

프리-리포솜 동결건조물은 멸균 진공 바이알에서 흰색의 솜털 같은 분말로 나타난다. 재수화 과정은 농축된 아데노신 용액을 바이알에 주입하는 것을 포함한다. 이어서 분말은 30초 이내에, 때로는 즉시 용해되며, 가볍게 휘젓는 것이 필요할 수 있다. 이어서 생성된 리포솜 현탁액은 주사기를 통해 바이알에서 제거될 수 있다. 바이알의 내용물은 진공 상태이므로 주사기를 삽입하면 아데노신 용액이 바이알에 빠르게 흡수될 수 있음을 유의한다. 재수화에 사용하기에 이상적인 아데노신 용액의 농도는 수중 최대 용해도인 7 mg/mL이다. 희석액으로는 주사용 멸균수(SWFI)를 사용했지만, 염수 및 완충 용액도 사용될 수 있다. 생성된 리포솜 현탁액의 현미경 사진은 도 5에 나와 있다.

각 입자의 평균 직경은 대략 50 마이크로미터이다. 이 실시예에서 본 발명자들은 7 mg/ml의 아데노신 용액(SWFI 중) 11 ml에 분말 80 mg을 재수화했다. 상기 현미경 이미지는 별도의 리포솜 입자를 볼 수 있도록 희석한 것임을 유의한다.

아데노신과 지질 함량 둘 다를 측정하기 위한 HPLC 방법이 프로토타입되었다. 리포솜 제형을 원심분리하여 상청액에서 펠렛을 분리하였다. 메탄올로 펠렛을 완전히 용해시켰다. 리포솜의 지질 부분은 아세토니트릴에 비교적 불용성인 반면, 아데노신은 아세토니트릴에 가용성이다. 따라서, HPLC 방법은 먼저 HPLC 컬럼(C18 컬럼이었음)에서 아데노신을 용출시키는 초기 이동성 물/아세토니트릴 상과 지질을 용출하기 위한 메탄올 이동상을 포함하였다. 각 제제에 대해 하나의 표준이 실행되었다: 아데노신 및 지질. 용해된 펠렛을 실행하고, 그 결과를 해당 표준과 비교했다. 펠렛 크로마토그램은 도 10에 도시되어 있다.

이 방법에서 아데노신의 체류 시간은 1.42분이고, 지질의 체류 시간은 9.75분이다. 두 분석물은 다른 파장에서도 검출된다: 아데노신 및 지질에 대해 각각 260 nm 및 203 nm. 도 11은 이러한 스펙트럼을 보여준다.

지질 [SM] 표준은 4 mg/mL이고 아데노신 [ADO] 표준은 1 mg/ml이었다. 표준 실행에 대한 결과적인 피크 면적은 다음과 같았다.

검량선 대신에 다음이 고려되었다:

[SM] = SM/22,465/4 = SM/5,616

[ADO] = ADO/25,338

이어서 펠렛을 3회 반복으로 실행하여 두 개의 피크에 대해 다음과 같은 결과를 얻었다.

크로마토그램 피크 면적 비율(ADO/SM)의 함수로서 펠렛 내 아데노신 분율([ADO]/([ADO]+[SM])으로 정의됨)은 다음과 같이 유도될 수 있다:

크로마토그램 결과에 적용했을 때, 다음 값을 얻었다:

실시예 3

이 실시예는 본 발명의 주사용 제형의 사용 방법에 관한 설명을 제공한다.

골관절염이 확립된 래트는 염수(100 μL)의 관절내 주사를 투여받았고, 다른 8개 동물 그룹은 3, 1, 0.3 및 0 mg/mL의 용량으로 2가지 다른 리포솜 제형의 Ade를 투여받았다. 제1 주사는 전방십자인대(ACL) 파열 4주 후에 시행되었다. 동물은 10일마다 1회 주사를 6회 투여받았다. 관절 염증의 척도로 모든 주사 전에 무릎 종창을 측정했다. 통증 시험은 기준선(제1 주사 전), 제3 주사 후 5일, 및 마지막으로 희생 직전 57일(마지막 주사 후 7일)에 래트에서 수행되었다. 희생 후 관절은 조직학 및 uCT를 사용하여 분석되었다.

10개 치료군

ㆍ 2가지 제형 X 4개의 용량 = 8개의 처리 그룹

ㆍ 1개의 양성 대조군(Rgn01)

ㆍ 1개의 음성 대조군(염수)

RgnA01은 문헌[참조: Corciulo et al., Endogenous adenosine maintains cartilage homeostasis and exogenous adenosine inhibits osteoarthritis progression, Nat Commun. 2017 May 11;8:15019]에 기재된 바와 같이 제조되었다.

리포솜은 주사 전날 새롭게 준비되었다. 에탄올은 아데노신, 또는 아데노신과 아데노신 수용체 길항제를 함유하는 대두유에 첨가되었다. 포스파티딜 콜린 및 콜레스테롤(몰비로 1:0.5)을 함유하는 지질 상을 이전 용액에 첨가하고 15,000 r.p.m.에서 10분 동안 유화시켰다. 이어서 글리세린과 함께 염수를 지질 상에 첨가하고, 20분 동안 15,000 r.p.m.에서 균질화한 다음 100% 듀티 사이클에서 1분 동안 초음파 처리하였다.

PTOA 래트를 실험 그룹으로 무작위 배정했다. 통증 시험은 실험 시작 전(전방십자인대 파열 후 4주)과 제3 주사 후 5일에 수행되었다. 통증 행동은 인캐패시턴스 측정기를 사용하여 동측과 대측 뒷다리 사이의 체중 부하 비대칭으로 측정되었다. 통각과민 시험 후 동물을 설치류 구속 장치(restrainer)에 넣어 뒷발로 서게 하였다. 뒷다리는 두 개의 체중 평균(weight averaging) 플랫폼 패드에 얹혀 있었다. 동물이 각 패드에서 체중을 이동하면, 장치는 3회 내지 4회의 연속 측정 동안 12초에 걸쳐 평균 체중을 그램 단위로 기록했다. 각 동물의 평균값을 통계 분석에 사용했다.

실시예 4

이 실시예는 본 발명의 리포솜을 제조하는 방법 및 본 발명의 리포솜의 방출 동역학에 대한 설명을 제공한다.

프리-리포솜 동결건조물의 제조:

모든 바이알은 총 100 mg을 함유하고, 충전 부피는 5 mL이며, 충전 농도는 20 mg/ml 용매였다.

RgnA09의 경우, 75 mg SM, 17.5 mg DMPC 및 7.5 mg DMPG를 1:1(부피 기준 비율)의 물 대 3급-부틸 알코올(TBA) 혼합물 5mL에 용해시켰다. 이 용액을 다음 파라미터로 동결건조시키고(우선 -40℃에서 30분 동안 동결한 다음 200 마이크론의 진공 하에 10℃에서 20시간 동안 1차 건조에 이어서 20℃에서 4.5시간 동안 2차 건조), 진공 밀봉된 바이알에 보관했다. 이어서 동결건조물을 실온(25℃)에서 40 mg의 순수한 물로 재수화했다.

RgnA10의 경우, 순수한 스핑고미엘린(SM) 100 mg을 3:2(부피 기준 비율)의 물 대 3급-부틸 알코올(TBA) 혼합물 5 mL에 용해시켰다. 이 용액을 다음 파라미터로 동결건조시키고(우선 -40℃에서 30분 동안 동결시킨 다음 200 마이크론의 진공 하에 10℃에서 20시간 동안 1차 건조에 이어서 20℃에서 4.5시간 동안 2차 건조), 진공 밀봉된 바이알에 보관했다. 이어서, 동결건조물을 실온(25℃)에서 40mg의 순수한 물로 재수화했다.

아데노신 스톡 용액의 제조: 순수한 아데노신 분말을 염수 완충액(0.9% 염수)에 용해시켜 아데노신 스톡 용액을 제조하였다. 0.9% 염수 50 mL를 멸균 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 아데노신 150 mg을 칭량하고, 염수로 옮겨 3 mg/ml 스톡 용액을 생성했다. 상기 용액을 적어도 30분에 걸쳐 간헐적으로 격렬한 와동을 통해 혼합하였다. 이어서 상기 용액을 0.2 μm 멸균 주사기 필터가 있는 새로운 50 mL 원심분리 튜브로 여과하여 용해되지 않은 큰 아데노신 입자를 제거함으로써 단량체 용해된 아데노신을 포함하는 용액을 생성했다. 용액은 실온에서 제조되었고, 사용 후 냉장(2 내지 8℃) 보관되었다.

리포솜-아데노신 현탁액의 제조. 리포솜 용액은 처음에 적절한 조성의 동결건조 지질 분말 100 mg을 함유하는 유리 바이알로 시작하여 다음 절차에 의해 제조되었다. 이어서 각 지질 바이알은 아데노신 스톡 용액(염수 중 3 mg/ml) 10 mL를 바이알에 주입하고 격렬하게 와동시켜 수화되었다. 완충액 10 mL에 지질 100 mg을 용해하면 총 지질이 10 mg/mL인 용액이 생성될 것으로 예상되었다. 형성된 리포솜은 크기가 1 내지 10 μm에 이르는 다중라멜라로 예상되며, 몇몇 더 크거나 작은 리포솜이 있을 수 있다.

투석에 의한 24시간 시험관내 방출: 투석 카세트 준비: 투석 카세트는 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 사용하기 위해 준비되었다. 간단히 말해서, 투석 카세트를 20% EtOH(DI 물과 1:4 v/v 비율로 혼합된 200 프루프 에탄올) 5 mL로 채우고 20% EtOH 500mL를 포함하는 유리 비커에 10분 동안 부유시켰다. 이 단계에서는 교반 막대 또는 교반을 사용하지 않았다. 이어서 투석 카세트를 피펫으로 비우고, 5 L DI 물로 채우고, 500 mL 부피를 버리고, DI 물 500 mL로 교체하고, 투석 카세트를 DI 물에 추가로 20분 동안 부유시켰다(스피닝(spinning) 없음). 그 후 카세트는 DI 물 5mL를 제거한 후 사용하기에 적합한 것으로 간주되었다.

투석 챔버 준비: 1 L 유리 비커를 외부 완충액으로 0.9% 염수 500mL로 채웠다. 각 유리 비커에 자기 교반 막대를 추가했다.

투석 카세트는 1) 순수 아데노신 스톡 용액 또는 2) 다중라멜라 리포솜 + Ade 용액인 적절한 시험 용액 3mL로 채웠다.

채워진 투석 카세트를 폼 플로트 링(foam float ring)에 넣고, 용기 500 mL당 하나의 투석 카세트로 0.9% 염수 500 mL에 부유시켰다. 250 내지 300 rpm의 회전 속도로 스플래싱(splashing) 없이 카세트에 영향을 줄 수 있는 깔때기/와류 형성 없이 균일한 교반을 유지하도록 교반 플레이트를 조정했다. 샘플이 채워진 카세트를 우선 비이커에 놓고, 교반을 시작하는 시간을 영점(zero-time point)으로 사용했다.

보유액(투석 카세트 내부 용액) 샘플을, 먼저 카세트 내부 용액을 1 mL 피펫으로 가볍게 피펫팅하여 혼합한 다음 50 μL를 꺼내 미리 표지된 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 옮김으로써 다양한 시점에서 취했다.

나노드롭 원씨(NanoDrop OneC) 분광광도계를 사용한 아데노신 농도 분석을 수행하여 260 nm에서 UV/Vis 흡광도를 측정했다(750 nm에서 기준선 보정 켜기, 자동 경로 길이 끄기). 측정은 모두 0.9% 염수에 대해 블랭크 측정되었다. UV/Vis 측정은 샘플 조건 시점당 총 n=3 측정(3회 x 2 μL 부피, 보푸라기가 없는 와이프(lint-free wipe)로 닦아 각 측정 사이에 받침대를 청소함)으로 기기 받침대 위에 피펫팅된 2 μL 샘플을 사용하여 이루어졌다.

10일 시험관내 방출 동력학: 멸균 유리 바이알 내의 리포솜 동결건조물을 미리 충전된 플라스틱 주사기(마이코사이언스 인코포레이티드(Mycoscience Inc)로부터 맞춤 주문)에 제공된 멸균 아데노신 용액(3 mg/ml, 염수)과 혼합했다. 리포-아데노신 현탁액 샘플(100 μl)을 37℃에서 0시간, 1시간, 2시간 및 1일, 2일, 5일, 7일 또는 10일 동안 인산염-완충 염수에서 인큐베이션했다. 각 인큐베이션 시간이 종료되면, 샘플을 4℃에서 15분 동안 23,000xg에서 원심분리했다. 상청액을 제거하고, 리포솜 펠렛을 0.5% 트리톤-X100을 함유하는 염수 용액에 재현탁시켰다. 남아있는 온전한 리포솜 내의 아데노신 농도를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정량화했다.

동물 연구: 골관절염이 확립된 래트는 염수(100 ul)의 관절내 주사를 투여받았고, 다른 8개 동물 그룹은 3, 1, 0.33 및 0 mg/ml의 용량으로 2가지 다른 제형의 Ade를 투여받을 것이다. 제1 주사는 전방십자인대(ACL) 파열 4주 후에 시행되었다. 동물은 10일마다 1회 주사를 6회 투여받았다. 관절 염증의 척도로 모든 주사 전에 무릎 종창을 측정했다. 통증 시험은 기준선(제1 주사 전), 제3 주사 전 30일 후, 및 마지막으로 희생 직전 57일(마지막 주사 후 7일)에 래트에서 수행되었다. 통증 시험과 운동 시험, 인캐패시턴스 시험(인캐패시턴스 측정기에 의해 동측과 대측 뒷다리 사이의 체중 부하 비대칭으로 측정됨) 및 로타로드(rotarod) 시험(래트가 떨어지기 전에 회전하는 막대 위에서 계속 달릴 수 있었던 시간)을 수행하였다. 희생 후 관절은 조직학 및 uCT를 사용하여 분석될 것이다.

투석에 의한 24시간 시험관내 방출: 도 13은 시간이 지남에 따라 비-리포솜 아데노신이 방출됨을 보여준다. 그러나, RgnA09는 리포솜 내 약물의 더 높은 보유율로 인한 리포솜-아데노신의 느린 방출로 인해 전체적으로 21.86% 내지 37.90% 더 높은 용량을 야기하고, 2시간 및 16시간 주위에 몇 번의 방출 버스트(burst)로 인해 25.76% 및 37.90% 더 높은 용량이 발생했다. 그에 반해, RgnA10은 리포솜 내 약물의 더 높은 보유율로 인한 리포솜-아데노신의 느린 방출로 인해 전체적으로 26.61% 내지 49.27% 더 높은 용량을 야기하고, 1시간, 2시간 및 3시간 주위에 몇 번의 방출 버스트로 인해 48.89%, 39.21% 및 29.65% 더 높은 용량이 발생했다.

10일 시험관내 방출 동력학: 도 12는 두 리포솜 제형 모두에서 아데노신 보유율(%)을 도시한 것이다. 아데노신은 초기에 일시(bolus) 방출된다(RgnA09의 경우 1096 μM; RgnA10의 경우 2014 μM). RgnA09와 RgnA10 제형 간에는 유의한 차이가 검출되지 않았다. 새로 제조된 리포솜 현탁액(시간 0)은 RgnA09에 대해 21%, RgnA10에 대해 19%의 아데노신 보유율을 나타낸다. 도 1 및 도 4는, 인큐베이션 1시간 후, 두 제형 모두에서 보유율이 4%로 떨어지고, 시간이 지남에 따라 서서히 감소하여 10일째에 159 μM 및 227 μM 아데노신에 해당하는 1.4% 및 2%(각각 RgnA09 및 RgnA10)에 도달함을 보여준다. 이러한 결과는 두 리포솜 제형이 모두 생체 내에서 A2A 수용체를 활성화하기에 충분한 농도로 아데노신을 캡슐화하고 느리게 방출시키기 위한 우수한 저장소임을 보여준다.

동물 연구: 본 발명자들은 외상 후 골관절염(PTOA) 래트 모델에서 새로 개발된 제형의 효능을 추가로 시험했다. 상기 기재된 바와 같이, 래트는 전방십자인대의 기계적 파열 후에 골관절염이 발생한다. PTOA 래트를 실험 그룹으로 무작위 배정했다. 인캐패시턴스 통증 시험은 실험을 시작하기 전에 수행되었다. 동물을 10개의 그룹으로 나누어 0(빈 리포솜/비히클), 0.3, 1 또는 3 mg/ml의 아데노신이 포함된 RgnA09 또는 RgnA10, 염수, 또는 코시울로(Corciulo) 등에서 이전에 설명된 바와 같은 제형이 제공되었다. 동물은 10일마다 1회 주사를 6회 투여받았다. 관절 염증의 척도로 모든 주사 전에 무릎 종창을 측정했다. 통증 시험은 기준선(제1 주사 전), 30일(치료 요법 중기), 및 희생 직전(마지막 주사 후 7일)에 래트에서 수행되었다. 희생 후 관절은 조직학 및 uCT를 사용하여 분석되었다. 통증 행동은 인캐패시턴스 측정기 및 로타로드 시험에 의해 동측과 대측 뒷다리 사이의 체중 부하 비대칭으로 측정되었다.

동물을 설치류 구속 장치에 넣어 뒷발로 서게 하고, 뒷다리는 2개의 체중-평균 플랫폼 패드에 얹혀 있었다. 동물이 각 패드에서 체중을 이동하면, 장치는 3회 내지 4회의 연속 측정 동안 12초에 걸쳐 평균 체중을 그램 단위로 기록했다. 각 동물의 평균값을 분석에 사용했다. 통증은 또한 무릎 관절에 가해지는 압력과 스트레스로 운동 기능을 평가하는 로타로드 시험을 사용하여 측정되었다. 래트를 가속 로타로드 위에 놓고, 막대 위에서 머무르지 못하는 실패를 측정하고 추가 분석에 사용했다.

인캐패시턴스 시험에 기초하여, 관절내 비히클과 RgnA09의 경우 1 mg/ml로 처리된 동물 사이에, 그리고 RgnA10의 경우 0.3 mg과 3mg으로 처리된 동물 사이에 통증 행동이 크게 감소했다. 또한, 30일(3회 주사 후)에 본 발명자들은 두 제형 모두에서 관절 통증 감소에 대한 용량 반응의 꾸준한 경향을 관찰했으며, 모든 용량은 Rgn09에 대한 비히클과 유의하게 상이했고, 3 mg의 Rgn10은 Rgn01 및 비히클과 상이했다(도 9). 로타로드 시험에서도 Rgn10의 최고 용량(3 mg/ml)에서 60일에 용량-반응 경향 및 차이를 보였다(도 14). 또한, 본 발명자들은 두 제형 모두에서 관절 염증의 현저한 변화를 관찰했으며, 일부 용량은 6회 주사 후 비히클 및 염수와 상당한 차이를 보였다. 3 mg/ml에서 두 제형 모두 시간이 지남에 따라 관절 염증이 꾸준히 감소했다(도 15). Rgn09와 Rgn10은 모두 3 mg/ml의 최고 용량으로 사용되었다.

도 16에서는 비히클 또는 3가지 용량의 리포솜 아데노신으로 처리한 후 영향을 받은 래트 경골의 대표적인 사프라닌 O-염색 섹션을 보여준다. 비히클로 처리된 동물에서는 연골 프로테오글리칸이 현저히 감소하였고, 연골 표면의 불규칙성을 보였다. 표면 연골이 증가된 RgnA09로 처리된 래트에서 연골 프로테오글리칸의 용량 의존적 개선과 연골의 마모(fraying) 감소가 나타났다. RgnA10으로 처리된 래트에서 효과는 연구된 최고 용량(3 mg/ml)으로 처리된 래트의 연골에서 가장 강력했지만, 더 낮은 용량에서도 연골의 보존이 관찰되었다.

결론: 리포솜 아데노신의 신규 제형은 연골의 보존 및 강화와 함께 골관절염이 있는 무릎의 통증과 종창 둘 모두의 완화에 있어서 보다 효과적이지는 않더라도 효과적이었다. 두 제형 모두 효과적이었고, 다중라멜라 소포로부터의 시험관내 아데노신 방출은 비-리포솜 또는 유리 아데노신보다 우수했다.

실시예 5

이 실시예는 본 발명의 리포솜을 사용하는 방법을 제공한다.

상온에서 안정한(shelf-stable) 제형 RgnA09 및 RgnA10. 지질 성분, 용해도 효율성 및 보유 특성을 기반으로 한 일련의 저장 안정성 제형 옵션이 개발 및 평가되었다. RgnA09 및 RgnA10은 친수성 아데노신의 농축 용액에서 재수화될 수 있다. 상기 재수화 과정에서, 리포솜의 수성 구획에 아데노신을 함유하는 다중라멜라 리포솜 입자가 생성된다. 리포솜은 크기가 약 10 내지 100 마이크론이며 준안정성이어서 하이퍼더믹 환경(약 40℃)에서 조밀한 형태로 붕괴된다. 리포솜은 인간 무릎의 활막 관절의 활액낭 내와 같이 국소적으로 폐쇄된 구획에 갇힐 때 아데노신을 지속적으로 방출한다. RgnA09 및 RgnA10을, 시간 경과에 따라 아데노신을 통합하고 방출하는 능력에 대해 평가하기 위해 시험하였다. 멸균 유리 바이알 내의 리포솜 동결건조물을 미리 충전된 플라스틱 주사기(마이코사이언스 인코포레이티드로부터 맞춤 주문)에 제공된 멸균 아데노신 용액(3 mg/mL, 염수)과 혼합했다. 리포-아데노신 현탁액 샘플(100 μL)을 37℃에서 0시간, 1시간 또는 2시간 및 1일, 2일, 5일, 7일 또는 10일 동안 인산염-완충 염수에서 인큐베이션했다. 각 인큐베이션 시간이 종료되면, 샘플을 4℃에서 15분 동안 23,000xg에서 원심분리했다. 상청액을 제거하고, 리포솜 펠렛을 0.5% 트리톤-X100을 함유하는 염수 용액에 재현탁시켰다. 남아있는 온전한 리포솜 내의 아데노신 농도를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정량화했다. 도 1, 4 및 12는 두 리포솜 제형 모두에서 아데노신 보유율(%)을 도시한 것이다. 아데노신은 초기에 일시 방출된다(RgnA09의 경우 1096 μM; RgnA10의 경우 2014 μM). RgnA09와 RgnA10 제형 간에는 유의한 차이가 검출되지 않았다. 새로 제조된 리포솜 현탁액(시간 0)은 RgnA09에 대해 21%, RgnA10에 대해 19%의 아데노신 보유율을 나타낸다. 인큐베이션 1시간 후, 두 제형 모두에서 보유율이 4%로 떨어지고, 시간이 지남에 따라 서서히 감소하여 10일째에 159 μM 및 227 μM의 아데노신에 해당하는 1.4% 및 2%(각각 RgnA09 및 RgnA10)에 도달한다. 이러한 결과는 두 리포솜 제형이 모두 생체 내에서 A2A 수용체를 활성화하기에 충분한 농도로 아데노신을 캡슐화하고 느리게 방출시키기 위한 우수한 저장소임을 보여준다.

새로 개발된 제형의 효능은 외상 후 골관절염(PTOA) 래트 모델에서 추가로 시험되었다. 상기 기재된 바와 같이, 래트는 전방십자인대의 기계적 파열 후에 골관절염이 발생한다. PTOA 래트를 실험 그룹으로 무작위 배정했다. 인캐패시턴스 통증 시험은 실험을 시작하기 전에 수행되었다. 동물을 10개의 그룹으로 나누어 0(빈 리포솜/비히클), 0.3, 1 또는 3 mg/ml의 아데노신이 포함된 RgnA09 또는 RgnA10, 염수, 또는 코시울로(Corciulo) 등에서 이전에 설명된 바와 같은 제형이 제공되었다. 동물은 10일마다 1회 주사를 6회 투여받았다. 관절 염증의 척도로 모든 주사 전에 무릎 종창을 측정했다. 통증 시험은 기준선(제1 주사 전), 30일(치료 요법 중기), 및 희생 직전(마지막 주사 후 7일)에 래트에서 수행되었다. 희생 후 관절은 조직학 및 uCT를 사용하여 분석되었다. 통증 행동은 인캐패시턴스 측정기에 의해 동측과 대측 뒷다리 사이의 체중 부하 비대칭으로 측정되었다(도 9).

통각과민 시험 후, 동물을 설치류 구속 장치에 넣어 뒷발로 서게 하고, 뒷다리는 2개의 체중-평균 플랫폼 패드에 얹혀 있었다. 동물이 각 패드에서 체중을 이동하면, 장치는 3회 내지 4회의 연속 측정 동안 12초에 걸쳐 평균 체중을 그램 단위로 기록했다. 각 동물의 평균값을 분석에 사용했다. 운동 능력은 또한 무릎 관절에 가해지는 압력과 스트레스로 운동 기능을 평가하는 로타로드 시험을 사용하여 측정되었다. 래트를 가속 로타로드 위에 놓고, 막대 위에서 머무르지 못하는 실패를 측정하고 추가 분석에 사용했다(데이터는 표시되지 않음). 인캐패시턴스 시험에 기초하여, 비히클과 RgnA09의 경우 1 mg/ml 사이, 그리고 RgnA10의 경우 0.3 mg과 3 mg 사이에 강한 용량 상호작용이 있었다. 또한, 30일(3회 주사 후)에 본 발명자들은 두 제형 모두에서 관절 통증 감소에 대한 용량 반응의 꾸준한 경향을 관찰했으며, 모든 용량은 Rgn09에 대한 비히클과 유의하게 상이했고, 3 mg의 Rgn10은 Rgn01 및 비히클과 상이했다. 로타로드 시험에서도 Rgn10의 최고 용량(3 mg/ml)에서 60일에 용량 반응 경향 및 차이를 보였다. 또한, 본 발명자들은 두 제형 모두에서 관절 염증의 현저한 변화를 관찰했으며, 일부 용량은 6회 주사 후 비히클 및 염수와 상당한 차이를 보였다. 3 mg/ml에서 두 제형 모두 시간이 지남에 따라 관절 염증이 꾸준히 감소했다(도 15). Rgn09와 Rgn10은 모두 3 mg/ml의 최고 용량으로 사용될 수 있다.

본 발명은 하나 이상의 특정한 실시예에 대해 설명되었지만, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 실시예가 만들어질 수 있음이 이해될 것이다.

Claims

염수(saline) 및 하나 이상의 라멜라를 포함하는 리포솜을 포함하는 주사용 제형으로서, 상기 리포솜 라멜라는 70 내지 100 질량%의 스핑고미엘린을 포함하고, 스핑고미엘린이 100 질량% 미만인 경우, 나머지는 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC) 또는 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포릴글리세롤(DMPG)이거나 DMPC와 DMPG를 함께 포함하고, 상기 리포솜은
(a) 직경이 50 nm 내지 150 μm이고;
(b) 상기 리포솜의 수성 구획에 아데노신을 캡슐화하는 것인, 주사용 제형.
제1항에 있어서, 상기 리포솜은 준안정성(metastable)인 것인, 주사용 제형.
제1항에 있어서, 상기 아데노신 또는 이의 일부는 최대 2주 동안 방출되는 것인, 주사용 제형.
제1항에 있어서, 부형제를 추가로 포함하는, 주사용 제형.
제1항에 있어서, 상기 제형은 관절내 주사에 적합한 것인, 주사용 제형.
제1항에 있어서, 상기 아데노신 농도는 0.1 내지 7 mg/mL인 것인, 주사용 제형.
제5항에 있어서, 상기 아데노신 농도는 0.1 내지 4 mg/mL인 것인, 주사용 제형.
제1항에 있어서, DMPC 및 DMPG의 비율은 6:4 내지 8:2인 것인, 주사용 제형.
제8항에 있어서, DMPC 및 DMPG의 비율은 7:3인 것인, 주사용 제형.
제1항에 있어서, 상기 총 지질 농도는 7 내지 12 mg/mL인 것인, 주사용 제형.
제1항에 있어서, 상기 리포솜 중 하나 이상은 직경이 50 nm 내지 100 μm인 것인, 주사용 제형.
제6항에 있어서, 상기 리포솜 중 하나 이상은 직경이 100 nm 내지 150 μm인 것인, 주사용 제형.
제1항에 있어서, 상기 리포솜은 35 내지 45℃의 온도에서 붕괴되는 것인, 주사용 제형.
제1항에 있어서, 상기 아데노신의 적어도 일부는 상기 개체의 관절에 투여된 지 1초 내지 1시간 이내에 방출되는 것인, 주사용 제형.
제14항에 있어서, 상기 아데노신의 적어도 일부는 상기 개체의 관절에 투여된 지 1분 내지 1시간 이내에 방출되는 것인, 주사용 제형.
제15항에 있어서, 상기 아데노신의 적어도 1 내지 20%는 상기 개체의 관절에 투여된 지 1분 내지 1시간 이내에 방출되는 것인, 주사용 제형.
제14항에 있어서, 상기 아데노신의 적어도 일부 또는 아데노신의 적어도 1 내지 20%는 상기 개체의 관절에 투여된 지 1초 내지 10분 이내에 방출되는 것인, 주사용 제형.
제1항의 주사용 제형을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, i) 연골 재생을 유도하고/하거나 ii) 관절 통증 및/또는 염증을 완화하고/하거나 iii) 진행성 구조적 조직 손상을 둔화 및/또는 저지 및/또는 역전시키는 방법으로서, i) 연골 재생이 유도되고/되거나 ii) 관절 통증 및/또는 염증이 완화되거나 부분적으로 완화되고/되거나 iii) 진행성 구조적 조직 손상이 둔화 또는 부분적으로 둔화되고/되거나 정지 또는 부분적으로 정지되고/되거나 역전 또는 부분적으로 역전되는 것인, 방법.
제18항에 있어서, 상기 주사용 제형은 관절내 주사를 통해 상기 개체의 관절에 투여되는 것인, 방법.
제18항에 있어서, 상기 주사용 제형은 1회 이상의 주사로 투여되는 것인, 방법.
제18항에 있어서, 상기 주사용 제형은 여러 번 투여되고, 각각의 투여는 10일마다 1회 발생하는 것인, 방법.
제18항에 있어서, 상기 개체는 골관절염, 류마티스 관절염, 급성 통풍 관절염 및/또는 활막염을 앓고 있는 것인, 방법.
제19항에 있어서, 상기 개체는 인간 또는 비인간 포유동물인 것인, 방법.