CN114302709A - 包裹腺苷的脂质体 - Google Patents

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C·科西洛
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Abstract

本文提供了一种包裹腺苷的脂质体。脂质体可以由鞘磷脂或鞘磷脂与1,2‑二肉豆蔻酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DMPC)的组合或鞘磷脂与1,2‑二肉豆蔻酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸甘油(DMPG)的组合或鞘磷脂、DMPG与DMPC的组合形成。包裹腺苷的脂质体可以用于诱导软骨再生，治疗骨关节炎，减轻关节疼痛，和/或减缓、阻止和/或逆转与骨关节炎相关的进行性结构组织损伤，或治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、急性痛风性关节炎和/或滑膜炎。脂质体可以释放腺苷最长达两周。

Description

包裹腺苷的脂质体
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年4月3日提交的美国临时专利申请第62/828,916号的优先权，其公开内容纳入本文。
背景技术
骨关节炎(OA)是一种以软骨流失为特征的疾病，也是最常见的关节炎类型，影响到全世界1.51亿人，包括美国和其他工业化国家近10％的人口。年龄、先前的创伤、肥胖和遗传是造成这种退行性关节疾病的风险因素之一。OA的发病率随着年龄的增长而增加，由此产生的疼痛、关节功能和活动能力的丧失、社会孤立和生活质量的大幅降低使得OA成为一种具有高度医学和社会影响的疾病。OA可以影响任何关节，但是最常见的是影响膝、髋和手。OA在膝关节的发病率最高，无论女性(47％)还是男性(40％)都是如此。目前的治疗方案不尽如人意，不能解决根本问题。治疗大多是姑息性的，包括使用非甾体抗炎药(如布洛芬)、麻醉性镇痛药、运动和针灸。FDA也已经批准了一些OA的具体治疗方法，包括皮质类固醇(抗炎剂)和透明质酸(润滑、止痛)，所有这些都是通过关节内(IA)注射来进行的。虽然这些可注射药剂能缓解症状，但是没有一个具有恢复性。
嘌呤系统在维持软骨平衡方面起到关键作用。腺苷作用于其A2A受体(A2AR)，是维持软骨细胞和软骨平衡的重要自分泌稳态因子。腺苷是一种内源性生理调节剂，其细胞内和细胞外的浓度受氧消耗、细胞压力和线粒体功能的严格控制。细胞外的腺苷主要来自ATP的水解(主要但不完全通过胞外酶CD39和CD73)，并且通过激活G蛋白偶联受体(A1R、A2AR、A2BR和A3R)来介导其作用。这些腺苷受体在进化上是高度保守的，它们的表达和功能也趋于保守。腺苷长期以来一直被认为可以调节炎症和免疫反应，以往的研究已经证明了腺苷及其受体在成骨细胞、破骨细胞和骨髓稳态中的重要性。先前的研究表明，腺苷受体也能调节软骨细胞的生理和病理，以应对啮齿动物、马、牛和人类软骨细胞的炎症刺激，但是涉及的具体受体尚未确定。尽管马的嘌呤代谢与其他物种不同，但是内源性腺苷的除去(通过添加腺苷脱氨酶)或A2AR的阻断会导致马软骨外植体的软骨退化，因为存在于大多数物种的淋巴细胞、血浆和细胞外液中的腺苷脱氨酶不存在于马的淋巴细胞或血清中。据报道，在化学诱导的OA模型中，A3R的刺激能减少OA的进展，这主要是因为A3R激动剂的抗炎作用。但是，腺苷的半衰期仅有几秒钟。
发明内容
本公开提供了一种可注射制剂。本文还公开了制造和使用该可注射制剂的方法。可注射制剂包含脂质体和生理盐水，其中，脂质体为亚稳态并包裹腺苷。
附图简要说明
为了更全面地了解本公开的性质和目的，参考以下与附图相关联的详细描述。
图1所示为由RgnA09形成的脂质体的腺苷保留。
图2所示为由RgnA09形成的脂质体悬浮液的显微镜图像。
图3所示为由RgnA09形成的脂质体的近似直径的直方图。
图4所示为由RgnA10形成的脂质体的腺苷保留。
图5所示为由RgnA10形成的脂质体悬浮液的显微镜图像。
图6所示为由RgnA10形成的脂质体的近似直径的直方图。
图7所示为预脂质体冻干物。
图8所示为现有技术的脂质体悬浮液的显微镜图像。脂质体悬浮液含有明显的结晶化腺苷的迹象，并且据信球形物是油。
图9所示为使用双足平衡测试(incapacitance test)记录的疼痛数据。
图10所示为实施例1中分离出的材料的HPLC色谱。
图11所示为图10中分离出的材料的UV光谱。
图12所示为RgnA09和RgnA10的初始突释。
图13所示为(左)RgnA09-MLV和(右)RgnA10-MLV在24小时内的腺苷释放动力学。
图14所示为60天时(六次注射后)使用(左)RgnA09和(右)RgnA10的旋转杆疼痛测试。
图15所示为(A)RgnA09和(B)RgnA10在不同浓度下的6次注射对关节炎症的影响。施用方式为同侧-对侧。统计学：单向(Brown-Forsythe和Welch)ANOVA。*P<0.05v/s载剂，
Figure BDA0003388404570000031
P<0.05v/s生理盐水，+P<0.05v/s 0.3mg和1mg。
图16所示为用载剂或3剂量的脂质体腺苷治疗后受影响的大鼠胫骨的代表性番红精-O染色切片。在载剂治疗的动物中，软骨蛋白多糖和软骨表面不规则性明显减少。在RgnA09治疗的大鼠中，软骨蛋白多糖有剂量依赖性的改善并且软骨磨损消失，伴有表面软骨增加。在RgnA10处理的大鼠中，在那些用最高剂量(3mg/ml)处理的大鼠中效果最强，虽然在较低剂量下也观察到软骨的保护。
具体实施方式
尽管将以特定实施方式来描述所要求保护的实质内容，但是包括不全部提供本文所阐述的优点和特征的实施方式在内的其他实施方式也在本公开的范围内。在不偏离本公开范围的情况下，可以对各种结构、逻辑和工艺步骤进行改变。
除非另有说明，否则本文提供的所有范围包括落在该范围内的所有数值，直至小数点后第十位。
本公开提供了一种可注射制剂。本文还公开了制造和使用该可注射制剂的方法。
在一个方面中，本公开提供一种可注射制剂，其包含脂质体和生理盐水，其中，脂质体包裹腺苷。
脂质体可以包含i)鞘磷脂或ii)鞘磷脂与1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)或iii)鞘磷脂与1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG)的组合或iv)鞘磷脂、DMPG与DMPC的组合。在多个示例中，脂质体包含70-100质量％的鞘磷脂。包含小于100质量％的鞘磷脂的脂质体可以进一步包含最多达30质量％(如其余部分)的DMPC或DMPG或DMPC与DMPG的组合。在一个实施方式中，脂质体可以包含70-99.9质量％的鞘磷脂和0.1-30质量％(如其余部分)的DMPC或1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG)或DMPC与DMPG的组合。在一个实施方式中，脂质体包含75-100质量％的鞘磷脂。包含小于100质量％的鞘磷脂的脂质体可以进一步包含最多达25质量％(如其余部分)的DMPC或DMPG或DMPC与DMPG的组合。在一个实施方式中，脂质体包含75-99.9质量％的鞘磷脂和0.1-25质量％(如其余部分)的DMPC或DMPG或DMPC与DMPG的组合。例如，脂质体可以包含75、80、85、90、95、96、97、98、99和99.9％的鞘磷脂，其余部分为DMPC、DMPG、或其组合。质量百分比是指磷脂的总质量。
脂质体的直径和/或平均直径可以是50nm-150μm，包括所有0.1nm的值和其间范围(如50nm-1μm、50nm-750μm、50-500nm、50-250nm、50-100nm、100nm-1μm、100-750nm、100-500nm、100-250nm、1-150μm、1-100μm、1-50μm、1-40μm、1-30μm、1-25μm、1-20μm、1-10μm、1-5μm)。例如，脂质体的直径和/或平均直径可以是50nm、75nm、100nm、250nm、500nm、1μm、10μm、25μm、30μm、40μm、50μm、75μm、或100μm。在一个实施方式中，至少60、至少70、至少80、至少90、至少95、至少96、至少97、至少98、至少99、至少99.9、或100％的脂质体的直径为50nm-1μm、50nm-750μm、50-500nm、50-250nm、50-100nm、100nm-1μm、100-750nm、100-500nm、100-250nm、1-150μm、1-100μm、1-50μm、1-40μm、1-30μm、1-25μm、1-20μm、1-10μm、1-5μm。在一个实施方式中，没有直径大于150μm的脂质体。在一个实施方式中，直径大于150μm的脂质体少于1％。在多个实施方式中，可以通过乙醇注射法生产脂质体，所产生的脂质体可以比通过其他方法形成的脂质体更小。
在释放腺苷之前，本公开的脂质体可以处于亚稳态。由于在递送部位具有更大的稳定性，亚稳态脂质体能提供增强的释放。亚稳态脂质体a)相对直径不等于1(如亚稳态脂质体不是完美的圆形或球形)；b)足够大，使得与膜弯曲相关的膨胀应力不足以克服脂质体的构象平衡趋势；以及c)最长线性尺寸(如直径)为100nm-150μm，包括每个0.1nm的值和其间范围。这种脂质体在受到35-45℃(包括所有0.1℃的值和其间范围)的温度(如与具有该温度的储存器接触)(如35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45℃)(如约(或略高于)40℃)时塌陷(如缩小或收缩)成更小的稳定形式。在一个实施方式中，更小的稳定脂质体的最长线性尺寸(如直径)为50nm-110μm，包括每个0.1nm的值和其间范围。另外，25℃下脂质体所包围的体积相对于加热到超过形成脂质体的一个或多个脂质的凝胶-流体相变的温度后脂质体所包围的体积的比例大于10。含有亲水剂的亚稳态脂质体可以在35-45℃(包括所有0.1℃的值和其间范围)(如35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃)(如约40℃)塌陷，以便在这种塌陷(如收缩或缩小)时释放(如逐渐释放)其荷载物(如腺苷)。亚稳态脂质体在美国专利公开第2016/0263031号中有所描述(为了便于参考，将其相关部分纳入本文)。亚稳态脂质体可以简称为脂质体。
脂质体可以与一个或多个赋形剂配制在一起。制剂可以是液体或凝胶的形式，优选是液体，以用于注射应用。
脂质体由一个或多个脂质形成，其在生理pH值下可以是中性、阴离子或阳离子。脂质的类型的示例包括但不限于固醇和脂质，例如胆固醇、磷脂、溶血脂、溶血磷脂、鞘氨醇脂或PEG化脂质。在一个实施方式中，磷脂的碳链长度为C10-C22。在一个实施方式中，磷脂的碳链长度为C14-C20。合适的脂质包括但不限于磷脂酰胆碱(PC)(例如鸡蛋PC、大豆PC)和磷脂酰甘油。PC的示例包括例如1,2-二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和1,2-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)。可以使用多种磷脂酰甘油。磷脂酰甘油的非限制性示例包括1,2-二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、1,2-二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)和1,2-二肉豆蔻-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG)。
在一个实施方式中，磷脂是鞘磷脂、或鞘磷脂与DMPC或DMPG、或其组合。总脂质浓度可以是7-12mg/mL，包括所有0.01mg/mL的值和其间范围。在一个实施方式中，总脂质浓度为8-10mg/mL。在一个实施方式中，总脂质浓度为8mg/mL或10mg/mL。在一个实施方式中，脂质体包含鞘磷脂、DMPC和DMPG，DMPC与DMPG的比例为6：4至8：2。在一个实施方式中，DMPC与DMPG的比例为7：3。
脂质体具有水性隔室。水性隔室可以含有水和腺苷。腺苷浓度可以是0.1-7mg/mL，包括所有0.01mg/mL的值和其间范围。在一个实施方式中，腺苷浓度可以是0.1-4mg/mL。在一个实施方式中，腺苷浓度为3mg/mL。
本文描述了制造亚稳态脂质体的方法。在一个实施方式中，脱水的亚稳态脂质体由磷脂、优选鞘磷脂在水/叔丁醇(TBA)共溶剂体系中的均质分散体制备，mg磷脂相对于mL水/叔丁醇的比例为2:1。可以采用各种水与TBA的比例(如10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、9:2、7:2、5:2、3:2、10:3、8:3、7:3、5:3(水:TBA))。将各向同性的单相脂质体溶液冷冻干燥，在无菌小瓶中产生脱水的脂质体粉末。在从小瓶中除去水和TBA后，冷冻干燥步骤产生空的脂质囊泡或脱水的脂质体。加入药学上可接受的载体(例如水、生理盐水或PBS)，冻干的产品会自发形成大的亚稳态脂质体分散体。脂质相对于TBA的比例是影响所产生的脂质体制剂的尺寸和多分散性的重要因素。
在一个实施方式中，脱水的亚稳态脂质体(例如RgnA09)由包含多种磷脂在TBA/水共溶剂体系中的分散体的溶液制备，水与TBA的体积比为1:1。例如，对于包含100mg磷脂的溶液，使用1-50mL(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、40或50mL)的TBA:水体积比为1:1的共溶剂体系。多种磷脂可以是75％鞘磷脂(以质量计)和25％PC/PG混合物(以质量计)的混合物，其中，PC/PG混合物包括70％(以质量计)DMPC和30％(以质量计)DMPG(如在包含鞘磷脂和PC/PG混合物的总的多种磷脂中，70％(以质量计)的多种磷脂是鞘磷脂，17.5％(以质量计)的多种磷脂是DMPC，7.5％(以质量计)是DMPG)。对得到的包含多种磷脂的溶液进行冷冻干燥，在无菌小瓶中产生脱水的脂质体粉末。之后，冻干物(如脱水的脂质体粉末)可以用包含腺苷的溶液进行再水化(如对于100mg磷脂用10mL包含腺苷的水性溶液(如包含腺苷的生理盐水，其中，腺苷的浓度为0.1-7mg/mL(如3mg/mL))来使冻干物再水化)。
在一个实施方式中，脱水的亚稳态脂质体(例如RgnA10)由包含磷脂在TBA/水共溶剂体系中的分散体的溶液制备，水与TBA的体积比为3:2。例如，对于包含100mg磷脂的溶液，使用1-50mL(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、40或50mL)的水:TBA体积比为3:2的共溶剂体系。磷脂可以是鞘磷脂。对得到的包含磷脂的溶液进行冷冻干燥，在无菌小瓶中产生脱水的脂质体粉末。之后，冻干物(如脱水的脂质体粉末)可以用包含腺苷的溶液进行再水化(如对于100mg磷脂用10mL包含腺苷的水性溶液(如包含腺苷的生理盐水，其中，腺苷的浓度为0.1-7mg/mL(如3mg/mL))来使冻干物再水化)。
可以用各种方法来制造本公开的脂质体。例如，制造的方法包括但不限于乳液法、反相蒸发法、洗涤剂耗尽法和乙醇注射法。本领域已知的其他各种方法也包含在本公开的范围内。
脂质体-腺苷悬浮液可以通过本公开的方法制备。脱水的脂质体粉末通过添加腺苷溶液进行水合，之后混合。例如，向含有100mg脱水的脂质体粉末的小瓶中添加10mL腺苷溶液(如生理盐水(如0.9质量％的氯化钠(每mL水含9mg NaCl))中的3mg/mL腺苷溶液)。所得到的包含腺苷的脂质体可以是多层的。包含腺苷的脂质体的最长线性尺寸(如直径)可以是50nm-150μm，包括所有0.1nm的值和其间范围(如50nm-1μm、50nm-750μm、50-500nm、50-250nm、50-100nm、100nm-1μm、100-750nm、100-500nm、100-250nm、1-150μm、1-100μm、1-50μm、1-40μm、1-30μm、1-25μm、1-20μm、1-10μm、1-5μm)。
选择的剂量取决于所需的治疗效果、施用途径和所需的治疗时间。对哺乳动物(如个体)施用的一般剂量水平为每天0.001-10mg/kg体重。一般来说，静脉注射或输液的剂量可以更低。
组合物也可以通过口服、胃肠外(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、透皮(被动或使用离子电渗或电穿孔)或经粘膜(鼻腔、阴道、直肠或舌下)等途径施用，并且可以配制成适合每种施用途径的剂型。在一个实施方式中，制剂被直接注射到个体的关节中。
本公开的含有腺苷的亚稳态脂质体有几个优点。例如，亚稳态脂质体能缓慢释放腺苷，从而延长所递送的腺苷的生物活性和/或减少所需剂量。
可以使用不同尺寸的亚稳态脂质体制剂的剂量单位。含有脱水的亚稳态预脂质体冻干物的干燥粉末或腺苷或其他亲水活性剂的水性溶液的剂量单位可以在容器中与药学上可接受的载剂进行重建。优选地，药学上可接受的载体是水性载体。合适的剂量单位包括但不限于0.1-1mg、1-3mg、3-10mg、10-20mg和20-50mg。合适的剂量单位浓度包括但不限于0.05mg/mL-10mg/mL，优选0.05mg/mL-5mg/mL，更优选0.05mg/mL-3.5mg/mL。
本公开的可注射制剂可以用于诱导软骨再生，治疗骨关节炎，缓解关节疼痛，和/或减缓、阻止和/或逆转需要治疗的个体中与骨关节炎相关的进行性结构组织损伤。在一个示例中，个体可能患有或被怀疑患有骨关节炎、类风湿性关节炎、急性痛风性关节炎和/或滑膜炎。诱导软骨再生、治疗骨关节炎、减轻关节疼痛和/或减缓、阻止和/或逆转需要治疗的个体中与骨关节炎相关的进行性结构组织损伤的方法包括对需要治疗的个体施用本公开的可注射制剂。
在多个实施方式中，个体是人类或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物的示例包括但不限于农业动物(如农场动物)(例如牛、猪、羊等)以及宠物、服务或体育竞技动物(例如马、狗、猫等)。个体的其他非限制性示例包括兔子、大鼠和小鼠。
对需要治疗的人施用后，腺苷从脂质体中释放最长达2周。在一个实施方式中，在施用可注射制剂之后，腺苷在对个体施用后的1秒至1小时(如1分钟至1小时)内从脂质体中释放出来。在一个实施方式中，至少一部分腺苷(如1-20％的腺苷)在对个体施用后的1分钟至1小时内从脂质体中释放出来。在一个实施方式中，至少一部分腺苷(如1-20％的腺苷)在对个体施用后的1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟或10分钟内释放出来。
可注射制剂可以通过关节内注射施用于个体的关节。可注射制剂可以分一次或多次注射来施用。制剂可以多次施用(如最多达十次)，例如每10天或更长时间一次。
本文公开的各种实施方式和实施例中描述的方法步骤足以执行本发明的方法。因此，在一个实施方式中，方法基本上由本文公开的方法步骤组合而成。在实施方式中，方法由这样的步骤构成。
下面的陈述描述了本公开的各个非限制性示例。
陈述1.一种制剂(如可注射制剂)，其包含生理盐水和一个或多个脂质体，其中，一个或多个脂质体包含一个或多个层状物(如一个或多个多层脂质体)，其中，脂质体层状物包含70-100质量％的鞘磷脂，当鞘磷脂少于100质量％时，其余部分是(如最多达30质量％)1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)或1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG)或DMPC与DMPG的组合，其中，脂质体(a)直径为50nm-150μm，包括所有0.1nm的值和其间范围(如50nm-1μm、50nm-750μm、50-500nm、50-250nm、50-100nm、100nm-1μm、100-750nm、100-500nm、100-250nm、1-150μm、1-100μm、1-50μm、1-40μm、1-30μm、1-25μm、1-20μm、1-10μm、1-5μm)；以及(b)将腺苷包裹在脂质体的水性隔室中。一个或多个脂质体的直径为50nm-100μm。一个或多个脂质体的直径为100nm-150μm。
陈述2.如陈述1所述的制剂(如可注射制剂)，其中，脂质体处于亚稳态。
陈述3.如陈述1所述的制剂(如可注射制剂)，其中，腺苷或其一部分释放最长达两周，或在对个体的关节施用后，腺苷或其一部分释放最长达两周。
陈述4.如前述陈述中任一项所述的制剂(如可注射制剂)，其进一步包含赋形剂。
陈述5.如前述陈述中任一项所述的制剂(如可注射制剂)，其中，腺苷浓度为0.1-7mg/mL。
陈述6.如陈述5所述的制剂(如可注射制剂)，其中，腺苷浓度为0.1-4mg/mL。
陈述7.如前述陈述中任一项所述的制剂(如可注射制剂)，其中，DMPC与DMPG的比例为6：4至8：2。
陈述8.如陈述7所述的制剂(如可注射制剂)，其中，DMPC与DMPG的比例为7：3。
陈述9.如前述陈述中任一项所述的制剂(如可注射制剂)，其中，总脂质浓度为7-12mg/mL。
陈述10.如前述陈述中任一项所述的制剂(如可注射制剂)，其中，脂质体在35-45℃的温度塌陷(如收缩或缩小)，温度包括所有0.1℃的值和其间范围(如35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃)(如约40℃，以释放其荷载物)。
陈述11.如前述陈述中任一项所述的制剂(如可注射制剂)，其中，腺苷在施用后的1秒至1小时内(如1分钟至1小时内)释放到个体的关节。
陈述12.如陈述11所述的制剂(如可注射制剂)，其中，至少一部分腺苷在施用后的1秒至1小时内(如1分钟至1小时内)释放到个体的关节。
陈述13.如陈述11或陈述12所述的制剂(如可注射制剂)，其中，至少1-20％的腺苷在施用后的1秒至1小时内(如1分钟至1小时内)释放到个体的关节。
陈述14.如陈述11-13中任一项所述的制剂(如可注射制剂)，其中，至少一部分腺苷或至少1-20％的腺苷在对个体的关节施用后1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟或10分钟内释放。
陈述15.一种在需要治疗的个体中诱导软骨再生和/或治疗骨关节炎的方法，包括对该个体施用前述陈述中任一项所述的制剂(如可注射制剂)。
陈述16.一种在需要治疗的个体中减轻关节疼痛的方法，包括对该个体施用陈述1-14中任一项所述的制剂(如可注射制剂)。
陈述17.一种在需要治疗的个体中减缓、阻止和/或逆转与骨关节炎相关的进行性结构组织损伤的方法，包括对该个体施用陈述1-14中任一项所述的制剂(如可注射制剂)。
陈述18.如陈述15-17中任一项所述的方法，其中，该制剂(如可注射制剂)通过关节内注射施用于个体的关节。
陈述19.如陈述15-18中任一项所述的方法，其中，可注射制剂以一次或多次注射的方式施用。
陈述20.如陈述15-19中任一项所述的方法，其中，可注射制剂每10天施用多次(如最多达10次)。
陈述21.如陈述15-20中任一项所述的方法，其中，个体具有骨关节炎、类风湿性关节炎、急性痛风性关节炎、和/或滑膜炎。
陈述22.如陈述15-21中任一项所述的方法，其中，个体是人类或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物的示例包括但不限于农业动物(如农场动物)(例如牛、猪、羊等)以及宠物、服务或体育竞技动物(例如马、狗、猫等)。个体的其他非限制性示例包括兔子、大鼠和小鼠。
以下实施例旨在说明本发明。它们不旨在作任何限定。
实施例1
该实施例对本公开的脂质体进行了描述。
因为腺苷的半衰期只有几秒钟，所以上述研究中使用的脂质体-腺苷是每天新鲜制备的。开发并评估了基于脂质组分、溶解效率和保留特性的一系列储存稳定的制剂方案。确定了是否应当包括胆固醇/稳定剂并优化了这些变量。测量了结合脂质体的腺苷在总制剂中的百分比，其可以通过减少或增加用于使固定量的预脂质体冻干物水化的腺苷溶液的量来增加或减少。用腺苷溶液使预脂质体冻干物水化而形成的所得脂质体颗粒中，腺苷相对于(腺苷+脂质)的比例取决于溶液中的腺苷浓度而不是所使用的体积。
所有制剂都用含有7mg/mL腺苷的水进行水化。
条件
Figure BDA0003388404570000111
Figure BDA0003388404570000121
数据分析
Figure BDA0003388404570000122
测试了两种制剂RgnA09(75％的鞘磷脂、17.5％的DMPC、7.5％的DMPG)和RgnA10(100％的鞘磷脂)，以评估其结合和随时间释放腺苷的能力。脂质体在含有100mg磷脂粉末的无菌玻璃小瓶中形成。脂质体与通过预填充的塑料注射器提供的10mL无菌腺苷溶液(3mg/mL，在生理盐水中)混合。脂质-腺苷悬浮液的样品(100μL)在37℃下在磷酸盐缓冲生理盐水中孵育0、1小时、2小时、1天和2、5、7、10天。在各孵育时间结束时，在4℃下将样品以23,000g离心15分钟。除去上清液，将脂质体颗粒重新悬浮在含有0.5％Triton-X100的生理盐水溶液中。通过高效液相色谱法(HPLC)对剩余的完整脂质体中的腺苷浓度进行定量。
图1和图4显示了两种脂质体制剂中腺苷的保留百分比。RgnA09与RgnA10之间没有发现明显的差异。观察到RgnA09在时间点零处的保留率略高，且保留率随着时间点的推移而增加。新鲜制备的脂质体悬浮液(时间0)显示RgnA09和RgnA10的腺苷保留率分别为21％和19％。孵育1小时后，两种制剂的保留率都下降至4％，并且随着时间的推移缓慢下降，在第10天达到1.4％和2％(分别对应RgnA09和RgnA10)，相当于159μM和227μM的腺苷。
这些结果表明，两种脂质体制剂都是包裹和缓慢释放腺苷的良好存储器，其浓度足以在体内活化A2A腺苷受体。
可以在亲水药理学试剂(如腺苷)的浓溶液中使预脂质体冻干物再水化。在所述再水化过程中，产生了多层脂质体颗粒，其在脂质体的水性隔室中含有所述亲水性试剂。所述颗粒是“大”的，大约30微米，并且是亚稳定的，因此其在高热环境下(约40℃)会塌陷成密集形式。另一方面，如果将这些颗粒限制在局部封闭的隔室、如人膝关节滑膜的滑囊内，则这些颗粒能实现所述药理学试剂的持续释放。因此，所含亲水性试剂在生理环境中不受分解酶的影响。
可以在冻干之前通过将脂质(包括至少50％的鞘磷脂)和最多达50％的非鞘磷脂磷脂胆碱溶解在水-叔丁醇(60：40v/v)的混合物中来制造产生这些大的亚稳态多层脂质颗粒的预脂质体冻干物。1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG)用作非鞘磷脂，比例为70％：30％。
实施例2
该实施例对本公开的脂质体进行了描述。
使用交叉偏振显微镜对所提供的脂质体-腺苷的实验室制剂进行了分析。其结果示于图8。
在显微镜下观察时，脂质体悬浮液展现出明显结晶化的腺苷的迹象。认为该脂质体悬浮液可能不含有大量的脂质体含量，主要是乳液。图像中的球形物体可能是油。该制剂的成分含有相当比例(60％)的大豆油，这不会是脂质体制剂的组分，但是会是乳液的组分。
考虑了腺苷在水中的溶解度，其为7mg/mL。实验室制剂要求将300mg的腺苷添加至10mL的生理盐水中。据推测，只有70mg的腺苷会溶解，剩下230mg的腺苷为结晶状。认为在对乳液进行离心处理时，大部分颗粒可能是结晶的腺苷。所提供的制剂的颗粒不通过HPLC，这是因为每次清洗颗粒时，其尺寸会减少，直到什么都不剩。我们看过使用该制剂的出版物，发现只对上清液进行了HPLC分析。该出版物称73％的腺苷被保留在脂质体中。但是，颗粒中的量是通过测量上清液中的腺苷浓度推断出来的。但是，这种对上清液的HPLC测量与70mg的腺苷按其在水中的最大溶解度溶解在10mL生理盐水中的情况相一致，其余230mg的腺苷在颗粒中结晶。据推测形成了一些含有腺苷的脂质体，但是不确定它们在该制剂中是否存在。
进行了对制备脂质体腺苷的预脂质体冻干物技术的分析，以研究腺苷的捕获量。这种技术的优点是，它是稳定且无菌的过程，对于药物制备而言是理想的。该技术涉及在活性剂的存在下重建组无菌预脂质体冻干物。图7显示了预脂质体冻干物的照片。
预脂质体冻干物在无菌真空小瓶中呈现为白色蓬松的粉末。再水化的过程包括将浓腺苷溶液注入小瓶中。之后，粉末在30秒内溶解，有时是瞬间溶解，并且可能需要轻轻旋转。之后，可以通过注射器从小瓶中取出所得的脂质体悬浮液。应注意，由于小瓶内处于真空状态，因此插入注射器后腺苷溶液将迅速被小瓶吸收。用于再水化的腺苷溶液的理想浓度是其在水中的最大溶解度，即7mg/mL。稀释剂使用注射用无菌水(SWFI)，但是也可以使用生理盐水和缓冲溶液。所得的脂质体悬浮液的显微图示于图5。
每个颗粒的平均直径为约50微米。在该实施例中，我们将80mg的粉末在11ml的7mg/ml的腺苷溶液(SWFI中)中再水化。应注意，上面的显微镜图像是稀释液，以便能够观察到单独的脂质体颗粒。
用于测量腺苷和脂质含量的HPLC方法被原型化。对脂质体制剂进行离心，并将颗粒与上清液分离。用甲醇将颗粒完全溶解。脂质体的脂质部分相对不溶于乙腈，而腺苷则可溶于乙腈。因此，HPLC方法包括初始的流动水/乙腈相，首先将腺苷从HPLC柱(C18柱)中洗出，之后用甲醇流动相洗出脂质。每种试剂都运行一个标准：腺苷和脂质。将溶解后的颗粒投入运行，并将结果与那些标准进行比较。颗粒色谱示于图10。
该方法中腺苷的保留时间为1.42分钟，而脂质的保留时间为9.75分钟。检测出这两种分析物的波长也不同：腺苷和脂质分别为260nm和203nm。图11显示了这些光谱。
脂质[SM]标准是4mg/mL，腺苷[ADO]标准是1mg/mL。标准运行产生的峰面积如下。
Figure BDA0003388404570000151
为了代替校准曲线，考虑以下内容。
[SM]＝SM/22,465/4＝SM/5,616
[ADO]＝ADO/25,338
之后，对该颗粒进行一式三份的检测，得到的两个峰的结果如下。
Figure BDA0003388404570000152
颗粒中腺苷的比例(定义为[ADO]/([ADO]+[SM]))与色谱峰面积的比例(ADO/SM)的函数关系可以如下获得。
[ADO]＝ADO/25，338
[SM]＝SM/5616
Figure BDA0003388404570000164
Figure BDA0003388404570000161
Figure BDA0003388404570000162
当应用于色谱图结果时，获得以下数值。
Figure BDA0003388404570000163
实施例3
该实施例对本公开的可注射制剂的使用方法进行了描述。
建立OA的大鼠接受生理盐水(100μL)的关节内注射，而其他8组动物接受2种不同脂质体制剂的Ade，剂量为3、1、0.3和0mg/mL。第一次注射在ACL破裂4周后进行。动物每10天接受一次注射，共6次。每次注射前测量膝关节肿胀，作为衡量关节炎症的标准。在基线(第一次注射前)、第3次注射后5天、以及最后在57天、也就是即将处决前(最后一次注射后7天)对大鼠进行疼痛测试。处决后的关节用组织学和uCT进行分析。
10个治疗组
2种制剂×4个剂量＝8个治疗组
1个阳性对照(Rgn01)
1个阴性对照(生理盐水)
RgnA01的制备按照Corciulo等人在“内源性腺苷维持软骨稳态以及外源性腺苷抑制骨关节炎进展(Endogenous adenosine maintains cartilage homeostasis andexogenous adenosine inhibits osteoarthritis progression)，自然通讯(NatCommun.)，2017年5月11日；8：15019”中描述的方法来进行。
脂质体在注射前一天新鲜制备。将乙醇添加到含有腺苷或腺苷加腺苷受体拮抗剂的豆油中。将含有磷脂酰胆碱和胆固醇(摩尔比为1：0.5)的脂质相添加至前述溶液中，以15,000r.p.m.乳化10分钟。之后，将生理盐水和甘油一起添加至脂质相中，并在15,000r.p.m.下均质化20分钟，之后在100％占空比下超声处理1分钟。
PTOA大鼠被随机分配到实验组。在实验开始前(ACL破裂后4周)以及第3次注射后5天进行疼痛测试。疼痛行为通过用双足平衡计测量同侧和对侧后肢之间的负重不对称性来进行。在痛觉过敏测试后，将动物放置在啮齿动物约束器中，让它们用后爪站立。后肢靠在两个重量平均平台垫上。当动物从各垫上移开它们的重量时，装置在12秒内进行3-4次连续测量来记录平均重量(克)。各个动物的平均值用于进行统计分析。
实施例4
该实施例对制备本公开的脂质体的方法和本公开的脂质体的释放动力学进行了描述。
预脂质体冻干物的制备：
条件
Figure BDA0003388404570000171
Figure BDA0003388404570000181
所有小瓶的总含量为100mg，填充体积为5mL，填充浓度为20mg/ml溶剂。
对于RgnA09，将75mg SM、17.5mg DMPC和7.5mg DMPG溶解在水与叔丁醇(TBA)为1：1(体积比)的5mL混合物中。该溶液按以下参数进行冻干(首先在-40℃下冷冻30分钟，之后在200微的真空下在10℃下进行20小时的一次干燥，之后在20℃下进行4.5小时的二次干燥)，并保持在真空密封的小瓶中。之后，在室温(25℃)下用40mg的纯水对冻干物进行再水化。
对于RgnA10，将100mg纯鞘磷脂(SM)溶解在水与叔丁醇(TBA)为3：2(体积比)的5mL混合物中。该溶液按以下参数进行冻干(首先在-40°下冷冻30分钟，之后在200微的真空下在10°下进行20小时的一次干燥，之后在20°下进行4.5小时的二次干燥)，并保持在真空密封的小瓶中。之后，在室温(25°)下用40mg的纯水对冻干物进行再水化。
腺苷储备溶液的制备：腺苷储备溶液通过将纯腺苷粉末溶解到生理盐水(0.9％生理盐水)中而制备。将50mL的0.9％生理盐水转移到无菌离心管中，之后称量150mg腺苷并转移到生理盐水中，形成3mg/ml的储备溶液。在至少30分钟的时间段内，通过间歇性的大力涡旋来将溶液混合。之后，将溶液过滤到新的50mL离心管中，用0.2μm的无菌注射器过滤器除去未溶解的腺苷颗粒，获得含有溶解的单体腺苷的溶液。溶液在室温下制备，使用后冷藏保存(2-8℃)。
脂质体-腺苷悬浮液的制备：脂质体溶液首先按以下步骤制备，先使用含有100mg合适组成的冻干脂质粉末的玻璃小瓶。之后，通过向小瓶中注入10mL腺苷储备溶液(在生理盐水中为3mg/ml)并大力涡旋，使得每瓶脂质发生水化。将100mg的脂质溶解在10mL的缓冲液中，预计会产生总脂质为10mg/mL的溶液。形成的脂质体预计是多层的，尺寸在1-10μm之间，可能有一些更大和更小的脂质体。
通过透析的24小时体外释放：准备透析盒：透析盒按照制造商推荐的方案进行使用。简而言之，透析盒中装有5mL的20％EtOH(200度乙醇与DI水按1：4的比例混合)，并让其在含有500mL的20％EtOH的玻璃烧杯中漂浮10分钟。此步骤中没有使用搅拌棒或搅拌。之后，用吸管吸空透析盒并装入5L的DI水，丢弃500mL的体积并用500mL的DI水替换，让透析盒在DI水中再漂浮20分钟(不搅拌)。之后，在除去5mL的DI水后，认为该透析盒适合使用。
准备透析室：在1L玻璃烧杯中装入500mL的0.9％生理盐水作为外部缓冲液。在每个玻璃烧杯中加入磁力搅拌子。
透析盒中装有3mL的合适测试溶液，或是1)纯腺苷储备溶液，或是2)多层脂质体+Ade溶液。
之后，将装好的透析盒放在泡沫浮圈中，让其漂浮在500mL的0.9％盐水中，每个500mL容器中有一个透析盒。调整搅拌板以保持均匀的搅拌，不飞溅，不形成可能影响透析盒的漏/旋涡，搅拌速度为250-300rpm。零时间点定为将装有样品的填充盒首次放入烧杯并开始搅拌的时间。
在多个时间点采集回流液(透析盒内的溶液)样品，包括首先用1mL的吸管轻吸来混合透析盒内的溶液、之后取出50μL并转移到预先标记的1.5mL Eppendorf管中。
腺苷浓度的分析使用NanoDrop OneC分光光度计测量260nm处的UV/Vis吸光度(750nm处基线校正开启，自动化路径长度关闭)来进行。测量时以0.9％的生理盐水作为空白。UV/Vis测量是用2μL的样品滴加到仪器基座上来进行的，每个样品条件时间点总共n＝3次测量(3×2μL体积，每次测量之间用无绒布擦拭基座)。
10天体外释放动力学：将无菌玻璃小瓶中的脂质体冻干物与无菌腺苷溶液(3mg/ml，在生理盐水中)混合，提供于预填充塑料注射器中(从Mycoscience Inc.定制)。脂质-腺苷悬浮液的样品(100μl)在37℃下在磷酸盐缓冲生理盐水中孵育0、1、2小时、1、2、5、7、10天。在各孵育时间结束时，在4℃下将样品以23,000×g离心15分钟。除去上清液，将脂质体颗粒重新悬浮在含有0.5％Triton-X100的生理盐水溶液中。通过高效液相色谱法(HPLC)对剩余的完整脂质体中的腺苷浓度进行定量。
动物研究：建立OA的大鼠接受生理盐水(100μl)的关节内注射，而其他8组动物将接受2种不同脂质体制剂的Ade，剂量为3、1、0.33和0mg/ml。第一次注射在ACL破裂4周后进行。动物每10天接受一次注射，共6次。每次注射前测量膝关节肿胀，作为衡量关节炎症的标准。在基线(第一次注射前)、第3次注射后30天、以及最后在57天、也就是即将处决前(最后一次注射后7天)对大鼠进行疼痛测试。进行了疼痛测试和运动测试，即双足平衡测试(通过双足平衡计测量同侧和对侧后肢之间的负重不对称性)和旋转杆测试(大鼠在脱落前能够持续在旋转杆上运行的时间)。处决后的关节将用组织学和uCT进行分析。
通过透析的24小时体外释放：图13显示了非脂质体的腺苷随时间的释放。但是，RgnA09实现了21.86％至37.90％的更高整体剂量，因为脂质体中的药物的更高保留率使得脂质体-腺苷缓慢释放，以及2小时和16小时附近的一些突释，实现25.76％和37.90％的更高剂量。另一方面，RgnA10实现了26.61％至49.27％的更高整体剂量，因为脂质体中的药物的更高保留率使得脂质体-腺苷缓慢释放，以及1小时、2小时和3小时附近的一些突释，实现48.89％、39.21％和29.65％的更高剂量。
10天体外释放动力学：图12显示了两种脂质体制剂中腺苷的保留百分比。腺苷有初始突释(RgnA09为1096μM；RgnA10为2014μM)。RgnA09与RgnA10制剂之间没有发现明显的差异。新鲜制备的脂质体悬浮液(时间0)显示RgnA09的腺苷保留率为21％，RgnA10的腺苷保留率为19％。图1和图4显示在孵育1小时后，两种制剂的保留率下降到4％，随着时间的推移而缓慢下降，在第10天达到1.4％和2％(分别对应于RgnA09和RgnA10)，相当于159μM和227μM腺苷。这些结果表明，两种脂质体制剂都是包裹和缓慢释放腺苷的良好存储器，其浓度足以在体内活化A2A受体。
动物研究：我们进一步测试了新开发的制剂在创伤后OA(PTOA)大鼠模型中的疗效。如上所述，大鼠在ACL破裂后发展出OA。PTOA大鼠被随机分配到实验组。在开始实验之前，进行双足平和疼痛测试。动物被分为10组，分别接受RgnA09或RgnA10的0(空脂质体/载剂)、0.3、1或3mg/ml的腺苷、生理盐水、或制剂，如先前Corciulo等人所述的那样。动物每10天接受一次注射，共6次。每次注射前测量膝关节肿胀，作为衡量关节炎症的标准。在基线(第一次注射前)、在30天(治疗方案的中期)、即将处决前(最后一次注射后7天)对大鼠进行疼痛测试。处决后的关节用组织学和uCT进行分析。疼痛行为通过用双足平衡计和旋转杆测试来测量同侧和对侧后肢之间的负重不对称性来进行。
将动物放在啮齿动物约束器中，用后爪站立，后肢靠在两个重量平均平台垫上。当动物从各垫上移开它们的重量时，装置在12秒内进行3-4次连续测量来记录平均重量(克)。各个动物的平均值用于进行分析。疼痛还通过旋转杆测试来测量，其提供了在具有膝关节压力和应力情况下的运动功能的评估。将大鼠放置在加速旋转杆上，测定未能停留在杆顶的情况，并用于进一步的分析。
基于双足平衡测试，用关节内载剂和1mg/mL和RgnA09处理，用RgnA10的0.3mg和3mg之间，治疗过的动物中疼痛行为都有明显减少。另外，在30天时(注射3次后)，我们观察到两种制剂在减少关节疼痛方面有稳定的剂量反应趋势，Rgn09的所有剂量都与载剂有显著差异，而3mg的Rgn10与Rgn01和载剂有差异(图9)。旋转杆测试也显示出剂量反应趋势以及在60天时最高剂量Rgn10(3mg/ml)的差异(图14)。另外，我们观察到两种制剂在关节炎症方面的显著变化，一些剂量在6次注射后显示出与载剂和生理盐水的显著差异。两种制剂在3mg/ml时，随着时间的推移，关节炎症都有稳定下降(图15)。Rgn09和Rgn10都是以3mg/ml的最高剂量使用。
图16所示为用载剂或3剂量的脂质体腺苷治疗后受影响的大鼠胫骨的代表性番红精-O染色切片。在载剂治疗的动物中，软骨蛋白多糖和软骨表面不规则性明显减少。在RgnA09治疗的大鼠中，软骨蛋白多糖有剂量依赖性的改善并且软骨磨损也消失，伴有表面软骨增加。在RgnA10处理的大鼠中，在那些用最高剂量(3mg/ml)处理的大鼠中效果最强，虽然在较低剂量下也观察到软骨的保护。
结论：脂质体腺苷的新制剂在缓解OA膝关节的疼痛和肿胀方面同样有效，甚至更有效，并同时保护和增强软骨。两种制剂都是有效的，而且多层囊泡的腺苷的体外释放优于非脂质体或游离腺苷。
实施例5
该实施例对使用本公开的脂质体的方法进行了描述。
储存稳定的制剂RgnA09和RgnA10：开发并评估了基于脂质组分、溶解效率和保留特性的一系列储存稳定的制剂方案。RgnA09和RgnA10可以在亲水腺苷的浓缩溶液中再水化。在所述再水化过程中，产生了多层脂质体颗粒，其在脂质体的水性隔室中含有腺苷。脂质体尺寸为～10-100微米，并且是亚稳定的，因此其在高热环境下(～40℃)会塌陷成密集形式。当将脂质体限制在局部封闭的隔室、如人膝关节滑膜的滑囊内时，能实现腺苷的持续释放。对RgnA09和RgnA10进行了测试，以评估它们在一段时间内结合和释放腺苷的能力。将无菌玻璃小瓶中的脂质体冻干物与无菌腺苷溶液(3mg/mL，在生理盐水中)混合，提供于预填充塑料注射器中(从Mycoscience Inc.定制)。脂质-腺苷悬浮液的样品(100μL)在37℃下在磷酸盐缓冲生理盐水中孵育0、1、2小时、1、2、5、7、10天。在各孵育时间结束时，在4℃下将样品以23,000×g离心15分钟。除去上清液，将脂质体颗粒重新悬浮在含有0.5％Triton-X100的生理盐水溶液中。通过高效液相色谱法(HPLC)对剩余的完整脂质体中的腺苷浓度进行定量。图1、4和12显示了两种脂质体制剂中腺苷的保留百分比。腺苷有初始突释(RgnA09为1096μM；RgnA10为2014μM)。RgnA09与RgnA10制剂之间没有发现明显的差异。新鲜制备的脂质体悬浮液(时间0)显示RgnA09的腺苷保留率为21％，RgnA10的腺苷保留率为19％。在孵育1小时后，两种制剂的保留率下降到4％，随着时间的推移而缓慢下降，在第10天达到1.4％和2％(分别对应于RgnA09和RgnA10)，相当于159μM和227μM腺苷。这些结果表明，两种脂质体制剂都是包裹和缓慢释放腺苷的良好存储器，其浓度足以在体内活化A2A受体。
进一步测试了新开发的制剂在创伤后OA(PTOA)大鼠模型中的疗效。如上所述，大鼠在ACL破裂后发展出OA。PTOA大鼠被随机分配到实验组。在开始实验之前，进行双足平和疼痛测试。动物被分为10组，分别接受RgnA09或RgnA10的0(空脂质体/载剂)、0.3、1或3mg/ml的腺苷、生理盐水、或制剂，如先前Corciulo等人所述的那样。动物每10天接受一次注射，共6次。每次注射前测量膝关节肿胀，作为衡量关节炎症的标准。在基线(第一次注射前)、在30天(治疗方案的中期)、即将处决前(最后一次注射后7天)对大鼠进行疼痛测试。处决后的关节用组织学和uCT进行分析。疼痛行为通过用双足平衡计测量同侧和对侧后肢之间的负重不对称性来进行(图9)。
在痛觉过敏测试后，将动物放在啮齿动物约束器中，用后爪站立，后肢靠在两个重量平均平台垫上。当动物从各垫上移开它们的重量时，装置在12秒内进行3-4次连续测量来记录平均重量(克)。各个动物的平均值用于进行分析。运动能力还通过旋转杆测试来测量，其提供了在具有膝关节压力和应力情况下的运动功能的评估。将大鼠放置在加速旋转杆上，测定未能停留在杆顶的情况，并用于进一步的分析(数据未示出)。基于双足平衡测试，对于RgnA09，载剂和1mg/mL之间，对于RgnA10，0.3mg和3mg之间，有强烈的剂量交互作用。另外，在30天时(注射3次后)，我们观察到两种制剂在减少关节疼痛方面有稳定的剂量反应趋势，Rgn09的所有剂量都与载剂有显著差异，而3mg的Rgn10与Rgn01和载剂有差异。旋转杆测试也显示出剂量反应趋势以及在60天时最高剂量Rgn10(3mg/ml)的差异。另外，我们观察到两种制剂在关节炎症方面的显著变化，一些剂量在6次注射后显示出与载剂和生理盐水的显著差异。两种制剂在3mg/ml时，随着时间的推移，关节炎症都有稳定下降(图15)。Rgn09和Rgn10可以以3mg/ml的最高剂量使用。
尽管已经针对一个或多个特定实施例描述了本发明，但应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以实施本发明的其他实施例。

Claims (23)

1.一种可注射制剂，其包含生理盐水和脂质体，所述脂质体包含一个或多个层状物，其中，脂质体层状物包含70-100质量％的鞘磷脂，并且当鞘磷脂低于100质量％时，其余部分为1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)或1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG)或DMPC与DPMG的组合，其中，脂质体
(a)直径为50nm-150μm；以及
(b)将腺苷包裹在脂质体的水性隔室中。
2.如权利要求1所述的可注射制剂，其中，脂质体处于亚稳态。
3.如权利要求1所述的可注射制剂，其中，腺苷或其一部分的释放最长达两周。
4.如权利要求1所述的可注射制剂，其进一步包含赋形剂。
5.如权利要求1所述的可注射制剂，其中，制剂适用于关节内注射。
6.如权利要求1所述的可注射制剂，其中，腺苷浓度为0.1-7mg/mL。
7.如权利要求5所述的可注射制剂，其中，腺苷浓度为0.1-4mg/mL。
8.如权利要求1所述的可注射制剂，其中，DMPC与DMPG的比例为6：4至8：2。
9.如权利要求8所述的可注射制剂，其中，DMPC与DMPG的比例为7：3。
10.如权利要求1所述的可注射制剂，其中，总脂质浓度为7-12mg/mL。
11.如权利要求1所述的可注射制剂，其中，一个或多个脂质体的直径为50nm-100μm。
12.如权利要求6所述的可注射制剂，其中，一个或多个脂质体的直径为100nm-150μm。
13.如权利要求1所述的可注射制剂，其中，脂质体塌陷的温度为35-45℃。
14.如权利要求1所述的可注射制剂，其中，至少一部分腺苷是在给个体关节施用后1秒至1小时内释放的。
15.如权利要求14所述的可注射制剂，其中，至少一部分腺苷是在给个体关节施用后1分钟至1小时内释放的。
16.如权利要求15所述的可注射制剂，其中，至少1-20％的腺苷是在给个体关节施用后1分钟至1小时内释放的。
17.如权利要求14所述的可注射制剂，其中，至少一部分腺苷或至少1-20％的腺苷是在给个体关节施用后1秒至10分钟内释放的。
18.一种i)诱导软骨再生和/或ii)缓解关节疼痛和/或炎症和/或iii)减缓和/或阻止和/或逆转进行性结构组织损伤的方法，其包括向个体施用权利要求1所述的可注射制剂，其中，i)软骨再生被诱导和/或ii)关节疼痛和/或炎症被缓解或部分缓解和/或iii)进行性结构组织损伤被减缓或部分减缓和/或被阻止或部分阻止和/或被逆转或部分逆转。
19.如权利要求18所述的方法，其中，可注射制剂通过关节内注射对个体的关节施用。
20.如权利要求18所述的方法，其中，可注射制剂以一次或多次注射的方式来施用。
21.如权利要求18所示的方法，其中，可注射制剂被多次施用，其中，每次施用每10天发生一次。
22.如权利要求18所述的方法，其中，个体患有骨关节炎、类风湿性关节炎、急性痛风性关节炎、和/或滑膜炎。
23.如权利要求19所述的方法，其中，个体是人类或非人类哺乳动物。
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