KR20210135255A - 조작된 면역 세포 - Google Patents

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KR20210135255A
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링 우
니콜라스 로버트 존 개스코인
조안나 브르조스텍
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내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
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Abstract

본 발명은 일반적으로 면역학의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, LCK의 발현 및/또는 기능이 감소되거나 제거되도록 면역 세포가 변형되어 있는, CAR을 발현하는 면역 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상체의 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

조작된 면역 세포
본 발명은 일반적으로 면역학의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR)를 발현하는 면역 세포 및 대상체(subject)의 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
면역요법은 최근에 암 환자의 치료에서 전례 없는 진보를 이루었다. 양자 T-세포 요법에서, 단리된 인간 T 세포는 키메라 항원 수용체의 발현 등에 의해 특정 종양 항원에 대한 이의 특이성을 증강시키기 위해 유전적으로 변형된다. 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포)를 포함하는 양자(adoptive) T-세포 요법은 면역-종양학 파이프라인의 주요 부분이다. 현재까지, 3세대의 CAR-T 기술이 개발되었고, B 세포 악성종양 및 다발성 골수종을 포함하는 다수의 암에 대한 임상 시험에서 사용되어 왔다.
암 치료로서 이의 거대한 유용성에도 불구하고, CAR-T 세포에 의한 양자 면역요법은 세포 표면에서의 내인성 T 세포 수용체의 발현에 의해 부분적으로 제한되었다. 내인성 T 세포 수용체를 발현하는 CAR-T 세포는 동종이계 환자에 대한 투여 후에 메이저 및 마이너 조직적합성 항원을 인식할 수 있다. 이는 비특이적 효과를 갖고, 환자의 이식편-대-숙주 질환(graft-versus-host-disease; GVHD)의 발증을 유도할 수 있다.
CAR-T 세포에 의한 T 세포 양자 면역요법의 또 다른 제한은, 환자에 대한 재관류 후, CAR-T 세포가 PD-1, LAG-3, TIGIT 등의 억제 수용체의 발현으로 인해 "고갈된" 표현형을 나타내기 시작하여 T 세포 효과기(effector) 기능의 소실을 초래한다는 것이다. 이는, 이들 억제성 수용체에 대한 리간드를 종종 발현하는 고형 종양(예를 들면, PD-1의 PD-L1 및 PD-L2)의 특정 문제이고, 고체 종양에 대한 CAR-T 요법의 유용성을 제한한다.
따라서, 상기 문제의 하나 이상을 극복하거나 적어도 경감시킬 필요가 있다.
본원에 제공된 것은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 세포이다.
한 가지 측면에서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 세포로서, 상기 CAR은 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제(LCK)의 부재하에 기능하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain) 또는 단편을 포함하고, 상기 면역 세포는 LCK의 발현 및/또는 기능이 감소 또는 제거되도록 변형되어 있는, 면역 세포가 제공된다.
한 가지 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인 또는 단편은 기능장애 LCK의 존재하에 기능한다.
한 가지 측면에서, CAR을 발현하는 면역 세포가 제공되고, 여기서 상기 면역 세포는, LCK 유전자의 발현 또는 기능이 파괴되도록 상기 면역 세포가 변형되어 있다.
한 가지 측면에서, 본원에 정의된 면역 세포를 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은, LCK의 발현 및/또는 기능을 감소 또는 제거하기에 충분한 시간 동안 및 이러한 조건하에서 면역 세포를 LCK의 억제제와 접촉시키는 것을 포함한다.
한 가지 측면에서, 1) LCK의 억제제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 2) CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 벡터 시스템이 제공된다.
한 가지 측면에서, LCK의 억제제를 코딩하는 핵산 서열 및 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터가 제공된다.
한 가지 측면에서, 세포 치료에서 CAR-발현 면역 세포의 효능을 향상시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 LCK의 발현 및/또는 기능을 감소 또는 제거하기에 충분한 시간 동안 및 이러한 조건하에서 CAR-발현 면역 세포를 LCK의 억제제와 접촉시키는 것을 포함한다.
한 가지 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 제공되고, 이 방법은 대상체를 치료하기에 충분한 시간 동안 및 이러한 조건하에서, 본원에 정의된 면역 세포를 투여하는 것을 포함한다.
한 가지 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 정의된 면역 세포가 제공된다.
한 가지 측면에서, 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 본원에 정의된 면역 세포의 용도가 제공된다.
본 발명의 일부 실시형태는 하기를 포함하는 첨부 도면을 참조하여 비제한적 예로서만 설명된다.
도 1. CHO 세포를 제시하는(presenting) 인공 항원은 CAR 및 TCR T 세포 자극을 위한 항원을 제공한다. (A) CAR 작제물의 개략도. Myc-tag는 CAR 발현의 검출에 사용된다. (B) Jurkat 76의 렌티바이러스 형질도입 후의 LMP2A 펩티드(L2)-특이적 CAR 또는 TCR의 발현. CAR 작제물을 항-Myc 항체를 사용하여 염색하고, TCR 발현을 항-CD3 항체에 의해 동정했다. (C) 본 연구에서 사용된 3개의 T 세포주에 대한 내인성 TCR 발현. Jurkat 76 세포주는 주로 연구의 주요 세포주로서 사용되었다. (D) 단일-펩티드 시스템으로서 공유 융합된 펩티드 서열을 갖는 일본쇄 HLA 작제물의 개략도가 상부 패널에 도시되어 있다. 하부 좌측 패널은 특정 항원 HLA-A2-L2 또는 무관한 항원 HLA-A2-GAG를 발현하는 각 CHO-APC에서 L2-특이적 TCR-유사 Ab를 사용한 염색을 도시한다. 하부 우측 패널은 모노-펩티드 시스템에서 특정 펩티드 또는 무관한 펩티드에 대한 L2-특이적 CAR-T의 반응성을 도시한다. 데이터는 적어도 3회의 실험으로부터 수득된, 기술적 3회의 평균 ± SD로서 플롯된다. (E) 다중-펩티드 시스템으로서 공유 융합된 펩티드 서열을 포함하지 않는 일본쇄 HLA 작제물의 개략도가 상부 패널에 도시되어 있다. 하부 좌측 패널은, 그루브-개방 HLA-A2에 펄스되고 대응하는 특정 TCR-유사 Ab에 의해 염색된 상이한 펩티드를 도시한다. 하부 우측 패널은, 다중 시스템에서 펄스 또는 비펄스된 각 특정 펩티드에 대한 EBNA1 펩티드(El), LMP1 펩티드(L1) 또는 LMP2A 펩티드(L2)-특이적 CAR-T의 반응성을 도시한다. 데이터는 적어도 3개의 독립적 실험을 나타내고, 기술 3회의 평균 ± SD로서 플롯된다. (*, p < 0.05, 및 유의성 없음(NS), P > 0.05)
도 2. TCR-유사 CAR의 활성화는 CD8에 의해 증강되지 않고, LCK 없이 T 세포 신호전달을 형질도입한다. (A) 전체 내부 반사 현미경(TIRFM)을 사용한 CD8 동원. CD8α는 mCherry 형광 단백질로 표지되었고, 일본쇄 HLA는 클로버 형광 단백질과 공유적으로 융합되었다. 좌측 패널은 이미징 데이터를 나타낸다. 우측 패널은 배경 보정된 평균 형광 강도의 정량화된 데이터이다. 데이터는 평균 ± SD, n > 80 세포 접합체(****, p < 0.0001)로서 플롯되고, 2개의 독립적 실험이 수행되었다. (B) CD8을 포함하거나 포함하지 않는 CAR-T 및 TCR-T의 칼슘 플럭스. 곡선은 Flowjo의 동적 프로그램에 의해 시뮬레이션(simulation)된다. 데이터는 적어도 3개의 독립적 실험을 나타낸다. (C) CD8 공수용체를 갖거나 갖지 않는 CAR 및 TCR 반응성. 모노-펩티드 시스템에서 제시된 GAG의 특정 펩티드 L2 또는 무관한 펩티드 에피토프는 각각 CHO-L2 또는 CHO-GAG로서 표지된다. 데이터는, 적어도 3회의 독립적 실험으로부터, 기술적 3회의 평균 ± SD(***, p < 0.001, 유의성 없음(NS), p > 0.05)로서 플롯된다. (D) CAR 또는 TCR-Jcam1.6 세포에서 LCK 또는 FYN 발현의 웨스턴 블롯 검출(좌측 패널). LCK-결핍 세포주 Jcam1.6에서 CAR 또는 TCR의 반응성(우측 패널). 데이터는 적어도 3개의 독립적 실험을 나타내고, 기술적 3회의 평균 ± SD로서 플롯된다. (E) CAR-Jcam 세포의 칼슘 플럭스. 곡선은 Flowjo의 동적 프로그램에 의해 시뮬레이션된다. 데이터는 적어도 3개의 독립적 실험을 나타낸다.
도 3. LCK-독립성 CAR 신호전달은 CD28 공자극 도메인을 필요로 한다. (A) 항-CD19 scFv의 세포외 인식 도메인을 갖는 CAR 작제물의 개략도. 이러한 작제물의 반응성은 우측에 도시되어 있다. (B) CD3ζ 도메인의 결실을 갖는 CAR 작제물의 개략도. 이러한 작제물의 반응성은 우측에 도시되어 있다. (C) 공자극 도메인이 변경된 CAR 작제물의 개략도: CD28 결실(CAR-1), CD137 세포내 영역으로의 치환(CD137-CAR), 및 CD28 및 CD137 둘 다로부터의 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 제3 세대 CAR 작제물(CD28/CD137-CAR). 작제물의 반응성은 우측에 도시되어 있다. (D) CD28 세포내 도메인은 YMNM 또는 PYAP 모티브에서 결실 또는 돌연변이에 의해 돌연변이되었다. (E) 공-자극인자 CD80 및 CD86과 함께 특정 항원 HLA-A2-L2를 발현하는 CHO-L2/CD80-CD86 세포에 의한 JCam1.6 T 세포 상의 CAR1의 CD28 공자극의 개략도. Jcam1.6 세포에서 CD28과 함께 CAR1 또는 TCR 공-자극의 반응성은 우측에 도시되어 있다. 이 도면에서 모든 데이터는 적어도 3개의 독립적 실험을 나타내고, 기술적 2회의 평균 ± SD로서 플롯된다.
도 4. CD28-CAR은 FYN에 의존하여 하류 신호전달을 형질도입한다. (A) SFK 억제제 PP2에 의한 CAR 및 TCR-Jurkat의 반응성. 적어도 3개 실험의 대표적 데이터는 기술적 3회의 평균 ± SD로서 플롯된다. (B) 상이한 농도(nM)에서 특정 LCK 또는 FYN 억제제, A770041 또는 SU6656의 존재하에 CAR 및 TCR-Jurkat의 반응성. IL-2 생산은 log(억제제 농도)에 대한 상대적 반응(%)으로서 제어되도록 정규화되었고, 데이터는 기술적 3회의 평균 ± SD로서 플롯되어 있다. (C) 상이한 시점에서의 FYN의 포스포릴화(pY420). APC는 특정 CHO-L2를 나타낸다. 하기 나타낸 수치는 전체 FYN의 강도 값에 대한 pY420 퍼센트의 강고 값을 계산함으로써 결정된 pY416의 상대 밴드 강도를 나타낸다. cCBL 또는 PLCγ1은 각각 CD28-CAR-Jcam 또는 TCR-Jcam에 대한 로딩 대조군으로서 각각 도시되어 있다. (D) CAR, TCR 및 CAR-1에 의해 상이한 시점들에서 TCR 신호전달 경로 분자 PLCγ1, Erk 및 CD3ζ의 포스포릴화. 각각의 포스포릴화의 상대 밴드 강도는 총 PLCγ1, Erk 또는 Erk의 강도 값에 대한 pPLCγ1, pErk1/2 또는 pCD3ζ의 강도 값을 계산함으로써 결정되었다. (E) CRISPR-Cas9에 의한 유전자 편집 후에 LCK 또는 FYN 녹아웃 Jurkat에서의 LCK 및 FYN의 발현. (F) LCK 또는 FYN 녹아웃 Jurkat에서 TCR 및 CAR의 IL-2 생산. 데이터는 적어도 3개의 독립적 실험을 나타내고, 기술적 3회의 평균 ± SD로서 플롯된다(*, p < 0.05, 및 ***, p < 0.0001).
도 5. LCK-결핍 CAR-T는 활성화 역치를 리셋(reset)하고, CAR 및 TCR 둘 다를 발현하는 T 세포에서 CAR 트리거링(triggering)만을 선택적으로 가능하게 한다. (A) 비펄스(unpulsed) HLA-A2 CHO APC 또는 특정 펩티드-펄스 HLA-A2 CHO APC에 반응하는 상이한 양의 CAR 발현을 갖는 CAR-Jurkat 세포. 좌측 및 중앙 패널은 선별 후의 CAR-Jurkat 세포에서 CAR 발현을 나타낸다. 우측 패널은 특정 펩티드-펄스 또는 비펄스 CHO-HLA-A2에 대해 상이한 양의 CAR 발현에 대한 CAR-Jurkat의 반응성을 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적 실험으로부터 기술적 3회의 평균 ± SD로서 플롯된다. (B) CAR-Jcam, CAR-JE6-1 및 CAR-Jurkat 76의 CAR 활성화 특이성의 비교. 데이터는 3개의 독립적 실험으로부터 기술적 3회의 평균 ± SD(*, p < 0.05, **, p < 0.01 및 ***, p < 0.0001)로서 플롯된다. (C) 외인성 LCK를 갖거나 갖지 않는 CAR-Jcam 세포의 특이성. 좌측 패널은 웨스턴 블롯에 의해 형질도입 후의 LCK 발현을 나타낸다. FYN 염색을 대조군으로서 사용했다. 우측 패널은 비펄스 HLA-A2 CHO APC 또는 특정 펩티드-펄스 HLA-A2 CHO APC에 대한 LCK-형질도입된 또는 비-형질도입된 CAR-Jcam 세포의 반응성을 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적 실험으로부터 기술적 3회의 평균 ± SD(**, p < 0.01 및 ***, p < 0.0001)로서 플롯된다. (D) LCK-충분 또는 결핍 Jurkat T 세포에서 TCR 및 CAR의 반응성 선택성. 상부 패널은 LCK-충분 또는 결핍 Jurkat T 세포에서 발현되는 E183 펩티드-특이적 TCR 또는 LMP2 펩티드-특이적 CAR의 개략도를 나타낸다. 하부 패널은 각각 CHO-E183 또는 CHO-L2에 대한 각 그룹의 반응성을 나타낸다. CHO-E183은 E183 펩티드만을 제시하는 모노-펩티드 CHO APC이다. 유사하게는, CHO-L2는 단지 A2-LMP2 펩티드만을 제시한다. 데이터는 적어도 3개의 독립적 실험을 나타내고, 기술적 3회의 평균 ± SD로서 플롯된다.
도 6. LCK-결핍 CAR-T 세포는 감소된 PD-1을 발현하고, 자극 후의 감소된 CAR 하향조절을 나타낸다. (A) L2 특이적 CAR-T를 CHO-L2로 18시간 자극한 후의 PD-1 상향조절. CAR 또는 TCR의 양은 각각 항-Myc 태그 항체 또는 항-CD3 항체에 의해 검출되었다. 하부 패널은 상기 도트 플롯에 대응하는 PD-1 및 CAR 또는 CD3의 히스토그램이다. 데이터는 적어도 3개의 독립적 실험을 나타낸다. (B) CAR-T 및 TCR-T에 대한 연속 자극 실험의 개략도, CAR-T 및 TCR-T는 특정 CHO-APC로 분리되었고, 18시간, 42시간 및 66시간에서 분석을 위해 샘플링되었다. 6시간 동안 휴식한 후, CAR-T 및 TCR-T를 24시간 및 48시간 동안 재자극시켰다. (C) 연속 자극 후의 PD-1 발현. PD-1 MFI는 PD-1 양성 모집단의 측정에 의해 결정했다. 데이터는 기술적 3회의 평균 ± SD로서 플롯된다(****, p < 0.0001). (D) 연속 자극 후의 CAR 또는 TCR 하향조절. %는 자극 전의 합계 CAR 또는 CD3 MFI에 대한 자극 후의 합계 CAR 또는 CD3 MFI의 비율에 의해 결정되었다. 데이터는 기술적 3회의 평균 ± SD로서 플롯된다(****, p < 0.0001).
도 7. CAR-T 및 TCR-T의 CD8 동원 및 기능적 영향. (A) CD8α-mCherry 형질도입. (B) 형광 현미경에서 시냅스 및 CD8 동원. 좌측 패널은 대표적 이미지 그래프(n ≥ 5)이고, GFP 채널은 CHO-APCCD19의 존재를 검출하고, mCherry는 CD8α-mCherry의 국재화를 검출했다. 우측 패널은, 시냅스의 mCherry MFI 및 외부 시냅스의 mCherry MFI에 의해 계산된, 평균 형광 강도(MFI) 비의 정량화된 데이터이다. 컷 오프 값(1.5)은 청색 점선에 의해 표시된다. 데이터는 평균 ± SD, n ≥ 5 세포 접합체로서 플롯된다(ns, p > 0.05). (C) CAR-Jurkat 또는 TCR-Jurkat 세포에서 CD8α 및 CD8β 작제물의 동시-형질도입. CD8α 및 CD8β 작제물은 상이한 렌티바이러스 상에 존재하고, CAR 또는 TCR-Jurkat 세포에서 동시-형질도입되었다. (D) CD8α 및 CD8β 동시 형질도입 후의 CAR 및 TCR 발현. HLA-A2-L2 사량체를 CAR-T 및 TCR-T 염색에 사용했다. 또한, TCR 발현은 항-CD3 항체에 의해 검출되었다. 합계 MFI는 각 그래프의 우측에 표시되어 있다.
도 8. 세포주 CHO-APC-CD80/CD86 발현. (A) Daudi 또는 Jurkat 세포에서 CD19 발현. (B) Jurkat 또는 Jcam1.6 세포주에서의 CD28 발현. (C) CHO-L2 APC에서의 CD80 및 CD86의 공-발현. CD80 및 CD86은 P2A 절단가능한 링커에 의해 연결되었다. CD80-P2A-CD86 작제물은 하나의 렌티바이러스 벡터 상에 있었다.
도 9. CAR-T 및 TCR-T에 대한 SRC 패밀리 키나제, LCK 및 FYN의 영향. (A) SFK PP2의 존재 또는 부재에 따른 CAR-Jcam 세포의 IL-2 생산. 데이터는 기술적 3회의 평균 ± SD로서 플롯된다. (B) CAR-Jurkat 또는 TCR Jurkat 세포에 대한 LCK- 또는 FYN-특이적 억제제의 IC50. 좌측 그래프는 LCK 억제제를 사용한 것이고, 우측 그래프는 FYN 억제제를 사용한 것이다. (C) 특정 HLA-A2-L2 사량체를 배지에 첨가한 후의 CAR2-Jcam 또는 CAR1-Jcam의 칼슘 플럭스. Jcam1.6 세포에 CD28 공자극 도메인을 갖는 제2 세대 CAR은 CAR2-Jcam으로 표지되고, Jcam1.6 세포 중의 제1 세대 CAR은 CAR1-Jcam으로 표지된다(3회 이상의 실험의 대표). (D) LCK KO 및 FYN KO 단일 클론 선택. LCK KO의 클론 20이 Jurkat LCK KO 세포로서 선택되고, FYN KO 중의 클론 8이 Jurkat FYN KO 세포로서 선택되었다. (E) CAR-Jurkat FYN KO 및 CAR-Jurkat, 또는 TCR-Jurkat FYN KO 및 TCR-Jurkat에서의 CAR 또는 TCR 발현의 검출. CD3은 TCR 발현의 지표로서 사용되었다. (F) CAR-Jurkat FYN KO 및 CAR-Jurkat, 또는 TCR-Jurkat FYN KO 및 TCR-Jurkat에서의 FYN 및 LCK의 발현, c-CBL을 내부 대조군으로서 사용했다.
도 10. LCK 결핍 CAR-T의 특이성 및 수용체 선택. (A) LCK의 존재 또는 부재에 따른 CAR-Jcam에 의한 IL-2 생산. 기술적 3회의 평균 ± SD로서 플롯된, 적어도 3회의 실험으로부터 대표적 데이터. (B) Jurkat에서의 CAR 또는 TCR 발현. TCR은 HB 항원, E183으로부터의 펩티드 에피토프에 특이적이다. CAR은, 상기한 바와 같이, LMP2a 단백질로부터 펩티드 에피토프(L2)에 특이성을 갖는다.
도 11. CAR 신호전달을 시험하기 위한 시스템. (A) Jurkat 76, Jcam1.6 및 JE61의 CD8 및 CD4 발현. (B) El-CAR, Ll-CAR 및 L2-CAR의 전기천공 및 18시간 후의 이들의 발현(n ≥ 3). (C) 다중-펩티드 CHO-APC 시스템에서 HLA-A2 및 특정 펩티드 L2 제시. 펩티드를 배지 중의 상이한 농도에서 3시간 동안 펄스화했다. 이어서, CHO-APC를 트립신처리하여 항-HLA-A2 항체(BB7.2) 또는 L2 특이적 TCR-유사 항체(n ≥ 3)로 염색했다.
도 12. 연속 자극 후의 CAR 또는 TCR 발현. CAR 또는 TCR의 발현은 항-myc 또는 항-CD3 항체에 의해 검출되었다. (≥ 3 실험의 대표).
도 13. CAR을 LCK 유전자좌(locus)에 표적화하면, 1차 CD8 + T 세포가 보다 많은 기억 및 보다 적은 표현형으로 전환되고, 생체내 효능을 증강시킨다. (A) LCK 유전자좌로의 CRISPR/Cas9-표적화된 CAR 통합의 개략도. 상부, LCK 유전자좌. 하부, 좌측 및 우측의 상동 아암(arm)의 lkb 인접 영역을 갖는 CAR 카세트를 포함하는 DNA 공여자 디자인. (B) LCK-유전자좌 CAR-T, 종래의 CAR-T 및 대조군 CD8 + T 세포에 대한 표적으로서 CD19-발현 Daudi 및 Raji 세포의 세포독성 검정. 세포독성(%)은 식(LDH방출-음성)/(LDHr방출 max-음성)에 의해 계산되었다. 데이터는 3개의 독립적 실험을 나타내고, 기술적 3회의 평균 ± SD로서 플롯팅(plotting)된다(NS, p > 0.05). (C) 휴지 상태(공급 세포에 의해 선별 및 재자극 후의 5일차)의 T 세포에서 CAR, 소모, 및 기억 마커 발현의 FACS 분석. 2개 공여자의 대표. (D) 상이한 E:T 비율에서 표적 세포와 조우한 후의, 소모의 레이더 챠트 요약, 및 T 세포에서 기억 마커의 발현. 축은 T 세포에서의 발현 백분율이다. 데이터는 2개의 독립적 실험을 나타낸다. (E) 생체내 동물 모델의 개략도. 암세포 투여는 0일차로서 지정되었다. (F) 마우스의 생존의 카플란-멜러 분석. 그룹당 n = 5마리 마우스, 로그-랭크 Mantel-Cox 시험. (G, H) Raji 보유 마우스를 5 × 106 CAR-T 세포로 처리했다. 11일 및 18일차에 마우스를 안락사시켰다. 골수 CAR-T 세포를 분석하고, 기억 T 세포(CD45RO+)의 백분율을 11일 및 18일차에 FACS에 의해 검출했다. 소모 마커 발현을 11일차에 분석했다. 그룹당 n = 4마리 마우스, 도트 = 1마리 마우스, CAR-T = 청색 정사각형 도트, LCK-유전자좌 CAR-T = 적색 원형 도트. 모든 데이터는 평균 ± SD(NS, p > 0.05, *, p < 0.05, 및 **, p < 0.01)이다.
도 14. LCK 유전자좌 CAR-표적화된 1차 CAR-T 세포. (A) LCK 유전자좌-표적화된 CRISPR/Cas9 편집 후의 CD8 + CAR + CAR-T 세포의 백분율. 적어도 3회의 실험으로부터의 대표적 데이터. (B) 선별된 LCK-유전자좌 CAR-T 세포의 LCK 단백질 발현. 좌측, 종래의 CAR-T와의 비교. 우측, LCK-유전자좌 CAR-T 세포에서 절단된 LCK의 존재. 적어도 3회의 실험으로부터의 대표적 데이터. (C) LCK 유전자의 표적 부위의 유전자형. 정방향 프라이머: 5'-AGGGAGAGGTGGTGAAACATTA-3', 역방향 프라이머: 5'-GAATGGAGTAGGGCATTGAAAG-3'. (D) CD19+ Daudi 세포 및 CD19-Jurkat 세포에 대한 LCK 유전자좌 CAR-T의 세포독성. 데이터는 기술적 3회의 평균 ± SD로서 플롯된다(****, p < 0.0001, NS, p > 0.05). (E) 다양한 E:T 비율에서 표적 세포와 조우한 후의 종래의 CAR-T 세포에서의 고갈 및 기억 마커 발현. 데이터는 2개의 독립적 실험의 대표이다. (F) 5 × 106 LCK-유전자좌 CAR-T 세포 그룹에서 생존 마우스의 다기관에서 항-인간 CD20 항체 염색. (G) CAR-T 세포(CD8 +/Live) 및 암(CD20+/Live) 세포는 FACS에 의해 골수에서 검출 및 계수했다. 그룹당 N = 4마리 마우스(NS, p > 0.05).
한 가지 측면에서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 세포가 제공되고, 여기서 상기 CAR은 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제(LCK)의 부재하에 기능하는 세포내 신호전달 도메인 또는 단편을 포함하고, 상기 면역 세포는 LCK의 발현 및/또는 기능이 감소되거나 제거되도록 변형되어 있다.
한 가지 실시형태에서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 세포가 제공되고, 여기서 상기 CAR은 LCK의 부재 또는 기능장애 LCK의 존재하에 기능하는 세포내 신호전달 도메인 또는 단편을 포함하고, 상기 면역 세포는 LCK의 발현 및/또는 기능이 감소되거나 제거되도록 변형되어 있다.
이론에 구속되지 않고, 본 발명자들은 T 세포 수용체(TCR) 신호전달에서 중요한 신호전달 키나제인 SRC-패밀리 키나제 LCK가 CAR 신호전달에 필수적일 수 있다는 것을 발견했다. LCK는 TCR-매개된 신호전달에 중요하기 때문에, CAR-T 세포에서 LCK를 결실 또는 억제하는 것은 CAR에 의한 항원 인식만이 T 세포의 활성화를 유도할 수 있다는 것을 보장할 수 있다. 이는 비-표적(off-target) 효과를 감소시킬 수 있고, 따라서 CAR 기술의 안전성을 증가시킬 수 있다. 이는 또한, 내인성 TCR에 의해 유발되는 자가면역의 발생을 회피하고, 동종이계 CAR-T 세포에 대한 이식편 대 숙주 질환의 가능성을 감소시키는 것을 도울 수 있다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은, 면역 효과기 세포에서, 표적 세포, 전형적으로 암 세포에 대한 특이성, 및 세포내 신호 생성을 세포에 제공하는 폴리펩티드의 세트를 지칭할 수 있다. CAR은 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하기 정의된 바와 같은 1차 신호전달 도메인 및/또는 공자극 도메인으로부터 유래하는 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인(본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로 지칭됨)을 포함한다. 폴리펩티드의 세트는 서로 인접할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드의 세트는, 이량체화 분자의 존재시에, 폴리펩티드를 서로 결합할 수 있고, 예를 들면, 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 결합할 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다.
한 가지 실시형태에서, CAR은 표 1에 나타낸 바와 같은 핵산 또는 아미노산 서열을 갖는다.
한 가지 실시형태에서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 세포가 제공되고, 여기서 상기 CAR은 LCK의 부재하에 기능하는 세포내 신호전달 도메인 또는 단편을 포함하고, 상기 면역 세포는 LCK의 발현 및/또는 기능이 녹아웃(knock-out) 또는 녹다운(knock-down)되도록 변형되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 신호화 도메인은 CAR 함유 세포(예를 들면, CART 세포)의 면역 효과기 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 예를 들면, CART 세포에서 면역 효과기 기능의 예는 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 세포가 제공되고, 여기서 CAR은 LCK의 부재하에 기능하는 CD28 또는 CD28의 단편을 포함하고, 여기서 LCK의 발현 및/또는 기능은 녹아웃 또는 녹다운되도록 변형되어 있다.
세포내 신호전달 도메인 또는 단편은 LCK의 부재 또는 기능장애 LCK의 존재하에 기능하는 것일 수 있다. LCK의 부재 또는 기능장애 LCK의 존재하에 기능하는 세포내 신호전달 도메인 또는 단편은 FYN과 상호작용할 수 있고/있거나 FYN에 의해 포스포릴화될 수 있고, 따라서 LCK-독립적 신호전달을 유발할 수 있는 것일 수 있다. 세포내 신호전달 도메인은, 예를 들면, ADD2, BCAR1, c-Raf, CBLC, CD28, CD36, CD44, CDH1, CHRNA7, CTNND1, CBL, CSF1R, DLG4, 디스트로글리칸(Dystroglycan), EPHA8, FYB, FASLG, GNB2L1, GRIN2A, ITK, 야누스 키나제(Janus Kinase) 2, KHDRBS1, LKB1, 네프린(Nephrin), PAG1, PIK3R2, PRKCQ, PTK2B, PTK2, PTPRT, UNC119, RICS, SH2D1A, SKAP1, Syk, TNK2, TRPC6, 타우(Tau) 단백질, TrkB, TYK2, TUBA3C, WAS 또는 ZAP-70의 신호전달 도메인 또는 단편을 포함할 수 있다. LCK의 부재 또는 기능장애 LCK의 존재하에 기능하는 세포내 신호전달 도메인 또는 단편은, LCK-독립적 신호전달을 유발할 수 있는 CD28 또는 CD28의 단편일 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 LCK의 부재하에 또는 기능장애 LCK의 존재하에 기능하는 CD28 단백질의 신호전달 도메인 또는 단편을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 PYAP 모티브를 갖는 CD28 단백질의 신호전달 도메인 또는 단편을 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 하기 서열을 포함한다:
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열번호 1).
한 가지 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, FcR 감마, Fc 엡실론 RI 베타, CD79a, CD79b, Fc 감마 RIIa, DAP10 또는 DAP12로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 1차 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 하기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공자극 도메인으로부터 유래하는 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 DAP10, CD28, CARD11, SLAMF1, LCK1, LCK3, LAT, OX40, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 공자극 도메인을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, CAR은 세포외 항원-결합 도메인을 포함한다. 항원 결합 도메인은, 예를 들면, 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항원-결합 도메인은 또한, B 림프구 상의 자가항원-특이적 B 세포 수용체에 의해 인식될 수 있는 자가항원일 수 있고, 따라서 항체-매개 자가면역 질환에서 자가반응성 B 림프구를 특이적으로 표적화 및 사멸시키도록 T 세포를 지시할 수 있다. 항원-결합 도메인은 또한 펩티드 또는 단백질 리간드일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래하는 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 지칭할 수 있다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날, 다중쇄 또는 일본쇄, 또는 무손상 면역글로불린일 수 있고, 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래할 수 있다.
용어 "항체 단편"은 항원의 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 일부를 지칭할 수 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, 디설파이드-결합된 Fv(sdFv), VH 및 CHI 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 선형 항체, sdAb(VL 또는 VH) 등의 단일 도메인 항체, 낙타 VHH 도메인, 힌지 영역에서 디설파이드 브리지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편 등의 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체, 및 항체의 단리된 CDR 또는 기타 에피토프 결합 단편을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv에 도입될 수 있다.
한 가지 실시형태에서, "항체 단편"은 scFV이다.
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하고, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들면, 합성 링커, 예를 들면, 짧은 유연한 폴리펩티드 링커를 통해 연속적으로 연결되고, 일본쇄 폴리펩티드로서 발현될 수 있으며, scFv는 그것이 유래하는 무손상 항체의 특이성을 보유한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, scFv는, 예를 들면, 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 말단에 대해, VL 및 VH 가변 영역을 어느 순서로 가질 수 있고, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
CAR은 항원 결합 도메인으로 지칭되는 표적 특이적 결합 요소를 포함할 수 있다. 부분의 선택은 표적 세포의 표면을 정의하는 리간드의 유형 및 개수에 의존한다. 예를 들면, 항원 결합 도메인은 특정 질환 상태와 연관된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서, CAR의 항원 모이어티 도메인에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염, 자가면역 질환 및 암 세포와 관련된 것들을 포함한다.
CAR은 종양 세포 상의 항원에 특이적으로 결합하는 목적하는 항원 결합 도메인을 조작함으로써 목적 종양 항원을 표적화하도록 조작될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "종양 항원" 또는 "과증식성(overproliferative) 장애 항원" 또는 "과증식성 장애와 관련된 항원"은 암 등의 특정 과증식성 장애에 공통하는 항원을 지칭한다. 본원에 논의된 항원은 단지 예로서 포함된다. 이 목록은 배타적인 것으로 의도되지 않으며, 추가의 예는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 용이하게 명백할 것이다.
종양 항원은 면역 반응, 특히 T-세포 매개 면역 반응을 유발하는 종양 세포에 의해 생성되는 단백질이다. 본 발명의 항원 결합 도메인의 선택은 치료되는 암의 특정 유형에 의존할 것이다. 종양 항원은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 신경교종 관련 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 섬모성 고나도트로핀, 알파페토프로테인(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, M-CSF, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서비빈 및 텔로머라제, 전립선암 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타아제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체, 엽산 수용체(FRa) 및 메소텔린을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 종양 항원은 엽산 수용체(FRa), 메소텔린, EGFRvIII, IL-13Ra, EGFR, CA-IX, MUC1, HER2 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 가지 실시형태에서, 제1 CAR은 메소텔린에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 제2 CAR은 FRa에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 가지 실시형태에서, CAR은 HER2에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 종양 항원은 악성 종양과 연관된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격을 위한 표적 항원으로서 기능할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 이들 분자는 흑색종의 MART-1, 티로시나제 및 GP 100 등의 조직-특이적 항원 및 전립선암의 전립선 산성 포스파타제(PAP) 및 전립선-특이적 항원(PSA)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 다른 표적 분자는 암유전자 HER-2/Neu/ErbB-2 등의 형질전환 관련 분자의 그룹에 속한다. 또한, 또 다른 그룹의 표적 항원은 암배아 항원(CEA) 등의 종양-태아 항원이다. B-세포 림프종에서, 종양 특이적 이디오타입 면역글로불린은 개별 종양에 고유한 진정한 종양-특이적 면역글로불린 항원을 구성한다. CD19, CD20 및 CD37 등의 B-세포 분화 항원은 B-세포 림프종의 표적 항원에 대한 다른 후보이다. 이들 항원의 일부(CEA, HER-2, CD19, CD20, 이디오타입)는 모노클로날 항체에 의한 수동 면역 요법의 표적으로서 사용되어 왔지만, 성공은 제한되어 있다.
본 발명에서 언급되는 종양 항원의 유형은 또한 종양 특이적 항원(TSA) 또는 종양 관련 항원(TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 고유한 것이고, 체내의 다른 세포 상에서는 발생하지 않는다. TAA 관련 항원은 종양 세포에 고유한 것이 아니고, 그 대신에, 항원에 대한 면역학적 내성의 상태를 유발하지 않는 조건하에서 정상 세포 상에서 발현된다. 종양 상에서 항원의 발현은 면역 시스템이 항원에 반응하도록 하는 조건하에서 발생할 수 있다. TAA는 면역 시스템이 미성숙 및 반응할 수 없는 태아의 발달 중에 정상 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있거나, 정상 세포에서는 통상 매우 낮은 수준으로 존재하지만, 종양 세포에서는 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비제한적 예는 다음을 포함한다: MART-1/MelanA(MART-I), gp100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2 등의 분화 항원, 및 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15 등의 종양 특이적 다계통 항원; CEA 등의 과발현된 배성 항원; p53, Ras, HER-2/neu 등의 과발현 암유전자 및 돌연변이된 종양-억제 유전자; 염색체 전좌에 기인하는 독특한 종양 항원; 예컨대, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 엡슈타인 바르 바이러스 항원 EBVA, LMP2(예: LMP2A 또는 LMP2B) 등의 바이러스 항원, 및 인간 파필로마바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 거대 단백질-기반 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erb-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, β-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, α-페토단백질, β-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3/CA 27.29/BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68/P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733/EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90/Mac-2 결합 단백질/사이클로필린 C-관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP 및 TPS을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, scFV는 항-CD19 scFV 도메인이다. 항-CD19 scFV 도메인은, 예를 들면,
a) DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSG TDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS (서열번호 2)의 서열을 가질 수 있다.
한 가지 실시형태에서, scFV는 LMP2A 단백질 펩티드 중 하나를 제시하는 펩티드-MHC 복합체에 결합할 수 있는 scFV이다. scFV는, 예를 들면,
a) QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISR LSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCARNWVPYYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCRASQNVFTNVAWYQQKPGQAPKALIYSTSYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYISYPLTFGAGTKLELK (서열번호 3)의 서열을 가질 수 있다.
한 가지 실시형태에서, scFV는 항-LMP2 scFV 도메인이다.
"항체 단편"은 표적화될 항원에 따라 당해 기술분야계에 공지된 항체 단편 서열의 다른 항체를 포함할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 신호 펩티드는, 예를 들면, MALPVTALLLPLALLLHAARP (서열번호 4)의 서열을 가질 수 있다.
CAR은 표 1에 제시된 바와 같은 단백질 서열을 갖는 CAR일 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 면역 세포는 재조합 면역 세포이다. 용어 "재조합"은 이종성 핵산의 도입에 의해 변형된 세포, 또는 이러한 방식으로 변형된 세포로부터 유래하는 세포에 대한 언급을 포함하지만, 의도적 인간의 개입 없이 발생하는 것과 같은 자연적으로 발생하는 이벤트(예를 들면, 자연 돌연변이, 자연 형질전환, 자연 형질도입, 자연 전위)에 의한 세포의 변화는 포함하지 않는다. 재조합 면역 세포는 비-천연 세포일 수 있다. 재조합 면역 세포는 또한 조작된 세포일 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 재조합 면역 세포는 조작된 T-세포 또는 조작된 NK 세포 등의 조작된 면역 세포이다. 한 가지 실시형태에서, 재조합 면역 세포는 단리된 면역 세포이다.
한 가지 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다.
본원에서 언급되는 바와 같은 용어 "면역 세포"는, 조혈 기원이고 면역 반응에서의 역할을 수행하는 세포를 포함한다. 면역 세포는 B 세포 및 T 세포 등의 림프구; 천연 킬러(NK) 세포; 단핵구, 마크로파지, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구 및 과립구 등의 골수성 세포를 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 면역 세포는 면역 효과기 세포이다. 본원에서 사용되는 용어 "면역 효과기 세포"는 면역 반응, 예를 들면, 면역 효과기 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 효과기 세포의 예는 T 세포, B 세포, 천연 킬러(NK) 세포, 천연 킬러 T(NKT) 세포, 비만 세포 및 골수-유래 식세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "면역 효과기 기능 또는 면역 효과기 반응"은, 예를 들면, 표적 세포의 면역 공격을 증강 또는 촉진하는 면역 효과기 세포의 기능 또는 반응을 지칭한다. 예를 들면, 면역 효과기 기능 또는 반응은 표적 세포의 성장 또는 증식 억제를 촉진하는 T 세포 또는 NK 세포의 특성을 지칭한다. T 세포의 경우, 1차 자극 및 공-자극은 면역 효과기 기능 또는 반응의 예이다.
용어 "자극"은 자극 분자(예를 들면, TCR/CD3 복합체 또는 CAR)와 이의 동족 리간드(또는 CAR의 경우에 종양 항원)의 결합에 의해 유도된 1차 반응을 지칭하고, 이에 의해 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달 또는 적절한 NK 수용체 또는 CAR의 신호전달 도메인을 통한 신호 전달 등(이들로 한정되지 않음)의 신호 전달 이벤트를 매개한다. 자극은 특정 분자의 발현의 변화를 매개할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "T 세포"는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 용어 T 세포는 또한 T 헬퍼 1형 T 세포 및 T 헬퍼 2형 T 세포 둘 다, 및 또한 Th-IL 17 세포를 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 면역 세포는 LCK의 발현 및/또는 기능이 감소되거나 제거되도록 변형되어 있다. 면역 세포는, 예를 들면, LCK 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-다운(knock down)을 수득하기 위해 변형시킬 수 있다. 용어 "녹-아웃"은 유전자의 제거 또는 유전자의 발현을 지칭할 수 있다. 예를 들면, 유전자는 판독 프레임의 파괴를 유도하는 뉴클레오티드 서열의 결실 또는 부가에 의해 녹-아웃될 수 있다. 또 다른 예로서, 유전자의 일부를 무관계 서열로 치환함으로써 유전자를 녹아웃시킬 수 있다. 한편, 용어 "녹-다운"은 유전자 또는 이의 유전자 산물(들)의 발현의 감소를 지칭할 수 있다. 유전자 녹-다운의 결과로서, 단백질 활성 또는 기능은 약화되거나 단백질 수준이 감소되거나 제거될 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 면역 세포는 LCK의 억제제를 포함하거나 접촉하고 있다.
LCK의 억제제는 유전자 발현을 하향조절 또는 제거하거나, LCK의 기능을 변형시킬 수 있는 핵산 서열이다.
상기 핵산은, 유전자 발현을 하향조절 또는 제거할 수 있거나 LCK의 기능을 변형시킬 수 있는 핵산일 수 있고, 안티센스 RNA, 안타고미르 RNA, siRNA, shRNA, CRISPR 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 시스템 및 전사 활성화인자-유사 효과기 기반 뉴클레아제(TALEN) 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 가지 실시형태에서, 핵산은 LCK를 분해시키거나, 또는 간접적으로 세포내 LCK의 분해를 유도하는 프로테아제와 결합하는 세포내 항체를 코딩한다.
당해 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이, 부위-특이적 뉴클레아제를 사용하여 살아있는 세포의 게놈에서 DNA 절단을 수행할 수 있고, 이러한 DNA 절단은 돌연변이성 비-상동 말단 결합(NHEJ) 수복을 통해 또는 트랜스제닉 DNA 서열과 상동성 재조합을 통해 게놈의 영구적 변형을 초래할 수 있다. NHEJ는 절단 부위에서 돌연변이유발을 생성하여, 대립유전자의 불활성화를 초래할 수 있다. NHEJ-관련 돌연변이유발은 조기 정지 코돈의 생성, 비정상 비-기능성 단백질을 생성하는 프레임시프트 돌연변이를 통해 대립유전자를 불활성화하거나, 또는 넌센스-매개된 mRNA 분해 등의 메카니즘을 유발할 수 있다. NHEJ를 통한 돌연변이유발을 유도하기 위한 뉴클레아제의 사용은 야생형 대립유전자에 존재하는 특정 돌연변이 또는 서열을 표적화하는데 사용될 수 있다. 뉴클레아제를 사용하여 표적 유전자좌에서 이본쇄 절단을 유도하면, 상동성 직접 수복(HDR), 특히 게놈 표적과 상동성인 서열에 인접하는 트랜스제닉 DNA 서열이 자극되는 것으로 공지되어 있다. 이러한 방식으로, 외인성 핵산 서열을 표적 유전자좌로 삽입할 수 있다. 이러한 외인성 핵산은, 예를 들면, 키메라 항원 수용체, 외인성 TCR, 또는 임의의 목적 서열 또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
상이한 실시형태에서, 다양한 상이한 유형의 뉴클레아제는 본 발명을 실시하는데 유용하다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명은 재조합 메가뉴클레아제를 사용하여 실시할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 CRISPR 뉴클레아제를 사용하여 실시할 수 있다. 소정의 DNA 부위를 인식하는 CRISPR을 제조하는 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TALEN 또는 컴팩트 TALEN을 사용하여 실시할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 본 발명은 메가TAL을 사용하여 실시할 수 있다.
CRISPR/Cas9 시스템에 기초한 조작된 엔도뉴클레아제는 또한 당해 기술분야에 공지되어 있다. CRISPR 엔도뉴클레아제는 2개의 성분: (1) 카스파제 효과기 뉴클레아제, 전형적으로 미생물 Cas9; 및 (2) 뉴클레아제를 게놈 내의 목적 위치로 지향하는 뉴클레오티드 표적 서열을 포함하는 짧은 "가이드 RNA"를 포함한다.
용어 "CRISPR"은 Cas9 등의 카스파제, 및 게놈 DNA의 인식 부위와 하이브리드화함으로써 카스파제의 DNA 절단을 지시하는 가이드 RNA를 포함하는 카스파제-기반 엔도뉴클레아제를 지칭한다. 녹-아웃을 위한 가이드 RNA는 표 2에 나타낸 것일 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 가이드 RNA는, 세포에서 LCK 유전자의 발현을 녹-아웃하기 위해, 서열번호 43과 함께 사용된다. 한 가지 실시형태에서, 가이드 RNA는 서열번호 10이다.
한 가지 실시형태에서, LCK의 억제제는 LCK 단백질의 억제제이다. LCK의 억제제는 LCK 키나제 활성의 억제제일 수 있다. LCK의 억제제는 아미노퀴나졸린, A-420983, A770041, 다사티닙, 사락티닙 및 마사티닙으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 면역 세포는, LCK의 발현 및/또는 기능이 감소 또는 제거되도록 변형되지 않은 세포와 비교하여, 감소된 PD-1 발현을 갖는다. 이는, T 세포가 고갈되는 경향을 감소시킬 수 있다. 이는 또한, 고형 종양에 대한 CAR-T 세포 반응을 개선시킬 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 면역 세포는 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 면역 세포는, LCK의 유전자 발현을 하향조절 또는 제거할 수 있는 LCK의 억제제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 면역 세포는, CAR을 코딩하는 핵산 및 LCK의 유전자 발현을 하향조절 또는 제거할 수 있는 LCK의 억제제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 작제물"은 특정 세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열(예를 들면, 생성물을 코딩하는 삽입 서열)의 발현에 필요한 목적 코딩 서열 및 적절한 핵산 서열을 함유하는 핵산 분자를 지칭할 수 있다. 발현 벡터 작제물은, 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함할 수 있고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터 작제물은, 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입한 코스미드, 플라스미드(예를 들면, 네이키드 또는 리포좀에 함유됨), 및 바이러스(예를 들면, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하여, 당해 기술분야에 공지된 모든 것들을 포함한다.
"벡터"는 또한, 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부로 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭하는 "전달 벡터"일 수 있다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련되는 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다수의 벡터가 당해 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "전달 벡터"는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 또한, 상기 용어는, 예를 들면, 폴리리신 화합물, 리포좀 등의, 세포 내로의 핵산의 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 추가로 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 전달 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, CAR 서열은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 세포 내로 전달된다. CAR-발현 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터는, 형질도입된 세포를 캐리어로서 사용하거나, 캡슐화된, 결합된 또는 네이키드 벡터의 무세포 국소 또는 전신 전달을 사용하여 상이한 유형의 진핵세포, 게다가 조직 및 전체 생물에 전달될 수 있다. 사용된 방법은 안정한 발현이 요구되거나 충분한 임의의 목적에 사용될 수 있다.
용어 "발현"은 프로모터에 의해 구동되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭할 수 있다.
용어 "코딩하다" 또는 "코딩하는"은 전사 및/또는 번역의 의미에서 다른 뉴클레오티드 또는 아미노산에 대응하는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산에 대한 언급을 포함한다.
용어 "핵산"은 일본쇄 또는 이본쇄 형태로 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 포함하고, 달리 한정되지 않는 한, 천연 존재 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 핵산과 하이브리드화하는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함한다. 용어 "핵산", "핵산 분자", "핵산 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"는, 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 본원에서 상호 교환가능하게 사용된다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비한정적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들면, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전사 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, siRNA, shRNA, RNAi 제제 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는, 본원에 기재된 또는 당해 기술분야에 공지된 임의의 다양한 변형 또는 치환을 사용하여, 하나 이상의 염기, 당 및/또는 포스페이트에서 변형 또는 치환될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 등의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 제공될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 차단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 표지 성분과의 결합 등에 의해, 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 또한, 상기 용어는 이본쇄 및 일본쇄 분자 모두를 지칭한다. 달리 특정되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본 발명의 임의의 실시형태는 이본쇄 형태, 및 이본쇄 형태를 구성하는 것이 공지 또는 예측되는 2개의 상보적 일본쇄 형태 각각의 둘 다를 포함한다. 일부 문맥에서, 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 등은 유전 정보를 전달하거나, 또는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드의 기능을 실행하는 임의의 물질을 포함하고(예를 들면, 이는 단백질로 번역될 수 있거나, RNAi 제제로서 작용할 수 있다), 이러한 물질은 엄밀하게는 뉴클레오티드(당, 염기 및 포스페이트로 이루어짐)로 구성되어 있지 않아도, 이러한 유전 물질은, 비-제한적 예로서, 펩티드 핵산(PNA), 록키드(locked) 핵산(LNA), 모르폴리노 뉴클레오티드, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 아라비노스 핵산(ANA), 2'-플루오로아라비노스 핵산(FANA), 사이클로헥센 핵산(CeNa), 안하이드로헥시톨 핵산(HNA) 및/또는 언록키드 핵산(UNA)을 포함할 수 있다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호 교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산(디펩티드 이상)의 임의의 중합체를 지칭할 수 있다. 약 10 내지 20 아미노산 잔기 미만의 폴리펩티드는 일반적으로 "펩티드"로 지칭된다. 본 발명의 폴리펩티드는 탄수화물 그룹 등의 비-펩티드 성분을 포함할 수 있다. 탄수화물 및 기타 비-펩티드 치환체는 폴리펩티드가 생성되는 세포에 의해 폴리펩티드에 부가될 수 있고, 세포의 유형에 따라 변화할 것이다. 폴리펩티드는 이들의 아미노산 골격 구조와 관련하여 본원에서 정의되고; 탄수화물 그룹 등의 치환체는 일반적으로 특정되지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
본원에서 제공된 것은 CAR을 발현하는 면역 세포이고, 여기서 면역 세포는 LCK 유전자가 파괴되도록 변형되어 있다. 본원에 제공된 것은 CAR을 발현하는 면역 세포이고, 여기서 면역 세포는 LCK 유전자의 발현 또는 기능이 파괴되도록 변형되어 있다. 한 가지 실시형태에서, LCK 유전자가 파괴된 CART 세포가 제공된다. 한 가지 실시형태에서, LCK 유전자의 발현 또는 기능이 파괴된 CART 세포가 제공된다. 한 가지 실시형태에서, CART 세포 또는 CAR을 발현하는 면역 세포에서 LCK 유전자를 파괴하는 방법이 제공된다. 한 가지 실시형태에서, CART 세포 또는 CAR을 발현하는 면역 세포에서 LCK 유전자의 발현 또는 기능을 파괴하는 방법이 제공된다.
용어 "파괴" 및 "파괴된"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용되어, 핵산 또는 이의 발현 생성물의 발현 및/또는 기능적 활성을 감소 또는 제거하는 임의의 유전자 변형을 지칭한다. 예를 들면, 유전자의 파괴는, 이의 범위 내에서, 유전자의 발현 및/또는 대응하는 유전자 산물(예를 들면, mRNA 및/또는 단백질)의 기능적 활성을 감소 또는 제거하는 임의의 유전자 변형을 포함한다. 유전자 변형은 핵산(예를 들면, 유전자)의 완전한 또는 부분적 불활성화, 억제, 결실, 중단, 차단 또는 하향-조절을 포함한다. 예시적 유전자 변형은 유전자 녹아웃, 불활성화, 돌연변이(예를 들면, 유전자 산물의 발현 또는 활성을 파괴하는 삽입, 결실, 점, 또는 프레임시프트 돌연변이), 또는 억제성 핵산(예를 들면, 센스 또는 안티센스 RNA 등의 억제성 RNA, siRNA, shRNA, miRNA 등의 RNA 간섭을 매개하는 분자), 억제성 폴리펩티드(예를 들면, 항체, 폴리펩티드-결합 파트너, 우성 음성 폴리펩티드, 효소 등)또는 LCK 유전자의 활성 또는 LCK 유전자의 발현 산물의 수준 또는 기능적 활성을 억제하는 임의의 기타 분자의 사용을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
한 가지 측면에서, 본원에서 정의되는 면역 세포를 제조(또는 조제)하는 방법이 제공되고, 여기서 이 방법은 LCK의 발현 및/또는 기능을 감소 또는 제거하기 위해 충분한 시간 동안 및 이러한 조건하에서 면역 세포를 LCK의 억제제와 접촉시키는 것을 포함한다. LCK의 억제제는 유전자 발현을 하향조절 또는 제거하거나, LCK의 기능을 변형시킬 수 있는 핵산 서열이다. 한 가지 실시형태에서, LCK의 억제제는 CRISPR 시스템이다. 상기 방법은 CAR을 코딩하는 핵산을 면역 세포 내로 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 환자로부터 면역 세포를 수득하는 사전 단계를 포함할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, LCK의 억제제를 코딩하는 핵산이 제공된다. 한 가지 실시형태에서, CAR을 코딩하는 핵산이 제공된다. 한 가지 실시형태에서, LCK의 억제제를 코딩하는 핵산 및 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산이 제공된다.
한 가지 측면에서, 1) LCK의 억제제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 2) CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 벡터 시스템이 제공된다.
한 가지 측면에서, LCK의 억제제를 코딩하는 핵산 서열 및 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터가 제공된다.
한 가지 실시형태에서, CAR을 코딩하는 핵산 서열은 또한 LCK의 억제제이다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 바와 같은 면역 세포 또는 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
"약제학적으로 허용되는 담체"는 동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물에게 국소 또는 전신 투여에서 안전하게 사용될 수 있는 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 대표적인 약제학적으로 허용되는 담체는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 산화방지제, 보존제(예를 들면, 항균제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 당업자에게 공지된 바와 같은 유사한 재료 및 이의 조합을 포함한다[참조: 예를 들면, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, 참조에 의해 본원에 도입됨]. 종래의 담체가 활성 성분(들)과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 의약 조성물에서 이의 사용이 고려된다.
한 가지 측면에서, 세포 요법에서 CAR-발현 면역 세포의 효능을 개선하는 방법이 제공되고, 이 방법은 LCK의 발현 및/또는 기능을 감소 또는 제거하기에 충분한 시간 동안 및 이러한 조건하에서 CAR-발현 면역 세포를 LCK의 억제제와 접촉시키는 것을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, CAR-발현 면역 세포는 CART 세포이다.
한 가지 실시형태에서, CAR-발현 면역 세포의 비-표적 효과가 감소된다. 한 가지 실시형태에서, CAR-발현 세포에서 소모 표현형이 감소된다. 한 가지 실시형태에서, CAR-발현 면역 세포의 기억이 개선된다.
본원에 개시된 것은 세포 요법에서 CAR-발현 면역 세포의 비-표적 효과를 감소시키는 방법이고, 이 방법은, LCK의 발현 및/또는 기능을 감소 또는 제거하기에 충분한 시간 동안 및 이러한 조건하에서, CAR-발현 면역 세포를 LCK의 억제제와 접촉시키는 것을 포함한다.
본원에 개시된 것은 세포 요법에서 CAR-발현 면역 세포의 고갈 표현형을 감소시키는 방법이고, 이 방법은, LCK의 발현 및/또는 기능을 감소 또는 제거하기에 충분한 시간 동안 및 이러한 조건하에서, CAR-발현 면역 세포를 LCK의 억제제와 접촉시키는 것을 포함한다.
본원에 개시된 것은 세포 요법에서 CAR-발현 면역 세포의 기억을 개선하는 방법이고, 이 방법은, LCK의 발현 및/또는 기능을 감소 또는 제거하기에 충분한 시간 동안 및 이러한 조건하에서, CAR-발현 면역 세포를 LCK의 억제제와 접촉시키는 것을 포함한다.
한 가지 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 제공되고, 이 방법은 대상체를 치료하기에 충분한 시간 동안 및 이러한 조건하에서, 본원에 정의된 바와 같은 면역 세포를 투여하는 것을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 대상체는 종양 항원의 발현과 관련된 질환(예를 들면, 증식성 질환(proliferative disease), 전암성 상태(precancerous condition), 암, 및 종양 항원의 발현과 관련된 비-암 관련 징후(non-cancer related indication))을 갖는다.
문구 "본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 질환"은, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 질병, 또는 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 세포와 연관된 상태를 포함하지만, 이들로 제한되지 않고, 예를 들면, 암 또는 악성 종양 등의 증식성 질환, 또는 골수이형성(myelodysplasia), 골수이형성 증후군 또는 전백혈병 등의 전암성 상태; 또는 본원에 기재된 바와 같이 종양 항원을 발현하는 세포와 관련된 비암 관련 징후를 포함한다. 한 가지 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 암은 혈액암이다. 한 가지 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 암은 고형암이다. 본원에 기재된 종양 항원의 발현과 관련된 추가의 질환은, 예를 들면, 비정형 및/또는 비고전적 암, 악성종양, 전암성 상태 또는 본원에 기재된 종양 항원의 발현과 관련된 증식성 질환을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 비-암 관련 징후는, 예를 들면, 자가면역 질환(예를 들면, 루푸스), 염증성 장애(알레르기 및 천식) 및 이식을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 종양 항원-발현 세포는 종양 항원을 코딩하는 mRNA를 발현하거나, 또는 언제라도 발현한다. 한 가지 실시형태에서, 종양 항원-발현 세포는 종양 항원 단백질(예를 들면, 야생형 또는 돌연변이체)을 생성하고, 종양 항원 단백질은 정상 수준 또는 감소된 수준으로 존재할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 종양 항원-발현 세포는 소정 시점에서 검출가능한 수준의 종양 항원 단백질의 검출할 수 있고, 후속적으로 검출가능한 종양 항원 단백질을 실질적으로 생성하지 않는다. 한 가지 실시형태에서, 종양 항원-발현 세포는 종양 항원 단백질을 과발현한다.
용어 "과발현된" 종양 항원 또는 종양 항원의 "과발현"은, 당해 조직 또는 기관으로부터의 정상 조직에서 발현 수준과 비교하여, 환자의 특정 조직 또는 기관 내의 고형 종양과 같이 질환 영역으로부터의 세포에서 종양 항원의 이상 수준의 발현을 나타내는 것을 의미한다. 고형 종양 또는 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 혈액학적 악성종양을 갖는 환자는 당해 기술분야에 공지된 표준 검정에 의해 결정될 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 대상체는 감염성 질병을 갖는다. 감염성 질환은 본 발명의 면역 세포에 의해 표적화될 수 있는 감염된 세포의 표면 상의 하나 이상의 감염 마커(박테리아 또는 바이러스 마커 등)의 발현을 유도할 수 있다. 감염증은, 예를 들면, 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Bar Virus)에 의한 감염증일 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 대상체는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 건선(psoriasis) 또는 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus) 등의 자가면역 질환을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "자가면역 질환"은 자가면역 반응으로부터 기인하는 장애로서 정의된다. 자가면역 질환은 자가-항원에 대한 부적절한 및 과도한 반응의 결과이다. 자가면역 질환의 예로는, 그 중에서, 애디슨 질환(Addision's disease), 탈모증(alopecia areata), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 자가면역 위염(autoimmune parotitis), 크론병(Crohn's disease), 당뇨병(diabetes)(유형 I), 이영향증 표피수포증(dystrophic epidermolysis bullosa), 부고환염(epididymitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 그레이브스병(Graves' disease), 길랑-바 증후군(Guillain-Barr syndrome), 하시모토병(Hashimoto's disease), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 증증 근무력증(myasthenia gravis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 건선(psoriasis), 류마티스 열(rheumatic fever), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 유육종증(sarcoidosis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 척추관절병증(spondyloarthropathies), 갑상선염(thyroiditis), 혈관염(vasculitis, vitiligo), 점액수종(myxedema), 악성 빈혈(pernicious anemia), 궤양성 대장염(ulcerative colitis)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
용어 "암" 및 "암성"은 통상 부분적으로 무질서한 세포 증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은, 초기 단계 및 후기 단계 암을 포함하는, 비전이성 및 전이성 암을 지칭한다. 용어 "전암성"은 통상 암에 선행하건, 또는 암으로 발전하는 상태 또는 성장을 지칭한다. "비-전이성"이란, 양성이거나, 또는 원발 부위에 잔류하고, 림프계 또는 혈관계 또는 원발 부위 이외의 조직에 침투하지 않은 암을 의미한다. 일반적으로, 비-전이성 암은 스테이지 0, I 또는 II의 임의의 암이고, 경우에 따라 스테이지 III의 암이다. "초기 단계 암"이란, 침윤성 또는 전이성이 아닌 암, 또는 스테이지 0, I 또는 II의 암으로 분류되는 암을 의미한다. 용어 "후기 단계 암"은 일반적으로 스테이지 III 또는 스테이지 IV의 암을 지칭하지만, 스테이지 II의 암 또는 스테이지 II 암의 서브-스테이지를 지칭할 수도 있다. 당업자는, 스테이지 II의 암을 초기 단계 암 또는 후기 단계 암 중 어느 하나로 분류하는 것은 특정 유형의 암에 의존한다는 것을 이해할 것이다.
용어 "암"은 유방암(breast cancer), 대장암(large intestinal cancer), 폐암(lung cancer), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 위(gastric)(위장) 암, 간암(liver cancer), 혈액암(blood cancer), 골암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 두경부암(head or neck cancer), 피부 또는 안내 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁 육종(uterine sarcoma), 난소암(ovarian cancer), 직장 또는 결장직장암(rectal or colorectal cancer), 항문암(anal cancer), 결장암(colon cancer), 나팔관암(fallopian tube carcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 외음부암(vulval cancer), 편평세포암(squamous cell carcinoma), 질암(vaginal carcinoma), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 식도암(esophageal cancer), 소장암(small intestine cancer), 내분비암(endocrine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 부신암(adrenal cancer), 연조직 종양(soft tissue tumor), 요도암(urethral cancer), 음경암(penile cancer), 전립선암(prostate cancer), 만성 또는 급성 백혈병(chronic or acute leukemia), 림프구성 림프종(lymphocytic lymphoma), 방광암(bladder cancer), 신장암(kidney cancer), 요관암(ureter cancer), 신세포암(renal cell carcinoma), 신골반암(renal pelvic carcinoma), CNS 종양(CNS tumor), 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme), 원발성 CNS 림프종(primary CNS lymphoma), 골수 종양(bone marrow tumor), 뇌간 신경교종(brain stem nerve gliomas), 뇌하수체 선종(pituitary adenoma), 포도막 흑색종(uveal melanoma)(안구내 흑색종(intraocular melanoma)으로 공지됨), 고환암(testicular cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharyngeal cancer) 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
치료될 수 있는 암은 혈관신생되지 않은 또는 실질적으로 혈관신생되지 않은 종양, 게다가 혈관신생된 종양을 포함한다. 상기 암은 비-고형 종양(예를 들면, 백혈병 및 림프종 등의 혈액학적 종양)을 포함할 수 있거나, 또는 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR로 치료되는 암의 유형은 암종, 아세포종 및 육종, 및 특정 백혈병 또는 림파성 악성종양, 양성 및 악성 종양, 게다가 육종, 암종 및 흑색종 등의 악성종양을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다.
혈액암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액학적(또는 조혈) 암의 예는 급성 백혈병(acute leukemias)(예: 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 골수구성 백혈병(acute myelocytic leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia) 및 골수아구성(myeloblastic), 전골수구성(promyelocytic), 골구단핵구성(myelomonocytic), 단핵구성(monocytic) 및 적혈구백혈병(erythroleukemia)), 만성 백혈병(chronic leukemias)(예: 만성 골수성(chronic myelocytic)(과립성(granulocytic)) 백혈병(leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia) 및 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 진성 적혈구증가증(polycythemia vera), 림프종(lymphoma), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)(무통형 및 고악성도 형태), 다발성 골수종(multiple myeloma), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄 질환(heavy chain disease), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 모세포 백혈병(hairy cell leukemia) 및 골수이형성증(myelodysplasia)을 포함한다.
고형 종양은 통상 낭포 또는 액체 영역을 포함하지 않는 이상 조직의 매스이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 이들을 형성하는 세포의 유형(예: 육종, 암종 및 림프종)에 대해 명명된다. 육종 및 암종 등의 고형 종양의 예는 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골육종(osteosarcoma), 및 기타 육종(sarcomas), 활액종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 결장암(colon carcinoma), 림프성 악성종양(lymphoid malignancy), 췌장암(pancreatic cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancers), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 기저세포암종(basal cell carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 땀샘암종(sweat gland carcinoma), 갑상선 수질암종(medullary thyroid carcinoma), 유두 갑상샘암종(papillary thyroid carcinoma), 갈색세포종 피지선암종(pheochromocytomas sebaceous gland carcinoma), 유두암종(papillary carcinoma), 유두선암종(papillary adenocarcinomas), 수질암종(medullary carcinoma), 기관지암종(bronchogenic carcinoma), 신세포암종(renal cell carcinoma), 간암 암종(hepatoma), 담관 암종(bile duct carcinoma), 융모막암종(choriocarcinoma), 빌름스 종양(Wilms' tumor), 자궁경부암(cervical cancer), 고환 종양(testicular tumor), 정액종(seminoma), 방광 암종(bladder carcinoma), 흑색종(melanoma) 및 CNS 종양(CNS tumors)(예: 신경교종(glioma)(예: 뇌간 신경교종(brainstem glioma) 및 혼합 신경교종(mixed gliomas)), 교모세포종(glioblastoma)(또는 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme)으로 공지됨) 성상세포종(astrocytoma), CNS 림프종(CNS lymphoma), 생식세포종(germinoma), 수모세포종(medulloblastoma), 신경초종 두개인두종(Schwannoma craniopharyogioma), 뇌실막종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 희소돌기아교종(oligodendroglioma), 수막종(menangioma), 신경모세포종(neuroblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma) 및 뇌 전이(brain metastases))을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 대상체를 질환으로부터 면역화하는 방법이 제공되고, 상기 방법은, 대상체를 면역화하기에 충분한 시간 동안 및 이러한 조건하에서, 본원에 정의된 면역 세포를 투여하는 것을 포함한다.
용어 "투여"는 본 발명의 조성물을 대상체에게 접촉, 적용, 주사, 수혈 또는 제공하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 (1) 장애의 하나 이상의 증상의 출현을 예방 또는 지연시키는 것; (2) 장애의 발증 또는 장애의 하나 이상의 증상을 억제하는 것; (3) 장애를 완화시키는 것, 즉 장애 또는 장애의 적어도 하나 이상의 증상의 퇴행을 유발하는 것; 및/또는 (4) 장애의 하나 이상의 증상의 중증도의 감소를 유발하는 것을 지칭할 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "대상체"는 인간을 의미하는 것으로 이해되어야 하거나, 가축 또는 반려 동물일 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 방법은 인간의 치료를 위한 것으로 특히 고려되지만, 이들은 또한, 개 및 고양이 등의 반려 동물, 및 말, 소, 양 등의 가축, 영장류, 고양이과, 개과, 소과 및 유제류 등의 동물원 동물의 치료를 포함하여 수의학적 치료에 적용할 수 있다. "대상체"는 개인, 환자 또는 개체를 포함할 수 있고, 임의의 연령 또는 성별일 수 있다.
본원에 정의된 방법은 필요한 대상체에게 유효량의 면역 세포를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본원에 정의되는 용어 "유효량"은, 그 유발, 치료 또는 예방에 효과적인, 단일 용량 또는 일련의 일부로서, 이를 필요로 하는 개체에게 소정 양의 약제의 투여를 의미한다. 유효량은 치료되는 개인의 건강 및 신체 상태, 치료되는 개인의 분류학적 그룹, 조성물의 제형, 의료 상황의 평가, 및 기타 관련 요인에 따라 변할 것이다. 상기 양은 정기적 실험을 통해 결정될 수 있는 비교적 광범위한 범위에 속할 것으로 예상된다.
한 가지 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체의 치료에 사용하기 위한, 본원에 정의된 면역 세포가 제공된다.
한 가지 측면에서, 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 본원에 정의된 면역 세포의 사용이 제공된다.
본 발명의 면역 세포는, 단독으로, 또는 희석제 및/또는 IL-2 또는 기타 사이토카인 또는 세포 모집단 등의 기타 성분과 조합하여 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 간단히 말하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 표적 세포 집단을, 하나 이상의 약제학적 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 중성 완충 생리식염수, 인산염 완충 생리식염수 등의 완충액; 포도당, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨 등의 탄수화물; 단백질; 폴리펩티드 또는 글리신 등의 아미노산; 산화방지제; EDTA 또는 글루타티온 등의 킬레이트제; 애주번트(예를 들면, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화되는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료(또는 방지)될 질환에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는, 환자의 상태 및 환자의 질환의 유형 및 중증도 등의 요인에 의해 결정되지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
생체외 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며, 이하에서 보다 상세히 논의된다. 간단히 말하면, 세포는 포유동물(예를 들면, 인간)로부터 단리되고, 본원에 개시된 CAR을 발현하는 벡터로 유전적으로 변형(즉, 시험관내 형질도입 또는 형질감염된)된다. CAR-변형된 세포는 치료상의 이점을 제공하기 위해 포유동물 수용자에게 투여될 수 있다. 포유동물 수용체는 인간일 수 있고, CAR-변형된 세포는 수용자에 대해 자가일 수 있다. 또는, 세포는 수용자에 대해 동종이계, 동계 또는 이종일 수 있다. 생체외 면역화와 관련하여 세포-기반 백신을 사용하는 것에 추가하여, 본원에 기재된 방법에는, 환자의 항원에 대해 지시된 면역 반응을 유도하기 위해 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법도 포함된다.
본원에 제공된 것은 본원에 정의되는 면역 세포의 용도이다.
본 기술분야의 숙련자들은 본원에 기재된 본 발명이, 구체적으로 기재된 것 이외의 변형 및 수정을 받기 쉽다는 것을 이해한다. 본 발명은 정신 및 범위 내에 속하는 모든 이러한 변형 및 수정을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에서 언급되는 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물을 개별적으로 또는 집합적으로 포함하고, 상기 단계 또는 특징의 임의의 2개 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는, 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 참조를 포함한다. 예를 들면, 용어 "약제"는 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 약제를 포함한다.
본 명세서 및 하기의 특허청구범위 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다", 및 "포함한다" 및 "포함하는" 등의 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하고 임의의 기타 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
임의의 이전 간행물(또는 이로부터 파생되는 정보), 또는 공지되어 있는 임의의 사항에 대한 본원 명세서에서의 언급은, 그 이전의 간행물(또는 이로부터 파생된 정보) 또는 공지된 사항이 본 명세서와 관련되는 노력의 분야에서 일반적 상식의 일부를 형성한다는 인지 또는 승인 또는 임의 형태의 제안이 아니고, 인지 또는 승인 또는 임의 형태의 제안으로서 간주되지 않는다.
이제, 본 발명의 특정 실시형태는 예시만을 목적으로서 의도되고 전술한 본원의 일반성의 범위를 한정하는 것을 의도하지 않는 하기 실시예를 참조하여 설명된다.
실시예
재료 및 방법
플라스미드 및 서열
렌티바이러스 및 이의 관련된 팩키징 플라스미드는 벡터빌더(Vectorbuilder)로부터 구입했다. CD28 및 CD137 공자극 서열을 갖는 키메라 항원 수용체를 합성하고, 벡터빌더(Vectorbuilder)에 의해 렌티바이러스 벡터에 클로닝했다. 인간 CD8A, CD8B, CD80, CD86 및 LCK 유전자는 사내에서 인간 cDNA 라이브러리로부터 클로닝되었다. TCR-유사 항체의 scFv 작제물은 폴 에이. 마카리(Paul A. Macary)의 연구실(NUS)에서 생성되고, 펩티드 LMP2A426-434(EBV로부터)를 갖는 HLA-A*02:01 및 펩티드 E183091(HBV로부터)을 갖는 A*02:01에 특이적인 TCR은 각각 한스 스타우스(Hans Stauss, University College London) 및 안토니오 베르토레티(Antonio Bertoletti, Duke-NUS Medical School)로부터의 관대한 기증물이었다. 일본쇄 트리머 GAG-HLA-A2는 케이스 고울드(Keith Gould, Imperial College London)로부터의 기증물이었다. 펩티드 돌연변이: GAG(SFYNTVATL)로부터 LMP2A426-434(CLGGLLTMV)(L2), LMP1125-133(YLLEMLWRL)(L1), EBNA1562-570(FMVFLQTHI)(E1), E183-91(FLLTRILTI)(E183) 또는 일본쇄 트리머 GAG-HLA-A2; CD28 Y170F, P187, 190A에서의 결실, 및 세포내 도메인 결실 돌연변이는 모두 Q5 돌연변이 키트(New England Biolabs)를 사용하여 수행되었다. 모든 분자 클로닝 작업은 인-퓨젼(In-Fusion) HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하여 실시하고, 일본쇄 트리머 MHC 작제물을 pcDNA3-Clover(Addgene 플라스미드 # 40259)에 클로닝하여 CHO 세포를 제시하는 인공 항원을 생성했다.
LCK-독립성 신호전달을 나타낸 2세대 CAR 및 3세대 CAR의 DNA 및 아미노산 서열. CD28-CAR 서열에서 강조된 부분은 항원-결합 도메인(항-CD19 scFV 도메인)을 나타낸다. 항원-결합 도메인은, 상이한 항원 특이성을 제공할 수 있는 기타 항원-결합 도메인(기타 scFV 또는 항체 등)으로 치환될 수 있다.
CD28-CAR (DNA 서열) CD28-CAR (단백질 서열)
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACCCAGACCACAAGCTCCCTGTCTGCCAGCCTGGGCGACAGGGTGACAATCTCTTGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCTGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACATCTCGGCTGCACAGCGGCGTGCCATCCAGGTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTATTCTCTGACAATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCCTATACATTTGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCACAGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCAGGCCTGGTGGCACCATCCCAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACAGTGAGCGGCGTGTCCCTGCCTGACTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCCCCTAGAAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACATACTATAATTCCGCCCTGAAGTCTCGGCTGACCATCATCAAGGATAACTCCAAGTCTCAGGTGTTTCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACCGACGATACAGCCATCTACTATTGTGCCAAGCACTACTATTACGGGGGGAGTTATGCTATGGATTATTGGGGGCAGGGCACCAGCGTCACTGTCTCATCACGGGCGGCCGCACATCATCATCACCACCATCACGGGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCGTACGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTACACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATACGCGTTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGATCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA (서열번호 5) MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSRAAAHHHHHHHGAAEQKLISEEDRTKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDTRFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호 6)
CD137/CD28-CAR (DNA 서열) CD137/CD28-CAR (단백질 서열)
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGCAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAGCACAGACTATAATGCAGCTTTCATATCCAGATTGAGCATCAGCAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAAGCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAAATTGGGTCCCTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTATCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTTGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAGGGCCAGTCAGAATGTGTTTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAAGCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATATCAGCTATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCACATCATCATCACCACCATCACGGGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCGTACGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTACACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATACGCGTTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGATCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGGGATCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA (서열번호 7) MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCARNWVPYYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCRASQNVFTNVAWYQQKPGQAPKALIYSTSYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYISYPLTFGAGTKLELKRAAAHHHHHHHGAAEQKLISEEDRTKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDTRFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호 8)
세포주 및 세포 배양
인간 T 세포 Jurkat 세포주, 내인성 TCR 및 보조 수용체 결손된 Jurkat 76은 힘스케르크 엠헤이치 박사(Dr. Heemskerk MH) 및 야생형 Jurkat E6-1(TIB-152), LCK-결손 Jurkat cam1.6(CRL-2063), Daudi 세포(CCL-213)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터의 것이다. 세포는, 37℃의 습윤 5% CO2 인큐베이터 내에서, 10% 태아 소 혈청(Hyclone), 2mM L-글루타민(Gibco) 및 MEM 비필수 아미노산(Gibco)이 보충된 RPMI-1640 배지(Hyclone)에서 유지했다. 인간 배아 신장 상피 세포(HEK293)은, 10% 태아 소 혈청(Hyclone), 2mM L-글루타민(Gibco) 및 MEM 비-필수 아미노산(Gibco)이 보충된 DMEM(Hyclone)에서 배양했다. 테트라사이클린-조절 발현(T-REx) CHO 세포주는 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 구입하고, 인공 항원 제시 세포주의 생성에 사용했다. CHO 세포는, 10% 태아 소 혈청(Hyclone), 2mM L-글루타민(Gibco) 및 MEM 비-필수 아미노산(Gibco)을 갖는 햄(Ham)의 F-12(Gibco) 배지에서 배양했다. 일본쇄 트리머 MHC 작제물의 CHO 내로의 형질감염은 폴리에틸렌이민(PEI) 방법을 사용하여 실시했다. 형질감염 후, 약물(Hyclone의 1.0mg/ml G418 설페이트)을 첨가하여 세포를 선택했다. 이어서, 단일 세포 분류를 적용하여 적절한 HLA 발현 클론을 선택했다. pMHC 복합체 발현은 유세포 분석에 의해 정기적으로 검사했다.
항체 및 화학물질
본 연구에서는 하기 항체를 사용했다: Myc-Tag 마우스 mAb Alexa Fluor 647(9B11), 항-pSrc 패밀리(pY416), 항-pPLCγ1, 항-p44/42 Erk1/2, 항-Erk1/2(모두 Cell signaling Technology사 제품); 래빗 항-인간 FYN(FYN-59), 항-인간 CD28 Alexa 488(CD28.2), 항-인간 CD80 PE(2D10), 항-인간 CD19 FITC, 항-인간 CD86 Brilliant Violet 421(BU63), 항-인간 CD3 APC, 항-인간 CD279(PD-1) PE(모두 Biolegend사 제품); 항-p CD3ζ(pY142), 마우스 항-인간 c-CBL, 항-PLCγ1(모두 Becton Dickinson사 제품); 항-인간 HLA-A2 APC(BB7.2), 항-인간 CD8A APC, 항-인간 CD8 PE-Cy7(모두 eBiomedience사 제품); 마우스 항-인간 LCK(3A5, Santa Cruz Biotechnology); 염소 항-마우스 IgG(H +L) 2차 항체 Alexa Fluor 647(Thermo Fisher Scientific); 특정 HLA/A2-L2, HLA/A2-L1. HLA/A2-E1 TCR-유사 항체는 기재된 바와 같이 제조했다[참조: Sim et al, 2013]. 이 연구에서 사용된 화학물질의 경우: SRC 패밀리 키나제(SFK) 억제제 PP2는 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)로부터 구입했고; 특정 LCK 또는 FYN 억제제(각각 A770041 또는 SU6656)는 각각 메드켐익스프레스(MedChemExpress) 또는 셀렉크켐(SelleckChem)으로부터 구입했고; 칼슘 염료 Indo-1, AM은 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)으로부터 구입했다.
렌티바이러스 생산 및 형질도입
형질감염의 1일 전에 웰당 합계 6.5 × 105 HEK293 세포를 6 웰 플레이트에 씨딩(seeding)하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이팅했다. 이어서, 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여, 세포에 패키징 플라스미드 및 렌티바이러스 벡터를 형질감염시키고, 12시간 후에 배지를 교환했다. 후속 2일에 바이러스 상청액을 2회 수거했다. 수집된 바이러스 상청액을 적정하고, 0.45㎛ 막 필터(Millipore)에 의해 여과하고, 초원심분리관(Millipore)에 의해 100×로 농축시켰다. 렌티바이러스 형질도입을 위해, 폴리브렌 및 HEPES를 각각 8-10㎍/ml 및 10mM에서 첨가하고, Jurkat 세포를 1ml 중의 웰당 1×106으로 첨가하고, 이어서 2시간 동안 2,500rpm으로 척수술로 첨가했다. CHO 세포 형질도입을 위해, 바이러스 용액은 척수술 없이 세포에 직접 첨가했다. 24시간 후, 세포 및 바이러스 용액을 분리하고, 세포를 유지 배지에서 배양했다. 추가로 48시간 배양 기간 후, 유세포 분석 분석을 수행하여 작제물의 발현을 확인했다.
전기천공
전기천공은, Amaxa 세포주 뉴클레오펙터 키트(VCA-1003)의 지시에 기초하여 수행했다. 요약하면, 각 샘플에 대한 106개의 세포를 제조하고, 90×g에서 10분 동안 스핀 다운했다. 세포를 100㎕ 뉴클레오펙터 용액으로 재현탁시키고, 2㎍ DNA와 조합했다. 전기천공 프로그램 X-05(고효율)를 뉴클레오펙터(Nucleofector®) 2b 장치에 적용했다. 작제물의 발현은 18시간 후 유세포 분석에 의해 검출되었다.
이미징(imaging)
전체 내부 반사 형광 현미경(TIRFM)의 경우, 특정 pMHC 및 기타 고정 단백질을 함유하는 지질 이중층을 전술한 바와 같이 제조했다. 요약하면, 0.2mol% 리포좀을 제조하고, 37℃에서 N2하에 증발시키고, 초음파 처리하여 4mM 지질 스톡을 수득했다. 유리 8-웰 챔버 LabTekII 챔버 슬라이드(Fisher Scientific)를 6M NaOH에서 2시간 동안 세정하고, 지질을 첨가하기 전에 ddH2O로 세정했다. 지질을 PBS에서 10배 희석하고, 깨끗한 챔버에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이팅했다. 과량의 리포좀을 12ml PBS로 세척했다. 이중층을 2mg/ml BSA로 30분 동안 차단시켰다. 5㎍/ml의 스트렙트아비딘을 첨가하고, 30분 동안 인큐베이팅했다. 과량의 스트렙트아비딘을 세정한 후, 비오티닐화된 HLA/A2-L2 단량체, 재조합 인간 ICAM1 단백질, hIg1-FcR.His Tag(Thermo Fisher Scientific)를 이중층에 30분 동안 첨가했다. 세척 후, 이중층은 사용할 준비가 되었다. 105 세포/100㎕의 CAR-Jurkat 또는 CD8α-mCherry을 갖는 TCR-Jurkat을 37℃에서 10분 동안 챔버의 1개 웰에 첨가했다. 이어서, 100㎕의 8% 파라포름알데히드를 첨가하여 세포를 고정시키고, 자극을 중지시켰다. 이어서, TIRF 현미경검사는 4-레이저 TIRF 모듈이 장착된 Olympus 1×83 도립 현미경으로 수행되었다. 이미지는 40X/1.49 NA 오일-침지 렌즈를 사용하여 획득했다. 100-nm 소멸 필드 내에서 여기된 형광은 하마마쓰(Hamamatsu) ORCA 플래시 4.0 카메라로 기록했다. 통상의 형광 이미징의 경우, CD8α-mCherry를 갖는 105 세포의 CAR-Jurkat 또는 TCR-Jurkat을, 챔버 중 하나의 웰에서 100㎕ RPMI 배지 중의 105 세포 특이적 CHO-APC와 10분간 혼합했다. 이어서, 100㎕의 8% 파라포름알데히드를 첨가했다. CD8 동원은 통상의 모듈에서 올림푸스(Olympus) 1×83 도립 현미경으로 검출했다. 이미지는 20×-40×/1.49 NA 오일-침지 렌즈를 사용하여 획득했다.
칼슘 플럭스 검정(Calcium Flux assay)
세포 샘플을 인산염 완충 생리식염수(PBS) 중의 ml당 10×106 세포의 밀도로 현탁시키고, 2μM Indo-1 AM을 37℃ 인큐베이터에서 30분 동안 로딩하고, 이어서 배양 RPMI로 2회 세척했다. 분석 전에 세포를 37℃로 10분간 예열하고, 이벤트 수집 동안 배양 RPMI에서 37℃로 유지했다. 세포 자극을 위해, HLA/A2-L2 단량체를 사전에 리폴딩하고, 비오티닐화하고, 스트렙트아비딘 Alexa 647(Thermo Fisher)로 가교결합하여 항원 테트라머를 형성했다. 이어서, 세포를 테트라머로 자극했다. Indo-1 고(BUV395)/Indo-1 저(DAPI)의 평균 형광비는 동역학 프로그램에 의해 FlowJo를 사용하여 계산했다.
T 세포 자극 분석
인공 항원 제시 CHO 세포(APC-CHO)를, 1일 전에 1웰당 2 내지 3×104로 96 웰 플레이트에 씨딩했다. 펩티드 펄스를 필요로 하는 APC-CHO의 경우, 펩티드를 4μM에서 3시간 동안 첨가하고, 이어서 CAR-T 또는 TCR-T 세포를 첨가하기 전에 세척했다. 각 CAR-T 세포 또는 TCR T 세포 샘플을 카운트하고, 배양 RPMI 배지에서 ml당 106의 농도로 현탁시켰다. 이어서, 1웰당 200㎕의 현탁 세포 용액을 APC-CHO 사전-씨딩된 플레이트에 첨가했다. 억제제 실험을 위해, 억제제를 이에 상응하게 세포 혼합물에 첨가했다. 모든 실험에 대해 기술적 3회 실험을 수행했다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 18시간 동안 인큐베이팅했다. 인큐베이션 후, 제조업자의 프로토콜(Invitrogen)에 따라 실시된 인간 IL-2 ELISA 검정을 위해 상청액을 수집하다. T 세포 펠렛은, 표면 얼룩을 위해 재현탁시키거나, 상기 기재된 방법을 반복함으로써 또 다른 라운드의 자극에 사용했다.
웨스턴 블로팅
합계 106개의 세포 샘플을 NP-40 용해 완충액에 의해 용해시켰다. 세포 파편을 펠렛화하고, 상청액을 수집하고, 환원 단백질 로딩 완충액(Thermo Fisher Scientific)으로 가열했다. 자극 후의 포스포릴화를 검출하기 위해, 자극의 1일 전에 105 APC-CHO 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 씨딩했다. 106 CAR-T 또는 TCR-T 세포를 각 웰에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 지정된 기간 동안 인큐베이팅했다. 자극된 CAR-T 또는 TCR-T 세포를 수집하고, 상기한 바와 같이 제조했다. 샘플을 4-12% 비스-트리스 구배 겔(NuPAGE, Invitrogen)에 로딩하고, PVDF 막(Immobilon-FL Transfer Membrane, Millipore)으로 옮겼다. 이어서, 차단 완충액(Odysfsey, LI-COR)를 사용하여 실온에서 1시간 동안 막을 차단했다. 이어서, 막을 추가로 상이한 1차 항체로 프로빙했다. 사용된 2차 항체는 IRDye 800 CW 염소 항-마우스 IgG2b(Cat # 926-32352, LI-COR) 및 IRDye 680 LT 염소 항-래빗(Cat # 926-68021)이었다. 블롯팅은 LI-COR Odyssey 적외선 이미징 시스템에 의해 정량화되었다.
CRISPR-Cas9 유전자 편집
Cas9 플라스미드는 Addgene(# 52961)로부터 입수했다. FYN 및 LCK에 대한 gRNA 서열은 http://chopchop.cbum.uib.no/로부터 검색되었고, 표 2에 제시되어 있다. Cas9 서열은 P2A 절단가능한 링커에 의해 mTagBFP와 연결되었고, 이어서 gRNA 서열과 함께 렌티바이러스 벡터에 클로닝되었다. Jurkat 세포로 형질도입 후, 단일 세포의 선별은 mTagBFP 형광 마커를 사용했다. 클론 스크리닝을 위해 세포내 염색 및 웨스턴 블로팅을 수행했다.
LCK 및 FYN 녹아웃을 위한 gRNA 풀. 각각의 gRNA는 http://chopchop.cbum.uib.no/로부터 선택되었다. 스크리닝 후, LCK 및 FYN 녹아웃을 위해 각각 LCK gRNA2 및 FYN gRNA3이 선택되었다.
gRNA 서열
LCK gRNA1 GACCCACTGGTTACCTACGA (서열번호 9)
LCK gRNA2 GCCGGGAAAAGTGATTCGAG (서열번호 10)
LCK gRNA3 CGGGACTTCGACCAGAACCA (서열번호 11)
LCK gRNA4 TGGAGCCCGAACCGTAAGTG (서열번호 12)
LCK gRNA5 CGGCGGATTGGAGCCTTCGT (서열번호 13_
LCK gRNA6 GCGGACCAGTTCATGCAGGC (서열번호 14)
LCK gRNA7 CGTTGTAGTACCCTGGGTCG (서열번호 15)
LCK gRNA8 GGGTGACAATTTCCGTCAGC (서열번호 16)
LCK gRNA9 CGTAAGTGGGGACCCGTCG (서열번호 17)
LCK gRNA10 CTGGAGCCCGAACCGTAAGT (서열번호 18)
LCK gRNA11 GGTGAATGTCCCGTAGTTAA (서열번호 19)
LCK gRNA12 GATCGTTTTCACTGTCGGTC (서열번호 20)
LCK gRNA13 CCGTAAGTGGGGACCCGTCG (서열번호 21)
LCK gRNA14 CCCTCTCACGACGGAGATCT (서열번호 22)
LCK gRNA15 CTGGCGCCCGGGAACACTCA (서열번호 23)
LCK gRNA16 GTAAGTGGGGACCCGTCGTG (서열번호 24)
LCK gRNA17 TGTGCCCGTTGTAGTACCCT (서열번호 25)
LCK gRNA18 ATTACACCAGTGAGCCCGAC (서열번호 26)
LCK gRNA19 TGGCCTAGCACGCCTCATTG (서열번호 27)
LCK gRNA20 CGTAGAGCCGAACCAGCCGC (서열번호 28)
LCK gRNA21 ATCCGTAATCTGGACAACGG (서열번호 29)
LCK gRNA22 GCCCTCTCACGACGGAGATC (서열번호 30)
LCK gRNA23 ATCGTTTTCACTGTCGGTCC (서열번호 31)
LCK gRNA24 GAACCTGAGCCGCAAGGACG (서열번호 32)
LCK gRNA25 CCATTATCCCATAGTCCCAC (서열번호 33)
LCK gRNA26 GCTCACACCCGGAAGATGAC (서열번호 34)
LCK gRNA27 CTCACGGCTCCTTCCTCATC (서열번호 35)
LCK gRNA28 AAGGCGCAGTCCCTGACCAC (서열번호 36)
LCK gRNA29 CTACGAAGGCTCCAATCCGC (서열번호 37)
FYN gRNA1 AGAGTTCACACCTCCAAAGA (서열번호 38)
FYN gRNA2 ACGGGGACCTTGCGTACGAG (서열번호 39)
FYN gRNA3 TTGTCCTTTGGAAACCCAAG (서열번호 40)
FYN gRNA4 GTCCCCCGAATCATTCCTTG (서열번호 41)
FYN gRNA5 TGGATACTACATTACCACCC (서열번호 42)
유세포 분석 및 세포 선별
유세포 분석 실험은 BD LSR Fortessa X-20(Becton Dickinson) 상에서 실시했다. 세포 선별은 싱가포르 국립대학 면역학 프로그램의 플로우 사이토메트리 연구소에 의해 Mo-flo XDP(Beckman Coulter, Inc.) 또는 SY3200(Sony Biotechnology Inc.)의 어느 하나로 수행되었다. 데이터 분석은 FlowJo 상에서 수행되었다.
통계 정보 및 데이터 분석
GraphPad Prism 7을 사용하여, 컬럼 데이터 또는 곡선 데이터에 대하여 각각 양측 스튜던트 t 검정 또는 쌍방향 ANOVA 분석을 실행했다. 데이터는 시험의 전제조건을 만족한다. 분산은 비교된 그룹 사이에서 유사하다.
실시예 1
CHO 세포를 제시하는 인공 항원은 CAR 및 TCR T 세포 자극에 대한 항원을 제공한다
CAR 및 TCR 사이의 분자 인식을 상세하게 비교하기 위해, 동일한 펩티드-MHC 특이성으로 CAR 및 TCR을 발현하는 Jurkat T 세포를 생성했다. CAR 작제물은 CD28 공자극 도메인이 기재된 이전 리포트에 기초하여 생성되었다(도 1A). CAR 상의 scFv는, HLA-A2에 의해 제시된 엡슈타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스(EBV)로부터 잠재 막 단백질 2A(LMP2A) 단백질의 펩티드 에피토프를 인식하는 TCR-유사 항체로부터 작제되었다. 용어 CAR은 CD28 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 사용하는 이러한 제2 세대 CAR을 지칭할 수 있다. 이어서, 렌티바이러스를 적용하여, 내인성 TCRα 및 베타 쇄를 결여하지만, CD3 서브유닛의 전체 세트를 함유하는 Jurkat 76 T 세포에 CAR을 전달했다. 렌티바이러스 형질도입은 CAR 또는 CAR과 동일한 펩티드-MHC 복합체에 특이적인 TCR 둘 다에 대해 효율적이었다(도 1B). CAR 또는 TCR-발현 Jurkat 세포를 선별하여, 안정한 CAR 또는 TCR-Jurkat 세포를 생성했다. T 세포 신호전달 연구에 이용가능한 다양한 인간 Jurkat T 세포주가 있다. 여기서, 3개의 Jurkat-유래 세포주, Jurkat 76, JE6.1 및 Jcam1.6을 사용했다. Jurkat 76은 대부분의 실험에 사용되기 때문에, 달리 언급하지 않는 한, Jurkat이라고 한다. Jurkat 76만이 표면에 CD3를 발현하지 않지만, JE6.1 및 Jcam1.6은 상이한 양의 CD3를 발현했다(도 1C). 이들 3개의 세포주 중 어느 것도 CD8 또는 CD4를 발현하지 않는다(도 11A). 추가로, 이종 CHO 세포에서 일본쇄 포맷의 인간 MHC 클래스 I의 발현에 기초한 인공 항원 제시 시스템이 설계되었다. 이 항원 제시 세포(APC) 시스템은 2개 버젼, 즉 선택된 펩티드가 β2-마이크로글로불린 및 중쇄에 공유 융합되는 모노-펩티드 시스템(도 1D), 및 HFA-A2의 펩티드 홈이 개방되고 다수의 펩티드가 MHC-I 분자에 결합하도록 세포 상에 펄스화될 수 있는 다중-펩티드 시스템(도 1E)으로 구축되었다(도 1). 특정 펩티드 제시가, 무관한 펩티드 제시와는 대조적으로, 각각 특정 TCR-유사 항체에 의해 유의하게 검출되는 것이 관찰된 바와 같이, 양쪽 시스템은 펩티드를 효율적으로 제시했다(도 1D, E). 그럼에도 불구하고, CAR-T 세포는, 도 1D 및 E에서 보는 바와 같이, 이들 시스템에 의한 자극에 대하여 상이한 반응을 나타냈다. LMP2A(F2) 펩티드-특이적 CAR-T는, CHO-L2에 특이적으로 반응하지만, 무관한 CHO-GAG에는 반응하지 않는다. 그러나, TCR-유사 CAR-T 세포는 HFA-A2를 발현하는 비펄스 CHO 세포에 대하여 일부 비특이적 반응을 나타냈다(도 1E). 또한, 이러한 비-특이적 활성화는 EBNA1 펩티드-표적화된 E1-CAR 또는 LMP1 펩티드-표적화된 L1-CAR 등의 기타 특이성을 갖는 TCR-유사 CAR에서도 발견되었다. 상이한 펩티드 농도에서 항-HLA-A2(BB7.2)에 의해 검출된 바와 같이, HLA-A2 작제물은 CHO-APC에 대한 펩티드 펄스 없이 발현된다(도 11C). 따라서, CHO 세포로부터의 다양한 미지의 펩티드가 다중-펩티드 시스템에서 제공된다. 펩티드 서열의 일부는 특정 펩티드와 유사하고, 비-특이적 트리거를 유발한다.
TCR-유사 CAR의 활성화는 CD8에 의해 증강되지 않고, LCK 없이 T 세포 신호전달을 전달할 수 있다
이 TCR-유사 CAR은 펩티드-MHC에 대해 TCR과 동일한 특이성을 갖기 때문에, T 세포 활성화에 대한 CD8 보조수용체의 기여를 동정하는 것은 매우 중요하다. 먼저, CD8 보조수용체는, 접촉면에서의 이벤트를 검출하기 위해 사용된 전체 반사 형광 현미경(TIRFM)을 사용하여, TCR-T 세포와 동일하게 CAR-T 세포에 의해 동원될 수 있는 것으로 밝혀졌다(도 2A). CD8α는 형광 단백질 mCherry에서 키메라로서 표지되었다. CAR-T 및 TCR-T는 표면에 CD8α-mCherry를 발현했다(도 7A). TIRFM의 경우, 서포트된 지질 이중층을 유리 플레이트 상에 제조하고, 인테그린 리간드 ICAM-1을 첨가하여 CAR-T 또는 TCR-T을 검출 표면에 고정시켰다. CD8α-mCherry를 발현하는 CAR-T 또는 TCR-T 세포를 특정 pMHC의 존재 또는 부재에 따라 10분 동안 첨가한 후, 평균 형광 강도(MFI)는 pMHC가 첨가된 양쪽 그룹 모두에서 현저히 증가했다. CAR-T 및 TCR-T과 이중층과의 접촉 표면 내의 CD8α-mCherry의 클러스터링은 명백했다. 면역 시냅스의 내부 및 외부 사이의 MFI 비는 통상의 광시야 형광 현미경을 사용하여 계산했다(도 7B). CD8α-mCherry를 사용한 CAR-T 및 TCR-T 사이에서 유의한 차이는 검출되지 않았고, 양쪽의 MFI 비는 면역 시냅스 형성의 컷-오프 비의 정의 1.5를 초과했고, 이는 CD8α-mCherry가 CAR-T 및 TCR-T 모두에서 동원되는 것을 입증한다. 이어서, CD8을 동원할 수 있는 것을 전제로 하여, CD8이 CAR-T에 기능적으로 기여하는지를 동정하고자 했다. CD8α 및 CD8β가 CAR- 및 TCR-Jurkat 세포 둘 다에서 공-형질도입되고, CAR 또는 TCR 발현량이 유사한 것으로 밝혀진 후(도 7C, D), 예상된 바와 같이, CD8αβ 보조수용체를 갖는 TCR-Jurkat의 반응성이 유의하게 증가하는 것으로 밝혀졌다. CD8을 갖는 TCR-T는 CD8이 없는 TCR-T보다 더욱 빠르고 강력한 칼슘 플럭스를 나타냈다(도 2B). CD8 보조수용체를 갖는 TCR-T에 의해 생성된 IL-2는 CD8 보조수용체를 갖지 않는 경우보다 거의 3배 더 높았다(도 2C). 그러나, CD8을 갖는 CAR-Jurkat 반응성은 CD8을 결여하는 세포에 비해 증강되지 않았다(도 2B, C). CD8을 갖는 경우와 갖지 않는 경우의 CAR-T의 칼슘 플럭스는 동등하고, CD8을 갖는 CAR-T에서는 IL-2 생산의 유의한 증가가 검출되지 않았다. CD8은 LCK를 면역 시냅스에 접촉시킴으로써 TCR 신호전달을 증강시키는데 중요한 것으로 간주된다. 이어서, 적어도 CD8-결합 LCK와 관련하여, LCK는 CAR 신호전달에 대해 중요하지 않을 수 있다고 가정했다. 놀랍게도, CAR-T는, LCK 결핍 Jurkat 세포주 Jcam1.6을 사용한 경우에 관찰된 바와 같이, LCK 없이 TCR 신호전달을 활성화시킬 수 있었다(도 2D, E). CAR-Jcam 세포는 IL-2 및 플럭스 칼슘을 정상적으로 생산할 수 있는 반면, TCR-Jcam 세포는 항원에 의한 자극시에 IL-2를 생산할 수 없었다
실시예 2
LCK-독립적 CAR 신호전달은 CD28 공자극 도메인을 필요로 한다
어느 도메인이 LCK의 부재하에 CAR의 비-표준적 T 세포 신호전달을 유발하는지를 특정하기 위해, CD28-함유 제2 세대 CAR에서 체계적 도메인 교환이 수행되었다. 먼저, LCK-독립적 신호전달이 세포외 도메인의 항원 특이성으로부터 초래되는지를 시험했다. TCR-유사 scFv를 CD19-scFv로 교환하고, CD19-발현 Daudi 세포주를 표적 세포로서 사용했다(도 8A). CD19-특이적 CAR-T 세포는 LCK의 존재 또는 부재하에 CD19-발현 Daudi 세포에 의해 활성화되었고, 이는 LCK-독립적 CAR 신호전달이 세포외 CAR 도메인의 항원 특이성과는 무관한 것을 암시한다(도 3A). CD3ζ 도메인의 중요성을 결정하기 위해, CD3ζ 세포내 도메인이 결실되고, IL-2 생성은 발견되지 않았으며, 이는 CAR-T 신호전달에서 CD3ζ ITAM의 불가결성을 입증했다(도 3B). 이어서, 1) 공자극 CD28 도메인을 결실하여 제1 세대 CAR을 생성하고, 2) CD28을 CD137(4-1BB) 세포내 도메인으로 치환하거나, CD137 도메인을 부가하여 제3 세대 CAR을 작성함으로써 LCK-독립적 CAR 트리거의 매개에서 공자극 신호전달 도메인의 역할을 결정하려고 했다(도 3C). 공자극 도메인이 없는 제1 세대 CAR-1은 TCR과 같이 거동하지 않고, CAR-1이 LCK-결핍 Jcam1.6 세포에 도입되었을 때에 신호전달이 폐지되었다. CD137-CAR을 작제했다. 그 결과는, 제2 세대 CAR의 경우, CD28 공자극 도메인을 포함하는 디자인에서만 LCK-독립적 신호전달을 수행하는 것을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, CD28 및 CD137 도메인을 모두 포함하는 제3 세대 CAR에서, 항원에 반응하여 CAR-T 활성화는 LCK-결핍 조건하에서 관찰되었지만, LCK의 부재하에는, CD28 세포내 도메인만을 함유하는 CAR만큼 강력하지 않았다(도 3C). CD28 신호전달 경로의 관여는 CD28 세포내 도메인에서의 기능적 결합 모티브의 돌연변이에 의해 실증되었다. PI3K 결합 모티브 및 프롤린 풍부 영역은, CD28 신호 전달에서 중요한 것으로 보고되었기 때문에, 시험되었다(도 3D). CAR 작제물에는 3개의 돌연변이가 이루어졌고: PI3K 결합 모티브 YMNM은 FMNM으로 돌연변이되고; 프롤린 풍부 영역 PYAP의 프롤린은 알라닌으로 치환되었다. 이어서, 모든 3개의 돌연변이체를 Jcam1.6 세포주에 형질도입했다. Il-2 생산은 CD28 세포내 도메인 없이 완전히 폐지되었다. 감소된 IL-2 생산은 FMNM 및 AYAA 돌연변이체 모두에서 관찰되었고, AYAA 돌연변이체는 FMNM 돌연변이보다 더 많은 활성을 감소시켰다. LCK-독립적 신호전달에서 CD28 신호전달의 영향을 추가로 시험하기 위해, CD80 및 CD86을 CHO-L2에 공-형질도입하여 CD28 신호전달을 활성화했다. 내인성 CD28의 발현은 Jurkat 및 Jcam1.6에서 모두 동정되었다(도 8B, C). 놀랍게도, CAR-1-Jcam 및 TCR-Jcam 세포는, CD80 및 CD86-발현 CHO-L2 세포를 사용하여 CAR-1-Jcam 또는 TCR-Jcam 세포를 자극하면, IL-2 생산의 회복을 나타냈다. 이러한 결과는, LCK-독립적 CAR 신호전달은, 제2 세대 CAR에 존재하는 CD28 세포내 도메인 또는 제1 세대 CAR 또는 TCR이 사용되는 경우의 내인성 CD28 분자로부터, YMNM 및 PYAP 모티브를 통해 적어도 부분적으로 매개되는 CD28 공자극 신호를 필요로 한다는 것을 나타낸다.
CD28-CAR은 FYN에 의존하여 하류 신호전달을 전달한다
이어서, 본 발명자들은 LCK의 부재하에 신호전달 동안 CAR의 포스포릴화에 관여하는 키나제를 동정하려고 했다. CAR-Jurkat 또는 CAR-Jcam의 IL-2 생산은 SRC 패밀리 키나제(SFK) 억제제 PP2가 부가된 후에 완전히 억제되고(도 4A, 도 9A), 이는 CAR 신호전달이 SFK에 결정적으로 의존한다는 것을 나타낸다. LCK 및 FYN이 T 세포에서 가장 현저하고 관련된 SFK인 것을 고려하면, 각각 LCK 및 FYN을 표적화하는 특이적 억제제 A770041 및 SU6656을 사용하여, CAR 및 TCR 신호전달에서 이들 2개의 SFK의 상대적 역할을 시험했다. 도 4B에 도시된 바와 같이, TCR-Jurkat는 CAR-Jurkat보다 LCK 억제제에 대해 더욱 민감하다. 역으로, CAR-Jurkat는 TCR-Jurkat보다 FYN 억제제에 대해 더욱 민감하다(도 4B). CAR-Jurkat 또는 TCR-Jurkat에 대한 억제제의 IC50은 상이한 감수성을 추가로 실증하고; LCK 억제제의 IC50은 TCR-Jurkat에서는 6.6nM이지만, CAR-Jurkat에서는 47nM이었다. FYN 억제제의 경우, CAR-Jurkat(3765nM)의 IC50은 TCR-Jurkat의 IC50(5583nM)보다 낮았다(도 9B). LCK에 의존하는 TCR과는 달리, FYN을 우선적으로 사용하는 CAR의 이러한 경향은, FYN이 CAR로부터 하류 신호전달을 활성화시키는 키나제일 수 있음을 시사한다. LCK-독립적 신호전달에서 FYN 활성화의 관여를 추가로 시험하기 위해, 웨스턴 블롯을 수행했다. 상이한 시점에서의 CAR-Jcam에서 FYN 포스포릴화의 결과는 FYN의 활성화 부위 Y420가 CAR-Jcam 후에 포스포릴화되지만, TCR-Jcam이 특정 APC에 관여하지 않는 것을 나타냈고(도 4C), FYN Y420 포스포릴화에서 30분 후에 거의 2배 증가했다. 포스포릴화 강도는 전체 FYN의 강도에 대한 pY420의 강도에 의해 계산되었다. 하류의 중요 신호전달 분자의 활성화는 또한 LCK-결핍 CAR-Jcam에서 조사되었다(도 4D). PLCγ1, Erk, 및 CD3ζ의 포스포릴화는 CAR-Jcam의 활성화 후에 검출되었지만, CARl-Jcam에서는 Erk만이 포스포릴화되었다. CAR-Jcam 및 CARl-Jcam 사이의 하류 신호 활성화의 차이는 또한 칼슘 플럭스 실험에서 반영되었다(도 9C). CAR1-Jcam 세포가 아닌 CAR-Jcam 세포는 동족 항원에 반응하여 칼슘 유입을 나타냈다. 활성화 후의 상이한 동태 패턴은 또한 CAR-Jcam과 TCR-Jurkat 사이에서 관찰되었다. PLCγ1, Erk 및 CD3ζ의 포스포릴화는 TCR의 포스포릴화보다 CAR 신호전달 후에 더욱 안정했다. TCR의 활성화는 각 분자의 포스포릴화가 30분에서 상승하고, 그 후에 약해지기 때문에, 비교적 짧은 펄스였다.
CAR 및 TCR 신호전달에서 LCK 및 FYN의 역할을 보다 양호하게 검증하기 위해, CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템이 LCK 또는 FYN을 녹아웃하기 위해 도입되었다. gRNA 스크리닝(표 2) 및 단일 클론 선별(도 9D) 후, LCK 녹아웃 클론 20 및 FYN 녹아웃 클론 8이 추가의 실험을 위해 LCK 또는 FYN 녹아웃 시스템으로서 선택되었다(도 4E). 실험 전에, CAR 또는 TCR 형질도입된 LCK 또는 FYN 녹아웃 T 세포를, TCR 및 CAR의 발현이 동등해지도록 선별했다. LCK 녹-아웃 Jurkat 세포에서, TCR은 신호전달을 활성화시켜 IL-2를 생산할 수 없지만, CAR은 여전히 기능하며, 이는 lck-결핍 Jcam1.6 세포주를 사용하여 수득한 이전의 결과와 일치한다(도 4F). 그러나, FYN 녹아웃 Jurkat 세포에서, TCR은 야생형 TCR-Jurkat보다 약간 더 많은 양의 IL-2를 생성했다. 그러나, CAR-Jurkat FYN KO 세포의 IL-2 생산은 야생형 CAR-Jurkat과 비교하여 극적으로 감소했다(도 4F). CAR 또는 TCR의 발현은 FYN KO Jurkat 세포에서 동등하고, FYN의 결여는 웨스턴 블로팅에 의해 CAR 또는 TCR-Jurkat FYN KO에서 확인되었다(도 9E, F)
실시예 3
LCK-결핍 CAR-T는 활성화 역치를 리셋하고, CAR 및 TCR 모두를 발현하는 T 세포에서 CAR 트리거만을 선택적으로 허용한다
이러한 발견에 기초하여, 이어서, LCK-독립적 트리거 메커니즘의 잠재적 기능적 결과, 및 LCK-결핍 CAR-T 세포가 실용적인 용도를 가질 수 있는지를 조사하기로 했다. CAR 활성화 역치에 대한 LCK의 존재 또는 부재의 효과를 먼저 시험했다. 다중-펩티드 제시 시스템(도 1E)에서의 일부 비-특이성은 이전에 언급되었다. TCR-유사 CAR의 이러한 비특이적 활성화는 이전에 보고되어 있고, TCR-유사 항체의 친화도가 특정 역치 이상인 경우 특이성이 감소될 수 있다. TCR-유사 CAR-T 세포를 상이한 양의 CAR 발현에 대해 선별한 후, 비펄스 HLA-A2 또는 특정 펩티드-펄스 HLA-A2에 대해 저발현으로부터 고발현의 CAR로 분비되는 IL-2의 양의 증가는 상이한 것으로 밝혀졌다(도 5A). 이러한 차이는, TCR-유사 CAR이 비-특이적 결합과 특이적 결합에 대해 상이한 친화성을 가질 수 있음을 나타내고, 특이적 결합의 친화성은 비-특이적 결합의 친화성보다 더 높다. 활성화 키나제가 각 시스템에서 상이하다는 것을 고려하면, 활성화 역치는 LCK-결핍 CAR-T와 LCK-충분 CAR-T 사이에서 상이할 수 있다고 가정했다. 따라서, 특이적 및 비-특이적 항원에 대한 반응은 LCK-결핍 CAR-T에서 구별할 수 있다. CAR-Jcam, CAR-Jurkat 76 및 CAR-JE6-1의 비교에서 볼 수 있는 바와 같이, CAR-Jcam에 의한 IL-2 생성은 음성 대조군과 동등하게 낮고, 무관한 펩티드 GAG를 나타내지만, CAR-JE6-1은 CAR-Jurkat 76과 동일한 비특이적 활성화를 나타냈다(도 5B). 특히, JE6-1은 Jcam1.6과 같은 내인성 TCR을 발현하고(도 1C), 따라서 CAR에 의한 비-특이적 활성화에 대한 내인성 TCR의 기여를 제외했다. 저친화성 비특이적 항원에 대한 TCR-유사 CAR-T 세포 활성화의 매개에서 LCK의 역할을 추가로 검증하기 위해, LCK를 Jcam1.6 세포에 형질도입하여, LCK 양성 CAR-Jcam 세포를 제조했다. 이 경우도, 비펄스화된 HLA-A2 APC는, LCK 양성 CAR-Jcam 세포가 아닌 LCK 양성 CAR-Jcam 세포에서 강력한 IL-2 생성을 유도했다(도 5C). 항원성 CHO-L2에 대한 IL-2 생산은 또한 LCK-음성 CAR-Jcam 세포보다 LCK-양성 CAR-Jcam에서 보다 낮은 것으로 관찰되었다(도 10A). 또한, LCK 결핍은 CAR 및 TCR 모두를 발현하는 T 세포에서 TCR이 아닌 CAR의 선택적 트리거를 허용하는 것으로 예측되었다. 이러한 가설을 시험하기 위해, L2 펩티드 특이적 CAR 및 B형 간염 바이러스(HBV) 유래의 E183-91(FLLTRILTI) 에피토프에 대한 특이성을 갖는 TCR(따라서, E183-TCR로 지칭됨)은 Jurkat 세포 또는 LCK 녹아웃 Jurkat 세포에서 공-형질도입되었다(도 10B). Jurkat-TCR + CAR은 CHO-E183 또는 CHO-L2에 의해 IL-2를 생산하도록 유도되었고, 이는 CAR 및 TCR의 활성화가 이중 CAR + TCR 시스템에서 손상되지 않았음을 나타낸다. 그러나, CHO-E183이 아닌 CHO-L2는, CAR과 TCR을 공발현하는 LCK-결핍 Jurkat T 세포에서 IL-2 생성을 유도하고, 이는 LCK 결핍이, TCR이 아닌 선택적 CAR 트리거의 TCR 신호전달 경로의 재-배선을 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
LCK-결핍 CAR-T 세포는 감소된 PD-1을 발현하고, 자극 후 감소된 CAR 하향조절을 나타낸다
유전자 발현의 다수의 변화는 TCR 신호전달 후에 발생한다. 중요한 변화 중의 하나는 암 면역요법에서 소모의 중요한 마커인 공-억제 분자 PD-1의 상향조절이다(도 6A). 어느 한 종류의 CAR-T 세포에서도, 자극하기 전에 세포 표면에서는 PD-1이 발현되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 상이한 CAR-T 세포의 자극 후, 이러한 차이는 자명하다. 도 6A에 도시된 바와 같이, LCK로 형질도입된 CAR-Jcam은 LCK_결핍 CAR-Jcam보다 더욱 강력하게 PD-1을 상향조절했다. 또한, PD-1 발현은 CAR-Jurkat 세포보다 CAR-Jurkat LCK KO에서 더욱 낮았다. 그러나, TCR-Jurkat는 이들 그룹 중에서 가장 많은 양의 PD-1을 발현했다. PD-1 상향조절의 이러한 차이는, 몇 라운드의 자극이 수행되는 경우, 추가로 현저하다(도 6B). CAR-Jcam + LCK는 3라운드의 자극 후에 CAR-Jcam보다 거의 3배 높은 PD-1을 상향조절했다. 동일한 상향조절 경향은 CAR-Jurkat 세포 샘플에서 관찰되었다. CAR-Jurkat LCK KO에서 PD-1의 발현은 그룹 중에서 가장 낮고, TCR-Jurkat은 PD-1을 가장 강력하게 상향조절했다. 더욱이, CAR 또는 TCR은, 이전 연구에 나타낸 바와 같이, LCK의 존재하에 항원 자극 후에 하향조절되었다. CAR은 Jcam 또는 Jurkat LCK KO 등의 LCK-결핍 세포에서 항원-의존성 수용체의 하향조절이 작은 것을 나타냈다(도 6A, D). 자극 전의 CAR 또는 TCR의 양과 비교하여, 둘 모두는 CAR-Jurkat 및 TCR-Jurkat에서 하향조절되었고, TCR은 극적으로 하향조절되었다. 그러나, CAR-Jcam 또는 CAR-Jurkat LCK KO에서 보는 바와 같이, LCK가 존재하지 않는 한, CAR의 양은 항원 자극 후에 보다 안정했다(도 12). 이러한 감소된 PD-1 상향조절 및 CAR 하향조절은, LCK-결핍된 CAR-T가 PD-1을 통한 억제성 신호전달에 저항성이고, LCK-충분 CAR-T와 비교하여 덜 "고갈"되기 쉬운 것을 시사했다.
실시예 3
방법
CD8+ T 세포 활성화 및 배양
혈액 샘플은 RosetteSepTM 인간 CD8+ T 세포 농축 칵테일(Stemcell) 및 Ficoll(GE Healthcare Life Sciences) 구배 원심분리를 사용하여 단리한 지원자 및 네이브 CD8+ T 세포로부터 수집했다. 이어서, 나이브 CD8+ T 세포를, 100U/ml IL-2(R&D System)를 포함하는 4% 인간 혈소판 용해물(Ultra-GROTM-Advanced, AventaCell)이 보충된 Biotarget 배지(Biological Industry)에서 항-CD3/CD28 비드(ThermoFisher)에 의해 자극하여 성숙 세포독성 CD8+ T 세포를 생성했다. 48시간의 활성화 후, 성숙 CD8+ T 세포는 100U/ml IL-2, 10ng/ml IL-15 및 10ng/ml IL-7(R&D System)을 함유하는 배지에서 배양했다. 배지를 2일마다 교환하고, 세포를 1ml당 106 세포로 재플레이팅했다. T 세포는, 공급 세포, 공여자로부터의 말초혈 단핵 세포(PBMC)에 의해 재자극했다. PBMC는 구배 원심분리에 의해 혈액으로부터 새롭게 단리하고, 30Gy에서 조사했다. PBMC와 T 세포를 2:1의 비율로 동일한 배지에 재현탁시켰다. 100U/ml IL-2, 10ng/ml IL-7, 10ng/ml IL-15의 최종 농도를 배양물에 첨가했다. 파세올루스(Phaseolus)(Sigma-Aldrich)로부터의 렉틴을 1.5㎍/ml의 농도로 배양물에 첨가했다. NUS IRB에 의해 승인된 프로토콜하에서, 건강한 지원자로부터 혈액을 수집했다. 서면 동의는 모든 공여자로부터 수득했다.
CRISPR-Cas9 유전자 편집
LCK 표적화된 상동 지향 수복(HDR)은 이전에 기재되어 있다. LCK gRNA2, GCCGGGAAAAGTGATTCGAG (서열번호 10)을 선택하고, 화학적으로 변형시켰다. 간단히 말하면, 완전한 RNA 서열은 5'-G*C*C*GGGAAAAGUGAUUCGAGGUUUUAGAGCU AGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*U*U*U-3' (서열번호 43)이었다. 별표(*)는 2'-O-메틸 3' 포스포로티오에이트를 나타낸다. Cas9-NLS 단백질(New England Biology)을 LCK gRNA2와 분자 비율 1:2로 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅하고, 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성했다. 이본쇄 DNA 공여자는 1kb의 상동 암이 양측의 CAR 작제물에 인접하도록 설계되었다. 프로그램 EH115를 통해 Amaxa4D 전기천공 시스템(Lonza)에 의해 120pmol의 RNP와 2㎍의 dsDNA을 100백만개의 활성화 CD8+ T 세포에 전기천공했다.
세포독성 검정
Daudi 또는 Raji 세포의 웰당 40,000개를 U 하부 96웰 플레이트에 씨딩하고, 이어서 웰당 0.1:1 내지 10:1의 효과기 대 표적(E:T) 비율에서 CAR-T 또는 LCK-유전자좌 CAR-T 세포를 4,000 내지 400,000개 첨가했다. 세포 혼합물을 37℃, 5% CO2에서 18시간 인큐베이팅했다. 이어서, 상청액을 회수하고, CytoTox96® 비방사성 세포독성 검정(Promega)을 사용하여, 사멸 세포로부터 LDH의 방출을 검출했다. 세포 펠렛을 현탁하고, 항체 접합체로 염색하여, 표적 세포와 조우한 후의 CD62L, PL-1, TIM-3 및 LAG-3의 발현을 검출했다.
마우스 모델 및 생체내 분석
6 내지 8주령 NOD/MrkBomT ac-Prkdcscid 암컷 마우스(Taconic)를, NUS 기관 동물 관리 및 사용 위원회(NUS Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜하에서 사용했다. CAR-T 세포는 공급 세포에 의해 -3일차에 재자극되고 확장된다. Raji 세포는, 마우스당 4백만개의 꼬리 정맥 주사를 통해 투여했다. Raji 세포는 매우 균일한 종양 양을 생성하고, 처리 전에 제외된 마우스는 없었다. 5×106, 2.5×106 또는 1×106의 확장된 CAR-T 세포를 Raji 세포 투여 후 4일차에 꼬리 정맥으로부터 투여했다. 마비가 관찰된 경우, 마우스를 일정하게 모니터링하고, 안락사시켰다. 생체내 투여 후의 CAR-T 세포 표현형 검사를 위해, 각 마우스의 골수를 11일차 및 18일차에 추출했다. 기억 및 소모 표면 마커를 검출하고, FACS에 의해 분석했다.
유세포 분석 및 세포 선별
유세포 분석 실험은 BD FSR Fortessa X-20(Becton Dickinson)에서 실시했다. 세포 선별은 싱가포르 국립대학 면역학 프로그램의 유세포 분석 연구소에 의해 Mo-Flo XDP(Beckman Coulter, Inc) 또는 SY3200(Sony Biotechnology Inc.)의 어느 하나로 실시했다. FlowJO로 데이터 분석을 실시했다.
통계 정보 및 데이터 분석
GraphPad Prism 7을 사용하여, 컬럼 데이터 도는 곡선 데이터에 대하여 각각 양측 스튜던트 t 검정 또는 쌍방향 ANOVA 분석을 실행했다. 데이터는 시험의 전제조건을 충족시킨다. 분산은 비교된 그래프 사이에서 유사하다.
결과
이어서, 본 발명자들은 1차 인간 CD8+ T 세포에서 Jurkat 세포로부터 발견을 요약하고자 했다. 이를 위해, CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 상동 직접 수복(HDR)을 수행하고, 여기서 CD28-CAR 작제물을 LCK 유전자좌로 지향하고, LCK의 196번째 아미노산의 위치에 삽입했다(도 13A). HDR 후에 CAR+ CD8+ T 세포의 명확한 모집단이 검출되었다(도 14A). 이어서, CAR+ CD8+ T 세포를 선별하여, LCK 단백질 발현을 측정했다. 도 14B에 도시된 바와 같이, LCK 발현은 종래의 CAR-T 세포와 비교하여 극적으로 감소했다. CD28-CAR의 N-말단에 P2A 절단가능한 서열을 부가하고, 따라서 절단된 LCK도 관찰했다(도 14B). 아미노산 196이 LCK의 SH2 도메인의 말단에 위치하고, 촉매 도메인의 일부가 아닌 것을 고려하면, 이 절단된 LCK는 기능장애 변이체이다. 삽입된 부위에서의 유전자형은 또한 CAR 작제물이 LCK 유전자좌에 삽입되었음을 확인했다(도 14C). 2개의 CD19-발현 세포주, Daudi 및 Raji를 사용하여, T 세포 세포독성을 시험했다. 종래의 CAR-T 및 LCK-유전자좌 CAR-T 모두는 동등한 세포독성을 갖지만, 이들은 또한 Daudi 세포보다 Raji 세포에 대해 보다 낮은 세포독성을 나타냈다. Raji 세포에 대한 이러한 낮은 세포독성은 T 세포 사멸에 대한 Raji 세포의 내성 메카니즘에 의해 야기될 수 있다(도 13B). 대조군 CD8+ T 세포는 또한 높은 E:T 비에서 이들 암 세포에 대해 어느 정도의 세포독성을 나타냈다. 도 14D에 도시된 바와 같이, LCK-유전자좌 CAR-T 세포의 특이성은 잔류되었고, 이는 CD19-음성 Jurkat 세포가 아닌 CD19-발현 Daudi 세포만을 사멸시킬 수 있기 때문이다. 종래의 CAR-T 및 LCK-유전자좌 CAR-T 사이의 차이는 소모 분자, PD-1, TIM-3, LAG-3 및 기억 마커 CD62L의 면역표현형에 의해 시험되었다. 휴지 상태에서, 종래의 CAR-T 세포는 LCK-유전자좌 CAR-T 세포보다 TIM-3 발현이 높고(25%), CD62L 발현이 낮았고(49%), 여기서 TIM-3 발현은 14%이고, CD62L 발현은 각각 85%이다(도 13C). 상이한 E:T 비율에서 표적 세포와 조우한 후, 소모 및 기억 분자의 발현은 변화했다(도 14E). 낮은 E:T 비율에서, 소모 분자의 보다 높은 발현 및 보다 낮은 CD62L 발현이 관찰되었다. 레이더 차트를 사용하여 표면 마커 발현을 요약하고, 상이한 그룹 내에서 비교하면, 이들 2개의 CAR-T 세포 사이의 차이는 보다 분명해졌다(도 13D). 종래의 CAR-T 세포는, E:T가 감소함에 따라, 보다 많은 소모 분자를 발현하고, CD62L의 발현을 감소시키는 경향이 있었다. 그러나, LCK-유전자좌 CAR-T 세포는 보다 지속성이 있고, 종래의 CAR-T 세포만큼 소모 마커를 상향조절하는 경향은 없었고, 여기서 PD-1, TIM-3 및 LAG-3의 발현은 높았지만, CD62L의 발현은 낮았다.
LCK-유전자좌 CAR-T 세포의 보다 지속적인 표현형, 즉 보다 많은 기억 및 보다 적은 소모 표현형은, 이들이 종래의 CAR-T 세포보다 우수한 생체내 항암 효능을 나타내는 것을 시사했다. 이어서, 종래의 CAR-T 세포 및 LCK-유전자좌 CAR-T 세포를 마우스 모델에서 Raji 세포를 취급하도록 챌린지하고, 여기서 Raji는 시험관내에서 Daudi 세포보다 CAR-T 세포독성에 대해 더욱 내성이다(도 13B). 이것은 또한 이들이 생체내에서 보다 내성이 있다는 것을 시사한다. NOD/SCID 면역-손상된 마우스 균주를 사용했고, CAR-T 세포를 상이한 용량으로 정맥내 투여하고, 4일 후에 Raji 세포를 투여했다(도 13E). 본 발명의 예상과 일치하여, 종래의 CAR-T 세포는 CD8+ T 세포와 비교하여 생체내에서 효능의 유의한 개선을 나타내지 않았다. 그러나, LCK-유전자좌 CAR-T 세포는 1백만 내지 5백만 세포의 모든 3개 용량에서 유의하게 증강된 생체내 성능을 나타냈다(도 13F). 실험의 종료에서, 5백만개 LCK-유전자좌 CAR-T 세포로 치료된 그룹 내의 1마리 마우스는 여전히 생존했다. 이 마우스로부터 추출된 복수의 기관 내에서 암 세포는 발견되지 않았다(도 14F). Raji 세포 및 T 세포는, Raji 세포 주사후 11일차 및 18일차에 마우스의 골수로부터 추가로 분석하여, 이들의 수, 및 T 세포의 기억 및 소모 상태를 동정했다. 11일차 및 18일차에 종래의 CAR-T 세포 및 LCK-유전자좌 CAR-T 세포의 그룹으로부터의 T 세포 및 Raji 세포의 수는 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 14G). 그러나, 도 13G에 도시된 바와 같이, LCK-유전자좌 CAR-T 세포는, 종래의 CAR-T 세포와 비교하여, 11일차 및 18일차 모두에서 유의하게 높은 기억 마커 CD45RO의 발현을 나타냈다. 또한, 종래의 CAR-T 세포는 LCK-유전자좌 CAR-T 세포보다도 소모 마커 PD-1, TIM-3 및 LAG3를 상향조절했다. 이는 모든 3개의 소모 마커를 공-발현하는 세포에 대해 특히 현저했다(도 13H). 따라서, 종래의 CAR-T 세포와 비교하여, LCK-유전자좌 CAR-T 세포의 보다 많은 기억 및 보다 작은 소모 표현형은 이들의 증강된 생체내 효능을 설명했다.
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Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 465 470 475 480 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 485 490 495 Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 500 505 510 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 515 520 525 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 530 535 540 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 545 550 555 560 Pro Arg <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCK gRNA1 <400> 9 gacccactgg ttacctacga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCK gRNA2 <400> 10 gccgggaaaa gtgattcgag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCK gRNA3 <400> 11 cgggacttcg accagaacca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCK gRNA4 <400> 12 tggagcccga accgtaagtg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCK gRNA5 <400> 13 cggcggattg 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Claims (32)

  1. 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR)를 발현하는 면역 세포로서,
    CAR은 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제(LCK)의 부재하에 기능하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain) 또는 단편을 포함하고,
    면역 세포는 LCK의 발현 및/또는 기능이 감소 또는 제거되도록 변형되어 있는, 면역 세포.
  2. 제1항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 LCK의 부재하에 기능하는 CD28 단백질의 신호전달 도메인 또는 단편을 포함하는, 면역 세포.
  3. 제1항에 있어서, 면역 세포가 T 세포 또는 NK 세포인, 면역 세포.
  4. 제1항에 있어서, 면역 세포가 LCK의 억제제를 포함하거나, LCK의 억제제와 접촉하고 있는, 면역 세포.
  5. 제4항에 있어서, LCK의 억제제가 유전자 발현을 하향조절(downregulating) 또는 제거할 수 있거나, LCK의 기능을 변형(modifying)할 수 있는 핵산 서열인, 면역 세포.
  6. 제5항에 있어서, LCK의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산이 안티센스(antisense) RNA, 안타고미르(antagomir) RNA, siRNA, shRNA, CRISPR 시스템, 징크 핑거(zinc finger) 뉴클레아제 시스템 및 전사 활성화인자-유사 효과기(effector) 기반 뉴클레아제(TALEN) 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 면역 세포.
  7. 제4항에 있어서, LCK의 억제제가 LCK 단백질의 억제제인, 면역 세포.
  8. 제7항에 있어서, LCK의 억제제가 아미노퀴나졸린, A-420983, A770041, 다사티닙(Dasatinib), 사락티닙(Saractinib) 및 마사티닙(Masatinib)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 면역 세포.
  9. 제1항에 있어서, 면역 세포가 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는, 면역 세포.
  10. 제1항에 있어서, 면역 세포가, 유전자 발현을 하향조절 또는 제거할 수 있거나 LCK의 기능을 변형할 수 있는 LCK의 억제제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는, 면역 세포.
  11. 제1항에 있어서, 면역 세포가, CAR을 코딩하는 핵산, 및 LCK의 유전자 발현을 하향조절 또는 제거할 수 있는 LCK의 억제제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는, 면역 세포.
  12. 제1항에 있어서, CAR이 세포외 항원-결합 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  13. 제1항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, FcR 감마, Fc 엡실론 RI 베타, CD79a, CD79b, Fc 감마 RIIa, DAP10 또는 DAP12로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 1차 신호전달 도메인을 추가로 포함하는, 면역 세포.
  14. 제1항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이, DAP10, CD28, CARD11, SLAMF1, LCK1, LCK3, LAT, OX40, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  15. 제1항에 있어서, 면역 세포가, LCK의 발현 및/또는 기능이 감소 또는 제거되도록 변형되지 않은 세포와 비교하여, 감소된 PD-1 발현을 갖는, 면역 세포.
  16. CAR을 발현하는 면역 세포로서, 면역 세포는, LCK 유전자의 발현 또는 기능이 파괴되도록 변형되어 있는, CAR을 발현하는 면역 세포.
  17. 제1항의 면역 세포의 제조 방법으로서,
    LCK의 발현 및/또는 기능을 감소 또는 제거하기에 충분한 시간 동안 및 이러한 조건하에서 면역 세포를 LCK의 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는, 면역 세포의 제조 방법.
  18. 제17항에 있어서, LCK의 억제제가 LCK의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산 서열인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, LCK의 억제제가 CRISPR 시스템인, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 방법이 CAR을 코딩하는 핵산을 면역 세포 내로 도입하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  21. 1) LCK의 억제제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 2) CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는, 벡터 시스템.
  22. LCK의 억제제를 코딩하는 핵산 서열 및 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
  23. 제22항에 있어서, CAR을 코딩하는 핵산 서열이 LCK의 억제제인, 벡터.
  24. 세포 요법에서 CAR-발현 면역 세포의 효능을 개선하는 방법으로서,
    LCK의 발현 및/또는 기능을 감소 또는 제거하기에 충분한 시간 동안 및 이러한 조건하에서 CAR-발현 면역 세포를 LCK의 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는, CAR-발현 면역 세포의 효능을 개선하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, CAR-발현 면역 세포가 CART 세포인, 방법.
  26. 제24항에 있어서, CAR-발현 면역 세포의 비표적(off-target) 효과가 감소되는, 방법.
  27. 제24항에 있어서, CAR-발현 세포에서 소모 표현형(exhaustion phenotype)이 감소되는, 방법.
  28. 제24항에 있어서, CAR-발현 면역 세포의 기억이 개선되는, 방법.
  29. 이를 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서,
    대상체를 치료하기에 충분한 시간 동안 및 이러한 조건하에 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 면역 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 치료 방법.
  30. 제29항에 있어서, 대상체가 종양 항원의 발현과 연관된 질환(예를 들면, 증식성 질환(proliferative disease), 전암성 상태(precancerous condition), 암, 및 종양 항원의 발현과 연관된 비-암 관련 징후(non-cancer related indication))을 갖는, 방법.
  31. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한, 면역 세포.
  32. 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 면역 세포의 용도.
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