KR20210133624A

KR20210133624A - 바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법

Info

Publication number: KR20210133624A
Application number: KR1020200052453A
Authority: KR
Inventors: 윤경섭; 양성준
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2021-11-08
Also published as: KR102449677B1

Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법은, pH 조절제 및 고압유화 처리를 이용하여 바이오틴의 캡슐화율을 향상시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법을 이용하면, 물리적으로 안정적이고, 캡슐화율 및 경피흡수율이 우수한 바이오틴 함유 나노리포좀을 제공할 수 있으며, 이를 다양한 화장료 조성물에 적용할 수 있다.

Description

바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법{Method for manufacturing biotin-containing nanoliposome}

본 발명은 바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 알지닌을 첨가하여 pH를 조절함으로써, 캡슐화율이 높은 바이오틴 함유 나노리포좀을 제조하는 방법에 관한 것이다.

바이오틴(biotin)은 비타민 B7으로 불리는 비타민 B 복합체의 하나다. 1927년 독일의 M. A. Boas는 실험동물에게 과량의 생 난백을 먹이게 되면 피부염이나 탈모 등의 증상들이 나타나는 것을 관찰하였고, 이 증상들을 예방하는 물질이 동물 간장 내에 존재한다는 것을 발견하였다.

1931년 독일의 P. Gorgy는 피부염 및 탈모 예방인자를 농축하여 유효물질을 얻었으며, 이 물질을 피부(Haut)를 의미하는 독일어의 첫 자를 따와 비타민 H라 명명하였다. 그 후 비타민 H가 바이오틴과 동일한 물질이라는 것을 증명하고, 화학구조 또한 밝혀졌으며, 1944년 S. A. Harris 연구진에 의하여 화학적으로 합성되었다.

바이오틴은 황을 함유하였으며 물에 용해도가 낮은 비타민으로서 여러 대사 경로에서 carboxylase 효소의 필수 보조제 역할을 한다.바이오틴의 단백질 합성 기능 중에서, 특히 케라틴 생성 기능은 건강한 손·발톱과 모발의 성장에 기여하는 것으로 보고되었다. 바이오틴은 상대적으로 경제적인 비용의 유효성 있는 미용 제품으로서 건강한 머리카락과 손톱을 원하는 소비자들에게 새로운 트렌드가 되었다. 현재까지 국내외적으로 바이오틴 제형화 연구는 초기상태이며 안정성과 용해도를 함께 향상시킬 수 있는 기술은 아직 보고된 사례가 없다.

따라서, 바이오틴을 식품 및 화장품으로 개발하고 이와 관련된 기술적인 문제를 해결하기 위해, 제조 및 유통과정에서 변질되지 않게 하고 본래의 활성을 유지할 수 있도록 하는 안정화 기술 즉, 제형화 기술이 요구된다.

최근에는 화장품 내 유효성분의 활성을 유지하면서 동시에 안정하게 피부에 흡수시킬 수 있는 경피흡수 전달체로서 리포좀(liposome) 제형에 대한 관심이 높아지고 있다. 리포좀은 인지질로 구성된 구형의 소포체(vesicle)로서 수용성 및 유용성 성분들을 동시에 캡슐화시킬 수 있어 비타민이나 약물 등과 같은 활성성분에 대한 약물전달체(drug delivery carrier)로 많은 연구가 진행되고 있다. 이중 인지질은 생체막 내의 주요 구성성분으로서 리포좀을 구성하는 인지질막 또한 생체막과 유사한 생리학적 기능과 특성을 갖는다. 따라서 리포좀은 피부 친화적이고 안전성이 우수하여 제약 및 화장품 분야 등에서 효과적인 약물전달체로서 응용되고 있다.

이에 따라 리포좀 제형을 산업화시키기 위해서 안정성, 캡슐화율의 재현성, 입자 분포의 균일성 등을 보완시켜야 하는데, 이러한 문제들을 보완할 수 있는 방법으로 E. Mayhew 등은 고압유화기(Microfluidizer등)를 활용하여 고농도 지질 현탁액으로부터 작은 입자크기의 리포좀 제조방법을 보고하였다. 또한 연속 흐름 미세 유체의 사용에 초점을 맞추어 재현 가능한 방식으로 좀 더 좁은 입자크기 분포를 갖는 마이크로(micro) 및 나노(nano) 크기의 리포좀 생산에 대한 보고가 있었다.

리포좀 종류와 특징으로 소포체의 크기와 형태에 따라 크게 MLV(Multilamella vesicle)과 ULV(Unilamella vesicle)로 나눌 수 있다. 특히 ULV는 크기에 따라 LUV(Large unilamella vesicle), SUV(Small unilamella vesicle), GUV(Giant unilamella vesicle)로 구분할 수 있다. SUV는 20 ∼ 100 nm, LUV는 100 ∼ 1000 nm, 및 GUV는 1000 nm 이상의 범위를 갖는다. MLV는 소포체의 막(Lamella) 형태에 따라 OLV(Oligo lamella vesicle), MLV, MVV(Multi vesicular vesicles)로 나눌 수 있다. OLV는 100 ∼ 500 nm, MLV는 500 ∼ 1000 nm, MVV는 200 ∼ 3500 nm 크기를 나타내며, 이외에도 다양한 크기와 형태에 따라 다양하게 분류된다.

또한, 소포체의 크기는 리포좀의 반감기를 결정하는 중요한 매개 변수이며, 크기 및 이중층의 개수가 리포좀 내 약물 캡슐화의 정도에 영향을 미친다. 따라서 리포좀은 전형적으로 그들의 크기 및 이중층 개수에 기초하여 분류되며, 최근 개발된 이중 리포좀(Double liposome) 및 MVV로 명명된 새로운 형태의 리포좀이 보고되고 있다. 이러한 기술로 제조된 리포좀은 다양한 효소에 대한 약물 보호를 향상시키는 것으로 알려져 있다.

리포좀 제형에 나노화 기술을 적용하게 되면 특정 유효성분을 피부 내에 전달하는 역할을 하는 나노 소포체의 크기가 피부를 구성하는 세포보다 작아지게 된다. 때문에 나노 크기의 입자가 포함된 기능성화장품을 사용하면 유효성분이 피부에 보다 깊숙이 흡수 및 전달되는 것으로 알려져 있다.

KR 10-0753437 B1 (2007.09.14. 공고)

본 발명의 목적은 용해도가 낮은 수용성 비타민인 바이오틴을 약물전달체의 일종인 나노리포좀에 함유시킴으로써, 바이오틴의 용해도를 향상시키고, 나노리포좀의 안정성을 향상시킨 바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 피부를 통한 유효성분 전달의 방법으로 알려진 나노리포좀의 효과 및 이용 가능성을 알아보기 위해 화장품에 사용되는 용해도가 낮은 탈모방지제 성분인 바이오틴을 나노리포좀에 캡슐화 시켜 바이오틴의 리포좀에서의 안정성 및 용해도에 미치는 영향을 확인해보는 데 있다.

본 발명의 바이오틴 함유 나노리포좀읠 제조방법은, pH 조절제 및 고압유화 처리를 이용하여 바이오틴의 캡슐화율을 향상시키는 것을 특징으로 한다.

상기 바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법은, (a) 인지질(Phospholipid), 콜레스테롤(Cholesterol), 및 알코올(Alcohol)을 혼합하여 제1 혼합액을 제조하는 단계; (b) 보존제(Preservative), 바이오틴(Biotin), pH 조절제 및 정제수를 혼합하여 제2 혼합액을 제조하는 단계; (c) 상기 (a) 단계의 제1 혼합액과 상기 (b) 단계의 제2 혼합액을 각각 가열하여 용해시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 제1 혼합액과 상기 (c) 단계의 제2 혼합액을 혼합하고 유화시켜 리포좀을 제조하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 리포좀을 고압유화 처리하여 나노리포좀을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 인지질은, 레시틴(Lecithin)일 수 있다.

상기 (c) 단계는, 70 ~ 75 ℃의 온도에서 1 ~ 10 분 동안 수행할 수 있다.

상기 (d) 단계는, 호머믹서기에서 상기 (c) 단계의 제1 혼합액을 상기 (c) 단계의 제2 혼합액에 투입하여 2,500 ~ 3,500 rpm으로 5 ~ 15 분 동안 수행할 수 있다.

상기 pH 조절제는, 알지닌(Arginine) 수산화나트륨(NaOH), 수산화칼륨(KOH), 및 트리에탄올아민(Triethanolamine)으로 이루어진 그룹 중 선택되는 1 종 이상일 수 있다.

상기 pH 조절제는 조성물 총 중량%에 대하여 0.001 ~ 0.5 중량%로 포함될 수 있다.

상기 (e) 단계는, 40 ∼ 45 ℃의 온도, 650 ~ 750 bar의 압력에서 1 ~ 3 회 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조되는 바이오틴 함유 나노리포좀을 제공할 수 있다.

상기 나노리포좀은 입자의 크기가 100 ~ 250 nm이고, 다분산지수가 0.2 ~ 0.5 이며, 제타전위가 -80 ~ -30 mV일 수 있다.

상기 나노리포좀 내 바이오틴의 캡슐화율이 25 % 이상일 수 있다.

상기 바이오틴의 경피흡수율이 30 % 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 나노리포좀을 포함하는 경피흡수 촉진용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법을 이용하면, 물리적으로 안정적이고, 캡슐화율 및 경피흡수율이 우수한 바이오틴 함유 나노리포좀을 제공할 수 있으며, 이를 다양한 화장료 조성물에 적용할 수 있다.

도 1은 리포좀 구조 및 친유성 또는 친수성 약물의 포획 모델을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 고압을 이용한 나노크기의 분산입자 제조장치를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 실온에서 1 일, 1 주일, 1 개월 및 3 개월 후의 바이오틴 나노리포좀(#3)을 관능평가한 것이다.
도 4는 실온에서 1 일, 1 주일, 1 개월 및 3 개월 후의 바이오틴 나노리포좀(#4)을 관능평가한 것이다.
도 5는 시간에 따른 나노리포좀(#2)의 입자 크기를 나타낸 것이다(3회 측정하여 평균값으로 나타냄, *p < 0.05, **p < 0.01).
도 6은 시간에 따른 나로리포좀(#2)의 다분산 지수(PDI)의 결과 값을 나타낸 것이다(3회 측정하여 평균값으로 나타냄, *p < 0.05, **p < 0.01).
도 7은 시간에 따른 나노리포좀(#2)의 제타 전위값을 나타낸 것이다(3회 측정하여 평균값으로 나타냄, *p < 0.05).
도 8은 시간에 따른 바이오틴 함유 나노리포좀(#4)의 입자 크기를 나타낸 것이다(3회 측정하여 평균값으로 나타냄, *p < 0.05, **p < 0.01).
도 9는 시간에 따른 바이오틴 함유 나노리포좀(#4)의 제타 전위를 나타낸 것이다(3회 측정하여 평균값으로 나타냄, *p < 0.05).
도 10 A는 알지닌이 첨가되지 않은 바이오틴 함유 나노리포좀(#4-3)의 극저온 투과 전자현미경(Cryo-TEM) 이미지를 나타낸 것이고, 도 10 B는 본 발명에 따른 알지닌 첨가 바이오틴 함유 나노리포좀(#4-4)의 극저온 투과 전자현미경(Cryo-TEM) 이미지를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 동일한 도면 부호를 붙였다.

본 발명에서, 리포좀은 인지질로 구성된 구형의 소포체(vesicle)로서 수용성 및 유용성 성분들을 동시에 캡슐화시킬 수 있어 비타민이나 약물 등과 같은 활성성분에 대한 약물전달체(drug delivery carrier)를 의미한다.

상기와 같은 목적을 달성하가 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법은, pH 조절제 및 고압유화 처리를 이용하여 바이오틴의 캡슐화율을 향상시키는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 상기 바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법은, (a) 인지질(Phospholipid), 콜레스테롤(Cholesterol), 및 알코올(Alcohol)을 혼합하여 제1 혼합액을 제조하는 단계; (b) 보존제(Preservative), 바이오틴(Biotin), pH 조절제 및 정제수를 혼합하여 제2 혼합액을 제조하는 단계; (c) 상기 (a) 단계의 제1 혼합액과 상기 (b) 단계의 제2 혼합액을 각각 가열하여 용해시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 제1 혼합액과 상기 (c) 단계의 제2 혼합액을 혼합하고 유화시켜 리포좀을 제조하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 리포좀을 고압유화 처리하여 나노리포좀을 제조하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 상기 (a) 인지질(Phospholipid), 콜레스테롤(Cholesterol), 및 알코올(Alcohol)을 혼합하여 제1 혼합액을 제조하는 단계는 상기 각 원료를 혼합하여 제조할 수 있으며 특별히 제한하지 않는다.

본 발명에서 상기 (b) 보존제(Preservative), 바이오틴(Biotin), pH 조절제 및 정제수를 혼합하여 제2 혼합액을 제조하는 단계는 상기 각 원료를 혼합하여 제조할 수 있으며 특별히 제한하지 않는다.

본 발명에서 상기 (c) 상기 (a) 단계의 제1 혼합액과 상기 (b) 단계의 제2 혼합액을 각각 가열하여 용해시키는 단계는, 70 ~ 75 ℃의 온도에서 1 ~ 10 분 동안 수행할 수 있다.

본 발명에서 상기 (d) 상기 (c) 단계의 제1 혼합액과 상기 (c) 단계의 제2 혼합액을 혼합하고 유화시켜 리포좀을 제조하는 단계는, 호머믹서기에서 상기 (c) 단계의 제1 혼합액을 상기 (c) 단계의 제2 혼합액에 투입하여 2,500 ~ 3,500 rpm으로 5 ~ 15 분 동안 수행할 수 있다.

상기 pH 조절제는, 알지닌(Arginine) 수산화나트륨(NaOH), 수산화칼륨(KOH), 및 트리에탄올아민(Triethanolamine)으로 이루어진 그룹 중 선택되는 1 종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 알지닌일 수 있다.

구체적으로, 상기 각 원료의 사용량은, 조성물 총 중량%에 대하여, 상기 인지질 2 ~ 3 중량%, 상기 콜레스테롤 0.25 ~ 1 중량%, 상기 알코올 10 ~ 20 중량%, 보존제 0.1 ~ 0.5 중량%, pH 조절제 0.05 ~ 0.007 중량% 및 잔량의 정제수를 포함할 수 있다.

상기 인지질은 레시틴일 수 있으며, 구체적으로, 대두 레시틴, 디스테아로일포스파티딜콜린, 수첨 대두 레시틴, 난(egg) 레시틴, 디올레오일포스파티딜콜린, 수첨 난 레시틴, 디엘라이도일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디미리스토일포스파티딜콜린으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 것일 수 있다.

상기 알코올은 에틸알코올일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 바이오틴(Biotion, 화학식: C₁₀H₁₆N₂O₃S)은, 수용성의 비타민 B 계열로서 비타민 B7(vitamin B7), 비타민 B8(vitamin B8), 비타민 H(vitamin H), 또는 조효소 R(coenzyme R)을 의미한다. 또한, 바이오틴은 국소 제형, 예컨대 샴푸, 컨디셔너, 비누, 목욕 오일 및 염류, 및 메이크업에서 모발 및 피부 컨디셔닝제로서 사용될 수 있으며, 바이오틴은 카르복실산이다.

상기 보존제는 이미다졸리디닐우레아, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 부틸파라벤으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종의 것을 사용할 수 있다.

상기 알지닌(Arginine, 화학식: C₆H₁₄N₄O₂)은 α-아미노산의 하나로 L-알지닌은 단백질을 구성하는 아미노산의 하나이며, 어류의 정자에 존재하는 단백질 프로타민이다. 또한, 생체 내의 대사경로로서 오르니틴회로의 구성성분이며, 아르지나아제의 작용에 의하여 요소와 오르니틴으로 분해하는 역할을 한다. 염기성 아미노산으로 강한 알카리성을 나타내어 산도조절제 역할을 한다.

상기한 함량을 벗어나는 경우 바이오틴의 캡슐화율이 저하될 수 있으며, 이에 따라 바이오틴의 경피흡수율이 저하되는 문제점이 있어 상기한 범위가 바람직하다.

또한, 바이오틴이 리포좀에 의하여 캡슐화되었을 때 안정성이 저하되는 문제점이 있어 상기한 범위가 바람직하다.

본 발명에서 상기 (e) 상기 (d) 단계의 리포좀을 고압유화 처리하여 나노리포좀을 제조하는 단계는 40 ∼ 45 ℃의 온도, 650 ~ 750 bar의 압력에서 1 ~ 3 회 수행할 수 있으며, 바람직하게는 40 ∼ 45 ℃의 온도, 700 bar의 압력에서 2 회 수행하는 것이 바람직하다.

상기한 고압유화처리 조건을 벗어나면, 시간이 지남에 따라 탁도가 증가하고, 바이오틴이 석출되면, 입자의 크기가 증가하는 문제점이 있어 상기한 범위가 바람직하다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 바이오틴 함유 나노리포좀은, 상기한 방법으로 제조되어, 입자의 크기가 100 ~ 250 nm이고, 다분산지수가 0.2 ~ 0.5 이며, 제타전위가 -80 ~ -30 mV인 것을 특징으로 한다.

상기한 범위의 제타전위의 값을 가짐으로 콜로이드 입자간의 반발력이 커져 콜로이드 상태가 안정화된다.

또한, 나노 분산액의 분산 안정성을 향상시킬 수 있고 물리적 안정화뿐만 아니라 전기적으로 안정화되는 효과가 있다.

본 발명에서 상기 나노리포좀은 내 바이오틴의 캡슐화율이 25% 이상일 수 있다.

본 발명에서 상기 바이오틴의 경피흡수율이 30% 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따라 바이오틴 함유 나노리포좀을 포함하는 경피흡수 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 바이오틴 함유 나노리포좀을 포함하는 경피흡수 촉진용 화장료 조성물은, 조성물 총 중량%에 대하여, 상기 바이오틴 함유 나노리포좀을 0.1 내지 20 중량%, 바람직하게는 1 내지 15 중량%를 포함할 수 있다.

상기 바이오틴 함유 나노리포좀을 포함하는 경피흡수 촉진용 화장료 조성물은 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(Foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

또한, 상기 바이오틴 함유 나노리포좀을 포함하는 경피흡수 촉진용 화장료 조성물은, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없다. 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이컵 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스, 바디 세정제, 연고, 패치 또는 분무제 등의 화장료 조성물로 제형화될 수 있다. 이들 각 제형은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 재료의 준비

레시틴(Lipoid S 75-3, Lipoid, Germany), 콜레스테롤(Cholesterol JP, Nippon Fine Chemical Co., LTD, Japan) 및 pH를 조절하기 위해서 알지닌(L-arginine, Ajinomoto, Japan) 준비하였다.

용매로 부틸렌글라이콜(1,3-Butylene glycol, Daicel, Japan), 에탄올(Ethyl alcohol, Daejung, Korea)을 준비하였으며, 정제수는 증류수 제조기(Pure RO 130, Human Co., Korea)에서 제조한 것을((< 3 μS/cm) 준비하였다.

바이오틴(Biotin, Sigma-Aldrich, MO, USA)은 순도 99% 이상의 HPLC 급으로 준비하였으며, 바이오틴 함량 분석을 위해 HPLC 용매로 사용한 메탄올, 정제수, 아세토나이트릴 및 sodium hexanesulfonate는 Sigma-Aldrich (MO, USA) 제품으로 모두 HPLC 급을 준비하였다.

리포좀을 제조하기 위하여 호모믹서(T.K. Auto homomixer mark Ⅱ 2.5, Tokushukika, Japan) 및 고압유화기(Nanodisperser, NLM1000, Ilshin autoclave, Korea)를 이용하였으며, pH 측정을 위해 pH meter(Orion star A111, Thermo scientific, USA)를 이용하였다. 리포좀의 입자크기, 제타전위 및 다분산지수(PDI, polydispersity index) 측정을 위해 제타사이저(Zetasizer Nano ZS system, Malvern Instrument Ltd., UK)를 이용하였으며, 나노리포좀 내 바이오틴 캡슐화율 및 바이오틴을 정량하는데 HPLC(Agilent 1100, Agilent Technologies, USA)를 이용하였다.

2. 리포좀의 제조

하기의 표들에 기재된 제조예 #1-1 ~ #4-3은 비교예이며, #4-4는 실시예이다.

1) 리포좀 제조 예비실험

① 용매 조건의 나노리포좀 제조 예비실험

나노리포좀을 제조하기 위하여 레시틴, 콜레스테롤, 부틸렌글라이콜 및 에탄올로 구성되는 유상(oil phase)과 수상(water phase)을 각각 70 ∼ 75 ℃로 가온하여 용해시킨 후 수상에 유상을 첨가하면서 호모믹서로 3,000 rpm, 10 min 동안 유화시켜 리포좀을 제조하였다.

여기서, 나노리포좀의 형성 여부를 확인하기 위해, 하기 표 1의 조성으로 리포좀을 제조하였으며, 제조된 리포좀을 40 ∼ 45 ℃에서 압력 700 bar, 통과 횟수 2회 조건으로 고압유화 처리하여 나노리포좀을 제조하였다.

	성분(wt%)	#1-1	#1-2	#1-3	#1-4
유상 (Oil phase)	레시틴	2.5	2.5	2.5	2.5
	콜레스테롤	0.5	0.5	0.5	0.5
	부틸렌글라이콜	20.0	30.0	-	-
	에탄올	-	-	10.0	15.0
수상 (Water phase)	증류수	76.7	66.7	86.7	81.7
수상 (Water phase)	보존제	0.3	0.3	0.3	0.3

② 고압유화 조건에서의 나노리포좀 제조 예비실험

고압유화 조건을 선정하기 위해, 하기 표 2의 조성 및 고압유화 조건으로 고압유화된 나노리포좀을 제조하였다.

여기서, 리포좀의 예비실험과 동일하게 실시하였다.

	성분(wt%)	#2-1	#2-2	#2-3	#2-4	#2-5	#2-6
유상 (Oil phase)	레시틴	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
	콜레스테롤	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
	에탄올	15.0	15.0	15.0	15.0	15.0	15.0
수상 (Water phase)	증류수	81.7	81.7	81.7	81.7	81.7	81.7
수상 (Water phase)	보존제	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
고압유화기 조건 (압력/횟수)		300/1	300/2	500/1	500/2	700/1	700/2

2) 나노리포좀의 제조

① 바이오틴 함유 나로리포좀의 제조

바이오틴 함유 나노리포좀을 제조하기 위해, 하기 표 3의 조성 및 고압유화 조건으로 바이오틴 함유 나로리포좀을 제조하였다.

이때, 고압유화 조건은 압력 700 bar 및 통과횟수는 2 회로 실시하였다.

	성분(wt%)	#3-1	#3-2	#3-3	#3-4
유상 (Oil phase)	레시틴	2.5	2.5	2.5	2.5
	콜레스테롤	0.5	0.5	0.5	0.5
	부틸렌글라이콜	20.0	30.0	-	-
	에탄올	-	-	10.0	15.0
수상 (Water phase)	증류수	76.6	66.6	86.6	81.6
	바이오틴	0.1	0.1	0.1	0.1
	보존제	0.3	0.3	0.3	0.3

② 알지닌(Arginine)이 첨가된 바이오틴 함유 나로리포좀의 제조

알리진이 첨가된 바이오틴 함유 나노리포좀을 제조하기 위해, 하기 표 4의 조성 및 고압유화 조건으로 알지닌이 첨가된 바이오틴 함유 나노리포좀을 제조하였다.

(리포좀 및 나노리포좀의 제조는 예비실험과 동일하게 진행하였다.)

	성분(wt%)	#4-1	#4-2	#4-3	#4-4
유상 (Oil phase)	레시틴	2.5	2.5	2.5	2.5
	콜레스테롤	0.5	0.5	0.5	0.5
	에탄올	15.0	15.0	15.0	15.0
수상 (Water phase)	증류수	81.7	81.64	81.6	81.54
	바이오틴	-	-	0.1	0.1
	알지닌	-	0.06	-	0.06
	보존제	0.3	0.3	0.3	0.3

<실험예>

1. 리포좀 안정성 평가

1) 온도별 제형 안정성 관능평가

각 제조된 나노리포좀을 각각 실온(25 ℃), 냉온(4 ℃), 항온(40 ℃)에서 보관하여 각각 1 일, 1 주일 1 개월 및 3 개월 날짜별로 경시변화를 측정하였으며, 경시변화는 리포좀의 투명도, 색상, 분리여부 및 바이오틴의 석출(결정화) 여부로 확인하였다.

2) pH 측정

각각의 시료 2 g을 정제수 30 mL로 희석하여, 25 ℃에서 pH meter로 나노리포좀의 pH를 측정하였다.

3) 입자크기 및 제타전위 측정

Dynamic light scattering 방식을 활용한 제타사이저를 이용하여 나노리포좀의 평균 입자크기와 제타전위 및 다분산지수 측정하였다.

이때, 온도는 25 ℃로 일정하게 유지되도록 하였으며 정확성을 위해 원액을 갖고 측정을 진행하였다. 또한 안정성 확인을 위해 1 일, 1 주일 1 개월 및 3 개월 주기로 측정하였다.

4) 바이오틴 함량 분석

HPLC system으로 바이오틴 함량을 분석하여 정량하였다.

이때, 칼럼은 C18 (150 × 4.6 mm)을 사용하였으며, 검출기는 UV 검출기(200 nm)를 사용하여 유속 1.0 mL/min, 오븐 온도는 40 ℃, 이동상으로는 아세토나이트릴/정제수(0.02% 인산) = 15/85로 혼합한 용매를 사용하여 분석하였다. 바이오틴 표준품 및 바이오틴 함유 나노리포좀은 메탄올(0.05% 인산) 용매로 희석하여 분석하였다.

2. 리포좀의 캡슐화율 측정

DMM(dialysis membrane method)을 이용하여 나노리포좀의 바이오틴 캡슐화율을 측정하였다.

나노리포좀(1.0 mL)을 분취하여 300 Da 분자량 한계인 Dialysis membrane bag에 넣고 클립으로 완전히 밀봉시켜 준비한 후, 밀봉된 Dialysis membrane bag을 1× PBS buffer(pH 7.4) 200 mL의 담긴 비커에 침지시켜 준비하였다. 5 시간 후 Membrane bag을 투과한 Outer 용액과 투과하지 못한 Inner 용액을 각각 분취하여 준비하였다. 각각의 용액들은 0.45 μm Syringe filter로 여과시켜준 후, HPLC system에서 바이오틴 함량분석 조건과 동일하게 하여 정량하였다. 이를 통해 캡슐화율을 구하기 위해 첫 번째로 Dialysis membrane bag을 투과한 시료에서의 바이오틴 함량과 바이오틴 함유 나노리포좀의 바이오틴 함량을 상대 비교하여 하기의 수학식 1에 의해 계산하였다. 이는 리포좀 내에 캡슐화 되지 않은 바이오틴의 함량으로 확인할 수 있다. 두 번째로 Dialysis membrane bag을 투과하지 못한 시료에서의 바이오틴 함량과 바이오틴 함유 나노리포좀의 바이오틴 함량을 상대 비교하여 하기의 수학식 2에 의해 계산하였다.

여기서, A는 막 외부 나노리포좀의 바이오틴 비율(%)이고, B는 막 내부 나노리포좀의 바이오틴 비율(%), C₁는 초기 나노리포좀의 바이오틴 양(%), C₂는 막 외부 나노리포좀의 바이오틴 양(%), C₃는 막 내부 나노리포좀의 바이오틴 양(%)이다.

3. In vitro 경피흡수율 측정(Franz diffusion cell method)

Franz diffusion cell system(FDC-6T, Logan Instrument, USA)을 이용하여 바이오틴 함유 나노리포좀의 경피흡수율을 측정하였다.

경피흡수율 측정은 인공피부(Strat-M membrane, Merck Millipore, USA)을 사용하였으며, 각질층이 위를 향하도록 하여 Donor와 Receptor phase 사이에 Membrane을 고정시켜 준비하였다. Receptor chamber에 50% 에탄올을 채웠으며, 측정이 진행되는 동안 항온수조를 통해 온도를 37 ± 1 ℃로 유지하였다. 24 시간 후 Receptor chamber에서 채취한 시료 내의 바이오틴 함량은 HPLC를 이용하여 측정하였다. 또한, 24 시간 후 Membrane에 남아있는 바이오틴 함량을 측정하기 위해 Membrane을 PBS로 3회에 걸쳐 세척 후 Receptor phase와 닿지 않은 부분을 잘라낸 다음 남은 부분에 대해 가위를 이용해 세절하였다. 세절한 Membrane을 10 mL의 50% 에탄올에 넣고 1 시간 동안 초음파 세척기를 이용하여 추출 및 처리하여 Membrane에 남아있는 바이오틴 함량을 측정하였다.

4. 바이오틴 함유 나노리포좀의 형성 측정

극저온 투과 전자현미경(TEM, Transmission Electron Microscope, Tecnai F20 G2, FEI Company, USA)을 이용하여 나노리포좀의 형상을 측정하였다.

먼저, 극저온 시스템(Cryo system)을 이용하여 시료를 전처리하여 준비하였다.

다음으로, Jet freezing device(JFD 030, BALTEC, Pfaffkkon ZH, Switzerland)을 이용하여 2,100 bar 이상의 고압 상태에서 액화 질소 냉매를 사용하여 시료를 급속 동결처리하였다. 동결 고정 방법에 의해 물리적으로 완전히 고정된 상태의 시료를 Freeze-fracture/etching system(MED 020 GBE, BALTEC, Pfaffikon ZH, Switzerland)을 통해 시편을 잘라내고 -90 ℃에서 탈수(etching)시켜 온도를 -120 ℃를 유지하면서 TEM에서 형상을 측정하였다.

4. 통계적 검증

측정 3회 반복 하였으며 측정 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 유의성은 Student's t-test로 진행하였고, 유의성에 따라 *p < 0.05, **p < 0.01로 표시하였다.

<결과 및 고찰>

1. 제형의 안정성 분석

1) 온도별 제형 안정성 및 pH 측정 결과 분석

대부분의 나노리포좀 실험품들(#3, #4)이 시간이 지남에 따라 붉어지는 현상이 나타났으며 탁도 또한 증가하는 것을 확인하였다. 붉어지는 현상은 리포좀 제조 시 사용한 레시틴에서 기인하며, 탁도의 증가는 바이오틴의 석출 및 입자크기의 증가에의 의한 것이다.

관능평가 1 주일 후, 바이오틴을 첨가하지 않은 나노리포좀 #1은 모두 석출/침전 현상이 일어나지 않았지만(Data not shown), 바이오틴을 첨가한 나노리포좀 #3에서는 모두 석출 현상이 나타났다. 이를 통해 바이오틴이 나노리포좀 내에서 용매에 상관없이 석출되는 문제점이 있음을 확인하였다.

그러나, 바이오틴이 첨가된 나노리포좀 #4-4에서는 석출 현상이 나타나지 않았으며, 나노리포좀 #3 및 나노리포좀 #4-3 보다 투명한 것을 확인할 수 있다(도 3 및 도 4).

이는 알지닌을 첨가하여 pH를 증가시킨 나노리포좀 #4-4의 경우, 나노리포좀 내의 바이오틴 석출 현상 및 나노리포좀에서 붉어지는 현상(discoloration)이 완화되어 나노리포좀의 안정성을 향상시키는 것을 확인할 수 있다.

또한, pH 측정결과에서 pH를 증가시킨 바이오틴 함유 나노리포좀이 그렇지 않은 바이오틴 함유 나노리포좀에 비해 더 안정성이 높은 것을 확인하였다.

하기의 표 5는 나노리포좀의 pH 및 관능 평가를 나타낸 것이다.

샘플(Sample)	pH	관능 평가(실온에서 1주일 후)
#3-1	4.48 ± 0.12	침적(deposition)
#3-2	4.77 ± 0.18	침적(deposition)
#3-3	4.62 ± 0.20	침적(deposition)
#3-4	4.88 ± 0.24	침적(deposition)
#4-1	7.12 ± 0.36	투명(clear)
#4-2	9.17 ± 0.18	투명(clear)
#4-3	4.88 ± 0.21	침적(deposition)
#4-4	5.62 ± 0.12	투명(clear)

2) 입자크기 및 제타전위 분석

① 용매 조건의 나노리포좀 제조 예비실험 결과

나노리포좀의 입자크기 및 제타전위를 제타사이저를 통해 측정한 결과, 제조에 사용된 용매에 따라 입자크기 및 제타전위가 다른 것을 확인할 수 있었으며, 이중 용매를 에탄올로 사용한 제형이 부틸렌글라이콜을 사용한 제형보다 입자크기가 상대적으로 작았으며 제타전위 절대 값이 커, 상대적으로 입자 간의 정전기적 반발력(electrostatic repulsive force)의 커서 리포좀 입자의 분산 안정성이 좀 더 높은 것을 확인하였다.

또한, 시간경과에 따른 관찰에서도 에탄올을 용매로 선정한 나노리포좀이 부틸렌글라이콜을 용매로 선정한 나노리포좀에 비해 입자크기 및 제타전위 평가에서 안정한 경향을 나타냈으며, 이를 통해 이후 나노리포좀 제조 시 에탄올을 용매로 선정하였다.

② 고압유화 조건에서의 나노리포좀 제조 예비실험 결과 분석

고압유화 조건 선정을 위한 실험 결과, 고압유화기의 압력(bar)이 높고, 처리 횟수가 많을수록 전체적으로 입자크기가 감소하였다. 낮은 압력에서는 처리 횟수를 증가시켰을 때(1회→2회) 입자 감소폭이 컸으나(#2-1, #2-2), 압력이 상대적으로 큰 경우는 처리 횟수를 증가시켜도 초기 입자 감소폭이 크지 않았다(#2-3, #2-4, #2-5 및 #2-6). 또한, 시간경과에 따라 입자가 커지는 것을 확인할 수 있었으며, 입자의 크기는 100 ∼ 250 nm였다(도 5).

다분산 지수(Polydispersity index, PDI)는 고압유화기의 압력이 높고, 처리 횟수가 많을수록 전체적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 입자크기와는 달리, 낮은 압력에서는 처리 횟수를 증가시켰을 때 초기 PDI 감소폭이 적으나(#2-1, #2-2), 압력이 상대적으로 큰 경우 처리횟수를 증가시켰을 때 초기 PDI 감소폭이 좀 더 크게 나타나는 것을 확인할 수 있다(#2-3, #2-4, #2-5, 및 #2-6). 또한, 시간경과에 따라 PDI는 오히려 감소하는 것을 확인할 수 있으며, 다분산 지수(Polydispersity index, PDI)는 0.2 ∼ 0.5 였다(도 6).

나노 분산액의 분산 안정성을 확인하기 위해 측정된 제타전위 값은 고압유화기의 압력과 처리 횟수에 따라 증가 및 감소 경향을 보이지는 않았다. 또한 시간경과에 따라서도 절대 값이 감소하기도 하며 오히려 증가하기도 하는 오차가 포함된 것으로 확인된다. 다만 나노리포좀 #2에서의 제타전위는 -80 ∼ -30 mV 정도로서 일반적인 안정한 범위의 제타전위 범위인 ± 30 mV 이상으로 측정되어 정전기적으로 안정적임을 확인할 수 있다(도 7).

고압유화 조건을 선정하기 위해 나노리포좀의 온도별 제형 안정성 관능평가, 입자크기, PDI 및 제타전위를 측정한 결과, 고압유화 시 압력 700 bar, 처리 횟수 2회로 결정하였다.

③ 바이오틴 함유 나로리포좀의 실험 결과 분석

바이오틴을 첨가한 나노리포좀에서 상대적으로 에탄올을 용매로 선정한 나노리포좀이 부틸렌글라이콜을 용매로 선정한 나노리포좀보다 온도에 따른 시간별 제형 안정성 관능평가, 입자크기 및 제타전위에서 좀 더 양호한 것을 확인할 수 있다.

그러나 실온 보관, 1 주일 후 관능평가에서 4개 실험품(#3)에서 모두 바이오틴이 석출되는 현상이 나타났다. 또한, 나노리포좀의 pH는 4.0 ∼ 5.0 정도로 이전 실험품들에 비해 현저하게 pH가 낮음을 확인할 수 있었다. 바이오틴 성분이 나노리포좀 내에서 용해도 감소로 인해 상대적으로 석출되는 속도의 증가로 1 주일 후 바이오틴이 석출되는 것을 확인할 수 있다. 이러한 현상은 냉온 및 항온 실험품에서도 동일하게 확인되었다.

④ 알지닌 첨가 바이오틴 함유 나노리포좀 실험 결과 분석

알지닌을 첨가한 #4-2와 #4-4의 pH를 측정한 결과 pH가 증가하였으며, 특히 바이오틴 함유 나노리포좀 #4-4에서 pH가 5.62으로 바이오틴을 첨가하였음에도 불구하고 실온, 1 주일 후 관능평가에서 바이오틴을 첨가하지 않은 나노리포좀과 같이 석출현상이 나타나지 않는 것을 확인하였다. 또한, 알지닌을 첨가하여 pH를 상승시킨 나노리포좀의 경우 시간이 지나도 붉어지는 현상이 나타나지 않았다. 이는 알지닌은 바이오틴과의 결합으로 바이오틴의 용해도를 증가시키는 것은 물론 레시틴의 성분에도 영향을 나타내는 것을 의미한다.

시간경과에 따른 관찰에서도 바이오틴과 알지닌이 첨가된 나노리포좀(#4-4)의 입자크기가 가장 작은 것을 확인할 수 있다(도 8). 또한 나노리포좀(#2)에서와 같이 시간에 따른 제타전위 값이 감소하기도 하며 오히려 증가하기도 하는 오차가 포함된 것으로 판단되나, 바이오틴 첨가 나노리포좀(#4-3)과 비교 시, 알지닌 첨가 나노리포좀(#4-4)의 제타전위가 더 큰 것으로 확인되었다(도 9).

따라서 나노리포좀 제조 조건(압력 700 bar, 처리 횟수 2회)에서 바이오틴 0.1%와 알지닌 0.06% 함유 나노리포좀(#4-4)은 시간별 제형 안정성 관능평가, 입자크기, 제타전위 평가에서 가장 안정한 것을 확인할 수 있다.

⑤ 바이오틴 함량 분석

바이오틴이 함유된 나노리포좀에 알지닌이 첨거됨으로써 물성 측면에서 안정성이 향상되었다. 바이오틴에 알지닌 성분이 첨가됨으로써 화학적 안정성이 유지되는지 확인하기 위하여 바이오틴 수용액의 농도별 HPLC 측정과 알지닌 첨가 바이오틴 수용액 의 농도별 HPLC 측정하였다.

바이오틴 수용액의 HPLC 분석 결과와 알지닌 첨가 바이오틴의 HPLC 분석 결과가 유사한 결과값을 나타내었으나, 알지닌을 첨가하는 경우 바이오틴 함량이 약 12 ∼ 14% 정도 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 실험 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

수용액 내의 샘플 함량(Sample in water)	바이오틴 양(Amount of biotin)
바이오틴 0.04%	0.0438 ± 0.0012
바이오틴 0.02%	0.0211 ± 0.0008
바이오틴 0.01%	0.0105 ± 0.0014
바이오틴 0.005%	0.0051 ± 0.0001
바이오틴 0.001%	0.0010 ± 0.0002
바이오틴 0.04% + 알지닌 0.0024%	0.0361 ± 0.0021
바이오틴 0.02% + 알지닌 0.0012%	0.0176 ± 0.0014
바이오틴 0.01% + 알지닌 0.0006%	0.0087 ± 0.0007
바이오틴 0.005% + 알지닌 0.0003%	0.0044 ± 0.0005
바이오틴 0.001% + 알지닌 0.00006%	0.0008 ± 0.0001

2. 바이오틴 함유 나노리포좀 캡슐화율 측정 결과 분석

알지닌을 첨가하지 않은 나노리포좀(#4-3)과 알지닌을 첨가한 나노리포좀(#4-4)에서 캡슐화되지 않은 및 캡슐화된 바이오틴 함량은 수학식 1 및 수학식 2로부터 계산할 수 있다.

HPLC 분석을 통해 바이오틴 성분 함량을 각 수학식 1 및 수학식 2에 대입하여 바이오틴의 캡슐화율과 화수율을 계산한 결과, 나노리포좀 #4-3의 경우 캡슐화율은 5.60%, 회수율은 96.29%를 나타내었다. 또한 나노리포좀 #4-4의 경우는 27.64%의 캡슐화율과 110.20%의 회수율을 나타내었다.

하기의 표 7은 Dialysis membrane method 방법에 의한 바이오틴 함유 나노리포좀 캡슐화율을 나타낸 것이다.

sample	양%(Amount)	캡슐화율% (Capsulation efficiency)
나노리포좀 #4-3(초기)	0.1072 ± 0.0001	5.60 ± 0.17
나노리포좀 #4-3(막 외부)	0.0974 ± 0.0187
나노리포좀 #4-3(막 내부)	0.0060 ± 0.0002
나노리포좀 #4-4(초기)	0.1147 ± 0.0001	27.64 ± 0.41
나노리포좀 #4-4(막 외부)	0.0947 ± 0.0003
나노리포좀 #4-4(막 내부)	0.0317 ± 0.0004

이를 통해 알지닌을 첨가한 바이오틴 함유 나노리포좀이 첨가하지 않은 바이오틴 함유 나노리포좀에 비하여 바이오틴 캡슐화율이 약 5배 정도 증가하였음을 확인할 수 있었다.또한, 알지닌 첨가에 따라 바이오틴의 석출 현상 없이 용해도 증가가 바이오틴 함유 나노리포좀을 제조하는 데에 있어 물리적 안정성뿐만 아니라 바이오틴의 캡슐화율을 향상시킬 수 있는 것을 확인할 수 있다.

3. 바이오틴 함유 나노리포좀의 경피흡수율(Skin absorption rate) 결과

바이오틴의 in vitro 경피흡수율 평가에 알지닌을 첨가한 바오틴 나노리포좀(#4-4)을 이용하여 2회 진행하였다. 인공피부를 이용하여 Franz diffution cell method를 이용하여 24 시간 후에 doner, receptor 및 membrane에서 각각 바이오틴 Giafid을 HPLC를 통해 측정하였다. 측정된 각각의 바이오틴 분석한 결과를 하기의 수학식 3 및 수학식 4를 이용하여 바이오틴의 경피흡수율(%)과 회수율(%)을 계산하였다.

[수학식 3]

[수학식 4]

(여기서, D는 바이오틴의 피부 흡수율(%)이고, E는 바이오틴의 회수율(%)이고, F₁은 초기 나노리포좀(#4-4)의 바이오틴 양(㎍)이고, F₂는 수용자(Receptor) 상태의 바이오틴 양(㎍)이고, F₃은 막(membrane)의 바이오틴 양(㎍)이고, F₄는 공여자(donor) 상태의 바이오틴 양(㎍)이다.)

하기의 표 8은 바이오틴 함유 나노리포좀(#4-4)의 함량 및 확산률을 나타낸 것이다.

샘플	샘플링 위치	양(%)
나노리포좀 #4-4	초기 상태 (Original phaes)_F1	95.28 ± 0.47
	공여자 상태 (Donor phase)_F4	50.65 ± 3.28
	막(Membrane)_F3	-
	수용자 상태(Receptor phase)_F2	32.50 ± 2.58

Franz diffusion cell method를 통해 바이오틴 함유 나노리포좀(#4-4)의 경피흡수율을 측정한 결과, 24 시간 경과 후 Receptor phase에서 바이오틴이 32.50 ㎍ 검출되었으며, Membrane에서의 잔존 바이오틴은 검출되지 않았다. 이를 통해 바이오틴 함유 나노리포좀의 경피흡수율이 34.11%로 확인되었으며, 회수율은 87.27%로 확인되었다.

4. 바이오틴 함유 나노리포좀 형상 분석

바이오틴 함유 나노리포좀의 형상을 관찰하기 위하여 Cryo-TEM을 측정한 결과, 입자크기가 100 ∼ 150 nm 정도로 제타사이저로 측정한 입자크기와 유사하였으며, ULV 형태를 띠는 것을 확인할 수 있었다(도 10).

또한, 바이오틴을 캡슐화시킨 나노리포좀의 경우 리포좀 내부와 외부 모두 침상 형상의 바이오틴이 결정 상태로 석출되는 반면, 알지닌을 첨가한 바이오틴 함유 나노리포좀은 바이오틴의 결정상태가 거의 나타나지 않았음을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 의해 제조된 알지닌 첨가 바이오틴 함유 나노리포좀은 바이오틴의 석출 현상없이 안정하다는 것을 확인할 수 있다.

결과적으로 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 바이오틴 함유 나노리포좀은 입자크기(시간에 따른 입자크기, 3개월)가 100 ∼ 250 nm, 다분산지수 0.2 ∼ 0.5, 제타전위 -80 ∼ -30 mV이며, Cryo-TEM 이미지 측정으로 나노리포좀의 크기는 100 ∼ 150 nm 정도로 100 ∼ 1000 nm의 LUV에서 작은 범위의 ULV 형태의 나노리포좀이 형성되는 것을 확인할 수 있다.

Claims

pH 조절제 및 고압유화 처리를 이용하여 바이오틴의 캡슐화율을 향상시킬 수 있는 바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법은,
(a) 인지질(Phospholipid), 콜레스테롤(Cholesterol), 및 알코올(Alcohol)을 혼합하여 제1 혼합액을 제조하는 단계;
(b) 보존제(Preservative), 바이오틴(Biotin), pH 조절제 및 정제수를 혼합하여 제2 혼합액을 제조하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계의 제1 혼합액과 상기 (b) 단계의 제2 혼합액을 각각 가열하여 용해시키는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 제1 혼합액과 상기 (c) 단계의 제2 혼합액을 혼합하고 유화시켜 리포좀을 제조하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 리포좀을 고압유화 처리하여 나노리포좀을 제조하는 단계를 포함하는,
바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 인지질은,
레시틴(Lecithin)인 것을 특징으로 하는,
바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 (c) 단계는,
70 ~ 75 ℃의 온도에서 1 ~ 10 분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는,
바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 (d) 단계는,
호머믹서기에서 상기 (c) 단계의 제1 혼합액을 상기 (c) 단계의 제2 혼합액에 투입하여 2,500 ~ 3,500 rpm으로 5 ~ 15 분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는,
바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 pH 조절제는,
알지닌(Arginine) 수산화나트륨(NaOH), 수산화칼륨(KOH), 및 트리에탄올아민(Triethanolamine)으로 이루어진 그룹 중 선택되는 1 종 이상의 것임을 특징으로 하는,
바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 pH 조절제는 조성물 총 중량%에 대하여,
0.001 ~ 0.5 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는,
바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 (e) 단계는,
40 ∼ 45 ℃의 온도, 650 ~ 750 bar의 압력에서 1 ~ 3 회 수행하는 것을 특징으로 하는,
바이오틴 함유 나노리포좀의 제조방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는,
바이오틴 함유 나노리포좀.
제9항에 있어서,
상기 나노리포좀은 입자의 크기가 100 ~ 250 nm이고, 다분산지수가 0.2 ~ 0.5 이며, 제타전위가 -80 ~ -30 mV인 것을 특징으로 하는,
바이오틴 함유 나노리포좀.
제9항에 있어서,
상기 나노리포좀 내 바이오틴의 캡슐화율이 25% 이상인 것을 특징으로 하는,
바이오틴 함유 나노리포좀.
제9항에 있어서,
상기 바이오틴의 경피흡수율이 30% 이상인 것을 특징으로 하는,
바이오틴 함유 나노리포좀.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는 바이오틴 함유 나노리포좀을 포함하는,
경피흡수 촉진용 화장료 조성물.
제13항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 조성물 총 중량%에 대하여, 나노리포좀을 0.1 내지 20 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는, 경피흡수 촉진용 화장료 조성물.