KR20210126901A - 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법 - Google Patents

전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커는 전이성 뇌종양의 진단 및 재발 예후 예측을 정확하게 분석할 수 있다.

Description

전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법 {Biomarker for diagnosis or prognosis analysis of brain metastasis and diagnosis method using same}
본 발명은 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서 발현되는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1와 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 전이성 뇌종양의 진단 및 예후를 분석하는 방법에 관한 것이다.
최근, 화학치료제, 표적치료제 및 면역치료제 등 다양한 항암치료제의 개발과 예후 예측을 위한 진단 키트의 개발에도 불구하고 여전히 항암치료 반응을 보지 못하는 환자가 많다. 암 환자들의 예후 예측을 위한 기존의 키트는 주로 암 조직 자체에 초점이 맞춰져 있으나, 예후 분석의 정확도가 떨어지고 전이 및 재발 가능성을 정확하게 예측하기 어려운 문제가 존재하는 상황이다.
암세포는 체내의 면역세포와 주변 미세환경을 자신에게 유리하도록 조절하는 능력을 가지고 있다. 암을 둘러싼 종양미세환경에는 크게 항종양 (anti-tumor) 면역세포와 종양촉진 (pro-tumor) 면역억제세포가 존재하고, 암세포는 '면역억제 스위칭 (immunosuppressive switching)' 기전을 통해 면역억제세포의 분화와 분획을 증가시켜 암의 진행과 전이를 촉진한다. 면역억제세포에는 대표적으로 암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAF), M2-like 종양연관대식세포 (tumor-associated macrophages; TAM) 및 골수유래면역억제세포 (myeloid derived suppressor cell; MDSC) 등이 있다.
한편, 최근 암의 진행에는 암세포뿐 아니라 주변의 종양미세환경 또한 매우 중요한 것으로 알려졌으며, 이에 따라, 암 환자들의 예후 예측 검사를 위해 암을 둘러싼 종양미세환경 구성 세포 및 이의 특이적 발현 분자를 활용한 신규 바이오마커의 개발이 중요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 전이성 뇌종양의 진단 및 재발 예후 예측을 정확하게 분석할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1가 전이성 뇌종양의 종양미세환경 내 암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAF)에서 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 전이성 뇌종양의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커는 전이성 뇌종양의 진단 및 재발 예후 예측을 정확하게 분석할 수 있다.
본 발명자들은 이에 전이성 뇌종양 주변의 암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)에서 발현된 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1의 발현수준과 전이성 뇌종양의 예후 사이에 유의적인 상관관계가 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 양태는 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서 발현된 마커와 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 조성물이다.
본 명세서 상의 용어 “전이성 뇌종양”은 신체의 다른 부위에 생긴 암이 뇌로 전이되어 발생한 종양으로서, 원발성 장기인 유방, 직결장, 신장, 간, 폐, 흑색종, 위 등에서 발생한 암이 뇌에 전이되어 발생한 종양을 의미한다.
본 명세서 상의 용어 “암 관련 섬유아세포”는 암의 내부 또는 암의 주변 미세환경에 존재하여, 암 주변 환경을 조절하고 구성하는 섬유아세포를 의미하는 것으로, 다양한 암 기질 내의 두드러진 세포 유형을 의미한다. 또한, 본 명세서 상의 용어 “암 관련 섬유아세포”는 본 발명의 목적을 고려하여 전이성 뇌종양의 내부 또는 주변 미세환경에 존재하는 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포를 의미한다.
본 명세서 상의 용어 "마커(marker)"는 전이성 뇌종양 질환을 가진 개체를 정상군 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 전이성 뇌종양 질환을 갖는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함할 수 있고, 예를 들어, 전이성 뇌종양 질환을 갖는 개체에서 발현이 증가되는 단백질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 마커는 전이성 뇌종양 질환을 갖는 개체의 암 관련 섬유아세포에서 증가되는 단백질 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 마커는 α-SMA (Alpha-smooth muscle actin), FAPα (Fibroblast activation protein alpha), S100A4/FSP1 (Fibroblast-specific protein 1), PDGFR-α (platelet-derived growth factor receptor A), PDGFR-β (Platelet-derived growth factor receptor beta), Collagen type I, NG2 (Neuron-glial antigen 2), Tenascin-C 및 Twist1 (Twist-related protein 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 마커는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 마커는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, PDGFR-β 및 α-SMA일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 마커는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 세개의 것일 수 있으며, 예를 들어, PDGFR-β, α-SMA, FAP-α일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 마커는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 셋 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, PDGFR-β, α-SMA, FAP-α, S100A4/FSP1, collagen I 및 twist1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제제는 항체 또는 앱타머를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 항체 또는 앱타머는, α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상과 각각 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 “항체”는, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미할 수 있으며, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 모두 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 항체는 당업계에 널리 공지된 기술에 따라 생산될 수 있으며, 다클론 또는 단클론 항체로 생산될 수 있다. 다클론 항체는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 또는 Twist1을 동물에 주사하고, 동물로부터 채혈한 혈청을 수득하는 공지된 방법에 따라 생산할 수 있다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 방법인 하이브리도마 방법 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, α-SMA에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab5694 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, FAPα에 특이적으로 결합하는 항체는 R&D. catalogue no. AF3715 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, S100A4/FSP1에 특이적으로 결합하는 항체는 Atlas. catalogue no. HPA007973 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, PDGFR-α에 특이적으로 결합하는 항체는 Santa Cruz. catalogue no. sc398206 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, PDGFR-β에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab32570 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, Collagen type I에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab34710 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, NG2에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab139406일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, Tenascin-C에 특이적으로 결합하는 항체는 Santa Cruz. catalogue no. sc25328 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, Twist1에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab50887 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, α-SMA에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab5694 일 수 있고, FAPα에 특이적으로 결합하는 항체는 R&D. catalogue no. AF3715 일 수 있고, S100A4/FSP1에 특이적으로 결합하는 항체는 Atlas. catalogue no. HPA007973 일 수 있고, PDGFR-α에 특이적으로 결합하는 항체는 Santa Cruz. catalogue no. sc398206 일 수 있고, PDGFR-β에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab32570 일 수 있고, Collagen type I에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab34710 일 수 있고, NG2에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab139406일 수 있고, Tenascin-C에 특이적으로 결합하는 항체는 Santa Cruz. catalogue no. sc25328 일 수 있고, Twist1에 특이적으로 결합하는 항체는 Abcam. catalogue no. ab50887 일 수 있다.
본 명세서 상의 용어, "앱타머 (aptamer)"는 20~60 뉴클레오티드 정도의 크기를 갖는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 앱타머는 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지 며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자를 검출하거나 이의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명에 있어서 앱타머는 RNA, DNA, 변형된 (modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 전이성 뇌종양은 유방, 직결장, 신장, 간, 폐, 흑색종 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서 발현된 마커와 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 키트이다.
본 발명에 있어서 키트는 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서 발현된 마커와 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 조성물을 포함할 수 있고, 이에 따라, 조성물 및 키트 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 있어서 키트는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 검출할 수 있는 것으로, 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘라이자 (Enzyme linked immunosorbent assay; ELISA) 키트, 블랏팅 (blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 면역염색키트, 단백질 칩 키트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있다. 발색효소는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타아제 (Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있다. 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있다. 발색 기질액은 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD (o-페닐렌디아민), TMB (테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 다음 단계를 포함하는 전이성 뇌종양의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법이다:
전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포를 포함하는 시료를 준비하는 준비 단계;
상기 암 관련 섬유아세포의 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 발현수준을 측정하는 측정 단계.
본 발명에 있어서 시료는 전이성 뇌종양 질환을 보유한 개체 또는 전이성 뇌종양 질환이 의심되는 개체로부터 수득한 생물학적 시료일 수 있다.
본 발명에 있어서 측정 단계는 웨스턴 블랏, 엘라이자 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역 분석 (Radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (oucherlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역 전기영동, 면역 조직 화학 염색, 면역 형광 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay), 유세포 분석 (Fluorescence Activated cell sorter; FACS), 앱타머 칩 (aptamer chip), 마이크로어레이 (microassay), 단백질 칩 (protein chip) 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있고, 예를 들어, 면역 조직 화학 염색 또는 면역 형광 염색에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 측정단계는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 각각 결합하는 항체 또는 앱타머를 통해 발현수준을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 항체 또는 앱타머는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 특이적으로 결합하여 항원-항체 복합체 또는 항원-앱타머 복합체를 형성할 수 있다. 그리고, 항원-항체 복합체 또는 항원-앱타머 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
검출라벨로 사용되는 효소는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노 트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 형광물은 FITC, RITC, 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 리간드는 바이오틴 유도체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 발광물은 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 미소입자는 콜로이드 금, 착색된 라텍스가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 레독스 분자는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8 , [Os(bpy)3]2+ ,[RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 방사선동위원소는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 측정 단계에서 발현수준은 항원-항체 복합체 또는 항원-앱타머의 복합체의 형성량을 측정함으로써 측정될 수 있고, 항원-항체 복합체 측정은 ELISA법을 이용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, ELISA는 직접적 ELISA, 간접적 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA, 간접적 샌드위치 ELISA일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현에에서, 측정 단계는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 발현수준을 측정하는 것일 수 있으며, 예를 들어, PDGFR-β 및 α-SMA의 발현수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 측정 단계는 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 셋 이상의 발현수준을 측정하는 것일 수 있으며, 예를 들어, PDGFR-β, α-SMA, FAP-α, S100A4/FSP1, collagen I 및 twist1의 발현수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 전이상 뇌종양은 유방, 직결장, 신장, 간, 폐, 흑색종 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명은 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커는 전이성 뇌종양의 진단 및 재발 예후 예측을 정확하게 분석할 수 있다.
도 1은 다양한 원발성 종양 (primary cancer)의 뇌전이 조직 내에서 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 마커 PDGFR-β, S100A4/FSP1, FAP-α, α-SMA, collagen I의 발현을 나타내는 면역 조직 화학 염색의 결과를 보여주는 사진이다.
도 2는 다양한 원발성 종양의 뇌전이 조직 내에서 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 마커 PDGFR-β, S100A4/FSP1, FAP-α, α-SMA, collagen I의 발현 수준을 나타내는 그래프이다.
도 3은 다양한 원발성 종양의 뇌전이 조직 내에서 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 마커 Twist1, NG2, tenascin-C 및 PDGRF-α의 발현수준을 나타내는 도면이다.
도 4는 임상병리학적 변수 (연령, 절제, 크기 및 보조방사선 요법) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 암 관련 섬유아세포 바이오마커 PDGFR-β, α-SMA의 발현수준에 대하여 로그 순위 검정 (log-rank test)에 의한 카플란-마이어법 (Kaplan-Meier estimator)을 사용하여 도출한 RFS (recurrence-free survival) 곡선 그래프이다.
도 5는 임상병리학적 변수 (연령, 전신의 전이, 1차 그룹) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 암 관련 섬유아세포 바이오마커 S100A4, PDGFR-β, α-SMA의 발현수준에 대하여 로그 순위 검정 (log-rank test)에 의한 카플란-마이어법 (Kaplan-Meier estimator)을 사용하여 도출한 PFS (progression-free survival) 곡선 그래프이다.
도 6은 정상 섬유아세포 (NFs)와 암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)의 형태를 광학 현미경을 통해 관찰한 사진이다.
도 7은 정상 섬유아세포, 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 마커 PDGFR-β, α-SMA, FAP- α와 결합하는 항체의 웨스턴 블롯 실험 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 정상 섬유아세포, 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서 발명의 일 실시예에 따른 바이오 마커 PDGFR-β, α-SMA의 발현을 나타내는 면역 형광 염색의 결과를 보여주는 사진이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 조직 표본 및 임상 데이터 선별
2004 년부터 2018 년 사이의 15년 동안 전남 대학교 화순 병원 및 의과 대학에서 두개골절단술 및 종양제거술을 시행받은 전이성 뇌종양 (brain metastasis; BM) 382 증례 중 7개의 원발장기 (유방, 직결장, 신장, 간, 폐, 흑색종 및 위)를 대표하는 68 건의 전이성 뇌종양 표본 및 임상 정보를 확보하였다.
그리고, 본 발명의 모든 실험은 전남 대학교 화순 병원 임상 시험 심사위원회의 승인을 받아 진행하였다. 또한, 임상 정보 및 병리학적 표본의 사용에 대해서 환자 또는 법적 대리인으로부터 서면 사전 동의를 얻어 진행하였다.
실시예 2: 면역 조직 화학 염색 및 염색 결과 해석
헤마톡실린&에오신 염색 (Hematoxylin and eosin; H&E) 및 면역조직화학염색 (immunohistochemistry; IHC)을 위한 대표적인 전이성 뇌종양 조직의 블록을 선정하였다. 이후, 전이성 뇌종양의 헤마톡실린&에오신 염색 및 면역조직화학 염색을 위한 3 μm 두께의 파라핀블럭을 제작하였다.
암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)의 면역 조직 화학 염색에는 Bond-max 자동염색기 (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA)를 사용하였다. 그리고, α-SMA (1:100 희석, Abcam), FAPα (1:1000 희석, R & D), S100A4/FSP1 (1:1000 희석, Atlas), PDGFR-α (1:100 희석, Santa Cruz), PDGFR-β (1:400 희석, Abcam), Collagen type I (1:300 희석, Abcam), NG2 (1:600 희석, Abcam), Tenascin-C (1:50 희석, Santa Cruz) 및 Twist1 (1:100 희석, Abcam)의 9종의 항체를 이용하여 면역 조직 화학 염색을 진행하였다.
염색 후, 숙련된 두 명의 병리의사가 임상적 세부사항에 대해 모른 채, 헤마톡실린&에오신 및 면역 조직 화학 염색된 슬라이드를 광학 현미경을 사용하여 염색 강도를 저발현과 고발현으로 나누어서 평가하였다.
암 관련 섬유 아세포의 염색 강도는 다음 기준에 따라 등급이 매겨졌다:
(1) α-SMA, FAP-α, PDGFR-β, S100A4/FSP1 및 Collagen type I 염색에서 염색강도가 낮은 경우 (0, 1)점 부여, 높은 경우 (≥2)점 부여.
(2) Twist1 염색에서 양성인 경우 (≥1)점 부여, 음성인 경우 0점 부여.
실시예 3: 세포 배양 및 조건화 배양액 준비
조건화 배양액 (Conditoned media) 제조를 위해 MRC-5, NIH-3T3, LLC1, MB-231, SL4 및 MC-38의 암 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection; ATCC)에서 구입하고, GL261 암 세포주를 시카고 대학교의 Maciej S. Lesniak 박사로부터 제공받아 사용하였다.
NIH-3T3, GL261, LLC1, SL4, MC-38, MRC-5, MB-231 세포를 각각 10 % 소 태아 혈청 (Invitrogen, USA), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하여 37°인큐베이터에서 5 % CO2가습 조건으로 배양하였다.
상기 암 세포주를 70-80 %의 컨플루언시 (confluency)까지 배양한 다음, PBS로 헹군 후 DMEM으로 성장 배지를 교체하였다. 이어서, 배양물을 24 시간 동안 유지하고 배지를 수집한 다음 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 0.22 μ필터로 여과하여 조건화 배양액를 제조하였다. 그리고, 이후 세포 배양 시 배양액과 상기 제조된 조건화 배양액을 2:1의 비율로 혼합하여 사용하였다.
실시예 4: 원발성 암 관련 섬유 아세포 및 정상 섬유 아세포의 확립
암 관련 섬유 아세포 및 정상 섬유 아세포의 배양을 위하여 환자 및 C57BL/6 마우스로부터 수득한 뇌전이암, 직결장암, 인체정상피부, 마우스피부조직을 샘플로 사용하였다.
수술 직후 수득한 신선조직을 1 mm이하의 작은 조직으로 분절한 후 콜라게나제 I (1 mg/mL, Sigma-Aldrich), DNase I (0.1 mg/mL, STEMCELL Technologies) 및 노르모신 (100 μg/mL, InvivoGen)을 함유하는 DMEM/F12를 사용하여 배양기내에 교반기 (shaker)를 넣어서 분해하였다.
분해된 샘플을 700rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 얻고, 얻은 상층액을 다시 800rpm에서 8분 동안 원심분리하여 섬유아세포를 분리하였다. 분리된 섬유아세포는 PBS로 세척한 후, 10 % FBS 및 1 % 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지에서 배양하였으며, 사용된 모든 암 관련 섬유아세포 및 정상 섬유아세포는 3계대 이내에 해당하는 세포를 사용하였다.
실시예 5: 웨스턴 블롯 분석
프로테아제 억제제 칵테일 (Roche, Germany)을 함유하는 방사성 면역 침전 분석 (radioimmunoprecipitation assay; RIPA) 완충액 (Bio Solution, South Korea)을 사용하여 정상 섬유아세포 및 암 관련 섬유아세포를 용해하여 단백질을 추출하였다.
이 후, 30 μg의 단백질 용해물을 0.1 % 소듐도데실 설페이트를 함유하는 8-10 % 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 이용하여 분리하고, 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인 (GE Healthcare, USA)으로 전기영동적으로 이동시켰다.
이 후, 멤브레인을 실온에서 1 시간 동안 차단완충제 (5 % 무 지방 탈지유)와 배양하고, 4 ℃에서 16 시간 동안 1차 항체 α-SMA(1:1000, Abcam), FAP-α(1:1000, Abcam), PDGFR-β (1:5000, Abcam), pan-Cytokeratin, (1:1000, Santa Cruz), β-actin (1:5000, Cell Signaling)로 탐침하였다. 그 후, 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase)와 접합된 항-토끼 또는 항-마우스 면역글로불린 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 멤브레인에 탐침시켰다.
형성된 밴드는 β-액틴을 대조군으로 사용하여 전기화학발광 시스템 (Millipore, USA)을 이용하여 검출하였으며, 자외선 (UV) 이미징 시스템인 LAS 4000 이미지 퀀트 시스템 (GE Healthcare, USA)으로 밴드를 정량화하였다.
실시예 6: 면역 형광 염색
배양된 암 관련 섬유아세포, 정상 섬유아세포 및 환자에서 유래한 전이성 뇌종양의 파라핀 블록 조직을 절단하여 이중면역형광 염색을 수행하였다.
배양된 암 관련 섬유아세포 및 정상 섬유아세포를 알코올로 탈수하고, 4 % 포름알데히드로 고정시킨 후, 실온에서 30분 동안 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단하고 0.1 % Triton X-100에 20분 동안 투과시켰다. 이후, 이를 일차항체 α-SMA, (1:200, Abcam) α-SMA (1:100, Abcam), PDGFR-β (1:100, Abcam) CD34 (1:50), EMA (1:200, Dako), GFAP (1:200, Cell Signaling Technology) 와 4℃에서 16시간 동안 공동배양했다. 이어서, 이차항체로 염소 항-마우스 IgG (goat anti-mouse IgG) (1:400, Life Technologies), 염소 항-토끼 IgG (goat anti-rabbit IgG) (1:400, Life Technologies) 항체와 1시간 동안 실온에서 공동배양 하였다.
또한, 인간 전이성 뇌종양의 파라핀-포매 조직을 3 mm 두께로 절단하고, 자일렌을 사용하여 파라핀을 제거하였다. 항원 검색은 열-활성화 시트레이트 완충액 (PH=6.0)을 이용하여 15분 동안 수행하였으며, 3% 과산화 수소를 이용해 내인성 퍼옥시다제를 불활성화하였다. 그 후, 조직을 일차항체 α-SMA, (1:200, Abcam) α-SMA (1:100, Abcam), PDGFR-β (1:100, Abcam) CD34 (1:50), EMA (1:200, Dako), GFAP (1:200, Cell Signaling Technology) 와 4℃에서 16시간 동안 공동배양 하고, 이어서, 이차항체로 사용한 염소 항-마우스 IgG (goat anti-mouse IgG) (1:400, Life Technologies), 염소 항-토끼 IgG (goat anti-rabbit IgG) (1:400, Life Technologies) 항체와 1시간 동안 실온에서 공동배양 하였다.
그리고, 조직 섹션을 300 nM의 DAPI와 함께 20 분 동안 배양한 후 PBS로 세척하였으며, 이를 방부제가 든 배지에 탑재하고 EVOS®형광 이미징 시스템 (Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 이미지화 하였다.
실시예 7: 통계 분석
종양의 크기 또는 국소적 재발의 존재, 임상 병리학적 변수들을 비교하기 위해, 카이 제곱 검정 (chi-squared test) 및 이항 논리 회귀 분석 (binary logistic regression)이 단변량, 다변량 분석에 적용되었다. 비재발 생존 (Recurrence-free survival; RFS) 및 비진행 생존 (Progression-free survival; PFS)에 대한 생존율을 일변량 및 다변량 분석하였다. 일변량 분석에는 로그 순위 검정으로 Kaplan-Meier 방법을 사용하였으며, 다변량 분석에서는 콕스 비례 위험 모델(Cox proportional hazards model)을 사용하여 분석하였다. 통계적 유의성은 p 값이 <0.05 인 경우를 유의성 있는 것으로 고려하였다.
그리고, 이러한 통계 분석은 SPSS 통계 분석 소프트웨어(SPSS Inc, USA)와 Graph Pad Prism (La Jolla, USA)을 사용하여 실시하였다.
실험예 1: 전이성 뇌종양에서의 암 관련 섬유아세포 바이오마커의 발현
전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서의 바이오마커의 발현을 확인하기 위해, 원발성 암 유형 (폐, 유방, 결장 직장 및 간암 각각 10 건, 위암 11건, 흑색 종 9건, 신장 8건)에 따라 총 68 건의 전이성 뇌종양 표본에서 면역조직화학 분석을 수행하였다.
분석결과, 도 1 및 도 2에서 확인할 수 있듯이, 암 관련 섬유아세포에서 PDGFR-β, S100A4/FSP1, FAP-α, α-SMA 및 collagen type I의 뚜렷한 발현을 관찰하였으며, 특히 모든 바이오 마커는 종양 주변에서 현저한 발현을 보였다.
또한, 도 3에서 확인할 수 있듯이, twist1은 원발 장기가 폐, 유방, 결장 직장 및 간인 경우의 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포에서는 크게 발현되었고, NG2는 원발장기가 유방, 결장 직장, 간 및 신장인 경우에 발현되었으며, tenascin-C 또한 원발장기가 폐 및 유방암인 경우에 발현되었다. 그리고, PDGRF-α는 종양 영역에서 현저하게 발현되었으나, 암 관련 섬유아세포에서는 발현되지 않았다.
실험예 2: 암 관련 섬유아세포-바이오 마커의 임상적 관련성 확인
암 관련 섬유아세포-바이오마커 발현과 종양의 크기 (종양 크기 ≥ 3 cm로 정의됨) 사이의 임상 병리학적 변수의 상관 관계를 분석하여 표 1에 나타내었다.
발현 비율 일변량 다변량
P 값 HR 95% CI P 값
PDGFR-β Low 39.1% <0.01 0.069 0.017-0.0284 <0.001
High 86.8%
α-SMA Low 37.5% 0.02 - - 0.587
High 80.0%
Collagen type 1 Low 41.5% 0.023 - - 0.698
High 75.5%
FSP Low 64.3% 0.674 - - 0.614
High 70.2%
FAP Low 66.7% 0.743 - - 0.595
High 70.6%
Twist-1 Low 62.5% 0.260 - - 0.804
High 75.9%
그리고, 외과적 절제 후 두개골내 국소 재발을 포함하는 전이성 뇌종양 환자에서의 임상 병리학적 변수 사이의 상관 관계를 분석하여 표 2에 나타내었다.
발현 비율 일변량 다변량
P 값 HR 95% CI P 값
PDGFR-β Low 21.7% 0.003 0.651
High 60.5%
α-SMA Low 18.8% 0.011 0.116 0.020-0.673 0.016
High 55.6%
Collagen type 1 Low 33.3% 0.330 0.730
High 49.0%
FSP Low 42.9% 0.795 0.607
High 46.8%
FAP Low 48.1% 0.754 0.519
High 44.1%
Twist-1 Low 37.5% 0.167 0.732
High 55.2%
분석 결과, 표 1에서 확인할 수 있듯이, PDGFR-β, α-SMA, collagen type I의 세 가지 표지자의 발현이 종양의 크기와 유의하게 관련이 있었으며, PDGFR-β의 높은 발현은 다변량 분석에서 전이성 뇌종양의 크기에 대한 가장 강력한 예측 인자였다.
또한, 표 2에서 확인할 수 있듯이, 국소재발과 관련 있는 인자는 PDGFR-β 발현, 및 α-SMA 발현으로 나타났다.
그리고, 이러한 결과를 도 4와 같이 Kaplan-Meier 곡선으로 나타내었으며, 도 4에서 확인할 수 있듯이, PDGFR-β의 높은 발현은 더 짧은 비재발 생존과 유의한 관련이 있음을 확인하였다. 또한, 도 5에서 확인할 수 있듯이, α-SMA의 고발현은 낮은 비진행 생존율과 관련이 있음을 확인하였다.
실험예 3: 원발성 암 관련 유전 및 정상 섬유아세포의 분리 및 특성 확인
암 관련 섬유아세포의 특성을 분석하기 위해, 뇌 전이암과 대장암으로 수술받은 환자의 신선조직에서 암 관련 섬유아세포와 정상 섬유아세포를 배양한 후, 웨스턴 블롯 분석과 면역 형광 염색을 수행하였다.
도 6에 나타난 것과 같이, 배양된 암 관련 섬유아세포는 정상 섬유모 세포보다 좀더 납작하거나 굽은 모양을 보였다. 그리고, 도 7에서 확인할 수 있듯이, 단백검출을 위한 웨스턴 블롯 분석에서는 정상 섬유아세포에 비해서 암 관련 섬유아세포에서 α-SMA, PDGFR-β, FAP-α 등 표지자의 발현이 훨씬 높게 나타났다.
그리고, 이러한 결과는 도 8에 나타나듯이, 면역 형광 염색 및 수술 조직 파라핀블럭 이중형광염색에 결과에서도, α-SMA, FAP-α 마커의 발현이 훨씬 높게 나타난 것을 확인하였다.

Claims (13)

  1. 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)에서 발현된 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 특이적으로 결합하는 제제;
    를 포함하는, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제제는 항체 또는 앱타머를 포함하는, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체는 단일클론항체인 것인, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제제는 PDGFR-β, α-SMA, FAP-α, S100A4/FSP1, collagen I 및 twist1과 특이적으로 결합하는 것인, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제제는 PDGFR-β, FAP-α 및 α-SMA과 특이적으로 결합하는 것인, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 전이상 뇌종양은 유방, 직결장, 신장, 간, 폐, 흑색종 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로 부터 유래된 것인, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 조성물.
  7. 전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)에서 발현된 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 특이적으로 결합하는 제제;
    를 포함하는, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA) 키트, 블랏팅(blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 칩 키트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 키트.
  9. 제7항에 있어서, 상기 제제는 항체 또는 앱타머를 포함하는 것인, 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 키트.
  10. 다음 단계를 포함하는 전이성 뇌종양의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    전이성 뇌종양의 암 관련 섬유아세포 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)를 포함하는 시료를 준비하는 준비 단계; 및
    상기 암 관련 섬유아세포의 α-SMA, FAPα, S100A4/FSP1, PDGFR-α, PDGFR-β, Collagen type I, NG2, Tenascin-C 및 Twist1로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 발현수준을 측정하는 측정 단계.
  11. 제10항에 있어서, 상기 측정 단계는 상기 암 관련 섬유아세포의 PDGFR-β, α-SMA 및 FAP-α의 발현수준을 측정하는 것인, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 전이상 뇌종양은 유방, 직결장, 신장, 간, 폐, 흑색종 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 유래된 것인, 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 측정 단계는 면역 조직 화학 염색 또는 면역 형광 염색에 의해 수행되는 것인, 방법.
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