KR20210120699A - 성별에 따른 방광암의 예후 진단용 조성물 및 키트 - Google Patents

성별에 따른 방광암의 예후 진단용 조성물 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 방광암 환자의 성별에 따른 예후 진단용 조성물, 방광암의 예후 진단용 키트 및 이를 이용하여 방광암의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방광암의 예후 진단용 조성물 및 키트를 이용하여, 방광암 환자의 성별에 따라 치료 후 생존 가능성 또는 재발 가능성 등의 예후를 진단 및 예측함으로써 방광암 환자의 치료 전략을 수립하는데 도움을 줄 수 있다.

Description

성별에 따른 방광암의 예후 진단용 조성물 및 키트{Composition And Kit For Diagnosing Prognosis Of Bladder Cancer According To Gender}
본 발명은 방광암 환자의 성별에 따른 방광암의 예후 진단용 조성물, 방광암의 예후 진단용 키트 및 이를 이용하여 방광암 환자의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
방광암(bladder cancer, BC)은 비뇨기계 영역에서 가장 빈번하게 발생하는 암으로서, 서양에서는 매년 인구 10만 명당 16.5명이 발병하는데 비하여 한국에서는 4.5명이 발생하는 것으로 보고되고 있다. 이처럼 서양에 비하여는 발생률이 낮으나, 해마다 발생률이 높아지고 있으며, 우리나라에서는 비뇨기계 암 중 가장 발생빈도가 높은 암으로 알려져 있다(Lee C, et al., 1992).
방광암은 침윤정도에 따라 크게 비침윤성 방광암(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)과 침윤성(muscle invasive bladder cancer, MIBC) 방광암으로 구분된다. 비침윤성 방광암은 암이 근육층의 침범 없이 점막에 국한된 병변으로써 경요도 방광절제술(transurethral resection of bladder tumor) 시행 후 위험 인자 유무에 따라 방광내 항암제 또는 BCG를 주입함으로써 비교적 간단하게 치료가 가능하나, 암의 재발과 침윤성 암으로의 진행이 문제가 된다.
한편, 침윤성 방광암은 암이 근육층까지 침투한 상태를 말하는 것으로서, 이의 치료를 위하여는 근치적 방광적출술과 함께 복잡한 요로전환(urinary diversion)을 수행하여야 할 뿐 아니라, 환자에게 치명적인 결과를 초래할 수도 있다. 따라서, 일차 치료 후 재발과 진행에 대한 예측과 조기발견 및 예방이 매우 중요하다.
이러한 이유로 방광암의 조기 진단과 암 발병 후 남은 수명을 체크할 수 있는 마커의 개발이 필요하다. 특허문헌 1에는 인간 방광암의 검출 또는 진단에 사용될 수 있는 일련의 유전자 마커를 개시하고 있다.
방광암을 비롯한 암을 진단하기 위한 마커가 개발되고 있으나, 방광암 환자의 재발, 또는 재발성 방광암 환자의 생존률과 특정 유전자의 돌연변이의 연관성에 대해서는 아직까지 연구가 이루어지지 않은 실정이다.
본 발명자는 방광암을 진단하거나, 방광암 환자에 대한 치료제를 발굴하여 치료 전략을 결정하기 위해서, 방광암 환자의 예후를 진단할 수 있는 마커의 개발의 필요성에 착안하여 방광암 환자에서 발견되는 유전자 변이와 환자의 성별과의 연관성에 대해서 연구하였다.
한국 특허공개공보 제2014-0092905호(2014.07.24)
방광암 환자에 적합한 치료적 전략을 적용하기 위해서는, 방광암 환자의 예후를 예측하고 및 치료 전략을 결정하는데 정보를 제공해 줄 수 있는 마커의 개발이 필요하다. 본 발명은 방광암 환자의 성별에 기반하여, 방광암 환자의 예후 진단 및 방광암 환자의 치료 전략 결정에 도움을 주는 마커를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명의 일 양태는 ASS1 유전자의 돌연변이, DMXL1 유전자의 돌연변이, CCNQ 유전자의 돌연변이, MLNR 유전자의 돌연변이, ZNF711 유전자의 돌연변이 및 TEX11 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 방광암 환자의 성별 특이적 마커를 검출할 수 있는 시약을 포함하는 방광암의 예후 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 ASS1 유전자의 돌연변이, DMXL1 유전자의 돌연변이, CCNQ 유전자의 돌연변이, MLNR 유전자의 돌연변이, ZNF711 유전자의 돌연변이 및 TEX11 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 방광암 환자의 성별 특이적 마커를 검출할 수 있는 시약을 포함하는 방광암의 예후 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 방광암 환자의 샘플로부터 시료 DNA를 준비하는 단계; 및 상기 시료 DNA에 대해 상기 방광암의 예후 진단용 조성물 또는 상기 방광암의 예후 진단용 키트를 이용하여 성별 특이적 마커의 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 방광암 환자의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방광암의 예후 진단용 조성물 및 이를 포함하는 방광암의 예후 진단용 키트를 이용하여, 방광암 환자의 성별에 기반하여 치료 후 생존 가능성 또는 재발 가능성 등의 예후를 진단 및 예측할 수 있다. 이로써 방광암 환자의 치료 전략을 수립하는데 도움을 줄 수 있다.
도 1 내지 도 6은 본 발명의 일 구현예로서, 후보 유전자 제2군의 각각의 유전자에 대해서, 해당 유전자에 돌연변이가 있는 방광암 환자(적색)와 해당 유전자에 돌연변이가 없는 방광암 환자(청색)의 총 생존율 및/또는 무병 생존율의 그래프를 나타낸다.
본 명세서에 있어서, 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서 용어 '유전자' 및 이의 변형물은 폴리펩티드 사슬 생성에 관여한 DNA 조각을 포함하며; 이는 코딩 부위 이전 및 이후의 부위, 예를 들면 프로모터 및 3'-미번역 부위를 각각 포함할 뿐 아니라, 개별적인 코딩 단편(엑손) 사이의 개입 서열(인트론)을 포함한다.
본 발명에서 용어 '암'은 이상 세포의 조절되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환 부류의 임의의 일원을 포함한다. 상기 용어는, 악성, 양성, 연조직 또는 고형 중 어느 것으로 특징지어지든, 모든 알려진 암 및 신생물 상태, 및 전이 전/후의 암을 포함하는 모든 시기 및 등급의 암을 포함한다.
본 발명에서 용어 '예후'란 암과 같은 신생물 질환의 예를 들어 재발, 전이성 확산 및 약물 내성을 비롯한 암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 방광암의 예후를 예측하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 방광암 환자의 무병 생존율 또는 생존율을 예측하는 것이다.
본 발명에서 용어 '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로서, 본 발명의 목적상, 암의 발병 여부를 확인하는 것뿐만 아니라 암의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 바람직하게 본 발명의 유전자의 돌연변이를 이용하는 경우, 개체의 시료로부터 돌연변이 여부를 확인함으로써 해당 개체의 암의 발병 여부뿐만 아니라, 향후 해당 개체의 예후가 좋을 것인지 여부에 대해서까지 예측이 가능하다.
본 발명에서 용어 '성별 특이적 마커'는 방광암 환자의 성별에 기반하여 치료 후 해당 개체에서 방광암의 예후를 예측하는 지표가 될 수 있는 유전자의 돌연변이 또는 유전자의 돌연변이들을 의미할 수 있다. 또한, 본 발명에서 '마커 유전자'는 상기 성별 특이적 마커에 포함되는 각각의 유전자 돌연변이를 지칭하는 의미로 사용될 수 있다.
1. 방광암의 예후 진단용 조성물 및 키트
본 발명의 일 양태는 방광암 환자의 성별 특이적 마커를 검출할 수 있는 시약을 포함하는 방광암의 예후 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 방광암의 예후 진단용 조성물의 성별 특이적 마커는 방광암 환자의 성별에 따라, 치료 후 해당 개체에서 방광암의 예후를 예측하는 지표가 될 수 있다.
예를 들어, 상기 성별 특이적 마커가 확인되고 방광암 환자가 특정 성별(여성 또는 남성)에 해당되는 경우 상기 성별 특이적 마커가 확인되지 않은 사람보다 해당 개체의 생존율이 낮거나 재발율이 높다고 판단할 수 있다.
구체적으로, 상기 성별 특이적 마커는 ASS1 유전자(Gene bank accession number: NM_000050.4)의 돌연변이, DMXL1 유전자(Gene bank accession number: NM_001290321.2)의 돌연변이, CCNQ 유전자(Gene bank accession number: NM_152274.5)의 돌연변이, MLNR 유전자(Gene bank accession number: NM_001507.1)의 돌연변이, ZNF711 유전자(Gene bank accession number: NM_021998.5)의 돌연변이 및 TEX11 유전자(Gene bank accession number: NM_001003811.2)의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 성별 특이적 마커가 ASS1 유전자의 돌연변이, CCNQ 유전자의 돌연변이 및 MLNR 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 경우, 상기 성별 특이적 마커가 확인되지 않은 사람보다 생존율이 낮거나 재발율이 높다고 판단할 수 있다.
또한, 상기 성별 특이적 마커 중 DMXL1 유전자의 돌연변이, ZNF711 유전자의 돌연변이 및 TEX11 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 경우, 상기 성별 특이적 마커가 확인되지 않은 사람보다 생존율이 높거나 재발율이 낮다고 판단할 수 있다.
상기 유전자들의 약어의 전체 명칭은 각각 ASS1(argininosuccinate synthase 1), DMXL1(Dmx like 1), CCNQ(cyclin Q), MLNR(motilin receptor), ZNF711(zinc finger protein 711) 및 TEX11(testis expressed 11)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 성별 특이적 마커를 검출할 수 있는 시약은 상기 성별 특이적 마커에 대한 프라이머, 프로브, 항체 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 프라이머, 프로브, 항체 또는 앱타머는 공지된 기술을 이용하여 제작가능하며, 본 발명의 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 항체 또는 앱타머는 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서, 용어 '프라이머'는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충 용액 및 온도에서 중합 반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 상기 돌연변이 유전자의 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 해당 유전자 마커의 존재 유무를 판단하고 이를 진단에 활용할 수 있다. 예를 들면, 정방향 프라이머의 경우에 결손, 치환 또는 삽입이 일어난 돌연변이체에 해당하는 프라이머를 디자인하고, 역방향 프라이머는 돌연변이가 일어나지 않는 위치에 해당하는 프라이머를 디자인하여 PCR하면, 본 발명의 유전자의 돌연변이체인 경우에는 PCR에 의해 증폭 산물이 생성될 것이나, 본 발명의 유전자의 돌연변이체가 아닌 경우에는 증폭 산물이 생성되지 않을 것이다. PCR 조건, 정방향 및 역방향 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서, 용어 '프로브'란 DNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기로 이루어진다. 프로브는 라벨링되어 있어서 특정 DNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 유전자의 돌연변이와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 방광암의 재발 여부를 진단할 수 있다. 예를 들면, 결손, 치환 또는 삽입이 일어난 돌연변이체에 해당하는 프로브를 합성하고, 방광암 환자의 게놈 DNA와 상기 프로브를 혼성화하면, 본 발명의 유전자의 돌연변이체인 경우에는 혼성화가 일어날 것이나, 본 발명의 유전자의 돌연변이체가 아닌 경우에는 혼성화가 일어나지 않을 것이다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서, 용어 '항체'는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에서 상기 항체는 각 마커 유전자에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미할 수 있다. 이러한 항체는 각 마커 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 마커 유전자의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 명세서에서 용어, '앱타머'는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미한다. 앱타머는 공지된 화학적 방법으로 합성할 수 있으며, 예를 들어 SELEX(Systematic Evolution of Ligands of Exponential enrichment)라는 방법으로 원하는 다양한 목적 물질 (단백질, 당, 염색물질, DNA, 금속이온, 세포 등)에 대한 앱타머를 개발할 수 있다.
상기 유전자의 돌연변이는 임의의 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고, 예를 들면, 절단형(truncating) 돌연변이, 미스센스(missense) 돌연변이(또는 과오 돌연변이), 넌센스(nonsense) 돌연변이, 프레임시프트(frame shift) 돌연변이, 인프레임(in-frame) 돌연변이(또는 해독틀내 돌연변이), 스플라이스 돌연변이 및 스플라이스 사이트(splice_region) 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 가질 수 있다. 상기 프레임시프트 돌연변이는 프레임시프트 삽입(frame shift insert, FS ins) 돌연변이 및 프레임시프트 결실 돌연변이(frame shift delete, FS del) 중 적어도 하나일 수 있다. 상기 인-프레임 돌연변이는 인-프레임 삽입(in-frame insertion, IF ins) 돌연변이 및 인-프레임 결실(in-frame delete, IF del) 돌연변이 중 적어도 하나일 수 있다.
폴리펩티드 서열에서의 돌연변이와 관련하여 용어 "X#Y"는 본 기술 분야에서 자명하게 인식되는 것으로, 여기서 "#"은 폴리펩티드의 아미노산 번호와 관련하여 돌연변이 위치를 나타내고, "X"는 야생형 아미노산 서열의 그 위치에서 발견되는 아미노산을 나타내며, "Y"는 그 위치에서의 돌연변이체 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, ASS1 폴리펩티드와 관련하여 표기 "S6F"는 야생형 ASS1 서열의 아미노산 번호 6에는 세린이 존재하고, 세린이 돌연변이체 ASS1 서열에서 페닐알라닌으로 대체되었음을 나타낸다. 상기 유전자들의 돌연변이는 하기와 같다:
상기 ASS1 유전자의 돌연변이는 서열번호 1의 아미노산 서열에서, S6F인 미스센스 돌연변이 또는 L315F인 미스센스 돌연변이일 수 있다.
상기 DMXL1 유전자의 돌연변이는 서열번호 2의 아미노산 서열에서, S1273F인미스센스 돌연변이, R1548*인 넌센스 돌연변이, I116V인 미스센스 돌연변이, L2530F인 미스센스 돌연변이, H2555Y인 미스센스 돌연변이, E1623Q인 미스센스 돌연변이, P1302H인 미스센스 돌연변이, S916C인 미스센스 돌연변이, D1123H인 미스센스 돌연변이, D2937N인 미스센스 돌연변이, Q102E인 미스센스 돌연변이, G41E인 미스센스 돌연변이, S1108Y인 미스센스 돌연변이, E1797Q인 미스센스 돌연변이, S1804*인 넌센스 돌연변이, L2962V인 미스센스 돌연변이, Q2777*인 넌센스 돌연변이, R1693T인 미스센스 돌연변이, E1234K인 미스센스 돌연변이, S2166*인 넌센스 돌연변이, M3003I인 미스센스 돌연변이, G77Efs*36인 프레임시프트 결실 돌연변이, M1775I인 미스센스 돌연변이, H1138R인 미스센스 돌연변이, S1601C인 미스센스 돌연변이, G862V인 미스센스 돌연변이 또는 Q2605*인 넌센스 돌연변이일 수 있다. 넌센스 돌연변이에서 *는 해당 아미노산 위치에서의 아미노산 합성이 종료된 것을 나타낸다(이하에서는 설명을 생략함). 프레임시프트 돌연변이의 표기 방식은, 아미노산 종류(아미노산 위치)아미노산 종류fs*(아미노산 위치에서 하류 방향으로 정지 코돈까지의 뉴클레오티드 개수)이다(프레임시프트 삽입 돌연변이, 프레임시프트 결실 돌연변이 모두 동일한 표기 방식이며, 이하에서는 설명을 생략함).
상기 CCNQ 유전자의 돌연변이는 서열번호 3의 아미노산 서열에서, L198V인 미스센스 돌연변이 또는 N152K인 미스센스 돌연변이일 수 있다.
상기 MLNR 유전자의 돌연변이는 서열번호 4의 아미노산 서열에서, R282Q인 미스센스 돌연변이, M329I인 미스센스 돌연변이 또는 K360N인 미스센스 돌연변이일 수 있다.
상기 ZNF711 유전자의 돌연변이는 서열번호 5의 아미노산 서열에서, E316*인 넌센스 돌연변이, G260R인 미스센스 돌연변이, V87L인 미스센스 돌연변이, I186T인 미스센스 돌연변이 또는 D53Y인 미스센스 돌연변이일 수 있다.
상기 TEX11 유전자의 돌연변이는 서열번호 6의 아미노산 서열에서, E63*인 넌센스 돌연변이, S114L인 미스센스 돌연변이, A191T인 미스센스 돌연변이, V919L인 미스센스 돌연변이, E887K인 미스센스 돌연변이, D285N인 미스센스 돌연변이 또는 E504Q인 미스센스 돌연변이일 수 있다.
상기 유전자의 돌연변이를 이용하여 방광암의 예후를 진단하기 위한 분석 방법으로 차세대 염기서열분석법(next generation sequencing, NGS), RT-PCR, 직접 핵산 서열분석 방법, 마이크로 어레이가 사용될 수 있으며, 본 발명의 유전자의 돌연변이를 이용하여 돌연변이의 존재를 확인할 수 있는 방법이라면 제한없이 적용할 수 있다. 일 구현예에서, 돌연변이의 존재는 엄격한 조건 하에 각 유전자의 돌연변이의 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 항-(각 유전자의 돌연변이) 항체 또는 핵산 프로브를 사용하여 결정된다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 핵산 프로브는 검출가능하게 표지된다. 또 다른 구현예에서, 표지는 면역형광 표지, 화학발광 표지, 인광 표지, 효소 표지, 방사성 표지, 아비딘/비오틴, 콜로이드성 금 입자, 착색 입자 및 자기 입자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이의 존재는 방사성면역 검정, 웨스턴블롯 검정, 면역형광 검정, 효소면역 검정, 면역침전 검정, 화학발광 검정, 면역조직화학 검정, 도트 블롯 검정, 슬롯 블롯 검정 또는 유동 세포측정 검정에 의해 결정된다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이의 존재는 RT-PCR에 의해 결정된다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이의 존재는 핵산 서열분석에 의해 결정된다.
본 발명에서 용어 '폴리뉴클레오티드'는 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 RNA, 단일-가닥 또는 보다 전형적으로는 이중-가닥일 수도 있거나 또는 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유로 인해 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA는 본원에서 의도된 용어와 같은 '폴리뉴클레오티드'이다. 또한, 이노신과 같은 비통상적 염기 또는 삼중수소화 염기와 같은 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA가 본원에 정의된 바와 같은 용어 '폴리뉴클레오티드'에 포함된다. 일반적으로, 용어 '폴리뉴클레오티드'는 비변형된 폴리뉴클레오티드의 모든 화학적으로, 효소적으로 및/또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 시험관내 재조합 DNA-매개 기술을 비롯한 다양한 방법에 의해, 그리고 세포 및 유기체 내의 DNA의 발현에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 ASS1 유전자의 돌연변이, DMXL1 유전자의 돌연변이, CCNQ 유전자의 돌연변이, MLNR 유전자의 돌연변이, ZNF711 유전자의 돌연변이 및 TEX11 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 방광암 환자의 성별 특이적 마커를 검출할 수 있는 시약을 포함하는 방광암의 예후 진단용 키트를 제공한다.
예를 들어, 상기 성별 특이적 마커가 ASS1 유전자의 돌연변이, CCNQ 유전자의 돌연변이 및 MLNR 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 경우, 상기 성별 특이적 마커가 확인되지 않은 사람보다 생존율이 낮거나 재발율이 높다고 판단할 수 있다.
또한, 상기 성별 특이적 마커 중 DMXL1 유전자의 돌연변이, ZNF711 유전자의 돌연변이 및 TEX11 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 경우, 상기 성별 특이적 마커가 확인되지 않은 사람보다 생존율이 높거나 재발율이 낮다고 판단할 수 있다.
상기 성별 특이적 마커를 검출할 수 있는 시약은 프라이머, 프로브, 항체 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으며, 구체적인 내용은 상술한 바와 같으므로 구체적인 설명을 생략한다.
본 발명의 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 일 예로서, 본 발명의 상기 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 RT-PCR 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는, 상기 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 예로서, 본 발명의 DNA 칩 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 상기 DNA 칩 키트는, 마커 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또다른 예로서, 본 발명의 키트는 상기 마커 유전자로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 키트로서, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 시약으로서 버퍼, 지시약, 또는 그 조합을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방광암의 예후 진단용 키트는 기존의 일반적인 유전자의 돌연변이 검색 방법에 비하여 시간과 비용이 절감되어 매우 경제적이다. SSCP(Single Strand Conformational Polymorphism), PTT(Protein Truncation Test), 클로닝(cloning), 직접 염기서열 분석(direct sequencing) 등과 같은 기존의 유전자 돌연변이 검색 방법을 이용하여 한 유전자를 모두 검사하려면 평균적으로 수 일 내지 수개월이 소요된다. 또한, 차세대 염기서열분석법(next generation sequencing: NGS)을 통해서도 빠르고 간단하게 유전자 돌연변이를 정밀하게 검사할 수 있다. 돌연변이를 SSCP, 클로닝, 직접 염기 서열 분석, RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 등의 기존 분석방법에 의해 검사하는 경우 검사 완료까지 약 한달 가량이 소요되는 반면, 본 발명의 키트를 이용하면 시료 DNA가 준비되어 있을 경우 약 10 내지 11시간 내에 결과를 얻을 수 있고, 칩 하나에 돌연변이를 검출할 수 있는 프라이머 세트가 함께 집적되어 있기 때문에 기존의 방법에 비해 시간뿐만 아니라 비용까지 절감할 수 있다. 기존의 방법에 비해 매 실험 당 평균 절반 이하의 시약비가 소모되므로 연구자의 인건비까지 감안하였을 때 더욱 큰 비용의 절감 효과를 기대할 수 있게 된다.
2. 방광암의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법
본 발명의 또다른 양태는 방광암 환자의 샘플로부터 시료 DNA를 준비하는 단계; 상기 시료 DNA를 상기 방광암의 예후 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 성별 특이적 마커의 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 방광암 환자의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 방광암 환자의 샘플로부터 준비한 시료 DNA를 상기 방광암의 예후 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 증폭하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 '방광암의 예후 진단용 조성물 및 키트'에 대한 설명은 ' 1.방광암의 예후 진단용 조성물 및 키트 '에 기재한 바와 동일하므로 구체적인 설명을 생략한다.
용어 '환자'는 통상 인간을 포함할 뿐 아니라 다른 동물, 예를 들어 다른 영장류, 설치류, 개, 고양이, 말, 양, 돼지 등을 포함할 수 있다.
용어 '샘플'은 암 또는 종양이 이미 발생하였거나 발생할 것으로 예상되는 개체 또는 조직의 시료로써, 그 예후를 진단하고자 하는 대상 시료를 의미한다. 구체적으로, 방광암을 갖는 환자로부터 수득한 동결 조직으로부터 제조된 종양 용해물 또는 추출물을 의미할 수 있다.
용어 '개체'는 방광암으로 판정되거나 의심되는 대상을 포함한다.
상기 방법은 방광암 환자의 총 생존율 또는 무병 생존율을 예측할 수 있다.
본 발명에서 용어 '총 생존율(overall survival, OS)'은 질환, 예컨대 암으로 진단되거나 그에 대해 치료된 후 한정된 시간 동안 살아 있는 환자를 기재하는 임상적 종점을 포함하며, 암의 재발 여부에 관계없이 생존하는 가능성을 의미한다.
본 발명에서 용어 '무병 생존율(disease-free survival, DFS)'은 특정 질환(예를 들어 암)에 대한 치료 후 암의 재발 없이 환자가 생존하는 기간을 포함한다.
본 발명은 방광암 환자의 샘플에서 본 발명의 유전자의 돌연변이의 존재를 확인함으로써 대상 시료를 가진 개체가 암에 대해 어떤 예후를 가지는지 예측할 수 있다. 또한 이러한 방법은 예후가 좋다고 알려진 돌연변이가 존재하지 않는 대조군의 개체의 총 생존율 또는 무병 생존율을 비교함으로써 달성될 수 있다. 본 발명에서 예후가 좋다고 알려진 개체란 암이 발병한 후에 전이, 재발, 사망 등의 이력이 없는 개체를 의미한다.
상기 성별 특이적 마커는 ASS1 유전자의 돌연변이, DMXL1 유전자의 돌연변이, CCNQ 유전자의 돌연변이, MLNR 유전자의 돌연변이, ZNF711 유전자의 돌연변이 및 TEX11 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다.
상기 방광암 환자의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법은 방광암 환자의 총 생존율 또는 무병 생존율을 예측할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 상기 성별 특이적 마커가 확인되고 방광암 환자가 특정 성별(여성 또는 남성)인 경우, 상기 성별 특이적 마커가 확인되지 않은 사람보다 생존율이 낮다고 판단하는 단계;를 포함할 수 있다. 또는 그 반대의 경우도 가능하다.
또한, 상기 방법은 상기 성별 특이적 마커가 확인되고 방광암 환자가 특정 성별(여성 또는 남성)인 경우, 상기 성별 특이적 마커가 확인되지 않은 사람보다 방광암의 재발율이 높다고 판단하는 단계;를 포함할 수 있다. 또는 그 반대의 경우도 가능하다.
예를 들어, 상기 성별 특이적 마커로서 ASS1 유전자의 돌연변이, CCNQ 유전자의 돌연변이 및 MLNR 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 확인되는 경우, 상기 성별 특이적 마커가 확인되지 않은 사람보다 생존율이 낮거나 재발율이 높다고 판단할 수 있다.
또한, 상기 성별 특이적 마커로서 DMXL1 유전자의 돌연변이, ZNF711 유전자의 돌연변이 및 TEX11 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 확인되는 경우, 상기 성별 특이적 마커가 확인되지 않은 사람보다 생존율이 높거나 재발율이 낮다고 판단할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 유전자의 돌연변이인 ASS1, DMXL1, CCNQ, MLNR. ZNF711 및 TEX11로 구성된 유전자 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 돌연변이를 이용하여 방광암 환자의 성별에 따라 방광암의 생존 가능성 또는 재발 가능성 등의 예후를 진단할 수 있다는 내용에 대해서는 아직까지 밝혀진 바 없다. 또한, 각 유전자에서 총 생존율 또는 무병 생존율이 상이할 수 있는 점에 대해서도 보고된 바 없다. 본 발명자들은 상기 유전자들의 돌연변이를 방광암 환자의 성별에 따라 치료 효과의 차이를 예측하거나, 방광암 환자의 예후를 진단할 수 있는 진단 표지자로 사용할 수 있는 점을 최초로 규명하였다.
본 발명의 방광암 환자의 치료 효과의 차이를 예측하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법은 방광암의 유전자 돌연변이를 진단하거나, 방광암 환자의 생존율을 높이거나, 또는 재발율을 낮추는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방광암 환자의 예후 진단에 대한 방법을 통해, 방광암의 유전자의 돌연변이 발생 정보를 이용해 방광암의 환자의 성별에 따라 치료 효과를 예측하거나, 방광암 환자의 생존율 또는 재발율을 예측할 수 있으므로, 각 환자에 적합한 치료제 발굴뿐만 아니라, 치료법 선택에 있어 정보를 제공할 수 있어, 방광암에 관한 치료적 전략을 효율적으로 설계할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
유전 정보 및 임상 정보의 확보
방광암 환자의 성별에 따라, 환자의 치료 후 예후를 진단할 수 있는 성별 특이적 마커를 도출하기 위하여, TCGA(The Cancer Genome Atlas)로부터 유전 정보와 임상 정보가 모두 확보되어 있는 방광암 환자 411명의 재발, 전이, 사망, 관측 시간 등에 관한 데이터를 입수하여 분석에 이용하였다.
환자수 비율(%)
성별 남 303 73.7
여 108 26.3
생존 O 230 56.0
X 181 44.0
합계 411 100
성별과 연관성 있는 유전자의 선별
상기 데이터 중에서 성별을 확인할 수 있는 411개 데이터에 대하여 성별에 따라, 남성(M0)/여성(M1)의 두 그룹으로 나누고, 3가지 Feature Selection (Information Gain, Chi-Square, MR) 방법으로 기계학습을 시행하여, 성별과 관련성이 있는(gender related) 다음의 64개의 유전자를 도출하였다.
상기 분석결과 p값을 하기 표 2에 구체적으로 나타내며, 데이터 해석시 편의를 위하여, 후술하는 실시예 2에서 수행된 카플란 마이어 생존 분석법에 따른 총 생존여부(Overall Survival) 및 무병 생존여부(Disease Free Survival)의 p값을 함께 나타낸다.
돌연변이수 돌연변이(%) 사이토밴드 돌연변이 유형 성별 패셔 검정(p값) 총 생존여부(p값) 무병 생존여부(p값)
절단 미스센스 인프레임 M F M/F 비율
ASS1 2 0.5% 9q34.11 0 2 0 0 0 0 0.069 0.00967 0.00568
BHLHB9 3 0.7% Xq22.1 0 3 0 0 0 0 0.018 0.852 0.308
CEP57 5 1.2% 11q21 0 5 0 0 1 0.25 0.02 0.552 0.59
COL20A1 3 0.7% 20q13.33 1 2 0 0 1 0.5 0.17 0.951 0.902
COMMD9 5 1.2% 11p13 0 5 0 0 2 0.7 0.116 0.939 0.429
CRELD2 1 0.2% 22q13.33 0 1 0 0 0 0 0.263 0.479 0.469
DMXL1 27 6.6% 5q23.1 6 21 0 0 27 1 0.000 0.0235 0.362
FAIM3 4 1.0% 1q32.1 1 3 0 0 0 0 0.005 0.154 0.113
CCNQ 2 0.5% Xq28 0 2 0 0 0 0 0.069 0.0119 0.00297
GDPD2 6 1.5% Xq13.1 1 5 0 0 0 0 0.001 0.294 0.1
GSTK1 4 1.0% 7q34 1 3 0 0 1 0.3 0.057 0.509 0.761
LAMP3 4 1.0% 3q27.1 1 3 0 0 1 0.3 0.057 0.208 0.471
MLNR 3 0.7% 13q14.2 0 3 0 0 0 0 0.018 0.00175 0.737
NLGN3 6 1.5% Xq13.1 0 6 0 0 0 0 0.000 0.792 0.344
NR1H4 4 1.0% 12q23.1 1 3 0 0 0 0 0.005 0.194 0.185
NRK 6 1.5% Xq22.3 2 4 0 0 1 0.2 0.006 0.675 0.86
OPHN1 8 1.9% Xq12 1 7 0 0 2 0.3 0.005 0.201 0.266
PARD3 25 6.1% 10p11.22-p11.21 10 15 0 0 24 24 0.008 0.652 0.0971
PCSK1 6 1.5% 5q15 0 6 0 0 1 0.2 0.006 0.0653 0.713
PPP3R2 2 0.5% 9q31.1 0 2 0 0 0 0 0.069 0.992 0.347
PROKR1 2 0.5% 2p13.3 0 2 0 0 0 0 0.069 0.912 0.947
RBAK 15 3.6% 7p22.1 0 15 0 0 5 0.5 0.001 0.969 0.335
RBMS3 5 1.2% 3p24.1 2 3 0 0 1 0.25 0.018 0.908 0.885
RFC4 9 2.2% 3q27.3 0 9 0 0 3 0.5 0.012 0.818 0.714
SEMA4G 6 1.5% 10q24.31 0 6 0 0 1 0.25 0.018 0.925 0.712
TCTN1 2 0.5% 12q24.11 0 2 0 0 0 0 0.069 0.3 0.948
ZNF205 5 1.2% 16p13.3 0 5 0 0 0 0 0.001 0.548 0.608
ZNF362 2 0.5% 1p35.1 0 2 0 0 0 0 0.069 0.981 0.999
ZNF711 5 1.2% Xq21.1 1 4 0 0 3 1.5 0.61 0.0377 0.127
BCOR 13 3.2% Xp11.4 0 13 0 0 4 0.4 0.001 0.0651 0.439
C2orf80 2 0.5% 2q33.3 0 2 0 0 0 0 0.069 0.284 0.897
CACNA1G 17 4.1% 17q21.33 1 16 0 0 17 1 0.009 0.168 0.136
CBX4 7 1.7% 17q25.3 1 6 0 0 5 5 1.000 0.577 0.288
CD274 6 1.5% 9p24.1 1 5 0 0 2 0.5 0.440 0.344 0.765
CKAP2 3 0.7% 13q14.3 0 3 0 0 1 0.5 0.170 0.967 0.213
CPA5 3 0.7% 7q32.2 0 3 0 0 1 0.5 0.170 0.863 0.278
F8 24 5.8% Xq28 2 22 0 0 9 0.6 0.000 0.284 0.264
FLG2 32 7.8% 1q21.3 5 27 0 0 30 15 0.060 0.684 0.89
GIMAP6 7 1.7% 7q36.1 2 5 0 0 2 0.4 0.015 0.251 0.0848
HCN1 24 5.8% 5p12 4 20 0 0 14 1.4 0.094 0.139 0.452
IFRD1 6 1.5% 7q31.1 3 3 0 0 3 1 0.189 0.489 0.907
IL27RA 5 1.2% 19p13.12 2 3 0 0 2 0.7 0.116 0.731 0.779
IRF4 3 0.7% 6p25.3 0 3 0 0 0 0 0.018 0.979 0.318
ISYNA1 2 0.5% 19p13.11 0 2 0 0 0 0 0.069 0.436 0.431
KRT27 5 1.2% 17q21.2 1 4 0 0 2 0.7 0.116 0.314 0.581
LAMA4 24 5.8% 6q21 3 21 0 0 13 0.18 0.032 0.979 0.586
MED12 24 5.8% Xq13.1 1 22 1 0 15 0.7 0.232 0.556 0.318
NLRP4 13 3.2% 19q13.43 0 13 0 0 13 1 0.025 0.333 0.0675
NLRP7 17 4.1% 19q13.42 0 14 1 2 15 7.5 0.259 0.508 0.915
PPP1R21 5 1.2% 2p16.3 0 5 0 0 1 0.25 0.018 0.0916 0.333
PPP1R9A 10 2.4% 7q21.3 3 7 0 0 4 0.7 0.024 0.974 0.263
PSMC6 10 2.4% 14q22.1 1 8 0 1 4 0.7 0.024 0.186 0.724
RIMKLA 3 0.7% 1p34.2 1 2 0 0 1 0.5 0.170 0.281 0.749
SACS 44 10.7% 13q12.12 2 41 1 0 39 7.8 0.018 0.933 0.333
SH2D1B 3 0.7% 1q23.3 1 2 0 0 1 0.5 0.170 0.212 0.138
SLC35G6 2 0.5% 17p13.1 1 1 0 0 1 1 0.457 0.597 0.623
SMC4 17 4.1% 3q25.33 2 15 0 0 16 16 0.037 0.689 0.156
SNRPD1 1 0.2% 18q11.2 0 1 0 0 0 0 0.263 0.337 0.347
SUPT16H 17 4.1% 14q11.2 2 14 1 0 17 1 0.009 0.706 0.608
TERF2 5 1.2% 16q22.1 0 4 0 1 0 0 0.001 0.395 0.469
TEX11 7 1.7% Xq13.1 1 6 0 0 2 0.4 0.015 0.0884 0.0372
THOC2 9 2.2% Xq25 1 8 0 0 2 0.3 0.002 0.66 0.606
TRMT10C 5 1.2% 3q12.3 1 4 0 0 1 0.25 0.018 0.311 0.334
ZNF157 3 0.7% Xp11.3 0 3 0 0 0 0 0.018 0.183 0.181
상기 표 2의 64개 유전자 중에서 피셔의 정확 검정(Fisher's exact test)의 p값이 0.05 이상인 29개의 유전자는 성별과 관련성은 있으나 연관성은 낮다고 판단된다. 또한, p값이 0.05 미만인 다음의 35개의 유전자(후보 유전자 제1군)는 성별 연관성이 높은 유전자로 여겨진다.
후보 유전자 제1군: BHLHB9, CEP57, DMXL1, FAIM3, GDPD2, MLNR, NLGN3, NR1H4, NRK, OPHN1, PARD3, PCSK1, RBAK, RBMS3, RFC4, SEMA4G, ZNF205, BCOR, CACNA1G, F8, GIMAP6, IRF4, LAMA4, NLRP4, PPP1R21, PPP1R9A, PSMC6, SACS, SMC4, SUPT16H, TERF2, TEX11, THOC2, TRMT10C, ZNF157.
예후 예측용 성별 특이적 마커의 선별 및 검토
예후 예측용 성별 특이적 마커로서 활용 가능성을 확인하기 위하여, 이들 유전자에 대해 상기 411명의 대상 환자 데이터에 대해 비교 분석을 실시하였으며, 결측값, 특이값 등은 제외되었다.
상기 환자들의 임상 정보(사건(사망 또는 재발) 여부, 관측 시간)을 토대로 SPSS를 이용한 카플란 마이어 생존 분석법으로 총 생존 기간(Overall Survival) 또는 무병 생존 기간(Disease-free Survival)을 계산하였다. 총 생존 기간에서는 사건을 사망으로 정하고, 무병 생존 기간에서는 사건을 방광암의 재발로 정하였다. 상기 유전자들 각각에서의 돌연변이 발생이 방광암에 의한 사망 또는 방광암의 재발과 상호 관련성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 카플란 마이어 생존 분석법에서 얻어진 각 군의 사건 시간(event time)을 토대로 돌연변이 발생과 총 생존 기간의 연관성, 및 돌연변이 발생과 무병 생존 기간의 연관성을 로그순위 검정(log rank test)에 의해 확인하였다. 0.05 미만의 p값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험군은 본 발명의 유전자들에 돌연변이가 있는 경우(case with alterations in query gene)로 하였고, 대조군으로는 본 발명의 유전자들에 돌연변이가 없는 경우(case without alterations in query gene)로 하였다. 생존 기간 중앙값(median months survival)은 해당 군의 환자들의 생존 기간을 나열하였을 때 중앙에 위치하는 값을 의미한다. 카플란 마이어 생존 분석법에 의한 생존 곡선에서의 경사도는 생존 기간에 의해 결정된다.
상기 분석 결과, 총 생존여부 또는 무병 생존여부의 p값이 0.05 미만인 다음의 6개의 유전자(후보 유전자 제2군)는 생존율 또는 재발율과 연관성이 높은 유전자로 여겨지며, 구체적으로 해당 유전자의 돌연변이가 있는 경우 생존율이 낮거나 재발율이 높다고 판단된다.
후보 유전자 제2군: ASS1, DMXL1, CCNQ, MLNR, ZNF711, TEX11.
특히, 상기 후보 유전자 제1군과 상기 후보 유전자 제2군에 중복적으로 포함되는 다음의 2개의 유전자(후보 유전자 제1군&제2군)의 경우, 해당 유전자에 돌연변이가 있고 대상체가 특정 성별(여성 또는 남성)에 해당되면, 생존율이 낮거나 재발율이 높다고 판단될 수 있다. 따라서, 해당되는 3개의 유전자의 경우 예후를 예측할 수 있는 성별 특이적 마커로서 활용 가능성이 높다고 생각된다.
후보 유전자 제1군&제2군: DMXL1, MLNR, TEX11.
한편, 상기 후보 유전자 제2군 중에서, 다음의 3개의 유전자는 성별과 관련성이 있으면서(gender related), 해당 유전자에 돌연변이가 있는 경우 방광암 재발율이 높거나 무병 생존 기간이 짧았다. 이들을 후보 유전자 제3군으로 정한다.
후보 유전자 제3군: ASS1, CCNQ, ZNF711.
또한, 상기 후보 유전자 제2군 중에서 다음의 2개의 유전자에 돌연변이가 있는 경우, 생존율이 낮을 뿐 아니라 방광암 재발율이 높거나 무병 생존 기간이 짧았다. 이들을 후보 유전자 제4군으로 정한다.
후보 유전자 제4군: ASS1, CCNQ.
도 1 내지 도 6은 상기 후보 유전자 제2군의 각각의 유전자에 대해서, 해당 유전자에 돌연변이가 있는 방광암 환자(적색)와 해당 유전자에 돌연변이가 없는 방광암 환자(청색)의 총 생존율 및/또는 무병 생존율의 그래프를 나타낸다.
돌연변이 위치 정보를 이용한 마커 유전자의 검출
상기 후보 유전자 제2군의 유전자의 돌연변이 위치 정보를 하기에 나타낸다.
Gene AA change Type Copy # COSMIC Chr Start Pos End Pos HGVSc
ASS1 S6F Missense diploid 1 chr9 133327632 133327632 ENST00000352480.5:c.17C>T
L315F Missense diploid 1 chr9 133364826 133364826 ENST00000352480.5:c.945G>C
DMXL1 S1273F Missense diploid 1 chr5 118485340 118485340 ENST00000311085.8:c.3818C>T
R1548* Nonsense diploid 1 chr5 118487671 118487671 ENST00000311085.8:c.4642C>T
I116V Missense gain 2 chr5 118440935 118440935 ENST00000311085.8:c.346A>G
L2530F Missense diploid 2 chr5 118533494 118533494 ENST00000311085.8:c.7588C>T
H2555Y Missense diploid 1 chr5 118533569 118533569 ENST00000311085.8:c.7663C>T
E1623Q Missense diploid 2 chr5 118500366 118500366 ENST00000311085.8:c.4867G>C
P1302H Missense shallowdel 1 chr5 118485427 118485427 ENST00000311085.8:c.3905C>A
S916C Missense gain 　 chr5 118483001 118483001 ENST00000311085.8:c.2747C>G
D1123H Missense gain 　 chr5 118484889 118484889 ENST00000311085.8:c.3367G>C
D2937N Missense diploid 1 chr5 118580221 118580221 ENST00000311085.8:c.8809G>A
Q102E Missense diploid 　 chr5 118440893 118440893 ENST00000311085.8:c.304C>G
G41E Missense diploid 　 chr5 118433708 118433708 ENST00000311085.8:c.122G>A
S1108Y Missense diploid 　 chr5 118484845 118484845 ENST00000311085.8:c.3323C>A
E1797Q Missense shallowdel 　 chr5 118503550 118503550 ENST00000311085.8:c.5389G>C
S1804* Nonsense amp 　 chr5 118505897 118505897 ENST00000311085.8:c.5411C>G
L2962V Missense shallowdel 　 chr5 118582714 118582714 ENST00000311085.8:c.8884C>G
Q2777* Nonsense diploid 　 chr5 118569088 118569088 ENST00000311085.8:c.8329C>T
R1693T Missense shallowdel 　 chr5 118502418 118502418 ENST00000311085.8:c.5078G>C
E1234K Missense shallowdel 　 chr5 118485222 118485222 ENST00000311085.8:c.3700G>A
S2166* Nonsense deepdel 　 chr5 118507480 118507480 ENST00000311085.8:c.6497C>G
M3003I Missense diploid 　 chr5 118582839 118582839 ENST00000311085.8:c.9009G>A
G77Efs*36 Frame_Shift_Del diploid 　 chr5 118437645 118437645 ENST00000311085.8:c.230del
M1775I Missense shallowdel 1 chr5 118503486 118503486 ENST00000311085.8:c.5325G>C
H1138R Missense diploid 　 chr5 118484935 118484935 ENST00000311085.8:c.3413A>G
S1601C Missense shallowdel 　 chr5 118500301 118500301 ENST00000311085.8:c.4802C>G
G862V Missense diploid 　 chr5 118482547 118482547 ENST00000311085.8:c.2585G>T
Q2605* Nonsense shallowdel 　 chr5 118539081 118539081 ENST00000311085.8:c.7813C>T
CCNQ L198V Missense diploid 　 chrX 152858023 152858023 ENST00000406277.2:c.592C>G
N152K Missense diploid 　 chrX 152858159 152858159 ENST00000406277.2:c.456C>A
MLNR R282Q Missense gain 1 chr13 49795318 49795318 ENST00000218721.1:c.845G>A
M329I Missense shallowdel 1 chr13 49796261 49796261 ENST00000218721.1:c.987G>C
K360N Missense shallowdel 　 chr13 49796354 49796354 ENST00000218721.1:c.1080G>C
TEX11 E63* Nonsense shallowdel 　 X 70099855 70099855 ENST00000344304.3:c.187G>T
S114L Missense diploid 　 X 70080735 70080735 ENST00000344304.3:c.341C>T
A191T Missense diploid 　 X 70053443 70053443 ENST00000344304.3:c.571G>A
V919L Missense diploid 　 X 69749013 69749013 ENST00000344304.3:c.2755G>T
E887K Missense diploid 　 X 69749756 69749756 ENST00000344304.3:c.2659G>A
D285N Missense diploid 　 X 69960586 69960586 ENST00000344304.3:c.853G>A
E504Q Missense shallowdel 　 X 69871318 69871318 ENST00000344304.3:c.1510G>C
ZNF711 E316* Nonsense shallowdel 　 X 84523329 84523329 ENST00000276123.3:c.946G>T
G260R Missense diploid 　 X 84519436 84519436 ENST00000276123.3:c.778G>C
V87L Missense diploid 　 X 84510444 84510444 ENST00000276123.3:c.259G>T
I186T Missense gain 　 X 84510742 84510742 ENST00000276123.3:c.557T>C
D53Y Missense diploid 　 X 84510342 84510342 ENST00000276123.3:c.157G>T
상기 돌연변이 위치 정보를 토대로, 상기 마커 유전자를 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 항체 또는 앱타머를 이용한 마이크로 칩의 제작이 가능하며, 구체적인 방법은 통상의 기술에 따를 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition And Kit For Diagnosing Prognosis Of Bladder Cancer According To Gender <130> 2019-DPA-3369 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 412 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Ser Lys Gly Ser Val Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp 1 5 10 15 Thr Ser Cys Ile Leu Val Trp Leu Lys Glu Gln Gly Tyr Asp Val Ile 20 25 30 Ala Tyr Leu Ala Asn Ile Gly Gln Lys Glu Asp Phe Glu Glu Ala Arg 35 40 45 Lys Lys Ala Leu Lys Leu Gly Ala Lys Lys Val Phe Ile Glu Asp Val 50 55 60 Ser Arg Glu Phe Val Glu Glu Phe Ile Trp Pro Ala Ile Gln Ser Ser 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ala Arg Pro 85 90 95 Cys Ile Ala Arg Lys Gln Val Glu Ile Ala Gln Arg Glu Gly Ala Lys 100 105 110 Tyr Val Ser His Gly Ala Thr Gly Lys Gly Asn Asp Gln Val Arg Phe 115 120 125 Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Leu Ala Pro Gln Ile Lys Val Ile Ala Pro 130 135 140 Trp Arg Met Pro Glu Phe Tyr Asn Arg Phe Lys Gly Arg Asn Asp Leu 145 150 155 160 Met Glu Tyr Ala Lys Gln His Gly Ile Pro Ile Pro Val Thr Pro Lys 165 170 175 Asn Pro Trp Ser Met Asp Glu Asn Leu Met His Ile Ser Tyr Glu Ala 180 185 190 Gly Ile Leu Glu Asn Pro Lys Asn Gln Ala Pro Pro Gly Leu Tyr Thr 195 200 205 Lys Thr Gln Asp Pro Ala Lys Ala Pro Asn Thr Pro Asp Ile Leu Glu 210 215 220 Ile Glu Phe Lys Lys Gly Val Pro Val Lys Val Thr Asn Val Lys Asp 225 230 235 240 Gly Thr Thr His Gln Thr Ser Leu Glu Leu Phe Met Tyr Leu Asn Glu 245 250 255 Val Ala Gly Lys His Gly Val Gly Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn Arg 260 265 270 Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg Gly Ile Tyr Glu Thr Pro Ala Gly Thr 275 280 285 Ile Leu Tyr His Ala His Leu Asp Ile Glu Ala Phe Thr Met Asp Arg 290 295 300 Glu Val Arg Lys Ile Lys Gln Gly Leu Gly Leu Lys Phe Ala Glu Leu 305 310 315 320 Val Tyr Thr Gly Phe Trp His Ser Pro Glu Cys Glu Phe Val Arg His 325 330 335 Cys Ile Ala Lys Ser Gln Glu Arg Val Glu Gly Lys Val Gln Val Ser 340 345 350 Val Leu Lys Gly Gln Val Tyr Ile Leu Gly Arg Glu Ser Pro Leu Ser 355 360 365 Leu Tyr Asn Glu Glu Leu Val Ser Met Asn Val Gln Gly Asp Tyr Glu 370 375 380 Pro Thr Asp Ala Thr Gly Phe Ile Asn Ile Asn Ser Leu Arg Leu Lys 385 390 395 400 Glu Tyr His Arg Leu Gln Ser Lys Val Thr Ala Lys 405 410 <210> 2 <211> 3048 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asn Leu His Gln Val Leu Thr Gly Ala Val Asn Pro Gly Asp His 1 5 10 15 Cys Phe Ser Val Gly Ser Ile Gly Asp Gln Arg Phe Thr Ala Tyr Ala 20 25 30 Ser Gly Cys Asp Ile Val Ile Leu Gly Ser Asp Phe Glu Arg Leu Gln 35 40 45 Ile Ile Pro Gly Ala Lys His Gly Asn Ile Gln Val Gly Cys Val Asp 50 55 60 Cys Ser Met Gln Gln Gly Lys Ile Ala Ala Ser Tyr Gly Asn Val Ile 65 70 75 80 Ser Ile Phe Glu Pro Val Asn Leu Pro Lys Gln Lys Lys Asn Leu Glu 85 90 95 Leu Tyr Ser Gln Trp Gln Lys Ser Gly Gln Phe Phe Leu Glu Ser Ile 100 105 110 Ala His Asn Ile Thr Trp Asp Pro Thr Gly Ser Arg Leu Leu Thr Gly 115 120 125 Ser Ser Tyr Leu Gln Leu Trp Ser Asn Thr Asn Leu Glu Lys Pro Thr 130 135 140 Glu Asp Glu Asn Leu Asn Lys Thr Asp Leu Asn Phe Gly Asp Trp Lys 145 150 155 160 Cys Ile Trp His Cys Lys Thr Ala Ser Gln Val His Leu Met Lys Phe 165 170 175 Ser Pro Asp Gly Glu Phe Phe Ala Thr Ala Gly Lys Asp Asp Cys Leu 180 185 190 Leu Lys Val Trp Tyr Asn Val Glu Asn Trp Arg Thr Ala Val Thr Ser 195 200 205 Pro Asp Gly Ser Ser Glu Lys Gln Ser Gln Gly Glu Ile Asp Phe Ser 210 215 220 Phe Val Tyr Leu Ala His Pro Arg Ala Val Asn Gly Phe Ser Trp Arg 225 230 235 240 Lys Thr Ser Lys Tyr Met Pro Arg Ala Ser Val Cys Asn Val Leu Leu 245 250 255 Thr Cys Cys Lys Asp Asn Val Cys Arg Leu Trp Val Glu Thr Phe Leu 260 265 270 Pro Asn Asp Cys Leu Leu Tyr Gly Gly Asp Cys Ser His Trp Thr Glu 275 280 285 Ser Ile Asn Leu Thr Asn Asn Phe Lys Arg Asn Ala Ser Ser Lys Glu 290 295 300 Arg Val Gln Asn Ala Leu Glu Val Asn Leu Arg His Phe Arg Arg Gly 305 310 315 320 Arg Arg Arg Ser Leu Ala Leu Val Ala His Thr Gly Tyr Leu Pro His 325 330 335 Gln Gln Asp Pro His His Val His Arg Asn Thr Pro Leu His Ala Asn 340 345 350 Ala Leu Cys His Phe His Ile Ala Ala Ser Ile Asn Pro Ala Thr Asp 355 360 365 Ile Pro Leu Leu Pro Ser Ile Thr Ser Leu Ser Leu Asn Glu Asn Glu 370 375 380 Glu Lys Thr Gly Pro Phe Val Val His Trp Leu Asn Asn Lys Glu Leu 385 390 395 400 His Phe Thr Leu Ser Met Glu Val Phe Leu Gln Gln Leu Arg Lys Ser 405 410 415 Phe Glu Gln Pro Ser Ser Glu Ala Ser Val Glu Asp Ser Asn Gln Ala 420 425 430 Asp Val Lys Ser Asp Glu Glu Thr Asp Asp Gly Val Asp Asp Leu Lys 435 440 445 Ile Asn Pro Glu Lys Lys Glu Leu Gly Cys Asp Lys Met Val Pro Asn 450 455 460 Ser Ser Phe Thr Ser Leu Ser Ser Ala Ala Ile Asp His Gln Ile Glu 465 470 475 480 Val Leu Leu Ser Glu Trp Ser Lys Asn Ala Asp Met Leu Phe Ser Ile 485 490 495 His Pro Met Asp Gly Ser Leu Leu Val Trp His Val Asp Trp Leu Asp 500 505 510 Glu Tyr Gln Pro Gly Met Phe Arg Gln Val Gln Val Ser Phe Val Ser 515 520 525 Arg Ile Pro Val Ala Phe Pro Thr Gly Asp Ala Asn Ser Leu Cys Lys 530 535 540 Ser Ile Met Met Tyr Ala Cys Thr Lys Asn Val Asp Leu Ala Ile Gln 545 550 555 560 Gln Gly Lys Gln Lys Pro Ser Gly Leu Thr Arg Ser Thr Ser Met Leu 565 570 575 Ile Ser Ser Gly His Asn Lys Ser Ser Asn Ser Leu Lys Leu Ser Ile 580 585 590 Phe Thr Pro Asn Val Met Met Ile Ser Lys His Ala Asp Gly Ser Leu 595 600 605 Asn Gln Trp Leu Val Ser Phe Ala Glu Glu Ser Ala Phe Ser Thr Val 610 615 620 Leu Ser Ile Ser His Lys Ser Arg Tyr Cys Gly His Arg Phe His Leu 625 630 635 640 Asn Asp Leu Ala Cys His Ser Val Leu Pro Leu Leu Leu Thr Thr Ser 645 650 655 His His Asn Ala Leu Arg Thr Pro Asp Val Asp Asn Pro Glu Gln Pro 660 665 670 Phe Asp Ala Leu Asn Ile Glu Glu Cys Ser Leu Thr Gln Gln Asn Lys 675 680 685 Ser Thr Val Asp Val Ala Phe Gln Asp Pro Ser Ala Val Tyr Ser Glu 690 695 700 Leu Ile Leu Trp Arg Val Asp Pro Val Gly Pro Leu Ser Phe Ser Gly 705 710 715 720 Gly Val Ser Glu Leu Ala Arg Ile Asn Ser Leu His Val Ser Ala Phe 725 730 735 Ser Asn Val Ala Trp Leu Pro Thr Leu Ile Pro Ser Tyr Cys Leu Gly 740 745 750 Ala Tyr Cys Asn Ser Pro Ser Ala Cys Phe Val Ala Ser Asp Gly Gln 755 760 765 Tyr Leu Arg Leu Tyr Glu Ala Val Ile Asp Ala Lys Lys Leu Leu Ser 770 775 780 Glu Leu Ser Asn Pro Glu Ile Ser Lys Tyr Val Gly Glu Val Phe Asn 785 790 795 800 Ile Val Ser Gln Gln Ser Thr Ala Arg Pro Gly Cys Ile Ile Ala Leu 805 810 815 Asp Pro Ile Thr Lys Leu His Gly Arg Lys Thr Gln Leu Leu His Val 820 825 830 Phe Glu Glu Asp Phe Ile Leu Asn Asn Leu Glu Lys Lys Ser Leu Gly 835 840 845 Lys Asp Ser Ile Leu Ser Asn Ala Gly Ser Ser Pro Asn Gly Phe Ser 850 855 860 Glu Lys Phe Tyr Leu Ile Val Ile Glu Cys Thr Gln Asp Asn Arg Ser 865 870 875 880 Leu Leu His Met Trp Asn Leu His Leu Lys Ser Ile Pro Val Ser Leu 885 890 895 Asp Glu Lys Val Asp Thr Lys Leu Ser Glu Ala Val Trp Gln Pro Glu 900 905 910 Glu His Tyr Ser Ser Ser Pro Glu Lys Ile Leu Ser Pro Phe Ser Gln 915 920 925 Lys Tyr Gln Ala Cys Arg Ala Asn Leu Gln Ser Thr Ser Arg Leu Thr 930 935 940 Leu Phe Ser Glu Met Val Tyr Ser Gln Glu Leu His Leu Pro Glu Gly 945 950 955 960 Val Glu Ile Ile Ser Ile Lys Pro Ser Ala Gly His Leu Ser Ser Ser 965 970 975 Ser Ile Tyr Pro Ala Cys Ser Ala Pro Tyr Leu 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Ser Thr Lys Val Val Pro Leu Ser Lys Phe Val Leu Leu 1185 1190 1195 1200 Arg Ser Val Asp Leu Val Ser Ser Val Asp Gly Ser Pro Pro Phe Pro 1205 1210 1215 Val Ser Leu Ser Trp Val Arg Asp Gly Ile Leu Val Val Gly Met Asp 1220 1225 1230 Cys Glu Met His Val Tyr Cys Gln Trp Gln Pro Ser Ser Lys Gln Glu 1235 1240 1245 Pro Val Ile Thr Asp Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Pro Ser Ile Thr Ser 1250 1255 1260 Leu Ile Lys Gln Ser Asn Ser Ser Ser Gly Leu His Pro Pro Lys Lys 1265 1270 1275 1280 Thr Leu Thr Arg Ser Met Thr Ser Leu Ala Gln Lys Ile Cys Gly Lys 1285 1290 1295 Lys Thr Ala Phe Asp Pro Ser Val Asp Met Glu Asp Ser Gly Leu Phe 1300 1305 1310 Glu Ala Ala His Val Leu Ser Pro Thr Leu Pro Gln Tyr His Pro Leu 1315 1320 1325 Gln Leu Leu Glu Leu Met Asp Leu Gly Lys Val Arg Arg Ala Lys Ala 1330 1335 1340 Ile Leu Ser His Leu Val Lys Cys Ile Ala Gly Glu Val Val Ala Leu 1345 1350 1355 1360 Asn Glu Ala Glu Ser Asn His Glu Arg Arg Leu Arg Ser Leu Thr Ile 1365 1370 1375 Ser Ala Ser Gly Ser Thr Thr Arg Asp Pro Gln Ala 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Ile Ala Met Glu Lys 770 775 780 Pro Ala His Tyr Pro Leu Ile Ala Leu Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu 785 790 795 800 Leu Leu Tyr Lys Lys Glu Glu Pro Ile Asp Ile Ser Gln Tyr Ser Lys 805 810 815 Cys Met His Asn Leu Val Asn Leu Ser Val Pro Asp Gly Ala Ser Asn 820 825 830 Val Glu Leu Cys Pro Leu Glu Glu Val Trp Gly Tyr Phe Glu Asp Ala 835 840 845 Leu Ser His Ile Ser Arg Thr Lys Asp Tyr Pro Glu Met Glu Ile Leu 850 855 860 Trp Leu Met Val Lys Ser Trp Asn Thr Gly Val Leu Met Phe Ser Arg 865 870 875 880 Ser Lys Tyr Ala Ser Ala Glu Lys Trp Cys Gly Leu Ala Leu Arg Phe 885 890 895 Leu Asn His Leu Thr Ser Phe Lys Glu Ser Tyr Glu Thr Gln Met Asn 900 905 910 Met Leu Tyr Ser Gln Leu Val Glu Ala Leu Ser Asn Asn Lys Gly Pro 915 920 925 Val Phe His Glu His Gly Tyr Trp Ser Lys Ser Asp 930 935 940

Claims (10)

  1. ASS1 유전자의 돌연변이, DMXL1 유전자의 돌연변이, CCNQ 유전자의 돌연변이, MLNR 유전자의 돌연변이, ZNF711 유전자의 돌연변이 및 TEX11 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 방광암 환자의 성별 특이적 마커를 검출할 수 있는 시약을 포함하는 성별에 따른 방광암의 예후 진단용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 시약은 프라이머, 프로브, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 성별 특이적 마커는 DMXL1 유전자의 돌연변이, MLNR 유전자의 돌연변이 및 TEX11 유전자의 돌연변이를 포함하는 조성물.
  4. ASS1 유전자의 돌연변이, DMXL1 유전자의 돌연변이, CCNQ 유전자의 돌연변이, MLNR 유전자의 돌연변이, ZNF711 유전자의 돌연변이 및 TEX11 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 방광암 환자의 성별 특이적 마커를 검출할 수 있는 시약을 포함하는 성별에 따른 방광암의 예후 진단용 키트.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 시약은 프라이머, 프로브, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 키트.
  6. 청구항 4에 있어서,
    상기 성별 특이적 마커는 DMXL1 유전자의 돌연변이, MLNR 유전자의 돌연변이및 TEX11 유전자의 돌연변이를 포함하는 키트.
  7. 방광암 환자의 샘플로부터 시료 DNA를 준비하는 단계;
    상기 시료 DNA에 대해 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 방광암의 예후 진단용 조성물 또는 청구항 4 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 방광암의 예후 진단용 키트를 이용하여 성별 특이적 마커의 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 방광암 환자의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 방광암 환자의 샘플로부터 준비한 시료 DNA를 증폭하는 단계를 더 포함하는 방법.
  9. 청구항 7에 있어서,
    상기 성별 특이적 마커 중 ASS1 유전자의 돌연변이, CCNQ 유전자의 돌연변이 및 MLNR 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 확인되는 경우, 상기 성별 특이적 마커가 확인되지 않은 사람보다 생존율이 낮거나 재발율이 높다고 판단하는 단계;를 더 포함하는 방법.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 성별 특이적 마커 중 DMXL1 유전자의 돌연변이, ZNF711 유전자의 돌연변이 및 TEX11 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나가 확인되는 경우, 상기 성별 특이적 마커가 확인되지 않은 사람보다 생존율이 높거나 재발율이 낮다고 판단하는 단계;를 더 포함하는 방법.
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