KR20210120178A - 3차원 미세유체 장치 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 3차원 미세유체 장치는 광경화성폴리머가 흡수된 여과지에 일정 패턴으로 자외선이 조사되어 중합 생성된 기판과, 상기 기판 일부에 복수개로 형성되며 색 형성 시스템을 포함하는 채널이 구비된 검출부; 상기 검출부 일면에 중첩하여 결합되고 파릴렌-C(parylene-C) 로 코팅되어 광경화성폴리머 용매에 저항성을 가지며, 외주를 따라 상기 광경화성폴리머가 경화된 소수성 장벽이 구비된 멤브레인부; 및 상기 멤브레인 일면에서 광경화성폴리머가 자외선에 노출되는 패턴에 따라 경화되어 형성되고 내측에 시료 전혈이 유입되는 저장부;를 포함한다.

Description

3차원 미세유체 장치 및 이의 제조방법{3 DIMENSIONAL MICROFLUIDIC ANALYTICAL DEVICE AND MAKING METHOD THEREBY}
본 발명은 종이기반 미세유체 분석 장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 혈장분리멤브레인이 결합되어 의료 현장에 즉시로 바이오 마커를 직접 감지할 수 있는 3차원 미세유체 장치 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
종이기반 미세유체 분석장치(Paper-based microfluidic analytical device; μPAD)는 비용이 저렴하고, 최근 현장진료(Point-of-Care; POC) 테스트 키트로서 사용하기 용이하며 채널로 샘플을 운반하기 위해 외부 힘을 필요로 하지 않기 때문에 관심을 끌고 있다.
최근에, 3 차원 (3D) μPAD (3D-μPAD)는 종래의 μPAD의 성능을 향상시키기 위해 개발되었다. 2D-μPAD에 비해 3D-μPAD의 분석적 장점에도 불구하고, 3D-μPAD 제작은 일반적으로 정렬, 본딩 및 라미네이션과 같은 길고 지루한 조립 단계가 포함되어 3D-μPAD의 대량 생산은 매우 어렵다.
대부분의 μPAD는 10-20 μm 직경의 기공을 가진 종이가 비색 검출을 방해하는 7 내지 8 ㎛ 크기의 적혈구를 걸러 낼 수 없기 때문에 전혈에서 바이오 마커를 직접 검출하는데 사용하는데 한계가 있으며, 플라즈마 분리 모듈을 μPAD에 통합하기 위한 다양한 방법이 개발되고 있다.
예를 들어 전혈에서 혈장을 분리하는데 사용되는 상용 멤브레인에 미리 제조된 μPAD를 결합하는 방법이 사용되고 있다. 이러한 결합을 위해 두 개의 μPAD는 왁스 인쇄용으로 설계되었으며 PSM은 구멍이 있는 양면테이프로 고정되었고 라미네이션을 통해 압착한다. 그러나 PSM과 μPAD 사이의 약한 접착력은 종종 액체를 누출시킨다. 또한 복잡한 스태킹, 정렬, 본딩 및 펀칭 프로세스와 같은 주요한 기술적 문제도 있다.
대한민국 공개특허공보 제10-2011-0005963호는 혈액 중에서 혈장 또는 혈청을 분리하는 미세유체 칩을 개시한다. 그러나 상기 장치는 비색 검출을 통하여 의료현장에서 즉시로 다양한 바이오 마커(Bio marker)를 검출할 수 없는 단점이 있다.
본 발명의 목적은 비용이 저렴하고 시료의 이동에 별도의 외력이 요구되지 않아서 현장진료(Point-of-Care; POC)가 가능한 종기 기반 미세유체 장치를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 디지털 라이트 프로세스(Digital Light Process: DLP) 기법을 이용한 3D 프린팅을 이용하여 라이네이션, 본딩과 같은 추가적인 조립이나 공정 없이 종이 기판 상에 플라스틱으로 혈장분리멤브레인(Plasma Separation Membrane; PSM)이 결합된 3차원 미세유체 장치를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전혈에서 포도당(glucose), 콜레스테롤(cholesterol) 및 트리글리세리드(triglyceride)를 포함한 여러 대사 질환 마커를 동시에 감지하여 의료현장에 적응성이 높은 3차원 미세유체 장치를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 광경화폴리머 용매에 용해되는 혈장분리멤브레인을 최적의 두께로 코팅하여 3D 프린팅 과정 중에서 멤브레인의 기질을 보호하고 분리된 혈장을 효과적으로 이동시켜 검출감도를 증가시킬 수 있는 3차원 미세유체 장치를 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 상기 및 기타의 목적들은 하기 설명되는 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.
1. 본 발명의 하나의 관점은 포함하는 3차원 미세유체 장치에 관한 것이다. 상기 3차원 미세유체 장치는 광경화성폴리머가 흡수된 여과지에 일정 패턴으로 자외선이 조사되어 중합 생성된 기판과, 상기 기판 일부에 복수개로 형성되며 색 형성 시스템을 포함하는 채널이 구비된 검출부; 상기 검출부 일면에 중첩하여 결합되고 파릴렌-C(parylene-C) 로 코팅되어 광경화성폴리머 용매에 저항성을 가지며, 외주를 따라 상기 광경화성폴리머가 경화된 소수성 장벽이 구비된 멤브레인부; 및 상기 멤브레인 일면에서 광경화성폴리머가 자외선에 노출되는 패턴에 따라 경화되어 형성되고 내측에 시료 전혈이 유입되는 저장부;를 포함한다.
2. 상기 1구체예에서, 상기 상기 색 형성 시스템은 글루코스 옥시다제(lucose oxidase; GOx), 양고추냉이과산화효소(Horseradish peroxidase; HRP), 및 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-3,5-디메틸아닐린 나트륨 염, 일수화물[N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulphopropyl)-3,5-dimethylaniline sodium salt, monohydrate; MAOS)을 포함하는 포도당 검출 효소일 수 있다.
3. 상기 1 또는 2 구체예에서, 상기 멤브레인부는 혈장분리멤브레인(plasma separation membrane; PSM) 이며, 산소 플라즈마 처리되어 친수성일 수 있다.
4. 상기 3 구체예에서, 상기 멤브레인부는 126 내지 440 nm의 두께의 파릴렌-C 코팅층을 구비할 수 있다.
5. 상기 1 내지 4중 어느 하나의 구체예에서, 상기 검출부 내부 일측에는 소수성 장벽이 구비되어 상기 멤브레인부의 소수성 장벽과 결합될 수 있다.
6. 상기 5 구체예에서, 상기 검출부에서 상기 여과지의 두께를 초과하여 형성되는 중합체는 상기 검출부와 상기 멤브레인부를 결합시켜 기밀성을 유지할 수 있다.
7. 상기 1 내지 6중 어느 하나의 구체예에서, 상기 저장부의 직경은 500 μm내지 12 mm일 수 있다.
8. 상기 1 내지 7중 어느 하나의 구체예에서, 상기 색 형성 시스템은 포도당, 콜레스트롤(cholesterol) 및 트리글리세라이드(triglyceride; TG)를 동시에 다중 비색 측정할 수 있다.
9. 본 발명의 다른 관점은 3차원 미세유체 장치 제조방법에 관한 것이다.
한 구체예에서 3차원 미세유체 장치 제조방법은
(a) 혈장분리멤브레인을 준비하는 단계;
(b) 여과지에 상기 혈장분리멤브레인을 중첩시키고, 광경화폴리머에 침지시켜 광경화폴리머를 상기 여과지와 혈장분리멤브레인에 흡수시키는 단계;
(c) 상기 여과지 바닥에 일정한 패턴으로 UV광을 노출시켜 경화시키고, 상기 여과지와 혈장분리멤브레인을 결합시켜 소수성 장벽이 구비된 복합층을 형성하는 단계; 및
(d) 상기 복합층을 반전하고, 상기 혈장분리멤브레인 상부에 UV광을 일정한 패턴으로 노출시켜 전혈이 투입되는 저장부를 형성하는 단계를 포함한다.
10. 상기 9 구체예에서, 상기 혈장분리멤브레인을 준비하는 단계는
(i) 다이클로로-다이-p-자일릴렌(파릴렌-C)를 증발시키는 단계,
(ii) 증발된 파릴렌-C를 열분해하여 반응성 자유라디칼로 변환시키는 단계,
(iii) 진공 하에서 상기 자유라디칼인 파릴렌-C를 상기 혈장분리멤브레인 상에 증착시키고, 중합하여 코팅층을 형성하는 단계,
(iv) 상기 코팅된 혈장분리멤브레인을 산소 플라즈마 처리하여 친수성으로 변화시키는 단계를 포함한다.
11. 상기 10 구체예에서, 상기 (iii) 단계에서 상기 코팅층은 상기 파릴렌-C의 첨가량 및 현미경 관찰을 통하여 두께가 126 내지 440 nm로 조절될 수 있다.
12. 상기 9 내지 11중 어느 하나의 구체예에서, 상기 소수성 장벽은 0.5 내지 5초간 UV광을 노출하여 형성될 수 있다.
본 발명은 디지털 라이트 프로세스(Digital Light Process: DLP) 기법을 이용한 3D 프린팅을 통하여 효율적으로 제조된 종이 기반 3차원 미세유체 장치를 제공한다. 라미네이션, 본딩과 같은 추가 공정이 요구되지 않아서 제조 효율이 매우 높으며, 시료가 이동하는 채널의 기밀성이 유지되어 외부로 액체가 유출되지 않아서 바이오 마커의 검출 감도 또한 높다.
또한 시료에서 포도당뿐만 아니라, 콜레스트롤 및 트리글리세라이드와 같은 바이오 마커를 다중으로 검출할 수 있어서 의료 현장에 적응성이 높으며, 현장진료 키트로 매우 적합하다.
또한 종이 기반 미세유체 장치로 색 대비 효과가 높아서 비색 검출의 감도가 매우 높다.
본 발명의 다른 관점은 혈장분리멤브레인의 기질을 보존하면서 종이에 혈장분리멤브레인을 중첩하게 배치된 후 3D 프린팅을 통하여 한 번에 종이와 혈장분리멤브레인을 결합시켜 기밀성이 유지되도록 하는 3차원 미세유체 장치의 제조방법을 제공한다.
또한 혈장분리멤브레인이 3D 프린팅 과정에서 사용되는 광경화성폴리머의 용매에 용해되는 문제점을 해결하기 위하여 파릴렌-C로 일정 두께의 코팅층을 형성하여 3D인쇄과정에서 혈장분리멤브레인의 기질을 보호하며, 전혈에서 적혈구를 분리하고 공급하여 다양한 바이오 마커에 대한 비색검출 성능을 효과적으로 유지시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치의 구성을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 다른 관점에 따른 3차원 미세유체 장치 제조방법의 공정이다.
도 3은 본 발명의 다른 관점에 따른 3차원 미세유체 장치 제조방법의 개략적인 구성을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치 제조방법에 있어서, 3D 프린팅 마스크 설계과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 파릴렌-C 첨가량에 따른 코팅층의 두께에 따른 지형 및 접촉각의 변화, 현미경과 주사전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 PSM의 플라즈마 처리에 따른 접촉각의 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 파릴렌-C로 코팅된 혈장분리멤브레인을 유기용매인 NMP에 30분간 침지 후 표면의 다공구조의 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 여과지 및 혈장분리멤브레인 내의 자외선 노출 시간에 따른 광경화 구조물의 높이를 나타낸 그래프와 단면 사진을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 혈장분리멤브레인의 노출 시간에 따른 가교된 광경화폴리머의 구조를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 한 구체예에 다른 3차원 미세유체 장치에서 양면테이프로 접착된 μPAD의 청색 잉크의 투과 정도를 비교한 것이다.
도 11은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 적혈구 분리와 혈장의 검출과정을 나타낸 모식도이다.
도 12는 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 검출부의 젖음(wetting) 및 5 mM의 포도당을 함유하는 전혈의 용량(10~100 ㎕)에 따른 검출부의 색 생성을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 인간 혈청, 전혈 및 PBS에 대하여 포도당 함량에 따른 비색검출 및 100 μL 시료에서 다양한 농도에 따른 검출부의 이미지 및 포도당 검출의 보정 곡선을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 포도당 농도 증가에 따른 강도(gray intensity)를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 상용 글루코미터의 포도당 농도에 따른 보정계수를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 글루코스, 콜레스테롤 및 TG를 포함하는 다수의 바이오 마커의 비색 검출한 것을 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 도면은 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 하기 도면에 의해 한정되는 것은 아니다. 또한, 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다.
명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.
본 명세서 상에서 언급한 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우 '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성 요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.
구성 요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.
~상에', '~상부에', '~하부에', '~옆에' 등으로 두 부분의 위치 관계가 설명되는 경우, '바로' 또는 '직접'이 사용되지 않는 이상 두 부분 사이에 하나 이상의 다른 부분이 위치할 수 있다.
'상부', '상면', '하부', '하면' 등과 같은 위치 관계는 도면을 기준으로 기재된 것일 뿐, 절대적인 위치 관계를 나타내는 것은 아니다. 즉, 관찰하는 위치에 따라, '상부'와 '하부' 또는 '상면'과 '하면'의 위치가 서로 변경될 수 있다.
본 발명자들은 간단한 3차원(3D) 프린팅을 이용하여 추가적인 조립 없이 혈장분리멤브레인(Plasma Separation Membrane; 이하 'PSM')이 결합된 미세유체 장지(Paper-based microfluidic analytical devices; 이하 'μPAD')를 제조하였다.
구체적으로 PSM을 3D 프린팅 동안 유기 용매에 의한 용해를 방지하기 위해 파릴렌-C(parylene C)로 코팅하고, 코팅된 PSM을 종이에 겹쳐 놓았다.
디지털 광 처리 프린터를 사용한 액체 광중합법을 사용하여 여과지와 PSM에 각각 검출부와 저장부를 한 번에 인쇄하여 PSM이 결합된 3차원 미세유체 장치(이하 '3D-μPAD ')제조하였다.
제조된 3D-μPAD의 포도당 검출 한계는 0.3 mM이었고, 이들 장치는 당뇨병 환자 혈액 샘플에서 임상적으로 유의한 성능을 나타냈다. 또한 3D-μPAD는 또한 전혈에서 포도당(glucose), 콜레스트롤(cholesterol) 및 트리글리세라이드(triglyceride; TG)를 포함한 여러 대사 질환 바이오 마커를 동시에 감지 할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
또한 상기 본 발명은 3D프린팅 기법이 PSM이 결합되어 전혈에서 바이오마커를 직접 검출하는 3D-μPAD를 제조하는데 매우 적합한 것을 나타낸다.
도 1은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치의 구성을 나타낸 모식도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 3D-μPAD는 검출부(100), 멤브레인부(200) 및 저장부(300)를 포함한다.
상기 검출부(100)는 광경화성폴리머가 흡수된 여과지에 일정 패턴으로 자외선이 조사되어 중합 생성된 기판(110)과, 상기 기판 일부에 복수개로 형성되며 색 형성 시스템(130)을 포함하는 채널(120)이 구비된다.
상기 기판(110)은 종이를 기반으로 하는 여과지(Filer paper)에 광경화성폴리머가 흡수되고 일정 강도의 자외선(이하 'UV 광')에 일정한 패턴으로 노출되어 상기 광경화성폴리머의 광중합으로 형성된다.
상기 기판(110)은 상기 여과지에 흡수된 광경화성폴리머가 UV 광에 반응하여 종이의 성질을 잃어버린 경화된 수지이다.
이 때 상기 광경화성폴리머는 디지털 라이트 프로세스(Digital Light Process: DLP) 인쇄에 사용되는 폴리머이며, UV 광을 사용하여 상기 여과지 내에 일정한 패턴으로 경화시켜 중합체를 형성할 수 있고, 상기 중합체는 여과지 내 일 측에 소수성 장벽을 형성하여 상기 채널(120)에서 시료가 유출되지 않도록 한다.
상기 채널(120)은 상기 UV광에 노출되지 않은 여과지의 일부가 그대로 남아서 형성되며, 시료인 전혈에서 분리된 혈장이 도입되면 내부에 포함된 상기 색 형성 시스템(130)과 반응하여 일정한 색을 나타내어 비색 검출(colorimetrically detect)이 가능하다.
상기 채널(120)은 상기 여과지를 기질로 하여 형성된 것이다.
상기 색 형성 시스템은 글루코스 옥시다제(lucose oxidase; GOx), 양고추냉이과산화효소(Horseradish peroxidase; HRP), 및 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-3,5-디메틸아닐린 나트륨 염, 일수화물[N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulphopropyl)-3,5-dimethylaniline sodium salt, monohydrate; MAOS)을 포함하는 포도당 검출 효소이다.
상기 색 형성 시스템(130)은 상기 검출부(100)에 도입된 혈장 시료에서 포도당과 결합하여 일정 색을 나타내기 때문에 비색 검출이 가능하다.
상기 색 형성 시스템(130)은 대상 바이오 마커 종류에 따라 달라질 수 있으며, 상기 여과지 내에 첨가될 수 되어 고정될 수 있는 것이면 제한되지 않는다.
상기 색 형성 시스템(130)은 포도당(glucose), 콜레스트롤(cholesterol) 및 트리글리세라이드(triglyceride; TG)를 동시에 다중 비색 측정이 가능하다.
상기 색 형성 시스템(130)의 구성에 따라 포도당뿐만 아니라 다양한 바이오 마커 검출이 가능하며, 특히 콜레스트롤 및 트리글리세라이드를 다중 비색 측정으로 검출할 수 있어서 현장진료 적합성이 매우 증가된다.
상기 멤브레인부(200)는 상기 검출부(100) 일면에 중첩하여 결합되고 파릴렌-C(parylene-C) 로 코팅되어 광경화성폴리머 용매에 저항성을 가지며, 외주를 따라 상기 광경화성폴리머가 경화된 소수성 장벽(240)이 구비된다.
상기 파릴렌-C는 PSM표면에 코팅층을 형성하여, 상기 PSM에 광경화성폴리머의 용매에 용해되지 않도록 하여 매우 바람직하나, 디지털 라이트 프로세스(Digital Light Process: 이하 'DLP')를 이용한 3D프린팅 과정에서 상기 PSM를 용해시키지 않는 것이면 제한되지 않는다.
상기 멤브레인부(200)는 126 내지 440 nm의 두께의 파릴렌-C 코팅층(210)을 구비한다.
상기 범위 내로 상기 코팅층(210)이 구비되는 경우에는 광경화폴리머의 주요 용매에 대하여 내식성을 가져서 상기 PSM가 DLP를 이용한 3D 프린팅 과정 중에서 손상되지 않는다.
상기 멤브레인부(200)는 PSM이며, 산소 플라즈마 처리되어 친수성이다.
상기 PSM이 산소 플라즈마 처리되어 친수성을 나타내는 경우에는 시료인 혈액이 멤브레인부(200)에 침투되기 매우 유리하여 혈장 분리 효율이 매우 증가한다.
상기 PSM은 상기 여과지에 중첩되게 배치되고, 광경화성폴리머가 흡수되며, UV 노출에 따른 광중합으로 상기 검출부(100)에 밀착되게 결합한다.
한편 상기 검출부(100)에서 상기 여과지의 두께를 초과하여 형성되는 중합체는 상기 검출부(100)와 상기 멤브레인부(200)를 결합시켜 기밀성을 유지할 수 있도록 한다.
상기 여과지의 두께를 초과하는 중합체는 상기 검출부(100) 일면에 중첩된 상기 멤브레인부(200)까지 도달하여 상기 검출부(100)와 상기 멤브레인부(200)을 결합시킨다.
본 발명의 한 구체예에서 상기 두께는 100 내지 180 μm이며, 상기 180 μm를 초과하는 경우에는 여과지의 두께를 초과하여 상기 멤브레인부(200)의 PSM까지 도달하여 여과지와 PSM을 함께 결합시킬 수 있다.
상기 저장부(300)는 상기 멤브레인부(200) 일면에서 광경화성폴리머가 UV광에 노출되는 패턴에 따라 경화되어 광중합으로 형성되고 내측에 시료 전혈이 유입되어 저장될 수 있다.
상기 저장부(300)는 상기 멤브레인부(200)의 일면에서 DLP 기법에 따라 UV광에 노출되는 패턴으로 생성되며, 본 발명의 한 구체예에서 상기 저장부(300)는 내부에 시료 전혈이 유입되어 보관될 수 있는 개방된 원통형으로 생성될 수 있다.
상기 저장부(300)의 직경은 500 μm내지 12 mm일 수 있다.
상기 저장부(300)는 직경이 감소되는 경우 도입되는 시료 전혈의 양을 감소시킬 수 있어서, 환자의 편의를 증가시킬 수 있다.
상기 범위에 미치지 못하는 경우 샘플 부피가 너무 감소되어 검출 감도가 감소될 우려가 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우에는 검출 대상 시료를 미리 보정해야 하는 불편함이 있다.
상기 검출부(100), 멤브레인부(200) 및 저장부(300)는 UV광에 노출되는 패턴에 따라 광중합으로 형태가 결정되어 3차원 구조를 이루며, 시료인 전혈(400)이 상기 저장부(300)에 도입되면 외력에 의하지 않고, 수직 방향으로 이동한다.
상기 시료인 전혈(400)이 저장부(300)에서 상기 멤브레인부(200)의 PSM을 통과하면 적혈구(410)는 분리되고, 혈장(420)은 그대로 통과하여 하측에 배치된 검출부(100) 내의 채널(120)에 도달하게 된다.
상기 혈장 중 포도당과 같은 지표는 상기 채널(120) 내의 색 형성 시스템(130)에 의하여 반응하고 일정 색을 나타내어 비색 검출이 가능하다.
한편 상기 검출부(100) 내측 일부에 형성된 소수성 장벽(140)은 상기 멤브레인부(200) 외주에 형성되는 소수성 장벽(240)과 연결되며, 최종적으로 상기 저장부(300)의 내측의 소수성 장벽(340)과 결합되어 본 발명의 한 구체예에 따른 3D-μPAD 는 액체가 외측으로 유출되지 않고 시료가 하측의 채널(120)을 향하여 일정하게 흐르도록 유도된다.
상기 광경화성폴리머가 광중합으로 경화되어 생성되는 중합체는 상기 소수성 장벽(140, 240, 340)으로 형성하여 미세유체가 수직으로 흐르는 관로를 형성할 뿐만 아니라 상기 검출부(100), 멤브레인(200) 및 저장부(300)를 보호하는 구조체를 형성한다.
도 2는 본 발명의 다른 관점에 따른 3차원 미세유체 장치 제조방법의 공정이다.
도 2 를 참조하면, 본 발명의 다른 관점에 따른 3차원 미세유체 장치 제조방법은 (a) 혈장분리멤브레인을 준비하는 단계; (b) 여과지에 상기 혈장분리멤브레인을 중첩시키고, 광경화폴리머에 침지시켜 광경화폴리머를 상기 여과지와 혈장분리멤브레인에 흡수시키는 단계; (c) 상기 여과지 바닥에 일정한 패턴으로 UV광을 노출시켜 경화시키고, 상기 여과지와 혈장분리멤브레인을 결합시켜 소수성 장벽이 구비된 복합층을 형성하는 단계; 및 (d) 상기 복합층을 반전하고, 상기 혈장분리멤브레인 상부에 UV광을 일정한 패턴으로 노출시켜 전혈이 투입되는 저장부를 형성하는 단계를 포함한다.
우선, PSM을 준비한다(S100).
본 발명의 한 구체예에서 상기 PSM 의 준비(S100)는 (i) 다이클로로-다이-p-자일릴렌(파릴렌-C)를 증발시키는 단계, (ii) 증발된 파릴렌-C를 열분해하여 반응성 자유라디칼로 변환시키는 단계, (iii) 진공 하에서 상기 자유라디칼인 파릴렌-C를 상기 혈장분리멤브레인 상에 증착시키고, 중합하여 코팅층을 형성하는 단계, (iv) 상기 코팅된 혈장분리멤브레인을 산소 플라즈마 처리하여 친수성으로 변화시키는 단계를 포함한다.
상기 (i) 내지 (iii) 단계를 통하여 파릴렌-C를 증발시키고 열분해로 자유라디칼로 증착하는 경우 PSM에 매우 효과적으로 코팅층을 형성할 수 있다.
상기 PSM은 광경화성폴리머의 유기 용매로부터 용융을 방지하기 위하여 파릴렌-C(parylene-C)로 코팅하였다.
상기 (iii) 단계에서 상기 코팅층은 상기 파릴렌-C의 첨가량 및 현미경 관찰을 통하여 두께가 126 내지 440 nm로 조절된다.
상기 파릴렌-C의 첨가량과 현미경 관찰을 통하여 상기 코팅층의 두께를 조절하는 경우에 상기 PSM를 광경화성폴리머의 용매로부터 보호할 수 있다.
이 때 상기 파릴렌-C의 첨가량이 증가될수록 상기 코팅층이 두께가 증가하며 상기 PSM 의 표면은 소수성으로 변화된다.
상기 (iv) 단계에서 산소 플라즈마 처리하는 경우 상기 PSM 을 친수성으로 변화시킬 수 있다.
상기 PSM 이 친수성으로 변화되는 경우에는 상기 PSM에 시료인 전혈의 도입이 매우 유리하다.
상기 여과지에 상기 혈장분리멤브레인을 중첩시키고, 광경화폴리머에 침지시켜 광경화폴리머를 상기 여과지와 혈장분리멤브레인에 흡수시킨다(S200).
상기 여과지 및 혈장분리멤브레인이 중첩된 상태로 광경화폴리머 용액에 침지되며 광경화폴리머가 흡수되어 여과지 및 혈장분리멤브레인에 일정한 패턴으로 UV 광을 노출시켜 상기 여과지 및 혈장분리멤브레인에 경화된 중합체를 형성할 수 있다.
상기 중합체는 소수성 장벽을 이루며 상기 여과지에 포함되는 검출부위와 혈정분리멤브레인을 보호하는 하우징을 형성할 수 있다.
상기 여과지 바닥에 일정한 패턴으로 UV광을 노출시켜 경화시키고, 상기 여과지와 혈장분리멤브레인을 결합시켜 소수성 장벽이 구비된 복합층을 형성한다(S300).
상기 소수성 장벽은 0.5 내지 5초간 UV광을 노출하여 형성될 수 있다.
상기 범위 내에서 상기 여과지 내부에 흡수되 광경화성폴리머를 광중합으로 경화시켜 여과지를 수지(resin)로 변화시킬 수 있으며, 상기 범위에 미치지 못하는 경우 광중합이 이루어지지 않거나, 상기 범위를 초과하는 경우에는 중합체 생성 효과가 떨어진다.
도 3은 본 발명의 다른 관점에 따른 3차원 미세유체 장치 제조방법의 개략적인 구성을 나타낸 모식도이다.
도 3을 참조하면, 본 발명의 다른 관점에 따른 3D-μPAD 제조방법은 2D 형태인 여과지와 PSM을 중첩하고 DLP 기법에 의한 UV 광 노출과정으로 여과지의 일부를 수지로 변화시키고 채널이 구비된 검출부를 생성하고, 상기 PSM과 결합시키는 복합층을 형성하는 전반 공정과, 상기 복합층을 반전하여 상기 PSM 상에 일정 패턴으로 UV광을 노출시켜 저장부를 형성하는 후반 공정으로 구분된다.
상기 후반 공정으로 상기 복합층을 반전하고, 상기 혈장분리멤브레인 상부에 UV광을 일정한 패턴으로 노출시켜 전혈이 투입되는 저장부를 형성한다(S400).
본 발명의 한 구체예에서 상기 저장부를 형성한 이후에 에탄올로 3D-μPAD를 세척하고 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 관점에 따른 3차원 미세유체 장치 제조방법은 디지털 라이트 프로세스(Digital Light Process: DLP) 인쇄에 사용되는 광경 화성 폴리머는 UV광을 사용하여 여과지 내에 소수성 장벽을 쉽게 형성하여 3차원 미세유체 장치를 제조할 수 있다.
종래 전혈에서 다수의 바이오 마커를 동시에 비색 검출할 수 없었으나, 상기 PSM을 결합하여 적혈구(Red Blood Cell; RBC)를 여과하고 무색 혈장을 기질에 노출 시 색을 생성하는 효소를 포함하는 검출부로 이동시킴으로써 전혈에서 여러 바이오 마커를 동시에 감지할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 3D-μPAD 제조
(1) 재료 준비
N-메틸-2-피롤리돈(N-Methyl-2-pyrrolidone; NMP), D-(+)-포도당, 글루코스 옥시다제(glucose oxidase; GOx), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine; 4-AAP), 콜레스테롤, 아데노신 5'-트리포스페이트이 나트륨 염 수화물 (adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate; ATP) 및 트리글리세리드(TG)는 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK)로부터 구입하였다.
양고추 냉이과산화효소(HRP), 콜레스테롤 산화효소(cholesterol oxidase; CO), 지단백질 리파제(lipoprotein lipase; LL), 콜레스테롤 에스테라제(cholesterol esterase; CE), L-α-글리세로 포스페이트 옥시다제(L-α-glycerophosphate Oxidase; GPO) 및 글리세롤 키나제(glycerol kinase; GK)는 도요보(Toyobo Co. 오사카, 일본)로부터 입수하였다.
N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-3,5-디메틸아닐린 나트륨 염, 일수화물(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulphopropyl)-3,5-dimethylaniline sodium salt, monohydrate; MAOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-3,5-디메톡시 아닐린, 나트륨 염(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3sulphopropyl)-3,5-dimethoxyaniline, sodium salt; DAOS), 및 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-3-메톡시 아닐린, 나트륨 염, 이수화물 (N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline, sodium salt, dihydrateADOS)은 도진도에(Rockville, MD, USA).)서 구입하였다. 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)는 Gibco (Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다.
폴리설폰으로 만든 PSM (Vivid GR)은 폴 라이프 사이언스(Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI, USA).)에서 구입하였다.
(2) PSM의 파릴렌-C 코팅 및 산소처리
파릴렌-C를 다음 3 단계 과정으로 PSM 상에 증착시켰다.
(i) 다이클로로-다이-p-자일릴렌(파릴렌-C) (Daisan Kasei Co. 구매, Tokyo, Japan) 분말을 160 ℃에서 증발시켰다.
(ii) 파릴렌-C를 650 ℃에서 열분해하여, 고 반응성 자유라디칼로 변환시켰다.
(iii) SCS Labcoter 2 파릴렌 증착 시스템(Kisco Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 상온 및 진공 하에서(at RT, <5.3 Pa (40 mTorr)) PSM상에 파릴렌-C를 증착시키고 및 중합하였다.
코팅의 두께는 다양한 양(120-520 mg)의 파릴렌 C를 사용하여 제어되었으며, 실리콘 캔틸레버와 함께 원자력 현미경(AFM, XE-100; Park Systems Co., Suwon, Korea)을 사용하여 측정하였다(스프링 상수, 42 N / m).
(iv) 이후 코팅된 PSM을 산소 (O2) 플라즈마 시스템 (Femto Science Ltd., 화성, 한국)을 사용하여 100W 및 0.05 Torr에서 1 분 동안 플라즈마 처리하여 표면을 친수성으로 만들었다.
(3) PSM이 결합된 미세유체 장치(3D-μPAD) 제조
도 4는 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치 제조방법에 있어서, 3D 프린팅 마스크 설계과정을 나타낸 모식도이다.
도 4를 참조하면, 3D 프린팅 마스크는 Inventor Professional 프로그램(Autodesk Inc., San Rafael, CA, US)을 사용하여 설계되었으며 stl 파일로 저장하고, 각 파일을 컴퓨터에 층별로 전송하였다.
3D 프린터(IM-96) 및 광경화성폴리머(폴리우레탄, CFY044W)는 (Carima Co. 한국 서울)에서 구입하였다.
파릴렌-C로 코팅된 PSM(기공 크기 : 1.3-17 μm, hatman International Ltd., Maidstone, UK)를 원형 여과지(직경 : 110 mm, 기공 크기 : 11 μm)에 중첩시킨 후, 이들을 폴리머가 담긴 3D프리터의 레진트레이에 10초 동안 침지하여 여과지와 PSM 둘 다 폴리머를 흡수시켰다.
다음으로 UV광 노출이 PSM의 바닥에 이를 때까지 프린터의 트레이를 사용하여 3초 동안 여과지의 바닥을 검출부의 패턴에 따라 2.8 mW/cm2 세기로 UV광에 노출시켰다. PSM과 여과지가 결합되어 복합층을 형성하였다.
결합된 복합층을 뒤집어서 프린터의 레진트레이에 배치하고, 다시 상부 PSM을 노출시켰다. 유사하게, 여과지 및 PSM은 프린터로부터 저장부 패턴으로 UV 광에 다시 노출하여 저장부를 형성하였다. 마지막으로, 인쇄된 3D-μPAD를 에탄올로 세정하여 잔류 중합체를 제거하고 실온에서 건조시켰다.
실험예 1. 혈청 및 전혈 완충용액에서 포도당 검출
인산완충용액((pH 7.4)에 MAOS (1mM), 4-AAP (10mM), HRP (1mg / mL) 및 GOx (10mg / mL)를 PBS(pH 7.4)에 용해시켜 포도당의 효소 검출용 시약을 제조하였다.
혼합물 (2 μL)을 3D-μPAD의 검출 구역에 첨가하고 인큐베이터에서 37 ℃에서 10 분 동안 건조시켰다.
PBS에서 포도당 검출을 위해, D-(+)-포도당 표준 용액(0-20 mM)은 D-(+)-포도당 (3.6 mg/mL)의 저장 용액을 PBS를 통하여 제조하였다. 각 표준 용액 100 μL를 RT에서 3D-μPAD의 저장부에 넣었다.
혈청에서 포도당 검출은 바이오-래드 연구소(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)의 리포첵 분석 화학 조절 수준 1 및 2(Lyphochek Assayed Chemistry control level 1 and 2)로부터 동결건조된 인간 혈청을 사용하였다.
사용전 5 mL의 탈이온수를 동결 건조된 인간 혈청에 첨가하였다. 그 후, 기포 발생을 피하기 위해 혼합물을 20분 동안 부드럽게 진탕시키고 D-(+)-글루코스를 사용하여 혈당을 상승(spike)시켰다.
이어서, 상이한 글루코스 농도 (5-20 mM)에서 새로 제조된 혈청 샘플 용액 100μL를 상온에서 3D-μPAD 저장소부 첨가하였다. 포도당 농도가 다른 전혈 샘플을 유사한 방식으로 (2.5-20 mM)을 제조하였다.
저장부에 PBS 또는 혈청 또는 전혈 샘플을 넣고 10 분 후, 검출부의 색상을 전하 결합 장치 카메라가 장착된 스테레오 현미경(SMZ 1500, Nikon) 또는 휴대폰 (Galaxy 10, 삼성전자, 한국)을 사용하여 캡처하였다.
검출부의 색 강도는 Image J (NIH, USA)를 사용하여 분석되었다. 분석을 위해 각 이미지를 그레이 스케일로 변환하였다. 검출부의 강도는 제어구역의 그레이 강도로부터 검출 구역의 그레이 강도를 차감하여 계산되었다.
실험예 2. 진성 당뇨병 환자의 전혈 시료의 분석
환자의 전혈 샘플은 강동 경희대 병원의 환자로부터 수득하였으며, 모든 실험은 헬싱키 선언 및 제도적 지침에 따라 수행하였다.
모든 전혈 샘플은 환자의 사전 서면 동의에 의해 획득되었다. 진성 당뇨병을 앓고 있는 8 명의 다른 지원자로부터의 전혈 샘플이 핑거 스틱 테스트를 통해 획득되었다. 3D-μPAD에 의해 검출된 결과를 검증하기 위해 상업적 혈당계 (Accu-Check @ instant S, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하여 전혈 샘플로부터의 확인된 값을 병원으로부터 제공받았다.
실험예 3. 전혈에서 다양한 바이오 마커의 다중 검출
콜레스테롤 검출용 시약은 PBS에 ADOS (1mM), CE (14.1U), CO (10mg / mL), 4-AAP (10mM) 및 HRP (1mg / mL)를 용해시켜 제조하였다. 감지하는데 사용되는 시약 TG는 DAG (1 mM), GPO (14.1 U), GK (2.6 U), ATP (3.6 mM), LL (3.8 U), 4-AAP (10 mM) 및 HRP (1 mg / mL)를 PBS 용해시켜 제조하였다.
각 시약의 분취량 (2 μL)을 3D-μPAD의 각각의 검출부에 투입하고 인큐베이터에서 37 ℃에서 10 분 동안 건조시켰다. 전혈 중 포도당, 콜레스테롤 및 TG는 D-(+)-포도당, 콜레스테롤 및 TG 용액을 사용하여 첨가하였다(spike). 검출을 위해, 각각의 표준 샘플 용액 100 μL를 3D-μPAD의 저장부에 투입하고, 이어서, 검출부의 색상은 상술한 바와 같이 시약을 첨가하고 분석한 한 10 분 이후에 캡쳐하였다.
실험예 4. PSM에 파릴렌-C 코팅 효과
PSM은 유기 용매에 용해되는 비대칭 폴리술폰으로 이루어진다.
유기 용매를 함유한 광경화성폴리머로 인해 PSM이 용해되는 것을 방지하기 위해, PSM 표면을 상이한 양 (120-520 mg)의 파릴렌-C를 사용하여 코팅하였다.
도 5는 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 파릴렌-C 첨가량(0-520 mg )에 따른 코팅층의 두께에 따른 지형 및 접촉각의 변화, 현미경과 주사전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 5를 참조하면, 파릴렌-C의 양이 증가함에 따라 PSM 코팅의 두께가 증가했다.
코팅에 의해 접촉각이 119 °에서 129 °로 증가함에 따라, PSM 표면은 친수성에서 소수성으로 변하였다. 광학 및 주사전자현미경 (SEM) 이미지를 확인하면 파릴렌-C 코팅에서 두께의 변화에 따라 PSM의 섬유질 구조에는 큰 차이가 없는 것을 확인하였다.
한편 액체를 PSM에 쉽게 침투시키기 위해, 표면을 산소 플라즈마로 처리하였다.
도 6은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 PSM의 플라즈마 처리에 따른 접촉각의 변화를 나타낸 것이다.
도 6을 참조하면, 과적으로 접촉각이 33 ° 내지 50 °로 낮아져 표면이 친수성이 되는 것을 확인하였다.
산소 플라즈마 처리를 통하여 PSM 코팅의 정도에 관계없이 접촉각이 변경되었다.
산소 플라즈마 처리는 표면을 친수성으로 만들고 PSM에 대한 전혈 흡수를 강화 시켰으며, 친수성은 적어도 2주 동안 유지되었다.
도 7은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 파릴렌-C로 코팅된 혈장분리멤브레인을 유기용매인 NMP에 30분간 침지 후 표면의 다공구조의 변화를 나타낸 것이다.
여기서 검은 박스는 뭉쳐있는 섬유를 나타내며 스케일은 200 ㎛이다.
PSM이 유기 용매에 용해되는 것을 방지하기 위한 파릴렌-C 코팅의 최적 두께를 결정하기 위해, 다양한 두께의 파릴렌-C로 코팅된 PSM을 광경화성폴리머의 주요한 유기용매인 NMP에 30분 동안 침지시켰다.
도 7을 참조하면, 각적으로, 125 nm를 초과하는 코팅 두께를 갖는 PSM은 손상되지 않은 것으로 보인 반면, 125 nm를 갖는 PSM은 부분적으로 손상된 것으로 나타났다.
125 및 239 nm 두께 PSM 섬유로 코팅된 PSM가 용해되는 경우 현미경 및 SEM 이미지를 나타내었다. 특히 절단된 섬유는 압축 또는 응집된 것으로 나타났다. 그러나, 440 nm 코팅 두께에서, 섬유는 그대로 유지되었다. 코팅 두께가 440 nm를 초과하면, PSM은 종종 3D 프린팅 동안 여과지에 결합하지 못했다.
따라서, 최적의 코팅 두께는 440 nm 인 것으로 확인되었다.
실험예 5. 여과지 및 PSM의 내부 광경화된 구조의 높이 대한 UV노출 시간에 따른 효과
여과지의 3D 구조의 두께는 DLP 인쇄에 의한 광경화성폴리머에 대한 노광량에 의해 결정된다.
여과지와 PSM 층은 상이한 광 투과율을 갖기 때문에, 각 층의 3D 구조의 두께는 노출 시간에 따라 개별적으로 최적화 되어야한다.
도 8은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 여과지 및 혈장분리멤브레인 내의 자외선 노출 시간에 따른 광경화 구조물의 높이를 나타낸 그래프와 단면 사진을 나타낸 것이다.
여기서, 0-3초 의 UV광 노출에 따른 여과지 내부의 인쇄된 구조물의 높이 및 가교된 광경화성폴리머의 단면을 나타내었다.
도 8을 참조하면, 광경화성폴리머로 적신 여과지를 처음 서로 다른 시간 (0-3 초)에 노출했을 때, 0.5 초 미만인 경우 여과지 내부에서 거의 경과된 폴리머가 나타나지 않았으며, 1초 후 투명하고 푸른빛의 경화된 폴리머가 흰색 여과지 내부에서 생성되기 시작하였다.
2초와 3차에서 여과지 내부에서 경화된 폴리머의 두께는 각각 100 및 180 μm에 달했다.
소수성 장벽은 3초 이내에 여과지 내부에서 완전하게 형성되었다.
두께가 여과지의 두께인 180 μm를 초과하여 증가한 경우, 경화된 중합체는 여과지 상부의 중첩된 PSM에 도달하고 PSM과 종이를 함께 결합시켰다.
다음으로, PSM에 상이한 0-10 초의 상이한 시간 동안에 UV광을 조사하여 중합체가 PSM에서 소수성 장벽을 형성하는데 필요한 노출 시간을 조사 하였다.
도 9는 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 혈장분리멤브레인의 노출 시간에 따른 가교된 광경화폴리머의 구조를 나타낸 것이다.
도 9를 참조하면, 여과지 인쇄와 유사하게 노출시간이 증가함에 따른 PSM내부 인쇄 구조의 높이가 증가되었다.
종이 내부에서 0.5 초 미만으로 노출하는 경우 경화된 중합체는 거의 발견되지 않았다. 1 초 후, 경화된 중합체가 PSM 내부에서 보이기 시작했으며, 2 초 및 4 초에서, 여과지 내부의 경화 된 중합체의 두께는 각각 180 및 300 ㎛에 달하였다.
소수성 장벽은 4.5 초 이내에 PSM 내부에서 완전히 형성되는 것으로 나타났다. 따라서, PSM 인쇄를 위한 최적의 노출 시간은 4.5 초인 것으로 결정되었다.
4.5 초 이후에, 경화된 중합체를 PSM의 표면에 인쇄 하였다.
한편, UV 광 노출에 의해 PSM에서 필요로 하는 높이를 가지는 저장부의 제조를 가능하게 하였다. 이것은 복잡한 구조의 저장부를 μPAD 상에 제작할 수 있다는 것을 나타내며, 공기 중 광선 투과율이 불투명 및 다공성 PSM보다 빠르기 때문에 5 초 후 인쇄된 폴리머의 높이 기울기가 5 초 전의 기울기보다 가파르고, 여과지의 경화 속도가 PSM보다 느리다는 것을 나타낸다.
여기서 두 가지 가능성이 있다.
여과지의 종류에 따라 공극구조와 광선 투과율이 서로 상이하며, 여과지의 공극구조는 거미줄과 같아서 빛을 투과하기 어려우나, PSM 은 원통형 공극구조로 인하여 보다 쉽게 경화되는 것으로 나타났다.
PSM은 여과지와 비교하여 불투명하고 두껍기 때문에 광선 투과율이 낮다.
단일 PSM이 유사한 패턴을 가지는 3D-μPAD를 제조하는데 사용될 수 있지만, 본 발명의 한 구체예에 따른 3D-μPAD는 여과지 위에 PSM을 겹쳐서 제작하는 경우에는 여과지의 높은 명암비를 사용하여 검출 한계 (limit of detection ; LOD)를 향상시킬 수 있다.
상기 최적화된 조건을 사용하여, 여과지 상에 오버레이 된 PSM으로 3D-μPAD를 제조하였다.
도 10은 본 발명의 한 구체예에 다른 3차원 미세유체 장치에서 양면테이프로 접착된 μPAD의 청색 잉크의 투과 정도를 비교한 것이다.
여기서 약 100 μL의 청색잉크를 각각의 저장부에 투입하여 액체를 시각화하였다. 밑면도의 점선 박스는 단면을 나타내었다.
도 10을 참조하면, 제작된 3D-μPAD의 최상층에서 PSM을 포함하는 저장부가 있으며 맨 아래 층에는 여과지 층이 있는 감지부가 형성된다.
유체가 3D-μPAD를 통해 운반될 수 있는지 테스트하기 위해 청색 잉크를 투입한 경우 운반되어 감지부에 도달하였다. 청색잉크는 저장소에 추가되었을 때 누수없이 3D-μPAD의 3개의 감지 영역에 모두 도달했다. 이는 소수성 장벽이 PSM과 여과지 내부에 빈틈없이 잘 형성되었음을 나타낸다.
3D-μPAD와 달리, 청색 잉크는 양면 테이프로 접착된 μPAD에서 누출되어, 검출 영역에 균일하게 도달하지 못하였다. 이 결과는 3D-μPAD가 양면 테이프로 접착된 μPAD보다 여과지와 PSM 사이에 더 밀접하게 결합되어 있음을 나타낸다.
상부 및 하부 층 사이의 간격이 양면 테이프와 동일한 깊이를 가지기 때문에 양면 테이프로 접착된 μPAD는 느슨해졌고, 이 결과 압력 강하 및 유체의 불규칙 또는 불균일한 움직임이 나타났다. 이와 같은 불완전한 결합 문제를 해결하기 위해서는 추가적인 설탕 분말 등의 라미네이션의 추가 공정이 요구된다.
따라서 본 발명의 다른 관점에 따는 3D-μPAD 제조방법은 유체 운반에 있어서, 추가적인 단계없이 여과지와 PSM 내부 일측에 소수성 장벽을 효과적으로 인쇄 할 수 있기 때문에 3D-μPAD의 빠른 제조가 가능하다.
실험예 6. 혈의 양에 따른 색 표시 효과
도 11은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 적혈구 분리와 혈장의 검출과정을 나타낸 모식도이다.
도 11을 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 3차원 미세유체 장치에 있어서, 적혈구 분리와 혈장의 검출과정을 나타낸 모식도이다.
도 11은 PSM 상부에 적혈구를 포함하는 혈액세포를 분리하는 것과, 분리된 혈장이 GOx 및 MAOS를 포함하는 포도당 검출 효소 시스템이 고정된 하부 여과지로 이송되어 색 신호를 생성하는 것을 나타낸다.
글루코스 및 MAOS의 존재 하에 GOx에 의해 생성된 퀴노니민(quinonimine )은 맑은 청록색을 생성한다.
삽도는 전혈을 저장부에 떨어 뜨린 후 저장부 및 감지부의 단면을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 검출부의 젖음(wetting) 5 mM의 포도당을 함유하는 전혈의 용량(10~100 ㎕)에 따른 검출부의 색 생성을 나타낸 것이다.
도 12을 참조하면, 전혈이 저장부에 투입되면, 적혈구는 저장부에 남아있는 반면에 혈장은 PSM을 통과하여 검색부에 색을 나타낸다.
혈장에 함유된 포도당은 과산화수소(H2O2) 및 GOx에 의한 글루콘산(gluconic acid)으로 변화되었다.
HRP의 존재 하에, H2O2, 4-AAP 및 MAOS는 무색에서 청록색으로 전환되었다.
3D-μPAD에서 PSM 층을 완전히 적시려면 100μL의 전혈이 필요하여 이 경우 강한 색을 생성할 수 있다. 소량의 전혈(10 및 30 μL)은 저장부에서 PSM을 적시기에 충분하지 않아서, 약한 색을 나타내었다. PSM에 투입되는 전혈 중 오직 10%의 혈장만이 추출된다.
한편 3D-μPAD의 저장부 직경을 12mm에서 500μm로 줄임으로써 3D-μPAD의 샘플 부피를 1μL 미만으로 줄일 수 있다.
실험예 7. 3D-μPAD에서 인간 전혈 및 혈청에서 포도당의 혈당 검출
3D-μPAD의 타당성을 테스트하기 위해 임상 시료(인간 혈청 및 전혈)를 탐지하였다. 결과는 PBS를 사용하여 얻은 결과와 비교하였다.
도 13은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 인간 혈청, 전혈 및 PBS에 대하여 포도당 함량에 따른 비색검출 및 100 μL 시료에서 다양한 농도에 따른 검출부의 이미지 및 포도당 검출의 보정 곡선을 나타낸 것이다.
도 13의 (A)에서 PBS는 0-20 mM의 포도당을 함유하였으며, (B)에서 혈청은 5-20 mM을 함유하고, (C)에서 전혈은 2.5-20 mM의 포도당을 함유하였다.
모든 보정곡선은 15회 다른 농도에서 포도당을 분석한 결과에서 얻어진 데이터를 도식화한 것이다.
도 13을 참조하면, 그래프의 추상 형태는 포화점(15mM)을 가진 2 차 포물선 방정식을 따르는 것으로 나타났다. 따라서, 샘플이 해당 포화점보다 높은 농도로 포도당을 함유하는 경우 분석 전에 희석해야할 필요가 있으며, 활동 레인지는 0-15mM이고 LOD는 0.3mM이다.
세 개의 음성 대조군의 표준 편차에 3을 곱하여 LOD를 계산하였다.
인간 혈청 및 전혈의 경우, 샘플에서 포도당이 항상 포함되기 때문에 음성 대조군이 없다. 따라서 정확한 LOD를 얻을 수는 없지만 혈청 및 전혈에서 0.3mM의 포도당을 검출 할 수 있다고 가정한다.
또한 선형 회귀 분석의 상관 계수는 3D-μPAD가 오류가 적고 신뢰성이 높다는 것을 보여준다(R2> 0.98). 변동 계수 (CV) 값은 10 % 미만이다.
이러한 결과는 다른 방법으로 제조된 3D-μPAD의 결과와 유사하며, 인간 혈청 및 전혈 실험 결과는 PBS로 얻은 결과와 유사하였다.
실험예 8. 진성당뇨병 환자의 전혈 분석
도 14는 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 포도당 농도 증가에 따른 이미지 강도(gray intensity)를 나타낸 것이다.
도 14를 참조하면, 임상 샘플의 전혈 중 포도당 농도가 증가함에 따라 그레이 강도가 증가한 것을 보여준다.
당뇨병은 공복 (FPG) 또는 식후 2시간의 혈장 포도당(2 시간 PG) 중 혈장 포도당 기준에 기초하여 진단하였다. 당뇨병은 7 mmol / L 초과의 FPG 수준 또는 10 mmol / L 초과의 2 시간 PG로 정의된다. 정상은 5.5 mmol / L 미만 또는 2 시간 PG 7.7 mmol / L 미만의 FPG로 정의된다. 당뇨병전기는 정상과 당뇨병 사이 값으로 정의된다.
이미지 강도를 역으로 계산하여 포도당 농도를 추정하면 정상 또는 당뇨병 환자를 구별할 수 있다. 이 기술을 상용 글루코 미터와 비교하고 상관 곡선을 하기 표 1에 기초하여 도 15에 도시하였다.
도 15는 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 상용 글루코미터의 포도당 농도에 따른 보정계수를 나타낸 그래프이다.
환자 번호 글루코미터(mM) 3D-μPAD(mM) CV(%)
1 7.8 8 5.9
2 6.1 6.1 3.37
3 6.6 6.6 1.12
4 6.3 6.5 1.5
5 5.4 5 2.89
6 7.3 6.8 8.8
7 6.5 6.5 0.95
8 12.4 11.3 9.2
상기 표 1은 각 환자의 전혈 시료에서 상용 글루코미터(Accu-Check@ Instant)와 본 발명의 실시예에 따른 3차원 미체유체 장치의 측정결과를 비교한 것이다.
여기서 CV는 보정 계수를 나타낸다.
도 15를 참조하면, R2 값은 0.96이고, CV 값은 10 % 미만이었다. 3D-μPAD의 성능은 글루코 미터와 유사한 것을 확인하였다. 따라서, 3D-μPAD는 환자의 전혈 샘플에 임상적으로 적용 가능하다.
실험예 9. 포도당, 콜레스테롤 및 TG의 동시 검출
3D-μPAD를 사용하여 전혈에서 포도당뿐만 아니라 콜레스테롤 및 TG와 같은 대사 질환과 관련된 여러 바이오 마커를 검출하였다.
도 16은 본 발명의 한 구체예에 따른 3차원 미세유체 장치에서 글루코스, 콜레스테롤 및 TG를 포함하는 다수의 바이오 마커의 비색 검출한 것을 나타낸 것이다.
도 16을 참조하면, 도을 참조하면 3D-μPAD의 저장부에 1mM 포도당, 10mM 콜레스테롤 또는 20mM TG로 첨가된 전혈(spiked blood)을 떨어뜨린 후 각 감지 구역의 색상이 변경되는 것을 확인하였다.
GOx의 존재하에 H2O2 및 MAOS로 인한 포도당은 맑은 청록색으로. CO의 존재 하에 H2O2 및 ADOS로 인하여 콜레스테롤은 적색으로; GPO의 존재 하에 H2O2 및 DAOS로 인해 TG는 청색으로 변화되었다.
따라서, 다수의 바이오 마커가 전혈에서 동시에 검출 될 수 있는 것을 확인하였다.
본 발명은 POC 테스트 키트로서 3차원 미세유체 장치를 제공하며, 임상 적용에 대한 타당성은 환자 혈액 샘플에서 포도당을 검출함으로써 입증되었으며, 테스트 결과는 상용 글루코미터(glucometer)를 사용하여 검증되었다.
디지털광처리 프린팅을 사용하여 PSM이 결합된 3D-μPAD는 결합에 추가적인 공정이 필요하지 않으며, 액체의 유출 또한 없는 것을 확인하였다. 3D-μPAD에 결합된 PSM이 비색 검출에 방해가 되는 적혈구를 적절하게 여과하였으며, 전혈에서 포도당뿐만 아니라 콜레스테롤 및 트라이글리세라이드를 동시에 검출할 수 있는 것을 확인하였다.
본 발명의 한 구체예에 따른 3D-μPAD는 원심분리와 같은 혈액 세포 및 혈장 분리 방법을 수행할 수 없는 현장 진료에서 전혈 내 다양한 바이오마커를 정량적으로 검출할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
100 : 검출부 110 : 기판
120 : 채널 130 : 색 형성 시스템
200 : 멤브레인부 210 : 코팅층
300 : 저장부 400 : 전혈
410 : 적혈구 420 : 포도당
140, 240, 340 : 소수성 장벽

Claims (12)

  1. 광경화성폴리머가 흡수된 여과지에 일정 패턴으로 자외선이 조사되어 중합 생성된 기판과, 상기 기판 일부에 복수개로 형성되며 색 형성 시스템을 포함하는 채널이 구비된 검출부;
    상기 검출부 일면에 중첩하여 결합되고 파릴렌-C(parylene-C) 로 코팅되어 광경화성폴리머 용매에 저항성을 가지며, 외주를 따라 상기 광경화성폴리머가 경화된 소수성 장벽이 구비된 멤브레인부; 및
    상기 멤브레인 일면에서 광경화성폴리머가 자외선에 노출되는 패턴에 따라 경화되어 형성되고 내측에 시료 전혈이 유입되는 저장부;를 포함하는 3차원 미세유체 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 색 형성 시스템은 글루코스 옥시다제(lucose oxidase; GOx), 양고추냉이과산화효소(Horseradish peroxidase; HRP), 및 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-3,5-디메틸아닐린 나트륨 염, 일수화물[N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulphopropyl)-3,5-dimethylaniline sodium salt, monohydrate; MAOS)을 포함하는 포도당 검출 효소인 것을 특징으로 하는 3차원 미세유체 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 멤브레인부는 혈장분리멤브레인(plasma separation membrane; PSM) 이며, 산소 플라즈마 처리되어 친수성인 것을 특징으로 하는 3차원 미세유체 장치.
  4. 제3항에 있어서, 상기 멤브레인부는 126 내지 440 nm의 두께의 파릴렌-C 코팅층을 구비하는 것을 특징으로 하는 3차원 미세유체 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 검출부 내부 일측에는 소수성 장벽이 구비되어 상기 멤브레인부의 소수성 장벽과 결합되는 것을 특징으로 하는 3차원 미세유체 장치.
  6. 제5항에 있어서, 상기 검출부에서 상기 여과지의 두께를 초과하여 형성되는 중합체는 상기 검출부와 상기 멤브레인부를 결합시켜 기밀성을 유지시키는 것을 특징으로 하는 3차원 미세유체 장치.
  7. 제1항에 있어서, 상기 저장부의 직경은 500 μm 내지 12 mm인 것을 특징으로 하는 3차원 미세유체 장치.
  8. 제1항에 있어서, 상기 색 형성 시스템은 포도당, 콜레스트롤(cholesterol) 및 트리글리세라이드(triglyceride; TG)를 동시에 다중 비색 측정하는 것을 특징으로 하는 3차원 미세유체 장치.
  9. (a) 혈장분리멤브레인을 준비하는 단계;
    (b) 여과지에 상기 혈장분리멤브레인을 중첩시키고, 광경화폴리머에 침지시켜 광경화폴리머를 상기 여과지와 혈장분리멤브레인에 흡수시키는 단계;
    (c) 상기 여과지 바닥에 일정한 패턴으로 UV광을 노출시켜 경화시키고, 상기 여과지와 혈장분리멤브레인을 결합시켜 소수성 장벽이 구비된 복합층을 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 복합층을 반전하고, 상기 혈장분리멤브레인 상부에 UV광을 일정한 패턴으로 노출시켜 전혈이 투입되는 저장부를 형성하는 단계를 포함하는 3차원 미세유체 장치 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 혈장분리멤브레인을 준비하는 단계는
    (i) 다이클로로-다이-p-자일릴렌(파릴렌-C)를 증발시키는 단계,
    (ii) 증발된 파릴렌-C를 열분해하여 반응성 자유라디칼로 변환시키는 단계,
    (iii) 진공 하에서 상기 자유라디칼인 파릴렌-C를 상기 혈장분리멤브레인 상에 증착시키고, 중합하여 코팅층을 형성하는 단계,
    (iv) 상기 코팅된 혈장분리멤브레인을 산소 플라즈마 처리하여 친수성으로 변화시키는 단계를 포함하는 포함하는 3차원 미세유체 장치 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 (iii) 단계에서
    상기 코팅층은 상기 파릴렌-C의 첨가량 및 현미경 관찰을 통하여 두께가 126 내지 440 nm로 조절되는 것을 특징으로 하는 3차원 미세유체 장치 제조방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 (c) 단계에서
    상기 소수성 장벽은 0.5 내지 5초간 UV광을 노출하여 형성되는 것을 특징으로 하는 3차원 미세유체 장치 제조방법.
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