KR20210119915A - 아커만시아 뮤시니필라 유래의 tars 또는 이의 단편 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 유래의 TARS(threonyl-tRNA synthetase) 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방, 개선 및 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 본 발명에 따른 아커만시아 뮤시니필라 TARS 또는 이의 단편은 항염증 대식세포인 M2 대식세포의 분화를 촉진시켜 대식세포를 증식시킴으로써 항염증 사이토카인인 IL-10의 분비를 증가시키고 이를 통해 B 세포를 증식시켜 항염증 효과를 나타내는 바, 염증성 질환 뿐만 아니라 염증을 동반하는 면역 질환, 감염 질환 및 대사성 질환의 개선 효과를 나타내며, 특히 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD) 등의 예방 또는 치료에 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

Description

아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편 및 이의 용도{TARS or its fragments from Akkermansia muciniphila and uses thereof}

본 발명은 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 유래의 TARS(threonyl-tRNA synthetase) 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방, 개선 및 치료 용도에 관한 것이다.

인체의 선천 면역에 중요한 역할을 하는 세포막 수용체인 톨-유사 수용체(Toll-like receptor, TLR)들은 미생물로부터 유래된 병원체 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)를 인식하고 어댑터 단백질을 통해 세포 신호 전달을 활성화시켜 염증성 또는 항염증성 면역 반응을 유도한다. 다양한 종, 다양한 세포에 발현되고 인간의 경우 10종의 TLR을 발현하는 것으로 알려져 있다. 이들 중에서 TLR2는 TLR1, TLR6, TLR10과 함께 이성 이량체(heterodimer)를 형성하여 기능을 한다. 이들은 주로 병원체의 세포벽 구성성분(lipoproteins, lipoteichoic acid, zymosan 등)을 인지한다. TLR2에 리간드가 인지된 상황에서, MyD88(Myeloid differentiation primary response gene 88) 및 MAL(MyD88 adaptor-like)/TIRAP(Toll/Interleukin-1 receptor domain-containing adapter protein)-의존적으로 신호전달이 이루어져 NF-kB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)와 AP-1(Activator protein 1) 같은 염증성 전사 인자가 활성화될뿐만 아니라, PI3K(phosphatidylinositol-3-kinase)/AKT(protein kinase B) 신호전달을 통해 항염증성 사이토카인의 생산이 유도된다. 또한, TLR2는 대식세포의 분화 조절에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

대식세포는 병원체나 세포자살 및 괴사에 의한 유해한 자극에 반응하여 염증 반응을 개시한다. 대식세포는 TLR과 사이토카인 수용체의 하위 신호전달를 통해 활성화된다. 활성화된 대식세포는 전사적 및 후생 유전적 변화에 의해 염증성 사이토카인과 케모카인의 생산, 세포의 이동 및 유해물의 제거 등을 야기한다. 염증 후기 단계에서 대식세포는 조직 부상을 야기하는 지속된 염증반응을 막고 염증을 제거하는데 기여한다.

세포 내 미세환경에 따라, 대식세포는 기능적 표현형인 M1와 M2 대식세포로 분리되며 M1은 인터페론-γ, LPS(lipopolysaccharide), 염증성 사이토카인 등에 의해, M2는 IL(interlukin)-4, IL-13 사이토카인 등에 의해 분극화가 촉진된다. M1 대식세포는 주로 IL-6, IL-12 및 TNF(tumor necrosis factor)-α와 같은 염증성 사이토카인 및 케모카인을 분비하며, M2 대식세포는 아르기나제(Arginase)-I, IL-10, TGF(transforming growth factor)-β 등의 항염증성 사이토카인을 분비하여 염증을 감소시키고 면역반응을 억제하는 기능을 한다. 특히, M2 대식세포가 분비하는 IL-10 은 염증반응 억제에 매우 중요한 사이토카인으로 알려져 있으며 B 세포의 증식 및 생존력을 증가시키는 것으로도 보고되어 있다. B 세포는 항체생성을 통해 면역반응 조절에 핵심적인 역할을 하는 것으로 매우 잘 알려져 있으며 이전 연구에서 조절(regulatory) T 세포와 함께 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD)에서 염증반응을 억제하는데 필수적이라고 보고된 바 있다(L Wang, et al., T regulatory cells and B cells cooperate to form a regulatory loop that maintains gut homeostasis and suppresses dextran sulfate sodium-induced colitis, Mucosal Immunol. 2015, 8(6):1297-312).

한편, AARS(aminoacyl-tRNA synthetase)는 단백질 합성의 초기 단계에서 아미노산을 운반 RNA(tRNA)에 연결하는 효소이다. 인간 유래 AARS 단백질들 중 일부는 세포에서 분비되어 다양한 기능을 한다고 알려져 있다. 대표적으로, 특정 환경에서 인간 YARS(tyrosyl-tRNA synthetase)는 세포 밖으로 분비되어 사이토카인과 같은 기능을 하고, 인간 KARS(lysyl-tRNA synthetase)는 면역세포를 자극하여 염증반응을 촉진한다고 알려져 있다. 특히, 인간 TARS(threonyl-tRNA synthetase)는 세포 밖으로 분비되면 염증신호를 매개로 혈관신생을 유도하고, 췌장암세포에서 트레오닌(threonine)이 다량 함유된 뮤신(mucin)의 주요 단백질 중 하나인 MUC1(Mucin 1)의 합성을 늘린다고 보고된 바 있으며, 그 밖에도 무척추동물에서 척추동물로 진화되는 과정의 혈관이나 신경계 등 발달에 필요한 유전자들의 단백질 합성에 필요한 척추동물 특이적인 단백질 합성 개시 복합체의 핵심 구성 인자로써의 기능이 보고된 바 있다.

이러한 인간 AARS들이 세포 밖으로 분비된 후 나타내는 기능들을 토대로, 본 발명자들은 인체 면역 조절을 통해 대사성 질환에 중요한 역할을 한다고 보고된 장 미생물인 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila)가 TARS을 특이적으로 분비하고, 상기 TARS가 대식세포의 IL-10 분비를 촉진시킴으로써 B 세포를 활성화하여 항염증 면역 항상성을 유도한다는 사실을 확인하고, 이를 통해 TARS가 대식세포를 매개로 하여 염증성 질환의 예방, 개선 및 치료 효능이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS(threonyl-tRNA synthetase) 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, B 세포 증식용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 대식세포 증식용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, M2 대식세포 분화용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발며의 또 다른 하나의 목적은 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로써 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS(threonyl-tRNA synthetase) 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "TARS(threonyl-tRNA synthetase)"는 단백질 합성의 초기 단계에서 아미노산을 운반 RNA(tRNA)에 연결하는 효소인 AARS(Aminoacyl-tRNA synthetases) 중 하나로, 인간 유래 AARS 단백질들 중 일부는 세포에서 분비되어 다양한 기능을 한다고 알려져 있다. 대표적으로, 특정 환경에서 인간 YARS(tyrosyl-tRNA synthetase)는 세포 밖으로 분비되어 사이토카인과 같은 기능을 하고, 인간 KARS(lysyl-tRNA synthetase)는 면역세포를 자극하여 염증반응을 촉진한다고 알려져 있다. 특히, 인간 TARS(threonyl-tRNA synthetase)는 세포 밖으로 분비되면 염증신호를 매개로 혈관신생을 유도하고, 췌장암세포에서 트레오닌(threonine)이 다량 함유된 뮤신(mucin)의 주요 단백질 중 하나인 MUC1(Mucin 1)의 합성을 늘린다고 보고된 바 있으며, 그 밖에도 무척추동물에서 척추동물로 진화되는 과정의 혈관이나 신경계 등 발달에 필요한 유전자들의 단백질 합성에 필요한 척추동물 특이적인 단백질 합성 개시 복합체의 핵심 구성 인자로써의 기능이 보고된 바 있다.

본 발명에 있어서, 상기 TARS는 인체 장내 박테리아로부터 유래하는 것일 수 있고, 구체적으로 아커만시아 속(Akkermansia sp.)으로부터 유래하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila)로부터 유래하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 TARS는 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 혼용하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 서열번호 1는 TARS 활성을 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 구체적으로, 상기 서열번호 1는 TARS를 코딩하는 유전자에 의해 코딩되는 TARS 활성을 갖는 단백질 서열일 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 단백질은 구체적으로 아커만시아 속(Akkermansia sp.)으로부터 유래하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila)로부터 유래하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 아미노산과 동일한 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 진뱅크(GenBank)에서 얻을 수 있다(GenBank: ACD05550.1). 상기 TARS는 AmTARS[아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 유래 TARS]와 혼용될 수 있다.

또한, 본 발명에서의 TARS 활성을 갖는 단백질은 비록 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이라고 정의하였으나, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 발명의 TARS 활성을 갖는 단백질에 해당됨은 당업자에게 자명하다.

구체적인 예를 들어, 본 발명의 TARS 활성을 갖는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질도 본 발명의 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

즉, 본 발명에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명하다.

본 발명에서 용어, "상동성" 또는 "동일성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 두 개의 모이티 사이의 상동성이 결정될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에서 상기 TARS를 코딩하는 유전자는 박테리아로부터 유래하는 것일 수 있고, 구체적으로 아커만시아 속(Akkermansia sp.)으로부터 유래하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila)로부터 유래하는 것일 수 있으나, TARS를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 아커만시아 속 미생물이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 TARS를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 염기 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 2의 염기 서열은 공지의 데이터 베이스인 진뱅크(GenBank)에서 얻을 수 있다(GenBank: CP001071.1).

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 TARS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.

또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 본 발명의 TARS 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 해당기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1xSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1xSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1xSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다.

본 발명에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 용어 "단편"은 모서열(parent sequence)의 일부를 의미한다. 예를 들어, 모서열에서 하나 이상의 아미노산이 C 또는 N 말단에서 제거된 형태의 폴리펩티드일 수 있다.

본 출원에서, 효소의 "단편"은 "기능적 단편(functional fragment)"을 지칭하는 것일 수 있다. "기능적 단편"은 활성 단편(active fragment)으로도 지칭될 수 있으며, 모효소의 일부이면서 모효소의 효소 활성을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 효소의 기능적 단편은 효소의 활성 부위(catalytic site)를 포함하는 것일 수 있다.

효소의 단편은 모효소의 전장(full length)의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 모효소의 전장의 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상, 100% 미만의 아미노산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, TARS의 단편은 전술한 아커만시아 뮤시니필라 유래 TARS의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 일부를 의미하며, 아커만시아 뮤시니필라 유래 TARS의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 유래하는 것이면 제한 없이 포함될 수 있다.

구체적으로, 상기 TARS의 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 염기 서열로부터 유래되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 서열번호 1의 99 내지 113번째 아미노산에 상응하는 서열인 서열번호 3; 및 서열번호 1의 290 내지 312번째 아미노산에 상응하는 서열인 서열번호 4; 중 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 TARS의 단편은 서열번호 2의 295 내지 339번째 염기에 상응하는 서열인 서열번호 5; 및 서열번호 2의 868 내지 936번째 염기에 상응하는 서열인 서열번호 6; 중 선택되는 어느 하나 이상의 염기 서열을 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 TARS 또는 이의 단편은 서열번호 3 및/또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 1의 아미노산 서열 중에서 연속하는 14개 내지 630개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드일 수 있다. 일 예로, 상기 펩타이드는 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 일 예로, 상기 펩타이드는 서열번호 3 및 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 발명에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.

예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.

이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.

본 발명의 TARS 또는 이의 단편은 항염증 효과를 나타내는 것으로, 염증성 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "염증성 질환"은 염증을 주병변으로 하는 질환을 총칭한다.

상기 염증성 질환은 예를 들면, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD), 부종, 피부염, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 통풍, 간직성 척추염, 위염, 건선관절염, 골관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 림프관염, 표저(felon), 뇨로감염증, 복막염, 방광염, 신장염, 호흡기 질환 및 패혈증 등을 포함할 수 있고, 구체적으로 염증성 장질환일 수 있으며, 보다 구체적으로 대장염, 궤양성 대장염, 크론병 및 베체트 장염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 염증성 질환은 염증을 동반하는 면역 질환, 대사성 질환 및 감염 질환을 포함할 수 있다.

상기 "염증을 동반하는 면역 질환"은 예를 들면, 자가면역질환, 이식거부, 이식편대숙주병 등이 있으며, 상기 자가면역질환은 구체적으로 아토피, 알레르기, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 자궁내막증, 건선, 천식, 갑상선기능저하증, 갑상선기능항진증, 베체트병, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증 및 전신성 경피증 등을 포함할 수 있고, 구체적으로 염증성 장질환일 수 있으며, 보다 구체적으로 아토피, 알레르기, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 자궁내막증, 건선, 갑상선기능저하증, 갑상선기능항진증 및 천식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

최근, 대사성 질환이 염증성 인자 발현 증가에 의해 발병한다는 연구결과가 보고되고 있는 바, 상기 대사성 질환은 염증에 의해, 또는 염증을 동반하여 발병할 수 있다. 상기 "염증을 동반하는 대사성 질환"은 비만, 당뇨병, 인슐린 저항증(insulin resistance), 지질 대사 이상, 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 유리지방산의 증가, 고밀도 콜레스테롤의 감소 또는 고혈압 등 및 이로부터 유발되는 다양한 합병증을 포함할 수 있고, 구체적으로 비만 및 당뇨병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 "염증을 동반하는 감염 질환"은 바이러스, 세균, 곰팡이, 기생충과 같이 질병을 일으키는 병원체가 동물이나 인간에게 전파, 침입한 것이 원인이 되는 염증성 질환을 의미한다. 상기 염증성 질환은 전술한 바와 같다.

본 발명에 있어서, 상기 TARS 또는 이의 단편은 IL-10의 분비를 증가시킬 수 있다.

또한, 상기 TARS 또는 이의 단편은 IL-6 및/또는 TNF-α의 분비를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 비염증 환경 또는 염증 환경에서 마우스 유래 면역세포인 마우스 골수 유래 대식세포(bone marrow-derived macrophage, BMDM) 및 인간 유래 면역세포인 인간 대식세포 DTHP1에 TARS을 처리하였을 때 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α는 분비되지 않거나 감소한 반면, 항염증 사이토카인인 IL-10은 AmTARS 농도 의존적으로 분비량이 증가하였다(도 3 내지 도 5).

이를 통해, TARS가 IL-10의 분비를 증가시키고, IL-6 및/또는 TNF-α의 분비를 감소시켜 염증성 질환 완화 효과를 유도함을 확인하였다.

전술한 바와 같은 IL-10 분비 증가와 IL-6 및/또는 TNF-α 분비 감소 효과는 아커만시아 뮤시니필라 유래 TARS 특이적으로 발휘되는 효과일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 인체 마이크로바이옴 내 다른 균들의 TARS와 인체 세포가 분비하는 TARS가 아커만시아 뮤시니필라 유래 TARS와 유사한 기능을 하는지 확인하기 위해, 인체 마이크로바이옴 내 균주인 박테로이드 후라길리스(Bacteroides fragilis), 대장균(Escherichia coli), 루미노코커스 브로미(Ruminococcus bromii) 및 인간(Homo sapiens) 유래 TARS(각각 BfTARS, eTARS, RbTARS, hTARS)를 정제하고 비염증 환경 또는 염증 환경에서 BMDM에 처리한 결과, 항염증 사이토카인 IL-10의 분비는 아커만시아 뮤시니필라 유래 TARS 특이적으로 나타나고(도 13), 아커만시아 뮤시니필라 유래 TARS 처리군에서는 단백질 농도 의존적으로 IL-10이 증가되는 것을 확인할 수 있으나, 다른 종의 TARS(BfTARS, eTARS, hTARS)에서는 IL-10의 분비가 LPS 처리 대조군 대비 유의미하게 증가하지 않음을 확인하였다(도 14).

또한, 전술한 바와 같은 TARS의 항염증 효과는 TARS의 단편으로부터 발휘되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, TARS, 기능 부위 1(R1, 서열번호 3), 기능 부위 2(R2, 서열번호 4) 및 이에 세포 내로 잘 전달되기 위한 tag인 Tat tag을 각각 첨가한 Tat-기능 부위 1(Tat-R1), Tat-기능 부위 2(Tat-R2)를 처리하여 면역 사이토카인 분비를 확인한 결과, 염증 환경 조성 시 TARS, R2 및 Tat-R2에 의해 IL-6의 분비는 감소되고, IL-10의 분비는 증가된 것을 확인하였다(도 17).

또한, 동일한 조건에서 기능 부위 2의 농도를 100, 200, 300 μM로 처리하였을 때, R2 100, 300 μM, Tat-R2 100, 200, 300 μM 모두 IL-6의 분비는 감소되고 IL-10의 분비는 증가되는 것을 확인하였다. 그 중에서도, Tat-R2 처리군에서 IL-10 분비가 TARS보다 2배 이상 증가됨을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 TARS 특이적 면역 사이토카인 분비 조절은 TARS의 단편로부터 발휘되는 효과임을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 TARS 또는 이의 단편은 세포내 신호전달체의 인산화를 조절함으로써 염증 반응은 억제하고 항염증 사이토카인 생성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, TARS 처리에 따른 영향을 받는 신호전달체는 p38, JNK(c-Jun N-terminal kinase) 및 NF-kB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)로 확인되었고, ERK(extracellular signal-regulated kinases)의 경우 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. JNK의 경우 TARS 처리 후 30분 뒤부터 인산화가 조절 되면서 영향을 받았고, p38과 NF-kB는 TARS 처리 후 2시간 뒤부터 인산화 정도가 대조군과 확연한 차이가 있었다(도 6).

본 발명에 있어서, 상기 TARS 또는 이의 단편은 대사성 질환과 관련된 세포내 신호전달 조절에 영향을 줄 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 마우스 지방세포 3T3-L1에 인슐린을 처리한 경우 AKT(protein kinase B)가 인산화 되었고, 인슐린 및 PMA를 처리한 경우 인산화가 인슐린 단독 처리에 비해 감소되었다. 그러나, 인슐린 및 PMA를 처리한 후 TARS를 처리한 결과 인산화가 다시 증가되었다(도 7).

또한, TNF-α 처리로 인슐린 저항성이 유도된 경우 인슐린이 처리되어도 AKT의 인산화가 감소하였으며, 이에 TARS를 추가로 처리시 인산화가 증가되었다. 동일 실험에서, AKT 하위 신호전달체인 GSK(glycogen synthase kinase)-3β는 인산화되어 억제되고, mTORC1(mammalian target of rapamycin(mTOR) complex 1)의 영향을 받는 S6K(S6 kinase)는 인산화되어 활성화되는 것을 확인하였다(도 8).

본 발명에 있어서, 상기 TARS 또는 이의 단편은 B 세포를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 염증성 장질환 마우스 모델에 TARS를 투여한 결과, 혈장내 IL-10 사이토카인의 분비가 증가하고 염증반응으로 인해 증가된 IgA의 양이 감소되는 것을 확인하였다. 또한, TARS 투여에 의해 염증성 장질환 완화에 중요한 역할을 하는 것으로 보고된 B 세포의 분포가 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 10).

그러나, B 세포가 결여된 염증성 장질환 마우스 모델에서는 B 세포가 결여되지 않은 정상 마우스와 달리 대장 길이 감소와 대장 조직 손상 개선 효과가 확인되지 않았고, TARS에 의한 B 세포 증가를 볼 수 없었으며 B 세포에 의해 분비되는 IgA의 발현도 일어나지 않는 것을 확인하였다(도 11 내지 도 12).

이를 통해, TARS가 대장에서 B 세포의 분포를 증가시켜 염증성 질환 완화 효과를 유도함을 확인하였다.

또한, 상기 TARS 또는 이의 단편의 항염증 기능은 TLR2(Toll-like receptor 2)과의 상호작용을 통해 일어남을 확인하였다(도 20 내지 도 24).

본 발명에 있어서, 상기 TARS 또는 이의 단편은 대식세포를 증가시킬 수 있다.

또한, 상기 TARS 또는 이의 단편은 대식세포의 M2 대식세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, TARS은 대식세포에 결합하는 것을 확인하였으며 B 세포를 포함한 다른 세포들과는 결합하지 않은 것을 확인하고(도 25), 이를 토대로 TARS의 항염증 효능이 대식세포를 매개하여 이루어지는지를 대식세포가 결핍된 염증성 장질환 마우스 모델에서 확인한 결과, 대식세포가 결핍된 마우스에서는 TARS에 의해 대장에서 B 세포의 분포가 증가하지 않고, 정상 마우스에서 염증반응에 의해 감소되었던 항염증 대식세포인 M2 대식세포의 비율이 TARS에 의해 증가하는 것을 확인하였다(도 27).

본 발명의 다른 일 구현예에서, TARS에 의해 대식세포가 항염증 대식세포로 분화하는 비율이 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 28).

이를 통해, TARS가 항염증 대식세포인 M2 대식세포의 분화를 촉진시켜 IL-10을 분비시키고 이를 신호로 B 세포의 분포를 증가시킴으로써 시스템적으로 항염증 기능을 유도함을 확인하였다.

본 발명은 아커만시아 뮤시니필라 균주의 AARS 중, 특히 TARS가 다양한 염증성 질환의 예방, 개선 또는 및 치료 효과를 가짐을 최초로 확인한 것에 의의가 있다.

특히, 인체 마이크로바이옴 내 다른 균주인 박테로이드 후라길리스, 대장균, 루미노코커스 브로미 및 인간 유래 TARS는 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 유래 TARS와 동일한 기능을 갖는 단백질임에도 불구하고 상기 염증성 또는 항염증 사이토카인 분비에 대한 영향이 아커만시아 뮤시니필라 유래 TARS과 상이한 바, 본 발명에 따른 아커만시아 뮤시니필라 유래 TARS는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료에 현저한 효과가 있음을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여에 의해 염증성 질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 염증성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 내용액제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편은 1일 0.0001 내지 100 μg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 μg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 포유동물에 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한 없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 인간에 적용되는 의약품뿐만 아니라, 동물 의약품의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "개체"는 염증성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 제외한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 약학 조성물을 염증성 질환의 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 염증성 질환의 의심 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명의 약학 조성물은 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 것을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체에든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, B 세포의 분화 또는 증식용 조성물을 제공하는 것이다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

상기 B 세포의 분화 또는 증식용 조성물은 B 세포의 분화 또는 증식을 위한 유도물질로써 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편 외에 당업계에 알려진 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 이에 특별한 제한은 없다.

상기 TARS 또는 이의 단편의 B 세포 분화 및 증식 효과는 전술한 바와 같다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, M2 대식세포의 분화 또는 증식용 조성물을 제공하는 것이다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

상기 M2 대식세포의 분화 또는 증식용 조성물은 M2 대식세포의 분화 또는 증식을 위한 유도물질로써 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편 외에 당업계에 알려진 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 이에 특별한 제한은 없다.

상기 TARS 또는 이의 단편의 M2 대식세포 분화 및 증식 효과는 전술한 바와 같다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "개선"은 상기 조성물을 이용하여 염증성 질환의 의심 및 발명 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 식품학적으로 허용가능한 염은 식품학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염 또는 염기에 의해 형성되는 금속염이 유용하다. 하나의 예로, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산으로는 염산, 황산, 브롬산, 아황산 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레인산, 푸마산, 글루콘산, 메탄술폰산 등을 사용할 수 있다. 또한, 금속염으로는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 사용할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다..

본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 상기 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함할 수 있는 성분으로는, 필수 성분으로 유효성분을 함유하는 외에 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러 생약 추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 식품 조성물에서 유효성분의 함량은 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 보조 첨가제는 당업계에 통상적인 식품 보조 첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 건강보조식품은 건강기능식품 및 건강식품 등을 포함할 수 있다.

상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.

본 발명의 식품 조성물을 포함하는 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품을 제공하는 것이다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치, 예방 또는 개선할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 의미하며, 피부외용제 및 개인위생용품도 포함한다.

본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정 겔일 수 있다. 또한, 본 발명의 의약외품 조성물의 또 다른 예로 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제가 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "사료 조성물"은 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있으며, 당업계의 공지된 다양한 형태로 제조 가능하다.

상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 여기서, 동물이란 가축 및 애완동물을 포함하는 개념이다.

본 발명의 사료 조성물에는 품질 저하를 방지하기 위해 첨가되는 결착제, 유화제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있고, 효용 증대를 위하여 첨가되는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태 질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등을 추가로 포함할 수 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 아커만시아 뮤시니필라 TARS 또는 이의 단편은 항염증 대식세포인 M2 대식세포의 분화를 촉진시켜 대식세포를 증식시킴으로써 항염증 사이토카인인 IL-10의 분비를 증가시키고 이를 통해 B 세포를 증식시켜 항염증 효과를 나타내는 바, 염증성 질환 뿐만 아니라 염증을 동반하는 면역 질환, 감염 질환 및 대사성 질환의 개선 효과를 나타내며, 특히 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD) 등의 예방 또는 치료에 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

도 1은 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 유래 소포체를 분리한 결과이다.
도 2는 아커만시아 뮤시니필라 유래 소포체 및 상층액의 MS(mass spectrometry) 분석 결과이다.
도 3은 AmTARS[아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 유래 TARS] 처리에 따른 BMDM과 DTHP1 세포에서의 사이토카인 발현 분석 결과이다.
도 4는 AmTARS 처리에 따른 염증 환경내 마우스 골수 유래 대식세포(bone marrow-derived macrophage, BMDM)에서의 마우스 사이토카인 발현 분석 결과이다.
도 5 는 AmTARS 처리에 따른 염증 환경내 인간 대식세포(human macrophages, DTHP1)에서의 인간 사이토카인 발현 분석 결과이다.
도 6은 LPS(lipopolysaccharide) 유도된 염증 환경에서 AmTARS 처리 유무에 따른 Raw 264.7 세포에서의 신호전달 결과이다.
도 7은 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 처리를 통한 대사성 염증 반응을 유도한 상황에서 AmTARS 처리에 따른 마우스 지방세포 3T3-L1에서의 신호전달 결과이다.
도 8은 TNF-α 처리를 통한 대사성 염증반응을 유도한 상황에서 AmTARS 처리에 따른 3T3-L1 세포에서의 신호전달 결과이다.
도 9는 염증성 장질환 마우스 모델에서 AmTARS 처리에 의한 병변 지수, 대장 길이, 대장 조직 손상을 분석한 결과이다.
도 10은 염증성 장질환 마우스 모델에서 AmTARS 처리에 의한 IL-10, IgA, 세포 분포 변화 분석 결과이다.
도 11은 염증성 장질환이 유도된 B 세포 결핍 또는 정상 마우스 모델에서 AmTARS 처리에 의한 대장 길이, 대장 조직 손상을 분석한 결과이다.
도 12는 염증성 장질환이 유도된 B세포 결핍 마우스 또는 정상 모델에서 AmTARS 처리에 의한 IgA, 세포 분포 변화 분석 결과이다.
도 13은 마이크로바이옴 및 인간 유래 주요 TARS 단백질 처리에 따른 BMDM 세포에서의 마우스 사이토카인 발현 분석 결과이다.
도 14는 AmTARS 특이적 단백질 서열 분석 결과이다.
도 15는 AmTARS 기능 부위 1, 2가 각각 결손된 단백질에 대한 효소 활성 및 이를 처리한 BMDM 세포에서의 IL-10사이토카인 발현 분석 결과이다.
도 16은 AmTARS 기능 부위 1, 2가 각각 결손된 단백질을 처리한 염증 환경내 Raw264.7 세포에서의 마우스 사이토카인 발현 분석 결과이다.
도 17은 AmTARS 기능 부위 1, 2 펩타이드를 처리한 염증 환경내 BMDM 세포에서의 마우스 사이토카인 발현 분석 결과이다.
도 18은 염증성 장질환 마우스 모델에서 AmTARS 기능 부위 1, 2가 각각 결손된 단백질 처리에 의한 병변 지수, 대장 길이, 대장 조직 손상을 분석한 결과이다.
도 19는 염증성 장질환 마우스 모델에서 AmTARS 기능 부위 1, 2가 각각 결손된 단백질 처리에 의한 IgA, 세포 분포 변화 분석 결과이다.
도 20은 AmTARS와 상호작용하는 단백질을 분석한 결과이다.
도 21은 AmTARS와 상호작용하는 단백질들의 MS 분석 결과이다.
도 22는 AmTARS와 TLR2의 결합 분석 결과이다.
도 23은 염증성 장질환이 유도된 TLR2 결핍 또는 정상 마우스 모델에서 AmTARS 처리에 의한 대장 길이, 대장 조직 손상을 분석한 결과이다.
도 24는 염증성 장질환이 유도된 TLR2 결핍 또는 정상 마우스 모델에서 AmTARS 처리에 의한 IgA, 세포 분포 변화 분석 결과이다.
도 25는 마우스에서 AmTARS가 표적으로 하는 면역세포를 분석한 결과이다.
도 26은 염증성 장질환이 유도된 대식세포 결핍 또는 정상 마우스 모델에서 AmTARS 처리에 의한 대장 길이, 대장 조직 손상, IgA를 분석한 결과이다.
도 27은 염증성 장질환이 유도된 대식세포 결핍 또는 정상 마우스 모델에서 AmTARS 처리에 의한 세포 분포 변화 분석 결과이다.
도 28은 AmTARS 처리에 따른 염증 대식세포 분화를 분석한 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 아커만시아 뮤시니필라( Akkermansia muciniphila )의 분비 단백질, 소포체 분리 및 프로테옴 분석

아커만시아 뮤시니필라를 BTTM(basal tryptone threonine medium) 배지에 접종 후, 혐기 조건을 유지하며 하루 동안 배양하였다. 박테리아 배양액 1 L를 모은 후, 순차적으로 원심분리를 3회 수행(500 x g, 5000 x g, 15000 x g, 각 30분)한 후 0.22 μm 크기의 필터로 여과하여 박테리아를 제거하여 배양액(supernatant)만을 수득하였다. 배양액을 농축하기 위해 10 kDa 컷-오프(cut-off) 필터가 부착된 퀵스스탠드(QuixStand) 기기를 사용하였고, 100 mL로 농축 후 배양액을 다시 15000 x g, 30분간 원심분리하고 0.22 μm 필터로 여과하였다. 마지막으로 200000 x g에서 2시간 동안 초고속 원심분리하여 소포체(vesicle)를 포함한 펠렛을 수득하였다.

동적광산란법(dynamic light scattering, DLS)으로 펠렛 내 소포체의 크기를 확인한 결과, 소포체가 30-100 nm(평균 42 nm) 크기의 입자임을 확인하였고, 전자현미경(transmission electron microscopy, TEM) 분석을 통해 구 형태임을 확인하였다(도 1).

이후, 수득한 펠렛을 용해 버퍼[50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 100 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 0.25% Na-데옥시콜레이트(Na-deoxycholate) 및 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail) 포함]를 이용하여 용해시키고, 용해물 및 배양액을 각각 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리 한 뒤, 20 μg으로 단백질을 정량하여 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시하였다. SDS-PAGE 상에서 분리된 단백질을 PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인으로 이동시키고, 1X TBST(137 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 0.1% Tween 20) 및 4% BSA 용액으로 1시간 30분 동안 반응시켰다.

아커만시아 뮤시니필라 유래 AARS(Aminoacyl-tRNA synthetases)인 TARS(threonyl-tRNA synthetase), YARS(tyrosyl-tRNA synthetase, PARS(prolyl-tRNA synthetase) 및 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)에 대한 항체로 토끼에서 항체(polyclonal antibody)를 각각 제작하였다. 고순도의 AmTARS, AmYARS, AmPARS 및 AmGAPDH 단백질을 항원으로 하여, 각 항원당 토끼 2마리에 3번씩 접종하였다. 접종을 마친 후 ELISA를 통해 혈청 내 항원 특이적 항체가 형성된 개체를 선정하고, 확보한 혈청을 친화성 정제하여 다클론 항체를 획득하였다.

1X TBST, 4% BSA 용액에 각각의 항체를 사용 농도에 따라 희석한 후 멤브레인에서 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 쿠마씨 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue, CBB) 염색을 통해 구성 단백질의 패턴을 분석하였다. 각 샘플을 3등분하여 LC-MS/MS(liquid chromatography-tandem mass spectrometry) 분석하고 AARS를 포함한 단백질을 동정하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 정제 과정을 거칠수록 상층액에 존재하는 단백질들의 양이 감소하는 것을 확인하였다.

또한, 소포체가 포함된 펠렛에서는 아커만시아 뮤시니필라 유래 AARS 중 AmTARS[아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 유래 TARS]가 가장 많이 존재하고, AmYARS(아커만시아 뮤시니필라 유래 YARS), AmPARS(아커만시아 뮤시니필라 유래 PARS)는 상대적으로 적은 양으로 존재하는 것을 확인하였다.

본 실시예에서, 모든 His tag이 달린 단백질들은 대장균(Escherichia coli, E. coli)를 이용하여 in vitro에서 정제되었다. 먼저, 열 충격법을 통해 pET21a-AmTARS를 균체 내로 도입한 후 암피실린(ampicillin) 항생제를 이용해 유전자가 포함된 세포를 선별하여 액체 배양하였다. 원심분리법을 이용하여 배양된 세포를 획득한 후, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸(imidazole) 용액을 이용하여 현탁하였다. 초음파 분해 처리법을 이용하여 세포를 용해시킨 후 고속 원심분리 법을 이용하여 상층액을 획득하였다. 친화성 크로마토그래피(Ni-NTA agarose affinity chromatography) 방법을 이용하여 AmTARS-His 단백질을 정제하였다. 얻어진 단백질은 1X PBS (pH 7.4) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 K2HPO4) 용액으로 집중 투석된 후, 균의 LPS(Lipopolysaccharide)를 제거하기 위해 Y Aida et al. (1990) 의 논문을 토대로 TX-114를 이용한 LPS 제거법을 통해 고 순도의 단백질을 획득하였다. AmTARS△1, AmTARS△2, AmYARS, AmPARS, AmGAPDH, BfTARS, eTARS, RbTARS 및 hTARS 단백질 또한 동일한 방법으로 수득하였다.

Strep tag이 달린 단백질의 경우 포유류 세포인 HEK293T 세포를 사용하였고, 여러 번의 세포 계대를 통해 150 mm 배양접시 50-100장을 배양하였다. pEXPR-IBA105-AmTARS를 세포에 형질 도입하기 위해 PEI(polyethylenimine)를 이용하였다. 도입 후 24시간 배양하였을 때 원심분리법을 이용하여 세포를 획득하였다. 100 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1X 프로테아제 억제제(1X protease inhibitor, GenDEPOT), 1X 포스파타제 억제제(1X phosphatase inhibitor, GenDEPOT) 용액에 세포를 현탁한 후, 회전기기를 이용하여 4℃에서 30분간 반응하였다. 고속 원심분리를 통해 상층액을 획득하였고 이를 친화성 크로마토그래피(Strep-Tactin agarose affinity chromatography) 방법을 이용하여 Strep-AmTARS을 정제하였다. 얻어진 단백질은 1X PBS(pH 7.4) 용액으로 집중 투석(dialysis) 후 실험에 사용되었다.

FLAG tag이 달린 단백질의 경우 FLAG M2 친화성 젤을 이용하여 친화성 크로마토그래피 방법을 통해 정제하였다.

본 실시예에서 사용된 DNA construct는 하기 표 1과 같다.

	명칭	서열번호	발현 벡터	태그(tag)	발현 시스템
1	AmTARS	2	pEXPR-IBA105	2XStrep	Mammal
2	AmTARS	2	pET21a(+)	6XHis	Bacteria
3	AmTARS△1	7	pET21a(+)	6XHis	Bacteria
4	AmTARS△2	8	pET21a(+)	6XHis	Bacteria
5	AmTARS△1△2	9	pEXPR-IBA105	2XStrep	Mammal
6	AmYARS	10	pET21a(+)	6XHis	Bacteria
7	AmPARS	11	pET21a(+)	6XHis	Bacteria
8	AmGAPDH	12	pET21a(+)	6XHis	Bacteria
9	BfTARS	13	pET21a(+)	6XHis	Bacteria
10	eTARS	14	pET21a(+)	6XHis	Bacteria
11	RbTARS	15	pET21a(+)	6XHis	Bacteria
12	hTARS	16	pET21a(+)	6XHis	Bacteria
13	TLR2	17	pIRES-FLAG	FLAG	Mammal

실시예 2. AmTARS 처리에 따른 면역세포 분비 사이토카인 분석

아커만시아 뮤시니필라는 장내 환경에서 면역 사이토카인을 조절한다고 알려져 있는 바, AmTARS을 처리하였을 때도 면역세포에서 사이토카인 분비가 일어나는지 확인하기 위해, 포유류 유래 면역세포를 이용하여 ELISA를 실시하였다.

구체적으로, 마우스 유래 면역세포인 마우스 골수 유래 대식세포(bone marrow-derived macrophage, BMDM)를 마우스 넓적다리 뼈와 정강이뼈에서 추출한 후 10% FBS(fetal bovine serum)와 항생제를 함유하고 있는 DMEM 배지에서 배양하였다. 인간 유래 면역세포인 인간 대식세포(human macrophages, DTHP1)는 10% FBS와 항생제를 함유하고 있는 RPMI 배지에서 배양하였다.

배양된 세포에 AmTARS 0.1, 0.2, 0.5 μM 을 24시간 동안 처리하여 세포 배양액을 수득하였다. 세포를 제거하기 위하여 배지를 500 x g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하고, 이를 ELISA 세트[mouse IL(interlukin)-6, mouse IL-10, mouse TNF(tumor necrosis factor)-α, human IL-6, human IL-10, human TNF-α; BD Biosciences]로 분석하여 마우스와 인간 유래 면역 사이토카인 분비를 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, BMDM에 AmTARS을 처리하였을 때 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α는 분비되지 않은 반면, 항염증 사이토카인인 IL-10은 AmTARS 농도 의존적으로 분비량이 증가하였다.

또한, DTHP1에서도 BMDM의 경우와 동일하게 AmTARS을 처리하였을 때 IL-6와 TNF-α는 분비되지 않은 반면, IL-10은 AmTARS 농도 의존적으로 분비량이 증가함을 확인하였다.

이를 통해, AmTARS가 면역세포로부터 항염증성 사이토카인인 IL-10의 분비를 유도함을 확인하였다.

실시예 3. 염증 환경에서 AmTARS의 사이토카인 분비 조절

세포 염증이 유도된 상황에서 AmTARS가 면역 사이토카인 분비에 영향을 주는지 확인하기 위해, 마우스 유래 면역세포인 마우스 골수 유래 대식세포 BMDM과 인간 유래 면역세포인 인간 대식세포 DTHP1을 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하였다.

구체적으로, 배양한 BMDM 및 DTHP1에 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 염증 반응을 유도하고, 동시에 AmTARS 0.1, 0.2, 0.5 μM 을 24시간 동안 처리하여 세포 배양액을 수득하였다. 수득한 세포 배양액에 대해 실시예 2와 동일한 방법으로 면역 사이토카인 분비를 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 염증이 유도된 BMDM에 AmTARS을 처리하였을 때 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α의 분비는 AmTARS 농도 의존적으로 감소한 반면, 항염증 사이토카인인 IL-10은 AmTARS 농도 의존적으로 분비량이 증가하였다.

또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 염증이 유도된 DTHP1에서도 BMDM의 경우와 동일하게 AmTARS을 처리하였을 때 IL-6, TNF-α은 AmTARS 농도 의존적으로 감소한 반면, IL-10은 AmTARS 농도 의존적으로 증가하였다.

이를 통해, 염증이 유도된 상황에서 AmTARS가 세포의 염증 반응은 억제하고 항염증 사이토카인 생성을 증가시키는 것을 확인하였다.

실시예 4. AmTARS의 염증 질환 관련 세포내 신호전달 조절 기능 분석

AmTARS의 면역 사이토카인 분비 조절에 따른 항염증 효과가 어떤 신호전달 경로를 통해 조절이 되는지 확인하기 위해, 마우스 유래 면역세포인 마우스 대식세포 Raw264.7에 LPS 처리를 통한 염증 환경을 조성한 후 AmTARS 처리 유무 및 시간 경과(0.5 ~ 3시간)에 따른 면역 사이토카인 분비 조절에 관여하는 신호전달체의 인산화 변화를 확인하였다. Raw264.7 세포는 10% FBS와 항생제를 함유하고 있는 DMEM (Hyclone) 배지에서 배양하였다.

그 결과, 도 6 에 나타난 바와 같이, AmTARS 처리에 따른 영향을 받는 신호전달체는 p38, JNK(c-Jun N-terminal kinase) 및 NF-kB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)로 확인되었고, ERK(extracellular signal-regulated kinases)의 경우 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. JNK의 경우 AmTARS 처리 후 30분 뒤부터 인산화가 조절 되면서 영향을 받았고, p38과 NF-kB는 AmTARS 처리 후 2시간 뒤부터 인산화 정도가 대조군과 확연한 차이가 있었다.

다음으로, AmTARS의 항염증 기능이 대사성 질환과 관련된 세포내 신호전달 조절에 영향을 주는지 확인하기 위해, 마우스 지방세포 3T3-L1를 이용하여 면역 블롯 분석을 실시하였다.

구체적으로, 3T3-L1 세포는 10% BCS(bovine calf serum)와 항생제를 함유하고 있는 DMEM 배지에서 5% CO₂, 37℃의 조건으로 배양하였다. 배양된 세포에 염증 환경을 조성하기 위해 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 2 μM 또는 TNF-α 20 ng/ml을 처리하고, 인슐린 100 nM과 AmTARS 0.5 μM을 24시간 동안 처리한 뒤 세포내 신호전달의 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 아무런 처리를 하지 않은 대조군(control)에 비해 인슐린을 처리한 경우 AKT(protein kinase B)가 인산화 되었고, 인슐린 및 PMA를 처리한 경우 인산화가 인슐린 단독 처리에 비해 감소되었다. 그러나, 인슐린 및 PMA를 처리한 후 AmTARS을 처리한 결과 인산화가 다시 증가되었다.

또한, 도 8에 나타난 바와 같이, TNF-α 처리로 인슐린 저항성이 유도된 경우 인슐린이 처리되어도 AKT의 인산화가 감소하였으며, 이에 AmTARS을 추가로 처리시 인산화가 증가되었다. 동일 실험에서, AKT 하위 신호전달체인 GSK(glycogen synthase kinase)-3β는 인산화되어 억제되고, mTORC1(mammalian target of rapamycin(mTOR) complex 1)의 영향을 받는 S6K(S6 kinase)는 인산화되어 활성화되었다. 그러나 인슐린 신호전달에서 AKT 상위 신호전달체인 IRS(insulin receptor substrate)는 큰 변화를 나타내지 않았다.

이를 통해, 세포 염증이 유도된 상황에서 AmTARS 처리시 세포내 신호전달체의 인산화를 조절함으로써 염증 반응은 억제하고 항염증 사이토카인 생성을 증가시키는 것을 확인하였으며, 대사성 질환과 관련된 세포내 신호전달 조절에 영향을 주는 것을 확인하였다.

실시예 5. 염증성 장질환((inflammatory bowel disease, IBD) 마우스 모델에서 AmTARS의 항염증 효능 검증

세포 실험을 통해 AmTARS가 면역 사이토카인 조절을 통해 항염증 기능을 있다는 것을 확인함에 따라 염증성 장질환 마우스 모델에서 AmTARS의 효능을 검증하기 위한 실험을 수행하였다.

구체적으로, 염증성 장질환을 유도하기 위하여 DSS(Dextran sulfate sodium)를 8주령 C57BL/6 수컷 마우스에 2% 농도로 10일간 음수시켰으며, AmTARS를 DSS 투여 1주일 전(Pre-AmTARS)과 DSS 투여 후(Post-AmTARS)의 두 가지 경로로 2일에 1회 복강 주사(0.1 mg/kg 농도)를 통해 투여한 후 항염증 효능을 확인하였다.

IgA를 측정하기 위해, 마우스의 변을 채취하여 단백질 억제제가 포함된 PBS에 희석한 후 불순물을 제거한 상층액을 얻어 96-웰 플레이트에 100 μl씩 4℃에서 2시간 동안 단백질을 코팅하였다. 세척 용액(50 mM Tris, 0.2% in PBS)으로 3회 세척 후, 100 μl의 블로킹 용액을 넣고 1∼2시간동안 상온 반응 후 세척하였다. HRP-접합 IgA 항체(1:3000)를 넣은 후 1시간 동안 상온 반응시키고 세척하였다. 이에 100 μl의 기질 용액을 넣고 30분간 반응 후, 50 μl의 정지 용액을 넣고 405~450 nm에서 ELISA 리더기로 측정하였다.

대장 조직을 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 고정시켜 냉동 절편을 제작한 후 10 μm 두께로 박절하여 슬라이드를 제작하였다. 슬라이드를 헤마톡실린(Hematoxylin)에 1~3분, 에오신(Eosin)에 30초 반응 시킨 후 탈수하여 형광현미경으로 관찰하였다.

또한, 병변 지수(Disease activity score)는 혈변, 설사, 몸무게 감소 항목을 각 0-4 점수를 합산하여 계산하였고, 상피 손상 지수(epithelial damage score)는 대장 조직의 손상 정도에 따라 0-4점수를 부여하여 계산하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, DSS 투여 전후 AmTARS 투여에 의해서 병변 지수, 대장 길이 감소, 대장 조직 손상 등이 완화되는 것을 확인하였다.

또한, 도 10에 나타난 바와 같이, AmTARS 투여에 의해서 마우스 혈장내 IL-10 사이토카인의 분비가 증가하고 염증반응으로 인해 증가된 IgA의 양이 감소되는 것을 확인하였다. 또한, AmTARS에 의해 염증성 장질환 완화에 중요한 역할을 하는 것으로 보고된 B 세포의 분포가 현저히 증가하였다.

이를 통해, AmTARS에 의한 IL-10 사이토카인 분비가 염증성 장질환의 완화 효과를 유도하는 것을 확인하였으며 이는 B 세포 매개 효과인 것으로 예상되었다.

실시예 6. 염증성 장질환 마우스 모델에서 B 세포 매개 AmTARS의 항염증 효능 검증

AmTARS에 의한 IL-10 사이토카인 분비가 염증성 장질환의 완화 효과가 B 세포 매개 효과인지 확인하기 위해 B 세포가 결여된 μMut 마우스(μ heavy chain mutation mouse, B cell depletion mouse)에 실시예 5와 동일한 방법으로 DSS를 투여하여 염증성 장질환을 유도하고, AmTARS을 투여하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 정상 마우스에서는 AmTARS에 의해 염증성 장질환에 의한 대장 길이 감소와 대장 조직 손상이 개선되었으나 B 세포가 결여된 마우스에서는 AmTARS에 의한 개선 효과가 관찰되지 않았다.

또한, 도 12에 나타난 바와 같이, B 세포가 결여된 마우스에서는 정상 마우스에서 보여지는 AmTARS에 의한 B 세포 증가를 볼 수 없었으며 B 세포에 의해 분비되는 IgA의 발현도 일어나지 않는 것을 확인하였다.

이를 통해, AmTARS가 대장에서 B 세포의 분포를 증가시켜 염증성 장질환 완화 효과를 유도함을 확인하였다.

실시예 7. 인체 마이크로바이옴내 주요 미생물 및 인간 유래 TARS의 기능 비교 분석

인체 마이크로바이옴 내 다른 균들의 TARS와 인체 세포가 분비하는 TARS가 AmTARS와 유사한 기능을 하는지 확인하기 위해, 인체 마이크로바이옴 내 균주인 박테로이드 후라길리스(Bacteroides fragilis), E. coli, 루미노코커스 브로미(Ruminococcus bromii) 및 인간(Homo sapiens) 유래 TARS(각각 BfTARS, eTARS, RbTARS, hTARS)를 정제하고 면역 세포를 이용하여 ELISA를 실시하였다.

구체적으로, pET21a 벡터에 결합된 AmTARS, pET21a 벡터에 결합된 BfTARS, pET21a 벡터에 결합된 eTARS, pET21a 벡터에 결합된 RbTARS 및 pET21a 벡터에 결합된 hTARS를 열충격법을 통해 대장균내로 각각 도입한 후 암피실린 항생제를 이용해 유전자가 포함된 세포를 선별하여 액체 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 세포를 수득한 후, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸 용액을 이용하여 현탁하였다. 초음파 분해 처리법을 이용하여 세포를 용해시킨 후 고속 원심분리하여 상층액을 획득하였다. 상층액을 친화성 크로마토그래피(Ni-NTA agarose affinity chromatography)에 통과시켜 AmTARS-His, BfTARS-His, eTARS-His, RbTARS-His 및 hTARS-His 단백질을 정제하였다. 얻어진 단백질은 1X PBS(pH 7.4) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2K₂HPO₄) 용액으로 집중 투석하고, TX-114를 이용해 대장균의 LPS(Lipopolysaccharide)를 제거하여 고순도의 단백질을 획득하였다(도 13, 좌측).

이후, 실시예 2와 동일한 방법으로 BMDM에 각 TARS(AmTARS, BfTARS, eTARS 및 RbTARS)를 처리하고 ELISA를 수행하여 IL-10의 분비를 확인하였다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 항염증 사이토카인 IL-10의 분비는 AmTARS 특이적으로 나타나는 것을 확인하였다.

다음으로, 실시예 3과 동일한 방법으로 BMBM에 LPS를 처리하여 염증 환경을 조성한 후 각 TARS(AmTARS, BfTARS, eTARS, hTARS)를 처리하여 IL-10의 분비를 확인하였다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, AmTARS 처리군에서는 단백질 농도 의존적으로 IL-10이 증가되는 것을 확인할 수 있으나, 다른 종의 TARS(BfTARS, eTARS, hTARS)에서는 IL-10의 분비가 LPS 처리 대조군 대비 유의미하게 증가하지 않음을 확인하였다.

이를 통해, 마이크로바이옴내 균주 유래 TARS의 면역 반응에서 기능을 비교한 결과, IL-10 분비 증가를 통한 항염증 반응은 AmTARS 처리시에만 나타나는 현상임을 확인하였다.

실시예 8. AmTARS 기능 부위 분석

AmTARS 내 항염증 기능 부위를 찾기 위해, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래 TARS 구조(PDB: 1NYQ) 를 기반으로 다양한 종(Akkermansia muciniphila, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, Escherichia coli, Homo sapiens, Bifidobacterium bifidum, Faeculibacterium prausnitzii) 유래 TARS 아미노산 서열을 분석하여 아커만시아 뮤시니필라에서만 발견되는 특이적 아미노산 서열 두 부분을 확인하였다. 이 두 부분을 각각 기능 부위 1, 기능 부위 2로 명명하였다(도 14).

기능 부위로 예상되는 두 부분[기능 부위 1(서열번호 5, 서열번호 2의 295-339번째 염기 서열) 및 기능 부위 2(서열번호 6, 서열번호 2의 868-936번째 염기 서열)]이 각각 결손된 돌연변이를 표 1에 따라 제작하였다. 기능 부위 1이 결손된 돌연변이는 AmTARS△1, 기능 부위 2가 결손된 돌연변이는 AmTARS△2로 명명하였다.

AmTARS△1 및 AmTARS△2를 정제하기 위해, pET21a 벡터에 결합된 AmTARS△1, pET21a 벡터에 결합된 AmTARS△2를 열충격법을 통해 대장균 내로 각각 도입한 후 암피실린 항생제를 이용해 유전자가 포함된 세포를 선별하여 액체 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 세포를 수득한 후, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸 용액을 이용하여 현탁하였다. 초음파 분해 처리법을 이용하여 세포를 용해시킨 후 고속 원심분리하여 상층액을 획득하였다. 상층액을 친화성 크로마토그래피(Ni-NTA agarose affinity chromatography)에 통과시켜 AmTARS△1-His 및 AmTARS△2-His 단백질을 정제하였다. 얻어진 단백질은 1X PBS (pH 7.4) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO₄, 2K₂HPO₄) 용액으로 집중 투석한 후, TX-114를 이용해 대장균의 LPS를 제거하여 고순도의 단백질을 획득하였다(도 15).

TARS는 단백질 합성에 관여하는 아미노아실화 촉매 효소로 그 기능에 관여하는 도메인 및 부위가 잘 알려져 있다. 제작된 결손 돌연변이는 상기 기능과 관계없는 부분이 결손된 것을 확인하였으나, 결손 돌연변이가 고유의 기능을 제대로 수행하는지 확인하기 위해 아미노아실화 반응 실험을 수행하였다.

구체적으로, 2배 반응 용액(100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM MgCl₂, 200 mM NaCl, 200 mM KCl, 2 mM DTT, 500 μM ATP 및 5 mM L-트레오닌(threonine))을 준비하고 25 μl 반응 용액, 20 μl 증류수 및 5 μl 단백질을 넣어 최종 50 μl 를 만들어 30분 반응하였다. 그 후 공작석 녹색 인산염 분석 키트(malachite green phosphate assay kit, Bioassay systems)를 사용하여 30분 동안 반응시키고 유리된 단인산기(Pi)를 620 nm 파장에서 측정하였다.

그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 트레오닌 아미노산 특이적 반응 대조군으로 사용된 AmYARS 에서는 반응이 나타나지 않았고, AmTARS, AmTARS△1 및 AmTARS△2 모두 아미노아실화 반응을 나타내었다. 이에 따라, 결손 부위가 단백질 고유의 기능에는 영향이 없음을 확인하였다.

다음으로, 실시예 2와 동일한 방법으로 BMDM에 AmTARS, AmTARS△1 및 AmTARS△2를 각각 처리하여 ELISA로 분석한 결과, AmTARS△1 및 AmTARS△2는 AmTARS와 달리 IL-10 분비가 증가하지 않음을 확인하였다.

다음으로, 염증 환경에서 AmTARS의 면역 사이토카인 분비 조절이 두 기능 부위에 의해 유도되는지 확인하기 위해, 실시예 3의 방법으로 마우스 유래 면역세포 Raw 264.7에 LPS를 처리하여 면역반응을 유도하고, AmTARS, AmTARS△1 및 AmTARS△2를 각각 24시간 동안 처리하여 세포 배양액을 수득하였다. 수득한 세포 배양액은 실시예 2와 동일한 방법으로 면역 사이토카인 분비를 분석하였다.

그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, AmTARS 처리시 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α의 분비는 단백질 농도 의존적 감소를 보였고, IL-10은 AmTARS 농도 의존적으로 분비량이 증가한 반면, AmTARS△1 및 AmTARS△2 처리시 IL-6, TNF-α 및 IL-10의 분비에 영향이 없는 것을 확인하였다.

상기 결손 부위인 기능 부위 1, 기능 부위 2가 AmTARS의 항염증 효과를 나타내는 부분인지 확인하기 위해, 각각 서열을 펩타이드로 제작하여 그 효과를 확인하였다.

기능 부위 1, 기능 부위 2 및 이에 세포 내로 잘 전달되기 위한 tag인 Tat tag을 각각 첨가한 것까지 총 4종의 단편(AmTARS, 기능 부위 1(R1, 서열번호 3), 기능 부위 2(R2, 서열번호 4), Tat-기능 부위 1(Tat-R1) 및 Tat-기능 부위 2(Tat-R2))을 합성하였다.

실시예 3과 동일한 방법으로 BMDM에 LPS로 염증 환경을 조성한 후 상기 4종의 단편을 처리하여 면역 사이토카인 분비를 ELISA로 측정하였다.

그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 염증 환경 조성 시 AmTARS, R2 및 Tat-R2에 의해 IL-6의 분비는 감소되고, IL-10의 분비는 증가된 것을 확인하였다.

또한, 동일한 조건에서 기능 부위 2의 농도를 100, 200, 300 μM로 처리하였을 때, R2 100, 300 μM, Tat-R2 100, 200, 300 μM 모두 IL-6의 분비는 감소되고 IL-10의 분비는 증가되는 것을 확인하였다. 그 중에서도, Tat-R2 처리군에서 IL-10 분비가 AmTARS보다 2배 이상 증가됨을 확인하였다.

이를 통해, AmTARS 특이적 면역 사이토카인 분비 조절은 기능 부위 1, 기능 부위 2로부터 발휘되는 효과임을 확인하였다.

실시예 9. 염증성 장질환 마우스 모델에서 AmTARS 기능 부위 효능 검증

AmTARS의 특이적 기능 부위의 항염증 효능을 검증하기 위해 실시예 5의 염증성 장질환 마우스 모델에 AmTARS, AmTARS△1 및 AmTARS△2을 각각 투여한 후 항염증 효능 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이, AmTARS와 달리 AmTARS△1와 AmTARS△2에서는 염증성장질환에 의해 유도된 병변 지수, 대장 길이 감소, 대장 조직 손상에 대한 완화 효과가 나타나지 않았다.

또한, 도 19에 나타난 바와 같이, AmTARS와 달리 AmTARS△1와 AmTARS△2에서는 대장의 B 세포를 증가시키는 효능이 감소되는 것을 확인하였으며, 염증성 장질환에 의해 증가한 IgA의 양의 감소 효과도 나타내지 않았다.

이를 통해, AmTARS가 항염증 효능을 나타내기 위해서는 기능 부위 1, 기능 부위 2가 필수적임을 확인하였다.

실시예 10. AmTARS의 인체 상호작용체 분석

AmTARS가 항염증 기능을 나타내는데 있어 상호작용하는 인체 단백질인 상호작용체를 발굴하기 위해 인간 유래 면역세포 DTHP1의 세포막 및 세포 용출물에 AmTARS을 반응시켰다.

구체적으로, DTHP1를 Mem-PER^TM Plus Membrane Protein Extraction Kit를 사용하여 세포질과 세포막 성분으로 분리하였다. 분리된 용출물에 His tag이 달린 AmTARS을 반응시킨 후 His tag 레진으로 pull-down 하였다. 레진에 결합한 단백질을 용출시킨 후, SDS-PAGE 젤에 걸어 CBB 염색법으로 단백질을 확인하였다.

그 결과, 도 20에 나타난 바와 같이, AmTARS을 비롯한 많은 단백질이 같이 침전된 것을 확인하였다.

다음으로, 젤을 크게 5등분하여 LC-MS/MS(Liquid Chromatograph-Tandem Mass Spectrometer) 분석을 진행하였다. 분석하고자 하는 부분의 젤을 1.5ml 튜브에 담았다. 25 mM ABC(Ammonium bicarbonat)/50% ACN(Acetonitrile)으로 젤이 투명해질 때까지 탈염색화하였다. 이후 10 mM DTT(DL-Dithiothreitol)와 55 mM IAA(Iodoacetamide)를 넣어 환원 및 알킬화(alkylation)시켰다. 반응이 끝나면 젤을 말린 후, 0.0125 μg/μl 트립신을 젤 부피만큼 첨가하여 밤새 반응시켰다. 이후 시료를 회수한 후 진공 펌프로 말렸다.

시료는 2% ACN/0.1% FA(Formic acid) 용액 10 μl로 녹여서 5 μl 주입하였다. 분석에 사용한 장비는 Thermo사의 LTQ-Orbitrap Elite와 easy-nanoLC1000이었고, LC에 사용된 용액 A는 0.1% FA/물, 용액 B는 0.1% FA/ACN이고, 구배는 120분 동안 2%에서 32% 용액 B로 흘려주었으며, 유속은 0.3 μl/min이었다. 사용한 트랩 컬럼은 pepamap 100(75 μm x 2 cm, C18, 3 μm, 100Å), 분석 컬럼은은 pepmap RSLC C18 2 μm, 100Å, 75 μm x 15 cm)이었다. 분석 컬럼 온도는 50℃로 지정, full ms 분해능은 60,000, AGC target 1E5으로 지정하였다. MS/MS는 HCD 방법을 이용하였고, 분해능 15,000, MS/MS는 top15, IT 100 ms, threshold 200,000으로 지정하였다.

LC-MS/MS로 얻은 raw data는 maxquant를 이용하여 분석하였다. 데이터베이스는 uniprot의 Homo sapiens를 이용하였고, modification은 fixed modification - carbamidomethyl(c), variable modification - oxidation(M), acetyl(protein N-term)로 지정하였다. peptide 2이상으로 지정하고, LFQ 및 match between runs하여 분석을 진행하였다. razor+unique peptide 2개 이상인 것으로 필터링하여 'LFQ 강도'를 비교하였다.

그 결과, 도 21에 나타난 바와 같이, 세포막 분획을 이용한 pull-down 샘플에서는 총 1178개의 단백질이 확인되었고, 세포 용출물 분획에서는 805개의 단백질이 확인되었다. 그 중에서도 AmTARS를 반응하지 않은 대조군 대비 강도(intensity)가 높고, 스코어 값이 큰 것을 기준으로 면역 반응에 관련하는 상호작용체 후보로 TLR2(Toll-like receptor 2)를 선별하였다. 이후, 이를 타겟으로 상호작용 실험을 수행하였다.

다음으로, 인간 유래 HEK 293T 세포에 Strep tag이 달린 AmTARS와 두 기능 부위 결손 AmTARS(AmTARS△1△2) 및 FLAG tag이 달린 TLR2를 PEI를 통해 형질 도입한 후, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 0.25% Na-데옥시콜레이트 및 프로테아제 억제제 칵테일을 포함하는 용해 버퍼를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용출물을 스트렙 탁틴 비드(Strep tactin bead)에 각각 반응시킨 후, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 1 mM EDTA를 포함하는 버퍼로 세척하고 비즈에 붙은 단백질을 용출시켜 면역블롯법으로 분석하였다.

또한, His tag이 달린 AmTARS과 FLAG tag이 달린 단백질을 1:2 비율로 섞어 Ni-NTA 비드에 반응시킨 후, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 300 mM NaCl, 30 mM 이미다졸, 1% NP-40를 포함하는 버퍼로 세척하고 비드에 붙은 단백질을 용출시켜 SDS-PAGE 젤에서 확인하였다.

그 결과, 도 22에 나타난 바와 같이, 인간 유래 세포 내 발현 시 AmTARS와 TLR2가 상호작용하는 것을 확인하였다. 두 기능 부위가 결손된 AmTARS△1△2도 TLR2와 상호작용하는 것으로 분석되었으며, 이로부터 두 기능 부위 외에도 다른 부위가 TLR2와 상호작용하는데 관여함을 알 수 있다. AmTARS와 TLR2의 상호작용은 정제된 단백질의 pull-down 실험에서도 확인되었다.

이를 통해, AmTARS는 TLR2와 직접적인 상호작용을 통해 항염증 기능을 나타냄을 확인하였다.

실시예 11. 염증성 장질환 마우스 모델에서 TLR2 매개 AmTARS 항염증 효능 검증

AmTARS과 TLR2 간 결합이 AmTARS의 항염증 효과에 실제로 작용하는지 검증하기 위하여 실시예 5와 동일한 방법으로 TLR2이 결핍된 마우스를 대상으로 염증성 장질환 마우스 모델을 제작하고 AmTARS을 투여한 후 항염증 효능을 확인하였다.

그 결과, 도 23에 나타난 바와 같이, TLR2이 결핍된 마우스에서는 염증성 장질환에서 AmTARS에 의해 유도되는 병변 지수, 대장 길이 감소, 대장 조직 손상 등의 완화 효과가 나타나지 않았다.

또한, 도 24에 나타난 바와 같이, TLR2이 결핍된 마우스에서는 AmTARS가 대장의 B 세포를 증가시키는 효능이 관찰되지 않았고 유의미한 IgA의 양의 변화를 확인할 수 없었다.

이를 통해, AmTARS의 항염증 효능은 TLR2과의 상호작용을 통해 일어남을 확인하였다.

실시예 12. 염증성 장질환 마우스 모델에서 대식세포 매개 AmTARS 항염증 효능 검증

생체 내에서 AmTARS가 어떠한 세포를 표적으로 항염증 기능을 수행하는지 규명하기 위해, AmTARS에 Alexa568 형광물질을 표지하여 마우스의 복강에 투여한 후 24시간 뒤에 복강 내에서 AmTARS가 결합한 세포를 분석하였다.

그 결과, 도 25에 나타난 바와 같이, 대부분의 AmTARS은 대식세포에 결합하는 것을 확인하였으며 B 세포를 포함한 다른 세포들과는 결합하지 않았다.

다음으로, AmTARS에 의한 항염증 효능이 대식세포를 매개하여 이루어지는지 검증하기 위해 클로드로솜(clodrosome) 투여(마우스의 복강에 200 μl/마리 농도로 1, 5, 8 일째 총 3회 투여)에 의한 대식세포 결핍 마우스를 제작한 후 실시예 5와 동일한 방법으로 항염증 효능 실험을 수행하였다. 대조군으로는 엔캡솜(encapsome)을 주입한 정상 마우스를 사용하였다.

그 결과, 도 26에 나타난 바와 같이, 염증성 장질환에서 클로드로솜에 의해 대식세포가 결핍된 마우스에서는 엔캡솜을 주입한 정상 마우스에서 나타나는 항염증 효능이 나타나지 않는 것을 확인하였다.

또한, 도 27에 나타난 바와 같이, 대식세포가 결핍된 마우스에서는 AmTARS에 의해 대장에서 B 세포의 분포가 증가하지 않고, 정상 마우스에서 염증반응에 의해 감소되었던 항염증 대식세포인 M2 대식세포의 비율이 AmTARS에 의해 증가하는 것을 확인하였다.

이를 통해 AmTARS은 대식세포를 매개하여 항염증 기능을 수행하며, 특히, 항염증 대식세포의 비율을 증가시킴으로써 그 기능을 수행하는 것으로 예상되었다.

실시예 13. AmTARS에 의한 항염증 대식세포 분화 촉진 검증

AmTARS가 항염증 대식세포의 분화를 촉진시키는지 검증하기 위해 마우스의 골수와 복강에서 대식세포를 분리하여 시험관내에서 AmTARS을 처리한 후 유세포 분석기를 이용하여 M1(F4/80+CD206-) 및 M2(F4/80+CD206-) 대식세포의 비율을 분석하였다.

구체적으로, 각 조직에서 분리한 5 x 10⁵ 개의 세포에 염색 완충용액(1% FBS, 0.01% NaN₃가 포함된 PBS, pH 7.4)으로 1회 세척한 후 각 형광물질이 결합된 항체(CD19:B세포, F4/80:대식세포, CD11b:단핵구, CD206: M2 대식세포)를 시료에 가해 4℃에서 20분간 반응시키고 염색 완충용액으로 2회 세척한 후 세포 표면 분자들의 발현을 유세포 분석기로 분석하였다.

그 결과, 도 28에 나타난 바와 같이, AmTARS에 의해 대식세포가 M2 대식세포로 분화하는 비율이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

이를 통해, AmTARS가 항염증 대식세포인 M2 대식세포의 분화를 촉진시켜 IL-10을 분비시키고 이를 신호로 B 세포의 분포를 증가시킴으로써 시스템적으로 항염증 기능을 유도함을 확인하였다.

상기 실시예의 결과로부터, 본 발명에 따른 아커만시아 뮤시니필라 TARS 또는 이의 단편은 항염증 대식세포인 M2 대식세포의 분화를 촉진시켜 대식세포를 증식시킴으로써 항염증 사이토카인인 IL-10의 분비를 증가시키고 이를 통해 B 세포를 증식시켜 항염증 효과를 나타내는 바, 염증성 질환 뿐만 아니라 염증을 동반하는 면역 질환, 감염 질환 및 대사성 질환의 개선 효과를 나타내며, 특히 염증성 장질환 등의 예방 또는 치료에 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Seoul National University R&DB Foundation <120> TARS or its fragments from Akkermansia muciniphila and uses thereof <130> KPA200047-KR-P1 <150> KR 10-2020-0036379 <151> 2020-03-25 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 630 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Akkermansia muciniphila TARS <400> 1 Met Ser Glu His Lys Glu Arg Lys Thr Leu Glu Glu Arg Gln Gln Met 1 5 10 15 Ser Asp Leu Glu Arg Leu Arg His Ser Cys Ala His Val Leu Ala Thr 20 25 30 Ala Ile Cys Arg Leu Trp Pro Asp Ala Gln Leu Ala Gly Gly Pro Ala 35 40 45 Val Asp Asn Gly Phe Tyr Tyr Asp Val Glu Leu Asp His Arg Ile Ser 50 55 60 Thr Glu Asp Phe Glu Arg Ile Glu Glu Glu Met Lys Lys Val Val Lys 65 70 75 80 Glu Asn Gln Val Phe Gln Lys Glu Val Ile Ser Arg Ala Asp Ala Met 85 90 95 Lys Met Ala Glu Ser Gly Glu Leu Gly Ala Leu Gly Pro Arg Ser Glu 100 105 110 Pro Ser Arg Phe Lys Ile Asp Leu Leu Asn Asp Ile Pro Glu Asp Glu 115 120 125 Glu Ile Ser Leu Tyr Arg Asn Gly Asp Phe 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ccgtaacgag gcaagcggtg agatgcacgg tcttatccgt 1140 gttcgtcagt tcacaatttc agaaggacac tacattctcc gtcccgatca gcttgaacag 1200 gaattcaagg gttgtcttga gcttgctaaa tatttccttg acacggtagg acttcttgaa 1260 aactgtactt tcagattctc acagtgggat cctgaaaaca agaataataa gtatgagggt 1320 acaaaggaac agtgggaaga gtcacaggct gttatgaaaa ctattctcga tgaccttgat 1380 gttgactatg agattggtat tgacgaggcc gcattctacg gtccgaagct tgatattcag 1440 tacaagaatg tattcggtaa ggaagacaca attgttacaa tccagattga tatgctcctt 1500 gccgaaagat tcggtatgta ctacatcgac aaggacggtc agaagaagct tccgtatatt 1560 attcacagaa cttcactcgg ttgctttgaa agaactcttg catatatgat tgagagattt 1620 gccggtgtaa tgccgctttg gcttgctccc gagcagatca gacttcttcc gataaaagag 1680 ggtaatgttg agtatgcaca gggtattgca gacagactta cttcactcgg tatgagagtt 1740 actgttgaca gcagagatga aaacatcggt ccaaagatta aggctgcaag acttgaaaga 1800 attccgtata ttcttgtaat cggcgacaac gagatgaatt catcaacagt tacggttcgt 1860 tcaagaaaaa gaggagaaat cccgaatatg cccgttgacg agtttgttgc tcttgttaag 1920 aacgaagtag atacaaagga aaaataa 1947 <210> 16 <211> 2175 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Homo sapiens TARS <400> 16 atgtttgagg agaaggccag cagtccttca gggaagatgg gaggcgagga gaagccgatt 60 ggtgctggtg aagagaagca aaaggaagga ggcaaaaaga agaacaaaga aggatctgga 120 gatggaggtc gagctgagtt gaatccttgg cctgaatata tttacacacg tcttgagatg 180 tataatatac taaaagcaga acatgattcc attctggcag aaaaggcaga aaaagatagc 240 aagccaatta aagtcacttt gcctgatggt aaacaggttg atgcggaatc ttggaaaact 300 acaccatatc aaattgcctg tggaattagt caaggcctgg ccgacaacac cgttattgct 360 aaagtaaata atgttgtgtg ggacctggac cgccctctgg aagaagattg taccttggag 420 cttctcaagt ttgaggatga ggaagctcag gcagtgtatt ggcactctag tgctcacata 480 atgggtgaag ccatggaaag agtctatggt ggatgtttat gctacggtcc gccaatagaa 540 aatggattct attatgacat gtacctcgaa gaagggggtg tgtctagcaa tgatttctct 600 tctctggagg ctttgtgtaa gaaaatcatt aaagaaaaac aagcttttga aagactggaa 660 gttaagaaag aaactttact ggcaatgttt aagtacaaca agttcaaatg ccggatattg 720 aatgaaaagg tgaatactcc aactaccaca gtctatagat gtggcccttt gatagatctc 780 tgccggggtc ctcatgttag acacacgggc aaaattaagg ctttaaaaat acacaaaaat 840 tcctccacgt actgggaagg caaagcagat atggagactc tccagagaat ttatggcatt 900 tcattcccag atcctaaaat gttgaaagag tgggagaagt tccaagagga agctaaaaac 960 cgagatcata ggaaaattgg cagggaccaa gaactatatt tctttcatga actcagccct 1020 ggaagttgct tttttctgcc aaaaggagcc tacatttata atgcacttat tgaattcatt 1080 aggagcgaat ataggaaaag aggattccag gaggtagtca ccccaaacat cttcaacagc 1140 cgactctgga tgacctcggg ccactggcag cactacagcg agaacatgtt ctcctttgag 1200 gtggagaagg agctgtttgc cctgaaaccc atgaactgcc caggacactg ccttatgttt 1260 gatcatcggc caaggtcctg gcgagaactg cctctgcggc tagctgattt tggggtactt 1320 cataggaacg agctgtctgg agcactcaca ggactcaccc gggtacgaag attccaacag 1380 gatgatgctc acatattctg tgccatggag cagattgaag atgaaataaa aggttgtttg 1440 gattttctac gtacggtata tagcgtattt ggattttctt ttaaactaaa cctttctact 1500 cgcccggaaa aattccttgg agatatcgaa gtatgggatc aagctgagaa acaacttgaa 1560 aacagtctga atgaatttgg tgaaaagtgg gagttaaact ctggagatgg agctttctat 1620 ggcccaaaga ttgacataca gattaaagat gcgattgggc ggtaccacca gtgtgcaacc 1680 atccagctgg atttccagtt gcccatcaga tttaatctta cttatgtaag ccatgatggt 1740 gatgataaga aaaggccagt gattgttcat cgagccatct tgggatcagt ggaaagaatg 1800 attgctatcc tcacagaaaa ctatgggggc aaatggccct tttggctgtc ccctcgccag 1860 gtaatggtag ttccagtggg accaacctgt gatgaatatg cccaaaaggt acgacaacaa 1920 ttccacgatg ccaaattcat ggcagacatt gatctggatc caggctgtac attgaataaa 1980 aagattcgaa atgcacagtt agcacagtat aacttcattt tagttgttgg tgaaaaagag 2040 aaaatcagtg gcactgttaa tatccgcaca agagacaata aggtccacgg ggaacgcacc 2100 atttctgaaa ctatcgagcg gctacagcag ctcaaagagt tccgcagcaa acaggcagaa 2160 gaagaatttt aatga 2175 <210> 17 <211> 2433 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Toll-like receptor2 (TLR2) <400> 17 atgccacata ctttgtggat ggtgtgggtc ttgggggtca tcatcagcct ctccaaggaa 60 gaatcctcca atcaggcttc tctgtcttgt gaccgcaatg gtatctgcaa gggcagctca 120 ggatctttaa actccattcc ctcagggctc acagaagctg taaaaagcct tgacctgtcc 180 aacaacagga tcacctacat tagcaacagt gacctacaga ggtgtgtgaa cctccaggct 240 ctggtgctga catccaatgg aattaacaca atagaggaag attctttttc ttccctgggc 300 agtcttgaac atttagactt atcctataat tacttatcta atttatcgtc ttcctggttc 360 aagccccttt cttctttaac attcttaaac ttactgggaa atccttacaa aaccctaggg 420 gaaacatctc ttttttctca tctcacaaaa ttgcaaatcc tgagagtggg aaatatggac 480 accttcacta agattcaaag aaaagatttt gctggactta ccttccttga ggaacttgag 540 attgatgctt cagatctaca gagctatgag ccaaaaagtt tgaagtcaat tcagaatgta 600 agtcatctga tccttcatat gaagcagcat attttactgc tggagatttt tgtagatgtt 660 acaagttccg tggaatgttt ggaactgcga gatactgatt tggacacttt ccatttttca 720 gaactatcca ctggtgaaac aaattcattg attaaaaagt ttacatttag aaatgtgaaa 780 atcaccgatg aaagtttgtt tcaggttatg aaacttttga atcagatttc tggattgtta 840 gaattagagt ttgatgactg tacccttaat ggagttggta attttagagc atctgataat 900 gacagagtta tagatccagg taaagtggaa acgttaacaa tccggaggct gcatattcca 960 aggttttact tattttatga tctgagcact ttatattcac ttacagaaag agttaaaaga 1020 atcacagtag aaaacagtaa agtttttctg gttccttgtt 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Claims (19)

1. 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS(threonyl-tRNA synthetase) 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 TARS는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 TARS의 단편은 서열번호 3 및 서열번호 4 중 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 TARS 또는 이의 단편은 IL-10의 분비를 증가시키는 것인, 약학 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 TARS 또는 이의 단편은 IL-6 또는 TNF-α의 분비를 감소시키는 것인, 약학 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 TARS 또는 이의 단편은 B 세포를 증가시키는 것인, 약학 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 TARS 또는 이의 단편은 대식세포를 증가시키는 것인, 약학 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 TARS 또는 이의 단편은 대식세포의 M2 대식세포로의 분화를 촉진시키는 것인, 약학 조성물.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증을 동반하는 면역 질환, 대사성 질환 및 감염 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학 조성물.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장질환(inflammatory bowel disease)을 포함하는, 약학 조성물.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 대장염, 궤양성 대장염, 크론병 및 베체트 장염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학 조성물.
    
12. 제9항에 있어서, 상기 염증을 동반하는 면역 질환은 아토피, 알레르기, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 자궁내막증, 건선, 갑상선기능저하증, 갑상선기능항진증 및 천식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학 조성물.
    
13. 제9항에 있어서, 상기 염증을 동반하는 대사성 질환은 비만 및 당뇨병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학 조성물.
    
14. 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법.
    
15. 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, B 세포 분화 또는 증식용 조성물.
    
16. 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, M2 대식세포 분화 또는 증식용 조성물.
    
17. 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
    
18. 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품.
    
19. 아커만시아 뮤시니필라 유래의 TARS 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.

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