KR20210116493A

KR20210116493A - 인간 신생아 각질형성세포 전구체에서 면역억제 활성을 갖는 티로신 억제제

Info

Publication number: KR20210116493A
Application number: KR1020217023138A
Authority: KR
Inventors: 바실 엠. 핸태쉬
Original assignee: 이스케이프 테라퓨틱스, 인코퍼레이티드
Priority date: 2019-01-19
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2021-09-27
Also published as: ZA202104401B; MX2021008405A; EP3911352A4; CA3125349A1; AU2020210030A1; CO2021009992A2; JP2022518128A; BR112021013926A2; WO2020150718A1; EP3911352A1; US20220088116A1; CN113677358A

Abstract

본 발명의 구현예는 인간 신생아 각질형성세포 전구체에서 면역억제 활성을 나타내는 티로신 억제제에 관한 것이다. 특정 구현예는 다음의 상이한 2 가지 방법에 의해 측정된 바와 같이, 데카펩티드 및/또는 옥시레스베라트롤의 면역억제 효과를 특징으로 한다: 자극된 세포 성장의 차단, 및 세포독성 사멸의 억제.

Description

인간 신생아 각질형성세포 전구체에서 면역억제 활성을 갖는 티로신 억제제

관련 출원에 대한 상호 참조

본 특허 출원은 2019년 1월 19일 출원된 미국 출원 제62/794,582호의 이익을 주장하며, 본 출원에 인용된 모든 다른 참고문헌과 함께 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 2020년 1월 20일 생성되고 본 출원과 함께 전자적으로 제출된 "20200120_ELIXP005_ST25.TXT"(3 킬로바이트)라는 제목의 서열 목록을 참조로 포함한다.

본 발명은 신규 생물작용제 분야에 관한 것이다.

구현예는 인간 신생아 각질형성세포 전구체에서 면역억제 활성을 나타내는 티로신 억제제에 관한 것이다. 특정 구현예는 다음 2 가지 상이한 방법에 의해 측정된 바와 같이, 데카펩티드 및/또는 옥시레스베라트롤의 면역억제 효과를 특징으로 한다: 자극된 세포 성장의 차단, 및 세포독성 사멸의 억제.

일부 구현예는 세포의 면역억제를 수행하는 대상체를 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 유효량의 하나 이상의 펩티드, 옥시레스베라트롤, 또는 둘 다를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 하나 이상의 펩티드는 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 또는 서열번호: 12를 포함한다. 세포는 포유류 세포일 수 있다. 세포는 피부 세포일 수 있다. 투여는 경구 투여를 포함할 수 있다. 다양한 구현예가 이 특허에 기재되어 있다.

일 구현예에서, 유효량의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포의 면역억제를 수행함으로써 대상체를 치료하는 방법으로, 여기서 하나 이상의 펩티드는 서열번호: 9, 서열번호:10, 서열번호: 11, 또는 서열번호: 12를 포함한다.

다양한 구현예에서, 펩티드는 서열번호: 9로 이루어진다. 세포는 포유류 세포이다. 포유류 세포는 피부 세포이다. 포유류 피부 세포는 전구체이다. 전구체는 표피 각질형성세포 전구체, 멜라닌모세포, 섬유모세포, 조직형성세포, 또는 덴드로블라스트(dendroblast)이다. 투여는 경구 투여에 의한 것이다. 세포는 말단에 분화된다. 세포는 각질형성세포, 멜라닌세포, 섬유세포, 조직세포, 또는 덴드로사이트(dendrocyte)이다. 펩티드는 약 1 밀리몰 이하의 농도로 존재한다. 조성물은 옥시레스베라트롤을 추가로 포함한다.

일 구현예에서, 유효량의 옥시레스베라트롤을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포의 면역억제를 수행함으로써 대상체를 치료하는 방법이다.

다양한 구현예에서, 옥시레스베라트롤은 약 0.1 밀리몰 내지 약 1.0 밀리몰의 농도로 존재한다. 조성물은 유효량의 하나 이상의 펩티드를 추가로 포함하며, 여기서 하나 이상의 펩티드는 서열번호: 9를 포함한다. 세포는 포유류 세포이다. 포유류 세포는 피부 세포이다. 포유류 세포는 전구체이다. 전구체는 표피 각질형성세포 전구체, 멜라닌모세포, 섬유모세포, 조직형성세포, 또는 덴드로블라스트이다. 투여는 경구 투여에 의한 것이다. 세포는 말단에 분화된 각질형성세포, 멜라닌세포, 섬유세포, 조직세포, 또는 덴드로사이트이다.

본 발명의 다른 목적, 특징, 및 이점은 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면의 고려 시 명백해질 것이며, 여기서 유사한 참조 명칭은 도면 전체에 걸쳐 유사한 특징을 나타낸다.

도 1a는 SIRT1(a)의 용량 의존적 전사 상향조절을 도시한다. 데이터는 내부 대조군 유전자 18S 대비 배수 증가로 표현되며, 3 회 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 1b는 SIRT3,(b)의 용량 의존적 전사 상향조절을 도시한다. 데이터는 내부 대조군 유전자 18S 대비 배수 증가로 표현되며, 3 회 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 1c는 SIRT6(c)의 용량 의존적 전사 상향조절을 도시한다. 데이터는 내부 대조군 유전자 18S 대비 배수 증가로 표현되며, 3 회 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 1d는 SIRT7(d)의 용량 의존적 전사 상향조절을 도시한다. 데이터는 내부 대조군 유전자 18S 대비 배수 증가로 표현되며, 3 회 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 2a는 표피 각질형성세포에 대한 데카펩티드-12 및 옥시레스베라트롤의 세포독성 효과를 도시한다. 데이터는 퍼센트 대조군으로 표현되며 3 회 개별 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. *P<0.05.
도 2b는 표피 각질형성세포 증식에 대한 데카펩티드-12 및 옥시레스베라트롤의 효과를 도시한다. 데이터는 퍼센트 대조군으로 표현되며 3 회 개별 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. *P<0.05.
도 3은 서열번호: 9의 데카펩티드 P4의 화학 구조를 도시한다.
도 4는 옥시레스베라트롤의 화학 구조를 도시한다.
도 5는 서열번호: 9의 데카펩티드 P4의 면역억제 효과의 플롯이다.
도 6은 옥시레스베라트롤의 면역억제 효과의 플롯이다.
도 7은 서열번호: 9의 데카펩티드 P4의 면역억제 효과의 플롯이다.
도 8은 옥시레스베라트롤의 면역억제 효과의 플롯이다.

피부는 연대순 및 광노화의 결과를 나타내어 노화 과정을 지속적으로 인식하고 영향을 늦추거나 또는 반전시키는 해결책을 추구하게 만든다. 피부 노화는 전통적으로 외적 또는 내재적으로 분류되었다. 최근 증거는 두 유형이 기질 메탈로프로테이나제 발현을 촉진하는 변경된 신호 전달 경로, 감소된 프로콜라겐 합성, 및 결합 조직 손상을 포함한 중요한 분자 특징을 공유함을 나타낸다.

인간 피부에서, 노화는 노쇠한 세포 수 증가 및 세포 증식 및 분화 능력 감소와 연관되어 있다. 실질적인 증거는 노화가 주로 다양한 내인성 활성 산소 종(ROS)에 의한 자유 라디칼 손상의 결과라는 이론을 뒷받침한다. Velarde 등은 미토콘드리아 산화적 손상, 세포의 노쇠, 및 피부의 노화 표현형 사이의 인과 관계에 대한 생체내 증거를 보고하였다. 또한, 자외선(UV) 방사선은 돌연변이생성 및 광노화에 연루된 ROS 합성을 자극한다. 이러한 발견과 일치하여, 데이터는 UV 조사된 피부 대 일광 보호된 피부에서 시르투인 활성의 발현 변경을 시사하고 이러한 차이는 피부 노화의 특정 측면에 기인할 수 있다.

세포의 노쇠는 세포가 분열을 멈추고 엄청난 염색질 및 분비단백질 변화, 뿐만 아니라 종양 억제인자 활성화를 포함한 독특한 표현형 변경을 거치는 과정을 설명한다. 수많은 보고서는 강력한 노화 방지 단백질로서 시르투인의 개념을 확립하는 데 도움이 되었으며, 세포의 노쇠 및 조기 노화를 지연시키는 데 있어서 다면발현 역할을 상세히 설명한다. 시르투인은 DNA 손상 복구, 텔로미어 단축, 산화 스트레스에 대한 세포 반응, 및 ROS-유도된 병리 개선과 같은 경로에서 핵심 이펙터이다.

포유류에는, 상이한 세포 구획에 위치하고 다양한 작용을 할 수 있는 7 개의 시르투인 유전자(SIRT1-7)가 있다. 생화학적으로, 시르투인은 주로 NAD⁺-의존적 리신 데아세틸라제 활성을 보유하는 단백질 부류이다. 시르투인은 다중 대사 경로의 중요한 조절인자, 세포에서 에너지 및 산화 환원 상태의 센서, 및 산화 스트레스의 조절인자로 광범위하게 인식되고 있다.

이러한 발견은 노화의 진행을 늦추는 데 도움이 되는 소분자 활성인자 또는 제약 개발 및 광범위한 연령 관련 장애에 대한 관심을 촉발시켰다. 7 개의 포유류 시르투인 중, SIRT1은 노화 및 수명과 관련하여 가장 광범위하게 연구되었다. 예를 들어, 레스베라트롤의 노화 방지 효과는 주로 SIRT1 활성화에 기인한다. 실제로, Ido 등은 레스베라트롤이 AMP-활성화 단백질 키나제 및 시르투인의 활성 증가를 통해 세포의 노쇠 및 증식 장애를 개선시켰음을 보고하였다.

본 발명자들은 이전에 인간 피부에서 데카펩티드-12의 강력한 미백 효능을 보고하였다. 추가의 임상 연구는 8 주 동안 0.01 퍼센트의 데카펩티드-12를 함유하는 국소 크림으로 매일 2 회 치료받은 피부이상변색증 환자에서 얼굴 피부 외관의 전반적인 개선을 입증하였다. 이러한 발견은 데카펩티드-12가 전반적인 피부 외관을 개선하기 위해 시르투인 활성을 조절할 수 있다는 가설을 세웠다. 이 가능성을 명확하게 하기 위해, 본 발명자들은 인간 표피 전구체에서 시르투인 전사에 대한 데카펩티드-12의 효과를 평가하였다.

보고서는 시르투인이 조기 노화를 억제하고, 세포의 노쇠를 지연시키고, 수명을 향상시키며, 광범위한 노화 장애를 개선하는 데 있어서 역할을 하는 다면발현 역할을 상세히 설명한다. 여기에서, 본 발명자들은 강력한 시르투인 활성인자인 데카펩티드-12에 대한 발견을 보고하고, 그의 성능을 잘 문서화된 옥시레스베라트롤과 비교한다. 인간 표피 각질형성세포 전구체를 100 마이크로몰 데카펩티드-12로 처리하면 SIRT1의 전사가 대조군 세포에 비해 141 ± 11 퍼센트까지 증가하는 반면, SIRT3, SIRT6, 및 SIRT7의 수준은 각각 121 ± 13 퍼센트, 147 ± 8 퍼센트, 및 95 ± 14 퍼센트까지 증가하였다. 데카펩티드-12는 옥시레스베라트롤과 유사한 수준으로 시르투인 전사를 상향조절하였지만 세포독성은 감소하였다.

재료 및 방법

시약

데카펩티드-12(YRSRKYSSWY) 서열번호: 9는 고체상 FMOC 화학을 사용하여 Bio Basic, Inc.(캐나다 온타리오 소재)에서 합성하였다. 옥시레스베라트롤은 Sigma-Aldrich(미주리주 세인트루이스 소재)에서 구입하였다.

세포 배양

인간 신생아 표피 전구체(Thermo Fisher Scientific, 뉴욕 소재)를 6-웰 플레이트에 웰 당 2 x 10⁵ 개 세포의 농도로 시딩하였다. 각 웰에 60 마이크로몰 칼슘 클로라이드를 함유하는 Epilife 배지(Thermo Fisher Scientific, 뉴욕 소재) 2 밀리리터를 넣었다. 플레이트를 섭씨 37도 및 5 퍼센트 CO₂에서 가습 챔버에서 배양하였다. 24 시간 후, 세포를 5　퍼센트 DMSO를 함유하는 PBS에 용해된 다양한 농도의 옥시레스베라트롤 또는 데카펩티드-12로 처리하였다. 대조군 웰에는 비히클만 넣었다(5 퍼센트 DMSO 및 PBS). 각 웰에서 DMSO의 최종 농도는 0.05 퍼센트였다.

총 RNA 추출, 정량, 및 cDNA 합성

72 시간 배양 기간 후, 세포를 트립신 처리하고 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy 키트(Qiagen, 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다.

RNA 농도는 나노드롭(Thermo fisher scientific, 뉴욕 소재)을 사용하여 결정하였다. 올리고 dT 프라이머 및 TaqMan 역전사 시약(Thermo fisher scientific, 뉴욕 소재)을 사용하여 cDNA를 합성하기 위해 2 μg의 총 RNA를 사용하였다. 반응은 DNA Engine Peltier Thermal Cycler(Bio-Rad, 캘리포니아주 에르쿨레스 소재)에서 수행하였다. 어닐링 온도는 섭씨 25　도에서 10 분, 이어서 제1 가닥 합성은 섭씨 48 도에서 1 시간, 및 열 불활성화는 섭씨 95 도에서 5 분이었다.

반정량적 분석

Primer3을 사용하여 SIRT1-7 프라이머(표 A)를 설계하였다. 반정량적 PCR 반응은 DNA Engine Peltier Thermo Cycler(Bio-Rad, 캘리포니아주 에르쿨레스 소재)에서 수행하였다. PCR을 다음 조건 하에 수행하였다: SIRT 1-7 및 하우스키핑 유전자 18S에 대해 섭씨 94 도에서 2 분 동안 변성 및 섭씨 54 도에서 30 초 동안 34 사이클로 프라이머 연장.

표 A: SIRT1-7 및 18S에 대한 프라이머 서열

샘플을 밀리리터 당 0.5 마이크로그램의 에티듐 브로마이드를 함유하는 1.5 퍼센트 아가로스 겔에서 실행 및 분리하고 FluorChem HD2 Imaging System(Protein simple, 캘리포니아주 산호세 소재)을 사용하여 이미지화하였다. 밀도계 분석은 AlphaEase FC 소프트웨어(Protein simple, 캘리포니아주 산호세 소재)를 사용하여 수행하였다. 강도비는 각 유전자에 대한 강도 값을 내부 대조군 유전자 18S의 강도 값으로 나누어 계산하였다.

생존력/증식 및 세포독성 검정

TACS® MTT 세포 증식 키트(R&D systems, 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용하여 증식률을 결정하였다. 세포를 섭씨 37 도에서 5 퍼센트 CO₂로 가습된 대기에서 96-웰 플레이트에 웰 당 2.5 x 10⁴ 개로 시딩하였다. 24 시간 후, 데카펩티드-12 또는 옥시레스베라트롤을 다양한 농도(0, 3, 10, 30, 100, 300, 및 1000 마이크로몰)로 상응하는 웰에 첨가한 다음, 배양물을 72 시간 동안 배양하였다. 나머지 절차는 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.

트리판 블루 염료 배제 검정을 사용하여 세포 독성을 측정하였다. 세포를 웰 당 4 x 10⁵ 개 세포의 밀도로 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 각 웰에 상이한 농도의 데카펩티드-12 또는 옥시레스베라트롤(0, 3, 10, 30, 100, 300, 및 1000 마이크로몰)을 첨가하였다. 플레이트를 가습된 5 퍼센트 CO₂ 챔버에서 섭씨 37 도로 배양하였다. 72 시간 후, 분취량을 취하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수하였다. 다음 식에 따라 세포독성을 측정하였다: [1 - (대조군 세포 수 - 테스트 샘플 중 살아있는 세포 수)/대조군 세포 수] x 100 퍼센트.

통계 분석

평균 및 표준 오차는 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)을 사용하여 3 회 독립적인 실행으로 계산하였고, 통계적 유의성은 대응표본 분산 분석을 사용하여 결정하였다. P 값은 P<0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

결과

증식률 및 세포독성에 대한 데카펩티드의 효과:

본 발명자들은 먼저 인간 표피 전구체에 대한 데카펩티드-12 및 옥시레스베라트롤의 독성 효과를 평가하였다. 도 2a는 100 마이크로몰 데카펩티드-12 또는 옥시레스베라트롤 처리가 각각 3 ±1 퍼센트 또는 6 ± 1 퍼센트까지 세포 사멸을 초래하였음을 나타낸다. 1 밀리몰에서, 데카펩티드-12 또는 옥시레스베라트롤은 각각 7± 2 퍼센트 또는 16 ± 2 퍼센트까지 세포 사멸을 초래하였다.

발명자들은 또한 인간 표피 전구체의 생존력 및 증식에 대한 데카펩티드-12 및 옥시레스베라트롤의 효과를 평가하였다. 도 2b는 300　마이크로몰 데카펩티드-12 또는 옥시레스베라트롤 처리가 각각 2 ± 1 퍼센트 또는 5 ± 1 퍼센트까지 세포 증식 감소를 초래하였음을 나타낸다. 그러나, 증식이 3 ± 2 퍼센트까지 감소된 1 밀리몰 데카펩티드-12와 달리, 옥시레스베라트롤과 3-d 배양은 증식을 12 ± 2 퍼센트까지 감소시켰다.

데카펩티드-12는 SIRT1-7의 전사를 상향조절하였다:

본 발명자들은 다음으로 인간 표피 전구체에서 시르투인 발현에 대한 옥시레스베라트롤 및 데카펩티드-12의 효과를 평가하였다. 도 1a-1d 및 표 B는 데카펩티드-12 및 옥시레스베라트롤이 SIRT1-7의 전사를 용량 의존적 방식으로 조절하였음을 나타낸다. 30 마이크로몰 옥시레스베라트롤에서, SIRT1 전사 수준은 대조군 세포에 비해 125 ± 9 퍼센트까지 상향조절된 반면, SIRT3, SIRT6, 및 SIRT7은 각각 133 ± 5 퍼센트, 73 ± 8　퍼센트, 및 95 ± 7 퍼센트까지 상향조절되었다.

표 B 및 표 C. 데카펩티드-12(표 B) 및 옥시레스베라트롤(표 C) 처리에 반응한 SIRT 1-7의 유전자 발현 프로파일. 결과는 3 회 독립적인 실행의 평균이다.

표 B

표 C

데이터는 100 마이크로몰 데카펩티드-12가 SIRT1의 전사를 미처리된 세포에 비해 141 ± 11 퍼센트까지 증가시킨 반면, SIRT3, SIRT6 및 SIRT7은 각각 121 ± 13　퍼센트, 147 ± 8 퍼센트, 및 95 ± 14 퍼센트까지 증가시켰음을 나타낸다(도 1a-1d).

논의

시르투인이 세포의 노쇠를 지연시키고 조기 노화 발달을 차단하는 역할을 하는 다면발현 역할은 이들을 강력한 노화 방지 단백질로서 입증하는 데 도움을 주었다. SIRT1 활성인자 및 잠재적인 노화 방지 제제로서 레스베라톨의 치료 용도는 광범위하게 연구되고 문서화되었다. 레스베라트롤은 SIRT1 활성화를 통해 H₂O₂-유도성 산화 스트레스 및 노쇠로부터 인간 내피를 보호한다. 유사하게, 옥시레스베라트롤은 또한 강력한 산화방지제 및 유리 라디칼 제거제이다. 그러나, 레스베라트롤과 달리, 이는 적은 세포독성 및 더 나은 수용성을 나타낸다. 결과적으로, 본 발명자들은 데카펩티드-12의 성능 및 인간 표피 각질형성세포에서 시르투인 전사를 조절하는 능력을 비교하는 양성 대조군으로 이를 사용하기로 결정하였다.

7 개 시르투인 모두 데카펩티드-12 처리 후 상향조절되었을지라도, 본 발명의 논의는 피부 노화에 직접적으로 연루된 시르투인에 초점을 맞출 것이다.

100 마이크로몰 또는 1 밀리몰에서, 데카펩티드-12는 SIRT1 전사를 각각 인상적인 141 또는 213 퍼센트까지 증가시켰다. SIRT1은 주로 핵 데아세틸라제이다. 이는 세포 증식, 분화, 세포자멸, 대사, 스트레스 반응, 게놈 안정성, 및 세포 생존과 같은 다양한 세포 과정을 제어한다. Cao 등은 SIRT1이 배양된 피부 각질형성세포에서 p53 및 c-Jun N-말단 키나제의 조절을 통해 UVB- 및 H2O2-유도된 세포 사멸에 대한 보호를 부여함을 보고하였으며, 이는 SIRT1 활성인자가 새로운 피부 노화 방지제로서 역할을 할 수 있었음을 시사한다. 다른 연구자들은 SIRT1이 NF-κB 신호전달을 억제할 수 있어서 노화 과정을 지연시키고 수명을 연장시킬 수 있음을 보고하였다. SIRT1 활성화는 NF-κB 복합체의 p65 서브유닛을 탈아세틸화함으로써 직접적으로 NF-κB 신호전달을 억제하고 산화적 대사 및 염증 해결을 향상시킨다. 결과적으로, SIRT1은 다수의 분자 경로를 조절함으로써 노기 노쇠 및 가속화된 노화를 방지하는 데 광범위한 효과를 매개하는 결정적인 노화 방지 단백질로서 간주될 수 있다.

SIRT3 전사는 100 마이크로몰 데카펩티드 처리 후 121 퍼센트까지 증가하였다. SIRT3은 주로 β-산화, ATP 생성, 및 ROS 관리와 같은 다양한 미토콘드리아 과정을 조절하는 데 관련되어 있다. SIRT3은 또한 조혈 줄기 세포의 재생 능력 유지에 연루되어 있다. SIRT3은 노화와 함께 억제되고, 노화된 조혈 줄기 세포에서 SIRT3 상향조절은 재생 능력을 개선시킨다. 이 발견은 SIRT3이 줄기 없이 유지하는 데 역할을 하는 중요한 역할을 수립하고, 보다 중요하게는, 조기 노화를 초래하는 대사 장애에 대한 미래의 줄기 세포-기반 개입 경로를 마련하는 데 도움이 된다.

SIRT6은 DNA 손상 복구, 대사 조절, 염증, 및 종양 억제에서 다면적 역할을 하는 중요한 노화 방지 단백질로서 간주될 수 있다. SIRT6은 녹아웃(knockout) 마우스 모델에서 1 개월 이내에 사망률을 초래하는 심각한 조기 노화 표현형이 발생했을 때 두드러졌다. 더욱이, SIRT6은 마우스의 전신에서 과발현되었을 때 수명의 명백한 증가를 나타내는 유일한 포유류 시르투인이다. 또한, Kawahara 등은 SIRT6이 NF-κB 표적 유전자의 프로모터 상의 K9에서 히스톤 H3을 탈아세틸화함으써 과활성 NF-κB 신호전달을 약화시켜, 결정적인 항염증 단백질로서 SIRT6의 역할을 향상시킴을 보고하였다.

Baohua 등은 SIRT6이 콜라겐 대사 및 NF-κB 신호전달의 조절을 통해 피부 노화 과정에서 핵심 역할을 한다는 것을 나타내었다. 이들은 SIRT6을 차단하여 유형 1 콜라겐의 전사를 억제하고, 기질 메탈로프로테이나제1 분비를 촉진하고 NF-κB 신호전달을 증가시킴으로써 하이드록시프롤린 함량을 유의하게 감소시켰음을 보고하였다. 종합하면, SIRT6은 다수의 경로를 조절하여 세포의 노쇠를 지연시키고 노화를 가속화시킴으로써, 노화 방지 과정의 핵심 조절인자로서 부각된다. 따라서, SIRT6 전사가 100 μM에서 147 퍼센트까지 향상되는 데카펩티드-12는 조기 피부 노화 및 광손상된 피부의 종종 동시 발생하는 표현형을 해결하기 위한 치료용 노화 방지 후보로서 큰 가능성을 가질 수 있다.

요약하면, 데카펩티드-12는 이 보고서에서 SIRT1, SIRT3, 및 SIRT6의 전사 수준을 유의하게 상향조절하는 것으로 나타났으며, 3 개 모두 피부 노화 및 다른 연령 관련 병리에 대응하는 데 있어서 유의한 역할을 한다. 데카펩티드-12를 함유하는 다양한 국소 제형에 대한 임상 연구는 현재 시험관내 결과를 검증하고 생체내에서 이 강력한 시르투인 활성인자의 효능을 테스트하는 데 도움이 되도록 설계되어 있다.

실시예

이 실시예에서, 하기 표 D에 상세히 설명된 바와 같이, P4 데카펩티드에 대한 특정 변형이 이루어졌다.

표 D

데카펩티드 P4에 대한 이러한 변형은 프로테아제에 대한 안정성을 개선하고 경피성 또는 세포간 침투, 또는 둘 다를 향상시키는 역할을 할 수 있다.

본 발명의 펩티드는 임의의 자연 발생 아미노산, 또는 비자연 발생 아미노산으로부터의 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 자연 발생 및 비자연 발생 아미노산은 D 또는 L 배열에 있을 수 있거나, 또는 둘 다 우선성 형태를 포함할 수 있다. 용어 D 및 L은 당업계에서 사용되는 것으로 알려진 바와 같이 본 출원에서 사용된다. 본 발명의 펩티드는 단일 아미노산 및 짧은 길이(예를 들어, 1-20 개)의 아미노산을 포함한다. 게다가, 본 발명의 변형된 펩티드는 또한 단량체 또는 이량체를 포함할 수 있다.

아미노산에 대한 표준 단일 글자 및 3 글자 코드가 본 출원에 사용되며 하기 표 E에 표시되어 있다.

표 E

상기 기재된 바와 같이, 나타낸 잔기는 자연 발생 L 아미노산, 또는 이들의 변형, 즉, 화학적 변형, 광학 이성질체, 또는 변형 기에 대한 연결일 수 있다. 특이적 변형은 시르투인 유전자(들)의 발현을 특이적으로 조절하는 본 펩티드의 능력을 유지하는 펩티드 내에서 이루어질 수 있음이 고려된다.

시르투인 1-7의 전사 수준에 대한 데카펩티드 P4, P4A, P4B, 및 P4C의 효과를 평가하였다. 표 F는 테스트된 농도: 10, 30, 50, 100, 및 300(모두 마이크로몰 단위)에서 상응하는 유전자가 있는 4 개의 데카펩티드 모두에 대한 전사 수준을 요약한다.

표 F

낮은 농도에서, 천연 데카펩티드 P4는 변형된 데카펩티드에 비해 향상된 전사 수준을 나타내었다. 그러나, 3 개의 변형된 데카펩티드(P4A, P4B, 및 P4C) 각각은 대조군에 비해 시르투인 유전자의 전사 수준을 상향조절하였다. 100 마이크로몰의 농도에서, 전사 수준에 대한 효과는 4 개의 데카펩티드 모두에 걸쳐 비슷하였다.

TACS® MTT 세포 증식 키트를 사용하여 3 개의 인간 세포주(표피 전구체, 멜라닌모세포, 및 섬유모세포)에 대한 증식률을 결정하였다. 세포를 섭씨 37 도에서 5 퍼센트 CO2로 가습된 대기에서 96-웰 플레이트에 웰 당 2.5 x 104 개로 시딩하였다. 24 시간 후, 데카펩티드를 다양한 농도로 상응하는 웰에 첨가하고 72 시간 동안 배양하였다. 나머지 절차는 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.

표 G는 72 시간 후 표피 전구체 증식률을 나타낸다.

표 G

표 H는 72 시간 후 멜라닌모세포 증식률을 나타낸다.

표 H

표 I는 72 시간 후 섬유모세포 증식률을 나타낸다.

표 I

표피 전구체, 멜라닌모세포, 및 섬유모세포를 100 마이크로몰의 데카펩티드 P4A와 72 시간 배양 후, 결과는 3 개 세포주 모두의 증식률에서 3 퍼센트 감소하였다.

1000 마이크로몰에서, 표피 전구체의 증식률은 6 퍼센트까지 감소한 반면, 멜라닌모세포 및 섬유모세포의 증식률은 각각 5 퍼센트 및 4 퍼센트까지 감소하였다.

세포 생존력에 대한 데카펩티드 각각의 효과를 또한 테스트하였다. 특히, 세포를 다양한 농도에서 데카펩티드와 배양한 다음 트리판 블루를 사용하여 대조군(미처리 세포) 대비 생존력을 계수하였다. 하기 식에 따라 세포독성을 측정하였다:

[1 - (대조군 세포 수 - 테스트 샘플 중 살아있는 세포 수) / 대조군 세포 수] x 100 퍼센트.

표 J는 7 일 후 표피 전구체 생존력을 나타낸다.

표 J

표 K는 7 일 후 멜라닌모세포 생존력을 나타낸다.

표 K

표 L은 7 일 후 섬유모세포 생존력을 나타낸다.

표 L

100 마이크로몰 농도에서, 세포 생존력은 3 개 세포주 모두에서 97 퍼센트 초과를 유지하였다. 1000 마이크로몰에서, 세포 생존력은 대조군에 비해 6 퍼센트까지 떨어졌다.

결론적으로, 최근 보고서는 시르투인이 조기 노화를 억제하고, 세포의 노쇠를 지연시키고, 수명을 향상시키며, 광범위한 노화 장애를 개선하는 데 있어서 역할을 하는 다면발현 역할을 상세히 설명한다. 따라서, 본 발명자들은 강력한 시르투인 활성인자인 데카펩티드-12에 대한 결과를 보고하고, 그의 성능을 잘 문서화된 옥시레스베라트롤과 비교한다. 인간 표피 전구체를 100 마이크로몰 데카펩티드-12로 처리하면 SIRT1의 전사가 대조군에 비해 141 ± 11 퍼센트까지 증가한 반면, SIRT3, SIRT6, 및 SIRT7의 수준은 각각 121 ± 13 퍼센트, 147 ± 8 퍼센트, 및 95.4 ± 14 퍼센트까지 증가하였다. 데카펩티드-12는 시르투인 전사를 옥시레스베라트롤과 유사한 수준으로 상향조절하였지만 세포독성은 감소하였다. 따라서, 데카펩티드-12는 피부 노화 및 다른 연령 관련 병리에 대응하는 안전한 치료제로서 가능성을 가질 수 있다.

상기 설명은 효과가 분명한 경우에 주목할 때 100 마이크로몰 이상의 전형적인 데카펩티드 농도를 언급하지만, 결과는 또한 더 낮은 농도가 긍정적인 효과를 가짐을 입증한다. 따라서 일부 구현예는 1 마이크로몰 이상의 데카펩티드 농도를 활용할 수 있으며, 특정 구현예는 100　마이크로몰 이상의 펩티드 농도 범위를 이용한다. 다양한 구현예에 따른 펩티드 농도 범위의 예는 1 마이크로몰 이상, 5 마이크로몰 이상, 10 마이크로몰 이상, 30 마이크로몰 이상, 50 마이크로몰 이상, 100　마이크로몰 이상, 300 마이크로몰 이상, 500 마이크로몰 이상, 및 1000 마이크로몰 이상이다.

추가로 특정 데카펩티드가 원하는 효과를 달성하기 위해 다른 성분(들)과 조합하여 사용될 수 있음에 주목한다. 예를 들어, 특정 데카펩티드는 데카펩티드 P4A, 4B, 및/또는 4C와 같은 다른 펩티드 및/또는 옥시레스베라트롤과 같은 다른 성분과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 다른 성분을 포함함으로써 실현되는 상승 효과는 궁극적으로 원하는 결과를 달성하는 데 필요한 임의의 개별 성분(예를 들어, 데카펩티드, 기타)의 농도를 감소시킬 수 있다.

상기는 구체적으로 가능한 추가 성분으로서 데카펩티드 및 옥시레스베라트롤을 포함하지만, 구현예는 이에 제한되지 않는다. 다른 가능한 첨가제의 예는 그 중에서도 α-리포산, 비오틴, 카페인, 세라마이드, 코엔자임 Q10, 글리콜산, 녹차, 인간 줄기 세포, 인간 줄기 세포 추출물, 히알루론산, 하이드로퀴논, 호호바 오일, 코직산, 락트산, 말산, 니아신아미드, 올리고펩티드, 펩티드, 식물 줄기 세포, 식물 줄기 세포 추출물, 레스베라트롤, 레티놀, 비타민 C, 비타민 E, 및 비타민 K를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

구현예가 다양한 피부 세포 유형을 치료하는 데 활용될 수 있음에 주목한다. 말단에 분화된 피부 세포의 예는 또한 시간 경과에 따라 노화되는 각질형성세포, 섬유모세포, 멜라닌세포, 및 랑게르한스 세포(예를 들어, 조직세포 또는 덴드로사이트)와 같은 면역 세포를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

구현예는 또한 피부 노화를 감소시키고 평생 동안 피부 재생을 허용하기 위해 피부 전구 세포를 치료하는 데 활용될 수 있다. 이러한 전구 세포의 예는 표피에 있는 랑게르한스 세포에 대한 전구체인 표피 각질형성세포 전구체, 섬유모세포, 멜라닌모세포, 조직형성세포, 또는 덴드로블라스트를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

마지막으로, 상기는 인간 피부 세포의 치료를 기재하고 있지만, 구체적 구현예는 이러한 접근법에 제한되지 않는다. 대안적인 구현예는 소(예를 들어, 가죽 제조 시), 돼지, 및 다른 동물(예를 들어, 콘테스트 목적을 위해 피부 외관에 기초하여 평가될 수 있는 개, 고양이, 및 다른 것들)과 같은 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 유기체로부터의 피부 세포의 치료를 이용할 수 있다.

양태(clause) 1A. 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 또는 서열번호: 12로 이루어진 펩티드.

양태 2A. 양태 1A에 있어서, 상기 펩티드가 변형 기에 의해 변형된 서열번호: 9로 이루어지며, 상기 변형 기가 아미노-말단 단부에서 팔미토일 기 또는 아세틸 기이거나, 또는 카복시-말단 단부가 아미드화되거나, 또는 둘 다인, 펩티드.

양태 3A. 양태 1A-2A 중 어느 한 양태에 있어서, D-이소형으로서 위치 6에 티로신 아미노산을 갖고, 다른 모든 아미노산이 L-이소형인 서열번호: 11로 이루어진, 펩티드.

양태 4A. 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 또는 서열번호: 12로 이루어진 첫번째 펩티드를 포함하는 조성물.

양태 5A. 양태 4A에 있어서, 상기 펩티드가 변형 기에 의해 변형된 서열번호: 9로 이루어지며, 상기 변형 기가 아미노-말단 단부에서 팔미토일 기 또는 아세틸 기이거나, 또는 카복시-말단 단부가 아미드화되거나, 또는 둘 다인, 조성물.

양태 6A. 양태 4A-5A 중 어느 한 양태에 있어서, D-이소형으로서 위치 6에 티로신 아미노산을 갖고, 다른 모든 아미노산이 L-이소형인 아미노산: 11로 이루어진, 조성물.

양태 7A. 양태 4A-6A 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 펩티드가 1 μm 이상의 농도로 존재하는, 조성물.

양태 8A. 피부 노화 증상을 감소시키기 위해 피부 세포에서 시르투인 유전자의 발현을 조절함으로써 대상체를 치료하는 방법으로, 상기 방법은 유효량의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 하나 이상의 펩티드는 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 또는 서열번호: 12로 이루어진, 방법.

양태 9A. 양태 8A에 있어서, 상기 펩티드가 변형 기에 의해 변형된 서열번호: 9로 이루어지며, 상기 변형 기가 아미노-말단 단부에서 팔미토일 기 또는 아세틸 기이거나, 또는 카복시-말단 단부가 아미드화되거나, 또는 둘 다인, 방법.

양태 10A. 양태 8A-9A 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 펩티드가 D-이소형으로서 위치 6에 티로신 아미노산을 갖고, 다른 모든 아미노산이 L-이소형인 서열번호: 11로 이루어진, 방법.

양태 11A. 양태 8A-10A 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 피부 세포가 전구체인, 방법.

양태 12A. 양태 11A에 있어서, 상기 전구체가 표피 각질형성세포 전구체, 멜라닌모세포, 섬유모세포, 조직형성세포, 또는 덴드로블라스트인, 방법.

양태 13A. 양태 8A-10A 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 피부 세포가 말단에 분화되는, 방법.

양태 14A. 양태 13A에 있어서, 상기 피부 세포가 각질형성세포, 멜라닌세포, 섬유세포, 조직세포, 또는 덴드로사이트인, 방법.

양태 15A. 양태 8A-14A 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 펩티드가 1 μm 이상의 농도로 존재하는, 방법.

양태 16A. 양태 8A-15A 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 시르투인 유전자가 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 또는 서열번호: 7을 포함하는, 방법.

양태 17A. 양태 8A-16A 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 조성물이 옥시레스베라트롤을 추가로 포함하는, 방법.

양태 18A. 양태 8A-17A 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 피부 세포가 포유동물 세포인, 방법.

양태 19A. 양태 18A에 있어서, 상기 피부 세포가 인간인, 방법.

양태 20. 피부 세포에서 시르투인 유전자의 발현을 조절하는 방법으로, 상기 방법은 유효량의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 하나 이상의 펩티드는 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 또는 서열번호: 12로 이루어진, 방법.

펩티드 제형 및/또는 옥시레스베라트롤의 면역억제 효과에 추가로 주목한다. 도 3은 서열번호: 9의 데카펩티드 P4에 대한 화학 구조를 나타낸다. 도 4는 옥시레스베라트롤의 화학 구조를 나타낸다.

특히, 서열번호: 9의 데카펩티드-12(P4) 및 옥시레스베라트롤은 다음 2 가지 상이한 방법에 의해 측정된 바와 같이 항염증 효과를 나타내었다:

1) 자극된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 차단, 및

2) 자연 살해(NK)-매개 세포독성 사멸의 억제.

이러한 결과는 이제 하기 실시예에서 상세하게 논의되고 있다.

실시예

BMC 증식 및 NK 세포독성 사멸 검정

저온보존된 인간 PBMC를 Astarte Biologics(미국 워싱턴주 레드먼드 소재)에서 구입하고, 피토헤마글루티닌(PHA)으로 활성화시키고, 증식을 평가하였다. 인간 K562 세포의 인터류킨(IL)-2 활성화된 인간 NK 세포 세포독성 사멸을 CytoTox96 비방사성 세포독성 검정 키트(Promega)를 사용하여 평가하였다. 데카펩티드-12의 분해를 방지하기 위해 프로테아제 억제제를 배지에 첨가하였다.

각 실험에 대해 3 회 독립적인 실험을 수행하였다. 마이크로소프트 엑셀(워싱턴주 시에틀 소재)을 사용하여 평균 및 표준 오차를 계산하였고 통계적 유의성은 독립표본 분산 분석 또는 양측 스튜턴트 T-검정을 사용하여 결정하였다. P 값 <0.05를 통계적으로 유의한 것으로 취하였다.

72 시간 동안 PHA에 노출 후 PBMC 증식률에 대한 데카펩티드-12 및 옥시레스베라트롤의 효과를 탐구하였다.

도 5는 PHA-자극된 PBMC 증식에 대한 데카펩티드-12(P4)의 면역억제 효과를 도시한다. 데이터는 퍼센트(%) 대조군으로 표현되고 3 회 개별 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. *P<0.05. E:T는 효과기 대 표적 세포 비를 나타낸다.

도 5는 데카펩티드-12가 증식을 0.05 밀리몰에서 28.0 ±3.8 퍼센트 및 0.1 밀리몰에서 54.3 ± 1.1까지 통계적으로 유의하게 감소시켰음을 나타낸다(p<0.02). 0.3 또는 1 밀리몰에서 유의한 추가 감소는 달성되지 않았다(p>0.05).

도 6은 PHA-자극된 PBMC 증식에 대한 옥시레스베라트롤의 면역억제 효과를 도시한다. 데이터는 퍼센트(%) 대조군으로 표현되고 3 회 개별 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. *P<0.05. E:T는 효과기 대 표적 세포 비를 나타낸다.

도 6은 옥시레스베라트롤이 또한 증식을 0.1 밀리몰에서 35.3 ± 1.8 퍼센트(p<0.02), 및 3 밀리몰에서 14.7 ± 3.4 퍼센트(p<0.02)까지 감소시켰음을 나타낸다.

K562 세포의 IL-2 프라이밍된 NK-매개된 세포독성 사멸에 대한 데카펩티드-12의 영향을 또한 평가하였다.

도 7은 K562 세포의 NK92-매개된 세포독성 사멸에 대한 데카펩티드-12(P4)의 면역억제 효과를 도시한다. 데이터는 퍼센트(%) 대조군으로 표현되고 3 회 개별 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. *P<0.05. E:T는 효과기 대 표적 세포 비를 나타낸다.

도 7은 데카펩티드-12가 효과기 대 표적(E:T) 세포의 10:1 비에서 NK 사멸을 각각 0.1 및 0.3 밀리몰에서 81.4 ± 1.3 퍼센트 및 59.3 ± 3.6 퍼센트까지 감소시켰음을 예시한다(p>0.05). 30:1 비에서, 데카펩티드-12는 NK 사멸을 각각 0.1 및 0.3 밀리몰에서 64.8 ± 5.3 퍼센트 및 44.8 ± 3.2 퍼센트까지 감소시켰다(p<0.04).

도 8은 K562 세포의 NK92-매개된 세포독성 사멸에 대한 옥시레스베라트롤의 면역억제 효과를 도시한다. 데이터는 퍼센트(%) 대조군으로 표현되고 3 회 개별 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. *P<0.05. E:T는 효과기 대 표적 세포 비를 나타낸다.

도 8은 옥시레스베라트롤이 10:1의 E:T 비에서 NK 사멸을 각각 0.1 및 0.3 밀리몰에서 88.7 ± 1.8 퍼센트 및 86.1 ± 0.9 퍼센트까지 감소시켰음을 나타낸다. 30:1 비에서, 옥시레스베라트롤은 NK 사멸을 각각 0.1 및 0.3 밀리몰에서 72.8 ± 1.9 퍼센트 및 64.0 ± 3.4 퍼센트까지 차단시켰다(p<0.03).

따라서, 연구는 데카펩티드-12 및 옥시레스베라트롤이 다음 두 가지 방법에 의해 측정된 바와 같이 항염증 효과를 나타냄을 보여주었다: 1) PHA-자극된 PBMC 증식의 차단, 및 2) NK-매개된 세포독성 사멸의 억제.

증식 차단 테스트의 경우, 데카펩티드-12의 효과는 용량 의존적으로 나타났다. 옥시레스베라트롤의 효과는 제한된 억제 농도 범위를 나타내었다.

사실, 일반적인 경향은 옥시레스베라트롤이 2상 효과를 가질 수 있음을 나타내었다. 이는 0.3 및 1 밀리몰의 농도가 0.1 밀리몰의 농도에서보다 점진적으로 적은 억제를 나타내었기 때문이다.

데카펩티드-12는 테스트된 농도 범위 중 0.1 밀리몰 이상에서 안정기 또는 최대 억제를 나타내었다. 이는 다운스트림 신호전달 경로 또는 피드백 루프의 활성화에서 용량 의존적 차이에 의해 설명될 수 있다. 실제로, 시르투인 발현 패턴의 용량 의존성 곡선의 세심한 조사는 더 높은 농도가 억제되게 되는 2상 효과를 입증한다.

대조적으로, NK 사멸의 폐지는 데카펩티드-12 및 옥시레스베라트롤 둘 다에 대해 용량 의존적으로 나타났다. 옥시레스베라트롤은 테스트된 모든 농도에서 더 현저한 억제를 나타내었다.

억제 효과는 데카펩티드-12 및 옥시레스베라트롤 둘 다에 대해 30:1보다 10:1의 E:T 비에서 더 컸다. 이는 NKG2D 및 퍼포린 매개된 세포독성의 차단 때문일 수 있다.

레스베라트롤(옥시레스베라트롤의 유사체)은 0.1 밀리몰에서 PHA-유도된 증식을 억제함에 주목한다. 이 억제 효과는 다른 효과 중에서도 시르투인에 의해 또한 조절되고 면역 및 염증 반응뿐만 아니라 세포 증식 및 세포자멸의 조절과 관련되어 있는 NF-카파 B의 억제 때문일 수 있다.

종합하면, 여기서 관찰된 면역억제 효과는 고유하고 특이적인 조절 경로가 면역 시스템의 상이한 부문에 관여하고 있음을 시사한다. 추가 연구는 이러한 다면발현 효과를 명확하게 할 수 있다.

예를 들어, TNFα, IL-1β, IFNγ, 및 IL-6과 같은 전염증 매개인자에 대한 이러한 2 가지 제제의 영향에 대한 평가는 통찰력이 있을 수 있다. 게다가, 활성화 대 휴지 PBMC의 번역 및 다른 전사 효과의 결정은 통찰력이 있을 수 있다.

상기 설명은 효과가 분명한 경우에 주목할 때 약 0 - 1.0 밀리몰 사이의 전형적인 데카펩티드 농도를 언급하지만, 상이한 농도가 긍정적인 효과를 가질 수 있다. 따라서 일부 구현예는 1.0 밀리몰 또는 그 이상의 데카펩티드 농도를 활용할 수 있다. 다양한 구현예에 따른 펩티드 농도 범위의 예는 0.025 밀리몰, 0.05 밀리몰, 0.1 밀리몰, 0.2 밀리몰, 0.3 밀리몰, 0.4 밀리몰, 0.5 밀리몰, 0.6 밀리몰, 0.7 밀리몰, 0.8 밀리몰, 0.9 밀리몰, 및 1.0 밀리몰, 또는 그 이상이다.

상기 설명은 효과가 분명한 경우에 주목할 때 약 0.1 - 1.0 밀리몰 사이의 전형적인 옥시레스베라트롤 농도를 언급하지만, 상이한 농도가 긍정적인 효과를 가질 수 있다. 따라서 일부 구현예는 1.0 밀리몰 또는 그 이상의 옥시레스베라트롤 농도를 활용할 수 있다. 다양한 구현예에 따른 옥시레스베라트롤 농도 범위의 예는 0.1 밀리몰, 0.2 밀리몰, 0.3 밀리몰, 0.4 밀리몰, 0.5 밀리몰, 0.6 밀리몰, 0.7 밀리몰, 0.8 밀리몰, 0.9 밀리몰, 및 1.0 밀리몰, 또는 그 이상이다.

특정 성분(예를 들어, 데카펩티드, 옥시레스베라트롤)은 원하는 효과를 달성하기 위해 다른 성분(들)과 조합하여 사용될 수 있음에 추가로 주목한다. 예를 들어, 특정 데카펩티드는 데카펩티드 P4A, 4B, 및/또는 4C와 같은 다른 펩티드 및/또는 옥시레스베라트롤과 같은 다른 성분과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 구현예에 따르면, 다른 성분을 포함함으로써 실현되는 상승 효과는 원하는 결과를 달성하는 데 필요한 임의의 개별 성분(예를 들어, 데카펩티드, 옥시레스베라트롤, 기타)의 농도를 궁극적으로 감소시킬 수 있다.

상이한 구현예는 다양한 피부 세포 유형의 면역억제에 활용될 수 있음에 주목한다. 말단에 분화된 피부 세포의 예는 또한 시간 경과에 따라 노화되는 각질형성세포, 섬유모세포, 멜라닌세포, 및 또한 시간 경과에 따라 노화되는 랑게르한스 세포(예를 들어, 조직세포 또는 덴드로사이트)와 같은 면역 세포를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

특정 구현예는 또한 면역억제 및 피부 노화 감소를 위해 피부 전구 세포를 치료하고 평생 동안 피부 재생을 허용하기 위해 활용될 수 있다. 이러한 전구 세포의 예는 표피에 있는 랑게르한스 세포에 대한 전구체인 표피 각질형성세포 전구체, 섬유모세포, 멜라닌모세포, 조직형성세포, 또는 덴드로블라스트를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 설명은 인간 피부 세포의 치료에 초점을 맞추고 있지만, 구체적 구현예는 이러한 접근법에 제한되지 않는다. 대안적인 구현예는 소(예를 들어, 피부로부터 가죽의 제조 시), 돼지, 및 다른 동물(예를 들어, 콘테스트 목적을 위해 피부 외관에 기초하여 평가될 수 있는 개, 고양이, 및 다른 것들)과 같은 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 유기체로부터의 피부 세포의 치료를 이용할 수 있다.

더욱이, 상기 설명은 피부 세포의 치료에 초점을 맞추고 있지만, 구현예는 이 유형 또는 임의의 다른 유형의 세포에 제한되지 않는다. 일부 구현예는 다양한 유형의 포유류 및 심지어 비-포유류 세포를 치료할 수 있다.

그리고, 일부 구현예에 따르면, 치료는 포유류 대상체에게 경구 투여를 통해 일어날 수 있다. 대안적으로, 치료는 직접 적용 또는 표적화된 국소 적용(예를 들어, 주사)과 같은 다른 전달 형태를 수반할 수 있다.

양태 1B. 세포의 면역억제를 수행함으로써 대상체를 치료하는 방법으로, 상기 방법은 유효량의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 하나 이상의 펩티드는 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 또는 서열번호: 12를 포함하는, 방법.

양태 2B. 양태 1B에 있어서, 상기 펩티드가 서열번호: 9로 이루어진, 방법.

양태 3B. 양태 1B에 있어서, 상기 펩티드가 변형 기에 의해 변형된 서열번호: 9로 이루어지며, 상기 변형 기가 아미노-말단 단부에서 팔미토일 기 또는 아세틸 기이거나, 또는 카복시-말단 단부가 아미드화되거나, 또는 둘 다인, 방법.

양태 4B. 양태 1B에 있어서, 상기 펩티드가 D-이소형으로서 위치 6에 티로신 아미노산을 갖고, 다른 모든 아미노산이 L-이소형인 서열번호: 11로 이루어진, 방법.

양태 5B. 양태 1B에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인, 방법.

양태 6B. 양태 5B에 있어서, 상기 포유류 세포가 피부 세포인, 방법.

양태 7B. 양태 6B에 있어서, 상기 포유류 피부 세포가 전구체인, 방법.

양태 8B. 양태 7B에 있어서, 상기 전구체가 표피 각질형성세포 전구체, 멜라닌모세포, 섬유모세포, 조직형성세포, 또는 덴드로블라스트인, 방법.

양태 9B. 양태 1B, 5B, 6B, 7B, 및 8B 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 투여가 경구 투여에 의한 것인, 방법.

양태 10B. 양태 1B에 있어서, 상기 세포가 말단에 분화되는, 방법.

양태 11B. 양태 10B에 있어서, 상기 세포가 각질형성세포, 멜라닌세포, 섬유세포, 조직세포, 또는 덴드로사이트인, 방법.

양태 12B. 양태 1B에 있어서, 상기 펩티드가 약 1 밀리몰 이하의 농도로 존재하는, 방법.

양태 13B. 양태 1B에 있어서, 상기 조성물이 옥시레스베라트롤을 추가로 포함하는, 방법.

양태 14B. 세포의 면역억제를 수행함으로써 대상체를 치료하는 방법으로, 상기 방법은 유효량의 옥시레스베라트롤을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

양태 15B. 양태 14B에 있어서, 상기 옥시레스베라트롤이 약 0.1 - 1.0 밀리몰 사이의 농도로 존재하는, 방법.

양태 16B. 양태 14B에 있어서, 상기 조성물이 유효량의 하나 이상의 펩티드를 추가로 포함하며, 여기서 하나 이상의 펩티드는 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 또는 서열번호: 12를 포함하는, 방법.

양태 17B. 양태 16B에 있어서, 상기 펩티드가 서열번호: 9로 이루어진, 방법.

양태 18B. 양태 16B에 있어서, 상기 펩티드가 약 1 밀리몰 이하의 농도로 존재하는, 방법.

양태 19B. 양태 14B에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인, 방법.

양태 20B. 양태 19B에 있어서, 상기 포유류 세포가 피부 세포인, 방법.

양태 21B. 양태 20B에 있어서, 상기 포유류 피부 세포가 전구체인, 방법.

양태 22B. 양태 21B에 있어서, 상기 전구체가 표피 각질형성세포 전구체, 멜라닌모세포, 섬유모세포, 조직형성세포, 또는 덴드로블라스트인, 방법.

양태 23B. 양태 14B, 19B, 20B, 21B, 및 22B 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 투여가 경구 투여에 의한 것인, 방법.

양태 24B. 양태 14B에 있어서, 상기 세포가 말단에 분화되는, 방법.

양태 25B. 양태 24B에 있어서, 상기 세포가 각질형성세포, 멜라닌세포, 섬유세포, 조직세포, 또는 덴드로사이트인, 방법.

본 발명의 이러한 설명은 예시 및 설명의 목적을 위해 제시되었다. 이는 본 발명을 기재된 정확한 형태로 제한하거나 또는 배타적인 것으로 의도하지 않으며, 상기 교시에 비추어 많은 변형 및 변경이 가능하다. 구현예는 본 발명의 원리 및 실제 적용을 가장 잘 설명하기 위해 선택되고 기재되었다. 이 설명은 당업자가 다양한 구현예에서 특정 용도에 적합한 다양한 변형으로 본 발명을 가장 잘 활용하고 실시할 수 있게 할 것이다. 본 발명의 범위는 하기 청구범위에 의해 정의된다.

SEQUENCE LISTING <110> Escape Therapeutics, Inc. <120> Tyrosine Inhibitors with Immunosuppressive Activity in Human Neonatal Keratinocyte Progenitors <130> ELIXP005PC <150> US 62/794,582 <151> 2019-01-19 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gccaatcata agatgttgct gaac 24 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aacctccctc atctctaact 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gttggttaca agatccagac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 agagctgtga gagaatgaag 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tcttccatac actttactac ctt 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cagcttaaac aggagtgaac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gacattttta gccatttgtc 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cggaggttcg aagacgatca gata 24 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Ser Ser Trp Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> N-terminal Palmitoyl <220> <221> AMIDATION <222> (10)..(10) <400> 10 Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Ser Ser Trp Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> N-Terminal Palmitoyl <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> D-isoform <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 11 Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Ser Ser Trp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 12 Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Ser Ser Trp Tyr 1 5 10

Claims

세포의 면역억제를 수행함으로써 대상체를 치료하는 방법으로서, 유효량의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물을 면역억제를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 펩티드는 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 또는 서열번호: 12를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 펩티드가 서열번호: 9로 이루어진, 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인, 방법.
제3항에 있어서, 상기 포유류 세포가 피부 세포인, 방법.
제4항에 있어서, 상기 포유류 피부 세포가 전구체인, 방법.
제5항에 있어서, 상기 전구체가 표피 각질형성세포 전구체, 멜라닌모세포, 섬유모세포, 조직모세포, 또는 덴드로블라스트인, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 경구 투여에 의한 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포가 말단에 분화되는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 세포가 각질형성세포, 멜라닌세포, 섬유세포, 조직세포, 또는 덴드로사이트인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 펩티드가 약 1 밀리몰 이하의 농도로 존재하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 옥시레스베라트롤을 추가로 포함하는, 방법.
세포의 면역억제를 수행함으로써 대상체를 치료하는 방법으로서, 유효량의 옥시레스베라트롤을 포함하는 조성물을 먼역억제를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제12항에 있어서, 상기 옥시레스베라트롤이 약 0.1 밀리몰 내지 약 1.0 밀리몰의 농도로 존재하는, 방법.
제12항에 있어서, 상기 조성물이 유효량의 하나 이상의 펩티드를 추가로 포함하며, 상기 하나 이상의 펩티드는 서열번호: 9를 포함하는, 방법.
제15항에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 포유류 세포가 피부 세포인, 방법.
제16항에 있어서, 상기 포유류 피부 세포가 전구체인, 방법.
제17항에 있어서, 상기 전구체가 표피 각질형성세포 전구체, 멜라닌모세포, 섬유모세포, 조직모세포, 또는 덴드로블라스트인, 방법.
제12항 및 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 경구 투여에 의한 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 세포가 말단에 분화된 각질형성세포, 멜라닌세포, 섬유세포, 조직세포, 또는 덴드로사이트인, 방법.