KR20210106544A - 수산양식용 프로바이오틱 먹이 - Google Patents

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KR20210106544A
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칼리스 목슬리
버논 에롤 코인
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유니버시티 오브 케이프 타운
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Abstract

본 발명은 양식된 수생 동물에게 먹이원으로서 비브리오 미대 SY9를 공급하는 단계를 포함하는 수산양식 방법을 제공한다. 또한 비브리오 미대 SY9를 포함하는 먹이 조성물이 제공된다. 상기 수생 동물은 전형적으로 조류를 먹는 해양 동물이다. 이들은 전복 및 극피동물, 예컨대 성게, 해삼, 불가사리, 거미 불가사리, 연잎 성게류 및 바다나리류를 포함한다. 상기 비브리오 미대 SY9는 지지체 상에 형성된 알긴산염 막 상에 또는 내에 제공될 수 있다.

Description

수산양식용 프로바이오틱 먹이
[관련 출원에 대한 상호 참조]
본 출원은 2018년 12월 24일에 출원된 영국 특허출원번호 제1821191.2호로부터의 우선권을 주장한다.
[발명의 분야]
본 발명은 수산양식(aquaculture)에 사용하기 위한 프로바이오틱 먹이 조성물(probiotic food composition), 및 양식된 수생 동물에게 먹이를 공급하는 단계를 포함하는 수산양식 방법에 관한 것이다.
전복(abalone) 및 극피동물(echinoderm)과 같은 해양 동물의 수산양식은 악명높게 어렵다. 전복은 그것의 높은 영양소 함량 및 질감, 풍미 및 외관의 특유한 감각적 특성으로 인해 매우 인기 있는 해산물 상품이다. 그러므로 전복은 국제 시장에서, 특히 그것이 매우 고가의 진미인 아시아에서 높은 가격으로 팔릴 수 있다. 남획과 밀렵은 야생 전복 개체 수를 그것이 위협받을 정도로 감소시켰으며, 이제 양식 전복이 소비되는 전복 고기의 대부분을 공급하고 있다.
성체 전복은 옥외 유수로(outdoor raceway)에서 양식되지만, 생식세포 융합으로부터 후기 후-유생(post-larvae) 단계(보통 정착(settlement) 후 약 3개월)까지의 전복 발달 단계(도 1)는 실내 부화 시설에서 일어난다. 산란 과정 중에, 성적으로 성숙한 성체 어미(broodstock)는 그것의 생식세포를 별도의 산란 용기로 방출한다. 그런 후 자유롭게 헤엄치는 정자가 수정 용기에 조심스럽게 옮겨지고, 음의 부력을 가진 난자가 사이포닝에 의해 수정 용기에 첨가된다. 수컷과 암컷 생식세포의 융합 후에, 수정된 난자가 용기의 바닥으로 가라앉는다. 난자가 수집되고 별도의 용기 중에 나누어지고, 밤새 배아 발달이 일어난다. 이 과정 중에, 배아는 반복된 분열이 진행되어 트로코포어 유생(trochophore larvae)이 형성되고, 그것은 물의 상부층까지 헤엄친다. 트로코포어의 발달은 수정 후 약 24시간 후에 완료된다. 그런 후, 사육수(rearing water)의 상부 70-80%는 유생 사육 용기로 빨아들여지고 그곳에서 트로코포어가 자유롭게 헤엄치는 플랑크톤 유생으로 부화한다. 전복은 여러 날 동안 유생 단계로 유지되고(할리오티스 미대(H. midae)의 경우 20℃에서 약 5일 또는 17.5℃에서 7일), 그런 후에 그것들은 정착할 수 있게 된다. 이 단계에서, 유능한 유생이 원하는 정착 밀도로 준비된 정착 탱크에 분포된다. 상업적 부화장에서, 정착 표면은 대형 유동 탱크에서 수직으로 부유하는 전형적으로 평평하거나 물결모양의 플라스틱 판이다. 유생을 첨가하기 전 약 3주 동안, 이들 정착 표면은 유동 탱크에서 수동 파종(즉, 유입되는 해수가 대량 서식하는 미생물을 제공함) 및 빛에의 노출을 통해 "조건화"된다. 이런 조건화 기간은 생물막(biofilm)의 성장을 촉진한다. 생물막은 고전적으로 액체- 또는 공기-표면 인터페이스를 식민지화하고 EPS(세포외 중합체 물질)의 매트릭스 내에서 캡슐화되는 미생물 집단으로서 언급된다. 부화장 배양에서, 생물막은 미세조류, 특히 저서 규조류(benthic diatoms), 및 해양 박테리아의 이질적 집단을 특징으로 한다. 이들 생물막은 후-유생 전복이 비부유성 단계(juvenile phase)가 시작될 때 인공 먹이 또는 거대조류로 먹이섭취가 옮겨갈 때까지 그들에 대한 주요 먹이원(food source)이다.
유감스럽게도, 할리오티스 미대의 최적 상업적 생산을 제한하는 선두 요인 중 하나는 생산의 부화 단계 중에 전형적으로 부딪히는 성능 저하이다. 부화장은 자주 낮은 생존율 및 불량한 성장률에 의해 어려움을 겪으며, 그것은 양질의 비부유성의 양식 과정의 성장 단계로의 정규 공급을 위협한다.
상기 기술된 규조류 생물막의 발생은 이들 생물막이 품질과 양의 측면에서 매우 가변적인 경향이 있고, 그로써 자주 후-유생 전복의 에너지 요구조건 또는 특수한 영양적 요구를 적절하게 충족시키지 못하기 때문에 관리하는 것이 매우 어렵다. 후-유생 발달을 위해 일관되고 영양가 있는 식이(diet)를 제공하지 못하는 이런 무능력은 낮은 생존율과 불량한 성장률에 기여하는 주요 요인으로서 인식되었고, 그것은 전복 수산양식의 성장 단계로의 양질의 비부유성의 정규 공급을 위협한다.
그러므로 후-유생 전복을 위한 영양적으로 완전한 식이를 제공할 수 있는 인공 제제의 개발에 수많은 연구 노력이 집중되었다. 예를 들어, 후-유생 생산 시스템(PPS)은 단백질, 탄수화물 및 영양소 혼합물을 함유한 알긴산염-기반 식이를 포함한다. 이런 인공 미세-미립자 식이는 단단한 물결모양 플라스틱 판 위에 칠해진다. 식이는 전체 생존율을 개선하지만 성장을 개선하지는 못하는 것으로 보고되었다. 식이는 또한 2일마다 재-코팅될 필요가 있었다. 스토트 전복 유생후 생산 시스템(SAPPS)으로 불리는 대체 인공 식이는 아가(0.5-1.0%)의 온도-관련 설정 특성에 의존한다. 이들 아가 제제는 인공 미세-식이와 혼합되고 단단한 물결모양 플라스틱 판 위로 분무된다. SAPPS 식이는 후-유생 전복의 성장 및 생존율을 개선시켰지만, 판은 여전이 1-2일마다 재분무될 필요가 있었다. 상기 식이를 전복 배양 표면에 제제화하고 유지하는 데 필요한 집약적인 노동 및 높은 비용으로 인해, 그것은 대규모 전복 생산에는 적합하지 않다.
그러므로, 인공 먹이의 개발은 현재의 부화장 급식(feeding) 기술에 대한 유망한 대안을 나타내지만, 현장에서 거의 진전이 이루어지지 않았으며, 상업적 상황에서 경제적으로 실행 가능할 대체 전략에 대한 필요성이 남아 있다.
발명의 제1 구현예에 따르면, 수생 동물의 수산양식 방법이 제공되며, 상기 방법은 수생 동물에게 먹이원으로서 적어도 비브리오 미대(Vibrio midae) SY9를 공급함으로써 수생 동물이 성장하게 하는 단계를 포함한다.
상기 비브리오 미대 SY9는 막(film) 상의 또는 막 내의 수생 동물에게 공급될 수 있다.
상기 막은 지지체 상에 형성될 수 있다.
상기 막은 탄수화물 결합제, 예컨대 알긴산염(alginate)을 포함할 수 있다.
상기 막 상의 또는 막 내의 비브리오 미대 SY9의 농도는 적어도 108 세포/cm2일 수 있다.
상기 방법은 추가 먹이원으로서 규조류를 상기 수생 동물에게 공급하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 규조류는 상기 비브리오 미대 SY9와 동일한 막 상에 또는 내에 공급될 수 있다.
상기 막 내의 규조류의 농도는 적어도 106 세포/cm2일 수 있다.
대안으로, 상기 방법은 먹이원으로서 규조류를 수생 동물에게 공급하는 단계 없이 수행될 수 있다.
또한 상기 방법은 5일 이상 후에 막을 교체하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 수생 동물은 해수 동물(salt water animals), 예컨대 전복 극피동물(예컨대 성게(sea urchins), 해삼(sea cucumbers) 등) 일 수 있다.
발명의 제2 구현예에 따르면, 수생 동물 사료용으로 제제화된 먹이 조성물이 제공되며, 상기 먹이 조성물은 먹이원으로서 비브리오 미대 SY9를 포함한다.
상기 비브리오 미대 SY9는 막 위에 코팅되거나 막 내에 캡슐화될 수 있다.
상기 막은 표면 상에 형성될 수 있다.
상기 막은 탄수화물 바인더, 예컨대 알긴산염으로부터 형성될 수 있다.
상기 먹이 조성물 중의 비브리오 미대 SY9의 농도는 적어도 109 세포/ml일 수 있다.
상기 먹이 조성물은 또한 후-유생 전복을 위한 추가 먹이원으로서 규조류를 포함할 수 있다.
상기 먹이 조성물 중의 규조류의 농도는 적어도 107 세포/ml일 수 있다.
상기 먹이 조성물은 5일 이상 동안 수성 조성물에서 안정적일 수 있다.
상기 수생 동물은 해수 동물, 예컨대 전복 및 극피동물(예컨대 성게, 해삼 등) 일 수 있다.
도 1은 전복, 할리오티스 종(Haliotis spp.)의 생애 주기를 도시한다(http://oceanlinkisland.net/Conservation/abalone/BHCAP/development.html에서 다시 그려짐).
도 2는 3개의 별도의 실험으로 테스트된, 프로바이오틱 비브리오 미대 K811, 코코네이스 종(Cocconeis sp.), 또는 프로바이오틱과 코코네이스 종 둘 다의 혼합물로 이루어진 인공 생물막 식이를 25일 동안 먹인 후-유생 할리오티스 미대의 생존율을 도시한다. 각각의 탱크는 150마리 전복의 초기 스톡 밀도를 가졌다.
비브리오 미대 SY9를 포함하는 먹이 조성물과 함께, 먹이원으로서 비브리오 미대 SY9를 양식된 수생 동물에게 공급하는 단계를 포함하는 수산양식 방법이 본원에서 기술된다.
수생 동물은 전형적으로 해조류를 먹는 해양 동물이며, 특히 그들의 생애 주기에서 자유롭게 헤엄치는 유생 단계를 가진 동물이다. 유생은 적절한 기판 위에 정착하고 탈바꿈한다. 이들 동물은 전복 및 성게, 해삼, 불가사리(starfish), 거미 불가사리(brittle stars), 연잎 성게류(sand dollars) 및 바다나리류(crinoids)와 같은 극피동물을 포함한다. 한 구현예에서, 비브리오 미대 SY9는 후-유생 단계의 이들 동물에게 공급된다.
전복은 할리오티대(Haliotidae)과의 해양 복족류 연체 동물(gastropod molluscs) 그룹의 일반명이다. 다른 일반명은 귀 껍질(ear shells), 바다 귀(sea ears), 머튼피시(muttonfish), 머튼껍질(muttonshells), 오메르(ormer) 및 파우아(paua)이다. 전세계적으로 인정된 종의 수는 30 내지 130개이며, 남아프리카의 가장 큰 전복은 할리오티스 미대이다. 전 세계 다양한 지역에서 양식된 다른 상업적으로 중요한 전복 종으로 할리오티스 다이버시컬러(Haliotis diversicolor), 할리오티스 루브라(Haliotis rubra), 할리오티스 디스쿠스 한나이(Haliotis discus hannai) 및 할리오티스 루페센스(Haliotis rufescens)를 들 수 있다.
용어 "후-유생"은 헤엄치는 유생이 물 기둥으로부터 단단한, 물에 잠긴 표면 위로 정착한 후 탈바꿈이 진행된 후 발생하는 생애 주기의 일부분을 나타낸다(도 1).
본원에서 사용되는 프로바이오틱은 장 균형을 개선함으로써 숙주 동물에게 유익하게 영향을 미치는 살아있는 미생물 보충물로서 정의된다.
후-유생 전복은 근육질 발에 의해 단단한 표면에서 이동성이 있고 약 3개월의 기간 동안 저서 규조류와 박테리아의 생물막을 먹는다. 후-유생 전복이 충분히(5-10 mm의 껍질 길이) 성장한 후에는, 저서 규조류의 먹이로부터 거대조류(해초)를 먹는, 먹이섭취가 옮겨간 비부유성 전복이 된다.
연구 결과 프로바이오틱스가 비부유성 및 성체 전복 배양의 결과를 개선하는 잠재력이 입증되었다. 그러나, 초기 발생 단계 중에 전복(및 일반적으로 수생 종)에 미치는 프로바이오틱스의 영향에 대해 알려진 것은 거의 없다.
출원인은 이제 비브리오 미대 SY9가 저서 규조류 집단서식 생물막의 부재시에 후-유생 할리오티스 미대의 성장 및 생존율을 개선시킬 수 있는 것을 나타냈다.
비브리오 미대 SY9는 기판 또는 표면 상에서 또는, 전형적으로 지지체 상에 형성된 막 또는 생물막 상에서 또는 내부에서 동물에게 공급될 수 있다. 지지체는 고체 표면, 예컨대 유리 또는 플라스틱 재료로부터 만들어진 시트 또는 판일 수 있다. 한 예에서, 지지체는 평평하고 다른 예에서 지지체는 물결무늬 등이 있다. 고체 표면은 막의 부착을 개선하기 위하여 메시형 직물을 함유할 수 있다. 대안으로, 지지체는 네트, 거즈 또는 메시-유사 물질일 수 있고, 프레임 내에 위치할 수 있다. 막은 결합제, 예를 들어 알긴산염, 전분 또는 아가와 같은 탄수화물 결합제로부터 형성될 수 있다.
비브리오 미대 SY9 세포는 동물에게 제공된 일차 또는 주요 영양소일 수 있다. 규조류는 추가 먹이원으로서 선택적으로 제공될 수 있다. 규조류는 실리카의 세포벽을 가진 단일 세포의 조류이다. 비록 저서 규조류의 생물막이 유입되는 해수로부터 자발적으로 생성되지만, 후-유생 전복 배양에 바람직한 일반 규조류로는 나비큘라(Navicula), 암피프로라(Amphiprora) 및 코코네이스 종을 들 수 있다. 방법은 대안으로, 먹이원으로서 규조류를 공급하는 단계 없이, 특히 동물이 유지되는 탱크에서 자발적으로 발생되지 않는 규조류를 도입하는 단계 없이 수행될 수 있다.
막에서의 비브리오 미대 SY9의 농도는 적어도 108 세포/cm2일 수 있고, 만약 존재한다면, 규조류의 농도는 적어도 106 세포/cm2일 수 있다.
막은 프로바이오틱의 일정한 공급을 상대적으로 높은 농도에서 보장하기 위하여 전형적으로 5일마다 교체된다. 그러나, 막의 제제를 변경시키는 것은 교체 기간의 연장, 예컨대 10일 이상으로의 연장을 초래할 수 있을 것으로 예상된다.
3개의 별도의 실험실 규모 실험에서, 후-유생 할리오티스 미대(평균 껍질 길이 2.7 mm)에게 알긴산염 및 추정 프로바이오틱 비브리오 미대 SY9 단독(식이 1), 저서 규조류 코코네이스 종과 비브리오 미대 SY9 K811의 혼합물(식이 2) 또는 코코네이스 종 단독(규조류 대조군 식이) 중 하나로 이루어진 3개의 상이한 인공 생물막 식이를 먹였다. 전복 생존율이 25일 동안 모니터링되었고, 성장이 전복 껍질 길이를 측정함으로써 정량화되었다. 결과는 비브리오 미대 SY9가 이들 동물의 생존율을 상당히 개선하고 성장률에서 3배 증가를 촉진함으로써 후-유생 할리오티스 미대에 프로바이오틱 효과를 가지는 것을 확인시켜주었다. 이들 결과는 후-유생 할리오티스 미대가 규조류 세포가 없는 박테리아 막 식이 상에서 생존하고 성장할 수 있는 것을 입증한다. 그러므로 박테리아가 후-유생 할리오티스 미대에 대한 주요 먹이원으로서 규조류를 대신할 수 있다. 이 연구에서 기술된 프로바이오틱 식이는 후-유생 전복에 대한 보다 믿을만하고 일관된 영양 공급원을 제공함으로써 상업적 전복 부화장에 대해 중요한 경제적 영향을 줄 수 있다. 후-유생 성장 및 생존율을 개선하는 것은 부화장 생산성을 크게 향상시킬 수 있고 전복 수산양식의 경제적 잠재력을 부양시킬 수 있다.
출원인이 알고 있는 한, 후-유생 전복 및 성게에 대한 직접적인 먹이원으로서 프로바이오틱 미생물의 사용이 기술된 것은 이것이 처음이다.
발명은 이제 전복이 예시의 수산양식 동물로서 사용되고 비브리오 미대 SY9가 예시의 프로바이오틱으로서 사용되는 하기의 비제한적인 실시예에 의해 보다 상세하게 기술될 것이다.
실시예
물질 및 방법
미생물 및 성장 배지
비브리오 미대 SY9(BCCM 등록 번호 MUCL 54982)를 먼저 성체 할리오티스 미대(Macey & Coyne, 2005)의 위장관으로부터 분리하였다. 스트레인 K811로 지정된, 비브리오 미대 SY9의 유전자 변형된 스트레인을 이 연구에서 사용하여 인공 먹이 제제에서 이 박테리아의 정량화를 할 수 있게 하였다. 비브리오 미대 K811은 스트렙토마이신에 대해 내성이며 생물발광 플라스미드 pKluxCat를 함유한다. 이 플라스미드는 포토르하브두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens)로부터의 lux 오페론(luxCDABE)을 함유하는 pAKlux2의 유도체이다(Karsi and Lawrence 2007). pAKlux2를 트랜스콘쥬간트의 항생물질 선택을 가능하게 하기 위하여 Tn9 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제(cat) 유전자의 첨가에 의해 변형시켰다(미공개 데이터). 비브리오 미대 K811을 120 μg/ml 스트렙토마이신 및 15 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 트립톤 소이 브로스(soy broth)(30 g/L NaCl, 17 g/L 트립톤, 6 g/L 펩톤, 2.5 g/l 글루코스, 2.5 g/L K2HPO4, pH7.8)에서 일상적으로 성장시키고 궤도 셰이커에서 150 rpm 및 25℃에서 인큐베이션하였다.
코코네이스 종을, 이 속의 구성원이 생물막을 먹는 후-유생(post-larvae) 전복(껍질 길이 >0.8 mm임)에 대한 주요 먹이원이기 때문에 이 연구를 위해 선택하였다. 코코네이스 종의 단일하지만 유균성 배양물을 수산산림부(Department of Forestry and Fisheries, DAFF) 연구 수족관(Cape Town, South Africa)으로부터 공급받았다. 배양물을 1 ml/L 메타규산 나트륨(40 g/L Na2SiO3 무수 스톡 용액) 및 20 ml/L 길라드 f/2 배지(Sigma-Aldrich)가 보충된 멸균 인공 해수(24.7 g/LNaCl, 4.7 g/L MgCl2·6H2O, 1.9 g/L CaCl2·2H2O, 6.3 g/L MgSO4·7H2O, 0.66 g/LKCl, 0.18 g/L NaHCO3, pH 7.8)에서 일상적으로 성장시켰다. 배양물을 15℃에서 12시간:12시간 명:암 광주기(광 세기 4.91 μmol/초/m2) 하에 인큐베이션하였고 각 배양액에 공기 호스를 매달아서 폭기(aeration)를 공급하였다.
인공 생물막 식이 제조
3개의 알긴산염-기반 생물막 식이를 제조하였다: 프로바이오틱 비브리오 미대 K811 단독으로 이루어진 막(식이 1), 비브리오 미대 K811 및 코코네이스 종 두 가지로 이루어진 혼합 생물막(식이 2), 및 코코네이스 종 단독으로 이루어진 생물막(규조류 대조군 식이). 신선한 생물막 또는 막을 각각의 25-일 성장 실험 과정 동안 3일마다 제조하였다.
유리 판의 제조
모기장 조각(11 cm x 19 cm)을 유리 판(11 cm x 19 cm, 3 mm 두께)의 가장자리에 해양 실리콘을 사용하여 부착시켰다. 30 g/L 알긴산 나트륨(Sigma-Aldrich)을 함유한 용액을 인공 해수(ASW)에 제조하여 제조된 표면에 0.05 ml/cm2의 부피로 첨가하였다. 혼합물을 L-자형 유리 스프레더를 사용하여 표면 위로 고르게 분산시켰다. 그런 후 알긴산염-코팅 표면을 24시간 동안 25℃에서 건조시킨 후 필요할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
비브리오 미대 K811 세포 현탁액의 제조
각각의 새로운 생물막 세트에 대해, 비브리오 미대 K811의 배양물을 표준 조건 하에서 4시간 동안, 대략 5 x 108 프로바이오틱 세포/ml과 동등한 OD600=1.0까지 성장시켰다. 각 배양물로부터 세포를 별도로 원심분리(10　000 xg, 10℃, 10분)에 의해 수득하였다. 상층액을 버리고 각각의 박테리아 세포 펠릿을 100 ml의 ASW로 2회 세척하였다. 그런 후, 각각의 박테리아 펠릿을 10 ml의 ASW에 현탁시켜서 대략 5　x　109　세포/ml의 농도를 만들었다. 프로바이오틱 세포 현탁액을 사용하여 비브리오 미대 K811 단독으로 이루어진 단일종 생물막(식이 1)을 제조하였다.
코코네이스 종 세포 현탁액의 제조
각각의 새로운 생물막 세트에 대해, 적절한 부피의 코코네이스 종 배양물을 표준 조건 하에 5일 동안 대략 107　세포/ml의 농도까지 성장시켰다. 각 배양물로부터 바이오매스를 별도로 원심분리(10　000 xg, 10℃, 10분)에 의해 수득하였다. 상층액을 버리고 각각의 바이오매스 샘플을 100 ml의 ASW로 2회 세척하였다. 코코네이스 종 단독으로 이루어지는 생물막의 경우, 규조류 세포 펠릿을 10 ml의 ASW에 현탁시켜서 대략 5　x　107　세포/ml의 농도를 만들었다. 규조류 세포 현탁액을 사용하여 이 연구에서 대조군 식이를 나타내는, 코코네이스 종 단독으로 이루어지는 단일종 생물막을 제조하였다.
혼합종 세포 현탁액의 제조
코코네이스 종의 펠릿화된 세포를 ASW에 현탁하지 않고 비브리오 미대 K811의 현탁액(상기 기술된 것과 같이 제조됨)에 현탁하였다. 이것으로 대략 5 x 109 프로바이오틱 세포/ml 및 대략 5 x 107 규조류 세포/ml의 최종 농도의 두 미생물로 이루어진 혼합종 세포 현탁액이 생성되었다. 이들 혼합종 세포 현탁액을 사용하여 혼합종 생물막(식이 2)을 생성하였다.
생물막의 제조
각각의 세포 현탁액을 제조된 유리 판에 40 cm2당 1 ml의 부피로 첨가하였다. 미생물을 L-자형 유리 스프레더를 사용하여 표면 위에 고르게 분산시켰다. 모든 판을 실온(대략 25℃)에서 20분 동안 인큐베이션하여 세포가 알긴산염-코팅 표면에 부착하도록 한 후, ASW에 침지하여 약하게 부착된 세포를 제거하였다.
생물막 구성요소의 정량화
모든 생물막을 Xenogen IVIS-Illumina II를 사용하여 시각화하여, 발광 및/또는 형광의 생체내에서의 동시 검출을 가능하게 하였고, 이미지를 Living Image 소프트웨어를 사용하여 포착하였다. 발광(비브리오 미대 K811)의 검출을 위한 획득 파라미터는 10초 노출, 작은 비닝(binning), f/중단 1, 오픈 필터 및 12.5 cm 시야(FOV)를 포함하였다. 형광(코코네이스 종)의 검출을 위한 획득 파라미터는 10초 노출, 작은 비닝, f/중단 8, 695-770 nm 여기 필터, Cy5.5 방출 필터, 12.5 cm FOV를 포함하였다. 기록한 모든 데이터를 노출 초당 포착된 빛의 광자의 수(p/s)를 나타내는 광자 플럭스를 사용하여 측정하였다.
각각의 시점에 생물막에 존재하는 미생물 세포의 수를 정량화하기 위하여, 기록된 플럭스(p/s) 데이터를, 플럭스(p/s) 대비 미생물 세포/cm2를 도표화함으로써 제작된 확립된 보정 곡선과 비교하였다. 비브리오 미대 K811의 세포를 생존 판 카운트(CFU/ml)를 사용하여 정량화하는 한편, 코코네이스 종의 세포를 카운팅 챔버(Neubauer improved, 크기: 0.0025 mm2 x 0.01 mm)를 사용하여 정량화하였다. 생체내에서 발광 및 형광의 정확한 검출을 위해 필요한 발광 비브리오 미대 K811 세포의 최소 수는 각각 대략 104 세포/cm2(비브리오 미대 K811) 및 105　세포/cm2(코코네이스 종)인 것으로 나타났다.
후-유생 전복의 실험실-기반 배양에 사용된 전형적인 조건 하에서 3개의 인공 생물막의 확인
이중으로 후-유생 전복에 대한 전형적인 하우징 조건(상기 기술됨)을 사용하여 3개의 상이한 생물막 식이의 수중 안정성을 테스트하기 위하여 6개의 유리 탱크(베이스 20 x 25 cm, 높이 20 cm, 유리 두께 2 mm)를 제조하였다. 동일한 구성요소를 함유한 2개의 생물막을 총 5일 동안 인큐베이션하는 각 유리 탱크의 바닥에 수평으로 배치하였다. 생물막을 24시간마다 탱크로부터 제거하여 생물막에 남아 있는 비브리오 미대 K811 및/또는 코코네이스 종의 농도를 앞서 기술된 것과 같이 정량화하였다.
후-유생 할리오티스 미대 성장 실험
후-유생 할리오티스 미대의 성장이 미치는 3개의 상이한 생물막 식이의 영향을 남아프리카 케이프타운 대학의 분자 및 세포 생물학 실험실에서 수행한 3개의 별도의 성장 실험으로 평가하였다. 각각의 성장 실험 기간은 25일이었다.
유리 하우징 탱크에 대한 사양
각각의 성장 실험에 대해, 6개의 별도의 유리 하우징 탱크(베이스 20 x 25 cm, 높이 20 cm, 유리 두께 2 mm)를 제조하여 3개의 상이한 생물막 식이의 각각을 이중으로 테스트하였다. 밀폐된, 재순환수 시스템을 사용하였다. 모든 탱크를 여과된(0.22 μm) 천연 해수(NSW)로 15 cm의 깊이까지 채웠다. 물 교환(50%)을 4-5일마다 사이포닝에 의해 수행하여 양호한 수질을 유지하였다. 더불어, 각각의 탱크에 성장 실험 내내 계속해서 실행되는 작은 잠수 물 필터(BOYU, 모델 SP-6011)를 장착하였다. 각각의 탱크를 공기 압축기(BOYU, 모델 ACQ-007)에 의해 공급된 에어 호스를 매달고, 각 탱크에서 에어 스톤으로 종결함으로써 폭기시켰다. 주변 온도를 15℃로 유지하였다. 12시간:12시간 명:암의 광 주기가 이어졌다. 각 탱크의 상부를 검은색 플라스틱 시트로 덮어서 낮은 광 조건을 선호하는 전복이 경험하는 광 세기뿐만 아니라 물 증발을 제한하였다. 실험 1 중에, 탱크를 오버헤드 공기-조절 장치 바로 아래에 하우징하였다. 그러나, 실험 2 및 3의 경우, 탱크를 실험 1에서 얻어진 결과에 영향을 미칠 수 있는 물 증발을 제한하기 위하여 공기-조절 장치로부터 2미터 떨어져 하우징하였다.
후-유생 할리오티스 미대
후-유생 할리오티스 미대(동일한 어미로부터 기원함)의 3개의 별도의 배치를 Jacobsbaai Sea Products(Jacobsbaai, South Africa)사로부터 기증받았다. 앞서, 전복은 상업적 부화장 시설 내에서 정착되고 천연 규조류 생물막 상에서 성장하였다. 부화장으로부터 수집되는 동안, 동물을 크고 부드러운 페인트 솔을 사용하여 플라스틱 정착 판의 표면에서 털어내어 플라스틱 용기(베이스 22 x 26 cm, 높이 10 cm)로 옮겼다. 용기를 해수로 절반을 채우고, 단단히 밀봉하여 본 발명자들의 실험실로 수송하기 위해 쿨러 박스에 냉동 아이스팩 사이에 두었다. 양식 표면으로부터 전복을 제거하고 그것을 실험 탱크로 수송하기까지 걸리는 시간은 3시간을 초과하지 않았다. 작고, 부드러운 페인트 솔을 사용하여, 150마리의 전복을 개별적으로 6개의 유리 탱크 각각으로 옮겼다. 전복을 실험을 시작할 때 개별적으로 발이 아래로 향하도록 두었고 그것의 방향을 매일 체크하였다. 필요에 따라, 전복을 부드러운 페인트 솔을 사용하여 발이 아래로 향하도록 회전시켰다. 동물은 성장 실험이 시작되기 전에 적응하거나 굶주리지 않았다. 실험 기간 중의 사망률을 제거하고 정량화하였다.
급식(feeding) 체제
전복을 릴레이식 체제에 따라 먹이를 주었다. 시험을 시작할 때, NSW를 15 cm의 깊이까지 함유하고 있는 각 탱크를 플라스틱 빨래 집게로 고정된 유리 칸막이(20 cm x 20 cm, 2 mm 두께)를 사용하여 2개의 동일한 절반으로 나누었다. 그런 후, 프로바이오틱 스트레인 K811 단독(식이 1), 두 미생물의 혼합물(식이 2) 또는 코코네이스 종 단독(규조류 대조군)을 함유한 한 생물막을 각 탱크의 한 쪽 절반의 바닥에 수평으로 배치하였다. 그런 후 전복을 탱크의 이 절반에 첨가하고 실험의 처음 3일 동안 제한시켰다. 3일째에, 신선한 생물막을 각 탱크의 나머지 절반에 배치하고 유리 칸막이를 제거함으로써, 전복이 두 생물막 사이를 자유롭게 이동하도록 하였다. 실험의 처음 3일 동안 탱크의 한쪽 절반에 동물을 제한시키는 것은 제2 생물막이 시스템에 첨가되었을 때 전복이 탱크의 유리 바닥에 갇히지 않는 것을 보장하였다. 6일 째에, 제1 생물막을 제거하고 신선한 생물막으로 교체하였다. 유사하게, 9일 째에, 제2 생물막을 제거하고 교체하였다. 이런 방식으로 급식을 지속함으로써 하나의 신선한 생물막이 3일마다 전복에게 제공되었고, 노화한 생물막은 6일 동안 방목된 후 제거되었다. 각각의 판에 부착하는 세포 바이오매스를 생물막 제조 직후뿐만 아니라 전복 방목 후 6일 후에 정량화하였다.
전복 성장의 정량화
각각의 실험을 시작할 때, 50마리의 전복을 동물의 초기 풀로부터 무작위로 선택하여 껍질 길이를 전자 버니어 캘리퍼스를 사용하여 0.01 mm에 가장 가깝게 측정하였다. 25-일의 실험 기간 후에, 각 탱크로부터의 50마리의 무작위-선택한 동물의 껍질 길이를 측정하였다. 상이한 식이를 먹인 전복의 껍질 길이의 백분율 증가뿐만 아니라 일일 성장률(μm/일)을 계산하였다.
통계적 분석
데이터를 해당되는 경우 평균 및 표준 오차(SE)로서 나타낸다. 생물막 수중 안정성의 확인을 위해, 학생 T-검정을 T20분, T24시간 및 T120시간(각 시점에 n = 4개 생물막)에서의 두 그룹간 통계적 비교에 사용하였다. 후-유생 전복의 성장 및 생존율에 미치는 프로바이오틱 식이 보충의 영향을 일원변량분석(ANOVA)을 사용하여 측정하였다. 후-유생 전복의 최종 평균 껍질 길이(SLT25)가 미치는 식이의 영향을 측정하기 위하여, 각 탱크에 대한 데이터를 개별 전복이 중복으로 사용되도록 각 실험에서 별도로 고려하였다(각 탱크에 대해 n=50). % 생존율(뿐만 아니라 %SL 증가 및 일일 성장률)의 통계적 분석을 위해, 모든 3개 실험에 대한 % 생존율 데이터(또는 %SL 증가/일일 성장률 데이터)를 식이별로 그룹화하였다(즉, 3개의 상이한 식이 각각에 대해 n=6). 통계적으로 유의미한 차이를 p<0.05에서 확립하였다. ANOVA의 영향이 유의미하였을 때, 다중 비교를 위한 사후 Tukey 검정을 사용하여 샘플 평균간 유의미한 차이를 테스트하였다. 모든 분석을 R 버전 3.0.1(R Development Core Team, 2014)을 사용하여 수행하였다.
결과
전형적인 전복 하우징 조건 하에서 3개의 인공 식이의 성능
비브리오 미대 K811의 T20분 농도(표 1)는 박테리아 생물막(식이 1)과 혼합종 생물막(식이 2) 사이에서 유의미하게 상이하지 않았다(p = 0.162). 평균적으로, 이들 생물막 중의 비브리오 미대 K811의 초기 농도는 1.20 x 108 세포/cm2였다. 유사하게, 코코네이스 종의 T20분 농도(표 1)는 규조류 대조군 식이와 혼합종 생물막(식이 2) 사이에서 유의미하게 상이하지 않았다(p = 0.107). 평균적으로, 이들 생물막 중의 코코네이스 종의 초기 농도는 2.56 x 106 세포/cm2였다. 생물막을 폭기 및 여과 장치로 인해 상당한 물 흐름이 있는 NSW를 함유하고 있는 유리 수족관에서 계속해서 인큐베이션하였다. 상이한 제제로부터의 미생물 세포의 손실을 5일 동안 모니터링하였다. 실험 내내 단일- 및 혼합종 생물막 사이에서 코코네이스 종 및 비브리오 미대 K811의 농도에는 유의미한 차이가 없었다.
전체적으로, 이 실험으로부터의 결과는 NSW에서의 연장된 인큐베이션 후에도, 각 미생물 구성요소의 농도가 상이한 생물막 사이에서 비슷한 것을 입증한다. 5일의 과정 동안 생물막으로부터의 미생물 구성요소의 손실에도 불구하고, 대략 105 프로바이오틱 세포/cm2 및 5 x 105 규조류 세포/cm2가 NSW에서의 5일 동안의 침지 후에 생물막에 남아 있었다.
후-유생 할리오티스 미대 성장 실험
적당한 먹이 공급이 실험 내내 유지된 것을 확실하게 하기 위하여, 세포 생물막 구성요소의 농도를 시간 경과에 따라 모니터링하고 정량화하였다. 비브리오 미대 K811 또는 코코네이스 종을 함유한 모든 생물막은 각각 대략 108 프로바이오틱 세포/cm2 또는 106 조류 세포/cm2의 출발 농도를 가졌다. 전복을 방목한지 6일 후에, 각 스트레인의 농도는 대략 105 프로바이오틱 세포/cm2 및 105　규조류 세포/cm2로 감소하였다(데이터 미제시).
단독(식이 1) 또는 코코네이스 종과 혼합된(식이 2) 비브리오 미대 K811로 이루어진 생물막을 먹인 전복은 각각 68% 및 74%의 생존율을 나타냈다. 코코네이스 종으로 이루어진 대조군 식이를 먹인 전복의 생존율은 약 49%였다(표 2). 식이는 후-유생 생존율에 유의미한 영향을 나타냈다(일원변량분석, F=5.51, df=2, p　=　0.016). 생존율은 전복에게 대조군 식이를 먹였을 때보다는 전복에게 비브리오 미대 K811 및 코코네이스 종의 혼합물로 이루어진 식이(식이 2)를 먹였을 때 상당히 더 컸다(p= 0.016). 생존율은 전복에게 대조군 식이와 비교하여 프로바이오틱 단독으로 이루어진 식이(식이 1)를 먹였을 때 유의미하게 개선되지 않았다(p=0.068). 더불어, 프로바이오틱 단독 식이(식이 1)와 혼합물 식이(식이 2)를 먹인 전복의 생존율 사이에 유의미한 차이는 없었다(p=0.744).
폭기 및 물 여과 장치가 장착된 유리 수족관에서 인큐베이션된 3개의 상이한 인공 생물막의 수중 안정성. 결과를 각 생물막에 대해 평균 농도(세포/cm 2 ) ±SE(각 생물막에 대해 n=4)로서 표시한다.
생물막 식이 세포/cm 2 (±SE)
20분 24시간 48시간 72시간 96시간 120시간
단일 종
대조군: 코코네이스 종 2.42x106
(±1.34x105)		 1.32x106
(±1.30x105)		 1.11x106
(±1.24x105)		 9.10x105
(±1.37x105)		 8.55x105
(±8.52x105)		 5.67x105
(±4.38x104)
식이 1: 비브리오 미대 K811 1.17x108
(±4.50x106)		 5.06x107
(±1.15x107)		 9.63x106
(±4.13x106)		 5.04x106
(±2.56x106)		 1.29x106
(±7.70x105)		 1.61x105
(±7.33x104)
식이 2: 혼합 종
비브리오 미대 K811 구성요소 1.23x108
(±4.23x106)		 4.92x107
(±2.09x106)		 2.64x106
(±2.57x105)		 1.67x106
(±4.48x105)		 2.68x105
(±3.50x104)		 8.31x104
(±1.44x104)
코코네이스 종 구성요소 2.71x106
(±1.62x105)		 1.04x106
(±1.67x105)		 8.07x105
(±8.37x104)		 7.79x105
(±6.62x104)		 7.35x105
(±7.07x104)		 6.85x105
(±6.27x104)
3개의 별도의 25-일 성장 실험에서 3개의 상이한 인공 생물막 식이를 전복에게 먹인 후, 생존하는 후-유생 할리오티스 미대의 수, 및 상응하는 백분율(%) 생존율. 각각의 식이의 영향을 이중으로 테스트하였고 초기 스톡 밀도는 150마리 동물/탱크였다.
생물막 식이 실험 1 실험 2 실험 3 평균 전복 수(±SE) 평균 % 생존율
전복 수 % 생존율 전복 수 % 생존율 전복 수 % 생존율
대조군 식이
코코네이스 종(1) 40 27 93 62 72 48 68(±11) 49
코코네이스 종(2) 67 45 81 54 84 56 77(±4)
식이 1
비브리오 미대 K811(1) 47 31 117 78 123 82 95(±17) 68
비브리오 미대 K811(2) 90 60 107 71 125 83 107(±7)
식이 2
혼합물(1) 111 74 103 69 109 73 107(±2) 74
혼합물(2) 107 71 113 75 118 79 112(±2)
전부 3개의 실험에서, 생존하는 전복의 수는 각각의 25-일 실험 기간 내내 감소하였다(도 2). 그러나, 각 실험이 끝났을 때, 생존율은 동물에게 프로바이오틱 식이(식이 1 및 2)를 먹였을 때 일관되게 더 높았다. 실험 1에서, 코코네이스 종 대조군 식이를 먹인 동물을 함유한 한 복제 탱크에서 4일 째에 높은 사망률 사건(67마리 사망)이 있었다. 더불어, 높은 사망률을 또한 코코네이스 종 대조군 식이를 먹인 동물을 함유한 제2 복제 탱크에서 18일째에 볼 수 있었고(25마리 사망), 뿐만 아니라 프로바이오틱-단독 식이를 먹인 동물을 함유한 한 복제 탱크에서 볼 수 있었다(식이 1, 22마리 사망). 이것은 실험이 끝났을 때, 50마리 미만의 껍질 길이 측정이 기록된(각각 40　및 47마리 전복) 두 탱크(대조군 탱크 1 및 프로바이오틱-단독 탱크 1)가 있음을 의미한다. 실험 2 및 3에서는 큰 사망률 사건이 없었고, 실험 1의 전복이 스트레스를 받았을 가능성이 있다(제1 실험에서, 모든 유리 하우징 탱크를 오버헤드 공기-조절 장치 바로 아래에 유지하였고, 그것이 물 증발, 및 결국 물 염도를 증가시켰을 수 있다).
후-유생의 초기 평균 껍질 길이(SLT0)는 실험 1, 2 및 3에 대해 각각 3.04(±0.10) mm, 2.06　(±0.04) mm 및 3.1(±0.04) mm였다. 식이는 모든 3개 실험에서 전복의 SLT25에 상당한 영향을 미쳤다(일원변량분석, p <0.05). 실험 1에서, 혼합 식이를 먹인 후-유생의 평균 SLT25는 코코네이스 종 식이를 먹인 후-유생의 평균 SLT25보다 상당히 더 컸다(p <0.05). 그러나, 실험 2 및 3에서, 두 프로바이오틱 식이(식이 1 및 2)는 전부 대조군 식이와 비교하여 후-유생의 평균 SLT25를 상당히 개선시켰다(p <0.05). 프로바이오틱 생물막 식이를 먹인 전복의 SLT25 사이에는, 프로바이오틱이 단독으로 또는 코코네이스 종과의 혼합물로서 존재하였는지의 여부와 관계없이, 유의미한 차이가 없었다(데이터 미제시).
비브리오 미대 K811 단독(식이 1) 또는 비브리오 미대 K811과 코코네이스 종의 혼합물(식이 2)로 이루어진 프로바이오틱 생물막 식이를 먹인 전복은, 평균, 각각 21.3% 및 23.0%의 껍질 길이의 개선과, 약 29.7 μm/일 및 33.1 μm/일의 성장률을 나타냈다(표 3). 코코네이스 종으로 이루어진 대조군 식이(대조군 식이)를 먹인 전복의 평균 껍질 길이는 단지 8.3% 개선되었고, 이들 전복의 성장률은 11.6 μm/일이었다. 전체적으로, 이들 결과는 프로바이오틱 식이가 후-유생 할리오티스 미대의 성장률을 3배로 할 수 있음을 나타낸다.
3개의 별도의 25-일 성장 실험에서 3개의 상이한 인공 생물막 식이를 먹인 후 전복의 최종 평균 껍질 길이(mm), 백분율(%) 껍질 길이 증가 및 일일 성장률(GR)(μm/일). 각각의 식이는 각 실험에서 이중으로 테스트되었다.
생물막 식이 실험 1 실험 2 실험 3 평균 %SL 증가(±SE) 평균 GR(μm/d)(±SE)
평균 SL T25 (±SE) mm %SL 증가 GR(μm/d) 평균 SL T25 (±SE) mm %SL 증가 GR(μm/d) 평균 SL T25 (±SE) mm %SL 증가 GR(μm/d)
대조군 식이
코코네이스 종(1) 3.73
(±0.14)		 18.5 27.6 2.08
(±0.05)		 1.1 0.8 3.25
(±0.09)		 4.7 6.0 8.3
(±2.99)		 11.6
(±4.53)
코코네이스 종(2) 3.57
(±0.10)		 14.8 21.2 2.08
(±0.04)		 0.9 0.8 3.43
(±0.08)		 9.6 13.2
식이 1
비브리오 미대 K811(1) 3.55
(±0.15)		 14.4 20.4 2.86
(±0.06)		 27.9 32.0 3.94
(±0.12)		 21.3 33.6 21.3
(±1.94)		 29.7
(±3.50)
비브리오 미대 K811(2) 3.91
(±0.13)		 22.2 34.7 2.51
(±0.07)		 17.8 18.0 4.09
(±0.11)		 24.3 39.6
식이 2
혼합물(1) 3.97
(±0.15)		 23.4 37.2 2.76
(±0.07)		 25.5 28.0 4.09
(±0.10)		 24.2 39.6 23.0
(±1.26)		 33.1
(±3.66)
혼합물(2) 4.13
(±0.11)		 26.4 43.6 2.53
(±0.07)		 18.4 18.8 3.89
(±0.13)		 20.3 31.6
후-유생의 초기 평균 껍질 길이(SLT0)의 차이(실험 1, 2 및 3에 대해 각각 3.04 mm, 2.06 mm 및 3.1 mm)에도 불구하고, 프로바이오틱 식이(식이 1 및 2)를 먹인 동물에 대한 % 껍질 길이 증가 및 일일 성장률 데이터는 전부 3개의 실험 사이에서 꽤 일관적이었다(표 3). 예를 들어, 프로바이오틱 단독 식이(식이 1)를 먹인 전복의 평균 SI 증가는 실험 1, 2 및 3에서 각각 18.3%, 22.9% 및 22.8%였던 한편, 혼합물 식이(식이 2)를 먹인 전복의 그것은 각각 24.9%, 22% 및 22.3%였다. 그러나, 대조군 식이를 먹인 동물에 대해 얻어진 결과에서는 일관성이 불량하였는데, 동물의 평균 SL 증가가 실험 1, 2 및 3에서 각각 16.7%, 1.0% 및 7.5%로 달랐다. 더불어, 코코네이스 종으로 이루어진 식이를 먹인 전복의 평균 성장률은 실험 1, 2 및 3에서 각각 24.4 μm/일, 0.8 μm/일 및 9.6 μm/일이었다.
식이는 전복의 %SL 증가에 상당한 영향을 미쳤다(일원변량분석, F=13.69, df=2, p <0.001). 후-유생의 %SL 증가는 전복에게 규조류 대조군 식이와 비교하여 프로바이오틱 식이(식이 1 및 2)를 먹였을 때 상당히 개선되었다(p <0.05). 비브리오 미대 K811 단독으로 이루어진 식이(식이 1)를 먹인 전복과 혼합 생물막(식이 2)을 먹인 전복 사이에서, %SL 증가에 유의미한 차이는 없었다(p = 0.845). 식이는 또한 전복 성장률에 상당한 영향을 미쳤다(일원변량분석, F=8.71, df　=　2, p=0.003). 후-유생의 성장률은 전복에게 규조류 대조군 식이와 비교하여 프로바이오틱 식이(식이 1 및 2)를 먹였을 때 상당히 개선되었다(p <0.05). 비브리오 미대 K811 단독으로 이루어진 식이(식이 1)를 먹인 전복과 비브리오 미대 K811 및 코코네이스 종으로 이루어진 혼합 생물막(식이 2)을 먹인 전복 사이에서 성장률의 유의미한 차이는 없었다(p= 0.814).
논의
현재 연구에서, 3개의 독립적인 급식 실험을 수행하여 인공 생물막 식이의 주요 구성요소로서 제공되었을 때, 후-유생 남아프리카 전복인 할리오티스 미대의 생존률 및 성장에 미치는 추정 프로바이오틱 비브리오 미대 SY9의 영향을 측정하였다. 결과는 프로바이오틱(식이 1 및 2) 및 대조군 식이를 먹인 후-유생 할리오티스 미대의 생존율이 각각 71% 및 49%였지만, 혼합물 식이(식이 2)만이 전복 생존율을 상당히 개선시킨 것을 입증하였다. 더불어, 프로바이오틱 식이는 전부 3개의 실험에서 후-유생의 SLT25에 대해 유의미한 영향을 미쳤으며, 프로바이오틱 식이를 먹인 후-유생 전복의 %SL 증가 및 성장률은 대조군 식이를 먹인 동물에 비교하여 상당히 더 높았다. 전체적으로, 이들 결과는 비브리오 미대 SY9가 발달의 후-유생 단계 중에 할리오티스 미대에 프로바이오틱 영향을 나타내는 것을 확인시켜준다.
본 연구의 성장 및 생존율 결과는 후-유생 성능에 미치는 알긴산염-기반 인공 식이의 영향을 테스트한 이전 연구(Stott et al. 2002; 2003a,b)에서 관찰된 것을 능가한다. 예를 들어, 본 연구에서, 3개의 별도의 실험에서 알긴산염-기반 프로바이오틱 식이(식이 1 및 2)를 먹인 할리오티스 미대 후-유생의 평균 성장률은 각각 29.7 μm/일 및 33.1 μm/일이었고, 이것은 규조류 대조군 식이를 먹인 후-유생에 대해 관찰된 11.6 μm/일의 평균 성장률보다 상당히 높았다. Stott 등(2003a)은 생후 3일된 할리오티스 디스쿠스 수퍼텍스타(H. discus supertexta) 후-유생에게 상업적 식이 SF-15 또는 SF-15[T]가 보충된 알긴산염-기반 식이를 먹이로 주었고 각각의 식이에 대해 각각 27.5 μm/일 및 28.6 μm/일의 평균 성장률을 보고하였다. 천연 규조류 대조군 식이를 먹인 후-유생의 성장률은 18.6 μm/일이었다. 그러나, 후-유생 할리오티스 미대의 생존율이 규조류 대조군(49% 생존율)과 비교하여 그것에게 프로바이오틱 식이를 먹였을 때 더 나았음(식이 1 및 2에 대해 71%의 평균 생존율)을 입증한 본 연구와 대조적으로, Stott 등(2003a)은 규조류 대조군(12.9%)과 비교하여 인공 식이시 더 낮은 후-유생 생존율을 보고하였다(SF-15 및 SF-15[T]에 대해 각각 5.3% 및 7.8%). 이것은 프로바이오틱 제제가 이전의 연구에서 기술된 알긴산염 제제와 비교하여 후-유생 전복에 대한 월등한 식이를 제공할 수 있었음을 시사한다.
코코네이스 종은 이 규조류가 후-유생 전복(>800 μm SL)에 의해 매우 소화가 잘 되는 것으로 보고되었음에도 불구하고, 후-유생 할리오티스 미대에 대해 적합한 규조류인 것으로 나타나지 않는다. 본 연구는 전복에게 단독 코코네이스 종으로 이루어진 대조군 식이를 먹였을 때 후-유생 성장률에 광범위한 가변성을 보였다(표 2). 전체적으로, 이들 결과는 후-유생 전복에 대한 주요 먹이원으로서 규조류의 사용과 관련된 어려움을 강조한다. 그것을 후-유생 발달을 위해 일관된 영양소 공급을 제공하는 제제화된 식이로 교체하는 것이 유익할 것이다.
이 연구는 후-유생 할리오티스 미대가 주요 먹이원으로서 박테리아가 공급될 때 성장하고 생존할 수 있음을 입증하였다. 결과는 성장 및 생존율이 전복에게 상이한 프로바이오틱 식이(식이 1 및 2)를 먹였을 때 유의미하게 상이하지 않았음을 보여주었다. 이것은 알긴산염 및 박테리아 프로바이오틱스만을 기반으로 한 인공 식이가 후-유생 전복의 상업적 사육을 위한 규조류 생물막의 필요성을 배제할 수 있음을 시사한다.
후-유생 생존율 및 성장률의 가장 큰 개선은 후-유생 할리오티스 미대에게 혼합 생물막(식이 2)을 먹였을 때 관찰되었고, 그것은 코코네이스 종이 비브리오 미대 K811 단독으로는 완전히 제공할 수 없는 영양적 이익을 제공할 수 있음을 시사한다.
미생물 기탁 세부사항
특허 절차의 목적으로 미생물 기탁에 대한 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 따라, 본 명세서에서 기술된 비브리오 미대 SY9 스트레인을 벨기에 조정 미생물 콜렉션(The Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms, BCCM)에 2013년 7월 1일에 등록 번호 LMG P-27727 하에 기탁하였다.
참고문헌
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Stott, A.E., Takeuchi, T., Koike, Y., Yamakawa, H. and Imada, O., 2002. Using micro particle diets to replace diatoms for feeding postlarval abalone Haliotis discus discus(Reeve.).　Fish. Sci. 68(5), pp.1088-1093.
Stott, A.E., Takeuchi, T., Koike, Y. and Imada, O., 2003a. Settling and raising postlarval abalone Haliotis diversicolor supertexta(Lischke) on microparticulate dists embedded in a layer of alginate.　Aquac. Res. 34(7), pp.561-567.
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Claims (21)

  1. 수생 동물의 수산양식 방법으로서,
    수생 동물에게 먹이원으로서 적어도 비브리오 미대 SY9를 공급하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 비브리오 미대 SY9는 알긴산염 막 상에서 또는 내에서 상기 수생 동물에게 공급되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 막은 지지체 상에 형성되는 것인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 막 중의 비브리오 미대 SY9의 농도는 적어도 108 세포/cm2 인 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수생 동물에게 추가 먹이원으로서 규조류를 공급하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 규조류의 농도는 적어도 106 세포/cm2 인 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수생 동물에게 먹이원으로서 규조류를 공급하는 단계를 포함하지 않는 것인 방법.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    5일 이상 후에 상기 막을 교체하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수생 동물은 전복인 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수생 동물은 후-유생 전복인 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수생 동물은 극피동물인 것인 방법.
  12. 수생 동물의 사료용으로 제제화된 먹이 조성물로서,
    주요 먹이원으로서 비브리오 미대 SY9를 포함하는 먹이 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 비브리오 미대 SY9는 알긴산염 막 위에 코팅되거나 알긴산염 막 내에 캡슐화되는 것인 먹이 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 막은 지지체 상에 형성되는 것인 먹이 조성물.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 먹이 조성물 중의 상기 비브리오 미대 SY9의 농도는 적어도 109 세포/ml 인 것인 먹이 조성물.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수생 동물에 대한 추가 먹이원으로서 규조류를 포함하는 것인 먹이 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 규조류의 농도는 적어도 107 세포/ml인 것인 먹이 조성물.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    5일 이상 동안 수성 조성물에서 안정적인 것인 먹이 조성물.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수생 동물은 전복인 것인 먹이 조성물.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수생 동물은 후-유생 전복인 것인 먹이 조성물.
  21. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수생 동물은 극피동물인 것인 먹이 조성물.
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