KR20210106520A - 당뇨병 및 관련 질환의 치료 및 예방을 위한 펩타이드 - Google Patents

당뇨병 및 관련 질환의 치료 및 예방을 위한 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 당뇨병 및 관련 질환의 치료를 위한 펩타이드에 관한 것이다.

Description

당뇨병 및 관련 질환의 치료 및 예방을 위한 펩타이드
본 발명은 의약 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 당뇨병 및 관련 질환의 치료에 관한 것이다.
진성 당뇨병 또는 당뇨병은 췌장에서 충분한 인슐린이 생산되지 않거나 세포가 생산되는 인슐린에 반응하지 않기 때문에 사람의 혈당이 높은 대사 질환 군이다.
당뇨병에는 세 가지 주요 유형이 있다.
-제1형은 신체의 인슐린 생산 실패로 인해 발생하며 현재는 인슐린을 주입하거나 인슐린 펌프를 착용해야 한다.
-제2형은 인슐린 저항(세포가 인슐린을 제대로 사용하지 못하는 상태)으로 발생한다.
-제3형은 임신성 당뇨병이라고 하며 임산부에게서 발생한다.
제2형 당뇨병의 비율은 1960년 이후 비만과 함께 크게 증가했다: 1985년 약 3천만 명에 비해 2010년 현재 약 2억 8천 5백만명이 이 질환을 앓고 있다. 고혈당으로 인한 장기적인 합병증에는 심장 질환, 뇌졸중, 당뇨병성 망막병증, 투석이 필요할 수 있는 만성 신부전 및 절단으로 이어지는 사지의 순환 불량이 포함될 수 있다. 비케톤성 고삼투압성 혼수 상태가 발생할 수 있다.
고혈당증은 진성 당뇨병의 발병 및 진행성 손상에 관여하는 것으로 보고되었으며, 즉, 포도당 독성 이론이다. 즉, 만성 고혈당증은 인슐린 분비를 감소시키고 더 나아가 인슐린 감수성을 감소시키며, 결과적으로 혈당 농도를 증가시켜 진성 당뇨병이 스스로 악화된다. 따라서 고혈당증을 치료함으로써 당뇨병의 자기-악화 사이클을 중단시켜 당뇨병의 예방 또는 치료가 가능하게 된다.
불행히도 베타-세포 기능이 시간이 지남에 따라 감소하기 때문에 기존 치료법은 장기적으로 정상 혈당을 회복하는 데 성공하지 못한다. 더욱이, 현재 이 질병의 모든 양상을 역전시킬 수 있는 단일 약물은 없다.
제2형 당뇨병의 진행성 특성은 많은 환자들이 궁극적으로 인슐린 및/또는 엑세나타이드 주사와 함께 경구 혈당 강하제를 병용해야 함을 의미한다. 제2형 당뇨병과 관련된 주요 메커니즘을 상쇄하기 위해 항 당뇨병 제제가 개발되었다: 인슐린 저항(비구아니드 및 티아졸리딘디온) 및 인슐린 분비(설포닐우레아, 글리니드, 디펩티딜펩티다제-4 억제제, 글루카곤-유사 펩타이드 1 수용체 작용제), 위장관에 의한 포도당 흡수를 지연시키거나 체중 감소를 촉진하는 제제, 및 신장 포도당 배설을 촉진하는 새로운 제제. 그러나 이들 약제의 대부분은 체중증가, 말초부종, 울혈성심부전 등의 유해한 부작용이 있는 것으로 나타났으며, 장 기간 사용하면 이들 약제의 효과가 상실되는 큰 문제가 있다. 따라서 혈당 조절을 위한 치료 옵션의 수가 증가함에도 불구하고 당뇨병 및 관련 상태의 치료를 위한 대체 및 개선된 약물이 필요하다.
놀랍게도, 본 발명자들은 식이 유도된 비만 마우스에서 포도당 내성을 특이적으로 개선시키는 PKCα의 키나제 도메인으로부터의 펩타이드 및 이의 유도체를 제공한다. 상기 펩타이드는 지방 조직에서 일반적으로 지방산 전달 단백질 2(FATP2; Fatty acid transport protein 2)로 알려진 용질 캐리어 패밀리 27 멤버 2(SLC27A2; Solute Carrier Family 27 Member 2)의 발현을 감소시킬 수 있다. 상기 펩타이드는 동물 모델의 혈장에서 당화 알부민을 감소시킬 수 있으며, 상기 당화 알부민은 당뇨병의 잘 알려진 바이오마커이다.
따라서, 본 발명은 당뇨병 및 관련 질환을 치료하기 위한 펩타이드에 관한 것으로, 여기서
- 상기 펩타이드는 특히 포유 동물의 지방 조직, 특히 인간 지방 조직에서 FATP2 발현을 특이적으로 감소시킬 수 있으며;
- 상기 펩타이드는 하나의 메티오닌, 하나의 프롤린 및 하나의 아르기닌을 동시에 포함하지 않으며;
- 상기 펩타이드는 나선, 바람직하게는 알파 나선인 이차 구조를 채택하며;
- 상기 펩타이드는 PKC(단백질 키나아제 C)의 키나아제 도메인의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 25개 연속 잔기의 분절 또는 PKC(단백질 키나아제 C)의 키나아제 도메인의 5 내지 40개 연속 잔기의 분절로부터의 서열을 포함하거나, 이로 기본적으로 구성되거나, 이로 구성되며;
- 상기 펩타이드는 5 내지 80개 아미노산 또는 5 내지 60개 아미노산 또는 5 내지 40개 아미노산의 길이를 가지며;
- 상기 펩타이드 서열은 PKC의 키나아제 도메인의 상기 분절의 서열 내에서 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들)을 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 펩타이드는 스테이플링과 같은 화학적 가교 공정에 의해 변형된다.
바람직하게, 상기 펩타이드는 적어도 5개의 아미노산과 40개 미만의 아미노산, 바람직하게는 적어도 5개의 아미노산 및 30개 미만의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 5개의 아미노산 및 25개 미만의 아미노산 길이를 갖는다.
바람직하게, 상기 펩타이드는 ALMS1과 αPKC 사이의 상호 작용을 감소시키거나 방지할 수 있다.
선택적으로, 상기 펩타이드 서열은 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된다: 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTXVEKRVLA(서열 번호: 9); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTMVEKXVLA(서열 번호: 10); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTXVEKXVLA(서열 번호: 11); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 LMYHIQQV(서열 번호: 4); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 LXYHIQQV(서열 번호: 12); LDN; 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 SVDWWAYGVLLYEMLA(서열 번호: 6); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 SVDWWAYGVLLYEXLA(서열 번호: 13); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 SVXWWAYGLLYEMLA(서열 번호: 52); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 EDEDELFQSIME(서열 번호: 7); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 EDEDELFQSIXE(서열 번호: 14); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 GERDVRE(서열 번호: 8); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 GEXDVRE(서열 번호: 15); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 GERDVXE(서열 번호: 16); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 GEXDVXE(서열 번호: 17); LDN; AFF; PDY; XDY; PEII(서열 번호: 5); XEII(서열 번호: 18); PAK; XAK; 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산이다.
선택적으로, 상기 펩타이드 서열은 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된다: 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTXVEKRVLA(서열 번호: 9); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTMVEKXVLA(서열 번호: 10); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTXVEKXVLA(서열 번호: 11); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 LMYHIQQV(서열 번호: 4); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 LXYHIQQV(서열 번호: 12); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 SVDWWAYGVLLYEMLA(서열 번호: 6); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 SVDWWAYGVLLYEXLA(서열 번호: 13); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 EDEDELFQSIME(서열 번호: 7); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 EDEDELFQSIXE(서열 번호: 14); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 GERDVRE(서열 번호: 8); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 GEXDVRE(서열 번호: 15); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 GERDVXE(서열 번호: 16); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 GEXDVXE(서열 번호: 17); 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산이다.
선택적으로, 상기 펩타이드 서열은 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된다:
a) 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTXVEKXVLALLDKXXFLTQLHS(서열 번호 20), 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산, 바람직하게는 α-나선 2차 구조에 유리한, 보다 바람직하게는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y, 보다 더 바람직하게는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;
b) 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTMVEKRVLALLDKXXFLTQLHS(서열 번호: 21), 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산, 바람직하게는 α-나선 2차 구조에 유리한, 보다 바람직하게는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y, 보다 더 바람직하게는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;
c) 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTXVEKRVLALLDKPPFLTQLHS(서열 번호: 22), 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산, 바람직하게는 α-나선 2차 구조에 유리한, 보다 바람직하게는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y, 보다 더 바람직하게는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;
d) 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTMVEKXVLALLDKPPFLTQLHS(서열 번호: 23), 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산, 바람직하게는 α-나선 2차 구조에 유리한, 보다 바람직하게는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y, 보다 더 바람직하게는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;
그리고, 임의의 서열 a) 내지 d)의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 25개의 연속 잔기의 임의의 분절의 서열.
선택적으로, 상기 펩타이드 서열은 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된다:
VECTM X EKRVLA X (서열 번호: 24)
VECTX X EKRVLA X (서열 번호: 25)
VECTM X EKXVLA X (서열 번호: 26)
VECTX X EKXVLA X (서열 번호: 27)
VECTX X EKXVLA X LDKXXFLTQLHS(서열 번호: 28)
VECTM X EKRVLA X LDKXXFLTQLHS(서열 번호: 29)
VECTX X EKRVLA X LDKPPFLTQLHS(서열 번호: 30)
VECTM X EKXVLA X LDKPPFLTQLHS(서열 번호: 31)
VECTT X EKEVLA X LDKAAFLTQHS(서열 번호: 53)
VECTT X EKEVLA X LDKAAF(서열 번호: 54)
VEGTT X EKEVLA X LDKAAF(서열 번호: 55), 및
ECTT X EKEVLA X L(서열 번호: 56)
ECTM X EKKVLA X L(서열 번호: 57)
여기서, 굵고 밑줄이 그어진 X 잔기는 스테이플링을 갖고 스테이플링에 적합한 임의의 아미노산 유도체이며; 그리고
여기서, X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산이며,
상기 서열은 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는다.
바람직하게, 상기 PKC는 알파-PKC(αPKC), βI 및 βII PKC를 포함하는 베타-PKC(βPKC), 델타-PKC, 세타-PKC, 에타-PKC 및 입실론-PKC로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 상기 PKC는 서열 번호: 1의 αPKC이다.
특정 실시양태에서, 상기 펩타이드 서열은 하기를 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된다:
VECTT R EKEVLA S LDKAAFLTQLHS(서열 번호: 32)
여기서, R 및 S 는 스테이플링을 갖고, 바람직하게는 각각 2-(7-옥테닐)아르기닌 및 2-(4-펜테닐)세린이며;
치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 당뇨병 및 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 당뇨병 및 관련 질환의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 본 개시내용에 따른 펩타이드의 용도에 관한 것이다.
선택적으로, 당뇨병 및 관련 질환은 I형 당뇨병, II형 당뇨병, 인슐린 저항성, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신장증, 고혈당증, 비만, 고인슐린혈증 및 바르데 비들(Bardet Biedl) 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 상기 펩타이드는 바람직하게는 항당뇨병제, 고지혈증제, 항비만제, 항고혈압제, 항지방증제, 항염증제, 및 퍼옥시좀 증식제-활성화제 수용체의 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부가 활성화제와 병용해서 사용된다.
도 1. 알파 PKC의 펩타이드에 의해 유도된 인간 지방 세포의 PKC 키나아제 활성. 1차 인간 지방 세포를 인슐린 없이 밤새 배양하고 다음 날 각각의 펩타이드에 대해 상이한 조건을 사용하였다. 펩타이드 ECTMVEKKVLALL 25 ㎍ 또는 펩타이드 SVEWWAYGLLYEMLA 25 ㎍을 각 웰에 첨가하고 PKC 활성을 측정하기 전에 30분 동안 인큐베이션하였다. 음성 대조군은 식염수 용액인 비히클이고, 사용된 양성 대조군은 10 mM의 인슐린이었다.
도 2. 인간 알파 PKC 유래 펩타이드로 처리한 인간 지방 세포의 FATP 아이소폼 발현 수준. 알파 PKC(즉, ECTMVEKKVLALL 및 SVEWWAYGLLYEMLA)에서 유도된 다양한 펩타이드와 함께 48시간 동안 인큐베이션한 후 FATP의 6가지 아이소폼의 발현 수준을 실시간 PCR로 측정했다. 인간 지방 세포에서 6가지 FATP 아이소폼(Fatp 1~6)에 대한 표준화된 발현 수준. GAPDH를 참조 유전자로 사용했다.
도 3. 인간 지방 세포에서 PKC 활성을 유발하는 PATAS 시험관 내 용량 반응. PATAS는 배양 배지에 첨가된 PATAS와 함께 인간 1차 지방 세포를 30분 인큐베이션한 후 인간 지방 세포에서 PKC 활성을 유발하는 시험관 내 용량 반응. n = 그룹 당 5개 및 PATAS 양은 웰 당 ㎍으로 표시한다.
도 4: 인간 1차 성숙한 지방 세포에서 포도당 흡수. N = 그룹 당 8개. ADPIF 펩타이드는 1차 인간 성숙한 지방 세포에서 포도당 흡수를 유발하는 인슐린만큼 효과적이다.
도 5. ADPIF 펩타이드는 쥐의 포도당 불내성을 개선하는 데 PATAD 펩타이드보다 더 활성이 있다
(a) 포도당 내성: 비히클(식염수 용액) 또는 비히클 + PATAD 417 또는 비히클 + ADPIF(CPC 펩타이드 A-MRO)를 0일에 마우스에 주사했다. 6일 후(D6) 마우스를 4시간 동안 금식시키고, 0분에 ipGTT를 수행하기 위해 피하에 포도당을 주사했다. 30분마다 꼬리 혈액에서 포도당 수치를 측정했다. 식이 요법(CTL 식이 요법)을 준 대조군 마우스 외에, 다른 모든 마우스에 고지방/고 포도당 식단을 주었다.
(b) (a)에 나타낸 포도당 내성 테스트에 대한 해당 곡선 아래 영역(AUC)은 PATAD(PATAD417) 및 ADPIF(PATAD417-MRP)의 주입에 대한 반응인 AUC의 하락을 보여주고, 이는 AUC를 줄이기 위해 PATAD보다 ADPIF가 더 효과적인 것을 보여준다. 이는 ADPIF가 PATAD보다 포도당 불내성을 개선하는 데 더 효과적임을 나타낸다.
도 6. PATAS는 지방 조직에서 FATP2 발현 수준의 감소와 관련된 확립된 질병 마우스 모델(db/db; Jax 실험실의 BKS)에서 항 당뇨병을 나타낸다.
(도 6a) 6주령 db/db 수컷 마우스에서 식이 요법 후 8시간 금식에 PATAS 피하 주사(2 mg/kg BW PATAS 투여) 4일 후 ipGTT 동안 혈당 이동 곡선. 포도당 한 회분(2 g/kg 체중)을 T = 0분에서 피하투여 및 관련 AUC 히스토그램이다(n = 그룹 당 10마리 마우스, 유의성은 *p-값 ≤ 0.05, **p-값 ≤ 0.01로 설정).
(도 6b) 4주 마다 PATAS 주사하고, 치료없이 4주 후에 db/db 마우스 sWAT. 피하 백색 지방 조직(sWAT)에서 6개의 FATP 아이소폼(FATP 1~6)에 대한 표준화된 발현 수준을 측정했다. 참조 유전자로서 GAPDH를 갖고 그룹 당 n = 6.
도 7. PATAS는 비만 및 제2형 당뇨병과 관련된 희귀 질환인 바르데 비들 증후군(BBS)에 대한 유전적 마우스 모델에서 포도당 불내성을 개선하는 데 효과적이다. BBS 마우스는 무제한 공급 식이 요법을 실행했다. n = 주사 전 및 주사 후 3일에 수행된 ipGTT를 사용한 교차 실험 설정을 갖는 4마리의 마우스.
BBS10 유전자(Bbs10 -/- )에 대한 넉아웃 마우스 모델을 만들고, 문헌에 설명한 바와 같이 자발적으로 비만이 되도록 하였다. 4개월 령에, 우리는 PATAS를 투여하기 전에 Bbs10 -/- 에 대해 복강 내 포도당 내성 테스트(ipGTT)를 수행했고, Bbs10 -/- 마우스가 약 30000 mg/dL.min의 해당 곡선 아래 영역(AUC)(도 8b)을 갖는 포도당 내성이 있다는 것을 발견했다(도 8a). 동일한 마우스에 체중 kg 당 2 mg의 PATAS를 피하 지방 조직에 투여하고 3일 후에 우리는 ipGTT를 수행하였고, Bbs10 -/- 마우스는 AUC가 약 16000 mg/dL.min(도 8b)으로 떨어지는 것에 해당하는 개선된 포도당 내성(도 8a)을 나타낸 것을 확인했다.
도 8. STAM 마우스 모델에서 혈장 내 당화 알부민에 대한 ADPIF의 효과.
일본 STAMT 모델 유래의 처리된 마우스의 혈장은 시판되는 키트를 사용하여 순환 당화 알부민 수준을 측정하는 데 사용하였다. 결과는 오차 막대에 대한 평균의 표준 오차와 함께 제시된 그룹 당 6마리 마우스의 평균값으로 본 도면에 나타냈다. 해당 마우스에 ADPIF를 5주 마다 주사한 후, 비히클 주입된 마우스 그룹에 비해 당화 알부민 수준이 크게 감소하는 것을 측정했다.
놀랍게도, 본 발명자들은 지방 조직에서 FATP2(지방산 수송 단백질 2; Fatty acid transport protein 2)의 발현을 특이적으로 감소시키는 PKCα의 키나아제 도메인으로부터의 펩타이드 및 이의 유도체를 제공한다. 마지막으로, 상기 펩타이드는 당뇨병의 바이오마커인 혈장 내 당화 알부민을 감소시킬 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 펩타이드는 당뇨병 및 관련 질환의 치료에 유용하다.
진성 당뇨병은 고혈당이 특징이다. 보다 구체적으로, 제2형 당뇨병은 고혈당증 및 인슐린 저항성을 특징으로 한다. 비만은 유전적으로 질환에 걸리기 쉬운 사람들의 제2형 당뇨병의 주요 원인으로 생각된다. 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신장증은 당뇨병 및 인슐린 저항성과 관련된 잘 알려진 질환이다. 그리고, 포도당 흡수를 증가시켜 혈당증을 낮추면 이러한 질병의 진행이나 발병을 치료하거나 지연시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기와 관한 것이다
- 당뇨병 및 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 펩타이드;
- 당뇨병 및 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물;
- 당뇨병 및 관련 질환의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 본원에 정의된 펩타이드 또는 약학적 조성물의 용도;
- 본원에 정의된 펩타이드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 당뇨병 및 관련 질환의 치료를 위한 방법.
정의
ALMS1, 알스트룀(Alstrom) 증후군 단백질 1은 ALMS1 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. ALMS1 유전자의 돌연변이가 알스트룀 증후군의 원인이 되는 것으로 밝혀졌다. 여러 데이터베이스, 즉 UniProt ID No Q8TCU4; Gene ID No 7840, HGNG ID No 428에 기재되어 있다. 참조 서열은 mRNA의 경우 NM_015120.4 및 단백질의 경우 NP_055935.4로 Genbank에 개시되어 있다.
"단백질 키나아제 C" 및 "PKC"(EC 2.7.11.13)라는 용어는 동일하며, 이들 단백질 상의 세린 및 트레오닌 아미노산 잔기의 수산기 인산화를 통해 다른 단백질의 기능을 제어하는 데 관여하는 단백질 키나아제 효소 계열을 나타낸다. PKC는 일반적으로 디아실글리세롤(DAG) 또는 칼슘 이온(Ca2+) 농도의 증가와 같은 신호에 의해 활성화된다. PKC는 여러 신호 전달 캐스캐이드에서 중요한 역할을 한다.
PKC 계열은 인간의 적어도 15개의 동종효소를 포함하며, 세 가지 주요 하위 계열인, 기존(또는 고전)의 PKC, 신규 PKC 및 비정형 PKC로 나뉜다.
기존의 (c)PKC는 아이소폼 α, βI, βII 및 γ를 포함한다. 이러한 PKC는 활성화를 위해 Ca2+, DAG 및 인지질, 예컨대 포스파티딜세린이 필요하다.
신규 (n)PKC에는 δ, ε, η 및 θ 아이소폼이 포함된다. 이러한 PKC에는 활성화를 위해 DAG가 필요하지만, Ca2+는 필요하지 않다.
비정형 (a)PKC에는 ζ, ι 및 λ 아이소폼이 포함된다. 이러한 PKC는 활성화를 위해 Ca2+나 디아실글리세롤이 필요하지 않다.
αPKC, PKC-A 또는 PKC-알파라고도 하는 단백질 키나아제 C 알파 유형은 칼슘과 두 번째 메신저 디아실글리세롤에 의해 활성화될 수 있는 세린- 및 트레오닌-특이적 단백질 키나아제 계열에 속한다. 여러 데이터베이스, 즉 UniProt ID No P17252, Gene ID No 9393, HGNG ID No 5578로 기재되어 있다. 참조 서열은 mRNA의 경우 NM_02737.2 및 단백질의 경우 NP_002728.1로 Genbank에 개시되어 있다. 인간 αPKC의 단백질 서열은 서열 번호: 1로 개시되어 있다.
αPKC의 키나아제 도메인은 서열 번호: 1로 개시된 바와 같이 위치 339 내지 위치 595이고, 서열 번호 2로 나타낸다.
"~로 구성되는", "~로 기본적으로 구성되는" 또는 "실질적으로 포함하는": 요소 또는 요소들에 대한 참조와 같은 용어를 사용하여 본 발명의 임의의 양태 또는 실시양태에 대한 본원의 설명은 문맥에 의해 달리 명시되거나 명백하게 모순되지 않는 한, 특정 요소 또는 요소들로 "구성되는", "기본적으로 구성되는" 또는 "실질적으로 포함하는" 것으로 본 발명의 유사한 양태 또는 실시양태를 지지하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 특정 서열을 포함하는 것으로 본원에 기술된 펩타이드 또는 단백질은 또한 달리 언급되거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 그 서열로 구성되는 펩타이드 또는 단백질을 기술하는 것으로 이해되어야 한다. "~로 기본적으로 구성되는"은 펩타이드 또는 단백질이 이 서열로 구성되는 것으로 의도되지만, 이는 또한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환, 부가, 결실 또는 혼합, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환, 부가, 결실 또는 이들의 혼합을 포함할 수도 있다. 특히, "~로 기본적으로 구성되는"이라는 것에 의해, 펩타이드가 N 및/또는 C-말단에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 부가 아미노산, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 부가 아미노산, 및/또는 1, 2 또는 3개의 치환, 결실, 부가 또는 이의 혼합을 포함할 수 있음을 의미할 수 있다. 바람직하게, 치환, 부가, 결실 또는 이의 혼합의 수는 서열의 길이에 따라 달라진다. 예를 들어, 치환, 결실, 부가 또는 이의 혼합의 백분율은 30% 이하, 바람직하게는 25% 이하일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치환"은 펩타이드 서열에서 단일 아미노산이 다른 아미노산으로 교환되는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "결실"은 펩타이드 서열에서 단일 아미노산의 제거를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "삽입" 또는 "부가"는 동일하며, 펩타이드 서열에서 단일 아미노산의 추가를 나타낸다.
"치환, 부가, 결실"은 하나의 아미노산의 치환, 부가, 결실을 의미한다. 이때, "1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환, 부가, 결실 또는 이의 혼합", "1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환, 부가, 결실 또는 이의 혼합" 또는 "1, 2 또는 3개의 치환, 결실, 부가 또는 이의 혼합"이라고 나타낸 경우, 각각 "치환, 부가, 결실 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형(들)", "치환, 부가, 결실 또는 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들)" 또는 "치환, 결실, 부가 또는 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)"을 의미한다. "1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환, 부가, 결실 또는 이의 혼합"은 또한 "1 내지 5개의 치환, 부가, 결실 또는 이의 혼합"을 의미한다. "1, 2, 또는 3개의 치환, 부가, 결실 또는 이의 혼합"은 또한 "1 내지 3개의 치환, 부가, 결실 또는 이의 혼합"을 의미한다.
본원에 개시된 펩타이드 서열에서, 아미노산은 하기 명명법에 따라 하나의 문자 코드로 표시된다: A: 알라닌; C: 시스테인; D: 아스파르트산; E: 글루탐산; F: 페닐알라닌; G: 글리신; H: 히스티딘; I: 이소류신; K: 라이신; L: 류신; M: 메티오닌; N: 아스파라긴; P: 프롤린; Q: 글루타민; R: 아르기닌; S: 세린; T: 트레오닌; V: 발린; W: 트립토판 및 Y: 티로신.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 2개의 펩타이드의 아미노산 유사성에 대한 정확한 아미노산을 나타낸다. 동일성 백분율은 서열을 정렬하고, 정렬된 두 서열 사이의 정확한 일치 수를 세고, 더 짧은 서열의 길이로 나눈 다음 결과에 100을 곱하여 두 분자 간의 서열 정보를 직접 비교함으로써 결정할 수 있다.
서열 동일성은 두 서열의 길이에 따라 전체적 또는 국부적 정렬 알고리즘을 사용하여 두 펩타이드 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게 전체 길이에 걸쳐 서열을 최적으로 정렬하는 전체적 정렬 알고리즘(예: Needleman Wunsch)을 사용하여 정렬되는 반면, 실질적으로 상이한 길이의 서열은 바람직하게는 국부적 정렬 알고리즘(예: Smith Waterman)을 사용하여 정렬된다. 그런 다음 서열은 (예를 들어 디폴트 매개변수를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬되는 경우) 적어도 서열 동일성의 특정 최소 백분율을 공유할 때 "실질적으로 동일한" 또는 "기본적으로 유사한"이라고 나타낼 수 있다. GAP는 Needleman 및 Wunsch 전체적 정렬 알고리즘을 사용하여 이들 전체 길이(완전한 길이)에 걸쳐 두 서열을 정렬하여 일치 수를 최대화하고 간격 수를 최소화한다. 두 서열이 유사한 길이를 가질 때 서열 동일성을 결정하기 위해 전체적 정렬을 사용하는 것이 적합하다.
"증가된", "증가하다" 또는 "향상하다"는 동일한 조건에서 테스트된 분자가 없는 경우 측정된 측정값과 비교할 때 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 증가된 측정값을 나타낸다. "감소된" 또는 "감소하다"는 동일한 조건에서 테스트된 분자가 부재 시 측정된 측정값과 비교할 때 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 감소한 측정값을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하다" 또는 "치료하는"은 질병의 치유, 완화 또는 지연과 같이 환자의 건강 상태를 개선하기 위한 모든 행위를 지칭한다. 여기에는 예방적 치료와 치료적 치료가 포함된다.
치료라는 용어는 특히 손상된 포도당 항상성의 교정, 지연 또는 감소를 나타낸다. "치료"라는 용어는 또한 포도당 흡수(예를 들면, 지방세포에 의한 포도당 포획)의 개선을 나타낸다. 본 발명의 맥락 내에서, "혈당 수치 조절" 또는 "혈당 수치의 조절"이라는 용어는 비정상적인 수치(즉, 정상 포도당 항상성을 가진 상응하는 포유동물 대상체에 대한 알려진 참조, 중앙값 또는 평균 값보다 낮거나 높은 수치)를 갖는 포유동물 대상체에서 혈액 또는 혈장 포도당 수치의 정상화 또는 조절을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 당뇨병 또는 관련 질환의 진행 또는 발병을 치료하거나 지연시키는 본 개시내용의 펩타이드 또는 본 개시내용의 약학적 조성물의 양을 지칭한다. 이는 또한 당뇨병 또는 관련 질환을 치료하거나 지연시키는 본 개시내용의 펩타이드 또는 본 개시내용의 약학적 조성물의 양을 지칭할 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "유효 성분", "활성 성분" 및 "활성 약학적 성분"은 동일하며, 치료 효과를 갖는 약학적 조성물의 성분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료적 효과"는 본 개시내용의 펩타이드와 같은 활성 성분에 의해, 또는 본 개시내용에 따른 약학적 조성물에 의해 유도되어, 당뇨병 또는 관련 질환의 진행 또는 발병을 치료하거나 지연시킬 수 있는 효과를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "부형제 또는 약학적으로 허용되는 담체"는 약학적 조성물에 존재하는 활성 성분을 제외한 임의의 성분을 지칭한다. 최종 제품에 특정 일관성 또는 기타 물리적 또는 미각적 특성을 부여하기 위해 첨가할 수 있다. 부형제 또는 약학적으로 허용되는 담체는 활성 성분과의 임의의 상호작용, 특히 화학적 상호작용이 없어야 한다.
본원에 사용된 용어 "피험체", "개인" 또는 "환자"는 상호교환가능하고 동물, 바람직하게는 포유동물, 훨씬 더 바람직하게는 성인, 어린이, 신생아 및 태아기의 인간을 포함하는 인간을 지칭한다.
본 문서에서 "약"이라는 용어는 지정된 값의 ± 10% 값 범위를 나타낸다. 예를 들어, "약 50"은 50의 ± 10% 값, 즉 45와 55 사이의 값을 포함한다. 바람직하게, 용어 "약"은 지정된 값의 ± 5% 값 범위를 나타낸다.
펩타이드
본 개시내용에 따른 펩타이드(들)는 하기 특징(들)을 제공한다:
- 하나의 메티오닌, 하나의 프롤린 및 하나의 아르기닌을 동시에 포함하지 않음;
- 바람직하게는 나선, 바람직하게는 알파 나선인 2차 구조를 채택함;
- 이는 PKC(단백질 키나아제 C)의 키나아제 도메인의 분절, 바람직하게는 PKC(단백질 키나아제 C)의 키나아제 도메인의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 25개 연속 잔기의 분절, 또는 PKC(단백질 키나아제 C)의 키나아제 도메인의 5 내지 40개의 연속 잔기의 분절로부터의 서열을 포함하거나, 이로 기본적으로 구성되거나, 이로 구성됨;
그리고
- 펩타이드 서열은 PKC의 키나아제 도메인의 분절의 상기 서열 내에서 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변형(들)을 포함할 수 있음.
상기 펩타이드(들)는 하기 특징 중 하나 또는 여러 개를 추가로 나타낸다:
- 이는 80개 미만의 아미노산, 보다 바람직하게는 60개 미만의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 40개 미만의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 30개 미만의 아미노산의 길이를 가지며;
- 이는 적어도 5개의 아미노산 및 40개 미만의 아미노산, 바람직하게는 적어도 5, 6, 7, 8 또는 9개의 아미노산 및 30개 미만의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 5, 6, 7, 8 또는 9개의 아미노산 및 25개 미만의 아미노산의 길이를 가지며;
- 이는 가교 결합에 의해 변형되며;
- 특히 ALMS1과 αPKC 간의 상호작용을 감소시키거나 방지하기 위해 ALMS1-PKC 상호작용을 방해할 수 있음; 또는 특히 ALMS1과 αPKC 간의 상호작용을 감소시키거나 방지하기 위해 ALMS1-PKC 상호작용을 방해할 수 없음;
- 이는 지방 조직에서 FATP 발현의 발현 수준을 변경하고, 우선적으로 지방 조직에서 FATP2 발현을 감소시킴.
상기 펩타이드(들)는 하기 특징 중 하나 또는 여러 개를 추가로 나타낸다:
- 이는 80개 미만의 아미노산, 보다 바람직하게는 60개 미만의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 40개 미만의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 30개 미만의 아미노산의 길이를 가지며;
- 이는 적어도 5, 6, 7, 8 또는 9개 아미노산 및 40개 미만의 아미노산, 바람직하게는 적어도 5, 6, 7, 8 또는 9개 아미노산 및 30개 미만의 아미노산의 길이, 보다 바람직하게는 적어도 5, 6, 7, 8 또는 9개의 아미노산 및 25개 미만의 아미노산의 길이를 가지며;
- 이는 교차 결합에 의해 변형되며;
- 특히 ALMS1과 αPKC 간의 상호작용을 감소시키거나 방지하기 위해 ALMS1-PKC 상호작용을 방해할 수 있음.
하나의 양태에서, 본 개시내용의 펩타이드는 PKC(단백질 키나아제 C)의 키나아제 도메인의 분절로부터의 서열을 포함하거나, 이로 기본적으로 구성되거나, 이로 구성된다. PKC는 기존의 PKC, 신규 PKC 및 비정형 PKC 중에서 선택할 수 있다. 특히, PKC는 기존의 PKC 중에서 선택할 수 있다. 바람직하게, PKC는 α, βI, βII 및 γ PKC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직하게, PKC는 α, βI 및 βII PKC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 더 바람직하게, PKC는 αPKC, 바람직하게는 인간 α PKC, 보다 바람직하게는 서열 번호: 1의 인간 αPKC이다. 인간 αPKC의 키나아제 도메인은 서열 번호: 2로 개시되어 있다.
PKC의 키나아제 도메인의 분절은 PKC의 키나아제 도메인의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 25개 연속 잔기를 갖는다. 하나의 양태에서, PKC의 키나아제 도메인의 분절은 PKC의 키나아제 도메인의 5 내지 40개의 연속 잔기(선택적으로, 5 내지 30개 또는 5 내지 25개 또는 7 내지 25개 또는 8 내지 25개 또는 9 내지 25개 또는 10 내지 25개 또는 11 내지 25개 또는 12 내지 25개)를 갖는다.
분절이 선택되는 PKC의 키나아제 도메인은 바람직하게는 서열 번호: 2의 서열과 적어도 40%의 동일성을 가지며, 보다 바람직하게는 서열 번호: 2의 서열과 적어도 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95%의 동일성을 갖는다.
바람직하게, PKC의 키나아제 도메인의 분절의 상기 서열은 펩타이드 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%에 상응한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 펩타이드 서열은 서열 번호: 1의 분절의 서열로 이루어진다.
PKC의 키나아제 도메인의 분절이 하나의 메티오닌 및/또는 하나의 프롤린 및/또는 하나의 아르기닌을 포함하는 경우, 이때 서열은 모든 프롤린 잔기, 및/또는 모든 메티오닌 잔기, 및/또는 모든 아르기닌 잔기를 제거하기 위해 (즉, 치환(들)을 도입함으로써) 변형될 수 있다. 예를 들어, 서열은 모든 프롤린 잔기를 제거하도록 (즉, 치환(들)을 도입함으로써) 변형될 수 있다. 대안적으로, 서열은 모든 메티오닌 잔기를 제거하도록 (즉, 치환(들)을 도입함으로써) 변형될 수 있다. 그렇지 않으면, 서열은 모든 아르기닌 잔기를 제거하도록 (즉, 치환(들)을 도입함으로써) 변형될 수 있다. 하나의 양태에서, 서열은 모든 프롤린 및 메티오닌 잔기를 제거하도록 (즉, 치환(들)을 도입함으로써) 변형될 수 있다. 또 다른 양태에서, 서열은 모든 프롤린 및 아르기닌 잔기를 제거하도록 (즉, 치환(들)을 도입함으로써) 변형될 수 있다. 추가 양태에서, 서열은 모든 메티오닌 및 아르기닌 잔기를 제거하도록 (즉, 치환(들)을 도입함으로써) 변형될 수 있다. 보다 바람직하게, 서열은 모든 프롤린 잔기, 모든 메티오닌 잔기 및 모든 아르기닌 잔기를 제거하도록 (즉, 치환(들)을 도입함으로써) 변형될 수 있다.
바람직하게, 펩타이드는 20개 이하, 바람직하게는 15개 이하, 보다 바람직하게는 10개 이하의 치환, 결실, 부가 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산 변형을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 펩타이드는 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개, 보다 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
예를 들어, 펩타이드는 바람직하게는 서열 번호: 2의 키나아제 도메인 PKC의 분절의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%의 동일성을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 서열 번호: 2에 상응하는 펩타이드의 서열의 일부는 서열 번호: 2의 분절의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%의 동일성을 갖는다.
특정 양태에서, 펩타이드는 키나아제 도메인 PKC, 바람직하게는 서열 번호: 2의 분절의 서열과 비교하여 치환, 결실 또는 추가된 적어도 하나의 아미노산을 갖는다.
예를 들어, PKC의 키나아제 도메인의 분절의 서열은 서열 번호: 1의 위치 339와 432 사이, 서열 번호: 1의 위치 434와 544 사이, 서열 번호: 1의 위치 546과 561 사이, 서열 번호: 1의 위치 563과 565 사이, 또는 서열 번호: 1의 위치 568과 595 사이의 서열에 속할 수 있다.
하나의 실시양태에서, PKC의 키나아제 도메인 분절의 서열은 하기 잔기를 포함하지 않을 수 있다: 서열 번호: 1의 G433, E545, S562, S566.
하나의 양태에서, 본 개시내용의 펩타이드는 알파 나선 구조를 갖는다. 본원에서 사용되는 용어 "알파 나선" "α-나선", "고전적인 폴링-코리-브랜슨(Pauling-Corey-Branson) α-나선" 및 "3.613-나선"은 동일하며, 서로에 관한 것이다. "알파 나선"이라는 용어는 모든 백본 N-H 그룹이 단백질 서열을 따라 3개 또는 4개의 잔기보다 먼저 위치하는 아미노산의 백본 C=O 그룹에 수소 결합을 제공하는 오른쪽 코일 또는 나선형 형태(나선)인 단백질의 2차 구조에서 공통적인 모티프를 나타낸다. 알파 나선은 나선형 회전 당 평균 잔기 수가 약 3.6개이고 수소 결합에 의해 형성된 고리에 13 개의 원자가 관여한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 펩타이드는 알파 나선 구조를 갖고/갖거나 알파 나선 구조를 예측하는 서열을 갖는다. 펩타이드의 구조를 결정하는 방법은 원편광 이색성 또는 NMR과 같은 것으로서 당업자에게 잘 알려져 있다. 마찬가지로, 펩타이드의 알파 나선 구조를 예측하는 방법은 STRIDE(Frishman D., Argos P., Proteins, vol. 23, no 4, 1995, p. 566-579); DEFINE(Richards F. M., Kundrot C. E., Proteins, vol. 3, no 2, 1988, p. 71-84); DSSP(Touw et al. Nucleic Acids Research 2015; 43 : D364-D368; Kabsch & Sander. Biopolymers. 1983, 22, 2577-2637)와 같이 당업자에게 잘 알려져 있다.
알파 나선은 하기 위치에서 키나아제 도메인에 있다: 서열 번호: 1의 372-377; 381-392; 425-432; 437-456; 466-468; 502-504; 507-510; 518-533; 543-552; 563-572; 577-579; 587-593 및 595-597.
따라서, 펩타이드는 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다:
- VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3);
- LMYHIQQV(서열 번호: 4);
- LDN;
- PDY;
- PEII(서열 번호: 5);
- SVDWWAYGVLLYEMLA(서열 번호: 6);
- EDEDELFQSIME(서열 번호: 7);
- PAK;
- GERDVRE(서열 번호: 8);
- AFF.
특정 실시양태에서, 펩타이드는 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 구성될 수 있다:
- VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3); 및
- GERDVRE(서열 번호: 8).
선택적으로, 펩타이드는 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 구성될 수 있다: VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3); VECTXVEKRVLA(서열 번호: 9); VECTMVEKXVLA(서열 번호: 10); VECTXVEKXVLA(서열 번호: 11); LMYHIQQV(서열 번호: 4); LXYHIQQV(서열 번호: 12); LDN; SVDWWAYGVLLYEMLA(서열 번호: 6); SVDWWAYGVLLYEXLA(서열 번호: 13); SVXWWAYGLLYEMLA(서열 번호: 52); EDEDELFQSIME(서열 번호: 7); EDEDELFQSIXE(서열 번호: 14); GERDVRE(서열 번호: 8); GEXDVRE(서열 번호: 15); GERDVXE(서열 번호: 16); GEXDVXE(서열 번호: 17); LDN; AFF; PDY; XDY; PEII(서열 번호: 5); XEII(서열 번호: 18); PAK; XAK; 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산이다. 바람직하게, X는 α-나선 2차 구조에 유리한 아미노산이다. 예를 들어, X는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y, 보다 바람직하게는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
하나의 양태에서, 펩타이드는 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다: VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3); VECTXVEKRVLA(서열 번호: 9); VECTMVEKXVLA(서열 번호: 10); VECTXVEKXVLA(서열 번호: 11); LMYHIQQV(서열 번호: 4); LXYHIQQV(서열 번호: 12); SVDWWAYGVLLYEMLA(서열 번호: 6); SVDWWAYGVLLYEXLA(서열 번호: 13); SVXWWAYGLLYEMLA(서열 번호: 52); EDEDELFQSIME(서열 번호: 7); EDEDELFQSIXE(서열 번호: 14); GERDVRE(서열 번호: 8); GEXDVRE(서열 번호: 15); GERDVXE(서열 번호: 16); GEXDVXE(서열 번호: 17); 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 양태에서, 펩타이드는 X가 K인 VECTMVEKXVLA(서열 번호: 10)를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 또 다른 특정 양태에서, 펩타이드는 X는 E인 SVXWWAYGLLYEMLA(서열 번호: 52)를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
특히, 펩타이드는 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다: VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3); VECTXVEKRVLA(서열 번호: 9); VECTMVEKXVLA(서열 번호: 10); VECTXVEKXVLA(서열 번호: 11); LXYHIQQV(서열 번호: 12); SVDWWAYGVLLYEXLA(서열 번호: 13); EDEDELFQSIXE(서열 번호: 14); GERDVRE(서열 번호: 8); GEXDVRE(서열 번호: 15); GERDVXE(서열 번호: 16); GEXDVXE(서열 번호: 17); 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산이다. 예를 들어, 펩타이드는 하기 서열 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: VECTMVEKRVLA 또는 VECTTVEKEVLA(서열 번호: 19).
선택적으로, 펩타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환(들), 결실(들), 부가(들) 또는 이의 혼합, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 치환(들), 결실(들), 부가(들) 또는 이의 혼합, 보다 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 치환(들)을 포함할 수 있다.
선택적으로, 펩타이드는 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다: 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개 변형(들), 보다 바람직하게는 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개 변형(들), 보다 바람직하게는 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 VECTXVEKRVLA(서열 번호: 9); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개 변형(들), 보다 바람직하게는 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 VECTMVEKXVLA(서열 번호: 10); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개 변형(들), 보다 바람직하게는 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 VECTXVEKXVLA(서열 번호: 11); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 LMYHIQQV(서열 번호: 4); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 LXYHIQQV(서열 번호: 12); LDN; 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개 변형(들), 보다 바람직하게는 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 SVDWWAYGVLLYEMLA(서열 번호: 6); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개 변형(들), 보다 바람직하게는 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 SVDWWAYGVLLYEXLA(서열 번호: 13); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개 변형(들), 보다 바람직하게는 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 SVXWWAYGLLYEMLA(서열 번호: 52); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개 변형(들), 보다 바람직하게는 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 EDEDELFQSIME(서열 번호: 7); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개 변형(들), 보다 바람직하게는 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 EDEDELFQSIXE(서열 번호: 14); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개 변형(들), 보다 바람직하게는 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 GERDVRE(서열 번호: 8); 선택적으로 치환(들) 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 GEXDVRE(서열 번호: 15); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 GERDVXE(서열 번호: 16); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 GEXDVXE(서열 번호: 17); LDN; AFF; PDY; XDY; PEII(서열 번호: 5); XEII(서열 번호: 18); PAK; XAK; 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산이다. 바람직하게, X는 α-나선 2차 구조에 유리한 아미노산이다. 예를 들어, X는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y, 보다 바람직하게는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
하나의 양태에서, 펩타이드는 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다: 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 VECTXVEKRVLA(서열 번호: 9); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 VECTMVEKXVLA(서열 번호: 10); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 VECTXVEKXVLA(서열 번호: 11); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 LMYHIQQV(서열 번호: 4); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 LXYHIQQV(서열 번호: 12); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 SVDWWAYGVLLYEMLA(서열 번호: 6); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 SVDWWAYGVLLYEXLA(서열 번호: 13); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 SVXWWAYGLLYEMLA(서열 번호: 52); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 EDEDELFQSIME(서열 번호: 7); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 EDEDELFQSIXE(서열 번호: 14); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 GERDVRE(서열 번호: 8); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 GEXDVRE(서열 번호: 15); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 GERDVXE(서열 번호: 16); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 GEXDVXE(서열 번호: 17); 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산이다. 바람직하게, X는 α-나선 2차 구조에 유리한 아미노산이다. 예를 들어, X는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y, 보다 바람직하게는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특히, 펩타이드는 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다: 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 VECTXVEKRVLA(서열 번호: 9); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 VECTMVEKXVLA(서열 번호: 10); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 VECTXVEKXVLA(서열 번호: 11); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 GERDVRE(서열 번호: 8); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 GEXDVRE(서열 번호: 15); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 GERDVXE(서열 번호: 16); 선택적으로 치환(들), 결실(들), 부가(들), 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 갖는 GEXDVXE(서열 번호: 17); 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산이다. 바람직하게, X는 α-나선 2차 구조에 유리한 아미노산이다. 예를 들어, X는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y, 보다 바람직하게는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 펩타이드는 하기 서열 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: VECTMVEKRVLA 또는 VECTTVEKEVLA(서열 번호: 19).
하나의 양태에서, 펩타이드는 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다:
a) 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTXVEKXVLALLDKXXFLTQLHS(서열 번호 20), 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산, 바람직하게는 α-나선 2차 구조에 유리한, 보다 바람직하게는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y, 보다 더 바람직하게는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;
b) 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTMVEKRVLALLDKXXFLTQLHS(서열 번호: 21), 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산, 바람직하게는 α-나선 2차 구조에 유리한, 보다 바람직하게는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y, 보다 더 바람직하게는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;
c) 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTXVEKRVLALLDKPPFLTQLHS(서열 번호: 22), 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산, 바람직하게는 α-나선 2차 구조에 유리한, 보다 바람직하게는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y, 보다 더 바람직하게는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;
d) 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 VECTMVEKXVLALLDKPPFLTQLHS(서열 번호: 23), 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산, 바람직하게는 α-나선 2차 구조에 유리한, 보다 바람직하게는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y, 보다 더 바람직하게는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;
그리고, 임의의 서열 a) 내지 d)의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 25개의 연속 잔기의 임의의 분절의 서열.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 알파 나선 형태로 유지하기 위해 설계되거나 변형된다. 당업계에 알려진 바와 같이, 이것은 생물학적 효과에 중요하지 않은 아미노산의 치환으로 아미노산 서열의 변형, 비천연 아미노산의 사용, 펩타이드 고리화, 및 펩타이드 백본에 대한 변형 또는 펩타이드 사슬에 있는 아미노산 사이의 화학적 연결을 부가를 포함하는 다양한 방법을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 이들의 열 및 프로테아제 안정성을 증가시키기 위해 펩타이드에 이러한 변형을 일어날 수 있다.
특히, 본 개시내용의 펩타이드는 화학적 가교 결합에 의해 변형된다. 예를 들어, 펩타이드는 스테이플링된 펩타이드일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용의 펩타이드는 스테이플링된다. 본원에 사용된 용어 "스테이플링된 펩타이드" 또는 "스티칭된 펩타이드"는 펩타이드 2차 구조가 펩타이드 중의 α-나선의 인접한 회전을 연결하는 하나 이상의 인공 분자 가교결합(브릿지)로 안정화된 인공적으로 변형된 펩타이드를 의미한다. 스테이플링된 펩타이드를 제조하는 방법은 예를 들어 Verdine & Hilinski(2012, Methods Enzymol, 503, 3-33), WO10033617 및 WO10011313(이의 개시내용이 본원에 인용되어 포함됨)에 공지되어 있다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용의 스테이플링된 펩타이드의 가교결합은 i+3 및/또는 i+4 및/또는 i+7 가교결합이다. 펩타이드에서, "i+3 가교결합"은 아미노산, "i" 아미노산 및 i 아미노산으로부터 3개 아미노산 잔기의 거리에 존재하는 또 다른 아미노산 사이의 가교결합이다. 펩타이드에서, "i+4 가교결합"은 아미노산, "i" 아미노산 및 i 아미노산으로부터의 4개 아미노산 잔기의 거리에 존재하는 또 다른 아미노산 사이의 가교결합이다. 펩타이드에서, "i+7 가교결합"은 아미노산, "i" 아미노산 및 i 아미노산으로부터의 7개 아미노산 잔기의 거리에 존재하는 또 다른 아미노산 사이의 가교결합이다. 바람직한 양태에서, 펩타이드는 "i+7 가교결합"을 갖는다.
가장 짧은 서열, 특히 3 내지 4개 잔기를 포함하는 서열의 경우, 가교결합은 i+3 및 i+4이며, 이 서열 외부에 있는 잔기 사이에 도입된다. 서열이 충분히 길면 i+7의 가교결합이 바람직하다.
하나의 특정 펩타이드에 대한 이러한 양태를 설명하기 위해, 펩타이드는 하기 서열 중 하나를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다:
VECTM X EKRVLA X (서열 번호: 24)
VECTX X EKRVLA X (서열 번호: 25)
VECTM X EKXVLA X (서열 번호: 26)
VECTX X EKXVLA X (서열 번호: 27)
VECTX X EKXVLA X LDKXXFLTQLHS(서열 번호: 28)
VECTM X EKRVLA X LDKXXFLTQLHS(서열 번호: 29)
VECTX X EKRVLA X LDKPPFLTQLHS(서열 번호: 30)
VECTM X EKXVLA X LDKPPFLTQLHS(서열 번호: 31)
VECTT X EKEVLA X LDKAAFLTQHS(서열 번호: 53)
VECTT X EKEVLA X LDKAAF(서열 번호: 54)
VEGTT X EKEVLA X LDKAAF(서열 번호: 55) 및
ECTT X EKEVLA X L(서열 번호: 56)
ECTM X EKKVLA X L(서열 번호: 57)
여기서 굵고 밑줄이 그어진 X 잔기는 스테이플링을 갖고 스테이플링에 적합한 임의의 아미노산 유도체이며;
여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산, 바람직하게는 α-나선 2차 구조에 유리한 아미노산, 보다 바람직하게는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y, 보다 더 바람직하게는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며,
치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열을 갖는다.
예를 들어, i+7 스테이플링의 맥락에서, 첫 번째 X 는 2-(7-옥테닐)아미노산(예를 들면, 2-(7-옥테닐)알라닌 또는 2-(7-옥테닐)아르기닌)이며, 두 번째 X 는 2-(4-펜테닐)아미노산(예를 들어, 2-(4-펜테닐)알라닌 또는 2-(4-펜테닐)세린)이다. 특정 조합은 2-(7-옥테닐)알라닌 및 2-(4-펜테닐)알라닌; 2-(7-옥테닐)알라닌 및 2-(4-펜테닐)세린; 2-(7-옥테닐)아르기닌 및 2-(4-펜테닐)알라닌; 또는 2-(7-옥테닐)아르기닌 및 2-(4-펜테닐)세린일 수 있다.
특정 실시양태에서, 펩타이드는 하기일 수 있다:
VECTT R EKEVLA S LDKAAFLTQLHS(서열 번호: 32)
여기서 R 및 S 는 스테이플링을 가지며, 바람직하게는 각각 2-(7-옥테닐)아르기닌 및 2-(4-펜테닐)세린이고;
치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형(들), 보다 바람직하게는, 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 환형 펩타이드이다. 본원에 사용된 용어 "환형 펩타이드" 또는 "원형 펩타이드"는 동일하며, N- 말단 및 C-말단, 또는 N-말단 및 다른 아미노산의 측쇄, 바람직하게는 C- 말단 아미노산, 또는 다른 아미노산의 C-말단 및 측쇄, 바람직하게는 N-말단 아미노산, 또는 아미노산의 측쇄 및 다른 아미노산의 측쇄, 바람직하게는 N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산은 고리 구조를 생성하는 공유 결합으로 연결된다. 본원에 사용된 용어 "N- 말단(N-terminus)", "아미노-말단(amino-terminus)", "NH2-말단(NH2-terminus)", "N-말단(N-terminal end)"및 "아민-말단(amine-terminus)"은 동일하며, 펩타이드의 첫 번째 아미노산에 존재하는 유리 아민 기(-NH2)를 나타낸다. 본원에 사용된 용어 "C-말단(C-terminus)", "카르복실-말단(carboxyl-terminus)", "카르복시-말단(carboxy-terminus)", "C-말단(C-terminal end)" "COOH-말단(COOH-terminus)"은 동일하며, 펩타이드의 마지막 아미노산에 존재하는 유리 카르복실 기(-COOH)를 나타낸다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 80개 미만의 아미노산, 보다 바람직하게는 60개 미만의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 40개 미만의 아미노산, 보다 더욱 더 바람직하게는 30개 미만의 아미노산 길이를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 25개 미만의 아미노산 길이를 갖는다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 20개 미만의 아미노산, 바람직하게는 15개 미만의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직하게, 펩타이드는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산보다 큰 최소 길이를 갖는다. 예를 들어, 펩타이드는 길이가 적어도 4개의 아미노산 및 40개 미만의 아미노산, 바람직하게는 길이가 적어도 4개의 아미노산 및 30개 미만의 아미노산이고; 보다 바람직하게는 적어도 6개의 아미노산 및 25개 미만의 아미노산을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 특히 ALMS1 및 αPKC 간의 상호 작용을 감소시키거나 방지하기 위해 ALMS1-PKC 상호작용을 방해 할 수 있다. 즉, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 ALMS1과 αPKC의 상호 작용을 차단할 수있다. 대안적으로, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 특히 ALMS1과 αPKC 사이의 상호 작용을 감소시키거나 방지하기 위해 ALMS1-PKC 상호 작용을 방해할 수 없다. 즉, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 ALMS1과 αPKC의 상호 작용을 차단할 수 없다.
αPKC의 ALMS1에 대한 결합에 미치는 펩타이드의 효과를 결정하기 위해, 당업자에게 공지된 임의의 기술, 특히 단백질 상호 작용을 결정하는 데 적합한 임의의 방법을 수행할 수 있다. 예를 들어, 재조합 또는 정제된 천연 ALMS1 또는 αPKC는 표면 플라즈몬 공명 선박에 결합될 수 있으며, 다른 분자는 예를 들어 Biacore(General Electric, USA) 기계에서 결합 친화도를 평가하기 위해 칩 위로 흘러가게 될 수 있다.
ALMS1에 대한 αPKC의 결합에 미치는 펩타이드(들)의 효과는 시험된 펩타이드(들)의 부재 및 존재하에 αPKC의 ALMS1에 대한 결합을 측정하고 αPKC와 ALMS1의 결합을 비교함으로써 결정된다.
특히 ALMS1을 미끼로 사용한 면역 침전 분석을 수행할 수 있다. 분석은 인슐린의 부재 및/또는 존재하에, 바람직하게는 인슐린의 부재하에 배양된 세포, 특히 지방 세포로 수행될 수 있다. 테스트할 펩타이드는 배양 배지에 첨가한다. 그런 다음 αPKC를 면역 검출한다.
"감소된", "감소하다" 또는 "예방하다"는 동일한 조건에서 시험된 분자의 부재하에 측정된 결합과 비교할 때 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 감소된 결합을 의미하는 나타내는 것으로 의도된다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 지방 조직에서 FATP2의 발현을 감소시킬 수 있다.
FATP2는 용질 캐리어 패밀리 27 멤버 2(Solute Carrier Family 27 Member 2; SLC27A2)라고도 한다. 이 단백질은 O14975로 데이터베이스 UniProtKB에 개시되어 있다. 이 유전자는 Hs.11729로 UniGene 데이터베이스에 기재되어 있다. 참조 서열은 NCBI에서 이이소폼 1의 경우 NP_003636.2 및 NM_003645.3 및 아이소폼 2의 경우 NP_001153101.1 및 NM_001159629.1.로 확인할 수 있다.
"감소된" 또는 "감소하다"는 같은 조건에서 펩타이드의 부재 하에 측정된 발현과 비교할 때 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 감소된 발현을 나타내도록 의도된다. 발현은 단백질 수준(예를 들어, 항체 사용) 또는 mRNA 수준에서 측정할 수 있다.
발현은 임의의 이용 가능한 방법, 예컨대 면역-조직화학, 반-정량적 웨스턴 블롯 또는 단백질 또는 항체 어레이에 의해 단백질 수준에서 측정될 수 있다. FATP2에 대한 항체는 예를 들어 Origene에서 시판되는 것으로서, ref TA350424 또는 TA333990; 또는 Santa Cruz Biotechnology에서 시판되는 ref sc-393906이 있다.
발현은 또한 사용 가능한 임의의 방법에 의해 mRNA 수준에서 측정될 수 있다. 바람직하게, FATP2의 발현 수준은 정량적 RT-PCR, 실시간 정량적 RT-PCR, 나노 스트링 기술 PCR 또는 RNA-Seq와 같은 고 처리량 시퀀싱 기술 또는 미세 유체 시스템을 사용한 시퀀싱 기술에 의해 mRNA 전사물의 양을 측정하여 결정한다. 보다 구체적으로, 발현은 실시예 섹션에 나타낸 방법으로 측정한다.
특정 실시양태에서, 지방 조직에서 펩타이드에 의해 야기되는 FATP2 발현에 대한 효과는 바람직하게는 FATP2에 특이적이다. 본 실시양태에서, 펩타이드는 특히 포유 동물의 지방 조직에서 다른 FATP, 즉 FATP1, FATP3, FATP4, FATP5 및 FATP6의 발현에 영향을 미치지 않거나, 덜 영향을 미칠 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 하기 특징을 나타낸다:
- 하나의 메티오닌, 하나의 프롤린 및 하나의 아르기닌을 동시에 포함하지 않으며;
- 나선, 바람직하게는 알파 나선인 2차 구조를 채택하며;
- PKC(단백질 키나아제 C)의 키나아제 도메인의 분절로부터의 서열을 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 이로 구성되며.
하기 특징 하나, 둘, 셋, 넷 또는 모두를 추가로 제공한다:
- 지방 조직에서 FATP 발현의 발현 수준을 변형시키고, 우선적으로 지방 조직에서 FATP2 발현을 감소시키며;
- 적어도 4개의 아미노산 및 40개 미만의 아미노산, 바람직하게는 적어도 4개의 아미노산 및 30개 미만의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 4개의 아미노산 및 25개 미만의 아미노산 길이를 가지며;
- 나선, 바람직하게는 알파 나선인 2차 구조를 채택하며;
- 교차결합에 의해 변형됨.
보다 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 하기 특징을 제공한다:
- 하나의 메티오닌, 하나의 프롤린 및 하나의 아르기닌을 동시에 포함하지 않으며;
- 적어도 4개의 아미노산 및 40개 미만의 아미노산, 바람직하게는 적어도 4개의 아미노산 및 30개 미만의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 4개의 아미노산 및 25개 미만의 아미노산 길이를 가지며;
- 나선, 바람직하게는 알파 나선인 2차 구조를 채택함.
또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 하기 특징을 제공한다:
- 지방 조직에서 FATP2 발현을 감소시키며;
- 하나의 메티오닌, 하나의 프롤린 및 하나의 아르기닌을 동시에 포함하지 않으며;
- 적어도 4개의 아미노산 및 40개 미만의 아미노산, 바람직하게는 적어도 4개의 아미노산 및 30개 미만의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 4개의 아미노산 및 25개 미만의 아미노산 길이를 가지며;
- 나선, 바람직하게는 알파 나선인 2차 구조를 채택함.
본 개시내용에 따른 펩타이드는 이의 세포 흡수 또는 진입을 촉진하는 모이어티, 특히 PTD(단백질 형질 도입 도메인)를 추가로 포함할 수 있다. PTD는 일반적으로 10 내지 20개 아미노산의 특정 아미노산 서열을 포함한다(Matsushita and Matsui, (2005), J Mol Med 83, 324-328; Vives et al, Biochimic et Biophysica Acta, 2008, 1786, 126-138). PTD는 주로 아르기닌이나 라이신과 같은 염기성 아미노산으로 구성되어 있으며, PTD의 대표적인 예로는 아르기닌이 풍부한 펩타이트, 예컨대 poly R8(RRRRRRRR(서열 번호: 33)) 또는 (RRPRRPRRPRRPRRP(서열 번호: 34)), 안테나피디아 또는 페네트라틴 펩타이드, 예컨대 (RQIKIWFQNRRMKWKK(서열 번호: 35)) 또는 HIV-Tat(YGRKKRRQRRR(서열 번호: 36))을 포함한다.
본 개시내용에 따른 펩타이드는 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산으로 제조될 수 있다. 용어 "비천연 아미노산"은 천연 아미노산의 유사체 또는 유도체(즉, 알라닌, 발린, 글리신, 류신, 이소류신, 라이신, 아르기닌, 글루타민산, 글루타민, 아스파르트 산, 아스파라긴, 히스티딘, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 세린, 프롤린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌)로 규정한다. 이들은 변형된 측쇄, 즉 더 짧거나, 더 길거나, 다른 작용기를 갖는 것으로 나타난다. 특히 이성질체 D는 프로테아제에 민감하지 않기 때문에 이성질체 D 및 L이 고려된다. 또한, 단백질 분해 저항성을 증가시키기 위해 일부 또는 모든 펩타이드 결합의 변형, 특히 (-CO-NH-)에 의해 (-CH2-NH-), (-NH-CO-), (-CH2-O-), (-CH2-S-), (-CH2-CH2-), (-CO-CH2-), (-CHOH-CH2-), (-N=N-), 및/또는 (-CH=CH-)에 의한 변형도 고려된다. 펩타이드는 카르복실산 C 말단(-COO-) 및 아미드 1(-CONH2)을 나타낼 수 있다. 펩타이드는 또한 본원에 개시된 바와 같은 펩타이드의 D-레트로-인버소 서열일 수 있다. N 말단은 특히 아세틸 라디칼로 변형될 수 있다.
선택적으로, 펩타이드는 이의 안정성을 높이기 위해 PEG화될 수 있다. 추가로 선택적으로, 펩타이드는 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비-수성 양성 자성 용매 용액으로 제제화될 수 있다. 펩타이드는 또한 폴리 락트 코-글리콜 산 마이크로스피어 데포 제제로 패키징될 수 있다. 많은 서방성 전달 시스템이 존재하고, 이들 중 다수가 본 개시내용에 사용하기에 적절하다. 예를 들어, PLGA, 폴리-락테이트 또는 폴리-글리콜레이트와 같은 분해성 폴리머를 기반으로 하는 폴리머-기반 서방형 조성물이 적합하며, WO2005/117830 및/또는 WO2006/075124에 기재된 것과 같은 지질 기반 데포 조성물(이의 전체 개시 내용은 본원에 인용되어 포함됨)이 적합하다. 생분해성 폴리머 데포 제제로의 활성제의 제제화는 당업계에 잘 확립되고 잘 알려져 있으며, 따라서 본 개시내용의 펩타이드는 공지된 방법을 사용하여 이들로 제제화될 수 있다. 바람직하게, 본 개시내용의 조성물은 적어도 1개월 동안 기능적 농도로 펩타이드를 방출할 수 있다
"펩타이드"는 상기에 개시된 바와 같은 펩타이드 또는 상기에 개시된 바와 같은 여러 펩타이드의 조합을 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상이한 펩타이드, 바람직하게는 2 또는 3개, 보다 바람직하게는 2개가 사용될 수 있다.
조합
본 개시내용에 따른 펩타이드(들)는 하나 이상의 추가 활성 약물, 예를 들어 항당뇨병제, 고지혈증제, 항비만제, 항고혈압제, 항지방증제, 항염증제, 및 퍼옥시좀 증식제-활성화제 수용체의 작용제와 병용하여 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기에 관한 것이다 :
- 특히 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 추가 활성 약물과 조합하여, 당뇨병 및 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물;
- 당뇨병 및 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 펩타이드 및 하나 이상의 추가 활성 약물을 포함하는 약학적 조성물;
- 당뇨병 및 관련 질환의 치료에 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한, 본 개시내용에 따른 펩타이드 및 특히 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 추가 활성 약물을 포함하는 제품, 조합 제제 또는 키트;
- 하나 이상의 추가 활성 약물과 조합하여 당뇨병 및 관련 질환의 치료를 위한 약물 제조를 위한 펩타이드의 용도;
- 당뇨병 및 관련 질환의 치료를 위한 약물의 제조를 위한, 특히 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 추가 활성 약물 및 본원에 개시된 펩타이드의 용도;
- 본원에 개시된 바와 같은 치료적 유효량의 펩타이드 및 치료적 유효량의 하나 이상의 추가 활성 약물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 당뇨병 및 관련 질환의 치료 방법;
- 본원에 개시된 펩타이드 및 특히 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 추가 활성 약물을 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 당뇨병 및 관련 질환의 치료 방법.
특히, 하나 이상의 추가 활성 약물의 치료적 또는 준-치료적 유효량을 사용할 수 있다. "준-치료적"은 (특히 동일한 지시 및/또는 동일한 투여 경로 및/또는 투여 빈도에 있어서) 예를 들어 통상적인 치료 투여량의 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10%일 수 있는 양을 의미하는 것으로 의도된다.
항당뇨병제는 예를 들어 인슐린, 인슐린 유도체 및 모방체; 설포닐우레아(예: 클로르프로파미드, 톨라자미드, 아세토헥사미드, 톨부타미드, 글리부리드, 글리메피리드, 글리피지드)와 같은 인슐린 분비 촉진제; 엠플라글리플로진 및 다파글리플로진과 같은 글리플로진; 글리부리드 및 아마릴; 리라글루타이드(NN2211); 메글리티니드와 같은 인슐린 분비 촉진성 설포닐우레아 수용체 리간드, 예를 들어, 나테글리니드 및 레파글리니드; 티아졸리딘디온(예를 들어, 로시글리타존(AVANDIA), 트로글리타존(REZULIN), 피오글리타존(ACTOS), 발라글리타존, 리보글리타존, 네토글리타존, 트로글리타존, 엔글리타존, 시글리타존, 아다글리타존, 다르글리타존으로, 이들은 인슐린 작용을 향상시켜(예를 들어, 인슐린 감작에 의해) 말초 조직에서 포도당 이용을 촉진함; PTP-112와 같은 단백질 티로신 포스파타제-IB(PTP-1B) 억제제; 토르세트라핍과 같은 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질(CETP) 억제제, SB-517955, SB-4195052, SB-216763, NN-57-05441 및 NN-57-05445와 같은 GSK3(글리코겐 합성효소 키나아제-3) 억제제; GW-0791 및 AGN-194204와 같은 RXR 리간드; T-1095 또는 카나글리플로진과 같은 나트륨-의존성 포도당 공동수송체 억제제; BAY R3401과 같은 글리코겐 포스포릴라제 A 억제제; 메트포르민과 같은 비구아나이드 및 포도당 이용 촉진, 간 포도당 생산 감소 및/또는 장내 포도당 생산량 감소에 의해 작용하는 기타 제제; 아카보스 및 미기이토(migiitoi)와 같은 알파-글루코시다아제 억제제 및 탄수화물 소화 및 결과적으로 장에서 흡수를 늦추고 식후 고혈당증을 감소시키는 기타 제제; GLP-1(글루카곤 유사 펩타이드-1), Exendin-4 및 GLP-1 모방체와 같은 GLP-1 유사체; 및 빌다글립틴과 같은 DPPIV(디펩티딜 펩티다제 IV) 억제제일 수 있다. 또한 Expert Opin Investig Drugs 2003, 12(4): 623-633, 도 1 내지 7에 기재된 항당뇨병제일 수 있다. 항당뇨병제는 또한 이의 개시내용이 본원에 인용되어 포함된 WO 2015/114062에 개시된 것과 같은 αPKC 및 ALMS1의 결합을 방지하는 분자를 포함할 수 있다.
고지혈증제는 예를 들어 3-히드록시-3-메틸-글루타릴 조효소 A(HMG-CoA) 환원효소 억제제, 예를 들어 로바스타틴, 피타바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 세리바스타틴, 메바스타틴, 벨로스타틴, 플루바스타틴, 달바스타틴, 아토르바스타틴, 로수바스타틴 및 리바스타틴; 스쿠알렌 신타제 억제제; 오베티콜산과 같은 FXR(파르네소이드 X 수용체) 및 LXR(간 X 수용체) 리간드; 콜레스티라민 및 콜레세벨람과 같은 담즙산 시퀀스트란트(bile acid sequenstrants); 피브레이트; 니코틴산 및 아스피린; 아람콜, 막횡단 G 단백질-결합 수용체(TGR) 5 작용제일 수 있다.
항비만제는 예를 들어 오르리스타트, 리모나반트, 펜터민, 토피라메이트, 퀴넥사 및 로카세린일 수 있다.
항고혈압제는 예를 들어 에타크린산, 푸로세미드 및 토르세미드와 같은 루프 이뇨제; 베나제프릴, 캅토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 모엑시프릴, 페리노도프릴, 퀴나프릴, 라미프릴 및 트란돌라프릴과 같은 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제; 디곡신과 같은 Na-K-ATPase 막 펌프의 억제제; 사쿠비트릴과 같은 뉴트럴엔도펩티다제(NEP) 억제제; 오마파트릴라트, 삼파트릴라트 및 파시도트릴과 같은 ACE/NEP 억제제; 칸데사르탄, 에프로사르탄, 이르베사르탄, 로사르탄, 텔미사르탄 및 발사르탄, 특히 발사르탄과 같은 안지오텐신 II 길항제; NEP 억제제와 사쿠비트릴 및 발사르탄(즉, 엔트레스토)과 같은 안지오텐신 II 길항제의 조합; 디테키렌, 잔키렌, 테를라키렌, 알리스키렌, RO 66-1132 및 RO-66-1168과 같은 레닌 억제제; 아세부톨롤, 아테놀롤, 베탁솔롤, 비소프롤롤, 메토프롤롤, 나돌롤, 프로프라놀롤, 소탈롤 및 티몰롤과 같은 β-아드레날린 수용체 차단제; 디곡신, 도부타민 및 밀리논과 같은 수축 촉진제; 암로디핀, 베프리딜, 딜티아젬, 펠로디핀, 니카르디핀, 니모디핀, 니페디핀, 니솔디핀 및 베라파밀과 같은 칼슘 채널 차단제; 알도스테론 수용체 길항제; 및 알도스테론 합성효소 억제제일 수 있다.
퍼옥시좀 증식제-활성화제 수용체의 작용제는 예를 들어 페노피브레이트, 피오글리타존, 로시글리타존, 테사글리타자, BMS-298585, L-796449, 특허 출원 WO 2004/103995에 구체적으로 기재된 화합물, 즉 실시예 1 내지 35의 화합물 또는 구체적으로 청구항 21에 열거된 화합물, 또는 특허 출원 WO 03/043985에 구체적으로 기재된 화합물, 즉 실시예 1 내지 7의 화합물 또는 청구항 19에 구체적으로 열거된 화합물, 및 특히 (R)-1-{4-[5-메틸-2-(4-트리플루오로메틸-페닐)-옥사졸-4-일메톡시]-벤젠술포닐}-2,3-디히드로-1H-인돌-2-카르복실산 또는 이의 염일 수 있다.
다른 관심 약물은 예를 들어 세니크리비록, 심투주맙, 셀론서팁, 엠리카산일 수 있다. 특정 실시양태에서, 펩타이드와 조합하여 사용되는 하나 이상의 추가 활성 약물은 GLP-1 유사체, 예컨대 리라글루티드, 오베티콜산, 글리플로진, 심투주맙(GS 6624), 세니크리비록, 아람콜, 갈렉틴 3 억제제, 예를 들어 GR-MD-02, TGR5 작용제 및 이중 FXR/TGR5 작용제, 예컨대 INT-777 또는 INT-767, 및 엠리카산 중에서 선택될 수 있다.
항염증제는 살리실산, 다양한 형태의 이부프로펜 및 다양한 형태의 나프록센을 포함하는 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 코르티코스테로이드와 같은 스테로이드성 항염증제, 항염증성 항-TNF 알파 항체 및 이들의 조합과 같이 당업자에게 알려진 임의의 약물일 수 있다.
약학적 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 요법은 자연적으로 치료할 상태, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 따라 다르다.
본 개시내용의 약학적 또는 치료 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 안내 투여 등을 위해 제제화될 수 있다.
본 개시내용의 약학적 조성물에 사용되는 펩타이드는 치료적 유효량으로 존재한다.
펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 당업자에게 알려진 표준 약학 관행(Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and JC Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York)에 따라 제제화된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 펩타이드 또는 이의 염을 포함하는 본 개시내용에 따른 약학적 조성물의 안정한 비경구 주사용 제제를 제공하며, 여기서 펩타이드는 건조된 다음에 사용 전에 용매 중에서 재구성된다. 펩타이드(또는, 제제가 2개 이상의 펩타이드를 포함하는 실시양태에서, 각각의 펩타이드)는 비휘발성 완충제와 혼합되고 건조 펩타이드 분말로 건조된다. 적합한 완충제는 글리신 완충제, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 하나의 실시양태에서, 완충제는 글리신 완충제이다. 또 다른 실시양태에서, 완충제는 시트레이트 완충제 및 포스페이트 완충제의 혼합물이다. 제제가 2개 이상의 펩타이드를 포함하는 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 완충액은 동일하다. 제제가 2개 이상의 펩타이드를 포함하는 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 완충액은 상이하다. 대안적으로, 본 개시내용에 따른 약학적 조성물은 수성 상태로 저장될 수 있다. 용액은 원하는 경우 유효 성분과 양립할 수 있는 추가 첨가제 또는 부형제를 포함할 수 있으며 동결 건조 단계에서 제거되지 않는 경우 이들은 투여 경로에도 적합해야 한다. 비경구 투여의 경우, 조성물은 피내, 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주사될 수 있다. 바람직하게, 조성물 또는 펩타이드는 특히 지방 조직에 피하 주사되거나 주사될 것이다.
바람직하게는 미니-삼투압 펌프 또는 신체에 이식된 다른 제어된 전달 장치와 함께 배치될 수 있다. 바람직하게, 다른 화합물과 혼합하여 데포 서방성 제제를 만들 수 있다. 바람직한 투여 경로는 예를 들어 인슐린 펜과 유사한 일회용 또는 다중 단위 분배 장치를 사용하여 피하 주사하는 것이다. 펩타이드는 또한 비침습적 시스템인 바늘 없이 피하 투여를 허용하는 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 펩타이드는 사용 가능한 모든 약물 전달 시스템을 사용하여 투여할 수 있다. 특히, 적절한 공동-투여 요법을 위한 피하 약물 전달을 가능하게 하고 최적화하기 위한 재조합 인간 히알루로니다제 효소, rHuPH20의 사용이 고려된다.
이 기술을 통해 정맥 내 투여되는 일부 생물학적 제제 및 화합물은 대신 피하 또는 피부 아래로 전달되어 잠재적으로 환자에게 더 나은 경험을 제공하고 투여 시간, 주사 통증 및 주입 부위 반응을 줄여 보건 시스템 효율성을 높일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용의 펩타이드는 데포 서방성 제제를 제조하기 위해 다른 화합물과 혼합될 수 있다. 다음에 펩타이드는 서방형 데포를 형성하기 위해 피하 주사될 수 있다.
경구 투여의 경우, 조성물은 정제, 캡슐제, 분말제, 과립제, 및 액체 제제, 예컨대 시럽, 엘릭시르 및 농축 점적제와 같은 통상적인 경구 투여 형태로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 포도당, 수크로스, 마그네슘, 탄산염 등을 포함하는 무독성 고체 담체 또는 희석제가 사용될 수 있다. 압축 정제의 경우 분말 재료에 응집성을 부여하는 제제인 바인더도 필요하다. 예를 들어, 전분, 젤라틴, 유당 또는 포도당과 같은 설탕, 천연 또는 합성 검을 결합제로 사용할 수 있다. 또한 정제의 분해를 촉진하기 위해 정제에는 붕해제가 필요하다. 붕해제에는 전분, 점토, 셀룰로오스, 알긴, 검 및 가교 중합체가 포함된다. 또한 정제에 윤활제 및 활택제를 넣어서 제조 공정에서 정제 물질이 표면에 부착되는 것을 방지하고, 제조시 분말 물질의 유동 특성을 향상시킨다. 콜로이드성 이산화규소는 활주제로 가장 일반적으로 사용되며 활석 또는 스테아르산과 같은 화합물은 윤활제로 가장 일반적으로 사용된다.
경피 투여를 위해, 조성물은 연고, 크림 또는 겔 형태로 제제화될 수 있고, 디메틸 설폭사이드, 디메틸 아세트아미드 및 디메틸포름아미드와 같은 적절한 침투제 또는 세제를 사용하여 침투를 촉진시킬 수 있다.
경점막 투여의 경우 비강 스프레이, 폐내 흡입, 직장 또는 질 좌약을 사용할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 당업계에 공지된 방법에 따라 폐내 약물 전달 장치를 사용하여 투여되는 건조 분말 또는 액체 제제를 사용하여 폐내 경로에 의해 투여될 수 있다. 활성 화합물은 당업계에 공지된 방법에 의해 공지된 좌약 기제 중 임의의 것에 혼입될 수 있다. 이러한 염기의 예로는 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜(카보왁스), 폴리에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 및 융점 또는 용해 속도를 변경시키기 위한 다른 호환 가능한 물질과 이들의 혼합물이 있다.
본 개시내용에 따른 약학적 조성물은 투여 즉시 또는 투여 후 임의의 미리 결정된 시간 또는 기간에 실질적으로 활성 약물을 방출하도록 제제화될 수 있다.
본 개시내용에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 담체와 관련된 본 개시내용의 하나 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다. 이들 부형제 및/또는 담체는 상기 기재된 바와 같은 투여 형태에 따라 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 약학적 조성물은 0.01 ng 내지 10 g의 본 개시내용의 펩타이드를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 약학적 조성물은 0.1 ng 내지 1 g의 본 개시내용의 펩타이드를 포함한다.
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비록 상이한 의미를 가지지만, 용어 "포함하는", "갖는", "구성되는" 및 "함유하는"은 전체 명세서에서 서로 대체될 수 있다.
본 개시내용의 추가 양태 및 이점은 하기 실시예에서 설명될 것이며, 이는 예시적이며 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
실시예
실시예 1: 1차 인간 성숙 지방세포에서 포도당 흡수에 대한 ADPIF/PATAS 펩티드의 효과
인간 1차 지방 전구 세포를 96-웰 플레이트에서 배양하고, 성숙한 인간 지방 세포로 분화시켰다. 지방 생성 3주 배양 후, 지방 세포를 인슐린이 없는 배양 배지에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이러한 2시간의 인슐린 금식 후, 배지는 사용된 포도당 유사체인 2-DG와 함께 30분 동안 인슐린이 없는 배지(-INS) 또는 인슐린이 있는 배지(+INS) 또는 ADPIF가 있는 배지(PATAS)로 다시 교체하여, Abcam 키트로 포도당 흡수를 확인하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 조건 당 8개의 웰에서 포도당 흡수를 측정하고, 도 1에 표시된 오차 막대에 대한 평균의 표준 오차로 히스토그램에 플로팅된 평균을 계산했다.
실시예 2: ADPIF/PATAS 펩타이드는 고혈당증 예방에 있어서 PATAD 펩타이드보다 더 활성을 나타냄
마우스에 스크램블 펩타이드 또는 PATAD 또는 ADPIF/PATAS의 단일 용량(마우스 당 25 마이크로그램)을 주사했다. DIO 포도당 불내성 수컷 마우스에서 일련의 포도당 내성 테스트(ipGTT)에서 얻은 결과이다(도 2a 및 b).
실시예 3: ADPIF/PATAS 펩타이드는 용량 반응 효과로 인간 지방 세포에서 PKC 키나아제 활성을 증가시킴
도 3에서 나타낸 것과 같이, 인슐린과 비교하여 웰 당 25 ㎍의 PATAS에서 유사한 수준의 PKC 활성에 도달하기 위해 ADPIF/PATAS 양이 증가함에 따라 PKC 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있다.
PKC 알파로부터의 다른 두 펩타이드, 즉 ECTMVEKKVLALL 및 SVEWWAYGLLYEMLA도 PKC 키나아제 활성에 대한 이들 효과에 대해 테스트하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 두 펩타이드 모두 인간 지방 세포에서 PKC 키나아제 활성을 증가시킬 수 있다. 또한 FATP1-6의 발현에 대한 두 개의 펩타이드가 확인되었으며, 두 펩타이드 모두 지방 세포에서 FATP2의 발현을 감소시킨다(도 2).
실시예 4: 확립된 당뇨병 마우스 모델(d b/db ; BKS 수컷 마우스)에서의 ADPIF/PATAS 펩타이드의 효과
도 6a에 나타낸 바와 같이, ADPIF/PATAS 펩타이드는 고혈당증을 예방할 수 있다.
또한, 지방 세포에서 FATP1-6의 발현에 대한 ADPIF/PATAS 펩타이드의 효과를 이 모델에서 결정하였다. ADPIF/PATAS 펩타이드는 FATP2의 발현을 감소시킬 수 있다(도 6b).
PATAS/ADPIF의 활성은 BKS 유전적 배경, 당뇨병 마우스 모델에서 db/db로 테스트하였다. 식이 요법 6주령 쥐에게 식염수 피하 주사 또는 2 mg/kg(체중)의 PATAS 주사를 맞았고 4일 후 ipGTT는 PATAS/ADPIF 투여에 대한 반응으로 포도당 불내성의 상당한 개선을 보여주었다(도 6a). 쥐에게 PATAS/ADPIF 또는 비히클을 추가로 3주 동안 매주 주사한 후 지속적으로 모니터링하면서 치료 없이 4주 더 투여했다. 그런 다음 db/db 마우스를 안락사시키고, 지방 조직에서 지방산 수송 단백질 아이소폼(Fatps) 발현 수준을 측정하여 대조군 마우스와 비교하여 PATAS 처리된 마우스(도 6b)에 대한 Fatp2 발현 수준이 특이적이고 상당히 감소한 것을 보여주었다.
실시예 5: 바르데 비들 증후군(BBS) 모델에서의 ADPIF/PATAS 펩타이드의 효과
BBS10 유전자(Bbs10 -/- )에 대한 녹아웃 마우스 모델을 생성하고, 문헌에 기재된 바와 같이 자발적으로 비만이 되도록 하였다.
생후 4개월에 우리는 PATAS/ADPIF를 투여하기 전에 Bbs10 -/- 에 대해 복강 내 포도당 내성 테스트(ipGTT)를 수행했으며, Bbs10 -/- 마우스가 약 30000 mg/dL.min의 곡선 아래 해당 면적(AUC)으로 포도당 내성이 있음을 발견했다(도 7). 동일한 마우스에 피하 지방 조직으로 체중 kg당 2 mg의 PATAS를 넣고 3일 후 ipGTT를 수행했으며, Bbs10 -/- 마우스가 약 16000mg/dL.min까지 AUC가 감소한 것에 해당하는 개선된 포도당 내성이 나타난 것을 발견했다(도 7).
실시예 6: ADPIF/PATAS는 마우스 당 25 ㎍의 ADPIF/PATAS를 5주 동안 매주 주입한 후 STAMt 마우스 모델에서 당화 알부민을 감소시키는 데 효과적임
당화 알부민은 생체 내에서 고혈당증의 증세를 결정하는 잘 알려진 강력한 파라미터이다. 따라서 우리는 식염수를 주사한 대조군과 비교하여 각각 25 ㎍씩 매주 ADPIF/PATAS 주사로 5주 동안 치료한 STAMT 마우스의 혈장을 사용했다. ADPIF/PATAS 처리된 마우스에서 당화 알부민이 크게 감소한 것이 확인되었으며, 이는 ADPIF/PATAS가 고혈당증을 개선시킬 수 있음을 나타낸다(도 8).
재료 및 방법
펩타이드 서열, 합성 및 용액 제조
PATAD 스테이플링된 펩타이드 서열: VE CTM-[2-(4-펜테닐)알라닌]-EK RVL A-[2-(4-펜테닐)알라닌]-L DKP PFL TQL HS(서열 번호: 49)
ADPIF/PATAS 스테이플링된 펩타이드 서열: VECTT R EKEVLA S LDKAAFLTQLHS(서열 번호: 32)
여기서, R 및 S 는 스테이플링이 있으며, 바람직하게는 각각 2-(7-옥테닐)아르기닌 및 2-(4-펜테닐)세린이다.
스테이플링을 갖는 M 및 A 가 있는 ECT M VEKKVL A LL(서열 번호: 50)
스테이플링을 갖는 A 및 M 이 있는 SVEWW A YGLLYEMLA(서열 번호: 51)
95% 순도의 스테이플링된 펩타이드를 사용하였다.
모든 펩타이드는 멸균 식염수에 용해시키고 희석하였다.
인간 성숙 지방 세포에서의 포도당 흡수 분석
인간 백색 내장 지방 전구 세포(카탈로그 번호: C-12732; PromoCell)를 구입했다. 지방 전구 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 접종하고, 지방 전구 세포 성장 배지(카탈로그 번호: C-27410; PromoCell)에서 컨플루언스하게 배양하였다. 배지를 지방 전구 세포 분화 배지(카탈로그 번호: C-27436; PromoCell)로 2일간 교환하여 지방 분화를 유도하였다. 분화 단계 후, 마지막으로 배지를 지방 세포 영양 배지( 카탈로그 번호: C-27438; PromoCell)로 변경하였다. 인슐린이 없는 배양의 경우, 인슐린이 없는 지방 세포 기저 배지(카탈로그 번호: C-2431; PromoCell)에 5 g/L의 데옥시포도당, 8 ㎍/mL의 d-비오틴, 400 ng/mL의 덱사메타손을 보충했다. 지방생성 분화 3주 후, 배양된 성숙한 지방 세포를 인슐린 없이 2시간 동안 배양하였다. 이 2시간 후, 배양 배지는 총 최종 부피 200 μL 중 10 ㎍/μL 농도에서 인슐린이 없는(-INS), 인슐린이 있는(+INS) 또는 인슐린 + 시험 펩타이드 2.5 μL가 없는 포도당 유사체(2-DG)를 포함하는 새로운 배양 배지로 교체하였다. 30분 인큐베이션 후, 세포를 Abcam에서 구입가능한 포도당 흡수 분석 키트의 표준 프로토콜에 표시된 대로 처리하였다: 포도당 흡수 분석 키트(Colorimetric)(카탈로그 번호: ab136955).
PKC 키나아제 활성 테스트를 위해, 우리는 96-웰 또는 6-웰 플레이트 형식(카탈로그 번호: OA-1096-3 또는 OA-1006-3)으로 Zenbio에서 구입한 망막 지방 조직에서 유래한 성숙한 1차 인간 지방 조직을 사용할 준비가 되어 사용하였다. PKC 키나아제 활성 분석 키트(카탈로그 번호: 139437) 및 절차는 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다.
생체 내 마우스 연구
명백한 제2형 당뇨병 마우스가 있는 비만 마우스 모델의 경우 BKS (D)-Leprdb/J, 재고 번호: 010803을 Jax Labs에서 구입하였다. Bbs10 녹아웃 마우스는 Strasbourg의 ICS(Institute Mouse Clinic)에서 만들었으며, 이전에 문헌에 설명되어 있다.
모든 마우스는 C57/BL6 유전적 배경 상에 있다. 모든 동물은 12h-조명/12h-암 주기로 온도 및 습도 제어 시설에 수용하였다. BKS(D)-Leprdb/J 마우스에는 식이 요법(LM-485; Harlan Teklad Premier Laboratory Diets)이 제공된 반면 Bbs 녹아웃 마우스에는 고지방/포도당 식이와 수돗물을 무제한으로 제공하였다. ipGTT 및 ipITT의 경우 실험 시작 전 6시간 동안 마우스를 금식시켰다. 인슐린 0.75 U/kg을 꼬리 정맥을 통해 정맥 내 주사하였다. 꼬리에서 혈당과 샘플을 수집하였다. 마우스는 경추 탈구로 희생시켰다.
비만이 아닌 STAM 마우스 모델 연구를 위해 Japan SLC, Inc.(일본)에서 C57BL/6 마우스(14일 임신한 암컷)를 구입하였다. 연구에 사용된 모든 동물은 일본 약리학회 동물 사용 지침에 따라 수용 및 관리하였다. 동물은 SPF 시설에서 온도(23 ± 2℃), 습도(45 ± 10%), 조명(12시간 인공 조명 및 암 주기, 조명 8:00 ~ 20:00) 및 공기 교환의 제어된 조건에서 유지하였다. 동물은 케이지 당 최대 3마리의 마우스가 있는 TPX 케이지(CLEA Japan)에 수용하였다. 침구에는 멸균 페이퍼 클린(Japan SLC)을 사용하고 일주일에 한 번 교체하였다. 멸균된 고체 60% HFD를 케이지 상단의 금속 뚜껑에 두어 무제한으로 제공하였다. 순수한 물은 고무 마개와 시퍼 튜브(sipper tube)가 장착된 물병에서 무제한으로 제공하였다. 물병은 일주일에 한 번 교체하고 세척하고 오토클레이브에서 멸균하여 재사용하였다.
마우스는 이어 펀치로 식별하였다. 각 케이지는 특정 식별 코드로 라벨링하였다.
NASH는 출생 2일 후 200 ㎍의 스트렙토조토신(STZ, Sigma-Aldrich, USA) 용액을 단일 피하 주사하고, 생후 4주 이후 고지방식(HFD, 57 kcal% 지방, Cat# HFD32, CLEA Japan , Inc., 일본)을 제공하였다.
BKS(D)-Leprdb/J, 재고 번호: 010803 및 Bbs10 녹아웃 마우스에 대한 펩타이드의 투여 요법
0일째: 모든 마우스를 아침에 4시간 동안 금식시켰다. 오후 1시에 대조군 마우스에게 22% 포도당 용액(후복막 지방/피하 주사)을 (체중(g)) × 10 밀리리터를 1회 주사하였다. 처리된 마우스에 22% 포도당 용액 (체중(g)) × 10에 용해된 시험된 펩타이드 25 ㎍(모 용액 2.5 μL)을 주사하였다. 30분 간격으로 꼬리 정맥 혈액에서 혈당 수준을 측정하고 다양한 처리 효과를 측정하기 위해 곡선 아래 면적에 대하여 플로팅하였다.
STAM 마우스 모델에 대한 펩타이드의 투여량 요법.
시험된 펩타이드는 상기에서 기재한 것과 같이 ADPIF/PATAS 펩타이드였다.
약물 투여 경로
펩타이드를 마우스 당 100 mL의 부피로 지방 조직에 피하 투여하였다.
실험 설계 및 처리
연구 그룹
그룹 1: ADPIF/PATAS 펩타이드
6마리의 NASH 마우스를 4주에서 9주령까지 매주 1회 마우스 당 25 mg의 용량으로 ADPIF/PATAS 펩타이드가 보충된 비히클을 투여 지방 조직에 피하 투여하였다.
그룹 2: 비히클
6마리의 NASH 마우스에 4주에서 9주령까지 매주 1회 마우스 당 100 mL의 부피의 지방 조직 투여 비히클[식염수 중 DMSO]을 피하 투여하였다.
하기 표는 처리 일정을 요약한 것이다:
Figure pct00001
FATP 발현 수준
RiboPure™ 키트(카탈로그 번호: AM1924; Ambion)를 사용하여 다른 조직 및 세포로부터 총 RNA를 준비한 후, TURBO DNA-free™(카탈로그 번호: AM 1907; Ambion)를 사용하여 DNAse 처리를 수행하였다. RNA 무결성은 Eppendorf Biophotometer Plus와 Hellma® Tray Cell(카탈로그 번호: 105.810-uvs; Hellma)을 사용하여 겔 전기영동 및 RNA 농도로 평가하였다. BioRadiScript™ cDNA 합성 키트(카탈로그 번호: 170-8891; BioRad)를 사용하여 1 ㎍ 총 RNA의 cDNA로의 역전사를 수행하였다. 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응 증폭은 iQTM SYBR® Green Supermix(카탈로그 번호: 170-8886; BioRAd)를 사용하여 BioRad CFX96 TM Real-Time System으로 수행하였으며, Real-time PCR을 위한 SYBR Green 기반 실시간 PCR을 위해 테스트 대상에 최적화된 프라이머 세트를 사용하였다. 인간 프라이머의 경우 사용된 모든 qPCR 프라이머는 Biorad 인증 MIQE 프라이머 세트에서 구입하였다.
Figure pct00002
혈장 생화학 측정
샘플 수집
혈장 샘플을 수집하고 분석을 위해 -80℃에 보관하였다. 이후 이 마우스의 혈장을 사용하여 LS Bio에서 상업적으로 이용 가능한 Mouse Glycated Albumin ELISA Kit(Sandwich ELISA) - LS-F28697(Strasbourg 소재)를 사용하여 당화 알부민 수준을 측정하였다.
통계 테스트
GraphPad Prism 6(GraphPad Software Inc., USA)에 대한 Student's t-test를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 단측 t- 검정이 P 값 < 0.1로 돌아오면 추세 또는 경향을 가정하였다. 결과는 평균 ± SD로 표시하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Universit?de Strasbourg et al <120> PEPTIDES FOR TREATMENT AND PREVENTION OF DIABETES AND ASSOCIATED DISORDERS <130> B2918PC <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 672 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Asp Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Thr Ala Ser Gln Asp Val 1 5 10 15 Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln Lys Asn Val His 20 25 30 Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala Arg Phe Phe Lys Gln Pro Thr 35 40 45 Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile Trp Gly Phe Gly Lys Gln Gly 50 55 60 Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val Val His Lys Arg Cys His Glu 65 70 75 80 Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp 85 90 95 Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro 100 105 110 Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His Gln 115 120 125 Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met Asn Val His Lys Gln Cys Val 130 135 140 Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met Asp His Thr Glu Lys Arg Gly 145 150 155 160 Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Ala Asp Glu Lys Leu His Val Thr 165 170 175 Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser 180 185 190 Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser 195 200 205 Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser Thr Leu Asn Pro Gln Trp Asn 210 215 220 Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu 225 230 235 240 Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met 245 250 255 Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu Leu Met Lys Met Pro Ala Ser 260 265 270 Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val 275 280 285 Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Glu Gly Asn Met Glu Leu Arg Gln Lys 290 295 300 Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro 305 310 315 320 Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu 325 330 335 Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys 340 345 350 Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr 370 375 380 Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys Pro Pro Phe Leu 385 390 395 400 Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val 405 410 415 Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Gln Val 420 425 430 Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser 435 440 445 Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu 450 455 460 Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala 465 470 475 480 Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg 485 490 495 Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr 500 505 510 Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu 515 520 525 Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp 530 535 540 Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser 545 550 555 560 Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Val Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His 565 570 575 Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg 580 585 590 Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg 595 600 605 Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu 610 615 620 Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly Gln Pro Val Leu Thr Pro Pro 625 630 635 640 Asp Gln Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp Gln Ser Asp Phe Glu Gly Phe 645 650 655 Ser Tyr Val Asn Pro Gln Phe Val His Pro Ile Leu Gln Ser Ala Val 660 665 670 <210> 2 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Met 1 5 10 15 Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys Ile Leu 20 25 30 Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr Met Val 35 40 45 Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys Pro Pro Phe Leu Thr Gln 50 55 60 Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val Met Glu 65 70 75 80 Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Gln Val Gly Lys 85 90 95 Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser Ile Gly 100 105 110 Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Leu 115 120 125 Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala Asp Phe 130 135 140 Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg Thr Phe 145 150 155 160 Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr Gln Pro 165 170 175 Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu Tyr Glu 180 185 190 Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp Glu Leu 195 200 205 Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Lys Glu Ala Val Ser Val Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His Pro Ala 225 230 235 240 Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg Glu His 245 250 255 Ala <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> segment of kinase domain of alphaPKC <400> 3 Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> segment of kinase domain of alphaPKC <400> 4 Leu Met Tyr His Ile Gln Gln Val 1 5 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> segment of kinase domain of alphaPKC <400> 5 Pro Glu Ile Ile 1 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> segment of kinase domain of alphaPKC <400> 6 Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ala 1 5 10 15 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> segment of kinase domain of alphaPKC <400> 7 Glu Asp Glu Asp Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> segment of kinase domain of alphaPKC <400> 8 Gly Glu Arg Asp Val Arg Glu 1 5 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid except R, M and P <400> 9 Val Glu Cys Thr Xaa Val Glu Lys Arg Val Leu Ala 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 10 Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Xaa Val Leu Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 11 Val Glu Cys Thr Xaa Val Glu Lys Xaa Val Leu Ala 1 5 10 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 12 Leu Xaa Tyr His Ile Gln Gln Val 1 5 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 13 Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu Tyr Glu Xaa Leu Ala 1 5 10 15 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 14 Glu Asp Glu Asp Glu Leu Phe Gln Ser Ile Xaa Glu 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 15 Gly Glu Xaa Asp Val Arg Glu 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 16 Gly Glu Arg Asp Val Xaa Glu 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 17 Gly Glu Xaa Asp Val Xaa Glu 1 5 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 18 Xaa Glu Ile Ile 1 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <400> 19 Val Glu Cys Thr Thr Val Glu Lys Glu Val Leu Ala 1 5 10 <210> 20 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(18) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 20 Val Glu Cys Thr Xaa Val Glu Lys Xaa Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys 1 5 10 15 Xaa Xaa Phe Leu Thr Gln Leu His Ser 20 25 <210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(18) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 21 Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys 1 5 10 15 Xaa Xaa Phe Leu Thr Gln Leu His Ser 20 25 <210> 22 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 22 Val Glu Cys Thr Xaa Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys 1 5 10 15 Pro Pro Phe Leu Thr Gln Leu His Ser 20 25 <210> 23 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 23 Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Xaa Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys 1 5 10 15 Pro Pro Phe Leu Thr Gln Leu His Ser 20 25 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <400> 24 Val Glu Cys Thr Met Xaa Glu Lys Arg Val Leu Ala Xaa 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <400> 25 Val Glu Cys Thr Xaa Xaa Glu Lys Arg Val Leu Ala Xaa 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <400> 26 Val Glu Cys Thr Met Xaa Glu Lys Xaa Val Leu Ala Xaa 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <400> 27 Val Glu Cys Thr Xaa Xaa Glu Lys Xaa Val Leu Ala Xaa 1 5 10 <210> 28 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(18) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 28 Val Glu Cys Thr Xaa Xaa Glu Lys Xaa Val Leu Ala Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Xaa Xaa Phe Leu Thr Gln Leu His Ser 20 25 <210> 29 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(18) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 29 Val Glu Cys Thr Met Xaa Glu Lys Arg Val Leu Ala Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Xaa Xaa Phe Leu Thr Gln Leu His Ser 20 25 <210> 30 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <400> 30 Val Glu Cys Thr Xaa Xaa Glu Lys Arg Val Leu Ala Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Pro Pro Phe Leu Thr Gln Leu His Ser 20 25 <210> 31 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <400> 31 Val Glu Cys Thr Met Xaa Glu Lys Xaa Val Leu Ala Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Pro Pro Phe Leu Thr Gln Leu His Ser 20 25 <210> 32 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <400> 32 Val Glu Cys Thr Thr Arg Glu Lys Glu Val Leu Ala Ser Leu Asp Lys 1 5 10 15 Ala Ala Phe Leu Thr Gln Leu His Ser 20 25 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> protein transduction domain <400> 33 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> protein transduction domain <400> 34 Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro 1 5 10 15 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> penetratin peptide <400> 35 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> HIV-tat <400> 36 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 37 tgctttggtt tctgggactt 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 38 gctctagccg aacacgaatc 20 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 39 tggacaaagt agacggagtg tc 22 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 40 tagcaaggcc tgtcccatac 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 41 tgagaacttg ccaccgtatg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 42 ggcaggtagg cccctatatc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 43 gtttcatccg ggtcttcatc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 44 gtgtctgtgc cctcgaaaat 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 45 aagttctctg cctcccgatt 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 46 caaagcgttg ctggaagttt 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 47 tcgattccct cctacactgc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 48 ttggtggtac tggctcatca 20 <210> 49 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> PATAD <400> 49 Val Glu Cys Thr Met Ala Glu Lys Arg Val Leu Ala Ala Leu Asp Lys 1 5 10 15 Pro Pro Phe Leu Thr Gln Leu His Ser 20 25 <210> 50 <211> 13 <212> PRT <213> artificial <220> <223> segment of kinase domain of alphaPKC <400> 50 Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Lys Val Leu Ala Leu Leu 1 5 10 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <400> 51 Ser Val Glu Trp Trp Ala Tyr Gly Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ala 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid except M, P and R <400> 52 Ser Val Xaa Trp Trp Ala Tyr Gly Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ala 1 5 10 15 <210> 53 <211> 24 <212> PRT <213> artificial <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <400> 53 Val Glu Cys Thr Thr Xaa Glu Lys Glu Val Leu Ala Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Ala Ala Phe Leu Thr Gln His Ser 20 <210> 54 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <400> 54 Val Glu Cys Thr Thr Xaa Glu Lys Glu Val Leu Ala Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Ala Ala Phe <210> 55 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <400> 55 Val Glu Gly Thr Thr Xaa Glu Lys Glu Val Leu Ala Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Ala Ala Phe <210> 56 <211> 13 <212> PRT <213> artificial <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <400> 56 Glu Cys Thr Thr Xaa Glu Lys Glu Val Leu Ala Xaa Leu 1 5 10 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> artificial <220> <223> mutated segment of kinase domain of alphaPKC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is any amino acid derivative suitable for stapling <400> 57 Glu Cys Thr Met Xaa Glu Lys Lys Val Leu Ala Xaa Leu 1 5 10

Claims (16)

  1. 당뇨병 및 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 펩타이드로서,
    상기 당뇨병 및 관련 질환은 I형 당뇨병, II형 당뇨병, 인슐린 저항성, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신장증, 고혈당증, 비만, 고인슐린혈증 및 바르데 비들(Bardet Biedl) 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    - 상기 펩타이드는 지방 조직에서 FATP2 발현을 감소시킬 수 있으며;
    - 상기 펩타이드는 하나의 메티오닌, 하나의 프롤린 및 하나의 아르기닌을 동시에 포함하지 않으며;
    - 상기 펩타이드는 나선, 바람직하게는 알파 나선인 이차 구조를 채택하며;
    - 상기 펩타이드는 αPKC(알파 단백질 키나아제 C)의 키나아제 도메인의 적어도 5개의 연속 잔기를 포함하며;
    - 상기 펩타이드는 5 내지 60개 아미노산 길이를 가지며;
    - 상기 펩타이드 서열은 상기 PKC의 키나아제 도메인의 분절의 상기 서열 내에서 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이의 혼합으로부터 선택된 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 포함할 수 있는, 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 화학적 가교결합으로 변형되는, 펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 펩타이드는 적어도 5개 아미노산 및 40개 미만의 아미노산의 길이, 바람직하게는 적어도 5개 아미노산 및 30개 미만의 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 적어도 5개 아미노산 및 25개 미만의 아미노산의 길이를 갖는, 펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 ALMS1과 αPKC 사이의 상호 작용을 감소시키거나 예방할 수 있는, 펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드 서열은 하기 서열 중 하나를 포함하는, 펩타이드:
    치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 VECTXVEKRVLA(서열 번호: 9); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 VECTMVEKXVLA(서열 번호: 10); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 VECTXVEKXVLA(서열 번호: 11); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 3개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 LMYHIQQV(서열 번호: 4); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 3개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 LXYHIQQV(서열 번호: 12); LDN; 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 SVDWWAYGVLLYEMLA(서열 번호: 6); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 SVDWWAYGVLLYEXLA(서열 번호: 13); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 SVXWWAYGLLYEMLA(서열 번호: 52); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 EDEDELFQSIME(서열 번호: 7); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 EDEDELFQSIXE(서열 번호: 14); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 3개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 GERDVRE(서열 번호: 8); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 3개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 GEXDVRE(서열 번호: 15); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 3개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 GERDVXE(서열 번호: 16); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 3개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 GEXDVXE(서열 번호: 17); LDN; AFF; PDY; XDY; PEII(서열 번호: 5); XEII(서열 번호: 18); PAK; XAK; 여기서, X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산임.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 펩타이드 서열은 하기 서열 중 하나를 포함하는, 펩타이드:
    치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 VECTXVEKRVLA(서열 번호: 9); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 VECTMVEKXVLA(서열 번호: 10); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 VECTXVEKXVLA(서열 번호: 11); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 SVDWWAYGVLLYEMLA(서열 번호: 6); 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 SVDWWAYGVLLYEXLA(서열 번호: 13); 또는 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 SVXWWAYGLLYEMLA(서열 번호: 52), 여기서, X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산임.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드 서열은 하기 서열 중 하나를 포함하는, 펩타이드:
    VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3); VECTXVEKRVLA(서열 번호: 9); VECTMVEKXVLA(서열 번호: 10); VECTXVEKXVLA(서열 번호: 11); LMYHIQQV(서열 번호: 4); LXYHIQQV(서열 번호: 12); SVDWWAYGVLLYEMLA(서열 번호: 6); SVDWWAYGVLLYEXLA(서열 번호: 13); EDEDELFQSIME(서열 번호: 7); EDEDELFQSIXE(서열 번호: 14); GERDVRE(서열 번호: 8); GEXDVRE(서열 번호: 15); GERDVXE(서열 번호: 16); GEXDVXE(서열 번호: 17); 여기서, X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산임.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 펩타이드 서열은 하기 서열 중 하나를 포함하는, 펩타이드:
    VECTMVEKRVLA(서열 번호: 3); VECTXVEKRVLA(서열 번호: 9); VECTMVEKXVLA(서열 번호: 10); VECTXVEKXVLA(서열 번호: 11); SVDWWAYGVLLYEMLA(서열 번호: 6); SVDWWAYGVLLYEXLA(서열 번호: 13); 또는 SVXWWAYGLLYEMLA(서열 번호: 52), 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산임.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드 서열은 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 이로 구성되는, 펩타이드:
    a) 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 VECTXVEKXVLALLDKXXFLTQLHS(서열 번호: 20), 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산;
    b) 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 VECTMVEKRVLALLDKXXFLTQLHS(서열 번호: 21), 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산;
    c) 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 VECTXVEKRVLALLDKPPFLTQLHS(서열 번호: 22), 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산;
    d) 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 변형(들)을 선택적으로 포함하는 VECTMVEKXVLALLDKPPFLTQLHS(서열 번호: 23), 여기서 X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산; 및
    e) 임의의 서열 a) 내지 d)의 적어도 5 내지 25개의 연속 잔기의 임의의 분절 서열을 포함하는 펩타이드.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드 서열은 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하거나, 기본적으로 이로 구성되거나, 이로 구성되는, 펩타이드:
    VECTM X EKRVLA X (서열 번호: 24)
    VECTX X EKRVLA X (서열 번호: 25)
    VECTM X EKXVLA X (서열 번호: 26)
    VECTX X EKXVLA X (서열 번호: 27)
    VECTX X EKXVLA X LDKXXFLTQLHS(서열 번호: 28)
    VECTM X EKRVLA X LDKXXFLTQLHS(서열 번호: 29)
    VECTX X EKRVLA X LDKPPFLTQLHS(서열 번호: 30)
    VECTM X EKXVLA X LDKPPFLTQLHS(서열 번호: 31)
    VECTT X EKEVLA X LDKAAFLTQHS(서열 번호: 53)
    VECTT X EKEVLA X LDKAAF(서열 번호: 54)
    VEGTT X EKEVLA X LDKAAF(서열 번호: 55) 및
    ECTT X EKEVLA X L(서열 번호: 56)
    ECTM X EKKVLA X L(서열 번호: 57)
    여기서, 굵고 밑줄이 그어진 X 잔기는 스테이플링을 갖고 스테이플링에 적합한 임의의 아미노산 유도체이며; 그리고
    여기서, X는 M, P 및 R을 제외한 임의의 아미노산이며,
    상기 서열은 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 변형(들)을 선택적으로 가짐.
  11. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    X는 α-나선 2차 구조에 유리한 아미노산, 또는 A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 또는 A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산인, 펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PKC는 서열 번호: 1의 αPKC 인, 펩타이드.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 첫 번째 굵고 밑줄이 그어진 X는 R이고, 상기 두 번째 굵고 밑줄이 그어진 X는 S이고, 상기 R 및 S 는 스테이플링을 갖는, 펩타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드 서열은 하기를 포함하는, 펩타이드:
    VECTT R EKEVLA S LDKAAFLTQLHS(서열 번호: 32)
    여기서, R 및 S 는 스테이플링을 갖고;
    여기서, 상기 펩타이드는 치환(들), 결실(들), 부가(들) 및 이들의 혼합으로부터 선택되는 아미노산의 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 변형(들)을 선택적으로 포함함.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    2-(7-옥테닐)아르기닌 및 2-(4-펜테닐)세린을 포함하는, 펩타이드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 하나 이상의 부가 활성화제, 바람직하게는 항당뇨병제, 고지혈증제, 항비만제, 항고혈압제, 항지방증제, 항염증제, 및 퍼옥시좀 증식제-활성화제 수용체의 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 부가 활성화제와 병용해서 사용되는, 펩타이드.
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