KR20210106496A - 컨쥬게이트 - Google Patents

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KR20210106496A
KR20210106496A KR1020217022384A KR20217022384A KR20210106496A KR 20210106496 A KR20210106496 A KR 20210106496A KR 1020217022384 A KR1020217022384 A KR 1020217022384A KR 20217022384 A KR20217022384 A KR 20217022384A KR 20210106496 A KR20210106496 A KR 20210106496A
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alkyl
hydrogen
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formula
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KR1020217022384A
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앨런 로슨 씨웰
에제키엘 실바 나이젠다
션 니얼 오브라이언
리카르도 로페즈-곤잘레즈
로돌포 마르케즈
Original Assignee
트랜스펙션 홀딩스 리미티드
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Abstract

본 발명은 화학식 (I)의 컨쥬게이트 및 치료 방법에 있어서의 그의 용도 및 활성 제제를 세포 내로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 활성 제제를 선충, 편충, 기생충 또는 세균에 전달하는데 이용될 수 있다. 화학식 (I)의 컨쥬게이트는 다음과 같다:
Figure pct00132

식 중 -D-는 C1-4 알킬렌 또는 C2-4 알케닐렌, 좋기로는 C2-4 알케닐렌이고, 여기서 알킬렌 또는 알케닐렌은 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 치환되며; A-는 전달을 위한 활성 제제이고; 및 -RA, -RB, -RT1, -RT2, -R1, -R2, -R3, -X- 및 -L-는 본문에 정의된 바와 같다.

Description

컨쥬게이트
관련 출원
이 출원은 2018년 12월 18일(18/12/2018)자로 출원된 GB 1820626.8에 기초한 우선권 주장 출원으로, 상기 출원의 내용은 그 전체가 본 발명에 참조 병합된다.
발명의 분야
본 발명은 활성 제제를 세포 또는 생명체 내로 전달하기 위한, 판토텐산 또는 그의 유도체와 활성 제제와의 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명은 또한 치료 방법에 사용되기 위한 상기 컨쥬게이트 및 상기 컨쥬게이트의 제조 방법도 제공한다.
기생충 질병의 치료 방법은 최근 숙주 체내의 기생충이 있는 위치로의 약물 전달 및 그에 이어 기생충 내로의 후속적인 그의 흡수(uptake)를 개선하는 기술에 초점이 맞추어져 왔다. 기생충 질병을 치료하기 위한 현행의 많은 방법들은 표적 위치에서 약물이 유익한 효과를 달성하는데 충분한 농도로 그리고 충분한 기간 동안 제공될 수 있도록 장기간 동안 고수준의 약물을 환자에게 투여하는 것에 의존하고 있다. 이러한 방식으로 약물을 투여할 경우 치료 과정에서 종종 심각한 부작용이 일어난다.
이러한 이유로 약물을 보다 적은 양으로 투여하면서도 유익한 치료 효과는 유지하게 해주는 약물 전달 전략을 제공할 필요가 있다. 이 분야의 최근 연구는 모든 태양의 약물 전달에 관해 이루어지고 있다. 그러한 연구 중 한 줄기는 감염된 숙주 내의 표적 위치로의 활성 제제의 수송을 향상시키는 것에 관한다. 예시적인 전략에는 약물 제형 및 투여 요법의 적응이 포함된다. 예컨대, 나노입자 또는 마이크로입자, 에멀젼 또는 리포좀 내로 항기생충제를 통합시키면 병원체에 대해 보다 표적화된 약물 전달이 제공될 수 있다(예컨대, Kayser 등 및 Date 등의 항기생충제의 전달 전략 리뷰 참조).
또 다른 연구 줄기는 기생충 자체 내로의 약물 전달, 및 특히 기생충의 세포막을 관통하여 약물을 수송하는 것에 초점이 맞춰져 왔다. 약물의 상대적인 세포막 통과 불능성으로 인해 많은 항생제 사용이 좌절되고 있다. 세포로의 약물 전달 문제점을 해결하기 위해, 연구자들은 세포막을 통과하는 것으로 알려진 제2 제제에 약물을 연결하는 것을 연구하였다. 이러한 제2 제제는 따라서 기생충의 세포 내로 약물을 운반하는데 이용될 수 있을 것이다.
말라리아 및 기타 기생충 질환의 치료를 위한 이러한 접근법의 일례로서, Sparr 등은 항말라리아 약물인 포스미도마이신과 옥타아르기닌 펩타이드와의 컨쥬게이트의 제조 및 그의 이용에 대해 설명한 바 있다. 포스미도마이신은 T. 곤디이, M. 투베르클로시스 및 P. 베르게이. 에 의해 잘 흡수되지 않는 것으로 보고되고 있다. 이 약물은 짧은 링커를 통해 옥타아르기닌 펩타이드에 공유적으로 연결되었거나, 또는 이 약물은 카운터 이온이 옥타아르기닌 페바이드로 표지된 염 형태로 제조되어 왔다. 옥타아르기닌 펩타이드는 이전에 P. 팔시파룸에 감염된 적혈구 세포의 세포막을 침투한 것으로 나타난 바 있다. 저자들은 옥타아르기닌 펩타이드가 P. 팔시파룸 및 다른 것들 내로의 포스미도마이신의 흡수를 향상시키고, 그에 후속하여 약물의 항기생충 효과를 증진시킬 수 있음을 보여주었다.
Landfear 역시도, 항기생충 제제가 세포 흡수와 연관된 관능기에 연결된다면, 세포내 환경으로의 항기생충 제제의 흡수가 향상될 수 있음을 보고한 바 있다. 즉, Landfear는 흡수 선택성을 증가시킬 목적으로 P2 트랜스포터 에 대한 기질로 알려진 P2-표적화 모티프를 사용할 것을 언급하고 있다.
활성 제제를 기생충 내로 전달하는데 유용한 추가적인 비히클이 요구되고 있다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 요구사항을 적어도 어느 정도 만족하거나; 및/또는 적어도 공중에게 유용한 선택지를 제공해주는, 선충 또는 벌레 및 세균을 비롯한 세포내 및 세포외 기생충에 활성 제제를 전달하는데 유용한 컨쥬게이트를 개발하였다.
발명의 개요
일반적인 태양에서 본 발명은 활성 제제를 세포 내로 전달하기 위한, 판토텐산기 또는 그의 유도체 ("판토텐산기")를 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 판토텐산기는 직접 또는 링커를 통해, 활성 제제에 공유적으로 연결된다.
따라서, 본 발명은 활성 제제의 수송 특징을 개선 또는 변경시키기 위해 판토텐산기를 이용하여 활성 제제를 변형시키는 것을 가능케 한다. 예컨대, 판토텐산기는 세포막을 통한 활성 제제의 수송을 개선시킬 수 있고, 그에 따라 세포내 환경에서 활성 제제의 양을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트는 활성 제제를 병원체의 세포, 예를 들어 세균 세포 또는 예를 들어 선충 또는 벌레와 같은 기생충 세포 내로 전달하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트는 병원체에 감염된 포유동물 대상체와 같은 숙주 대상체를 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트는 병원체에 감염된 세포 내로 활성 제제를 선택적으로 전달하는데 이용될 수 있다. 따라서, 컨쥬게이트는 감염되지 않은 세포로는 활성 제제를 전달하지 않는다.
본 발명의 컨쥬게이트는 또한 세포내 또는 세포외 기생충인 병원체에 활성 제제를 전달하는데 이용될 수도 있다.
본 발명의 제1 태양에 따라 다음 화학식 (I)의 컨쥬게이트 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태가 제공된다:
Figure pct00001
식 중:
-RA 및 -RB 는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 시클로알킬알킬, 알카니올 및 아르알카노일로부터 선택되고, 예를 들어 수소이며;
또는 -RA 및 -RB는 -C(RC1)(RC2)-와 함께, 6-원 고리를 형성하며, 여기서 -RC1은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선택되고, -RC2는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아르알콕시 및 시클로알킬알콕시로부터 선택되며, 예를 들어 -RC1 및 -RC2 는 알킬이거나, 또는 -RC1 및 -RC2는 함께 옥소 (=O)를 형성한다;
-RT1 및 -RT2는 각각 독립적으로 수소 또는 알킬, 예를 들어 수소이고;
-R1 및 -R2 는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선태되고, 예를 들어 알킬이며;
-R3는 수소 또는 알킬, 예를 들어 수소이고;
-D-는 C1-4 알킬렌 또는 C2-4 알케닐렌, 예를 들어 C2 알킬렌 또는 C2 알케닐렌이며, 여기서 알킬렌 또는 알케닐렌은 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 치환되고;
-X-는 공유 결합, -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R4)-, 예를 들어 -N(R4)-이며, 여기서 -R4는 수소 또는 알킬, 예를 들어 수소이고;
-L-는 링커 또는 공유 결합이다.
일 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (Ia-I) 내지 (Ia-III)의 화합물로부터 선택된다:
Figure pct00002
일 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (Ib) 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태 를 갖는다:
Figure pct00003
식 중 RA, -RB, -L- 및 -A는 화학식 (I)의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
일 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (Ic)를 갖는다:
Figure pct00004
식 중 RA, -RB, -L- 및 -A 화학식 (I)의 화합물, 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태에 대해 정의된 바와 같다.
일 구체예에서, 화합물은 다음 화합물이 아니다:
Figure pct00005
본 발명의 제2 태양에서 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물이 제공된다.
본 발명의 제3 태양에서 치료 방법에 사용되기 위한, 본 발명의 제1 및 제2 태양에서 설명된 바와 같은, 화학식 (I)의 컨쥬게이트 또는 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물이 제공된다.
본 발명의 제4 태양에서 감염, 예를 들어 미생물 감염, 예를 들어 세균 감염; 또는 선충 또는 편충 감염; 또는 기생충 감염을 치료하는 방법에 사용되기 위한, 본 발명의 제1 및 제2 태양에서 설명된 바와 같은, 화학식 (I)의 컨쥬게이트 또는 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물이 제공된다.
다양한 구체예에서, 감염은 헤몬쿠스 콘토투스, 트리파노조마 브루세이, 테일레리아 아눌라타, 플라스모디움 팔시파룸, 로트마리아 파씸, 바베시아 보비스, 또는 미코박테리움 투베르클로시스 중 어느 하나에 의해 기인할 수 있다.
다양한 구체예에서, 감염은 벌레, 키네티도플라스트, 아피콤플렉산, 또는 미코세균.에 의해 일어날 수 있다.
본 발명의 제5 태양에서 인간 질병의 동물 모델로서 이용되는, 씨노랩디티스 엘레강스로의 약물 및 단백질 전달을 위한 도구로서의 컨쥬게이트의 용도가 제공된다.
본 발명은 또한 본 발명의 제1 및 제2 태양에 설명된 바와 같은 화학식 (I)의 컨쥬게이트 또는 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물을, 세포 내로 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포를 화학식 (I)의 컨쥬게이트, 또는 컨쥬게이트를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 인간의 몸 또는 동물의 몸을 치료하는 방법이 아니다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법은 생체외(ex vivo) 방법이다.
일 태양에서 화학식 (I)의 화합물의 제조에 사용되기 위한 화합물이 제공된다. 일 구체예에서, 상기 화합물은 화학식 (II), (III), (IV) 또는 (V)의 화합물이며, 이들에 대해서는 이하에서 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 또 다른 태양에서 화학식 (I)의 화합물의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 화합물을 활성 제제와 반응시켜, 화학식 (I)의 화합물을 생성하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 화학식 (V)의 화합물을 화학식 (II), (III), 또는 (IV)의 화합물과 반응시킴으로써, 화학식 (I)의 화합물을 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 태양에서 치료 방법에 사용되기 위한 활성 제제의 용도가 제공되며, 여기서 상기 활성 제제는 판토텐산기에 컨쥬게이트된 것이다. 따라서, 활성 제제는 화학식 (I)의 컨쥬게이트일 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 태양 및 구체예들을 이하에서 더욱 상세히 설명한다.
도 1은 한 쌍의 형광 현미경 이미지로서, 좌측은 본 발명의 컨쥬게이트로 처리된 2개의 영양체(trophozoite) 단계의 기생충을 함유하는 감염된 적혈구를 나타내며, 여기서 화합물은 기생충의 세포질 전반에 걸쳐 존재한다. 소화 액포(digestive vacuoles)는 화합물 축적이 부족한 검은색 원으로 나타나며; 우측 이미지는 감염되지 않은 몇몇 적혈구를 보여주며 이들은 영양체 단계의 감염된 세포를 둘러싼 형광을 나타내지 않는다.
도 2는 본 발명의 컨쥬게이트로 처리된 유기체의 형광 현미경 이미지를 비롯한 여러 개의 현미경 이미지를 나타낸 것으로, 여기서 (a)는 컨쥬게이트 5로 처리된 바베시아 보비스에 의해 감염된 적혈구의 형광 현미경 이미지이다. 미감염 적혈구는 컨쥬게이트를 흡수하지 않는다; (b) 는 컨쥬게이트 5로 처리된 테일레리아 파르바 에 의해 감염된 적혈구의 형광 현미경 이미지이다. 컨쥬게이트는 기생충 내에 축적된 것으로 나타난다; (c) 는 컨쥬게이트 5로 처리된 플라스모디움 팔시파룸 에 의해 감염된 적혈구의 명시야(좌측) 및 형광(우측) 현미경 이미지이다. 미감염 적혈구는 컨쥬게이트를 흡수하지 않는다; (d)는 컨쥬게이트 9(형광 이미지에서 녹색 스팟으로 보임)로 처리된 트리파노모사 브루세이의 명시야(좌측) 및 형광(우측) 현미경 이미지이다. DAPI 염색도 볼 수 있다 (형광 이미지의 청색 스팟). 컨쥬게이트 5 역시도 테스트되었다(이미지 미표시). 컨쥬게이트 5는 T. 브루세이에 의해 흡수되며 트리 파노좀 몸 전체에 작은 소포를 형성하는 반면 리소좀이나 핵에 축적되지 않고 오히려 편모 포켓과 리소좀 사이의 소포에 축적된다. 반면에 컨쥬게이트 9는 화합물 5보다 훨씬 더 빨리 그리고 훨씬 더 높은 농도로 흡수된다. 화합물 9는 또한 세포 전체에 퍼져 있지만 미토콘드리아 또는 소포체(endoplasmic reticulum)에서 더 높은 농도의 영역을 가지고있는 것으로 보인다; (e)는 유기체에 의한 컨쥬게이트의 흡수를 보여주는 컨쥬게이트 5로 처리된 대장균(E. coli)의 형광 현미경 이미지이고; (f)는 유기체에 의한 컨쥬게이트의 흡수를 보여주는 컨쥬게이트 5로 처리된 엔테로코커스 페칼리스의 형광 현미경 이미지이며; (g)는 유기체에 의한 컨쥬게이트의 흡수를 보여주는 컨쥬게이트 5로 처리된 스타필로코커스 아우레우스의 형광 현미경 이미지이다; (h)는 컨쥬게이트 1 (우측 이미지) 및 5 (좌측 이미지)로 처리된 씨노랩디티스 엘레강스의 한 쌍의 형광 현미경 이미지이다. 컨쥬게이트 5는 C. 엘레강스의 소화관에 국한되어 있다. 컨쥬게이트 1 은 선충 전체에 걸쳐 분포하며; (i) 는 컨쥬게이트 1에 의해 처리되거나 처리되지 않은 헤몬쿠스 콘토투스의 한 쌍의 형광 현미경 이미지이다. 좌측 이미지는 H. 콘토르투스의 자가-형광을 나타내는 대조군이다. 우측 이미지는 컨쥬게이트 1과 함께 인큐베이션된 H. 콘토르투스의 이미지이다.
도 3은 L. 파씸 에서 전달 비히클인 (a) 화합물 2 및 (b) 화합물 8의 흡수 테스트 결과를 나타낸다. 사진은 화합물 2의 경우 500 μM, 화합물 8의 경우 10 μM, 실온에서 45 분 동안 인큐베이션하여 수행된 실험에서 찍은 것으로, 크기 막대: 5 μm이다.
도 4는 L. 파씸에 대한 전달 비히클과 BODIPY 11의 평가 결과를 보여준다. 막대 차트는 1μM 및 실온에서 45분 간의 인큐베이션을 수행한 실험으로부터의 RFU를 나타낸다. RFU는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지로부터 계산하였다. (유닛 x106). 별표는 독립적인 Student's t-test를 사용하여 분석된 샘플과 BODIPY 대조군 11 간의 유의차(P < 0.03) 를 나타낸다.
도 5는 꿀벌 내장에서 BODIPY 유닛 11뿐만 아니라 전달 비히클 2 및 8의 흡수 테스트 결과를 보여준다. 사진은 100μM 및 33℃에서45 분 동안 수행한 실험에서 찍은 것이다. 인큐베이션, 크기 막대: 100 μm. 사진은 명시야 (좌측 이미지) 및 FITC 필터 (우측 이미지) 이미지를 보여준다. (a) BODIPY 11; (b) 화합물 1; (c) 화합물 2; (d) 화합물 8.
도 6은 B. 보비스에 감염된 적혈구에서 전달 비히클의 흡수 평가를 보여준다. 사진은 명 시야 및 FITC 필터를 병합한 결과이다. 크기 막대: 5 μm. a) 화합물 1; b) 화합물 3; c) 화합물 2; d) 화합물 5; e) BODIPY 11.
도 7은 B. 보비스에 감염된 RBC에서 전달 비히클 (R)-P3의 흡수 평가를 보여준다. 사진은 100 μM 및 37℃에서 45분 간의 인큐베이션을 수행한 실험 결과이다. 사진: 기생충에 감염된 적혈구, 크기 막대: 5 μm. (a) 명시야; (b) DAPI; (c) FITC; (d) 병합.
도 8은 야생형 선충의 혼합 배양체에서 이버멕틴 B1a 및 화합물 14 및 15 및 이버멕틴 B1a의 흡수 평가를 보여준다. 이미지는 5μM 및 50μM 농도, 25℃ 및 24 시간 인큐베이션을 수행한 실험으로부터 찍힌 것이다, 크기 막대: 100μm. (a) 이버멕틴 B1a, 5 μM, 명시야; (b) 화합물 14, 5 μM, 명시야; (c) 화합물 15, 5 μM, FITC; (d) 인버멕틴B1a, 50 μM, 명시야.
도 9는 50 μg/mL의 화합물 1-8, 10 및 대조군 PBS (인산염-완충염수)와 함께, 세균, M. 투베르클로시스 (균주 H37Rv)를 인큐베이션하는 것에 대한 흡수 평가를 나타낸다. 도 9(a) 는 45 분 동안 세균과 함께 인큐베이션한 후 화합물 1-8, 10 및 대조군 PBS의 상대 형광 유닛 (RFU)를 사용한 흡수 실험의 그래프를 나타낸 것이다. 도 9(b) 는 화합물 1 (위) 및 2 (아래)를 이용한 흡수 실험에 대한 M. 투베르클로시스 세균의 두 개의 명시야 이미지를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 판토텐산 및 그의 유도체가 생체내에서 활성 제제의 전달을 개선하기 위해 상기 활성 제제를 변형시키는 데 사용될 수 있음을 발견하였다.
컨쥬게이트는 제제에 직접 또는 링커 기를 통해 공유적으로 연결된 판토텐산기를 포함한다.
판토텐산은 생체내에서 코엔자임 A(CoA)를 제조하는 데 사용된다 (Van der Westhuyzen 등 참조). 생합성의 첫 번째 단계는 PanK에 의해 매개되는, 판토텐산의 P-Pan으로의 전환이다. 이 인산화된 화합물은 이어서 PPCS의 작용하에 P-Pan-CMP로 전환된 다음 PPC로 전환된다.
최근, 코엔자임 A 생합성을 방해할 수 있는 판토텐산의 유사체가 설명되었다. 연구에 따르면 어떤 세균들은 판토텐산을 합성할 수 없으므로 CoA 합성을 위해 그들의 환경으로부터 판토텐산을 흡수하는 데 의존하는 것으로 나타났다. 따라서 CoA 생합성을 방해하는 것은 세균 감염 치료에 유용한 전략이다.
판토텐산의 생체활성 유도체의 한 가지 예는 CJ-15,801이다. 구조적으로, CJ-15,801은 β-알라닌 모이어티에 이중 결합이 있다는 점에서만 판토텐산과 다르다. CJ-15,801은 PanK 및 PPCS에 의해 생체내에서 처리되어 P-CJ-CMP (P-Pan-CMP의 CJ-15,801버전)를 생성한다. P-CJ-CMP는 PPCS의 강력한 결합-억제제이다. 따라서 판토텐산의 처리가 방지된다.
Han 등은 항생제 CJ-15,801에 대한 합성 경로를 설명한 바 있다. 여러 중간체가 항생제의 보호된 형태이며, 예를 들어 카복실산 말단이 벤질 아미드 또는 알릴옥시카보닐기로 보호된다. 보호된 형태의 항생제는 항생제 활성이있는 것으로 보고되지 않았으며 카복실산 말단에 사용된 보호기는 활성 제제로 간주되지 않는다.
본 발명자들은 활성 제제의 전달을 개선하기 위해, 예를 들어, 기생충 및 세균 내로의 활성 제제의 전달을 개선하기 위해 활성 제제를 판토텐산 및 그의 유도체로 변형시킬될 수 있음을 확립하였다. 본 발명자들은 판토텐기를 포함하는 컨쥬게이트가 빠르게 세포에 흡수된다는 사실을 확립하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 본 발명의 컨쥬게이트가 특히 S. 아우레우스 및 E. 페칼리스 세포에 45분 이내로 흡수된다는 점에 주목했다. 따라서, 본 발명의 컨쥬게이트는 그램-양성 및 그램-음성 세균과 함께 사용된다.
또한, 본 발명의 컨쥬게이트는 특정 세포 유형에 대해 선택적이며, 예를 들어 바람직하게는 포유동물 세포보다 세균 세포로 흡수되거나 숙주 세포보다 기생충 세포로 흡수될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 미감염 포유동물 세포보다 기생충에 감염된 포유동물 세포에 우선적으로 흡수될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 곤충 세포보다 기생충에 감염된 세포에 우선적으로 흡수될 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트는 세균 세포와 같은 원핵 세포로 전달될 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트는 예를 들어 크로말베올라타 미생물, 예를 들어 아피콤플렉사미생물, 또는 키네티도플라스티드 예를 들어 트리파노조마 및 로트마리아를 비롯한 원생생물(protists)와 같은, 진핵 미생물의 세포를 포함하는, 진핵 세포 내로 전달가능하다. 본 발명의 컨쥬게이트는 벌레, 예를 들어 C. 엘레강스 및 H. 콘토르투스 와 같은 벌레로 전달될 수 있다.
따라서, 본 발명의 컨쥬게이트는 질병과 관련된 미생물의 치료를위한 제제를 전달하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 컨쥬게이트는 포유동물 대상체와 같은 대상체 내에서 미생물 감염의 치료에 사용된다.
따라서, 판토텐산 및 그의 유도체는 CoA 생합성 경로에서 생체내 사용하는데 유용한 것으로 알려진 반면(기질로서 또는 항대사산물로서), 산 및 그의 유도체는 본 발명에서 활성 제제의 수송 특징을 변경, 예를 들어 개선시키는데 이용된다.
Clarke 등은 앞서 코엔자임 A (CoA)의 생합성을 연구하는데 있어서 판토텐산 유도체를 설명한 바 있다. 여기서, 판토텐산은 디아미노알킬렌 링커를 통해 형광 염료에 공유적으로 연결되었다. 판토텐산 유사체는 대장균 세포 내로 흡수된 후 세포 내에서 처리되어 코엔자임 A 유사체를 생성하였다.
판토텐산 유사체는 치료 방법에 사용되지 않았으며, 상기 유사체가 기생충을 지니는 포유동물 세포 내로 전달될 수 있다는 내용은 시사된 바 없다. 실제로, 위 저자들은 상기 유사체는 항균 활성을 거의 갖지 않으며, 이것이 상기 유사체의 장점이라고 강조되어 있다.
Clarke 등의 연구는 세포 내에서의 판토텐산염 화합물의 대사 처리를 연구하는 데에만 집중되어 있다. 따라서, 판토텐산 유사체는 천연 산물 규명을 위한 기질로서 제공되어 있을 뿐 이 문헌에는 판토텐산 또는 그의 유도체가 세포 내로 다른 활성 제제를 전달한다거나 또는 전달하는데 이용될 수 있다는 점에 대해서는 전혀 제안되어 있지 않다.
일 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 Clarke 등의 화합물 1이 아니다. 추가 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 생물 활성, 예를 들어 항기생충 활성, 예를 들어 항미생물 활성을 갖는 활성 제제를 포함한다.
EP 0068485에는 항생제로서 사용하기 위한 판토텐산기에 컨쥬게이트된 카바페넴 유도체가 개시되어 있다. 이 특허의 초점은 세균, 예를 들어 스트렙토마이세스 sp. OA-6129로부터 이들 카바페남 유도체를 생산하는데 있다. 이들 화합물은 β-락탐-고민감성 미생물인 코마모나스 테리게나 B-996에 대해 항미생물 활성을 갖는 것으로 개시되었으나, 정량적 데이터는 제시되어 있지 않다. 이 문헌에는 판토텐산 또는 그의 유도체가 세포 내로 다른 활성 제제를 가져오는 전달 비히클로서 이용된다거나 또는 이용될 수 있다는 점에 대해서는 전혀 제안되어 있지 않다.
본 발명은 세균과 같은 미생물에 사용하기 위한 컨쥬게이트가, 판토텐산기의 β- 알라닌 모이어티에 적어도 하나의 불포화 결합을 포함하여, 엔아미드(enamide)를 형성한다는 점에서 EP 0068485와 상이하다. 이 판토텐산기의 유도체는 세균에 대해 판토텐산기 자체보다 더욱 선택적이다 (예를 들어 실시예에서 미코박테리움 투베르클로시스 에 대한 테스트 참조).
US 9,108,942는 심한 통증 치료에 사용하기 위한 컨쥬게이트 CLX-SYN-G18-CO1을 개시한다. 이 컨쥬게이트는 판토텐산기에 부착된 활성 제제로서 2-(2-((2,6-디클로로페닐)아미노)페닐)아세트산기를 함유한다. 개시된 다른 컨쥬게이트는 활성 제제에 부착된 매우 다양한 상이한 기를 갖는다. 개시된 목록의 다른 기에 비해 판토텐산기가 더 바람직하다는 내용은 시사되어 있지 않다.
본 발명의 컨쥬게이트는 판토텐산기의 β-알라닌 모이어티 내에 적어도 하나의 불포화 결합을 함유하여, 엔아미드를 형성하기 때문에, CLX-SYN-G18-CO1에 대해 신규성을 구비한다. 판토텐산기의 이 유도체는 판토텐산기 자체보다 더욱 선택적이다 (예컨대 실시예의 플라스모디움 팔시파룸, 트리파노조마 브루세이, 테일레리아 아눌라타, 및 미코박테리움 투베르클로시스 에 대한 테스트 참조).
WO 2012 064632는 세균 및 원생동물 감염과 같은 다양한 병태를 치료하는데 사용하기 위한, 지방산 합성효소를 억제할 수 있는 5-머캅토-1H-인다졸-4,7-디온 유도체의 용도를 개시하고 있다. 개시된 화합물들 중 일부는 다른 가능한 다양한 기들 중에서도 판토텐산기에 컨쥬게이트된다. 상기 화합물이 세균 또는 원생동물에 대해 활성이 있다는 주장을 뒷받침하는 생물학적 데이터는 제공되지 않았다. 원생동물이 반드시 기생충인 것은 아니다.
세균 또는 기생충에 사용하기 위한 본 발명의 컨쥬게이트는 판토텐산기의 β-알라닌 모이어티에 적어도 하나의 불포화 결합을 함유하여, 엔아미드를 형성하기 때문에 WO 2012 064632에 대해 신규하다. 판토텐산기의 이 유도체는 세균 또는 기생충에 대해 판토텐산기 자체보다 더 선택적이다 (예컨대 실시예의 플라스모디움 팔시파룸, 트리파노조마 브루세이, 테일레리아 아눌라타, 및 미코박테리움 투베르클로시스에 대한 테스트 참조).
WO 2012/097454 는 판토텐산기에 부착된 아미노글리코사이드 모이어티를 포함하는, 내성균 세포를 강화하기 위한 컨쥬게이트를 개시한다. 이 컨쥬게이트는 그 자체로는 항균 활성이 부족하지만 다른 항생제에 대해 세균을 재감작시키는 것으로보고되었다. 판토텐산 또는 그 유도체가 다른 활성 제제를 세포로 전달하기 위한 전달 비히클로서 사용되어야 하거나 사용될 수 있다는 내용은 시사되어 있지 않다.
본 발명은 세균에 사용하기 위한 본 발명의 컨쥬게이트가 판토텐산기의 β-알라닌 모이어티에 적어도 하나의 불포화 결합을 포함하여 엔아미드를 형성하기 때문에 WO 2012/097454에 대해 신규하다. 이 판토텐산기의 유도체는 판토텐산기 자체보다 세균에 대해 더 선택적이다 (예를 들어 실시예에서 미코박테리움 투베르클로시스 에 대한 테스트 참조).
WO 2019/060634는 판토텐산기에 컨쥬게이트된 시스타민 유도체를 포함하는 두 가지 화합물을 개시한다. 이 화합물은 시스테아민에 민감한 증상, 증후군 및 질병을 치료하기 위한 것이다. 여기에는 세균 및 기생충 감염과 같은 전염병이 포함된다. 시스테아민에 민감한 감염을 일으키는 것으로 언급된 세균 및 기생충의 예로는 낭포성 섬유증을 유발하는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 과 말라리아를 유발하는 플라스모디움 팔시파룸 및 플라스모디움 베게이 기생충이 있다. 다시 말하지만, 판토텐산 또는 그의 유도체가 다른 활성 제제를 세포로 가져 오기 위한 전달 비히클로 사용되어야 하거나 사용될 수 있다는 제안은 어디에도 없다.
본 발명은 본 발명의 세균 및 기생충에 대한 사용을위한 컨쥬게이트의 활성제가 판토텐산기의 β-알라닌 모이어티에 하나 이상의 불포화 결합을 함유하여 엔아미드를 형성하기 때문에 WO 2019/060634에 대해 신규하다. 이 판토텐산기의 유도체는 판토텐산기 자체보다 세균 및 기생충에 대해 더 선택적이다 (예컨대 실시예에서 플라스모디움 팔시파룸, 트리파노조마 브루세이, 테일레리아 아눌라타, 및 미코박테리움 투베르클로시스에 대한테스트 참조).
Meier 등은 판토텐산기에 컨쥬게이트된 형광 염료 모이어티를 함유하는 시험관내 및 생체내 단백질 표지를 위한 화합물을 개시한다. 이들 화합물은 대장균의 CoA 경로에 통합되고 담체 단백질 Fren에 부착되는 것으로 나타났다. 다시 말하지만, 판토텐산 또는 그의 유도체가 다른 활성 제제를 대장균과 같은 세균에 전달하기 위한 전달 수단으로 사용되어야 한다거나 사용될 수 있다는 제안은 없다.
본 발명은 대장균과 같은 세균으로의 전달 방법에 사용하기 위한 컨쥬게이트가 판토텐산기의 β-알라닌 모이어티에 적어도 하나의 불포화 결합을 포함함에 따라 엔아미드를 형성하기 때문에, Meier 등에 대해 신규하다. 이 판토텐산기의 유도체는 판토텐산기 자체보다 세균에 대해 더 선택적이다 (예를 들어 실시예에서 미코박테리움 투베르클로시스에 대한 테스트 참조).
Shakya 등은 폴리케타이드 모방체로서 판토텐산 유도체를 개시한다. 이 모방체는 폴리케타이드 신타제 (PKS)를 조사하는데 사용하기 위해 액티노로딘 아실 담체 단백질 (actACP)에 부착된다. 판토텐산 또는 그의 유도체가 활성 제제를 세포로 전달하기 위한 전달 수단으로 사용되어야 하거나 사용될 수 있다는 제안은 없다.
본 발명의 컨쥬게이트는 판토텐산기의 β-알라닌 모이어티에 적어도 하나의 불포화 결합을 포함하여 엔아미드를 형성하기 때문에, 본 발명은 Shakya 등에 대해 신규하다. 또한, 판토텐기에 부착된 모이어티는 염료, 소약물, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 다당류가 아니다.
Storz 등은 PqsD 효소를 억제하는 화합물을 개시한다. PqsD의 억제는 2-헵틸-4-히드록시퀴놀린 (HHQ) 및 슈도모나스 퀴놀론 신호 (PQS)의 생성을 억제한다. 분자 HHQ와 PQS는 병원성 그램-음성 세균인 녹농균의 독성 인자 생성 및 생물막 형성의 조절에 관여한다. 따라서 PqsD는 항감염제 개발의 표적이다.
세균에 사용하기 위한 본 발명의 컨쥬게이트는 판토텐산기의 β-알라닌 모이어티에 적어도 하나의 불포화 결합을 포함하여 엔아미드를 형성하므로, 본 발명은 Storz등에 대해 신규하다. 이 판토텐산기의 유도체는 판토텐산기 자체보다 세균에 대해 더 선택적이다 (예를 들어 실시예에서 미코박테리움 투베르클로시스 에 대한 테스트 참조).
컨쥬게이트
본 발명은 판토텐산기와 어떤 제제(agent)과의 컨쥬게이트를 제공한다. 따라서, 일 구체예에서, 컨쥬게이트는 다음 구조를 갖는 기를 포함한다:
Figure pct00006
이 경우, 판토텐산기 및 그의 유도체 ("판토텐산기")라 함은 전술한 구조를 갖는 기를 가리킨다.
본 발명의 일 태양에서 화학식 (I)의 컨쥬게이트 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태가 제공된다:
Figure pct00007
치환기는 이하에서 상세히 설명된다.
예시적인 컨쥬게이트
일 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (Ib)의 화합물 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태이다:
Figure pct00008
식 중 -RA, -RB, -L- 및 -A는 화학식 (I)의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
일 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (Ic)의 화합물 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태이다:
Figure pct00009
식 중 -RA, -RB, -L- 및 -A는 화학식 (I)의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
일 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (Id)의 화합물 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태이다:
Figure pct00010
식 중 -RT1, -RT2, -RA, -RB, -R1, -R2, -R3, -D-, 및 -X-는 화학식 (I)의 화합물에 대해 정의된 바와 같고;
-L1-은 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
-L2-는 알킬렌 또는 헤테로알킬렌이다.
일 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 다음 화학식으로부터 선택된다:
Figure pct00011
식 중 -L- 및 -A는 화학식 (I)의 화합물에서 정의된 바와 같다.
바람직한 일 구체예에서, -L-은 화학식 (Id)의 화합물에 대해 정의된 바와 같은 링커이다. 더욱 바람직한 일 구체예에서, -L1-은 C2 알킬렌이고, -L2-는 C3 알킬렌 또는 C5 알킬렌이다.
일 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (Ie) 또는 (If)의 화합물이다. 바람직한 일 구체예에서, -L-은 화학식 (Id)의 화합물에 대해 정의된 바와 같은 링커이다. 더욱 바람직한 일 구체예에서, -L1-은 C2 알킬렌이고, -L2-는 C3 알킬렌 또는 C5 알킬렌이다.
중간체 화합물
본 발명의 또 다른 태양에서 화학식 (I)의 화합물의 제조에 사용되기 위한 중간체 화합물이 제공된다.
따라서, 화학식 (II)의 화합물 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태가 제공된다.
Figure pct00012
식 중 -RT1, -RT2, -RA, -RB, -R1, -R2, -R3, -D-, 및 -X- 화학식 (I)의 화합물에 대해 정의된 바와 같고;
-L1-은 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
-D1은 -OH, -SH, -SeH, -NH2, -NHRN, -COOH, -COH, -COORD, -N3, -C=CH2, -C=C(H)(Hal) 및 -C≡CH으로부터 선택되며, 여기서 -RN 및 -RD는 각각 독립적으로 알킬이고, Hal은 할로겐이다.
또한 화학식 (III)의 화합물 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태도 제공된다:
Figure pct00013
식 중 -RT1, -RT2, -RA, -RB, -R1, -R2, -R3 및 -D- 화학식 (I)의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 화학식 (IV)의 화합물 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태도 제공한다:
Figure pct00014
식 중 -RT1, -RT2, -RA, -RB, -R1, -R2, -R3, -D-, 및 -X-는 화학식 (I)의 화합물에 대해 정의된 바와 같고;
-L1-은 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
-L2-는 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
-D2는 -OH, -SH, -SeH, -NH2, -NHRN, -COOH, -COH, -COORD 및 말레이미딜로부터 선택된다.
또한, 본 발명에 따라 제공되고 사용하기 적합한 화학식 (V)의 화합물 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태도 제공된다:
Figure pct00015
식 중 -A는 활성 제제;
-L3-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
-T는 -OH, -SH, -SeH, -NH2, -NHRN, -COOH, -COH, -COORD, -N3, -C=CH2 및 -C≡CH로부터 선택되고, 여기서 -RN 및 -RD는 각각 독립적으로 알킬로부터 선택된다.
치환기
알킬기라 함은 1가의 탄화수소기를 가리킨다. 알킬기는 완전히 포화된다. 이것은 선형 또는 분지형일 수 있다. 알킬기는 C1-10 알킬, C1-6 알킬, C1-4 알킬, C1-2　알킬 또는 C1 알킬(메틸)일 수 있다.
알킬렌기라 함은 2가의 탄화수소기를 가리킨다. 알킬렌기는 완전히 포화된다. 이것은 선형 또는 분지형일 수 있다. 알킬렌기는 C1-10 알킬렌, C1-6　알킬렌, C1-4 알킬렌, C1-3 알킬렌, C2-3 알킬렌, C1-2　알킬렌, C2 알킬렌 (에틸렌) 또는 C1 알킬렌 (메틸렌)일 수 있다.
알케닐기는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합, 예를 들어 하나의 이중 결합을 갖는 1가의 탄화수소기를 가리킨다. 알케닐기는 완전히 또는 부분적으로 불포화되며, 예를 들어 부분적으로 불포화된다. 이것은 선형 또는 분지형일 수 있다. 알케닐기는 C2-10 알케닐, C2-6 알케닐, C2-4 알케닐, C2-3　알케닐, C3 알케닐 (알릴) 또는 C2 알케닐 (비닐)일 수 있다.
알케닐렌기는 2가의 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합, 예를 들어 하나의 이중 결합을 갖는 2가의 탄화수소기이다. 알케닐기는 완전히 또는 부분적으로 불포화되며, 예를 들어 부분적으로 불포화된다. 이것은 선형 또는 분지형일 수 있다. 알킬렌기는 C2-12 알케닐렌, C2-10 알케닐렌, C2-6　알케닐렌, C4-6 알킬렌, C2-4 알케닐렌, C2-3 알케닐렌, C2 알케닐렌, 또는 C3 알케닐렌일 수 있다.
알키닐기는 하나 이상의 탄소-탄소 3중 결합, 예를 들어 하나의 삼중 결합을 갖는 1가의 탄화수소기를 가리킨다. 알키닐기는 완전히 또는 부분적으로 불포화되며, 예를 들어 부분적으로 불포화된다. 이것은 선형 또는 분지형일 수 있다. 알키닐기는 C2-10 알키닐, C2-6 알키닐, C2-4 알키닐, C2-3　알키닐, C3 알키닐 (프로파르길) 또는 C2 알키닐일 수 있다.
시클로알킬기는 1가의 시클릭 탄화수소기를 가리킨다. 시클로알킬기는 완전히 포화된다. 시클로알킬기는 하나의 고리, 두 개 이상의 융합된 고리를 가질 수 있다. 시클로알킬기는 C3-10 시클로알킬, 예를 들어 C3-6 시클로알킬, 이를테면 C4-6 시클로알킬, 예를 들어 C6 시클로알킬 (시클로헥실)일 수 있다.
시클로알킬렌기는 2가의 시클릭 탄화수소기를 가리킨다.시클로알킬렌기는 완전히 포화된다. 시클로알킬렌기는 하나의 고리, 또는 두 개 이상의 융합된 고리를 가질 수 있다. 시클로알킬기는 C3-10 시클로알킬렌, 예를 들어 C3-6 시클로알킬렌, 예컨대 C4-6 시클로알킬렌, 예를 들어 C6 시클로알킬렌 (시클로헥실렌)일 수 있다.
헤테로알킬렌기는 하나 이상의 탄소 원자가 헤테로원자로 치환된 2가의 탄화수소기를 가리킨다. 헤테로알킬렌기는 완전히 포화된다. 이것은 선형 또는 분지형일 수 있다.
헤테로알킬렌기는 C2-12 헤테로알킬렌기, 예를 들어 C3-12 헤테로알킬렌, 예를 들어 C3-12 헤테로알킬렌일 수 있다.
헤테로알킬렌기는 알킬렌 글리콜기, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜기일 수 있다. 이의 예로는 에틸렌 글리콜기, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜기를 들 수 있다.
헤테로알킬렌기는 하나 또는 두 개의 헤테로원자, 예를 들어 하나의 헤테로 원자를 갖는다.
헤테로원자는 -O-, -S- 및/또는 -NH-로부터 선택될 수 있다.
아릴기는 1가의 방향족기를 가리킨다. 아릴기는 카보아릴기 또는 헤테로아릴기일 수 있다.
카보아릴기는 C6-14 카보아릴, C6-10 카보아릴, 예를 들어 C6 카보아릴 (페닐) 또는 C10 카보아릴 (나프틸)일 수 있다.
헤테로아릴기는 C5-10 헤테로아릴, 예를 들어 C5-6 헤테로아릴, 예를 들어 C5 헤테로아릴 또는 C6 헤테로아릴일 수 있다. 헤테로아릴기는 N, S 및 O로부터 선택된 하나 이상의 방향족 고리 원자를 갖는다.
C5 헤테로아릴기의 예에는 피롤릴 및 옥사졸릴이 포함된다. C6 헤테로아릴기의 예로는 피리딜 및 피리미디닐을 들 수 있다.
아릴기는 하나의 고리, 또는 두 개 이상의 융합된 고리를 가질 수 있다. 헤테로아릴기가 두 개 이상의 고리를 갖는 경우, 각각의 고리는 5 내지 7개의 고리 원자를 가질 수 있는 데, 이 중 0 내지 4개는 헤테로원자이다 (단 적어도 하나의 고리는 하나의 헤테로원자를 가질 것을 전제로 한다).
아릴렌기는 2가의 방향족 기이다. 아릴렌기는 카보아릴렌기 또는 헤테로아릴렌기일 수 있다.
카보아릴렌기는 C6-14 카보아릴렌, C6-10 카보아릴렌, 예를 들어 C6 카보아릴렌 (페닐렌) 또는 C10 카보아릴렌 (나프틸렌)일 수 있다.
헤테로아릴렌기는 C5-10 헤테로아릴렌, 예를 들어 C5-6 헤테로아릴렌, 예를 들어 C5 헤테로아릴 또는 C6 헤테로아릴렌일 수 있다. 헤테로아릴기는 N, S 및 O로부터 선택된 하나 이상의 방향족 고리 원자를 갖는다.
C5 헤테로아릴렌기의 예로는 트리아졸릴렌, 피롤릴렌 및 옥사졸릴렌을 들 수 있다. C6 헤테로아릴렌기의 예로는 피리딜렌 및 피리미딜렌을 들 수 있다.
아릴렌기는 하나의 고리, 또는 두 개 이상의 융합된 고리를 가질 수 있다. 헤테로아릴렌기가 두 개 이상의 고리를 갖는 경우, 각각의 고리는 5 내지 7 고리 원자를 가질 수 있고, 이 중 0 내지 4개는e 헤테로원자이다 (단 적어도 하나의 고리는 하나의 헤테로원자를 가질 것을 전제로 한다).
헤테로시클렌기는 2가의 헤테로사이클을 가리킨다. 헤테로시클렌기는 완전히 포화된다.
헤테로시클렌은 C5-12 헤테로시클렌, 예를 들어 C5-7 헤테로시클렌, 예를 들어 C5-6 헤테로시클렌, 예를 들어 C6 헤테로시클렌일 수 있다.
헤테로시클렌은 하나 또는 두 개의 융합된 고리를 가질 수 있다. 고리가 두 개 존재하는 경우, 하나 또는 두 개의 고리 모두가 헤테로원자를 가질 수 있다.
헤테로시클렌은 O, S 및 N (예를 들어 NH)으로부터 선택된 하나 이상의 고리 헤테로원자를 가질 수 있다. 황 원자는 산화물, 예를 들어 SO 및 SO2일 수 있다.
헤테로시클렌기 내의 탄소 고리 원자는 옥소 치환기 (=O)를 가질 수 있다. 일 구체예에서, 옥소 치환기는 이웃하는 질소 고리 원자를 갖는 탄소 고리 원자 상에 제공됨으로 해서, 헤테로사이클 내에 아미도-유사 기를 제공한다.
헤테로시클렌이 질소 고리 원자를 가지면, 이 헤테로시클렌은 질소 고리 원자를 통해 연결될 수 있다.
아르알킬기라 함은 하나 이상의, 예를 들어 하나의, 아릴 치환기를 갖는 알킬기를 가리킨다. 아르알킬은 알킬기를 통해 연결된다. 아르알킬기의 일례는 벤질이다. 알킬 및 아릴기는 각각 본 명세서에 정의된 바와 같다.
시클로알킬알킬기는 시클로알킬 치환기를 갖는 알킬기를 가리킨다. 시클로알킬알킬기는 알킬기를 통해 연결된다. 알킬 및 시클로알킬기는 각각 본 명세서에 정의된 바와 같다.
알카노일기는 알킬기로서 연결을 형성하는 알킬기의 탄소가 옥소(=O)에 의해 치환되어 있는 알킬기를 가리킨다. 알카노일기의 일례는 아실 (C2 알카노일)이다. 알카노일기는 본 명세서에 설명된 바와 같은 알킬에 기반할 수 있다.
아르알카노일기는 아르알킬기를 가리키되 여기서 연결을 형성하는 알킬기의 탄소가 옥소 (=O)에 의해 치환된 아르알킬기이다. 아르알카노일기의 일례는 벤조일이다. 아르알카노일기는 설명된 바와 같은 아르알킬에 기반할 수 있다.
알콕시기는 에테르 산소 원자를 통해 연결된, 알킬 에테르를 가리킨다. 여기서 알킬기는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
알켄옥시기는 에테르 산소 원자를 통해 연결된, 알케닐 에테르를 가리킨다. 여기서 알케닐기는 본 명세서에서 정의된 바와 같다. 일 구체예에서, 에테르 산소는 탄소-탄소 이중 결합에도 참여하는 탄소 원자에는 제공되지 않는다.
알킨옥시기는 에테르 산소 원자를 통해 연결된, 알키닐 에테르를 가리킨다. 알키닐기는 본 명세서에서 정의된 바와 같다. 일 구체예에서, 에테르 산소는 탄소-탄소 삼중 결합에도 참여하는 탄소 원자에는 제공되지 않는다.
아르알콕시기는 아르알킬의 알킬 상에 제공된 에테르 산소 원자를 통해 연결된, 아르알킬 에테르를 가리킨다. 여기서 아르알킬기는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
시클로알킬알콕시기는 시클로알킬알킬의 알킬 상에 제공된 에테르 산소 원자를 통해 연결된, 시클로알킬알킬 에테르를 가리킨다. 여기서 시클로알킬알킬기는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
-RA 및 -RB
-RA 및 -RB 기는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 시클로알킬알킬 및 알카노일로부터 선택되거나, 또는 -RA 및 -RB는 -C(RC1)(RC2)-와 함께, 6-원 고리를 형성한다.
-RA 및 -RB는 함께 -C(RC1)(RC2)- 기일 수 있다. 이 6원 고리는 -RA 및 -RB가 각각 결합된 산소, 및 판토일 모이어티 내에서 상기 산소 원자들에 대해 α 및 β인 탄소 원자와 함께 형성된다:
Figure pct00016
6원 고리는 1,3-디옥산기이다. 이 화합물은 예컨대 -RC1 및 -RC2가 알킬 또는 수소인 아세탈이라 칭해질 수 있다. 또 다른 구체예에서, -RC1 및 -RC2는 함께 옥소 (=O)기를 형성한다. 여기서, 이 화합물은 시클릭 카보네이트라 칭할 수 있다.
일 구체예에서, -RA 및 -RB는 각각 독립적으로 수소 및 알킬로부터 선택되거나, 또는 -RA 및 -RB는 -C(RC1)(RC2)-와 함께 6-원 고리를 형성한다.
일 구체예에서, -RA 및 -RB는 각각 독립적으로 수소 및 알킬로부터 선택되며, 예를 들어 수소이다.
-RA 및 -RB 양자 모두가 수소인 화합물은 -RA 및 -RB가 함께 -C(RC1)(RC2)-인 화합물로부터 형성될 수 있다. 마찬가지로, -RA 및 -RB 양자 모두가 수소가 아닌 화합물은 -RA 및 -RB 양자 모두가 수소인 화합물로부터 형성될 수 있다.
알카니올기는C1 -6 알카니올기, 예를 들어 C1-4, 예를 들어 C2 알카니올 (아실기)일 수 있다. 알카니올기를 갖는 화합물은 알코올을 예컨대 적절한 산 염화물 또는 무수물과 반응시킴으로써 형성될 수 있다.
전형적으로, -RA 및 -RB 양자 모두는 수소이거나 또는 -RA 및 -RB는 함께 -C(RC1)(RC2)-, 예를 들어 -C(Me)2-이다.
일 구체예에서, -RA는 수소이다.
일 구체예에서, -RB는 수소이다.
입체화학
본 발명의 컨쥬게이트는 판토텐산에 기반한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 판토텐산의 입체화학적 배치 역시도 포함할 수 있다. 이것은 (2R)-배치이다. 따라서, 일 구체예에서, 화학식 (I)의 컨쥬게이트는:
Figure pct00017
일 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 (2R)-입체화학을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 (2S)-입체화학을 갖는다. 따라서, 일 구체예에서, 화학식 (I)의 컨쥬게이트는:
Figure pct00018
일 수 있다.
-R C1 및 -R C2
-RC1 기는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선택될 수 있다.
-RC2 기는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아르알콕시 및 시클로알킬알콕시로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, -RC1 및 -RC2는 함께 옥소 (=O)이다. 이것은 디올 관능기에 대한 카보네이트 보호기로 칭해질 수 있다.
-RC2 기는 에테르기, 예를 들어 알콕시일 수 있다. 이 화합물은 오르토에스테르로 칭해질 수 있다.
일 구체예에서, -RC1는 수소, 알킬 및 아르알킬로부터 선택된다.
일 구체예에서, -RC1는 수소 및 알킬로부터 선택된다.
일 구체예에서, -RC1은 알킬, 예를 들어 메틸이다.
일 구체예에서, -RC2는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, -RC2는 수소, 알킬 및 아르알킬로부터 선택된다.
일 구체예에서, -RC2는 수소 및 알킬로부터 선택된다.
일 구체예에서, -RC2는 알킬, 예를 들어 메틸이다.
일 구체예에서, -RC1 및 -RC2는 각각 알킬이다.
일 구체예에서, -RC1 및 -RC2는 각각 메틸이다.
-R T1 및 -R T2
-RT1 및 -RT2기는 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이다. 알킬기는 C1-6 알킬, 예를 들어 C1-4 알킬, 예를 들어 C1-2 알킬일 수 있다. 알킬기는 메틸일 수 있다.
일 구체예에서, -RT1은 수소이고 -RT2는 수소 또는 알킬, 예를 들어 메틸이다.
일 구체예에서, -RT1 및 -RT2 각각은 수소이다.
ω-위치 (판토일 모이어티의 말단 위치, β-위치이기도 함)에 알킬 치환기를 갖는 판토텐산기는 Bird 등 (및 Spry 등에 의해 논의됨)에 의해 공지되었다.
-R D
각각의 -RD는 독립적으로 알킬이다.
알킬기는 C1-12 알킬기, 예를 들어 C1-6 알킬, 예를 들어 C1-4 알킬, 예를 들어 C1-2　알킬일 수 있다. 알킬기는 C1 알킬 (메틸)일 수 있다.
일 구체예에서, 각각의 -RD는 메틸이다.
-R N
각각의 -RN은 독립적으로 알킬이다.
알킬기는 C1-12 알킬기, 예를 들어 C1-6 알킬, 예를 들어 C1-4 알킬, 예를 들어 C1-2　알킬일 수 있다. 알킬기는 C1 알킬 (메틸)일 수 있다.
일 구체예에서, 각각의 -RN은 메틸이다.
-R 1 및 -R 2
-R1 및 -R2는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선택된다.
일 구체예에서, -R1 및 -R2는 각각 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선택된다.
일 구체예에서, -R1 및 -R2는 각각 알킬이다. -R1 및 -R2 기는 양자 모두 메틸일 수 있다.
-R1 및 -R2 중 하나는 메틸일 수 있고 다른 하나는 메틸이 아닐 수 있다.
일 구체예에서, -R1은 -R2과 동일하다.
Akinnusi 등은 판토텐산의 gem-디메틸 치환기가 하나 또는 두 개의 대안적인 알킬, 알케닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬기에 의해 치환되어 있는 판토텐아미드의 제미날(geminal) 유도체에 대해 설명하고 있다.
-R 3
일 구체예에서, -R3는 수소이다.
일 구체예에서, -R3는 알킬, 예를 들어 메틸이다.
-D-
-D- 기는 C1-4 알킬렌 또는 C2-4 알케닐렌으로서, 여기서 상기 알킬렌 또는 알케닐렌는 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 치환되며, 예를 들어 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 일- 또는 이-치환되고, 예를 들어 알킬에 의해 선택적으로 일- 또는 이-치환된다.
대안적으로, -D-는 C2-4 알케닐렌이며 여기서 알케닐렌은 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 치환된다.
일 구체예에서, -D-는 C1-3 알킬렌 또는 C2-3 알케닐렌이고 여기서 알킬렌 또는 알케닐렌은 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 치환된다.
대안적으로, -D-는 C2-3 알케닐렌이며 여기서 알케닐렌은 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 치환된다.
일 구체예에서, -D-는 C2 알킬렌 또는 C2　알케닐렌이고, 여기서 알킬렌 또는 알케닐렌은 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 치환된다.
대안적으로, -D-는 C2　알케닐렌이고, 여기서 알케닐렌은 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 치환된다.
알킬렌 또는 알케닐렌은 선형 알킬렌 또는 선형 알케닐렌일 수 있다.
일 구체예에서, -D-는 -C(R5)2-C(R6)2- 또는 -C(R5)=C(R6)-이고, 여기서 각각의 -R5는 수소 또는 알킬이고 각각의 -R6는 수소 또는 알킬이다.
일 구체예에서, -D-는 알킬에 의해 선택적으로 치환된 C2 알킬렌 또는 C2 알케닐렌이다.
대안적으로, -D-는 알킬에 의해 선택적으로 치환된 C2 알케닐렌이다.
-D-가 C4 알케닐렌이면, 이 알케닐렌은 디엔일 수 있다.
좋기로는, -D-는 C2-3 알케닐렌이다.
더욱 좋기로는, -D-는 C2 알케닐렌이다.
이중 결합
일 구체예에서, 예를 들어 바람직한 일 구체예에서, 이중 결합이 화학식 (I)의 컨쥬게이트에 존재한다.
일 구체예에서, 이중 결합은 트랜스(trans) 또는 시스(cis) 배열이다.
일 구체예에서, 이중 결합은 트랜스 배열이다. 여기서, 트랜스는 이중 결합을 가로지르는 아미도 그룹의 배열을 나타낸다. 예를 들어, 화학식 (Ia-I)의 화합물은 트랜스 배열을 갖는다:
Figure pct00019
일 구체예에서, 이중 결합은 시스 배열을 갖는다. 여기서 시스는 이중 결합을 가로지르는 아미도 그룹의 배열을 나타낸다. 예를 들어, 화학식 (Ia-II)의 화합물은 시스 배열을 갖는다.
Figure pct00020
본 발명자들은 이중 결합의 기하학적 구조가 특정 세포 또는 특정 유기체로 제제를 전달하는 컨쥬게이트의 선택성에 영향을 미칠 수 있음을 발견하였다.
상기 기가 디엔인 경우, 이중 결합들은 트랜스 또는 시스의 기하학적 구조를 모두 가질 수 있거나, 또는 하나는 트랜스이고 다른 하나는 시스일 수 있다.
-R 5
판토텐산기가 이중 결합을 갖는 경우, 하나의 -R5 기가 존재할 수 있다. 판토텐산기가 이중 결합을 갖지 않으면, 두 개의 -R5 기가 존재할 수 있다. 여기서, -R5 기들은 같거나 다를 수 있다.
일 구체예에서, 각각의 -R5는 수소이다.
일 구체예에서, 각각의 -R5는 알킬 예를 들어 -R5 메틸이다.
-R 6
판토텐산기가 이중 결합을 갖는 경우, 하나의 -R6 기가 존재할 수 있다. 판토텐산기가 이중 결합을 갖지 않으면, 두 개의 -R6 기가 존재할 수 있다. 여기서, -R6 기들은 같거나 다를 수 있다.
일 구체예에서, 각각의 -R6는 수소이다.
일 구체예에서, 각각의 -R6는 알킬 예를 들어 메틸이다.
이중 결합이 존재하는 경우, -R6 기는 -R5 기와 같거나 다를 수 있다. 예컨대, -R5 및 -R6는 양자 모두 수소일 수 있다.
이중 결합이 존재하지 않는 경우, -R6 기들은 같을 수 있고, 이들은 각각 -R% 기와 동일할 수 있다. 예컨대, 각각의 -R5 기 및 각각의 -R6 기들은 수소일 수 있다.
-X-
-X-는 공유 결합, -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R4)-, 예를 들어 -R4가 수소 또는 알킬, 예를 들어 수소인 -N(R4)-이다.
일 구체예에서, -X-는 공유 결합, -O-, -S-, 또는 -N(R4)-이다.
일 구체예에서, -X-는 공유 결합, -O-, 또는 -N(R4)-이다.
일 구체예에서, -X-는 공유 결합 또는 -N(R4)-이다.
대안적으로, -X-는 공유 결합 또는 -O-일 수 있다.
일 구체예에서, -X-는 -N(R4)-이다. 예시적인 기로는 -N(H)- 및 -N(Me)-를 들 수 있다.
-R 4
일 구체예에서, -R4는 수소이다.
일 구체예에서, -R4는 알킬, 예를 들어 메틸이다.
-L-
-L-기는 공유 결합일 수 있다. 여기서, 판토텐산기는 -X-기와 함께 활성 제제 -A에 직접 연결된다.
대안적으로, -L- 기는 판토텐산기 및 -X- 기를 활성 제제 -A에 간접적으로 공유 연결시키기 위한 링커일 수 있다.
일 구체예에서, 링커 -L-은 *-L3-B-L4-G-LA- 기이고,
여기서, 별표는 -X-에의 부착 지점을 가리킨다;
-L3-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
-B-는 공유 결합, 아릴렌, 헤테로시클렌, 또는 시클로알킬렌;
-L4-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌; 및
-G-는 공유 결합, -O-, -S-, -N(RN)-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -N(RN)C(O)-, -OC(O)-, 및 말레이미드-유래된 기로부터 선택되며, 여기서, -RN은 수소 또는 알킬이고,
-LA-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌이며,
역서 -L3-, -B- 및 -L4- 중 적어도 하나는 공유 결합이 아니고, -B-가 공유 결합이면, -L4-는 공유 결합이다.
일 구체예에서, -L3- 및 -B- 및 -L4- 모두가 공유 결합은 아니다.
일 구체예에서, 링커 -L-은 *-L3-G-LA- 기이고
여기서 별표는 -X-에의 부착 지점을 나타낸다;
-L3-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌; 및
-G-는 공유 결합, -O-, -S-, -N(RN)-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -N(RN)C(O)-, -OC(O)-, 및 말레이미드-유래된 기로부터 선택되고, 여기서 -RN은 수소 또는 알킬이며,
-LA-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌이다.
일 구체예에서, -L3-는 C-3 또는 C5 알킬렌이다. 일 구체예에서, -G-는 말레이미드-유래된 기이다.
일 구체예에서, -L3- 는 C-3 또는 C5 알킬렌이고, -G-는 말레이미드-유래된 기이다.
일 구체예에서, 링커 -L-은 *-L3-B-L5-G- 기이고,
여기서 별표는 -X-에의 부착 지점을 나타낸다;
-L3-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
-B-는 공유 결합, 아릴렌, 헤테로시클렌, 또는 시클로알킬렌;
-L5-는 화학식 *-(NRNC(O)-L6)-의 아미드기이고, 여기서 별표는 -B-에의 부착 지점을 나타내고, -L6-는 알킬렌이다;
G-는 공유 결합, -O-, -S-, -N(RN)-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -N(RN)C(O)-, -OC(O)-, 및 말레이미드-유래된 기이고
-RN은 수소 또는 알킬이다.
일 구체예에서, 링커는 말레이미드-유래된 기:
Figure pct00021
를 포함한다.
말레이미드-유래된 기는 활성 제제 -A와의 연결을 위해, 예컨대 -G-기와 같은, 링커 -L-의 말단에 존재할 수 있다. 따라서 링커와 활성 제제 간의 연결은 일반적으로 활성 제제가 티오 관능기를 갖는 경우, 티올기와 말레이미드의 반응에 의해 형성될 수 있다. 예컨대, 활성 제제는 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 여기서, 활성 제제의 황 원자는 말레이미드-유래된 기의 탄소 고리 원자에 결합되다:
Figure pct00022
상기 나타난 결합은 황 원자를 통해 형성되는 한편, 말레이미드-유래된 기 역시도 -O-, -Se-, 및 -NH-를 통해 연결될 수 있으며, 여기서 이 기들은 예컨대 적절한 아미노산 잔기(예를 들어 각각 Ser, Se-Cys 및 Lys)의 측쇄 관능기로부터 유래할 수 있다.
말레이미드-유래된 기는 예컨대 -B- 기로서, 링커 -L- 내의 헤테로시클렌일 수 있다.
-L 1 -
-L1- 기는 알킬렌 및 헤테로알킬렌으로부터 선택된다.
헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는, 특히 -X-가 공유 결합이 아닌 경우, -X- 기에 결합되지 않을 수 있다.
헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -D1 기에 결합하지 않을 수 있다.
헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-, -S-, 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O- 또는 -N(H)- d으로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-이다
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -N(H)-이다.
일 구체예에서, -L1-은 C1-12 알킬렌, 예를 들어 C2-6 알킬렌, 예를 들어 C4-6 알킬렌, 또는 C3-5 알킬렌이다.
-L 2 -
-L2- 기는 알킬렌 및 헤테로알킬렌으로부터 선택된다.
헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 트리아졸의 질소 원자에 결합되지 않을 수 있다.
헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -D2 기에 결합되지 않을 수 있다.
헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-, -S-, 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O- 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-이다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -N(H)-이다.
일 구체예에서, -L2-은 C1-12 알킬렌, 예를 들어 C2-6 알킬렌, 예를 들어 C4-6 알킬렌이다.
-L 3 -
-L3- 기는 공유 결합, 알킬렌 및 헤테로알킬렌으로부터 선택된다.
헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 특히 -X-가 공유 결합이 아닐 경우, -X- 기에 결합되지 않을 수 있다.
헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-, -S-, 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다..
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O- 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-이다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -N(H)-이다.
일 구체예에서, -L3-는 C1-12 알킬렌, 예를 들어 C2-6 알킬렌, 예를 들어 C4-6 알킬렌이다.
-B-
-B- 기는 공유 결합, 아릴렌, 헤테로시클렌, 또는 시클로알킬렌이다.
일 구체예에서, -B-는 공유 결합이다. 여기서, -L4- 역시도 공유 결합이다.
일 구체예에서, -B-는 아릴렌, 헤테로시클렌, 또는 시클로알킬렌이다.
일 구체예에서, -B-는 아릴렌, 예를 들어 카보아릴렌 또는 헤테로아릴렌이다.
일 구체예에서, -B-는 카보아릴렌, 예를 들어 페닐렌이다.
일 구체예에서, -B-는 헤테로아릴렌, 예를 들어 트리아졸릴렌, 예를 들어 1,2,3-트리아졸릴렌, 예를 들어 1,2,3-트리아졸릴-1,4-엔 및 1,2,3-트리아졸릴-1,5-엔이다.
일 구체예에서, -B-는 헤테로시클렌이다.
-L 4 -
-L4- 기는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌이다.
헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 특히 -G-가 -O-, -S-, -N(RN)-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -N(RN)C(O)-, 및 -OC(O)-이면, -G-기에 결합하지 않을 수 있다.
헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-, -S-, 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O- 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-이다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -N(H)-이다.
-G-
-G-는 공유 결합, -O-, -S-, -N(RN)-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -N(RN)C(O)-, -OC(O)-, 및 말레이미드-유래된 기로부터 선택되고, 여기서 -RN은 수소 또는 알킬이다.
일 구체예에서, -G-는 공유 결합이다.
일 구체예에서, -G-는 -O-, -S-, -N(RN)-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -N(RN)C(O)-, -OC(O)-, 및 말레이미드-유래된 기로부터 선택된다.
일 구체예에서, -G-는 -O-, -N(RN)-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -N(RN)C(O)-, -OC(O)-, 및 말레이미드-유래된 기로부터 선택된다.
일 구체예에서, -G-는 -O-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -N(RN)C(O)-, -OC(O)-, 및 말레이미드-유래된 기로부터 선택된다.
일 구체예에서, -G-는 공유 결합, -C(O)N(RN)-, -N(RN)C(O)-, 및 말레이미드-유래된 기로부터 선택된다.
일 구체예에서, -G-는 -C(O)N(RN)-, -N(RN)C(O)-, 및 말레이미드-유래된 기로부터 선택된다.
일 구체예에서, -G-는 공유 결합, -C(O)N(RN)-, 및 말레이미드-유래된 기로부터 선택된다.
일 구체예에서, -G-는 -C(O)N(RN)-, 및 말레이미드-유래된 기로부터 선택된다.
일 구체예에서, -G-는 말레이미드-유래된 기이다.
-L A -
-LA- 기는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌이다.
헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 특히 -G-가 -O-, -S-, -N(RN)-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -N(RN)C(O)-, 및 -OC(O)-이면, -G- 기에 결합하지 않을 수 있다.
헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-, -S-, 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O- 또는 -N(H)-로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -O-이다.
일 구체예에서, 헤테로알킬렌기에 존재하는 헤테로원자는 -N(H)-이다.
일 구체예에서, -LA-는 공유 결합이다.
일 구체예에서, -LA-는 알킬렌이다.
-L 5 -
-L5- 기는 화학식 *-(NRNC(O)-L6)-의 아미드기이며, 여기서 별표는 -B-에 대한 부착 지점을 가리키고, -L6-는 알킬렌이다.
일 구체예에서, -L5-는 *-(NHC(O)-L6)-이다.
일 구체예에서, -L6-는 C2-12 알킬렌, 예를 들어 C2-6 알킬렌이다.
트리아졸
본 발명의 일부 구체예에서, 화합물은 링커 -L-에, 또는 링커 -L-의 전구체 기에 존재할 수 있는, 트리아졸기, 특히 1,2,3-트리아졸을 함유한다.
1,2,3-트리아졸이 존재할 경우, 이것은 1,4- 또는 1,5-치환된다. 일 구체예에서, 1,2,3-트리아졸은 1,4-치환된다.
-D 1
-D1 기는 -D1과의 반응을 위한 관능기가 제공된 개질된 활성 제제를 비롯한, 관능기를 갖는 활성 제제와 공유 결합을 형성하기 위한 관능기이다.
따라서, -D1은 -OH, -SH, -SeH, -NH2, -NHRN, -COOH, -COH, -COORD, -N3, -C=CH2, -C=C(H)(Hal) 및 -C≡CH로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, -D1은 -OH, -SH, -NH2, -NHRN, -COOH, -COH, -COORD, -N3, -C=CH2, -C=C(H)(Hal) 및 -C≡CH로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, -D1은 OH, -SH, -SeH, -NH2, 및 -NHRN으로부터 선택된다.
일 구체예에서, -D1은 -OH, -NH2, -COOH, -N3, 및 -C≡CH로부터 선택된다.
일 구체예에서, -D1은 -NH2, -COOH, -N3, 및 -C≡CH로부터 선택된다.
-D1이 -NH2이면, 이 기는 아미드, 카바메이트 및 카바미드 결합을 형성하는데 적합하다.
-D1은 -COOH이고, 이 기는 아미드 및 에스테르 결합을 형성하는데 적합하다.
-D1이 -N3이고 -C≡CH이면, 이들 기들은 연결 1,2,3-트리아졸기를 형성하는데 적합하다.
-D1이 -C=C(H)(Hal)이면, 이 기는 가교-커플링 반응에 참여하는데 적합할 수 있다.
-D 2
-D2 기는 -D1과의 반응을 위한 관능기가 제공된 개질된 활성 제제를 비롯한, 관능기를 갖는 활성 제제와 공유 결합을 형성하기 위한 관능기이다.
따라서, -D2는 -OH, -SH, -SeH, -NH2, -NHRN, -COOH, -COH, -COORC 및 말레이미딜로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, -D2는 -OH, -SH, -NH2, -NHRN, -COOH, -COH, -COORC 및 말레이미딜로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, -D2는 -OH, -SH, -SeH, -NH2, -NHRN 및 말레이미딜로부터 선택된다.
일 구체예에서, -D2는 -OH, -NH2, -COOH 및 말레이미딜로부터 선택된다.
일 구체예에서, -D2는 말레이미딜이다.
일 구체예에서, -D2는 -OH, -NH2 및 -COOH로부터 선택된다.
-T
-T 기는 화학식 (II), (III) 또는 (IV), 예를 들어 (III)의 화합물에 대한 공유 결합을 형성하기 위한 관능기이다. 따라서, -T는 카복실산기 (예를 들어 (III)에 존재함) 또는 -NH2기(예를 들어 화학식 (II)의 화합물에서 -D1이 -NH2이거나 또는 화학식 (IV)의 화합물에서 -D2가 -NH2인 경우)와 반응성일 수 있다.
-T는 -OH, -SH, -SeH, -NH2, -NHRN, -COOH, -COH, -COORD, -N3, -C=CH2 및 -C≡CH로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, -T는 -OH, -SH, -SeH, -NH2, 및 -NHRN으로부터 선택된다. 이러한 기들은 화합물 (III)에 존재하는 카복실기와의 반응에 적합하다.
일 구체예에서, -T는 -OH, -NH2, 및 -NHRN으로부터 선택된다.
일 구체예에서, -T는 -NH2 또는 -NHRN이다.
일 구체예에서, -T는 -COOH, -COH, 및 -COORD로부터 선택된다. 이러한 기들은 화합물 (II) 또는 (IV)에 존재하는 아미노기와의 반응에 적합하다.
일 구체예에서, -T는 -COOH이다.
일 구체예에서, -T는 -N3 또는 -C≡CH이다. 이러한 기들은 화합물 (II) 또는 (IV)에 각각 존재하는, -C≡CH 또는 -N3과의 반응에 적합하다.
A-
컨쥬게이트는 세포 내로 전달하기 위한 활성 제제를 함유한다. -A 기는 활성 제제의 래디칼로서, 활성 제제로부터 수소 래디칼을 제거함으로써 형식적으로(반드시 실제로 그런 것은 아님) 유래할 수 있다.
활성 제제는 치료 방법에 사용하기 위한 제제와 같은 생물학적 활성 제제일 수 있다. 예를 들어, 활성 제제가 작은 유기 분자인 경우, 활성 제제는 분자량이 1,000 Da 이하, 예를 들어 500 Da 이하일 수 있으며, 소약물이라 칭할 수 있다. 선택적으로, 활성제는 분자량이 150 Da 이상, 예를 들어 175 Da 이상, 예를 들어 200 Da 이상이다.
활성 제제는 하기 구조물에 부착되지 않은 때조차 생물학적으로 활성적일 수 있다:
Figure pct00023
식 중 -RA, -RB, -RT1, -RT2 -R1 -R2, -R3, 및 -D-는 상기 정의한 바와 같다 (즉, 판토텐산기와 컨쥬게이트되지 않은 활성 제제).
활성 제제는 미생물, 예를 들어 세균 감염을 치료하는데 적합한 화합물일 수 있다.
활성 제제는 기생충 감염을 치료하는데 적합한 화합물일 수 있다.
활성 제제는 선충 또는 벌레, 예를 들어 편충, 감염을 치료하는데 적합한 화합물일 수 있다.
활성 제제는 미코박테리움 감염, 에스케리치아 감염, 스타필로코커스 감염 또는 엔테로코커스 감염을 치료하는데 적합한 화합물일 수 있다.
활성 제제는 플라스모디움 감염, 트리파노조마 감염, 테일레리아 감염, 또는 바베시아 감염, 및 추가적으로 또는 대안적으로, 피토프로라 감염, 크리티디아 감염, 또는 로트마리아 감염을 치료하는데 적합한 화합물일 수 있다.
활성 제제는 씨노랩디티스 감염 또는 헤몬쿠스 감염을 치료하는데 적합한 화합물일 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트에서, 활성 제제는 판토텐산 또는 그의 유도체가 아닌 것으로 예상된다. 따라서, 일 구체예에서, -A는 판토텐산기가 아니며, 따라서 -A는 하기 구조를 갖지 않는다:
Figure pct00024
식 중 -RA, -RB, -RT1, -RT2 -R1 -R2, -R3, 및 -D-는 상기 정의한 바와 같다.
따라서, 일 구체예에서, 컨쥬게이트는 판토텐산기의 이량체가 아니다.
-A 기는 염료, 예를 들어 유기 염료일 수 있다.
일 구체예에서, 염료는 형광 염료이다.
일 구체예에서, -A는 형광 염료가 아니다.
활성 제제는 폴리펩타이드, 예를 들어 단백질일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다.
활성 제제는 폴리뉴클레오타이드일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다.
활성 제제는 다당류일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다.
또한, 다당류는 이당류 또는 삼당류, 또는 3개 이상의 당(saccharide) 유닛을 갖는 다당류일 수 있다. 일 구체예에서, 활성 제제는 이당류가 아닐 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트는 제제를 원하는 위치, 예를 들어 세포 내로 전달하는데 사용된다.
이러한 제제는 특히 제한되지 않으며, 특정 위치에 존재하는 것이 소망되는 제제이면 어느 것이든 무방하다.
이러한 제제는 치료 방법 또는 진단 방법에 사용되기 위한 활성 제제일 수 있다.
일반적으로, 활성 제제는 링커와 공유 연결을 형성하기 위한 관능기를 가질 수 있다. 따라서, 활성 제제는 -OH, -SH, -NH2, -NHRN, -COOH, -COH, -COORC, -N3, -C=CH2, -C≡CH 및 말레이미딜로부터 선택된 하나 이상의 기를 가질 수 있다.
예컨대, 티올-함유 (-SH) 활성 제제, 예를 들어 시스테인-함유 폴리펩타이드는, 링커 전구체, 예를 들어 화합물 (III) 또는 (IV) 상에서 말레이미드기에 대한 연결을 형성할 수 있다.
활성 제제는 판토텐산기에 대한 공유 연결 형성을 위한 특별한 관능기를 병합하도록 개질될 수 있다.
활성
본 발명의 컨쥬게이트는 병원체, 예를 들어 세균 및 선충에 대한 활성을 가질 수 있다. 여기서, 본 발명의 컨쥬게이트에는 요구되는 생물학적 활성을 갖는 활성 제제가 일반적으로 제공된다.
본 발명의 화합물은 예를 들어 다음에 상세히 설명되는 치료 방법에 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 컨쥬게이트는 미처리 집단에 비해 또는 활성 제제 단독(즉, 판토텐산기와 컨쥬게이트되지 않은 활성 제제)에 비해, 기생충혈증(parasitemia)을 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 70, 적어도 80, 또는 적어도 90%까지 감소시킬 수 있다.
기생충혈증은 기생충 집단의 초기 치료로부터 예컨대, 48 h 또는 72 h에 결정될 수 있다.
기생충은 플라스모디움 기생충, 예를 들어 P. 팔시파룸, 또는 테일레리아 기생충, 예를 들어 T.아눌라타일 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 기생충은 후술하는 바와 같은 기생충일 수 있다.
기생충은 아피콤플렉산 또는 키네티도플라스티드일 수 있다.
기생충은 테일레리아 기생충, 예를 들어 T.아눌라타 및 T. 파르바, 또는 피토프로라 기생충, 예를 들어 P. 신나모미 및 P. 아가티디시다, 또는 바베시아 기생충, 예를 들어 B. 보비스, 또는 크리티디아 기생충, 예를 들어 C. 봄비, 또는 로트마리아 기생충, 예를 들어 L.　파씸, 또는 톡소플라즈마 기생충, 예를 들어 T. 곤디이일 수 있다.
기생충은 또한 플라스모디움 기생충, 예를 들어 P. 비박스, P. 오발레, P. 말라리아 및 P. 놀레시, 또는 트리파노조마 기생충, 예를 들어 T. 브루세이일 수 있다.
기생충은 플라스모디움 기생충, 예를 들어 P. 팔시파룸일 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트는 항미생물 또는 항연충(anthelmintic) 활성을 갖는 화합물일 수 있다.
일 구체예에서, 컨쥬게이트는 MIC로 측정시 최대 150 μM, 최대 100 μM, 최대 50 μM, 최대 25 μM, 최대 10 μM 또는 최대 5 μM의 항균 활성을 가질 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 컨쥬게이트는 예를 들어, 후술하는 바와 같은 세균에 대한 항균 활성을 갖는 화합물일 수 있다.
세균은 미코세균 세균, 예를 들어 M. 투베르클로시스일 수 있다.
세균은 엔테로코커스 세균, 예를 들어 E. 페칼리스일 수 있다.
세균은 에스케리치아 세균, 예를 들어 대장균, 또는 스타필로코커스 세균, 예를 들어 S. 아우레우스일 수 있다.
항미생물 및 항연충 활성은 본 명세서에 설명된 분석법을 이용하여 구할 수 있다.
일 구체예에서, 컨쥬게이트는 LC50으로 측정시, 최대 10.0 ㎍/mL, 최대 5.0 ㎍/mL, 최대 2.0 ㎍/mL, 최대 1.0 ㎍/mL, 최대 0.5 ㎍/mL, 또는 최대 0.1 μg/mL의 항연충 활성을 가질 수 있다.
이에 더해, 연충(helminth)은 선충 또는 벌레, 예를 들어 편충일 수 있다. 선충 또는 벌레는 씨노랩디티스 선충, 예를 들어 C. 엘레강스, 또는 헤몬쿠스 선충, 예를 들어 H. 콘토르투스, 또는 시스토조마 편충, 예를 들어 S. 헤마토비움일 수 있다.
활성 제제는 생물학적 활성을 가질 수 있으며, 활성 제제가 단독으로(즉, 판토텐산기와 컨쥬게이트되지 않은 활성 제제) 사용될 경우, 상기 컨쥬게이트와 관련하여 설명된 항기생충, 항미생물 또는 항연충 활성을 가질 수 있다. 그러나, 활성 제제가 표적 유기체의 세포 내로 확실히 전달되도록 함으로써 활성 제제의 생물학적 활성을 증가시키기 위해 컨쥬게이트를 제공하는 것이 본 발명의 특징이다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에서 활성 제제를 함유하는 컨쥬게이트는 단독으로 사용된 활성 제제에 비해 향상된 활성을 갖는다.
본 발명의 컨쥬게이트는 독성이 낮을 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트로 처리된 인간 배아 신장 세포주의 생존율 백분율에 대해 측정된 컨쥬게이트의 독성은 40% 이하, 예를 들어 30% 이하, 예를 들어 20% 이하, 예를 들어 10% 이하일 수 있다. 화합물은 100 μM의 농도로 사용될 수 있다.
염, 용매화합물 및 기타 형태
본 발명의 화합물, 예를 들어 화학식 (I)의 컨쥬게이트의 염의 예로는, 약학적으로 허용가능한 모든 염, 예를 들어 아무 제한 없이, HCl 및 HBr 염과 같은 강 무기산의 산 부가염 및 메탄설폰산염과 같은 강 유기산의 부가염을 들 수 있다. 염의 추가 예로는 설페이트 및 아세테이트 예를 들어 트리플루오로아세테이트 또는 트리클로로아세테이트를 들 수 있다.
화학식 (I)의 화합물은 또한 전구약물로서 제형화될 수 있다. 전구약물은 생물학적 활성 화합물을 유리시키기 위해, 하나 이상의 아미노기가 생체내에서 절단될 수 있는 기로 보호된, 본원에 기재된 항균 화합물을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 전구약물은 "아민 전구약물"이다. 아민 전구약물의 예로는, 예컨대, Bergen 등 [Antimicrob. Agents 및 Chemotherapy, 2006, 50, 1953]에 설명된 설포메틸 또는 예컨대 Schechter 등 [J.Med Chem 2002, 45(19) 4264]에 설명된 HSO3-FMOC, 및 이들의 염을 들 수 있다. 아민 전구약물의 또 다른 예가 Krise 및 Oliyai [Biotechnology: Pharmaceutical Aspects, 2007, 5(2), 101-131]에 설명되어 있다.
일 구체예에서 화학식 (I)의 화합물은 전구약물로서 제공된다.
본 발명의 화합물에 대한 언급은 그 화합물의 용매화물에 대한 언급이기도 하다. 용매화물의 예로는 수화물을 들 수 있다.
본 발명의 화합물은 원자가 자연발생 또는 비-자연발생 동위 원소로 대체된 화합물을 포함한다. 일 구체예에서 동위 원소는 안정한 동위 원소이다. 따라서, 여기에 기재된 화합물은 예컨대 중수소 함유 화합물 등을 포함한다. 예컨대, H는 1H, 2H (D), 및 3H (T)를 비롯한 임의의 동위원소 형태일 수 있고; C는 12C, 13C, 및 14C를 비롯한 임의의 동위원소 형태일 수 있으며; O는 16O 및 18O를 비롯한 임의의 동위원소 형태일 수 있다.
특정 화합물은 하나 이상의 특정 기하, 광학, 거울상 이성질체, 부분 입체 이성질체, 에피머, 아트로프, 입체 이성질체, 호변 이성질체, 입체 형태 또는 아노 머 형태로 존재할 수 있으며, 비제한적으로 시스-및 트랜스-형태; E- 및 Z- 형태; c-, t- 및 r- 형태; 엔도- 및 엑소-형태; R-, S- 및 메조 형태; D 형 및 L 형; d- 및 l- 형태; (+) 및 (-) 형태; 케토, 에놀 및 에놀레이트 형태; syn- 및 anti-형태; 향사형(synclinal form) 및 배사형(anticlinal form); α- 및 β- 형태; 축 및 적도 형태; 보트, 의자, 트위스트, 봉투 및 반의자 형태; 및 이들의 조합 형태로 존재할 수 있고, 이하 총칭하여 "이성질체"(또는 "이성질체 형태")라 칭한다.
호변이성질체 형태에 대한 후술 내용을 제외하고, 본 명세서에서 "이성질체"라는 용어로부터 구조(또는 구성) 이성질체 (즉, 공간 중 원자의 위치에 의해서가 아니라 원자들 간의 연결이 상이한 이성질체)는 특히 배제된다. 예컨대, 메톡시기 -OCH3에 대한 언급은 그의 구조 이성질체인 히드록시메틸기 -CH2OH에 대한 언급으로 해석되어서는 아니된다. 마찬가지로, 오르토-클로로페닐에 대한 언급은 그의 구조 이성질체인 메타-클로로페닐에 대한 언급으로 해석되어서는 아니된다. 그러나, 구조 클래스에 대한 언급은 그 클래스에 속하는 구조 이성질체 형태를 포함할 수 있다 (예컨대,　C1-6 알킬은 n-프로필 및 이소-프로필을 포함하고; 부틸은 n-, 이소-, sec-, 및 3차-부틸을 포함하며; 메톡시페닐은 오르토-, 메타-, 및 파라-메톡시페닐을 포함한다).
달리 명시하지 않는 한, 특정 화합물에 대한 언급은 이들의 혼합물 (예를 들어, 라세미 혼합물)을 비롯한 모든 이러한 이성질체 형태를 포함한다. 이러한 이성질체 형태의 제조 (예컨대 비대칭 합성) 및 분리 (예컨대 분별 결정화 및 크로마토그래피 수단) 방법은 당업계에 공지되어 있거나, 본원에서 교시된 방법 또는 공지된 방법을 공지된 방식으로 적용함으로써 용이하게 수득된다.
본원에 기재된 화합물은 보호된 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 예를 들어 합성 중에 또는 보관 동안 의도하지 않은 반응을 방지하기 위해 화합물 내의 하나 이상의 작용기에 보호기가 제공될 수 있다.
화학적으로 보호된 형태로 화합물을 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 바람직할 수 있다. 본원에서 사용된 "화학적으로 보호된 형태"라는 용어는, 하나 이상의 반응성 관능기가 바람직하지 않은 화학 반응으로부터 보호된, 즉 보호된 형태인 화합물 또는 보호기 (마스킹된 또는 마스킹 기, 또는 차단된 또는 차단 기로도 알려짐)에 관한다. 반응성 관능기를 보호함으로써, 보호기에 영향을 주지 않고 다른 비보호 반응성 관능기와 관련된 반응을 수행할 수 있다. 보호기는 일반적으로 분자의 나머지 부분에 실질적으로 영향을 주지 않고 후속 단계에서 제거될 수 있다. 참조, 예컨대, "Protective Groups in Organic Synthesis" (T. Green 및 P.　Wuts; 제3판; John Wiley 및 Sons, 1999).
예컨대, 아민기는 아미드 또는 우레탄으로서, 예컨대: 메틸 아미드 (-NHCO-CH3); 벤질옥시 아미드 (-NHCO-OCH2C6H5, -NH-Cbz)로서; t-부톡시 아미드 (-NHCO-OC(CH3)3, -NH-Boc)로서; 2-바이페닐-2-프로폭시 아미드 (-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5, -NH-Bpoc), 9-플루오레닐메톡시 아미드 (-NH-Fmoc)로서, 6-니트로베라트릴옥시 아미드 (-NH-Nvoc)로서, 2-트리메틸실릴에틸옥시 아미드 (-NH-Teoc)로서, 2,2,2-트리클로로에틸옥시 아미드 (-NH-Troc)로서, 알릴옥시 아미드 (-NH-Alloc)로서, 2(-페닐설포닐)에틸옥시 아미드 (-NH-Psec)로서; 또는 적절한 경우, N-옥사이드 (>NO·)로서 보호될 수 있다.
카복실산기는 에스테르로서 예컨대: C1-7 알킬 에스테르 (예컨대 메틸 에스테르; t-부틸 에스테르); C1-7 할로알킬 에스테르 (예컨대 C1-7 트리할로알킬 에스테르); 트리C1 -7 알킬실릴-C1-7 알킬 에스테르; 또는 C5-20 아릴-C1-7 알킬 에스테르 (예컨대 벤질 에스테르; 니트로벤질 에스테르)로서; 또는 아미드로서, 예컨대, 메틸 아미드로서 보호될 수 있다.
히드록실기는 에테르 (-OR) 또는 에스테르 (-OC(=O)R)로서, 예컨대: t-부틸 에테르; 벤질, 벤즈히드릴 (디페닐메틸), 또는 트리틸 (트리페닐메틸) 에테르; 트리메틸실릴 또는 t-부틸디메틸실릴 에테르; 또는 아세틸 에스테르 (-OC(=O)CH3, -OAc)로서 보호될 수 있다.
본 발명에 사용되기 위한 화합물은 -RA 및 -RB 각각이 수소인 1,3-디올 관능기를 가질 수 있다. 각각의 히드록실기는 독립적으로 에테르 또는 에스테르 형태로서 보호될 수 있다. 본 발명에서 디올은 또한 아세탈로서 보호될 수도 있다. 따라서, -RA 및 -RB는 -C(RC1)(RC2)-와 함께 6-원 고리를 형성하고, 여기서 각각 -RC1 및 -RC2는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선택된다.
알데히드기 또는 케톤기는 각각 아세탈 또는 케탈로서 보호될 수 있고, 여기서 카보닐기(>C=O)는 예컨대, 일차 알코올과의 반응에 의해 디에테르 (>C(OR)2)로 전환된다. 알데히드기 또는 케톤기는 산 존재 하에 과량의 물을 이용함으로써 쉽게 재생가능하다.
본 발명의 일 태양은 실질적으로 정제된 형태 및/또는 오염물질이 실질적으로 없는 형태의 화합물에 관한다.
일 구체예에서, 실질적으로 정제된 형태는 적어도 50 중량%, 예컨대, 적어도 60 중량%, 예컨대, 적어도 70 중량%, 예컨대, 적어도 80 중량%, 예컨대, 적어도 90 중량%, 예컨대, 적어도 95 중량%, 예컨대, 적어도 97 중량%, 예컨대, 적어도 98 중량%, 예컨대, 적어도 99 중량%이다.
달리 명시하지 않는 한, 실질적으로 정제된 형태는 임의의 입체 이성질체 또는 거울상 이성질체 형태의 화합물을 의미한다. 예를 들어, 일 구체예에서, 실질적으로 정제된 형태는 입체 이성질체의 혼합물, 즉 다른 화합물에 대해 정제된 것을 지칭한다. 일 구체예에서, 실질적으로 정제된 형태는 하나의 입체 이성질체, 예를 들어 광학적으로 순수한 입체 이성질체를 지칭한다. 일 구체예에서, 실질적으로 정제된 형태는 거울상 이성질체의 혼합물을 지칭한다. 일 구체예에서, 실질적으로 정제된 형태는 거울상 이성질체의 등몰(equimolar) 혼합물 (즉, 라세미 혼합물, 라세미체)을 의미한다. 일 구체예에서, 실질적으로 정제된 형태는 하나의 거울상 이성질체, 예를 들어 광학적으로 순수한 거울상 이성질체를 지칭한다.
일 구체예에서, 오염물질은 50 중량% 이하, 예를 들어 40 중량% 이하, 예를 들어 30 중량% 이하, 예를 들어 20 중량% 이하, 예를 들어 10 중량%, 예를 들어 5 중량% 이하, 예를 들어 3 중량% 이하, 예를 들어 2 중량% 이하, 예를 들어 1 중량% 이하이다.
달리 명시하지 않는 한, 오염물질은 입체 이성질체 또는 거울상 이성질체 이외의 다른 화합물을 의미한다. 일 구체예에서, 오염물질은 다른 화합물 및 다른 입체 이성질체를 지칭한다. 일 구체예에서, 오염물질은 다른 화합물 및 다른 거울상 이성질체를 지칭한다.
일 구체예에서, 실질적으로 정제된 형태는 적어도 60% 광학적으로 순수하며 (즉, 화합물의 60%는 몰 기준(molar basis)으로 원하는 입체 이성질체 또는 거울상 이성질체이고, 40%는 바람직하지 않은 입체 이성질체 또는 거울상 이성질체 임), 예를 들어, 광학적으로 적어도 70% 순수, 예를 들어 광학적으로 적어도 80% 순수, 예를 들어, 광학적으로 적어도 90%, 예를 들어, 광학적으로 적어도 95%, 예를 들면, 광학적으로 적어도 97%, 예를 들어, 광학적으로 적어도 98% 순수 예를 들어 광학적으로 99% 이상 순수하다.
컨쥬게이트의 제조 방법
본 발명은 또한 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 포함하는 본 발명의 컨쥬게이트의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예는 컨쥬게이트의 제조 방법을 설명하며, 이러한 방법은 화학식 (I)의 다른 컨쥬게이트의 제조에 적용가능하다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 판토텐산기를 취하고 이 관능기를 활성 제제와 반응시켜 컨쥬게이트를 형성한다. 컨쥬게이트가 링커를 함유하는 경우, 링커는 판토텐산기 또는 활성 제제에 부착될 수 있으며 링커는 둘 사이의 연결을 형성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일부 방법에서 판토텐산기에는 말레이미드기에서 종결되는 링커가 제공된다. 이 말레이미드기는 폴리펩타이드와 같은 활성 제제와 반응하여 컨쥬게이트를 형성하는 티올 관능기를 갖는다.
다른 방법에서, 판토텐산기와 활성제는 링커의 일부를 포함할 수 있고, 판토텐산 기와 활성제 사이의 반응은 완성된 연결기를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일부 방법에서 판토텐산기에는 아세틸렌기에서 종결되는 링커의 일부가 제공된다. 활성 제제에는 아지드기에서 종결되는 링커의 일부가 제공된다. 아세틸렌기는 클릭-화학 유형(click-chemistry type)의 반응으로 아지드기와 반응하여, 이미다졸을 형성하고, 이에 따라 판토텐산기와 활성제 사이에 링커가 생성된다.
판토텐산 유도체의 제조는 당업계에 기술되어있다. 이들 방법은 본 발명에서 사용하기 위해 개조될 수 있다.
본 발명의 방법은 화학식 (II), (III) 및 (IV)의 중간체 화합물, 및 임의로 화학식 (V)의 화합물 역시도 사용할 수 있다.
일 태양에서, 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 화합물을 활성제와 반응시켜 화학식 (I)의 화합물을 생성하는 단계를 포함한다.
여기서 활성제는 화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 화합물과의 반응을 위한 관능기를 갖는다. 예를 들어, 화학식 (III)의 화합물은 그 말단의 카복실산이다. 이 기는 활성제에 존재하는 히드록실, 티올 또는 아미노 관능기와 반응하여 에스테르, 티오 에스테르 또는 아미도 관능기를 갖는 컨쥬게이트를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 태양에서 본 발명의 컨쥬게이트를 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 화학식 (II)의 화합물을 화학식 (V)의 화합물과 반응시키는 단계를 포함한다.
여기서 활성제 (V)와 판토텐산기 (II) 양자 모두에는 링커의 일부가 제공되고, 상기 링커 부분에는 함께 반응하기 위한 적절한 작용기가 제공되어 완전한 링커를 형성하게 된다.
화학식 (II)의 화합물은:
Figure pct00025
이다.
식 중 -RT1, -RT2, -RA, -RB, -R1, -R2, -R3, -D-, 및 -X-는 화학식 (I)의 화합물에 대해 정의된 바와 같다;
-L1-은 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
-D1은 -OH, -SH, -SeH, -NH2, -NHRN, -COOH, -COH, -COORD, -N3, -C=CH2, -C=C(H)(Hal) 및 -C≡CH로부터 선택되고, 여기서 -RN 및 -RD는 각각 독립적으로 알킬이고, Hal은 할로겐이다. 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태.
따라서, 화학식 (II)의 화합물은 -L-이 알킬렌 또는 헤테로알킬렌기를 함유하는 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 제조하는데 적합하다.
화학식 (II)의 화합물은 -D1 기와의 반응을 위해 적절한 관능기가 제공된, 전술한 바와 같은 활성 제제와 직접 반응할 수 있다.
대안적으로, 화학식 (II)의 화합물은 예를 들어 화학식 (V)의 화합물과 같이, 링커 부분이 선택적으로 제공된 활성 제제와 반응할 수 있다.
화학식 (V)의 화합물은 다음과 같다:
Figure pct00026
식 중 -A는 활성 제제;
-L3-은 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
-T는 -OH, -SH, -SeH, -NH2, -NHRN, -COOH, -COH, -COORD, -N3, -C=CH2 및 -C≡CH로부터 선택되고 여기서 -RN 및 -RD는 각각 독립적으로 알킬로부터 선택된다
및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태.
따라서, -T 기는 화학식 (II)의 화합물의 -D1 기와의 반응을 위해 제공된다.
화합물 (II)와 화합물 (V)과의 반응은 활성 제제에 연결되거나, 또는 -T 및 -D1과의 반응으로부터 형성된 기를 통해 알킬렌 또는 헤테로알킬렌기에 연결된 알킬렌 또는 헤테로알킬렌기를 함유하는 링커를 갖는 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 제공한다.
대안적으로, 화학식 (III)의 화합물은 예를 들어 화학식 (V)의 화합물과 같은 링커 부분이 선택적으로 제공된 활성 제제와 반응할 수 있다.
화학식 (III)의 화합물은 다음과 같다:
Figure pct00027
식 중 -RT1, -RT2, -RA, -RB, -R1, -R2, -R3 및 -D-는 화학식 (I)의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태.
화학식 (V)의 화합물에서, -T 기는 카복실산과의 반응에 적합한 기이며. 예컨대, -T는 -OH, -SH, -NH2, 또는 -NHRN, 예를 들어 -NH2, 또는 -NHRN 예를 들어 -NH2이다.
화합물 (III)과 화합물 (V)의 반응은 활성제에 연결된 판토텐산기 또는 -T와 카복실기의 반응으로 형성된 기를 통해 알킬렌 또는 헤테로알킬렌기에 연결된 판토텐산기를 갖는 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 제공한다.
화학식 (III)의 화합물은 화학식 (II)의 화합물을 제조하는데 이용될 수 있다.
대안적으로, 화학식 (IV)의 화합물은 예를 들어 화학식 (V)의 화합물과 같은 링커 부분이 선택적으로 제공된 활성 제제와 반응할 수 있다.
화학식 (IV)의 화합물은 다음과 같다:
Figure pct00028
식 중 -RT1, -RT2, -RA, -RB, -R1, -R2, -R3, -D-, 및 -X- 화학식 (I)의 화합물에 대해 정의된 바와 같다;
-L1-은 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
-L2-는 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
-D2는 -OH, -SH, -SeH, -NH2, -NHRN, -COOH, -COH, -COORD 및 말레이미딜로부터 선택된다,
및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태.
전술한 방법은 표준 결합을 형성하는 공통 관능성의 반응을 기반으로 한다. 따라서 아미드 결합을 제공하는, 아미노와 카복실 작용기의 반응이 예상된다. 마찬가지로, 트리아졸 연결기를 제공하는, 아세틸렌과 아지드 관능기의 반응이 예상된다. 이러한 결합 형성을 달성하는 데 필요한 반응 조건은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 본 발명의 실시예에 예시적인 조건이 제공된다.
치료 방법
화학식 (I)의 화합물, 또는 이 화합물을 함유하는 제약 제형은 치료 및 예방 방법에 사용하기에 적합하다. 이 화합물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트는 세균 감염, 원생동물 감염과 같은 미생물 감염, 또는 연충 감염, 예컨대 선충 또는 벌레 감염, 예컨대 편충 감염과 같은 기생충의 치료 방법에 사용될 수 있다.
화학식 (I)의 컨쥬게이트는 치료에 의한 인간 또는 동물의 치료 방법에 사용된다. 본 발명의 일부 태양에서, 화학식 (I)의 화합물은 미생물 감염, 예를 들어 세균 감염을 치료하기 위해 인간과 같은 포유동물 대상체에 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 치료에 사용되는 의약을 제조하는데 사용의 제조를 위한 화학식 (I)의 화합물의 용도에 관한다. 일 구체예에서, 상기 의약은 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 포함한다. 일 구체예에서, 의약은 미생물 감염, 예를 들어 세균 감염을 치료하는데 사용된다.
일 구체예에서, 컨쥬게이트는 항연충제로 사용되는데 적합하다. 따라서, 컨쥬게이트는 연충 감염, 예를 들어 선충 또는 벌레 감염, 예를 들어 주혈흡충증(schistosomiasis)을 치료하는데 이용될 수 있다
추가적으로 또는 대안적으로, 컨쥬게이트는 헤몬쿠스 감염, 예를 들어 H. 콘토르투스 감염을 치료하는데 이용될 수 있다. 컨쥬게이트는 따라서 헤몬쿠스 감염(haemonchosis)을 치료하는데 이용될 수 있다. 치료 대상체는 포유동물, 예를 들어 양 또는 염소일 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 컨쥬게이트는 시스토조마 감염, 예를 들어 S. 헤마토비움 감염을 치료하는데 이용될 수 있다. 컨쥬게이트는 따라서 주혈흡충증을 치료하는데 이용될 수 있다. 치료 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
일 구체예에서, 벌레 감염을 치료하는데 사용되는 컨쥬게이트는 구조 Ie 또는 Il를 갖는다.
Figure pct00029
일 구체예에서, L은 화학식 (Id)의 화합물에 대해 정의된 바와 같은 링커이다. 일 구체예에서, -L2-는 C3 알킬렌이다. 바람직한 일 구체예에서, -L1-은 C2 알킬렌이고 -L2-는 C3 알킬렌이다.
일 구체예에서, 링커 -L-은 *-L3-G-LA-기이고,
여기서 별표는 -X-에의 부착 지점을 나타낸다;
-L3-는 알킬렌; 및
-G-는 말레이미드-유래된 기; 및
-LA-는 공유 결합이다.
바람직한 일 구체예에서, -L3-는 C3 알킬렌이다.
일 구체예에서, 컨쥬게이트는 에스케리치아 감염, 예를 들어 대장균 감염, 또는 스타필로코커스 감염, 예를 들어 S. 아우레우스 감염을 치료하는데 이용된다.
추가적으로 또는 대안적으로, the, 컨쥬게이트는 엔테로코커스 감염, 예를 들어 E. 페칼리스 감염을 치료하는데 이용된다.
일 구체예에서, 컨쥬게이트는 아피콤플렉스문(Apicomplexan ) 감염을 치료하는데 이용된다.
예컨대, 컨쥬게이트는 바베오시아, 예컨대 B. 보비스 감염을 치료하는데 이용될 수 있다. 컨쥬게이트는 따라서 바베시오시스(babesiosis)를 치료하는데 이용될 수 있다. 대상체는 소 대상체와 같은 포유동물일 수 있다.
일 구체예에서, 바베오시아 감염을 치료하는데 사용되는 컨쥬게이트는 구조 Ie 또는 Ii을 갖는다.
Figure pct00030
일 구체예에서, L은 화학식 (Id)의 화합물에 대해 정의된 바와 같은 링커이다. 일 구체예에서, -L2-는 C3 알킬렌이다. 바람직한 일 구체예에서, -L1-은 C2 알킬렌이고 -L2-는 C3 알킬렌이다.
일 구체예에서, 링커 -L-은 *-L3-G-LA-기이고,
여기서 별표는 -X-에의 부착 지점을 나타낸다;
-L3-는 알킬렌; 및
-G-는 말레이미드-유래된 기; 및
-LA-는 공유 결합이다.
바람직한 일 구체예에서, -L3-는 C5 알킬렌이다.
컨쥬게이트는 테일레리아 감염, 예를 들어 T.아눌라타 및 T. 파르바 감염을 치료하는데 이용될 수 잇다. 따라서 이 컨쥬게이트는 열대성 담낭증 및 이스트코스트 열병을 치료하는 데 사용할 수 있다. 치료를 위한 대상체는 소 또는 양과 같은 포유동물일 수 있다.
컨쥬게이트는 플라스모디움 감염, 예를 들어 P. 팔시파룸, P. 비박스, P. 오발레, P. 말라리아 및 P. 놀레시 감염을 치료하는데 이용될 수 있다. 컨쥬게이트는 따라서, 말라리아를 치료하는데 이용될 수 있다. 치료를 위한 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 컨쥬게이트는 피토프로라 감염, 예를 들어 P. 신나모미 및 P. 아가티디시다 감염을 치료하는데 이용될 수 있다. 컨쥬게이트는 따라서 카우리 다이백(kauri dieback)을 치료하는데 이용될 수 있다. 치료를 위한 대상체는 식물, 예를 들어 나무일 수 있다.
컨쥬게이트는 톡소플라즈마 감염, 예를 들어 T. 곤디이 감염을 치료하는데 이용될 수 있다. 컨쥬게이트는 따라서 톡소플라즈마증을 치료하는데 이용될 수 있다. 치료를 위한 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
컨쥬게이트는 키네토플라스티드(kinetoplastid) 감염, 예를 들어 트리파노조마 감염 예를 들어 트리파노조마 브루세이 감염을 치료하는데 이용될 수 있다. 컨쥬게이트는 따라서 수면병을 치료하는데 이용될 수 있다.
컨쥬게이트는 로트마리아 감염, 예를 들어 로트마리아 파씸 감염을 치료하는데 이용될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 컨쥬게이트는 크리티디아 감염, 예를 들어 C. 봄비 감염을 치료하는데 이용될 수 있다. 대상체는 따라서, 예를 들어 호박벌과 같은 벌일 수 있다.
일 구체예에서, 로트마리아 감염을 치료하는데 사용되는 컨쥬게이트는 구조식 If를 갖는다.
Figure pct00031
컨쥬게이트는 미코세균 감염, 예를 들어 미코세균 결핵 감염을 치료하는데 이용될 수 있다. 컨쥬게이트는 따라서 결핵을 치료하는데 이용될 수 있다.
일 구체예에서, 미코세균 감염을 치료하는데 사용되는 컨쥬게이트는 구조식 If를 갖는다
Figure pct00032
화학식 (I)의 컨쥬게이트는 제2 활성 제제와 연계하여 투여될 수 있다. 투여는 동시, 개별 또는 순차적일 수 있다.
투여 방법 및 방식은 컨쥬게이트 (I)의 화합물 및 제2 활성 제제의 약동학(pharmacokinetics)에 의존한다.
"동시" 투여라 함은, 화학식 (I)의 화합물 및 제2 활성 제제가 동일한 투여 경로에 의해 일회 용량으로 대상체에 투여됨을 의미한다.
"개별" 투여라 함은, 화학식 (I)의 화합물 및 제2 활성 제제가 두 가지 상이한 경로로 동시에 대상체에 투여됨을 의미한다. 이것은 예컨대 한 가지 제제는 주입에 의해 투여되고 다른 제제는 주입이 일어나는 동안 경구로 주어지는 방식으로 일어날 수 있다.
"순차"라 함은, 두 가지 제제가 상이한 시점에서 투여되는 것을 의미하되, 단, 제2 제제가 투여되는 시점에서 대상체에서 첫 번째로 투여된 제제의 활성이 존재하고 진행중임을 전제로 한다.
전달 방법
본 발명의 컨쥬게이트는 유기체의 세포를 비롯하여 유기체 내로 활성 제제를 전달하는 방법과 같은 전달 방법에 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 화학식 (I)의 컨쥬게이트와 같은 본 발명의 컨쥬게이트를 유기체에 노출시키고 컨쥬게이트가 유기체로 통과하도록 하는 단계를 포함한다.
유기체는 연충, 예를 들어 선충 또는 벌레일 수 있다. 선충 또는 벌레는 컨쥬게이트를 섭취할 수 있다. 선충 또는 벌레는 씨노랩디티스 선충, 예를 들어 씨노랩디티스 엘레강스 선충, 또는 헤몬쿠스 선충, 예를 들어 헤몬쿠스 콘토투스 선충, 또는 시스토조마 편충, 예를 들어 시스토조마 헤마토비움 편충일 수 있다.
더욱 바람직한 일 구체예에서, 유기체는 선충 또는 벌레이다.
추가적으로 또는 대안적으로, 유기체는 기생충일 수 있다. 기생충은 컨쥬게이트를 섭취할 수 있다. 기생충은 플라스모디움 기생충, 예를 들어 P. 팔시파룸, P. 비박스, P. 오발레, P. 말라리아 및 P. 놀레시, 또는 테일레리아 기생충, 예를 들어 T.아눌라타 및 T. 파르바, 또는 피토프로라 기생충, 예를 들어 P. 신나모미 및 P. 아가티디시다, 또는 바베시아 기생충, 예를 들어 B. 보비스, 또는 크리티디아 기생충, 예를 들어 C. 봄비, 또는 로트마리아 기생충, 예를 들어 L. 파씸, 또는 트리파노조마 기생충, 예를 들어 T. 브루세이, 또는 톡소플라즈마 기생충, 예를 들어 T. 곤디이일 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 유기체는 기생충이다.
유기체이 기생충인 경우, 기생충은 좋기로는 플라스모디움 기생충, 예를 들어 P. 비박스, P. 오발레, P. 말라리아 및 P. 놀레시, 또는 테일레리아 기생충, 예를 들어 T.아눌라타 및 T. 파르바, 또는 피토프로라 기생충, 예를 들어 P. 신나모미 및 P. 아가티디시다, 또는 바베시아 기생충, 예를 들어 B. 보비스, 또는 크리티디아 기생충, 예를 들어 C. 봄비, 또는 로트마리아 기생충, 예를 들어 L. 파씸, 또는 트리파노조마 기생충, 예를 들어 T. 브루세이, 또는 톡소플라즈마 기생충, 예를 들어 T. 곤디이이다.
유기체가 기생충인 경우, 기생충은 더욱 좋기로는 테일레리아 기생충, 예를 들어 T.아눌라타 및 T. 파르바, 또는 피토프로라 기생충, 예를 들어 P. 신나모미 및 P. 아가티디시다, 또는 바베시아 기생충, 예를 들어 B. 보비스, 또는 크리티디아 기생충, 예를 들어 C. 봄비, 또는 로트마리아 기생충, 예를 들어 L. 파씸, 또는 톡소플라즈마 기생충, 예를 들어 T. 곤디이이다.
유기체는 미생물, 예를 들어 세균일 수 있다. 미생물, 예를 들어 세균은 컨쥬게이트를 섭취할 수 있다. 미생물, 예를 들어 세균은, 미코세균 세균, 예를 들어 M. 투베르클로시스, 또는 에스케리치아 세균, 예를 들어 대장균, 또는 스타필로코커스 세균, 예를 들어 S. 아우레우스, 또는 엔테로코커스 세균, 예를 들어 E. 페칼리스일 수 있다.
유기체가 미생물, 예를 들어 세균인 경우, 미생물은 좋기로는 미코세균 세균, 예를 들어 M. 투베르클로시스, 또는 엔테로코커스 세균, 예를 들어 E. 페칼리스이다.
유기체가 미생물, 예를 들어 세균인 경우, 미생물은 더욱 좋기로는 미코세균 세균, 예를 들어 M. 투베르클로시스이다.
컨쥬게이트는 유기체의 세포벽을 통과할 수 있다.
유기체는 단세포 또는 다세포일 수 있다.
전달 방법은 생체내 또는 생체외에서 수행가능하다. 따라서, 유기체는 인간, 곤충 또는 동물 체내에 위치할 수 있고 또는 유기체는 인간, 곤충 또는 동물의 체외에 위치할 수 있다.
치료
본원에서 병태를 치료하는 맥락에서 "치료"라는 용어는 일반적으로 예를 들어, 병태 진행의 억제를 비롯한 일부 소망되는 치료 효과가 달성되는, 인간, 곤충, 또는 동물(예컨대 수의학적 적용에서)을 막론한 치료 또는 요법에 관한 것으로, 병태 진행 속도의 감소, 진행률의 중단, 병태의 증상 완화, 병태의 개선 및 병태의 치유가 이에 포함된다. 예방 조치 (예컨대 예방)로서의 치료도 포함된다. 예를 들어, 아직 병태가 발생하지 않았지만 병태가 발생할 위험이 있는 환자 또는 대상체에 대한 사용은 "치료"라는 용어에 포함된다.
본원에서 "치료적-유효량" 이라는 용어는, 소망되는 치료 요법에 따라 투여시, 합당한 이익/위험 비율에 상응하는, 어떤 소망되는 치료 효과를 생성하는 데 효과적인 화합물 또는 그 화합물을 포함하는 물질, 조성물 또는 투여 형태의 양에 관한 것이다.
용어 "치료"는 본원에 기재된 바와 같은 조합 치료 및 요법을 포함하며, 여기서 두 가지 이상의 치료 또는 요법이 예를 들어 순차적으로 또는 동시에 조합된다.
제형(Formulations)
일 태양에서, 본 발명은 담체와 같은 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 이러한 의약 조성물은 제2 활성제를 추가로 포함 할 수 있다. 치료에 사용하기 위해 제2 제제가 제공되는 대안적인 구체예에서, 제2 제제는 화학식 (I)의 화합물과 별도로 제형화될 수 있다. 따라서 화학식 (I)의 화합물과 관련하여 후술하는 설명은 별도로 제형화된, 제2 제제에도 적용될 수 있다.
화학식 (I)의 화합물은 단독으로 또는 제2 제제와 함께 투여되는 것이 가능하지만, 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 화학식 (I)의 화합물을, 당업자에게 잘 알려진 하나 이상의 다른 약학적으로 허용가능한 성분과 함께 포함하는 의약 제형(예컨대 조성물, 조제물, 의약)으로서 제공하는 것이 바람직하며, 여기서 상기 약학적으로 허용가능한 성분의 비제한적인 예로는, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제, 보조제, 충전제, 완충제, 방부제, 항산화제, 윤활제, 안정화제, 가용화제, 계면활성제 (예컨대 습윤제), 마스킹제, 착색제, 향료 및 감미료를 들 수 있다. 제형은 또한 다른 활성제, 예를 들어 다른 치료제 또는 예방제를 추가로 포함할 수도 있다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 의약 조성물, 및 상기 설명된 바와 같은 적어도 하나의 화학식 (I)의 화합물을 당업자에게 잘 알려진 하나 이상의 다른 약학적으로 허용가능한 성분, 예컨대, 담체, 희석제, 부형제, 등과 함께 혼합하는 것을 포함하는 의약 조성물의 제조 방법을 제공한다. 불연속 유닛 (예컨대, 정제, 등.)으로서 제형화될 경우, 각각의 유닛은 소정량(투여량)의 화합물을 함유한다. 조성물은 선택적으로 제2 활성 제제를 소정량으로 추가로 포함한다.
본원에서 "약학적으로 허용가능한"이라는 용어는, 건전한 의학적 판단 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제나 합병증 없이, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하며, 문제의 대상체(예컨대 인간)의 조직과 접촉시켜 사용되는데 적합한, 화합물, 성분, 물질, 조성물, 투여 형태에 관한 것이다. 각각의 담체, 희석제, 부형제, 등은 또한 제형의 다른 성분들과의 상용성 관점에서 "허용가능"하여야 한다.
적절한 담체, 희석제, 부형제, 등은 표준 제약 텍스트, 예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18판, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5판, 2005에서 찾아볼 수 있다.
제형은 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 방법은 화학식 (I)의 화합물을 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 화합물을 담체 (예컨대 액체 담체, 미분된 고체 담체 등)와 균일하고 밀접하게 결합시킨 다음, 필요한 경우 제품을 성형함으로써 제조된다.
제형은 신속하거나 느린 방출; 즉시, 지연, 시간제한 또는 지속 방출; 또는 이들의 조합 방식을 제공하도록 제조될 수 있다.
제형은 적절한 액체, 용액 (예컨대 수성, 비수성), 현탁액 (예컨대 수성, 비수성), 에멀젼 (예컨대 수중유, 유중수), 엘릭서, 시럽, 생약, 구강 청결제, 점적제, 정제 (예를 들어, 코팅된 정제 포함), 과립, 분말, 로젠지, 알약, 캡슐 (예를 들어, 경질 및 연질 젤라틴 캡슐 포함), 카슈, 알약, 앰플, 볼 루스, 좌약, 페서리, 팅크, 젤, 페이스트, 연고, 크림, 로션, 오일, 폼, 스프레이, 미스트 또는 에어로졸의 형태일 수 있다.
투여량(Dosage)
일반적으로, 본 발명의 방법은 생물학적 효과를 제공하기 위해 유효량의 화학식 (I)의 화합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
당업자라면 화학식 (I)의 화합물 및 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 조성물의 적절한 투여량이 환자마다 다를 수 있음을 인식할 것이다. 최적의 투여량을 결정하는 것은 일반적으로 위험 또는 유해한 부작용에 대한 치료적 이점 수준의 균형을 맞추는 것을 포함한다. 선택된 투여량 수준은 화학식 (I)의 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 조합에 사용된 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 병태의 중증도, 환자의 종, 성별, 나이, 체중, 병태, 일반적인 건강 상태 및 이전 병력을 포함 하나 이에 제한되지 않는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적으로 투여량은 실질적인 해롭거나 해로운 부작용을 일으킴이 없이 작용 부위에서 소망되는 효과를 달성하는 국소 농도가 달성되도록 선택될 것이지만, 화학식 (I)의 화합물의 양 및 투여 경로는 궁극적으로는 의사, 수의사, 양봉가 또는 임상의의 재량에 달려 있다.
투여는 치료 과정 전반에 걸쳐 연속 또는 간헐적으로 (예를 들어, 적절한 간격으로 분할된 용량으로) 1회 용량으로 수행될 수 있다. 가장 효과적인 투여 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 치료에 사용되는 제형, 치료 목적, 치료할 표적 세포(들) 및 치료 대상체에 따라 달라질 것이다. 치료 의사, 수의사 또는 임상의에 의해 선택된 용량 수준 및 패턴으로 단일 또는 다중 투여가 수행될 수 있다.
일반적으로, 화학식 (I)의 화합물의 적합한 용량은 하루에 대상체의 체중 킬로그램 당 약 10 μg 내지 약 250 mg (보다 전형적으로 약 100 μg 내지 약 25 mg) 범위이다. 화학식 (I)의 화합물이 염, 전구약물 등인 경우, 투여되는 양은 모 화합물을 기준으로 계산되므로 사용될 실제 중량은 이에 비례하여 증가한다.
투여 경로
화학식 (I)의 화합물 또는 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 의약 조성물은 전신/말초 또는 국소(즉, 원하는 작용 부위)에 상관없이 임의의 편리한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
투여 경로의 예로는 경구 (예를 들어, 섭취에 의함); 협측; 설하; 경피 (예컨대 패치, 석고 등 포함); 경점막 (예를 들어 패치, 석고 등 포함); 비강내 (예컨대 비강 스프레이에 의함); 안구 (예컨대 점안액 사용); 폐 (예를 들어, 입 또는 코를 통한 에어로졸을 통한 흡입 또는 흡입 요법에 의함); 직장 (예컨대 좌약 또는 관장에 의함); 질 (예컨대 페서리에 의함) 비경구, 예를 들어 피하, 피내, 근육내, 정맥내, 동맥내, 심장내, 척수강내, 척추내, 캡슐내, 피막하, 안와내, 복강내, 기관내, 피하, 관절내, 지주막 하 및 흉골내를 포함하는 주사에 의한 것; 예를 들어, 피하 또는 근육 내로 저장소 또는 저장소의 이식에 의한 것을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
대상체 /환자
대상체/환자는 척삭동물, 척추동물, 포유동물, 태반 포유동물, 유대류 (예컨대 캥거루, 웜뱃), 설치류 (예컨대 기니피그, 햄스터, 쥐, 마우스), 쥐과 (예를 들어 마우스), 라고모프 (예컨대 토끼), 조류 (예컨대 새), 개 (예컨대 개), 고양이 (예컨대 고양이), 말 (예컨대 말), 돼지 (예컨대 , 돼지), 양 (예컨대 양), 소 (예컨대 소), 영장류, 유인원 (예컨대 원숭이 또는 유인원), 원숭이 (예컨대 마모셋, 개코 원숭이), 유인원 (예컨대 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 긴팔 원숭이), 곤충 (예컨대 벌, 호박벌) 또는 인간일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 대상체/환자는 염소 (예컨대 염소)일 수 있다.
또한, 대상체/환자는 태아와 같은 발달 형태 중 하나일 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 컨쥬게이트가 포유동물 세포에 흡수되지 않을 수 있음을 발견했으며, 이는 발달중인 태아 내의 세포와 같이 빠르게 분열하는 포유동물 세포를 포함한다.
따라서, 본 발명의 컨쥬게이트는 임산부 및 임신하려는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 대상체/환자는 인간이다.
또한, 본 발명은 미생물 감염을 갖는 비인간 동물에 대해 실시될 수 있음이 예상된다. 인간이 아닌 포유동물은 설치류일 수 있다. 설치류에는 쥐, 생쥐, 기니피그, 친칠라 및 실험실 연구에 사용되는 기타 유사한 크기의 작은 설치류가 포함된다.
기타 선호사항
전술한 실시예들의 각각의 모든 호환 가능한 조합은 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 언급된 것처럼 여기에 명시적으로 개시된다.
본 발명의 다양한 추가 양태 및 구체예는 본 개시내용을 고려하여 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 서로를 포함하거나 포함하지 않는 2 개의 특정된 특징 또는 구성 요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 여기에서 개별적으로 설명된 것처럼 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 용어 "포함하는"은 "적어도 부분적으로 구성되는"을 의미한다. "포함하는(comprising)"이라는 용어를 포함하는 본 명세서 및 청구범위의 진술을 해석할 때, 각 설명에서 이 용어가 시작하는 특징 외에 다른 특징도 존재할 수 있다. "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"와 같은 관련 용어는 유사한 방식으로 해석되어야 한다.
외부 문서 또는 기타 정보 소스를 참조한 본 명세서에서, 이는 일반적으로 본 발명의 특징을 논의하기 위한 맥락을 제공하기 위한 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 그러한 외부 문서에 대한 참조는 그러한 문서 또는 그러한 정보 소스가 모든 관할권에서 선행 기술이거나 해당 기술에서 일반적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
문맥이 달리 지시하지 않는 한, 전술한 특징의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 측면 또는 구체예로 제한되지 않고 설명되는 모든 측면 및 구체예에 동일하게 적용된다. 기술적으로 적절한 구체예가 결합될 수 있고 따라서 본 개시는 본 명세서에 제공된 구체예의 모든 순열 및 조합으로 확장된다.
본 발명의 특정 태양 및 구체예를 이하에 실시예를 들어 그리고 전술한 도면을 참조로 설명한다.
실시예
하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위해 제공되며 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
일반적인 합성 방법
공기 민감 시약 및 무수 용매를 포함하는 반응을 오븐(130℃)에서 건조된 유리 제품에서 수행하였다. 이러한 반응은 아르곤 분위기를 사용하여 공기를 배제한 상태에서 수행되었다. 아세토니트릴, 디클로로메탄, 디에틸 에테르, 테트라히드로푸란 및 톨루엔을 Pure Solv 400-5MD 용매 정제 시스템(Innovative Technology, Inc.)을 통해 정제하였다. 달리 명시되지 않는 한 모든 시약은 받은 대로 사용되었다. Buchi Rotavapor를 사용하여 40℃에서 감압하에 용매를 증발시켰다.
마이크로웨이브 반응을 Biotage Initiator 시스템에서 수행하였다.
컬럼 크로마토그래피는 고정상으로 실리카겔(Fluoro Chem Silica LC 60A)을 사용하고 용리액으로 HPLC 등급 용매를 사용하여 가압 하에 수행하였다. 반응을 박층 크로마토그래피로 모니터링하였다. TLC는 실리카겔(Merck 또는 Fluorochem Silica Gel 60 F254)로 미리 코팅된 알루미늄 시트에서 수행되었다. UV 형광의 소광(lmax 254 nm) 및/또는 KMnO4 용액 또는 산성 에탄올성 아니스알데히드 딥으로 염색하여 플레이트를 가시화시켰다.
Proton Bruker DPX Avance400 기기 또는 Bruker AvanceIII500 기기를 사용하여 400MHz 및 100MHz 또는 500MHz 및 125MHz에서 양성자 자기 공명 스펙트럼(1H NMR) 및 탄소 자기 공명 스펙트럼(13C NMR)을 기록하였다. 화학적 이동(δ)은 백만분율(ppm)로 보고되며 잔류 용매 피크를 참조한다. 괄호 안의 인용 순서는 (i) 등가 핵의 수(적분에 의해), (ii) 다중도(s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, q = 사중선, m = 다중선, b = 광폭, dm = 이중 다중선 또는 이러한 용어의 조합) 및 (iii) 0.1Hz에 가장 가까운 헤르츠로 인용된 결합 상수(J)이다.
IR 스펙트럼은 유형 IIa 다이아몬드를 단일 반사 요소로 사용하는 Golden Gate™ 부착물을 사용하여 얻어졌다. 따라서 어떠한 샘플 준비 없이도 (Shimadzu FTIR- 8400) 화합물(고체 또는 액체)의 IR 스펙트럼을 직접 탐지(박층)할 수 있었다. 유의한 흡수만이 파수로 보고된다.
Shimadzu UV-3600 UV-Vis-NIR 분광 광도계를 사용하여 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 기록하였다. 경로 길이가 10mm이고 부피가 3mL인 Brand® UV-Cuvette UV-투명 분광 광도계 플라스틱 큐벳이 사용되었다. Shimadzu RF-5301 PC 분광 형광 광도계 및 Panorama 형광 1.1 소프트웨어를 사용하여 형광 방출 스펙트럼을 기록하였다.
고해상도 질량 스펙트럼은 전자 분무 및 화학 이온화에 의한 JEOL JMS-700 질량 분석계 또는 전자 분무 이온화에 의한 Bruker microTOFq 질량 분석계를 이용하여 Glasgow University의 화학 부서의 분석 그룹에 의해 기록되었다.
화합물 합성 - 중간체
(E)-2-(트리메틸실릴)에틸 3-(2,2,5,5- 테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트 및 (Z)-2-(트리메틸실릴)에틸 3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트
Figure pct00033
2-(트리메틸실릴)에틸-2-(트리페닐포스포라닐리덴)아세테이트 (0.84 g, 3.9 mmol)를 벤젠 (60 mL)에 용해시키고 N-포르밀-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (R-형 또는 S-형) (0.84 g, 3.9 mmol)를 첨가하였다. 용액을 80℃로 18 시간 가열한 다음 실온으로 냉각시켰다. 용매를 진공 제거하여 조물질(crude)을 황색 오일로서 얻었다. 이 조질물을 컬럼 크로마토그래피 (10-20% EtOAc/페트롤륨 에테르)로 정제하여 엔아미드 생성물을, 각각 황색 오일과 백색 고체의 시스(0.46g, 33%) 및 트랜스(0.75g, 54%) 이성질체의 분리 가능한 혼합물로서 수득하였다. 이 화합물에 대해 얻은 NMR 데이터는 이 화합물에 대한 문헌 데이터와 일치한다.
Sewell 등도 참조할 것.
(E)-형: 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 8.38 (1H, d, J = 11.8 Hz), 7.97 (1H, dd, J = 14.2, 11.8 Hz), 5.59 (1H, d, J = 14.2 Hz), 4.24-4.18 (2H, m), 4.20 (1H, s), 3.72 (1H, d, J = 11.8 Hz), 3.32 (1H, d, J = 11.8 Hz), 1.52 (3H, s), 1.46 (3H, s), 1.06 (3H, s), 1.02 (2H, t, J = 8.4 Hz), 1.01 (3H, s), 0.05 (9H, s); 13C NMR (CDCl3, 125　MHz) δ: 169.4, 168.7, 137.2, 104.7, 100.0, 78.7, 72.2, 63.9, 34.9, 30.9, 23.3, 20.3, 20.1, 18.8, 0.0; IR nmax(필름)/cm-1 3295, 2957, 2897, 1688, 1638, 1476; HRMS (CI) C17H32O5NSi (M+H)+ 계산치: m/z 358.2050, 실측치 m/z 358.2052; mp 126-127℃.
R-형: [α]D +58.9 (c = 1.1, CHCl3, T = 22.5℃).
S-형: [α]D -56.7 (c = 0.6, CHCl3, T = 21.6℃).
(Z)-형: 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 11.08 (1H, d, J = 11.6 Hz), 7.40 (1H, dd, J = 11.6, 9.0 Hz), 5.15 (1H, d, J = 8.9 Hz), 4.26-4.20 (2H, m), 4.21 (1H, s), 3.72 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.32 (1H, d, J = 11.6 Hz), 1.59 (3H, s), 1.47 (3H, s), 1.05 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.02 (2H, m), 0.05 (9H, s); 13C NMR (CDCl3, 125　MHz) δ: 170.2, 169.8, 137.3, 100.8, 99.8, 79.1, 72.8, 63.7, 34.8, 30.8, 23.4, 20.5, 20.1, 18.9, 0.0; IR nmax(필름)/cm-1 3331, 2959, 2858,1680, 1628, 1478; HRMS (CI) C17H32O5NSi (M+H)+ 계산치: m/z 358.2050, 실측치 m/z 358.2054.
R-형: [α]D +40.5 (c = 1.0, CHCl3, T = 22.5℃).
S-형: [α]D -38.0 (c = 0.8, CHCl3, T = 22.5℃).
(E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산
Figure pct00034
이 화합물 역시도 Sewell 등에 공지되어 있다 (참조: 화합물 11).
(E)-2-(트리메틸실릴)에틸 3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트 (R-형 또는 S-형) (110 mg, 0.310 mmol)를 THF (20 mL)에 용해시키고 0℃로 냉각한 다음 TBAF (THF 중 0.370 mL의 1 M 용액, 0.370 mmol)에 첨가하였다. 얻어진 담황색 용액을 실온으로 승온시키면서 16 시간 동안 교반한 다음 반응 혼합물을 진공 농축하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-2% MeOH/CH2Cl2) 산 생성물을 TBAF 불순물과의 혼합물로서 수득하였다. 이 조질의 생성물을 EtOAc (10 mL) 및 물 (10 mL)에 용해시킨 다음 용액의 pH가 12가될 때까지1 M 수성 NaOH를 첨가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 1 시간 교반한 다음 수성층을 수집하고 EtOAc (15 mL)로 희석한 다음 pH가 5가될 때까지 1 M HCl을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 다시 1 시간 교반한 후 층들을 분리하고 수성상을 EtOAc (2 Х 10 mL)로 추출하였다. 유기층을 한데 모아 염수 (20 mL)로 세척하고, 건조 (Na2SO4) 및 여과한 후 용매를 진공 제거하여 산 생성물 (64 mg, 79%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ: 7.95 (1H, d, J = 14.3 Hz), 5.86 (1H, J = 14.3 Hz), 4.31 (1H, s), 3.80 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.32 (1H, d, J = 11.6 Hz), 1.53 (3H, s), 1.45 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.03 (3H, s); 13C NMR (CD3OD, 100 MHz) δ: 171.5, 170.9, 138.5, 104.0, 100.8, 78.6, 72.2, 34.3, 29.5, 22.1, 19.3, 19.0; IR nmax(필름)/cm-1 3318, 3094, 2963, 2878, 1670, 1636; HRMS (CI) C12H20O5N (M+H)+ 계산치: m/z 258.1341, 실측치 m/z 258.1346; mp 185-186℃.
R-형: [α]D +81.3 (c = 0.5, CHCl3, T = 22.7℃).
S-형: [α]D -77.6 (c = 1.2, CHCl3, T = 22.8℃).
(Z)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산
Figure pct00035
(Z)-2-(트리메틸실릴)에틸 3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트 (R-형 또는 S-형) (310 mg, 0.868 mmol)을 THF (6 mL) 및 물 (0.150 mL)의 혼합물에 용해시킨 다음 0℃로 냉각하였다. TBAF (THF 중 1.30 mL의 1 M 용액, 1.30　mmol)를 시린지를 통해 0℃에서 첨가한 다음 실온에서 16시간 방치하였다. 이어서 용매를 진공 제거하여 조질의 생성물을 담황색 오일로서 수득하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-2% MeOH/CH2Cl2) 목적하는 산 생성물 (178 mg, 80%)을 무색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 11.25, (1H, d, J = 11.8 Hz), 7.54 (1H, dd, J = 11.8, 8.8 Hz), 5.22 (1H, d, J = 8.9 Hz), 4.21 (1H, s), 3.73 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.33 (1H, d, J = 11.7 Hz), 1.53 (3H, s), 1.46 (3H, s), 1.05 (3H, s), 1.03 (3H, s); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 173.6, 168.8, 138.6, 99.3, 96.6, 77.2, 71.2, 33.2, 29.2, 21.8, 19.0, 18.6; IR nmax(필름)/cm-1 3302, 2993, 2940, 2870, 1678, 1601; HRMS (CI) C12H20O5N (M+H)+ 계산치: m/z 258.1341, 실측치 m/z 258.1339.
R-형: [α]D +51.0 (c = 0.5, CHCl3, T = 22.7℃).
S-형: [α]D -47.1 (c = 0.8, CHCl3, T = 21.7℃).
(Z)-3-(2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미도)아크릴산
Figure pct00036
(Z)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (R-형 또는 S-형) (40 mg, 0.160　mmol)을 H2O (50 μL) 및 MeCN (1 mL) 중 BiCl3 (5 mg, 16　μmol)로 처리하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-5% MeOH/CH2Cl2) 디올 생성물 (9 mg, 26%)을 무색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 7.43 (1H, d, J = 8.9 Hz), 5.17 (1H, d, J = 8.9 Hz), 4.05 (1H, s), 3.49 (1H, d, J = 10.9 Hz), 3.41 (1H, d, J = 10.9 Hz), 0.94 (3H, s), 0.93 (3H, s); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 174.6, 171.4, 137.3, 98.8, 76.8, 69.8, 40.8, 21.3, 20.5; IR nmax(필름)/cm-1 3306, 2967, 2940, 2832, 1670; HRMS (CI) C9H15O5N (M+H)+ 계산치: m/z 218.1028, 실측치 m/z 218.1029.
R-형은 공지되어 있다.
S-형: [α]D -30.8 (c = 1.4, MeOH, T = 25.5℃).
(E)-N-(3-(3-히드록시프로필아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00037
(E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (50 mg, 0.195　mmol)을 CH2Cl2 (0.5 mL)에 용해하고 얻어진 용액을 HBTU (110　mg, 0.290 mmol), 3-아미노-프로판-1-올 (22 μL, 0.290 mmol) 및 DIPEA (51 μL, 0.290 mmol)로 처리하였다. 얻어진 용액을 80℃ 마이크로웨이브 조건 하에 2.5시간 동안 가열한 다음 용매를 진공 제거하여 조질의 생성물을 얻었다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-5% MeOH/EtOAc) 판토텐아미드 생성물 (20 mg, 33%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 8.35 (1H, d, J = 10.8 Hz), 7.80 (1H, dd, J = 13.8, 10.8, Hz), 5.98 (1H, t, J = 6.0 Hz), 5.86 (1H, d, J = 13.8 Hz), 4.20 (1H, s), 3.73 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.66-3.63 (2H, m), 3.53-3.48 (3H, m), 3.33 (1H, d, J = 11.7 Hz), 1.74-1.69 (2H, m), 1.52 (3H, s), 1.47 (3H, s), 1.06 (3H, s), 1.01 (3H, s); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 168.2, 167.5, 133.3, 105.7, 99.5, 77.3, 71.3, 59.2, 36.3, 33.4, 32.5, 29.5, 21.9, 18.8, 18.7; IR nmax(필름)/cm-1 3275, 2998, 2953, 2876, 1705, 1659; HRMS (CI) C15H27O5N2 (M+H)+ 계산치: m/z 315.1920, 실측치 m/z 315.1917; m.p. 165-166℃.
(Z)-N-(3-(3-히드록시프로필아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00038
(I)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (50 mg, 0.195　mmol)을, 전술한 대응하는 (E)-형에 대한 합성 공정에 따라 BTFFH (92　mg, 0.290 mmol), 3-아미노-프로판-1-올 (22 μL, 0.290 mmol) 및 DIPEA (51 μL, 0.290　mmol)로 처리하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-5% MeOH/EtOAc) 판토텐아미드 생성물 (31 mg, 57%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2CO, 500 MHz) δ: 11.91 (1H, d, J = 11.1 Hz), 7.38 (1H, br s), 7.24 (1H, dd, J = 11.1, 8.9 Hz), 5.25 (1H, d, J = 8.9 Hz), 4.28 (1H, s), 3.87 (1H, br s), 3.81 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.58 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.41-3.35 (2H, m), 3.31 (1H, d, J = 11.6 Hz), 1.70-1.65 (2H, m), 1.60 (3H, s), 1.50 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.00 (3H, s); 13C NMR ((CD3)2CO), 125 MHz) δ: 169.3, 169.0, 133.3, 101.4, 99.7, 77.7, 71.6, 59.5, 36.3, 33.7, 33.5, 29.5, 22.0, 19.3, 19.0; IR μmax(필름)/cm-1 3243, 2974, 2930, 2842, 1672, 1612; HRMS (CI) C15H26O5N2 (M+H)+ 계산치: m/z 315.1918, 실측치 m/z 315.1920; m.p. 80-81℃.
(E)-N-(3-(5-히드록시펜틸아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00039
(E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (50 mg, 0.195　mmol)을 (E)-N-(3-(3-히드록시프로필아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드의 합성 공정에 따라 HBTU (110　mg, 0.290 mmol), 5-아미노-펜탄-1-올 (100 mg, 0.971 mmol) 및 DIPEA (51 μL, 0.290 mmol)로 처리하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-5% MeOH/EtOAc) 판토텐아미드 생성물 (12 mg, 18%)을 무색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.31 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.78 (1H, dd, J = 13.9, 11.0 Hz), 5.85 (1H, d, J = 13.9 Hz), 5.61 (1H, t, J = 5.4 Hz), 4.21 (1H, s), 3.74 (1H, d, J = 11.8 Hz), 3.67 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.39-3.34 (2H, m), 3.34 (1H, d, J = 11.8 Hz), 1.78 (1H, br s), 1.65-1.55 (4H, m), 1.53 (3H, s), 1.48 (3H, s), 1.48-1.41 (2H, m), 1.07 (3H, s), 1.02 (3H, s); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 168.2, 166.3, 132.8, 106.3, 99.5, 77.2, 71.3, 62.6, 39.4, 33.4, 32.2, 29.5, 29.4, 23.0, 21.9, 18.8, 18.7; IR nmax(필름)/cm-1 3264, 2991, 2934, 2868, 1701, 1661; HRMS (CI) C17H31O5N2 (M+H)+ 계산치: m/z 343.2238, 실측치 m/z 343.2233.
(Z)-N-(3-(5-히드록시펜틸아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00040
(Z)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (50 mg, 0.195　mmol)을, (E)-N-(3-(3-히드록시프로필아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드의 합성 공정에 따라 BTFFH (92　mg, 0.290 mmol), 5-아미노-펜탄-1-올 (30 mg, 0.290 mmol) 및 DIPEA (51 μL, 0.290　mmol)로 처리하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-5% MeOH/EtOAc) 판토텐아미드 생성물 (27 mg, 40%)을 무색 오일로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2CO, 400 MHz) δ: 11.92 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.27 (1H, br s), 7.22 (1H, dd, J = 11.0, 8.9 Hz), 5.24 (1H, d, J = 8.9 Hz), 4.27 (1H, s), 3.80 (1H, d, J = 11.8 Hz), 3.58-3.54 (2H, m), 3.29-3.24 (2H, m), 3.31 (1H, d, J = 11.8 Hz), 1.78 (1H, br s), 1.58-1.50 (4H, m), 1.52 (3H, s), 1.50 (3H, s), 1.46-1.40 (2H, m), 1.04 (3H, s), 1.00 (3H, s); 13C NMR ((CD3)2CO), 100 MHz) δ: 169.0, 168.6, 133.0, 101.8, 99.8, 77.8, 71.6, 62.3, 39.4, 33.7, 33.4, 30.2, 29.9, 24.1, 22.1, 19.4, 19.0; IR nmax(필름)/cm-1 3293, 2992, 2937, 2868, 1652, 1609; HRMS (CI) C17H31O5N2 (M+H)+ 계산치: m/z 343.2230, 실측치 m/z 343.2233.
(R,E)-N-(3-(부트-3-이닐아미노)-3--옥소프로프-1-에닐) -2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00041
(R,E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (100 mg, 0.389　mmol)을, (E)-N-(3-(3-히드록시프로필아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드의 합성 공정에 따라 BTFFH (184 mg, 0.584 mmol), 1-아미노-3-부틴 (46 μL, 0.584 mmol) 및 DIPEA (102 μL, 0.584 mmol)로 처리하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (50-60% EtOAc/페트롤륨 에테르) 판토텐아미드 생성물 (118 mg, 99%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2CO, 500 MHz) δ: 9.35 (1H, d, J = 11.1 Hz), 7.83 (1H, dd, J = 13.9, 11.1 Hz), 7.18 (1H, br s), 5.95 (1H, d, J = 13.9 Hz), 4.28 (1H, s), 3.78 (1H, d, J = 11.4 Hz), 3.40-3.36 (2H, m), 3.29 (1H, d, J = 10.6 Hz), 2.39 (2H, td, J = 6.9, 2.6 Hz), 2.36 (1H, t, J = 2.6 Hz), 1.47 (3H, s), 1.40 (3H, s), 1.03 (3H, s), 1.00 (3H, s). 13C NMR ((CD3)2CO), 125 MHz) δ: 169.3, 166.9, 133.8, 106.7, 100.0, 82.7, 77.9, 71.7, 70.7, 39.1, 33.9, 29.9, 22.1, 19.9, 19.2, 19.0; IR nmax(필름)/cm-1 3309, 3287, 2996, 2944, 2889, 2871, 1657, 1616; HMRS (EI) C16H24O4N2 M+ 계산치: m/z 308.1736, 실측치 m/z 308.1739; m.p. 153-154℃; [α]D +73.9 (c = 0.5, (CH3)2CO, T = 30.0℃).
(S,E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산로부터 유사한 방식으로 (S,E)-형을 제조할 수 있다. [α]D-65.5 (c = 1.1, (CH3)2CO, T = 24.4℃).
(R,E)-N-(3-(부트-3-이닐아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄-아미드
Figure pct00042
(R,E)-N-(3-(부트-3-이닐아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (110 mg, 0.357 mmol)을 MeCN (1 mL) 및 H2O (50　μL)의 혼합물에 용해시켰다. 이어서 BiCl3 (11 mg, 0.035 mmol)를 첨가하여, 유백색 현탁액을 얻고, 이를 실온에서 18시간 교반하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액 몇 방울로 반응 혼합물을 켄칭한 다음 셀라이트® 패드를 통해 여과시키고 이어서 EtOAc (10 mL)로 세척하였다. 용리액을 진공 농축하여 조질의 생성물을 얻었다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (5-7% MeOH/CH2Cl2) 디올 생성물 (49 mg, 51%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2CO, 400 MHz) δ: 9.55 (1H, d, J = 11.3 Hz), 7.87 (1H, dd, J = 14.0, 11.3 Hz), 7.27 (1H, br s), 6.00 (1H, d, J = 14.0 Hz), 4.09 (1H, d, J = 5.0 Hz), 4.03 (1H, t, J = 5.5 Hz), 3.56 (1H, br s), 3.49 (1H, dd, J = 10.5, 5.5 Hz), 3.43 (1H, dd, J = 10.6, 5.5 Hz), 3.41-3.35 (2H, m), 2.38 (2H, td, J = 6.9, 2.6 Hz), 2.37-2.35 (1H, m), 0.94 (3H, s), 0.93 (3H, s); 13C NMR ((CD3)2CO), 100 MHz) δ: 172.9, 167.1, 134.2, 106.2, 82.7, 77.5, 70.7, 70.4, 40.3, 39.2, 21.3, 20.7, 19.9; IR nmax(필름)/cm-1 3368, 3309, 3247, 2965, 2920, 2861, 1691, 1652; HMRS (EI) C13H19O4N2 (M-H)+ 계산치: m/z 267.1350, 실측치 m/z 267.1344; m.p. 171-172℃; [α]D +78.1 (c = 1.1, (CH3)2CO, T = 30.0℃).
(Z)-N-(3-(부트-3-인-1-일아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00043
(Z)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (R-형 또는 S-형) (125　mg, 0.49 mmol)을 자석 교반 막대와 함께 CH2Cl2 (1 mL) in 0.5-2 mL 마이크로웨이브 바이알 내 CH2Cl2 (1 mL)에 용해시켰다. BTFFH (233 mg, 0.74 mmol)를 첨가하고 이어서 DIPEA (150 μL, 0.74　mmol) 및 1-아미노-3-부틴 (61 μL, 0.74 mmol)을 마이크로피펫을 통해 첨가하였다. 바이알 뚜껑을 닫고 80℃ 마이크로웨이브 조건 하에서 2.5시간 동안 가열하였다. 이어서 용매를 진공 제거하여 조질물을 담황색 오일로서 수득하였다. 이를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (10-25% EtOAc/페트롤륨 에테르) 정제하여 알킨 생성물을 백색 고체 (110 mg, 73%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 11.66 (1H, d, J = 10.9 Hz), 7.31 (1H, dd, J = 10.9, 8.9 Hz), 5.74 (1H, br s), 5.03 (1H, d, J = 8.9 Hz), 4.20 (1H, s), 3.72 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.48 (2H, m), 3.32 (1H, d, J = 11.6 Hz), 2.44 (2H, dt, J = 6.5, 2.6 Hz), 2.03 (1H, t, J = 2.6 Hz), 1.61 (3H, s), 1.47 (3H, s), 1.05 (6H, s); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 168.9, 167.7, 133.7, 100.2, 99.3, 81.5, 77.3, 71.4, 70.2, 37.6, 33.3, 29.4, 21.9, 19.5, 19.1, 18.7; IR　vmax(필름)/cm-1 (neat)): 3294, 2955, 1656, 1467, 1249; HRMS (ESI) C16H23N2O4 (MH) 계산치: m/z 307.1663 실측치 m/z 307.1658; m.p. 122-125℃.
R-형: [α]D +20.6 (c = 1.0, (CH3)2CO, T =24.4℃).
S-형: [α]D -23.1 (c = 1.4, (CH3)2CO, T = 24.4℃).
(Z)-2-메틸-3-[((R)-2,2,5,5-테트라메틸-[1,3]디옥산-4-카보닐)-아미노]-아크릴산 에틸 에스테르, 및 (E)-2-메틸-3-[((R)-2,2,5,5-테트라메틸-[1,3]디옥산-4-카보닐)-아미노]-아크릴산 에틸 에스테르
Figure pct00044
Sewell 등에 의해 설명된 포르밀 화합물 9 (186　mg)를 벤젠 내 1-카베톡시에틸리덴 트리페닐포스포란 용액에 첨가하여 엔아미드 생성물 (175mg, 65%)을 E 및 Z 이성질체의 혼합물 (E:Z 비율 3:1)로서 수득하였다. 일반적인 공정에서, 벤젠 (10 mL) 중 포르밀 화합물 (1.0 mmol)의 용액을 에톡시카보닐메틸렌 트리페닐포스포란 (3.0 mmol)으로 처리하고 얻어진 혼합물을 95℃에서 19 시간 동안 가열하였다. TLC 분석에 의해 반응 종결이 확인되면, 용매를 진공 제거하였다. 이어서 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (실리카겔, 40-60 페트롤륨 에테르 중 10% 내지 30% EtOAc)로 정제하여 목적하는 엔아미드를 수득하였다.
Z-형: 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ: 10.90 (1H, bd, J = 12.4 Hz), 7.26 (1H, dd, J = 11.5, 1.3 Hz), 4.18 (2H, qd, J = 7.2, 1.4 Hz), 4.13 (1H, s), 3.66 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.26 (1H, d, J = 11.7 Hz), 1.79 (3H, d, J = 1.3 Hz), 1.51 (3H, s), 1.39 (3H, s), 1.25 (3H, t, J = 7.1 Hz), 0.98 (3H, s), 0.96 (3H, s). 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ: 167.6, 167.3, 131.3, 105.5, 98.2, 75.7, 70.4, 60.1, 32.2, 28.4, 20.9, 18.0, 17.6, 15.4, 13.4. IR max(필름)/cm-1 3410, 3036, 2992, 1695, 1652. HRMS C15H25O5N (M+) 계산치: 299.1733. 실측치 299.1735. [α]D +62.1 (c = 1.1, CHCl3).
E-형: 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ: 8.25 (1H, bd, J = 12.3 Hz), 7.86 (1H, dq, J = 12.3, 1.4 Hz), 4.14 (1H, s), 4.10 (2H, qd, J = 7.2, 1.2 Hz), 3.64 (1H, d, J = 11.8 Hz), 3.22 (1H, d, J = 11.8 Hz), 1.71 (3H, d, J = 1.4 Hz), 1.41 (3H, s), 1.39 (3H, s), 1.25 (3H, t, J = 7.1 Hz), 0.97 (3H, s), 0.91 (3H, s). 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ: 168.0, 167.4, 130.1, 109.2, 99.3, 77.2, 71.2, 60.5, 33.2, 29.4, 21.8, 18.8, 18.6, 14.4, 10.4. IR
Figure pct00045
max(필름)/cm-1 3410, 3028, 2992, 1695, 1652. HRMS C15H25O5N (M+) 계산치: 299.1733. 실측치 299.1735. [α]D +40.7 (c = 1.1, CHCl3).
(Z)-N-(2-브로모비닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00046
(브로모메틸)트리페닐포스포늄 브로마이드 (8.72 g, 20.0 mmol) 및 포타슘 3차-부톡사이드 (2.24 g, 20.0 mmol)를 10분 동안 진공 건조한 다음 플라스크를 0℃로 냉각하고 THF (40 mL)를 첨가하여 밝은 황색 현탁액을 얻었다. 혼합물을 1.5시간 교반한 다음 THF (5.0 mL) 중 N-포르밀-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (1.09 g, 5.0 mmol)의 용액을 첨가하고 실온이될 때까지 16 시간 동안 교반 방치하였다. 반응 혼합물을 헥산 (30 mL) 및 H2O (30 mL)로 희석한 후 여과하여 고체를 제거하였다. 수성 물질을 EtOAc (3 Х 30 mL)로 추출한 다음, 한데 모 유기물을 염수 (45 mL)로 세척하고, 건조 (Na2SO4), 여과하여 용매를 진공 제거하여 조질물을 갈색 오일로서 수득하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (5-10% EtOAc/페트롤륨 에테르) 디브로모 및 시스-브로모 엔아미드의 혼합물을 수득하였다. 이어서 혼합물을 EtOAc (20 mL)에 용해시켰다. Pd(PPh3)4 (288 mg, 0.249 mmol)를 첨가한 다음, Bu3SnH (0.670 mL, 2.49 mmol)를 첨가하고, 실온에서 16시간 교반 방치하였다. 혼합물을 헥산 (10 mL)으로 희석한 다음 셀라이트®를 통해 여과하고 용매를 진공 제거하여 조질물을 갈색 오일로서 수득하였다. 컬럼 크로마토그래피 (2-4% EtOAc/페트롤륨 에테르)하여 시스-브로모 엔아미드 (2 단계에 걸쳐 607 mg, 41%)를 담황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.61 (1H, d, J = 11.2 Hz), 7.37 (1H, dd, J = 11.2, 5.9 Hz), 5.58 (1H, d, J = 5.9 Hz), 4.20 (1H, s), 3.75 (1H, d, J = 11.8 Hz), 3.35 (1H, d, J = 11.8 Hz), 1.55 (3H, s), 1.49 (3H, s), 1.08 (3H, s), 1.06 (3H, s); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 167.3, 124.2, 99.3, 89.8, 77.2, 71.3, 33.2, 29.4, 21.9, 18.9, 18.7; IR nmax(필름)/cm-1 3390, 2993, 2959, 2872, 1699, 1643.
(Z)-N-(2-브로모비닐)-2,2,5,5-펜타메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00047
(브로모메틸)트리페닐포스포늄 브로마이드 (3.27 g, 7.50 mmol) 및 포타슘 3차-부톡사이드 (300 mg, 7.50 mmol)를 10분간 진공 건조한 후 플라스크를 0℃로 냉각하고 THF (10 mL)를 첨가하여 밝은 황색 현탁액을 얻었다. 혼합물을 1.5시간 교반한 후 THF (2.0 mL) 중 N-포르밀-N,2,2,5,5-펜타메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (345 mg,1.50 mmol) 용액을 첨가하고 16시간 동안 실온이될 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 헥산 (10 mL) 및 H2O (10 mL)로 희석한 후 여과하여 고체를 제거하였다. 수성 물질을 EtOAc (3 Х 15 mL)로 추출한 다음, 한데 모은 유기물을 염수 (20 mL)로 세척, 건조 (Na2SO4), 여과하고 용매를 진공 제거하여 조질의 생성물을 갈색 오일로서 수득하였다. 컬럼 크로마토그래피 (5-10% EtOAc/페트롤륨 에테르) 결과 디브로모 화합물 및 미식별 불순물의 혼합물이 얻어졌다. 이어서 혼합물을 EtOAc (5 mL)에 용해하였다. Pd(PPh3)4 (59 mg, 0.051 mmol), Bu3SnH (0.164 mL, 0.612 mmol)를 첨가한 후 실온에서 16시간 교반하였다. 혼합물을 헥산 (5 mL)으로 희석한 후 셀라이트®로 여과하고 진공하에 용매를 제거하여 조질의 생성물을 갈색 오일로서 수득하였다. 컬럼 크로마토그래피 (5-20% EtOAc/페트롤륨 에테르) 결과 시스-브로모 엔아미드 (두 단계에 걸쳐 97 mg, 21%)를 담황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.14 (1H, d, J = 5.5 Hz), 6.03 (1H, d, J = 5.9 Hz), 4.32 (1H, s), 3.61 (1H, d, J = 11.4 Hz), 3.31 (1H, d, J = 11.4 Hz), 3.13 (3H, s), 1.46 (3H, s), 1.42 (3H, s), 1.26 (3H, s), 0.90 (3H, s); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 167.1, 134.6, 99.5, 93.5, 77.2, 72.7, 33.7, 33.5, 29.4, 21.8, 19.4, 18.4; IR nmax(필름)/cm-1 3092, 2959, 2935, 2859, 1663.
(Z)-2,2,5,5-펜타메틸-N-(4-페닐부트-1-엔-3-이닐)-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00048
(Z)-N-(2-브로모비닐)-N,2,2,5,5-펜타메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (48 mg, 0.157　mmol)를 MeCN (1 mL)에 용해시킨 후 페닐아세틸렌 (35 μL, 0.314 mmol), Et3N (87 μL, 0.628 mmol), CuI (6 mg, 31 μmol) 및 마지막으로 Pd(PPh3)4 (18 mg, 16 μmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 교반한 후 20% EtOAc/헥산과 함께 셀라이트®를 통해 여과하여 조질물을 갈색 고체로서 수득하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (2-5% EtOAc/페트롤륨 에테르) 엔-인(ene-yne) 생성물 (29　mg, 59%)을 담황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz, 55℃) δ: 7.42-7.40 (2H, m), 7.33-7.30 (3H, m), 7.05 (1H, d, J = 8.7 Hz), 5.15 (1H, d, J = 8.7 Hz), 4.48 (1H, s), 3.65 (1H, d, J = 11.5 Hz), 3.55 (3H, br s), 3.35 (1H, d, J = 11.5 Hz), 1.48 (3H, s), 1.30 (3H, s), 0.94 (3H, s); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz, 55℃) δ: 167.8, 136.9, 131.1, 128.3, 128.2, 123.5, 99.6, 94.7, 93.2, 85.8, 76.6, 72.7, 34.2, 33.7, 29.1, 21.8, 19.2, 18.5; IR nmax(필름)/cm-1 2955, 2929, 2958, 2859, 1684, 1619.
화합물 합성 - 방사성 표지된 중간체
1,2-13C3-2-(트리메틸실릴)에틸 2-브로모아세테이트
Figure pct00049
13C2-브로모아세트산 (284) (890 mg, 6.41 mmol)을 CH2Cl2에 용해시키고 0℃로 냉각한 후 순차적으로 2-트리메틸실릴 에탄올 (1.83 mL, 12.8 mmol), 촉매량의 DMAP을 첨가하고 마지막으로 DCC(1.39 g, 6.73 mmol)를 수차례 나누어 첨가하였다. 얻어진 용액을 2 시간 동안 교반한 후 셀라이트® 베드를 통해 여과하였다. 셀라이트® 패드를 20% EtOAc/헥산 (200 mL)로 세척한 다음, 용리액을 NaHCO3 (150 mL) 포화수용액, 물 (150 mL) 및 염수 (150 mL)로 세척하였다. 이어서 용액을 건조 (Na2SO4)하고 용매를 진공 제거하여 조질의 생성물을 황색 오일로서 수득하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (2-4% EtOAc/헥산) 에스테르 생성물 (1.05 g, 68%)을 담황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 4.29-4.24 (2H, m), 4.00-3.61 (2H, dd, J = 152.8, 4.4 Hz), 1.07-1.00 (2H, m), 0.06 (9H, s); 13C NMR (CDCl3, 100MHz) δ: 172.6 (d, J = 49.0 Hz), 66.3, 27.6 (d, J = 49.0 Hz), 18.7, 0.0; IR nmax(필름)/cm-1 2955, 2899, 1693, 1249; HRMS (ESI) C5 13C2H15O2BrNaSi (M+Na)+ 계산치: m/z 262.9984, 실측치 m/z 262.9977.
1,2-13C2-2-(트리메틸실릴에톡시카보닐메틸) 트리페닐포스포늄 브로마이드
Figure pct00050
1,2-13C2-2-(트리메틸실릴)에틸 2-브로모아세테이트 (1.05 g, 4.38 mmol)를 톨루엔 (20 mL)에 용해시켰다. 트리페닐포스핀 (1.15 g, 4.38 mmol)을 첨가하고, 얻어진 용액을 실온에서 16시간 교반하였다. 이 시점에서, 반응 혼합물은 걸쭉한 백색 침전물이었다. 추가 10mL 분량의 톨루엔을 첨가한 후 초음파 처리하고 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 백색 침전물을 여과에 의해 수집하고 톨루엔 (2　Х 20 mL)으로 세척한 다음 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시켰다. 이 용액을 염수 (50　mL)로 세척하고, 건조 (Na2SO4) 및 진공 농축하여 포스포늄염 (1.42 g, 65%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.98-7.93 (6H, m), 7.85-7.80 (3H, m), 7.74-7.69 (6H, m), 5.83-5.44 (2H, ddd, J = 134.0, 17.0, 9.0 Hz), 4.12-4.07 (2H, m), 0.90-0.87 (2H, m), 0.00 (9H, s); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 166.5 (d, J = 57.5 Hz), 136.7, 135.7, 131.9, 67.1, 35.0 (d, J = 57.5 Hz), 18.8, 0.00; IR nmax(필름)/cm-1 3478, 3405, 2954, 2802, 1674; m.p. 90-91℃.
13C-1H-벤조트리아졸-1-카복스알데히드
Figure pct00051
무수 아세트산 (1.34 mL, 14.2 mmol) 및 13C-포름산 (0.800 mL, 21.3 mol)을 50℃에서 3 시간 가열하였다. 이 시점에서, 조 NMR 스펙트럼을 분석하여 13C1-아세트산 포름산 무수물의 질량비를 계산할 수 있었다. 이 경우, 9.94 mmoles의 혼합 무수물이 형성되었다. 벤조트리아졸 (1.06 g, 8.92 mmol)을 -10℃에서 THF (5 mL)에 용해시키고 얻어진 용액을 조질의 혼합된 무수물 혼합물로 시린지 첨가하여 처리하고 1 시간 동안 교반 방치하였다. 용매를 진공 제거하고 형성된 조질의 백색 고체를 CHCl3와 함께 공비(azeotroped)시켜 과량의 포름산을 제거하여 포르밀화된 생성물 (1.06 g, 99%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 10.08-9.54 (1H, d, J = 220.0 Hz), 8.28 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.18 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.73 (1H, ddd, J = 8.2, 7.2,1.0 Hz), 7.59 (1H, ddd, J = 8.2, 7.2,1.0, Hz); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 159.9, 146.5, 130.7, 129.9, 127.0, 120.4, 114.4; IR nmax(필름)/cm-1 3103, 1686, 1594; HRMS (EI) C6 13CH6ON3 (M+H)+ 계산치: m/z 148.0467, 실측치 m/z 147.0469; m.p. 93-94℃.
13C-(R)-N-포르밀-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00052
R)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (Han 등에 공지됨) (1.33 g, 7.12 mmol)를 THF (40 mL)에 용해시켰다. 용액을 0℃로 냉각하고 n-부틸리튬 (3.13 mL, 헥산 중 2.5 M, 7.83 mmol)을 시린지를 통해 서서히 첨가한 후 0℃에서 0.5시간 동안 교반 방치하였다. THF (10 mL) 중 13C-1H-벤조트리아졸-1-카복스알데히드 (1.16 g, 7.83 mmol)의 용액을 시린지를 통해 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반 방치시켰다. 반응 혼합물을 이소프로판올 (10 mL)로 희석한 후 NaHCO3 (50 mL) 포화수용액으로 세척하였다. 수성 물질을 분리하고 EtOAc (3 Х 50 mL) 추출한 후 한데 모은 유기물을 염수 (100 mL)로 세척, 건조 (Na2SO4), 여과 및 진공 농축하여 조질의 생성물을 담황색 고체로서 수득하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (10-20% EtOAc/페트롤륨 에테르) 정제하여 생성물 이미드 (1.20 g, 78%)를 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 9.38-8.96 (1H, dd, J = 193.5,10.4 Hz), 8.92 (1H, br s), 4.21 (1H, s), 3.73 (1H, d, J = 11.9 Hz), 3.35 (1H, d, J = 11.9 Hz), 1.50 (3H, s), 1.47 (3H, s), 1.08 (3H, s), 1.07 (3H, s); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 170.6, 161.4, 99.7, 77.1, 71.2, 33.4, 29.4, 21.7, 18.9, 18.6; IR nmax(필름)/cm-1 3264, 2994, 2960, 2882, 1724, 1657, 1457; HRMS (ESI) C9 13C1H17NO4Na M+ 계산치: m/z 239.1083, 실측치 m/z 239.1081; m.p. 130-131℃.
13C3-(R,E)-2-(트리메틸실릴)에틸 3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도) 아크릴레이트 및 13C3-(R,Z)-2-(트리메틸실릴)에틸 3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도) 아크릴레이트
Figure pct00053
1,2-13C2-2-(트리메틸실릴에톡시카보닐메틸) 트리페닐포스포늄 브로마이드 (1.42 g, 2.85　mmol)를 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시키고 수성 1 M NaOH (50 mL)와 함께 실온에서 2 시간 교반하였다. 이어서 유기층을 분리하고 진공 농축하여 조질의 트리메틸실릴 일리드(1.24 g)를 황색 오일로서 수득하였다. 조질의 일리드를 벤젠 (15 mL)에 용해시킨 후 13C-(R)-N-포르밀-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (425　mg, 1.84 mmol)를 첨가하였다. 그런 다음 얻어진 용액을 80℃에서 16시간 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 농축하고 이어서 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (5-20% EtOAc/페트롤륨 에테르) 시스 이성질체 (99 mg, 15%)를 황색 오일로서 수득하고, 이어서 트랜스 이성질체 (537 mg, 82%)를 백색 고체로서 수득하였다.
13C3-(R,E) -2-(트리메틸실릴)에틸 3-(2,2,5,5- 테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도) 아크릴레이트: 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 8.33 (1H, d, J = 11.5 Hz), 8.13-7.71 (1H, dddd, J = 177.0, 14.5, 11.5, 5.0 Hz), 5.70-5.34 (1H, dddd, J = 163.0, 14.5, 3.0, 1.5 Hz), 4.25-4.21 (2H, m), 4.17 (1H, s), 3.67 (1H, d, J = 11.8 Hz), 3.27 (1H, d, J = 11.8 Hz), 1.52 (3H, s), 1.46 (3H, s), 1.06 (3H, s), 1.02 (2H, t, J = 8.4 Hz), 1.01 (3H, s), 0.05 (9H, s); 13C NMR (CDCl3, 125MHz) δ: 169.4, 169.0 (dd, J = 79.5, 4.3 Hz), 137.5 (dd, J = 79.5, 4.3 Hz), 104.7 (dd, J = 79.5, 79.5 Hz), 101.0, 78.7, 72.7, 63.8, 34.9, 30.9, 23.3, 20.3, 20.1, 18.8, 0.0; IR nmax(필름)/cm-1 3306, 2955, 2899, 2874, 1708, 1649, 1476; HRMS (EI) C14 13C3H32O5NSi M+ 계산치: m/z 360.2073, 실측치 m/z 360.2064; m.p. 126-127℃.
13C3-(R,Z)-2-(트리메틸실릴)에틸 3-(2,2,5,5- 테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도) 아크릴레이트: 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 11.10 (1H, d, J = 11.6 Hz), 7.62-7.09 (1H, dm, J = 175.2 Hz), 5.32-4.86 (1H, ddm, J = 168.8, 9.2 Hz), 4.23 (2H, tm, J = 8.3 Hz), 4.21 (1H, s), 3.72 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.32 (1H, d, J = 11.6 Hz), 1.59 (3H, s), 1.47 (3H, s), 1.05 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.04-1.00 (2H, m), 0.05 (9H, s); 13C NMR (CDCl3, 100MHz) δ: 170.2, 169.8 (d, J = 75.4 Hz), 137.3 (d, J = 74.4 Hz), 100.8 (dd, J = 75.4, 74.4 Hz), 99.7, 78.7, 72.8, 63.7, 34.8, 30.8, 23.4, 20.5, 20.1, 18.9, 0.0; IR nmax(필름)/cm-1 3300, 2965, 2924, 2860, 1672, 1630, 1454; HRMS (EI) C14 13C3H32O5NSi M+ 계산치: m/z 360.2073, 실측치 m/z 360.2064.
13C3-(R,E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산
Figure pct00054
13C3-(R,E)-2-(트리메틸실릴)에틸 3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도) 아크릴레이트 (500 mg, 1.40 mmol)를 THF (10 mL)에 용해시켰다. 물 (0.200 mL)을 첨가한 후 시린지를 통해 TBAF (4.20 mL, 4.2 mmol, THF 중 1M 용액)를 첨가하고 얻어진 옅은 오렌지색 용액을 40℃에서 18시간 가열하였다. 반응 혼합물을 진공 농축하고 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (0-2% MeOH/CH2Cl2) 정제하여 불순한 백색 고체를 얻었다. 조질의 생성물을 EtOAc (25　mL)에 용해시키고 수성 1 M NaOH (25 mL)와 함께 1시간 동안 교반하였다. 수성 층을 모으고, EtOAc (50 mL)로 희석한 다음 수성 1 M HCl을 이용하여 pH 5로 산성화시켰다. 혼합물을 1시간 교반시켜 수성 층을 EtOAc (3 Х 25 mL)로 추출하였다. 한데 모은 유기물을 염수 (50 mL)로 세척, 건조 (Na2SO4), 여과 및 진공 농축하여 목적하는 산 (287 mg, 80%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 8.52 (1H, d, J = 11.8 Hz), 8.26-7.85 (1H, dddd, J = 176.5, 14.2, 11.8, 5.0 Hz), 5.76-5.40 (1H, ddm, J = 163.0, 14.2 Hz), 4.22 (1H, s), 3.71 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.32 (1H, d, J = 11.6 Hz), 1.55 (3H, s), 1.51 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.03 (3H, s); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 172.6, 172.9 (dd, J = 77.3, 4.4 Hz), 138.1 (dd, J = 77.1, 4.4 Hz), 101.8 (dd, J = 77.3, 77.1 Hz), 99.6, 77.2, 71.2, 33.4, 29.4, 21.8, 18.8, 18.7; IR nmax(필름)/cm-1 3315, 3085, 2995, 2880, 1695, 1668; HRMS (EI) C9 13C3H20O5N M+ 계산치: m/z 260.1365, 실측치 m/z 260.1364; m.p. 187-188℃.
13C3-(R,E)-3-(2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미도)아크릴산
Figure pct00055
13C3-(R,E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (100 mg, 0.389 mmol)을 MeCN (3 mL)에 용해시켰다. 물 (300 μL)을 첨가하고 이어서 BiCl3 (12 mg, 38 μmol)을 첨가하여, 백색 현탁액을 얻었다. 혼합물을 실온에서 16시간 교반한 후 소형 셀라이트® 패드를 통해 여과한 후 EtOAc (20　mL)로 세척하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 13C3-CJ-15,801을 무색 오일 (35 mg, 41%)로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2CO, 500 MHz) δ: 9.70 (1H, d, J = 10.5 Hz), 8.09-7.67 (1H, dddd, J = 174.0, 14.5, 10.5, 5.2 Hz), 5.87-5.51 (1H, ddm, J = 163.5, 14.5 Hz), 4.00 (1H, s), 3.38 (1H, d, J = 10.9 Hz), 3.31 (1H, d, J = 10.9 Hz), 0.82 (3H, s), 0.81 (3H, s); 13C NMR ((CD3)2CO, 125　MHz) δ: 173.1, 170.4 (dd, J = 76.7, 4.3 Hz), 138.5 (dd, J = 76.7, 4.3 Hz), 102.2 (dd, J = 76.7, 76.7 Hz), 77.4, 70.2, 40.3, 21.4, 20.5; IR nmax(필름)/cm-1 3295, 2964, 2836, 2878, 1642, 1584; HRMS (ESI) C6 13C3H15NO5Na (M+Na)+ 계산치: m/z 243.0943, 실측치 m/z 243.0940.
13C3-(R,E)-벤질 3- (2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미도)아크릴레이트
Figure pct00056
CH2Cl2 (3 mL) 중 13C3-(R,E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (100　mg, 0.389 mmol)의 용액을 0℃로 냉각한 후 순차적으로 벤질 아민 (30 μL, 0.291 mmol), 촉매량의 DMAP 및 DCC (21 mg, 0.101 mmol)를 첨가하였다. 얻어진 용액을 4시간 동안 0℃에서, 백색 침전물이 형성될 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트® 패드를 통해 여과한 다음 EtOAc (20 mL)로 세척하였다. 이어서 유기층을 NaHCO3 포화 수용액 (15　mL), H2O (15 mL) 및 염수 (15 mL)로 세척한 후, 건조 (Na2SO4), 여과 및 진공 농축하여 조질의 생성물을 백색 고체 (71 mg, 0.203 mmol)로서 수득하였다. 실패한(unsuccessful) 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한 후, 조질의 생성물을 MeCN (1.5 mL) 및 H2O (0.150 mL)의 혼합물에 용해시킨 다음 BiCl3 (6 mg, 19 μmol)를 첨가하여 유백색 현탁액을 얻고 이를 실온에서 16시간 교반하였다. 반응 혼합물에 NaHCO3 포화수용액을 몇 방울 떨어뜨려 켄칭하고 셀라이트® 패드를 통해 여과한 다음 EtOAc (10 mL)로 세척하였다. 용리액을 진공 농축하여 조질의 생성물을 무색 오일로서 수득하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (20-70% EtOAc/페트롤륨 에테르) 디올 생성물 (26 mg, 41%)을 무색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 9.03 (1H, d, J = 11.6 Hz), 8.29-7.77 (1H, dddd, J = 176.7, 13.8, 11.6, 4.9 Hz), 7.38-7.34 (5H, m), 5.89-5.41 (1H, ddm, J = 163.1, 13.8 Hz), 5.18 (2H, d, J = 3.3 Hz), 4.58 (1H, d, J = 4.1 Hz), 4.17 (1H, d, J = 4.1 Hz), 3.58 (1H, br d, J = 10.6 Hz), 3.53 (1H, d, J = 10.6 Hz), 3.04 (1H, br s), 1.02 (3H, s), 0.97 (3H, s); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 171.4 (d, J = 3.6 Hz), 167.1 (dd, J = 80.0, 4.6 Hz), 136.8 (dd, J = 77.9, 4.6 Hz), 135.2, 128.6, 128.2, 128.1, 102.5 (dd, J = 80.0, 77.9 Hz), 77.4, 71.6, 66.2, 39.4, 20.9, 20.3; IR nmax(필름)/cm-1 3316, 2963, 2934, 2875, 1682, 1649; HRMS (ESI) C13 13C3H21O5NNa M+ 계산치: m/z 333.1413, 실측치 m/z 333.1407.
화합물 합성 - BODIPY 아미드 컨쥬게이트
3-(1H-피롤-2-일)프로판-1-아민
Figure pct00057
2-(3-아지도프로필)-1H-피롤 (100 mg, 0.704 mmol)을 MeOH (3 mL)에 용해시키고, 아르곤 분위기 하에 놓았다. Pd/C (10 mg, 10%)를 첨가한 후 아르곤 분위기를 수소 분위기로 바꾸고 실온에서 1.5시간 교반하였다. 조질의 혼합물을 셀라이트® 베드를 통해 여과하여 Pd를 제거한 후, MeOH (10 mL)로 세척하고 용매를 진공 제거하여 아민 생성물 (84 mg, 100%)을 담황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.73 (1H, br s), 6.68-6.66 (1H, m), 6.13-6.11 (1H, m), 5.94-5.92 (1H, m), 2.78 (2H, t, J = 6.8 Hz), 2.69 (2H, t, J = 7.4 Hz), 1.81-1.75 (2H, m), 1.57 (2H, br s); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 132.1, 116.2, 108.5, 105.0, 41.7, 33.0, 25.2; IR nmax(필름)/cm-1 3364, 3233, 3098, 2932, 2851; HRMS (EI) C7H13N2 (M+H)+ 계산치: m/z 125.1079, 실측치 m/z 125.1077.
(9H-플루오렌-9-일)메틸 3-(1H-피롤-2-일)프로필카바메이트
Figure pct00058
3-(1H-피롤-2-일)프로판-1-아민 (719 mg, 5.75 mmol)을 CH2Cl2 (45　mL)에 용해시킨 다음 Et3N (1.61 mL, 11.5 mmol) 및 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드 (1.64 g, 6.33 mmol)를 첨가하였다. 이어서 얻어진 용액을 실온에서 16시간 교반하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2 (25 mL)로 희석한 다음 NaHCO3 (30 mL) 포화수용액, 물 (30 mL) 및 염수 (30 mL)로 세척하고, 건조 (Na2SO4) 및 여과한 후 진공 농축하여 조질의 생성물을 무색 오일로서 수득하였다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (10-20% EtOAc/페트롤륨 에테르) 정제하여 클린 Fmoc 보호된 아민 (1.15 g, 58%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.58 (1H, br s) 7.79 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.61 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.42 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.32 (2H, t, J = 7.4 Hz), 6.71- 6.69 (1H, m), 6.13-6.11 (1H, m), 5.93-5.90 (1H, m) 4.79 (1H, br s), 4.47 (2H, d, J = 6.7 Hz), 4.23 (1H, t, J = 6.7 Hz), 3.30-3.27 (2H, m), 3.05 (2H, t, J = 6.8 Hz), 1.80-1.73 (2H, m); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 157.2, 143.9, 141.4, 131.5, 127.7, 127.1, 125.0, 124.7, 116.6, 108.1, 105.3, 66.6, 47.3, 39.9, 31.0, 24.0; IR nmax(필름)/cm-1 3403, 3341, 2982, 2928, 1690; HRMS (CI) C22H22N2O2 (M)+ 계산치: m/z 346.1681, 실측치 m/z 346.1676.
3-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]아미노-[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s- 인다센-3-일]프로판
Figure pct00059
(9H-플루오렌-9-일)메틸-3-(1H-피롤-2-일)프로필카바메이트 (692 mg, 0.739 mmol) 및 3,5-디메틸-1H-피롤-2-carb알데히드 (268 mg, 2.20 mmol)를 CH2Cl2 (15　mL)에 용해시키고 0℃로 냉각한 후 POCl3 (0.205 mL, 2.20 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 실온에서 6시간 교반한 후 이를 다시 0℃로 냉각하고 BF3.Et2O (0.987　mL, 8.00　mmol) 및 DIPEA (1.46 mL, 8.40 mmol)를 첨가한 다음 실온에서 12시간 교반 방치하였다. 이어서 혼합물을 H2O (25　mL) 및 CH2Cl2 (10 mL)로 희석한 후 셀라이트® 베드를 통해 여과하고 CH2Cl2 (2 Х 25 mL)로 건조시켰다. 한데 모은 유기물을 건조 (Na2SO4) 및 진공 농축하여 조질의 생성물을 암적색/녹색 고체로서 수득하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (10-40% EtOAc/페트롤륨 에테르) 생성물 (320 mg, 32%)을 적색 오일로서 수득하고 이를 냉각에 의해 응고시켰다. NMR 값은 유사한 BODIPY 화합물에 필적하였다 (참조: Giessler 등).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.77 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.62 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.40 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.30 (2H, t, J = 7.4 Hz), 7.08 (1H, s), 6.92 (1H, d, J = 3.9 Hz), 6.32 (1H, d, J = 3.9 Hz), 6.13 (1H, s), 5.26 (1H, br s), 4.36 (2H, d, J = 7.3 Hz), 4.22 (1H, t, J = 7.3 Hz), 3.30-3.27 (2H, m), 3.05 (2H, t, J = 7.1 Hz), 2.59 (3H, s), 2.26 (3H, s), 2.01-1.95 (2H, m); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 159.7, 158.9, 156.4, 144.1, 143.5, 141.3, 134.9, 133.2, 128.5, 127.6, 127.0, 125.2, 123.7, 120.2, 119.9, 116.9, 66.6, 47.3, 40.2, 29.0, 25.6, 14.9, 11.3; IR nmax(필름)/cm-1 3333, 2943, 2859, 1601.
3-(1H-피롤-2-일)프로판-1-올
Figure pct00060
Et2O (130　mL) 중 메틸 3-(1H-피롤-2-일)프로파노에이트 (2.64 g, 17.5 mmol)의 용액을 0℃로 냉각한 후 LiAlH4 (996 mg, 26.3 mmol)를 서서히 첨가하였다. 현탁액을 실온이될 때까지 16시간 동안 교반 방치하였다. 조질의 반응 혼합물을 pH가 중성이될 때까지 1M NaOH로 켄칭하였다. Et2O를 따라내고, 리튬/알루미늄 염을 추가의 Et2O (3 Х 50 mL)로 세척하였다. 한데 모은 유기물을 건조 (Na2SO4), 여과 및 용매 진공 제거하여 알코올 생성물 (2.15 g, 100%)을 무색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.24 (1H, br s), 6.70-6.68 (1H, m), 6.15-6.13 (1H, m), 5.95-5.94 (1H, m), 3.73 (2H, t, J = 5.9 Hz), 2.75 (2H, t, J = 7.3 Hz), 1.93-1.87 (2H, m), 1.50 (1H, br s); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 131.8, 116.4, 108.3, 105.2, 62.3, 32.2, 24.2; IR nmax(필름)/cm-1 3365, 2940, 2976, 2850, 1012; HRMS (CI) C7H12NO (M+H)+ 계산치: m/z 126.0919, 실측치 m/z 126.0917.
2-(3-아지도프로필)-1H-피롤
Figure pct00061
CH2Cl2 (60 mL) 중 3-(1H-피롤-2-일)프로판-1-올 (1.00 g, 8.13 mmol)의 용액을 0℃로 냉각한 후 Et3N (2.26 mL, 16.26 mmol) 및 메탄설포닐 클로라이드 (0.755 mL, 9.76 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 교반시킨 후 실온으로 승온시키고 1 M HCl (40 mL), NaHCO3 포화수용액 (60 mL) 및 염수 (60 mL)로 세척한 다음, 건조 (Na2SO4), 여과 및 용매 진공 제거하여 메실레이트 중간체 (1.52 g, 94%)를 수득하였다. 조질의 메실레이트를 DMF (60　mL)에 용해시키고 용액을 소듐 아지드 (1.48 g, 22.7 mmol)로 처리하고 16시간 동안 70℃로 가열하였다. 이어서 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 EtOAc (60 mL) 및 이어서 H2O (60 mL)를 첨가하였다. 수성 상을 EtOAc (2 Х 60 mL)로 세척한 다음, 한데 모은 유기물을 염수 (5 Х 100 mL)로 세척하고, 건조 (Na2SO4), 여과 및 용매 진공 제거하여 아지드 생성물 (947 mg, 88%)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.98 (1H, br s), 6.70-6.68 (1H, m), 6.15-6.13 (1H, m), 5.96-5.94 (1H, m), 3.34 (2H, t, J = 6.6 Hz), 2.73 (2H, t, J = 7.4 Hz), 1.92-1.87 (2H, m); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 130.7, 116.5, 108.5, 105.5, 50.7, 28.9, 24.7. IR nmax(필름)/cm-1 3379, 2940, 2870, 2091; HRMS (EI) C7H11N4 (M+H)+ 계산치: m/z 151.0984, 실측치 m/z 151.0987.
3-아지도[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로판, 11
Figure pct00062
2-(3-아지도프로필)-1H-피롤 (105 mg, 0.739 mmol) 및 3,5-디메틸-1H-피롤-2- 카복스알데히드 (99 mg, 0.813 mmol)를 CH2Cl2 (5 mL)에 용해시키고 0℃로 냉각한 후 POCl3 (76 μL, 0.813 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 실온에서 6 시간 교반시킨 후 다시 0℃로 냉각하고 BF3.Et2O (0.365 mL, 2.96 mmol) 및 DIPEA (0.539 mL, 3.10 mmol)를 첨가한 다음 실온에서 12시간 교반 방치하였다. 이어서 혼합물을 H2O (10 mL) 및 CH2Cl2 (5 mL)로 희석한 후 셀라이트® 베드를 통해 여과하고 CH2Cl2 (2 Х 10 mL)로 세척하였다. 이어서 한데 모은 유기물을 건조 (Na2SO4) 및 용매 진공 제거하여 조질물을 어두운 적색/녹색 고체로서 수득하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (5% EtOAc/페트롤륨 에테르) 목적하는 아지드 (155 mg, 57%)를 적색 오일로서 수득하고 이를 냉각에 의해 응고시켰다. NMR 값은 유사한 BODIPY 화합물과 필적하였다 (참조: Giessler 등).
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 7.09 (1H, s), 6.91 (1H, d, J = 3.9 Hz), 6.28 (1H, d, J = 3.9 Hz), 6.12 (1H, s), 3.40 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.05 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.57 (3H, s), 2.27 (3H, s), 2.04 (2H, m); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 160.3, 157.8, 147.9, 143.7, 133.3, 128.2, 123.7, 120.4, 116.6, 50.9, 28.1, 25.8, 14.9, 11.3. IR nmax(필름)/cm-1 2959, 2932, 2870, 2091; HRMS (ESI) C14H17BF2N5 (M+H)+ 계산치: m/z 304.1545, 실측치 m/z 304.1528; m.p. 49-50℃.
3-아미노[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로판
Figure pct00063
THF (1 mL) 중 3-아지도[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3yl]프로판 (25 mg, 0.083 mmol)의 용액에 폴리머 결합된 트리페닐포스핀 (103 mg, 1.6 mmolg-1) 및 H2O (50 μL)를 첨가하였다. 결과적인 현탁액을 50℃에서 4시간 가열한 다음, TLC에 의해 반응을 진행시켰다. 반응 완료 후, 현탁액을 실온으로 냉각시킨 후 셀라이트® 베드를 통해 여과하고 용매를 진공 제거하여 목적하는 아민을 적색 오일 (61-82%)로서 수득하였다. 더 이상의 정제 없이 물질을 사용하였다.
아미드 컨쥬게이트 - 310
Figure pct00064
이 화합물은 3-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]아미노-[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로판으로부터, 피페리딘 처리, (E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 처리에 의해 현장(in situ) 제조된, 3-아미노[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로판의 아미드 커플링에 의해 제조되었다.
따라서, 실온에서 3-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]아미노-[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로판을 THF에서 피페리딘으로 3 시간 처리하였다. HBTU, DIPEA, CH2Cl2의 존재 하에, 80℃에서 마이크로웨이브 조건 하에 2.5 시간 동안 조질의 생성물을 (E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산으로 처리하였다. HPLC 정제에 의해 조질의 생성물을 2 단계에 걸쳐 <10% 수율로 얻었다.
화합물 합성 - BODIPY 클릭 컨쥬게이트
(R,E)-N-((((3-[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로필)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에틸아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드, 1
Figure pct00065
(R,E)-N-(3-(부트-3-이닐아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (20 mg, 65 μmol) 및 3-아지도[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로판 (15 mg, 50 μmol)을 THF (2 mL)에 용해시켰다. 한 방울의 DIPEA를 피펫을 통해 첨가한 다음, 촉매량의 CuI를 첨가하였다. 결과적인 혼합물을 70℃로 18시간 가열한 다음 진공 농축하여 조질의 생성물 갈색 오일로서 수득하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-2% MeOH/CH2Cl2) 목적하는 화합물 (23 mg, 76%)을 적색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 8.32 (1H, d, J = 11.4 Hz), 7.84 (1H, dd, J = 13.9, 11.4 Hz), 7.38 (1H, s), 7.09 (1H, s), 6.87 (1H, d, J = 4.1 Hz), 6.34 (1H, br s), 6.23 (1H, d, J = 4.1 Hz), 6.11 (1H, s), 5.73 (1H, d, J = 13.9 Hz), 4.40 (2H, t, J = 6.9 Hz), 4.15 (1H, s), 3.68 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.65-3.61 (2H, m), 3.28 (1H, d, J = 11.6 Hz), 2.97 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.90 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.53 (3H, s), 2.38-2.31 (2H, m), 2.24 (3H, s), 1.46 (3H, s), 1.42 (3H, s), 1.02 (3H, s), 0.97 (3H, s); 13C NMR (CDCl3,125 MHz) δ: 168.0, 166.3, 160.5, 156.6, 144.2, 135.3, 133.1, 132.8, 128.2, 123.9, 122.1, 120.6, 116.6, 106.0, 99.4, 77.2, 71.3, 49.8, 38.7, 33.3, 29.4, 29.3, 25.6, 25.5, 21.9, 18.8, 18.7, 14.9, 11.3; IR nmax(필름)/cm-1 3295, 2991, 2830, 2876, 1666, 1598; HRMS (ESI) C30H39BF2N7O4 (M-H)+ 계산치: m/z 609.3166, 실측치 m/z 609.3141; [α]D +29.6 (c = 0.6, (CH3)2CO, T = 24.4℃).
(S,E)-N-(3-(부트-3-이닐아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드로부터 유사한 방식으로 (S,E) 형태 (3)를 제조할 수 있다. [α]D-21.8 (c = 1.2, (CH3)2CO, T = 24.4℃).
(R,E)-N-((((3-[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로필)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에틸아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미드, 5
Figure pct00066
(R,E)-N-((((3-[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로필)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에틸아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (20 mg, 33 μmol)을 THF (1 mL) 및 H2O (50 μL)의 혼합물에 용해시킨 후 BiCl3 (1 mg, 3 μmol)를 첨가하고 실온에서 16시간 교반 방치하였다. 조질의 혼합물을 셀라이트®를 통해 여과한 다음 진공 농축하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (5-8% MeOH/CH2Cl2) 디올 생성물 (10 mg, 56%)을 적색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 9.43 (1H, d, J = 11.2 Hz), 7.90-7.85 (1H, m), 7.47 (1H, s), 7.09 (2H, br s), 6.86 (1H, d, J = 3.9 Hz), 6.22 (1H, d, J = 3.9 Hz), 6.10 (1H, s), 5.81 (1H, d, J = 13.8 Hz), 5.53 (1H, br s), 4.37-4.34 (3H, m), 4.17 (1H, s), 3.56-3.50 (3H, m), 3.43 (1H, d, J = 10.7 Hz), 2.93 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.90 (2H, br s), 2.52 (3H, s), 2.31-2.28 (2H, m), 2.22 (3H, s), 0.93 (3H, s), 0.92 (3H, s); 13C NMR (CDCl3,125 MHz) δ: 172.7, 167.3, 160.5, 156.6, 145.2, 144.2, 135.2, 133.8, 133.2, 128.3, 124.0, 122.1, 120.6, 116.6, 105.6, 76.8, 70.3, 49.7, 39.6, 39.1, 29.3, 25.6, 25.5, 21.0, 20.7, 14.9, 11.3; IR nmax(필름)/cm-1 3295, 2970, 2829, 2873, 1661, 1597; HRMS (ESI) C27H35BF2N7O4 (M-H)+ 계산치: m/z 569.2853, 실측치 m/z 569.2831; m.p. 104-105℃; [α]D +28.1 (c = 0.5, (CH3)2CO, T = 24.4℃).
(S,E) 형태 (7)은 (S,E)-N-((((3-[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로필)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에틸아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드로부터 유사한 방식으로 제조될 수 있다. [α]D-24.0 (c = 1.0, (CH3)2CO, T =24.4℃).
(Z)-N-((((3-[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로필)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에틸아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드, (R)-2, (S)-4
Figure pct00067
(Z)-N-(3-(부트-3-인-1-일아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (R-형 또는 S-형) (96 mg, 0.3 mmol)을 THF (1.5 mL)에 용해시킨 후 3-아지도[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로판 (122 mg, 0.4　mmol)를 한번에 첨가한 다음 DIPEA (1 방울) 및 촉매량의 CuI를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 70℃로 16시간 가열한 다음 진공 농축하여 조질물을 암갈색 오일로서 수득하였다. 조질물을 컬럼 크로마토그래피 (5% MeOH/CH2Cl2)를 통해 정제하여 트리아졸 생성물 (161 mg, 85%)을 적색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 11.68 (1H, d, J = 11.1 Hz), 7.39 (1H, s), 7.23 (1H, dd, J = 11.1, 8.9 Hz), 7.10 (1H, s), 6.88 (1H, d, J = 3.9 Hz), 6.35 (1H, t, J = 5.5 Hz), 6.24 (1H, d, J = 3.9 Hz), 6.12 (1H, s), 5.03 (1H, d, J = 8.9 Hz), 4.42 (2H, t, J = 6.9 Hz), 4.19 (1H, s), 3.71 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.68-3.58 (2H, m), 3.32 (1H, d, J = 11.7 Hz), 2.97 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.92 (2H, t, J = 6.2 Hz), 2.54 (3H, s), 2.37 (2H, quin, J = 7.2 Hz), 2.26 (3H, s), 1.60 (3H, s), 1.46 (3H, s), 1.04 (6H, s); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 168.7, 167.8, 160.6, 156.5, 145.4, 144.2, 135.3, 133.1, 133.0, 128.1, 123.8, 121.7, 120.6, 116.5, 100.8, 99.2, 77.2, 71.4, 49.6, 38.2, 33.3, 29.4, 29.2, 25.5, 25.4, 22.0, 19.0, 18.6, 14.9, 11.3; IR vmax(필름)/cm-1 (neat): 2926, 2360, 1660, 1610, 1139; HRMS (ESI) C30H40N7BF2O4Na (M+Na)+ 계산치: m/z 633.3131, 실측치 m/z 633.3107; MP 범위: 66-69℃.
R-형: [α]D +3.8 (c = 0.9, (CH3)2CO, T = 24.4℃).
S-형: [α]D -1.6 (c =1.0, (CH3)2CO, T = 24.4℃).
(Z)-N-((((3-[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로필)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에틸아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미드, (R)-6, (S)-8
Figure pct00068
(Z)-N-((((3-[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로필)-
1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에틸아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (60 mg, 0.1 mmol)를 MeCN (1.2 mL) 및 H2O (0.1　mL)에 용해시킨 다음 BiCl3 (6 mg, 0.02mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 격렬히 교반한 후 셀라이트®를 통해 여과하고 MeCN (40 mL)를 통해 세척하였다. 용매를 진공 제거하여 조질의 디올을 암갈색 오일로서 수득하였다. 이 조질물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (5% MeOH/CH2Cl2) 정제하여 디올을 적색 오일 (52 mg, 92%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 11.85 (1H, d, J = 11.1 Hz), 7.42 (1H, s), 7.23 (1H, dd, J = 11.1, 8.8 Hz), 7.10 (1H, s), 6.89 (1H, d, J = 4.0 Hz), 6.55 (1H, t, J = 5.5 Hz), 6.24 (1H, d, J = 4.0, Hz), 6.13 (1H, s), 5.05 (1H, d, J = 8.8 Hz), 4.42 (2H, t, J = 6.9 Hz), 4.16 (1H, s), 3.66-3.55 (2H, m), 3.53 (1H, s), 2.96 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.92 (2H, t, J = 6.2 Hz), 2.54 (3H, s), 2.35 (2H, quin, J = 7.4 Hz), 2.26 (3H, s), 1.03 (3H, s), 0.98 (3H, s); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 172.0, 168.1, 160.6, 156.5, 145.2, 144.2, 135.3, 133.5, 133.1, 128.2, 123.9, 121.8, 120.6, 116.5, 100.6, 77.9, 71.1, 49.7, 39.4, 38.4, 29.2, 25.5, 25.4, 20.9, 20.6, 14.9, 11.3; IR vmax(필름)/cm- 1(neat): 3309, 2953, 1654, 1610, 1139; HRMS (ESI) C27H36N7BF2O4Na (M+Na)+ 계산치: m/z 593.2818, 실측치 m/z 593.2810.
R-형: [α]D+15.3 (c = 0.6, (CH3)2CO, T =24.4℃).
S-형: [α]D-16.0 (c = 1.0, (CH3)2CO, T =24.4℃).
7-(3-아지도프로필)-5,5-디플루오로-1-(3-메톡시-3-옥소프로필)-5H-디피롤로 [1,2- c:1',2'-F][1,3,2]디아자보리닌-4-이움-5-유이드
Figure pct00069
CH2Cl2 (10 mL) 중 2-(3- 아지도프로필)-1H-피롤 (275 mg, 1.83 mmol)의 0℃ 용액을 CH2Cl2 (10　mL) 중 메틸 3-(5-포르밀-1H-피롤-2-일)프로파노에이트 (365 mg, 2.01 mmol)로 처리하고, 결과적인 용액에 POCl3 (0.2 mL, 2.01 mmol)를 적가하여 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 교반한 후 0℃로 냉각하였다. 이어서 혼합물을 BF3(OEt)2 (1 mL, 7.3 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.4 mL, 8.24 mmol)로 처리하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 혼합물을 H2O (15 mL) 및 CH2Cl2 (10 mL)로 희석한 후 셀라이트® 베드를 통해 여과하였다. 셀라이트® 를 CH2Cl2 (2 Х 15 mL)를 통해 세척하고 유기 상들을 한데 모았다. 용액을 Na2SO4 건조 및 진공 농축하여 암적색/녹색의 조질의 고체 잔기를 수득하였다. 조질의 고체를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (Pet. 에테르: EtOAc; 8:2)로 정제하여 271 mg (41%)의 목적하는 에스테르를 적색 오일로서 수득하고, 이를 냉각하여 응고시켰다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.13 (1H, s), 7.03-6.95 (1H, m), 6.35 (1H, t, J = 3.7 Hz), 3.70 (1H, s), 3.40 (1H, t, J = 6.9 Hz), 3.32 (1H, t, J = 7.5 Hz), 3.07 (1H, t, J = 7.7 Hz), 2.78 (1H, t, J = 7.6 Hz), 2.11-1.96 (1H, m).
(R)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)프로판산.
Figure pct00070
아세톤 (25 mL) 중 D-판토텐산 헤미칼슘염 (500 mg, 1.0 mmol)의 용액을 p-TsOH.H2O (560 mg, 3.0 mmol) 및 1.0 g의 4Å 분자체로 처리하였다. TLC 분석에 의해 반응이 종결될 때까지 실온에서 교반하였다(18시간). 이어서 현탁액을 셀라이트® 베드를 통해 여과하고 아세톤 (2x15 mL)으로 세척한 다음 유기 상들을 한데 모았다. 모아진 유기 세척물(washes)을 진공 농축한 다음 EtOAc (30 mL)를 조질의 잔사에 첨가하였다. 결과적인 용액을 염수 (2x30 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조 및 진공 농축시켰다. 용매가 완전히 제거되기 전, 아세토나이드의 결정화가 유도될 때까지 헥산을 첨가하였다 (300 mg, 55%). 목적하는 아세토나이드를 백색 결정으로서 수득하였으며, 이는 추가 정제를 필요로 하지 않았다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.04 (1H, m), 4.12 (1H, s), 3.71 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.66-3.47 (2H, m), 3.30 (1H, d, J = 11.6 Hz), 2.65 (2H, t, J = 6.0 Hz), 1.48 (3H, s), 1.45 (3H, s), 1.06 (3H, s), 1.00 (3H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 174.7, 170.1, 99.0, 77.2, 71.4, 34.1, 33.7, 32.9, 29.4, 22.0, 18.8, 18.7.
(R)-N-(3-(부트-3-인-1-일아미노)-3-옥소프로필)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드.
Figure pct00071
CH2Cl2 (1.5 mL) 중 (R)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)프로판산 (160 mg, 0.6 mmol)의 용액을 HBTU (340 mg, 0.9 mmol) 및 이어서 1-아미노-3-부틴 (70 μL, 0.9 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (150 μL, 0.9 mmol)로 처리하였다. 이어서 반응 혼합물을 마이크로웨이브 오븐에서 80℃에서 3.5 시간 동안 가열하였다. 이어서 반응물을 감압 농축하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-5% MeOH/CH2Cl2) 목적하는 알킨을 적색 오일 (175 mg, 90%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.05 (1H, br s), 6.24 (1H, br s), 4.10 (1H, s), 3.71 (1H, d, J = 12.0 Hz), 3.65-3.50 (2H, m), 3.30 (1H, d, J = 12.0 Hz), 3.24-3.17 (2H, m), 2.50 (2H, t, J = 8.0 Hz), 2.42 (2H, td, J = 6.4, 2.4 Hz), 2.03 (1H, t, J = 2.4 Hz),1.48 (3H, s), 1.46 (3H, s), 1.06 (3H, s), 0.99 (3H, s). 13C NMR (CD3)2CO, 125 MHz) δ: 171.6, 169.8, 99.4, 82.5, 77.7, 71.8, 70.8, 39.0, 36.1, 35.5, 33.4, 22.3, 19.8, 19.2, 19.0. IR υmax (필름)/cm- 1: 3293, 2989, 1740, 1650, 1536, 1368, 1232, 1090. [α]D +9.50 (c = 0.5, CHCl3, T = 23.0℃).
(R)-N-((((3-[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로필)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에틸아미노)-3-옥소프로필)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드, 10
Figure pct00072
THF (2.5 mL) 중 3-아지도 [4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로판 (40 mg, 0.1 mmol)의 용액을 THF (2.5 mL) 중 N-(3-(부트-3-인-1-일아미노)-3-옥소프로필)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (43 mg, 0.1 mmol)의 용액으로 처리하였다. 얻어진 혼합물을 촉매량의 CuI (5 mg) 및 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.1 mL, 0.6 mmol)으로 처리하였다. 이어서 반응물을 TLC 분석에 의해 반응이 종결될 때까지 70℃로 가열하였다 (18 시간). 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 H2O (5 mL)로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc (3x10 mL)로 추출하고 한데 모은 유기물을 염수 (3x30 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조 및 감압 농축하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-5% MeOH/CH2Cl2) 예상된 트리아졸 10을 적색 오일 (74 mg, 87%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.45 (1H, s), 7.13 (1H, s), 6.91 (1H, d, J = 4.0 Hz), 6.61 (1H, t, J = 5.0 Hz), 6.28 (1H, d, J = 4.0 Hz), 6.15 (1H, s), 4.44 (2H, t, J = 8.0 Hz), 4.07 (1H, s), 3.70 (1H, d, J = 12.0 Hz), 3.62-3.56 (3H, m), 3.54-3.45 (1H, m), 3.28 (1H, d, J = 12.0 Hz), 3.01 (2H, t, J = 8.0 Hz), 2.90 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.56 (3H, s), 2.43 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.39-2.33 (2H, m), 2.28 (3H, s),1.46 (3H, s), 1.44 (3H, s), 1.03 (3H, s), 0.96 (3H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 171.2, 169.9, 160.5, 156.5, 145.2, 135.0, 133.1, 132.0, 128.8, 123.9, 121.9, 120.6, 116.5, 99.1, 77.1, 71.4, 49.7, 38.7, 35.9, 34.8, 32.9, 29.4, 29.3, 25.8, 25.4, 22.1, 18.9, 18.6,14.9, 11.3. 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ: -70.1, -72.0. IR υmax (필름)/cm- 1: 3357, 2922, 2850, 1740, 1650. [α]D -15.50 (c = 0.1, CHCl3, T = 23.0℃).
(R)-N-((((3-[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로필)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에틸아미노)-3-옥소프로필)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미드, 9
Figure pct00073
CH3CN (3 mL) 중 (R)-N-((((3-[4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일]프로필)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에틸아미노)-3-옥소프로필)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 10 (40 mg, 60 μmol)의 용액을 촉매량의 BiCl3 (5 mg) 및 이어서 H2O (0.1 mL)로 처리하였다. 이어서 반응 혼합물을 TLC 분석에 의해 반응 종결될 때가지 실온에서 교반하였다 (17 시간). 이어서 NaHCO3 포화수용액 몇 방울을 첨가함으로써 반응물을 켄칭하고 EtOAc (5 mL)로 희석하였다. 결과적인 현탁액을 셀라이트® 베드를 통해 여과한 다음 EtOAc (2x5 mL)로 철저히 세척하였다. 결합된 유기 세척물을 Na2SO4로 건조 및 감압 농축하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-10% MeOH/CH2Cl2 중 2M NH3)예상된 디올 9을 적색 오일 (10 mg, 28%)로서 수득하였다
1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ: 8.57 (1H, s), 7.45 (1H, s), 7.06 (1H, s), 7.00 (1H, d, J = 4.0 Hz), 6.71 (1H, br s), 6.43 (1H, d, J = 4.0 Hz), 6.24 (1H, s), 4.51 (2H, t, J = 8.0 Hz), 4.09 (1H, s), 3.69 (1H, d, J = 12.0 Hz), 3.63-3.59 (2H, m), 3.56-3.53 (2H, m), 3.15 (1H, d, J = 12.0 Hz), 3.00 (2H, t, J = 8.0 Hz), 2.92 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.51 (3H, s), 2.31 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.20-2.12 (2H, m), 2.07 (3H, s), 1.04 (3H, s), 0.74 (3H, s). 13C NMR (CD3OD, 100 MHz) δ: 179.0, 167.8, 160.3, 155.8, 145.4, 134.2, 132.4, 130.8, 129.6, 124.3, 122.5, 120.9, 116.2, 100.5, 77.4, 71.8, 50.1, 38.7, 35.9, 35.1, 31.6, 29.0, 25.5,18.7, 18.4,13.0, 11.4. 19F NMR (CD3OD, 376 MHz) δ: -74.1, -76.0. IR υmax (필름)/cm- 1: 3491, 2927, 1843, 1644, 1557, 1411, 1258. [α]D -26.00 (c = 0.02, CHCl3, T = 23.0℃).
7-(3-아지도프로필)-3-(2-카복시에틸)-5,5-디플루오로-5H-디피롤로[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]디아자보리닌-4-이움-5-유이드
Figure pct00074
THF (13 mL) 중 7-(3-아지도프로필)-5,5-디플루오로-1- (3-메톡시-3-옥소프로필)-5H-디피롤로 [1,2- c:1',2'-F][1,3,2]디아자보리닌-4-이움-5-유이드 (114 mg, 315 μmol)의 용액을 H2O (7 mL) 및 진한 HCl (5 mL)로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음 H2O로 희석하고 CH2Cl2로 추출하였다. 유기 추출물을 Na2SO4로 건조하고 감압 농축하였다. 조질의 생성물을 컬럼 크로마토그래피 (Pet. 에테르:EtOAc; 7:3) 정제하여 목적하는 산을 68% 수율의 적색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.14 (1H, s), 7.01 (2H, dd, J = 11.9, 4.1 Hz), 6.36 (2H, d, J = 4.1 Hz), 3.40 (2H, t, J = 6.9 Hz), 3.32 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.07 (2H, t, J = 7.7 Hz), 2.84 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.08-2.00 (2H, m). 13C NMR: (CDCl3, 100 MHz) δ: 161.56, 160.42, 134.85, 130.79, 130.63, 127.97, 118.56, 51.02, 33.05, 29.84, 28.14, 26.17, 24.06, 14.25. 19F NMR: (377 MHz, CDCl3) δ -143.75, -143.84, -143.93, -144.02. IR υmax (필름)/cm-1 2954, 2925, 2854, 2097, 1709, 1604, 1439, 1114.
(Rac)-프라지콴아민-2,3,6,7-테트라히드로-1H-피라지노[2,1-a]이소퀴놀린-4(11bH)-온.
Figure pct00075
2 mL의 EtOH 중 프라지콴텔 (250 mg, 0.8 mmol)을 함유하는 25 mL 둥근 바닥 플라스크에 1　N HCl 용액 (7.5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 60 시간 동안 환류시켰다. 그 후 실온에서 반응물을 5 mL의 EtOAc로 세척하고 아이스배쓰에서 냉각시켰다. 이어서, 5M NaOH를 첨가하여 pH를 12-14로 조정하였다 (pH 용지 사용). 수성 층을 CH2Cl2로 추출하고 유기층을 Na2SO4로 건조 및 진공 건조시켰다. 담황색 고체를 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH; 9:1) 정제하여 순수한 생성물 프라지콴아민을 83% 수율(135 mg)로 얻었다. 얻어진 NMR 데이타는 앞서 보고된 것과 일치하였다 (PLoS Negl Trop Dis. 2011 Sep; 5(9): e1260).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.25-7.09 (4H, m), 4.90-4.83 (1H, m), 4.80 (1H, dd, J = 10.0, 4.5 Hz), 3.73 (1H, dd, J = 13.0, 4.7 Hz), 3.60 (2H, dd, J = 56.8, 17.4 Hz), 3.05-2.68 (4H, m), 2.00 (1H, s).
5,5-디플루오로-1,3-디메틸-7-(3-옥소-3-(4-옥소-3,4,6,7-테트라히드로-I-피라지노[2,1-a]이소퀴놀린 2(11bH)-일)프로필)-5H-디피롤로[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]디아자보리닌-4-이움-5-유이드, 12
Figure pct00076
1 mL의 CH2Cl2, 중 BODIPY 산 (53 mg, 0.18 mmol) 및 PZQ아민 (35 mg, 0.18 mmol)의 용액을 EDC (80 mg, 0.36 mmol)로 처리하고 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 일단 TLC (CH2Cl2:MeOH; 95:5) 기준으로 반응이 완결되면, 혼합물을 진공 농축시켰다. 나머지 적색 오일을 EtOAc에 용해시키고 Na2CO3 포화수용액 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 감압 농축하였다. 조질의 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH; 98:2)에 의해 정제하여 적색 고체를 90% 수율 (80 mg)로 수득하였다. 얻어진 NMR 데이타는 앞서 보고된 내용과 일치하였다. Mol. Biochem. Parasitol. 164:57-65, 2009.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.28-7.00 (4H, m), 6.88 (1H, t, J = 3.7 Hz), 6.38 6.09 (1H, m), 5.19-5.12 (1H, m), 4.95-4.62 (2H, m), 4.54-4.35 (1H, m), 3.90 (1H, dd, J = 86.2, 18.0 Hz), 3.34 (1H, t, J = 7.5 Hz), 3.15-2.70 (4H, m), 2.59 (2H, d, J = 8.3 Hz), 2.26 (2H, s), 1.28 (2H, s).
3-(3-아지도프로필)-5,5-디플루오로-7-(3-옥소-3-(4-옥소-3,4,6,7-테트라히드로-1H-피라지노[2,1-a]이소퀴놀린-2(11bH)-일)프로필)-5H-디피롤로[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]디아자보리닌-4-이움-5-유이드
Figure pct00077
1 mL의 CH2Cl2, 중 비스-관능화된 BODIPY 산 (40 mg, 0.11 mmol) 및 PZQ아민 (23 mg, 0.11 mmol)의 용액을, EDC (55 mg, 0.23 mmol)로 처리하고 얻어진 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 일단 TLC (CH2Cl2:MeOH; 95:5) 기준으로 반응이 종결된 것으로 체크되면, 혼합물을 진공 농축하였다. 나머지 적색 오일은 EtOAc에 용해시킨 다음 Na2CO3 포화수용액 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조하고 감압 농축시켰다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH; 97:3) 정제하여 목적 생성물을 적색 고체로서 90% 수율 (80 mg)로 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.32-6.96 (4H, m), 6.39 (1H, td, J = 11.0, 4.1 Hz), 5.15 (1H, dd, J = 13.4, 2.8 Hz), 4.87-4.67 (1H, m), 4.46-4.34 (1H, m), 3.92 (1H, dd, J = 83.6, 18.0 Hz), 3.44-3.30 (2H, m), 3.18-2.69 (4H, m), 2.11-1.96 (1H, m), 1.60 (1H, s), 1.30-1.20 (1H, m), 1.25 (3H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 170.33, 164.18, 135.42, 134.90, 132.83, 132.37, 129.45, 127.63, 127.12, 126.84, 125.69, 119.98, 76.84, 55.65, 55.03, 51.04, 48.97, 45.39, 39.16, 29.84, 28.87, 28.17, 26.21, 24.46. IR υmax (필름)/cm-1 2924, 2854, 2096, 1649, 1259, 1114. HRMS (ESI) C27H28BF2N7O2 [M+Na] 계산치 553.2294 m/z, 실측치 553.2283 m/z.
5,5-디플루오로-7-(3-옥소-3-(4-옥소-3,4,6,7-테트라히드로-1H-피라지노[2,1-a]이소퀴놀린-2(11bH)-일)프로필)-3-(3-(4-(2-((E)-3-((R)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴아미도)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)프로필)-5H-디피롤로[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]디아자보리닌-4-이움-5-유이드, 13
Figure pct00078
건조 THF (1.5 mL) 중 PZQ-BODIPY-아지드 (37 mg, 70 μmol) 및 판토텐산염 유래된 알킨 (22　mg, 70 μmol)의 용액을 촉매량의 CuI 및 DIPEA로 처리하였다. 얻어진 혼합물을 40℃로 가열하고 밤새 교반하였다. 일단 TLC가 출발 물질 (CH2Cl2:MeOH; 96:4)의 소모를 나타내면, 반응물을 실온으로 냉각시키고 조질의 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 화합물이 20% 수율 (11 mg)의 암적색 고체로서 트리아졸들의 혼합물로서 수득되었다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.30 (1H, d, J = 11.3 Hz), 7.81 (1H, dt, J = 20.3, 10.2 Hz), 7.44 (1H, s), 7.35 (1H, s), 7.26-6.92 (8H, m), 6.46-6.28 (2H, m), 5.75 (1H, dd, J = 13.8, 4.5 Hz), 5.15 (1H, dd, J = 13.3, 3.0 Hz), 4.88-4.68 (2H, m), 4.47-4.32 (3H, m), 4.15 (1H, dd, J = 6.8, 5.2 Hz), 4.04 (1H, d, J = 17.5 Hz), 3.91-3.57 (4H, m), 3.39-3.24 (3H, m), 3.07-2.71 (8H, m), 2.37 (2H, dq, J = 15.0, 7.5 Hz), 2.17 (2H, s), 1.46 (3H, s), 1.38 (3H, s) 0.97 (3H, s), 0.87 (3H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 168.1, 164.2, 134.9, 129.4, 127.1, 99.5, 76.8, 71.4, 50.9, 33.4, 29.5, 22.0, 18.9, 18.8. 19F NMR (377 MHz, CDCl3) δ -141.87, -141.95, -142.05, -142.14, -142.35, -142.44, -142.53, -142.62. HRMS (ESI) C43H52BF2N9O6 [M+Na]+ 계산치 861.4030 m/z, 실측치 861.4004 m/z.
화합물 합성 - 쿠마린 컨쥬게이트
에틸 2-(7-(디메틸아미노) -2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세테이트
Figure pct00079
ZnCl2를 140℃에서 진공 하에 18 시간 교반한 다음 마지막으로 불꽃-건조한 후 칭량에 앞서 냉각하였다. EtOH (10 mL) 중 3-(디메틸아미노)페놀 (2.92 mL, 16.0 mmol)의 용액을 에틸 아세톤디카복실레이트 (2.00 g, 14.6 mmol) 및 이어서 ZnCl2 (2.38 g, 17.5 mmol)와 함께 가열하였다. 결과적인 현탁액을 16시간 동안 가열 환류시킨 후 실온으로 냉각하고 얼음(50 g)을 부었다. 수성상을 CH2Cl2 (3 Х 30 mL)로 추출하고 한데 모은 유기물을 염수 (50 mL)로 세척, 건조 (Na2SO4), 여과 및 진공 농축하여 조질의 생성물을 어두운 보라색 오일로서 얻었다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (20-50% EtOAc/페트롤륨 에테르) 쿠마린 생성물을 담황색 고체 (1.94 g, 48%)로서 수득하였다. NMR 데이타는 문헌 (참조: Ma 등)과 일치하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.40 (1H, d, J = 9.0 Hz), 6.61 (1H, dd, J = 9.0, 2.6 Hz), 6.51 (1H, d, J = 2.6 Hz), 6.05 (1H, br s), 4.18 (2H, q, J = 7.1 Hz), 3.67 (2H, d, J = 0.9 Hz), 3.05 (6H, s), 1.25 (3H, t, J = 7.1 Hz); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 169.1, 161.7, 156.0, 153.0, 148.4, 125.3, 110.7, 109.0, 108.5, 98.4, 61.5, 40.1, 38.2, 14.1.
2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세트산
Figure pct00080
THF (42 mL) 중 에틸 2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세테이트 (1.92 g, 6.97 mmol)의 용액에 H2O (85　mL) 중 LiOH (338 mg, 14.1 mmol)의 용액을 첨가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 4시간 교반하고 이 동안 반응 혼합물을 Et2O (2 Х 100 mL)으로 세척하였다. 이어서 수성 층을 1 M HCl을 이용하여 pH 2로 산성화하고 얻어진 황색 침전물을 여과하여 생성물 산 (1.24 g, 72%)을 황색 고체로서 수득하였다. NMR 데이타는 문헌(참조: Ma 등)과 일치하였다.
1H NMR ((CD3)2CO, 400 MHz) δ: 7.56 (1H, d, J = 8.9 Hz), 6.76 (1H, dd, J = 8.9, 2.6 Hz), 6.54 (1H, d, J = 2.6 Hz), 6.08 (1H, br s), 3.85 (2H, d, J = 0.7 Hz), 3.10 (6H, s), 2.88 (1H, br s); 13C NMR ((CD3)2CO,100 MHz) δ: 170.8, 161.4, 157.0, 154.1, 150.3, 126.7, 111.2, 109.8, 109.4, 98.7, 40.2, 37.9.
N-(3-아지도프로필)-2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세트아미드
Figure pct00081
CH2Cl2 (1.5 mL) 중 3-아지도프로판-1-아민 (50 mg, 0.500 mmol) (Zabrodski 등에 공지됨)의 용액을 0℃로 냉각하고 2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세트산 (49 mg, 0.200　mmol), EDC (46 mg, 0.240 mmol), DIPEA (70 μL, 0.400 mmol) 및 촉매량의 DMAP를 첨가하였다. 0℃에서 15분간 교반하자, 백색 침전물이 형성되면서 반응 혼합물이 혼탁해졌다. 추가 부분의 CH2Cl2 (3 mL)를 첨가하고 혼합물을 초음파처리하여 교반을 도왔다. 슬러리를 실온으로 승온시키는 한편 16시간 교반하자 현탁액이 황색 용액이 되었다. 반응 혼합물을 진공 농축하여 조질의 생성물의 황색 오일로서 수득하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-2% MeOH/CH2Cl2) 아지드 생성물 (40 mg, 84%)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2CO, 400 MHz) δ: 7.58 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.45 (1H, br s), 6.71 (1H, dd, J = 9.0, 2.6 Hz), 6.49 (1H, d, J = 2.6 Hz), 6.02 (1H, br s), 3.66 (2H, d, J = 0.7 Hz), 3.34 (2H, t, J = 6.9 Hz), 3.30-3.25 (2H, m), 3.07 (6H, s), 1.77-1.70 (2H, m); 13C NMR ((CD3)2CO, 100 MHz) δ: 168.7, 161.5, 156.9, 154.1, 151.3, 126.9, 111.1, 109.7, 109.5, 98.6, 49.7, 40.5, 40.2, 37.5, 29.6; IR υmax(필름)/cm-1 3283, 2920, 2881, 2807, 2085, 1705, 1604; HRMS (EI) C16H18O3N5 (M-H)+: m/z 328.1415, 실측치 m/z 328.1404.
(R,E)-N-(3-(2-(1-(3-(2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세트아미도)프로필)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에틸아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00082
(R,E)-N-(3-(부트-3-이닐아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (59 mg, 0.192 mmol) 및 N-(3-아지도프로필)-2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세트아미드 (46 mg, 0.192 mmol)를 THF (2 mL)에 용해시켰다. 한 방울의 DIPEA를 피펫을 통해 첨가한 후, 촉매량의 CuI를 첨가하였다. 결과적인 혼합물을 40℃로 18 시간 가열한 후, 진공하에 환원하여 용매를 ㅈ제거하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (0-5% MeOH/CH2Cl2)로 정제하여 목적하는 화합물 (78 mg, 74%)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2CO, 500 MHz) δ: 9.42 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.81 (1H, dd, J = 14.0, 11.0, Hz), 7.69 (1H, s), 7.60 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.59 (1H, t, J = 5.7 Hz), 7.21 (1H, t, J = 5.7 Hz), 6.72 (1H, dd, J = 9.0, 2.6 Hz), 6.48 (1H, d, J = 2.6 Hz), 6.02 (1H, br s), 5.95 (1H, d, J = 14.0 Hz), 4.35 (2H, t, J = 6.9 Hz), 4.26 (1H, s), 3.75 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.66 (2H, s), 3.53-3.50 (2H, m), 3.26 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.22-3.19 (2H, m), 3.06 (6H, s), 2.39 (2H, t, J = 6.9 Hz), 2.09-2.02 (2H, m), 1.44 (3H, s), 1.37 (3H, s), 1.00 (3H, s), 0.98 (3H, s); 13C NMR ((CD3)2CO, 125 MHz) δ: 169.3, 168.7, 167.0, 161.6, 156.9, 154.1, 151.4, 145.8, 133.8, 126.9, 123.0, 111.1, 109.8, 109.5, 106.9, 100.0, 98.6, 77.9, 71.7, 48.1, 40.4, 40.2, 39.6, 37.3, 33.8, 30.9, 29.7, 26.8, 22.1, 19.3, 19.0; HRMS (ESI) C32H42N7O7 (M-H)+: m/z 636.3151, 실측치 m/z 636.3133; m.p. 141-142℃.
(R,E)-N-(3-(2-(1-(3-(2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세트아미도)프로필)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에틸아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄-아미드
Figure pct00083
(R,E)-N-(3-(부트-3-이닐아미노)-3--옥소프로프-1-에닐)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미드
(49 mg, 0.183 mmol) 및 N-(3-아지도프로필)-2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세트아미드 (44 mg, 0.183 mmol)를 THF (2 mL)에 용해시켰다. DIPEA 한 방울을 피펫을 통해 첨가한 다음, 촉매량의 CuI를 첨가하였다. 결과적인 혼합물을 70℃로 18 시간 가열한 다음, 진공 농축하여 용매를 제거하여 조질의 생성물을 황색 오일로서 수득하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-10% MeOH/CH2Cl2 중 7M NH3) 목적하는 화합물 (33 mg, 30%)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2SO, 500 MHz) δ: 10.20 (1H, d, J = 10.9 Hz), 8.31 (1H, t, J = 5.5 Hz), 7.95 (1H, t, J = 5.7 Hz), 7.87 (1H, s), 7.62 (1H, dd, J = 11.0, 10.9 Hz), 7.55 (1H, d, J = 9.0 Hz), 6.73 (1H, dd, J = 9.0, 2.6 Hz), 6.55 (1H, d, J = 2.6 Hz), 6.01 (1H, br s), 5.86 (1H, d, J = 14.0 Hz), 5.68 (1H, br s), 5.51 (1H, br s), 4.31 (2H, t, J = 6.9 Hz), 3.87 (1H, s), 3.62 (2H, s), 3.38-3.32 (3H, m), 3.16 (1H, d, J = 10.4 Hz), 3.09-3.05 (2H, m), 3.02 (6H, s), 2.76 (2H, t, J = 7.3 Hz), 1.96-1.91 (2H, m), 0.83 (3H, s), 0.80 (3H, s); 13C NMR ((CD3)2SO, 125 MHz) δ: 170.5, 168.0, 166.1, 160.7, 155.4, 152.8, 151.2, 145.4, 133.0, 125.9, 122.2, 109.4, 109.0, 108.2, 105.1, 97.4, 74.9, 67.4, 46.9, 39.7, 39.6, 39.2, 38.8, 38.5, 29.7, 25.7, 21.1, 19.9; IR υmax(필름)/cm-1 3295, 2945, 2929, 2876, 1711, 1653, 1615, 1598; HRMS (ESI) C29H38N7O7 (M-H)+: m/z 596.2838, 실측치 m/z 596.2822; m.p. 146-147℃.
화합물 합성 - 펜벤다졸컨쥬게이트
5-(페닐티오)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민
Figure pct00084
DMSO (12 mL) 및 물 (4 mL) 중 펜벤다졸(1.00 g, 3.34 mmol)의 현탁액에 포타슘 히드록사이드 (750 mg, 13.4 mmol)를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 80℃로 가열하여, 물질을 용액으로 들어가게 하였다. 72 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각한 다음 EtOAc (100 mL) 및 물 (100　mL)로 희석하였다. 층들을 분리하고 수성 물질을 추가 부분의 EtOAc (2 Х 75 mL)로 더 세척한 다음 유기층들을 한데 모아 염수 (100 mL)로 세척, 황산나트륨으로 건조하고 진공 농축하여 목적하는 구아니딘 (796 mg, 99%)을 밝은 보라색 고체로서 얻었다.
1H NMR ((CD3)2CO, 400 MHz) δ: 10.17 (1H, br s), 7.35 (1H, dd, J = 1.7, 0.5 Hz), 7.27-7.22 (3H, m), 7.14 - 7.10 (4H, m), 5.97 (2H, br s).
3차-부틸 3-옥소-3-(5-(페닐티오)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일아미노)프로필카바메이트
Figure pct00085
5-(페닐티오)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 (116 mg, 0.482 mmol) 및 N-(3차-부톡시카보닐)-L-알라닌 (137 mg, 0.723 mmol)를 DMF (4.5 mL)에 용해시켜 보라색 용액을 얻었다. 혼합물을 0℃로 냉각한 다음 HBTU (292 mg, 0.771 mmol) 및 DIPEA (134 μL, 0.771 mmol)을 첨가하고 16 시간 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (30 mL)로 희석한 다음 1　M NaOH (25 mL), 물 (25　mL) 및 염수 (4 Х 20 mL)로 세척한 다음 건조 (Na2SO4) 및 진공 환원시켜 조질의 생성물을 황색 오일로서 수득하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (0-2%　MeOH/CH2Cl2) 정제하여 목적 생성물 (185 mg, 93%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2CO, 400 MHz) δ: 11.87 (2H, br s), 7.80 (1H, s), 7.70 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.40-7.36 (3H, m), 7.31-7.26 (3H, m), 6.25 (1H, br appt), 3.60-3.56 (2H, m), 2.93 (2H, t, J = 6.7 Hz), 1.47 (9H, s). HRMS (ESI) C21H24N4NaO3S (M+Na)+ 계산치: m/z 435.1461, 실측치 m/z 435.1443.
(R,E)-2,2,5,5-테트라메틸-N-(3-옥소-3-(3-옥소-3-(5-(페닐티오)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일아미노)프로필아미노)프로프-1-에닐)-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00086
3차-부틸 3-옥소-3-(5-(페닐티오)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일아미노)프로필카바메이트 (60 mg, 0.145 mmol)를 CH2Cl2 (1 mL) 및 TFA (1 mL)의 혼합물에 용해시키고 및 실온으로 2 시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공 환원하여 조질의 TFA 염을 핑크색 오일로서 수득하였다. 조질의 염을 DMF (1.5 mL)에 용해시키고 0℃로 냉각한 다음 (R,E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (27 mg, 0.106 mmol), HBTU (60 mg, 0.159 mmol) 및 DIPEA (56 μL, 0.318 mmol)을 순차적으로 첨가하였다. 결과적인 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반한 후 EtOAc (15 mL)로 희석하고 포화 NaHCO3 (15 mL), 물 (15 mL) 및 염수 (4 Х 10 mL)로 세척한 후 건조 (Na2SO4)하고 진공 환원시켜 조질의 생성물을 황색 오일로서 수득하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (0-5% MeOH/CH2Cl2) 정제하여 목적하는 생성물 (31mg, 53%)을 크림 무색 고체로서 얻었다.
1H NMR ((CD3)2CO, 500 MHz) δ: 11.33 (1H, br s), 11.30 (1H, br s), 9.41 (1H, d, J = 10.8 Hz), 7.85 (1H, dd, J = 14.0, 10.8 Hz), 7.69 (1H, s), 7.58 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.33-7.18 (7H, m), 5.96 (1H, d, J = 14.0 Hz), 4.23 (1H, s), 3.78 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.68-3.65 (2H, m), 3.29 (1H, d, J = 11.7 Hz), 2.86 (2H, t, J = 6.5 Hz), 1.47 (3H, s), 1.39 (3H, s), 1.03 (3H, s), 1.00 (3H, s).
화합물 합성 - 알벤다졸 컨쥬게이트
5-(프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민
Figure pct00087
MeOH (25 mL) 및 물 (6.5 mL) 중 알벤다졸 (886 mg, 3.34 mmol)의 현탁액에 포타슘 히드록사이드 (375 mg, 6.68 mmol)를 첨가하였다. 결과적인 혼합물을 환류 가열하여 황색 용액을 수득하였다. 72 시간 가열한 후, TLC 분석 결과 출발 물질이 존재하는 것으로 나타났다. 포타슘 히드록사이드 (375 mg, 6.68 mmol)의 추가 부분을 첨가하고 혼합물을 24 시간 더 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각한 후 MeOH를 진공 제거하였다. 남아있는 수성 물질을 CH2Cl2 (3Х20 mL)로 희석한 후 한데 모은 유기층을 염수 (50 mL)로 세척하고, 황산나트륨으로 건조 및 진공 농축하여 목적하는 구아니딘 (501 mg, 72%)을 담회색 고체로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2SO, 400 MHz) δ: 10.67 (1H, br s), 7.14 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.03 (1H, dd, J = 8.1, 0.5 Hz), 6.92 (1H, br), 6.20 (2H, s), 2.79 (2H, t, J = 7.3 Hz), 1.56-1.47 (2H, m), 0.94 (3H, t, J = 7.3 Hz). 참조문헌: Zhao 등 Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 3328-3337.
(R,E)-2,2,5,5-테트라메틸-N-[3-옥소-3-[(5-프로필설파닐-1H-벤즈이미다졸-2-일)아미노]프로프-1-에닐]-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00088
5-(프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 (33 mg, 0.159 mmol) 및 (R,E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (27 mg, 0.106 mmol)을 DMF (1 mL)에 0℃에서 용해시켰다. HBTU (60 mg, 0.159 mmol) 및 DIPEA (28 μL, 0.159 mmol)를 첨가하고 결과적인 혼합물을 16 시간 동안 교반하면서 온도를 실온으로 승온시켰다. 반응물을 EtOAc (15 mL)로 희석하고 포화 NaHCO3 (15 mL), 물 (15 mL) 및 염수 (4Х10 mL)로 세척한 후 건조 (Na2SO4) 및 진공 환원시켜 조질의 생성물을 황색 오일로서 수득하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (0-5% MeOH/EtOAc)로 수회 정제 시도하여 목적하는 생성물 (9 mg, 17%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 11.65 (1H, br), 7.82 (1H, dd, J = 12.0, 8.9 Hz), 7.40 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.37 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.11 (1H, dd, J = 8.4, 1.7 Hz), 6.33 (2H, br), 6.08 (1H, d, J = 12.0 Hz), 4.31 (1H, s), 3.78 (1H, d, J = 11.8 Hz), 3.39 (1H, d, J = 11.8 Hz), 2.92 (2H, t, J = 7.3 Hz), 1.72-1.65 (2H, m), 1.64 (3H, s), 1.52 (3H, s), 1.10 (6H, s), 1.03 (3H, t, J = 7.3 Hz). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 169.2, 167.9, 154.5, 140.7, 132.7, 124.3, 122.8, 118.4, 112.8, 99.4, 97.2, 77.4, 71.2, 36.8, 33.4, 29.7, 29.3, 22.6, 21.8, 19.1, 18.7, 13.4. HRMS (ESI) C22H31N4O4S (M+H)+ 계산치: m/z 447.2066, 실측치 m/z 447.2037.
3차-부틸 3-옥소-3-(5-(프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일아미노)프로필카바메이트
Figure pct00089
5-(프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 (100 mg, 0.482 mmol) 및 N-(3차-부톡시카보닐)-L-알라닌 (137 mg, 0.723 mmol)을 DMF (4.5 mL)에 용해시켜 보라색 용액을 수득하였다. 혼합물을 0℃로 냉각한 다음 HBTU (292 mg, 0.771 mmol) 및 DIPEA (134 μL, 0.771 mmol)을 첨가하고 16 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (30 mL)로 희석한 다음 1M NaOH (25 mL), 물 (25 mL) 및 염수 (4Х20 mL)로 세척한 후 건조 (Na2SO4) 및 진공 환원시켜 조질의 생성물을 황색 오일로서 수득하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (0-2% MeOH/CH2Cl2) 정제하여 목적하는 생성물 (125 mg, 69%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2SO, 500 MHz) δ: 12.06 (1H, br), 11.54 (1H, s), 7.50-7.36 (2H, m), 7.11 (1H, d, J = 7.9 Hz), 6.91 (1H, t, J = 5.6 Hz), 3.29-3.25 (2H, m), 2.86 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.59 (2H, t, J = 7.0), 1.57-1.50 (2H, m), 1.37 (9H, s), 0.95 (3H, t, J = 7.2 Hz). HRMS (ESI) C18H26N4NaO3S (M+Na)+ 계산치: m/z 401.1618, 실측치 m/z 401.1596.
(R,E)-2,2,5,5-테트라메틸-N-(3-옥소-3-(3-옥소-3-(5-(프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일아미노)프로필아미노)프로프-1-에닐)-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00090
3차-부틸 3-옥소-3-(5-(프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일아미노)프로필카바메이트 (60 mg, 0.159　mmol)를 CH2Cl2 (1 mL) 및 TFA (1 mL)의 혼합물에 용해시키고 온에서 2 시간 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공 환원하여 조질의 TFA 염을 핑크색 오일로서 수득하였다. 이 조질의 염을 DMF (1.5 mL)에 용해하고 0℃로 냉각한 후 (R,E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (27 mg, 0.106 mmol), HBTU (60 mg, 0.159 mmol) 및 DIPEA (56 μL, 0.318 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 결과적인 혼합물을 실온에서 16 시간 교반한 다음 EtOAc (15 mL)로 희석하고 포화 NaHCO3 (15 mL), 물 (15 mL) 및 염수 (4 Х 10 mL)로 세척한 후 건조 (Na2SO4) 및 진공 환원하여 조질의 생성물을 회백색 고체로서 수득하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (0-10% MeOH/EtOAc) 정제하여 목적하는 생성물 (32 mg, 58%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2CO, 500 MHz) δ: 11.52 (2H, br), 9.38 (1H, d, J = 10.8 Hz), 7.83 (1H, dd, J = 14.0, 10.8 Hz), 7.59 (1H, s), 7.45 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.28 (1H, t, J = 5.7 Hz), 7.20 (1H, dd, J = 8.4, 1.7 Hz), 5.93 (1H, d, J = 14.0 Hz), 4.26 (1H, s), 3.75 (1H, d, J = 11.8 Hz), 3.66-3.62 (2H, m), 3.26 (1H, d, J = 11.8 Hz), 2.88 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.83 (2H, t, J = 6.5 Hz), 1.64-1.56 (2H, m), 1.44 (3H, s), 1.36 (3H, s), 1.00-0.97 (9H, m); HRMS (ESI) calc for C25H36N5O5S (M+H)+ 계산치 518.2437; 실측치 518.2406.
화합물 합성 - 단백질 컨쥬게이트
3차-부틸 (5-히드록시펜틸)카바메이트
Figure pct00091
100 mL 플라스크에 5-아미노펜탄올 (500 mg, 4.84 mmol) 및 CH2Cl2 (10　mL)을 첨가하고 이 혼합물을 5분간 교반한 후, Et3N (1.3 mL, 9.6 mmol)를 첨가한 다음 CH2Cl2 (10 mL) 중 Boc2O (1.16 g, 5.3 mmol)의 용액을 적가하였다. 이어서 반응 혼합물을 실온에서 16 시간 교반한 후, 물 (20 mL)로 희석하였다. 상들을 분리하고, 수성 상을 CH2Cl2 (2x20 mL)로 추출하였다. 한데 모은 유기물을 염수 (60　mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조 및 여과하였다. 용매를 진공 제거하여 황색 오일을 수득하였다. 조질의 생성물을 크로마토그래피 (CH3OH/CH2Cl2 (1-5%)) 정제하여 목적하는 알코올을 황색 오일 (730 mg, 74%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 4.5 (1H, br s), 3.67 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.15 (2H, dd, J = 12.8, 6.3 Hz), 1.6-1.49 (4H, m), 1.45 (9H, s), 1.44-1.39 (2H, m). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 156.0, 79.1, 62.7, 40.4, 32.2, 29.8, 28.4, 22.9.
3차-부틸 (5-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)펜틸)카바메이트.
Figure pct00092
25 mL 플라스크에 3차-부틸 (5-히드록시펜틸)카바메이트 (203 mg, 1 mmol), 말레이미드 (107 mg, 1.1 mmol), 트리페닐포스핀 (283 mg, 1.08 mmol) 및 THF (5　mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 간 교반한 후 DIAD (0.23 mL, 1.2 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 다시 16 시간 더 교반하고 이 시점에서, 용매를 진공 환원시켜 조질의 황색 오일을 수득하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (CH3OH/CH2Cl2 (0-1%)) 정제하여 목적하는 화합물 (248 mg, 87%)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 6.70 (2H, s), 4.5 (1H, br s), 3.53 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.12 (2H, dd, J = 12.6, 6.2 Hz), 1.67-1.57 (2H, m),1.56-1.47 (2H, m), 1.46 (9H, s),1.36-1.30 (2H, m). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 170.8, 156.3, 134.0, 79.1, 70.1, 40.3, 37.6, 29.8, 28.4, 23.9.
3차-부틸 (3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로필)카바메이트
Figure pct00093
25 mL 플라스크에 3차-부틸 (3-히드록시프로필)카바메이트 (0.25 mL, 1.5 mmol), 말레이미드 (175 mg, 1.8 mmol), PPh3 (472mg, 1.8 mmol) 및 THF (7　mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 간 교반한 후, DIAD (0.35 mL, 1.8 mmol)를 적가하였다. 반응물을 실온에서 다시 18 시간 더 교반하교 용매를 진공 제거하여 조질의 황색 오일을 수득하였다. 이 조질의 오일을 컬럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트/페트롤륨 에테르 (0- 30%)) 정제하여 무색 오일 (257 mg, 69%)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 6.63 (2H, s), 5.08 (1H, br s), 3.55-3.42 (2H, t, J = 6.7 Hz), 3.06-2.9 (2H, dd, J = 11.9, 5.8 Hz), 1.73-1.63 (2H, q, J = 6.7 Hz),1.38 (9H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 170.9, 170.3, 135.1, 79.3, 70.1, 37.3, 34.9, 28.4.
1-(5-아미노펜틸)-1H-피롤-2,5-디온 2,2,2-트리플루오로아세테이트염
Figure pct00094
10 mL 플라스크에 3차-부틸 (5-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)펜틸)카바메이트 (140 mg, 0.49 mmol), CH2Cl2 (0.6 mL) 및 트리플루오로아세트산 (0.6 mL)를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 2 5. 시간 교반한 후, 반응 혼합물을 CH2Cl2 (2 mL)로 희석하고 물 (5 mL)로 켄칭하였다. 상들을 분리하고 유기상을 물 (5x3 mL)로 세척하였다. 한데 모은 수성상들을 CH2Cl2 (3x5　mL)로 추출한 후 고진공 하에 물을 36 시간 동안 제거하였다. 생성물이 백색 결정 (107 mg, 73%)으로서 수득되었다.
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ: 6.71 (2H, s), 3.40 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.80 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.62-1.49 (4H, m), 1.30-1.23 (2H, m). 13C NMR (MeOD, 125 MHz) δ: 171.2, 133.9, 39.1, 36.6, 27.6, 26.5, 23.1. 19F NMR (MeOD, 470 MHz) δ: -76.8.
3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로판-1-아미늄 2,2,2-트리플루오로아세테이트염
Figure pct00095
10 mL 플라스크에 3차-부틸 (3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로필)카바메이트 (250 mg, 0.98 mmol), CH2Cl2 (1.5 mL) 및 트리플루오로아세트산 (1.5 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3 시간 교반하였다. 그 후 반응 혼합물을 CH2Cl2 (2 mL)로 희석한 후 물 (5 mL)을 첨가하였다. 유기상을 물 (5x 3mL)로 희석하였다. 한데 모은 수성상들을 CH2Cl2 (3x5 mL)로 세척한 후 물을 고진공 하에 36 시간 동안 제거하였다. 생성물은 백색 고체 (250 mg, 95%)로서 수득되었다.
1H NMR (MeOD, 500 MHz) δ: 6.86 (2H, s), 3.63 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.95 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.97-1.91 (2H, m). 13C NMR (MeOD, 125 MHz) δ: 171.1, 134.1, 37.0, 34.0, 26.5. 19F NMR (MeOD, 470 MHz) δ: -76.8 (3F).
퍼플루오로페닐 (R,E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트
Figure pct00096
10 mL 플라스크에 (R,E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (100 mg, 0.38 mmol), 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀 (90 mg, 0.48　mmol), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 염산염 (88 mg, 0.45　mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘 (2 mg, 0.016 mmol) 및 CH2Cl2 (3 mL)를 첨가하였다. 결과적인 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 이 시점에서, 용매를 진공 환원하고 조질의 물질을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 (100%))로 정제하였다. 정제 후 출발 물질 아크릴산(10 mg, 10%)이 황색 오일(60mg, 40%)로서 예상되는 생성물 및 황색 오일(60mg, 40%)로서 상응하는 Z-이성질체와 함께 회수되었다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 8.61 (1H, d, J = 12.5 Hz), 8.1 (1H, dd, J = 12.5,12.5 Hz), 5.76 (1H, d, J = 14 Hz), 4.18 (1H, s), 3.66 (1H, d, J = 12.0 Hz), 3.27 (1H, d, J = 12.0 Hz), 1.45 (3H, s), 1.40 (3H, s), 0.99 (3H, s), 0.96 (3H, s). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 168.2, 162.9, 140.2, 140.0, 138.8, 136.8, 99.7, 98.8, 77.0, 71.2, 33.5, 29.4, 21.7, 18.9, 18.8. 19F NMR (CDCl3, 470 MHz) δ: -152.0, -158.0, -163.0. HRMS (ESI) C18H18F5NO5 M+ 계산치: m/z 423.1105, 실측치 m/z 423.1081.
퍼플루오로페닐 (R,Z)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트
Figure pct00097
10 mL 플라스크에 (R,Z)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (35 mg, 0.13 mmol), 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀 (38 mg, 0.20 mmol), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 염산염 (38 mg, 0.19 mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘 (3 mg, 0.02 mmol) 및 CH2Cl2 (2 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18 시간 교반한 다음 용매를 진공 제거하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (페트롤륨 에테르:에틸 아세테이트 (0-20%)) 정제하였다. 정제 후, 목적하는 에스테르가 황색 오일 (40 mg, 64%)로서, 대응하는 황색 오일의 E-이성질체(22 mg, 35%)와 함께 수득되었다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 10.80 (1H, d, J = 11.5 Hz), 7.63-7.59 (1H, dd, J = 9.0, 8.5 Hz), 5.39 (1H, d, J = 8.5 Hz), 4.16 (1H, s), 3.64 (1H, d, J = 12.0 Hz), 3.25 (1H, d, J = 12.0 Hz), 1.42 (3H, s), 1.39 (3H, s), 0.99 (3H, s), 0.97 (3H, s). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 168.9, 163.6, 142.4, 140.3, 138.9, 136.8, 99.4, 93.8, 77.2, 71.1, 33.3, 31.9, 21.7, 18.9, 18.5. 19F NMR (CDCl3, 470 MHz) δ: -151.6, -158.6, -162.7. HRMS (ESI) C18H18F5NO5 M+ 계산치: m/z 423.1105, 실측치 m/z 423.1080.
퍼플루오로페닐 (R)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)프로파노에이트
Figure pct00098
10 mL 플라스크에 (R)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)프로판산 (150 mg, 0.57 mmol), 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀 (141 mg, 0.76 mmol), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 염산염 (132 mg, 0.68　mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘 (3 mg, 0.02 mmol) 및 CH2Cl2 (4 mL)를 첨가하였다. 결과적인 혼합물을 실온에서 18시간 교반한 후, 용매를 진공 환원하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (페트롤륨 에테르-에틸 아세테이트 (0-40%)) 정제하여 목적하는 에스테르를 백색 고체 (200 mg, 81%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 7.01 (1H, br s), 4.13 (1H, s), 3.78-3.60 (2H, m), 3.71 (1H, d, J = 12.5 Hz), 3.31 (1H, d, J = 11.5 Hz), 2.98 (2H, t, J = 6.5 Hz), 1.47 (3H, s), 1.45 (3H, s), 1.08 (3H, s), 1.00 (3H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 170.1, 168.1, 99.1, 77.2, 71.4, 34.1, 33.5, 33.0, 29.3, 22.0, 18.7, 18.6. 19F NMR (CDCl3, 470 MHz) δ: -152.6, -157.6, -162.0. HRMS (ESI) C18H20F5NO5 M+ 계산치: m/z 425.1262, 실측치 m/z 425.1237.
(R,E)-N-(3-((3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로필)아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00099
10 mL 플라스크에 퍼플루오로페닐 (R,E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트 (25 mg, 0.06 mmol), 3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로판-1-아미늄 2,2,2-트리플루오로아세테이트염 (14.5 mg, 0.05 mmol) 및 CH2Cl2 (1.5 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분간 교반한 후 DIPEA (10 μL, 0.06　mmol)를 첨가하였다. 실온에서 20시간 계속 교반한 후 혼합물을 진공 환원하고, 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:CH3OH (0-4%)) 정제하여 목적하는 생성물을 옅은 핑크색 고체(8 mg, 48%)로서 수득하였다 (출발 물질 (5 mg)이 함께 회수됨).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.23 (1H, d, J = 10.8 Hz), 7.77 (1H, dd, J = 11.2, 11.2 Hz), 6.65 (2H, s), 5.95 (1H, br s), 5.75 (1H, d, J = 14 Hz), 4.12 (1H, s), 3.64 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.52 (2H, t, J = 6 Hz), 3.24 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.22-3.17 (2H, m), 1.76-1.70 (2H, m), 1.44 (3H, s), 1.38 (3H, s), 0.98 (3H, s), 0.93 (3H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 171.1, 168.0, 162.9, 134.2,123.0, 105.9, 99.4, 77.2, 71.3, 35.9, 34.7, 33.4, 29.4, 28.3, 21.9, 18.8, 18.7. IR nmax (neat)/cm- 1: 3323, 3050, 2926, 1705, 1664, 1600, 1097. HRMS (EI+) C19H27N3O6 M+ 계산치: m/z 393.1900, 실측치 m/z 393.1903. [α]D +54.667 (c = 0.3, CHCl3, T = 23.9℃).
(R,E)-N-(3-((5-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)펜틸)아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00100
10 mL 플라스크에 퍼플루오로페닐 (R,E)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트 (60 mg, 0.14 mmol), 1-(5-아미노펜틸)-1H-피롤-2,5-디온 트리플루오로아세테이트염 (38 mg, 0.12 mmol) 및 CH2Cl2 (2.2 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 간 교반한 후 DIPEA (20 μL, 0.12 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 추가로 72시간 더 교반한 후 혼합물을 진공 환원하고 농축물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:CH3OH (0-4%)) 정제하여 목적하는 생성물을 무색 오일로서 수득하였다 (32 mg, 60%).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.21 (1H, d, J = 10.4 Hz), 7.69 (1H, dd, J = 10.8,10.8 Hz), 6.63 (2H, s), 5.73 (1H, d, J = 14 Hz), 5.47 (1H, br s), 4.11 (1H, s), 3.63 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.45 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.25-3.17 (2H, m), 3.2 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.22-3.17 (2H, m), 1.76-1.70 (2H, m), 1.57-1.47 (4H, m),1.43 (3H, s), 1.38 (3H, s), 1.30-1.27 (2H, m), 0.98 (3H, s), 0.93 (3H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 170.9, 168.0, 166.2, 134.0, 132.7, 106.2, 99.4, 77.2, 71.3, 39.3, 37.4, 33.3, 29.4, 28.9, 28.2, 23.8, 21.9, 18.8, 18.7. IR nmax (neat)/cm- 1: 3329, 3050, 2933, 1701, 1662, 1097, 720. HRMS (ESI) C21H31N3O6 M+ 계산치: m/z 421.2213, 실측치 m/z 421.2207. [α]D +25.09 (c = 2.2, CHCl3, T = 23.0℃).
(R,Z)-N-(3-((3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로필)아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00101
10 mL 플라스크에 퍼플루오로페닐 (R,Z)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트 (25 mg, 0.05 mmol), 3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로판-1-아미늄 2,2,2-트리플루오로아세테이트염 (14.5 mg, 0.05 mmol) 및 CH2Cl2 (1.4 mL)를 첨가하였다. 결과적인 혼합물을 10분 동안 실온에서 교반한 후 DIPEA (10 μL, 0.06　mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 72 시간 교반한 후 혼합물을 감압 환원시키고, 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:CH3OH (0-3%))로 정제하여, 목적하는 생성물을 황색 오일 (4 mg, 17%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 11.58 (1H, d, J = 11.2 Hz), 7.25-7.20 (1H, dd, J = 9.2, 9.2 Hz), 6.65 (2H, s), 5.89 (1H, t, J = 6 Hz), 4.98 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.12 (1H, s), 3.65 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.53 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.25 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.23-3.13 (2H, m), 1.77-1.70 (2H, m), 1.53 (3H, s), 1.39 (3H, s), 0.98 (6H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 171.0, 168.8, 167.8, 134.2, 133.4, 100.5, 99.2, 77.2, 71.4, 33.5, 34.8, 33.1, 29.3, 28.3, 22.0, 19.0, 18.6. IR nmax (neat)/cm- 1: 3311, 3050, 2928, 1705, 1654, 1097, 696. HRMS (EI) C19H27N3O6 M+ 계산치: m/z 393.1900, 실측치 m/z 393.1898. [α]D +24.00 (c = 0.5, CHCl3, T = 23.8℃).
(R,Z)-N-(3-((5-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)펜틸)아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00102
10 mL 플라스크에 퍼플루오로페닐 (R,Z)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트 (30 mg, 0.07 mmol), 1-(5-아미노펜틸)-1H-피롤-2,5-디온 트리플루오로아세테이트염 (15 mg, 0.05 mmol) 및 CH2Cl2 (1.2 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분간 교반한 후 DIPEA (10 μL, 0.06 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 72 시간 동안 계속 교반한 후 혼합물을 진공 환원시키고 조질의 농축물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:CH3OH (0-3%)) 정제하여, 목적하는 생성물을 무색 오일로서 수득하였다 (12 mg, 40%).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 11.59 (1H, d, J = 11.2 Hz), 7.23-7.18 (1H, dd, J = 4.0, 2.0 Hz), 6.63 (2H, s), 5.37 (1H, t, J = 5.2 Hz), 4.92 (1H, d, J = 9.2 Hz), 4.12 (1H, s), 3.64 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.46 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.25 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.22-3.19 (2H, m), 1.58-1.43 (4H, m), 1.53 (3H, s), 1.37 (3H, s), 1.32-1.21 (2H, m), 1.18 (3H, s), 0.99 (3H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 170.9, 169.4, 168.2, 134.1, 133.2, 100.9, 99.2, 77.2, 71.4, 38.9, 37.3, 33.3, 29.7, 28.7, 28.1, 23.8, 22.0, 19.0, 18.6. HRMS (ESI) C21H31N3O6 M+ 계산치: m/z 421.2213, 실측치 m/z 421.2189. IR nmax (neat)/cm- 1: 3323, 2926, 2854, 1703, 1656, 1465, 1097, 720. [α]D +12.5 (c = 0.8, CHCl3, T = 23.9℃).
(R)-N-(3-((3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로필)아미노)-3-옥소프로필)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00103
25 mL 플라스크에 퍼플루오로페닐 (R)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)프로파노에이트 (95 mg, 0.22 mmol), 3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로판-1-아미늄 2,2,2-트리플루오로아세테이트염 (80 mg, 0.29 mmol) 및 CH2Cl2 (8 mL)를 첨가하였다. 이어서 혼합물을 실온에서 10분간 교반한 후 DIPEA (70 μL, 0.42 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 72 시간 더 계속 교반한 후 혼합물을 진공 환원시켰다. 이어서 조질의 농축물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:메탄올 (0-3%)) 정제하여 목적하는 생성물을 무색 오일(52 mg, 59%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 7.00 (1H, t, J = 7 Hz), 6.65 (2H, s), 6.32 (1H, t, J = 7 Hz), 4.01 (1H, s), 3.67 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.55-3.42 (2H, m), 3.50 (2H, t, J = 8 Hz), 3.21 (1H, d, J = 15 Hz), 3.16-3.11 (2H, m), 2.39 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.74-1.68 (2H, m), 1.38 (3H, s), 1.34 (3H, s), 0.96 (3H, s), 0.90 (3H, s). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 171.1, 170.9, 170.0, 134.2, 99.0, 77.2, 71.4, 36.1, 36.0, 34.8, 32.9, 30.9, 29.4, 28.2, 22.1, 18.8, 18.6. IR nmax (neat)/cm-1: 3310, 3098, 2945, 1706, 1647, 1533, 1097, 696. HRMS (ESI) C19H29N3O6 M+ 계산치: m/z 395.2056, 실측치 m/z 395.2033. [α]D +21.231 (c = 1.3, CHCl3, T = 23.7℃).
(R)-N-(3-((5-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)펜틸)아미노)-3-옥소프로필)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드
Figure pct00104
25 mL 플라스크에 퍼플루오로페닐 (R)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)프로파노에이트 (95 mg, 0.22 mmol), 1-(5-아미노펜틸)-1H-피롤-2,5-디온 트리플루오로아세테이트염 (60 mg, 0.20 mmol) 및 CH2Cl2 (5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분간 교반한 후 DIPEA (60 μL, 0.36 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 72시간 더 교반한 후 혼합물을 진공 환원하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:CH3OH, (0-3%)) 정제하여, 목적하는 첨가물(adduct)을 무색 오일 (90 mg, 95%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 6.97 (1H, t, J = 5.5 Hz), 6.63 (2H, s), 5.98 (1H, br s), 4.00 (1H, s), 3.61 (1H, d, J = 11.5 Hz), 3.58-3.46 (2H, m), 3.44 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.21 (1H, d, J = 11.5 Hz), 3.17-3.12 (2H, m), 2.36 (2H, t, J = 6.0 Hz), 1.56-1.42 (4H, m), 1.39 (3H, s), 1.34 (3H, s), 1.26-1.18 (2H, m), 1.03 (3H, s), 0.80 (3H, s). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 170.9, 170.8, 170.2, 134.2, 99.0, 77.2, 71.4, 39.3, 37.4, 36.1, 34.9, 32.9, 29.4, 29.2, 28.1, 23.9, 22.1, 18.8, 18.6. IR nmax (neat)/cm- 1: 3330, 2930, 1706, 1656, 1521, 1097, 696. HRMS (ESI) C21H33N3O6 M+ 계산치: m/z 423.2369, 실측치 m/z 423.2364. [α]D +24.267 (c = 1.5, CHCl3, T = 23.7℃).
(R,E)-N-(3-((3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로필)아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미드
Figure pct00105
5 mL 플라스크에 (R,E)-N-(3-((3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로필)아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (12　mg, 0.03 mmol), CH3CN (0.2 mL), 비스무쓰 클로라이드 (1 mg, 0.003 mmol) 및 H2O (10　μL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24 시간 교반한 다음 NaHCO3. 포화수용액으로 켄칭하였다. 이어서 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 후 셀라이트®를 통해 여과하였다. 용매를 진공 제거하고, 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:메탄올:NH3 (0-5%)) 정제하여 목적하는 생성물을 무색 오일 (10 mg, 92%)로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2CO), 400 MHz) δ: 9.56 (1H, br s), 7.86 (1H, dd, J = 12.0, 11.2 Hz), 7.08 (1H, br s), 6.87 (2H, s), 6.00 (1H, d, J = 13.6 Hz), 5.17 (1H, d, J = 7.0 Hz), 3.95 (2H, d, J = 5.2 Hz), 3.38 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.24 (1H, d, J = 11.6 Hz), 3.12-3.11 (2H, m), 1.64-1.61 (2H, m), 1.16 (6H, s). 13C NMR ((CD3)2CO), 100 MHz) δ: 170.8, 134.2, 133.0, 105.4, 76.5, 69.4, 39.3, 36.4, 35.2, 28.9, 20.4, 19.7. IR nmax (neat)/cm- 1: 3323, 2924, 1701, 1654, 1329, 1188. HRMS (ESI) C16H23N3O6 M+ 계산치: m/z 353.1587, 실측치 m/z 353.1562. [α]D +16.8 (c = 0.5, 아세톤, T = 24.0℃).
(R,E)-N-(3-((5-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)펜틸)아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미드
Figure pct00106
5 mL 플라스크에서 (R,E)-N-(3-((5-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)펜틸)아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (10　mg, 0.02 mmol), CH3CN (0.2 mL), 비스무쓰 클로라이드 (1 mg, 0.003 mmol) 및 H2O (10　μL)를 혼합하였다. 이어서 반응 혼합물을 실온에서 24 시간 교반한 다음 NaHCO3 포화수용액으로 켄칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 셀라이트®를 통해 여과하였다. 용매를 진공 제거하고, 및 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:메탄올:NH3 (0-5%))로 정제하여 목적하는 생성물을 무색 오일 (3 mg, 33%)로서 수득하였다.
HRMS (ESI) C18H27N3O6 M+: m/z 381.1900, 실측치 m/z 381.1880.
(R,Z)-N-(3-((3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로필)아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미드
Figure pct00107
5 mL 플라스크에 (R,Z)-N-(3-((3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로필)아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (18　mg, 0.05 mmol), CH3CN (0.3 mL), 비스무쓰 클로라이드 (3 mg, 0.009 mmol) 및 H2O (30　μL)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 24시간 교반한 다음 수 방울의NaHCO3 포화수용액으로 처리한 다음 에틸 아세테이트로 희석하였다. 용액을 셀라이트®를 통해 여과하고 용매를 진공 제거하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (CH2Cl2:메탄올:NH3 (0-5%)) 목적하는 첨가물을 무색 오일 (5 mg, 30%)로서 얻었다.
1H NMR ((CD3)2CO, 400 MHz) δ: 11.85 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.12-7.07 (1H, dd, J = 9.2, 8.8 Hz), 6.73 (2H, s), 5.07 (1H, d, J = 6.0 Hz), 3.98 (1H, s), 3.42-3.30 (3H, m), 3.29 (1H, d, J = 10.8 Hz), 3.09-3.04 (2H, m), 1.75-1.66 (2H, m), 1.16 (6H, s). 13C NMR ((CD3)2CO), 100　MHz) δ: 170.8, 134.2, 133.0, 100.1, 76.5, 69.4, 39.3, 36.1, 35.1, 28.9, 20.4, 19.7. HRMS (ESI) C16H23N3O6 M+ 계산치: m/z 353.1587, 실측치 m/z 353.1567.
(R,Z)-N-(3-((5-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)펜틸)아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미드
Figure pct00108
5 mL 플라스크에 (R,Z)-N-(3-((5-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)펜틸)아미노)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (19　mg, 0.04 mmol), CH3CN (0.3 mL), BiCl3 (3 mg, 0.009 mmol) 및 H2O (30　μL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 교반하고 수 방울의 NaHCO3 포화수용액으로 처리하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 셀라이트®를 통해 여과하였다. 용매를 진공 제거하고, 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:메탄올:NH3 (0-5%)) 정제하여 목적하는 생성물을 무색 오일 (5 mg, 29%)로서 수득하였다.
HRMS (ESI) C18H27N3O6 M+: m/z 381.1900, 실측치 m/z 381.1877.
(R)-N-(3-((5-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)펜틸)아미노)-3-옥소프로필)-2,4-디히드록시-3,3-디메틸부탄아미드
Figure pct00109
5 mL 플라스크에 (R)-N-(3-((5-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)펜틸)아미노)-3-옥소프로필)-2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미드 (100 mg, 0.23　mmol), CH3CN (1.6 mL), BiCl3 (8 mg, 0.02 mmol) 및 H2O (80 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 교반한 다음 수 방울의 NaHCO3 포화수용액으로 처리하였다. 이어서 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 셀라이트®를 통해 여과하였다. 용매를 진공 제거하고 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:메탄올:NH3 (0-5%)) 정제하여 목적하는 생성물을 황색 오일 (43 mg, 47%)로서 수득하였다.
1H NMR ((CD3)2CO), 500 MHz) δ: 7.52 (1H, t, J = 6.0 Hz), 7.22 (1H, br s),6.73 (2H, s), 3.80 (1H, s), 3.41-3.24 (6H, m), 3.06-3.02 (2H, m), 2.28 (2H, t, J = 5.5 Hz), 1.46-1.34 (4H, m), 1.20-1.18 (2H, m), 0.86 (3H, s), 0.74 (3H, s). 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 173.6, 170.9, 170.8, 134.2, 76.3, 69.6, 63.3, 39.2, 38.8, 37.1, 35.2, 29.4, 28.0, 23.8, 21.1, 19.8. IR υmax (neat)/cm-1: 3310, 2931, 1700, 1646, 1539, 1410, 695. HRMS (ESI) C18H29N3O6 M+ 계산치: m/z 383.2056, 실측치 m/z 383.2051. [α]D +13.023 (c = 4.3, 아세톤, T = 23.9℃).
화합물 합성 - 이버멕틴 컨쥬게이트
5-O-(3차-부틸디메틸실릴)아버멕틴 B1a
Figure pct00110
무수 DMF (8.0 mL) 중 이버멕틴 B1a (980 mg, 1.1 mmol) 용액을 이미다졸 (495 mg, 7.3 mmol)로 처리한 다음, 이어서 무수 DMF (2.0 mL) 중 TBDMSCl (560 mg, 3.28 mmol) 용액으로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2.5 시간 교반한 다음 Et2O (25 mL) 및 이어서 H2O (15 mL)로 처리하였다. 이어서 결과적인 에멀젼을 0.5 시간 교반하고, 유기층을 분리하고, 수성상을 Et2O (3 x 25 mL)로 추출하였다. 한데 모은 유기물을 H2O (5 x 100 mL) 및 염수 (2 x 100 mL)로 세척하였다. 한데모은 유기 세척물을 Na2SO4로 건조하고 감압 농축하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (실리카겔, 페트롤륨 에테르 중 용리 구배 0-30% EtOAc) 예상 생성물을 백색 고체 (638 mg, 58%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 5.83-5.78 (1H, br m), 5.73-5.69 (2H, br m), 5.38 (1H, d, J = 3.2 Hz), 5.32 (1H, br s), 5.29-5.28 (1H, br m), 4.97 (1H, d, J = 9.6 Hz), 4.76 (1H, d, J = 3.2 Hz), 4.67 (1H, d, J = 14.4 Hz), 4.56 (1H, d, J = 14.8 Hz), 4.42 (1H, br s), 3.92(1H, br s), 3.85-3.78 (2H, br m), 3.77-3.72 (1H, br m,), 3.68-3.57 (2H, br m), 3.50-3.45 (1H, br m), 3.41 (3H, s), 3.40 (3H, s), 3.36 (1H, br s), 3.25-3.19 (2H, br m), 3.14 (1H, t, J = 8.8 Hz), 2.53 (1H, app t, J = 6.8 Hz), 2.35-2.29 (2H, br m), 2.28-2.25 (1H, br m), 2.21 (1H, dd, J = 13.2, 5.0 Hz), 1.98 (1H, dd, J = 12.0, 4.4 Hz), 1.77 (3H, s), 1.74-1.71 (1H, br m), 1.64 (1H, d, J = 11.1 Hz), 1.59-1.52 (7H, br m), 1.49 (3H, s), 1.47-1.39 (2H, br m), 1.33 (1H, t, J = 11.6 Hz), 1.26 (3H, br s), 1.25 (3H, br s), 1.14 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.96-0.92 (3H, br m), 0.91 (9H, s), 0.87-0.81 (4H, br m), 0.76 (3H, d, J = 4.4 Hz), 0.12 (6H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 174.0, 140.2, 137.5, 137.4, 135.0, 124.8, 119.3, 118.3, 117.3, 98.4, 97.4, 94.7, 81.8, 80.3, 80.2, 80.0, 79.3, 78.1, 76.5, 76.0, 69.4, 68.6, 68.1, 67.9, 67.2, 56.4, 56.3, 45.7, 41.1, 39.6, 36.8, 35.7, 35.4, 34.5, 34.1, 31.2, 27.3, 26.8, 25.8, 20.2, 20.0, 18.4, 17.6, 17.4, 15.1, 12.4, 12.0, -4.6, -4.8.
4"-O-[(R,Z)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트]-5-O-(3차-부틸디메틸실릴)아버멕틴 B1a
Figure pct00111
CH2Cl2 (1 mL) 중 5-O-(3차-부틸디메틸실릴)아버멕틴 B1a (45 mg, 40 μmol)의 용액을 DCC (19 mg, 90 μmol), 이어서 DMAP (10 mg, 80 μmol) 및 CH2Cl2 (1.5 mL) 중 (R,Z)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴산 (10 mg, 40 μmol)의 용액으로 순차적으로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서, TLC 분석이 반응 종결을 나타낼 때까지 (18 시간) 교반하였다. 이어서 반응물을 CH2Cl2 (5 mL)로 희석하였다. 유기상을 1M HCl (7 mL)로 세척하고, NaHCO3 (7 mL) 포화수용액 및 염수 (7 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 건조하고 감압 농축하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (실리카겔, 페트롤륨 에테르 중 용리 구배 0-10% EtOAc) TBS 보호된 이버멕틴을 무색 오일 (30mg, 61%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 11.12 (1H, d, J = 11.6 Hz), 7.52-7.43 (1H, m), 5.87-5.82 (1H, br m), 5.79-5.71 (2H, br m), 5.42 (1H, br s), 5.36-5.31 (2H, br m), 5.19 (1H, d, J = 8.9 Hz), 5.00 (1H, d, J = 9.9 Hz), 4.79 (1H, br s), 4.77 (1H, appt, J = 9.6 Hz), 4.70 (1H, d, J = 14.6 Hz), 4.60 (1H, d, J = 14.5 Hz), 4.46 (1H, br s), 4.22 (1H, s), 3.96 (1H, br s), 3.92-3.83 (3H, m), 3.73 (1H, d, J = 11.7 Hz), 3.70-3.60 (3H, m), 3.45 (3H, s), 3.42-3.38 (4H, m), 3.34 (1H, d, J = 11.7Hz), 3.28-3.20 (2H, m), 2.53 (1H, br s), 2.38-2.32 (2H, m), 2.31-2.22 (2H, m), 2.00 (1H, dd, J = 11.7, 3.8 Hz), 1.81 (3H, s), 1.79-1.62 (9H, m),1.59 (3H, s), 1.47 (3H, s), 1.44-1.41 (5H, m), 1.37 (1H, t, J = 12.4 Hz), 1.28 (3H, br s), 1.27 (3H, br s), 1.18 (3H, d, J = 6.3 Hz), 1.07 (3H, s), 1.05 (3H, s), 0.99-0.96 (3H, m), 0.94 (9H, s), 0.88-0.85 (4H, m), 0.81-0.79 (1H, m), 0.15 (6H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 174.0, 168.9, 167.2, 140.3, 137.5, 137.4, 136.6,135.0, 124.8, 119.3, 118.3, 117.2, 99.3, 98.4, 98.2, 97.5, 94.8, 81.9, 80.8, 80.2, 80.0, 79.2, 77.2, 77.1, 76.6, 75.7, 75.6, 71.3, 69.5, 68.7, 67.9, 67.1, 57.2, 56.5, 45.7, 41.1, 39.6, 36.8, 35.7, 35.4, 35.2, 34.5, 34.1, 33.3, 31.2, 29.3, 27.2, 26.9, 25.8, 21.9, 20.3, 20.0, 18.9, 18.6,18.4, 17.4 (2C), 15.2, 12.4, 12.1, -4.5, -4.8. HRMS (ESI) C68H109NO18Si [M-CO2]+ 계산치: m/z 1211.7516, 실측치 m/z 1211.6699. IR υmax (필름)/cm-1: 3420, 2945, 2879, 1775, 1670, 1550, 1392, 1128. [α]D +12.21 (c = 0.7, CHCl3, T = 23.1℃).
4"-O-[(R,Z)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트]아버멕틴 B1a, 14
Figure pct00112
MeOH (2.5 mL) 중 4"-O-[(R,Z)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트]-5-O-(3차-부틸디메틸실릴)아버멕틴 B1a (30 mg, 20 μmol)의 용액을 촉매량의 p-TsOH (3 mg)로 처리하였다. 반응 혼합물을 18℃에서 30분간 교반하였다. 그런 다음 반응물을 H2O (17 mL) 및 이어서 EtOAc (20 mL)로 희석하였다. 유기층 H2O (3 x 20 mL) 및 염수 (20 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고 감압 농축하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (실리카겔, 용리 구배 0-3% MeOH/CH2Cl2) 4"-O-[(R,Z)-3-(2,2,5,5-테트라메틸-1,3-디옥산-4-카복사미도)아크릴레이트]아버멕틴 B1a를 황색 오일 (16 mg, 58%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 11.27 (1H, d, J = 11.6 Hz), 7.52 (1H, dd, J = 11.6 Hz, 9.6 Hz), 5.89 (1H, d, J = 9.2 Hz), 5.82-5.69 (2H, m), 5.44 (1H, br s), 5.42-5.32 (2H, m), 5.23 (1H, d, J = 9.2 Hz), 5.00 (1H, d, J = 10.0 Hz), 4.80 (1H, br s), 4.75 (1H, d, J = 9.5 Hz), 4.72-4.65 (2H, m), 4.32 (1H, d, J = 6.0 Hz), 4.23 (1H, s), 4.13 (1H, br s), 3.99 (2H, m), 3.92-3.84 (2H, m), 3.73-3.62 (4H, m), 3.58 (1H, d, J = 6.8 Hz), 3.45 (3H, br s), 3.38 (3H, br s), 3.30 (1H, br s), 3.28-3.21 (3H, m), 2.54 (1H, br s), 2.39-2.32 (2H, m), 2.32-2.22 (2H, m), 2.00 (1H, dd, J = 12.0, 4.4 Hz), 1.89 (3H, s),1.77 (1H, d, J = 11.6 Hz), 1.67 (1H, d, J = 9.6 Hz), 1.62-1.47 (16H, m),1.47-1.34 (3H, m), 1.29-1.25 (3H, m), 1.20-1.15 (6H, m), 1.07 (3H, s), 1.00 (3H, s), 0.95 (3H, t, J = 7.2 Hz), 0.87 (3H, d, J = 6.6 Hz), 0.83-0.78 (4H, m). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 174.0, 168.9, 167.2, 140.3, 138.0, 137.9, 137.2, 135.0, 124.7, 120.4, 118.3, 118.0, 107.0, 98.5, 98.3, 97.4, 94.8, 81.8, 80.7, 80.4, 79.2, 79.0, 77.9, 77.2, 76.3, 75.8, 75.7, 71.3, 68.6, 68.5, 67.7, 67.2, 67.1, 57.1, 56.5, 45.7, 41.1, 39.7, 36.9, 35.7, 35.4, 35.1, 34.5, 34.1 (2C), 31.2, 28.0, 27.2, 22.9, 20.8, 20.5, 20.2, 20.0, 18.8, 18.4, 17.4 (2C), 15.1, 12.4, 12.1. HRMS (ESI) C62H95NO18 [M-CO2]+ 계산치: m/z 1097.6651, 실측치 m/z 1097.1176. IR υmax (필름)/cm- 1: 3680, 2947, 2879, 1783, 1645, 1498, 1288. [α]D +4.50 (c = 0.2, CHCl3, T = 23.0℃).
화합물 합성 - BODIPY - 이버멕틴 복합체
5-(3-아지도프로필)-1H-피롤-2-카브알데히드
Figure pct00113
무수 DMF (20 mL)를 0℃로 냉각한 다음 POCl3 (0.6 mL, 6.6 mmol)로 처리하였다. 결과적인 용액을 이어서 0℃에서 5분간 교반한 다음 실온에서 추가 30분 동안 교반하였다. 반응물을 0℃로 냉각하고, 무수 DMF (2 mL) 중 2-(3- 아지도프로필)-1H-피롤 (805 mg, 5.3 mmol) 용액으로 처리하였다. 이어서, TLC 분석에 의해 반응 종결로 나타날 때까지 (18 시간) 혼합물을 40℃로 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각하고 EtOAc (5 mL)로 희석한 다음 4M 수성 NaOH 용액 (5 mL)으로 처리하였다. 상들을 분리하고, 수층을 EtOAc (3 x 5 mL)로 추출하였다. 한데 모은 유기층들을 H2O (5 x 20 mL), 염수 (2 x 20 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하였다. 결과적인 용액을 감압 농축하여 목적하는 알데히드를 갈색 오일 (490 mg, 51%)로서 수득하였다. 생성물을 추가 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 9.95 (1H, br s), 9.41 (1H, s), 6.93-6.91 (1H, m), 6.13-6.12 (1H, m), 3.01 (2H, t, J = 8.0 Hz), 2.72 (2H, t, J = 7.0 Hz), 1.8- 1.6 (2H, m). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 178.3, 129.7, 128.5, 127.8, 109.6, 60.4, 28.0, 24.4. HRMS (ESI) C8H10N4O [M]+ 계산치: m/z 178.0855, 실측치 m/z 178.0851. IR υmax (필름)/cm- 1: 3233, 2831, 2099, 1735, 1653, 1376.
3차-부틸 (E)-3-(1H-피롤-2-일)아크릴레이트
Figure pct00114
벤젠 (110 mL) 중 피롤-2-카복스알데히드 (1.5 g, 15.2 mmol)의 용액을 (3차-부톡시카보닐메틸렌)트리페닐포스포란 (10.0 g, 26.5 mmol)로 처리하였다. TLC 분석에 의해 반응 종결로 나타날 때까지 (22 시간) 반응 혼합물을 80℃로 가열하였다. 이어서 반응물을 실온으로 냉각하고 감압 농축하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-20% EtOAc/PE) 예상된 에스테르를 오렌지 오일 (2.45 g, 83%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 9.00 (1H, br s), 7.49 (1H, d, J = 16.0 Hz), 6.92 (1H, apps), 6.55 (1H, apps), 6.29 (1H, apps), 6.01 (1H, d, J = 16.0 Hz), 1.55 (9H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 167.1, 133.3, 128.5, 122.0, 113.7, 113.3, 110.8, 80.2, 28.2. HRMS (ESI) C11H15NO2 [M+Na]+ 계산치: m/z 216.0995, 실측치 m/z 216.0966. IR υmax (필름)/cm- 1: 3358, 2919, 2848, 1713, 1632, 1150.
3차-부틸 3-(1H-피롤-2-일)프로파노에이트
Figure pct00115
무수 MeOH (95 mL) 중 (E)-3-(1H-피롤-2-일)아크릴레이트 (2.4 g, 12.4 mmol)의 용액을 아르곤 분위기 하에 5분간 교반하였다. Pd/C (10%, 160 mg, 7 mol%)을 이 용액에 첨가하고, 반응물을 수소 분위기 하에 놓고, TLC 분석이 반응 종결을 나타낼 때까지 (18 시간) 실온에서 교반하였다. 반응물을 셀라이트® 베드를 통해 여과하고 MeOH (2 x 25 mL)로 세척하였다. 유기상들을 한데 모아, 진공 농축하여 목적하는 에스테르를 갈색 오일 (2.23 g, 92%)로서 수득하였다. 수득한 생성물은 추가 정제를 필요로 하지 않았다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.62 (1H, br s), 6.69 (1H, apps), 6.12 (1H, appd, J = 2.4 Hz), 5.93 (1H, apps), 2.89 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.57 (2H, t, J = 6.4 Hz), 1.47 (9H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 173.6, 131.3, 116.7, 107.8, 105.4, 80.7, 35.7, 28.1, 22.6. HRMS (ESI) C11H17NO2 [M+Na] + 계산치: m/z 218.1151, 실측치 m/z 218.1168. IR υmax (필름)/cm- 1: 3394, 2919, 2848, 1644.
3차-부틸 3-(5-(3-아지도프로필)-4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)프로파노에이트
Figure pct00116
CH2Cl2 (8 mL)중 5-(3-아지도프로필)-1H-피롤-2-carb알데히드 (330 mg, 1.9 mmol)의 0℃ 용액을 CH2Cl2 (2 mL) 중 3차-부틸 3-(1H-피롤-2-일)프로파노에이트 (346 mg, 1.8 mmol) 용액으로 처리하였다. 이어서 결과적인 혼합물을 POCl3 (150 μL, 1.5 mmol)을 적가하여 처리하고 및 이어서 실온에서 6.5 시간 동안 교반한 다음 0℃로 다시 냉각하였다. 이어서 반응 혼합물을 BF3.Et2O (0.9 mL, 7.2 mmol), 다음으로 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.5 mL, 8.5 mmol)으로 순차적으로 처리하였다. 그런 다음 TLC 분석이 반응 종결을 가리킬 때까지 (18시간) 혼합물을 실온에서 교반하였다. H2O (10 mL)에 의해 반응물을 켄칭하고 CH2Cl2 (5 mL)로 희석한 다음 셀라이트® 베드를 통해 여과하였다. 셀라이트®를 CH2Cl2 (2 x 10 mL)로 세척하고 유기상들을 한데 모았다. 결합된 유기 세척물을 Na2SO4로 건조하고 감압 농축하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (실리카겔, 페트롤륨 에테르 중 용리 구배 0-15% EtOAc) 예상된 에스테르를 적색 오일 (71 mg, 9%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.13 (1H, s), 7.00-6.92 (2H, m), 6.37- 6.34 (2H, m), 3.35-3.27 (4H, m), 2.80 (2H, t, J = 8.0 Hz), 2.67 (2H, t, J = 8.0 Hz), 1.46 (9H, s),1.27 (2H, appt, J = 7.2 Hz). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 172.7, 161.6, 161.1, 134.7, 134.6, 130.6, 130.2, 127.8, 118.7, 118.1, 80.7, 51.8, 34.2, 32.8, 29.7, 28.2, 24.2. 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ: -144.17, -144.26, -144.35, -144.44. HRMS (ESI) C19H24BF2N5O2 [M-N3]+ 계산치: m/z 361.1899, 실측치 m/z 361.3293. IR υmax (필름)/cm- 1: 3172, 2978, 2150, 1733, 1609, 1490, 1439, 1155.
λexc= 467 nm. (510 nm 방출에서, c= 0.2 nM, MeOH).
λemis= 516 nm. (315 nm 여기에서, c= 0.2 nM, MeOH).
메틸 3-(5-포르밀-1H-피롤-2-일)프로파노에이트
Figure pct00117
무수 DMF (10 mL)를 0℃로 냉각하고 POCl3 (0.6 mL, 6.6 mmol)로 처리하였다. 그런 다음 결과적인 용액을 0℃에서 5분, 및 이어서 실온에서 추가 30분 동안 교반하였다. 반응물을 다시 0℃로 냉각하고, 및 무수 DMF (2 mL) 중 메틸 3-(1H-피롤-2-일)프로파노에이트 (800 mg, 5.2 mmol)의 용액으로 처리하였다. 이어서 TLC 분석이 반응 종결을 가리킬 때까지 (14 시간) 혼합물을 40℃로 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고 EtOAc (18 mL)로 희석한 다음 4M 수성 NaOH 용액 (5 mL)로 세척하였다. 상들을 분리하고 수층을 EtOAc (3x18 mL)로 추출하였다. 결합 유기층들을 H2O (5 x 30 mL), 염수 (2 x 30 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하였다. 결과적인 용액을 감압 농축하여 목적하는 알데히드를 갈색 오일 (630 mg, 66%)로서 수득하였다. 생성물을 추가 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 10.01 (1H, br s), 9.42 (1H, s), 6.89 (1H, appt, J = 4.0 Hz), 6.1-6.0 (1H, appt, J = 4.0 Hz), 3.73 (3H, s), 3.02 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.72 (2H, t, J = 7.1 Hz). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 178.4, 173.3, 116.8, 132.3, 122.1, 109.6, 52.0, 33.3, 22.8. HRMS (ESI) C9H11NO3 [M+H]+ 계산치: m/z 182.0739, 실측치 m/z 182.0828. IR υmas (필름)/cm- 1: 3248, 2924, 2853, 1735, 1647.
메틸 3-[3-(3-아지도프로필)-4, 4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-5-일]프로파노에이트
Figure pct00118
CH2Cl2 (5 mL) 중 2-(3-아지도프로필)-1H-피롤 (100 mg, 0.7 mmol)의 0℃ 용액을 CH2Cl2 (5 mL) 중 3-(5-포르밀-1H-피롤-2-일)프로파노에이트 (60 mg, 0.3 mmol)의 용액으로 처리하였다. 결과적인 혼합물을 POCl3 (100 μL, 1.0 mmol) 적가하여 처리한 다음, 및 실온에서 6.5 시간 교반한 후 0℃로 냉각하였다. 반응 혼합물을 BF3.Et2O (0.2 mL, 1.6 mmol) 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.3 mL, 1.7 mmol)로 춘차적으로 처리하였다. TLC 분석이 반응 종결을 나타낼 때까지 (18 시간) 반응물을 실온에서 교반하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 H2O (10 mL)로 켄칭하고 CH2Cl2 (5 mL)로 희석 및 셀라이트® 베드를 통해 여과하였다. 셀라이트®를 CH2Cl2 (2 x 10 mL)로 세척하고 유기상들을 한데 모았다. 결합된 유기 세척물을 Na2SO4로 건조하고 감압 농축하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (실리카겔, 페트롤륨 에테르 중 용리 구배 0-30% EtOAc) 예상된 에스테르를 적색 오일 (31 mg, 26%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.15 (1H, s), 7.04 (1H, d, J = 4.0 Hz),
Figure pct00119
max (film)/ cm7.01 (1H, d, J = 4.4 Hz), 6.3 (2H, appt, J = 4.0 Hz), 3.72 (3H, s), 3.42 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.34 (2H, t, J = 7.6 Hz), 3.09 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.81 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.09-2.02 (2H, m). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 164.6, 159.9, 156.5, 146.8, 140.1, 134.9, 128.3, 127.9, 120.9, 114.7, 51.8, 50.8, 34.7, 28.0, 25.4, 21.4. 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ: -143.7, -143.8, -143.9, -144.0. HRMS (ESI) C16H18BF2N5O2 [M-H]+ 계산치: m/z 360.1522, 실측치 m/z 360.3250. IR υmax (필름)/cm- 1: 3171, 2936, 2098, 1734, 1609, 1497, 1175.
λexc= 467 nm (510 nm에서 방출, c= 0.2 nM, MeOH).
λemis= 509 nm (315 nm에서 여기, c= 0.2 nM, MeOH).
3-[3-(3-아지도프로필)-4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-5-일]프로피온산
Figure pct00120
THF (4 mL) 중 메틸 3-[3-(3-아지도프로필)-4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-5-일]프로파노에이트 (30 mg, 80 μmol)의 0℃ 용액을 H2O (2.6 mL), 이어서 진한 HCl (1.6 mL)로 처리하였다. 이어서 TLC 분석이 반응 종결을 나타낼 때까지(18 시간) 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 CH2Cl2 (20 mL)로 희석하고 실온에서 1시간 교반하였다. 유기층을 분리하고 H2O (2 x 20 mL) 및 이어서 염수 (2 x 25 mL)로 세척하였다. 결과적인 용액을 Na2S4로 건좌고 감압 농축하여 목적하는 카복실산을 적색 오일 (15 mg, 52%)로서 수득하였다. 생성물을 추가 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.16 (1H, s), 7.05 (1H, d, J = 4.0 Hz), 7.01 (1H, d, J = 3.2 Hz), 6.39-6.38 (2H, m), 3.42 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.35 (2H, t, J = 7.6 Hz), 3.10 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.86 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.10-2.02 (2H, m). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 166.2, 161.6, 159.9, 153.1, 149.0, 134.9, 130.8, 128.8, 127.9, 118.5, 50.9, 31.9, 30.5, 26.0, 23.8. 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ:-143.75, -143.84, -143.92, -144.01. HRMS (ESI) C15H16BF2N5O2 [M-H]+ 계산치: m/z 346.1365, 실측치 m/z 346.3293. IR υmax (필름) cm- 1: 3423, 2915, 2850, 1644.
λexc= 467 nm (510 nm에서 방출, c=5 nM, MeOH)
λemis= 510 nm (315 nm에서 여기, c=5 nM, MeOH).
4"-O-[3-(5-(3-아지도프로필)-4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)프로파노에이트]-5-O-(3차-부틸디메틸실릴)아버멕틴 B1a
Figure pct00121
CH2Cl2 (2.5 mL) 중 5-O-(3차-부틸디메틸실릴)아버멕틴 B1a (40 mg, 40 μmol)의 용액을 CH2Cl2 (2.5 mL) 중 3-(5-(3-아지도프로필)-4,4-디플루오로-4-보라-3a, 4a-디아자-s-인다센-3-일)프로판산 (15 mg, 40 μmol)의 용액, 이어서 DCC (16 mg, 70 μmol) 및 DMAP (3 mg, 20 μmol)로 처리하였다. 그런 다음 TLC 분석이 반응 종결을 나타낼 때까지(18h) 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 반응물을 감압 농축하고 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (실리카겔, 페트롤륨 에테르 중 용리 구배 0-20% EtOAc) 정제하여 4"-O-[3-(5-(3-아지도프로필)-4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)프로파노에이트]-5-O-(3차-부틸디메틸실릴)아버멕틴 B1a를 적색 오일 (23 mg, 39%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 7.14 (1H, s), 7.00 (2H, d, J = 4.4 Hz), 6.43 (1H, d, J = 4.0 Hz,), 6.37 (1H, d, J = 4.0 Hz), 5.85-5.82 (1H, m), 5.77-5.72 (2H, m), 5.41 (1H, br s,), 5.36-5.31 (2H, m), 5.00 (1H, d, J = 9.6 Hz), 4.79 (1H, br s), 4.74 (1H, appt, J = 10.0 Hz), 4.71-4.68 (1H, m), 4.60 (1H, d, J = 14.4 Hz), 4.45 (1H, br s), 3.96 (1H, br s), 3.88-3.83 (3H, m), 3.70-3.60 (3H, m), 3.45 (6H, br s), 3.41- 3.37 (4H, m), 3.34-3.31 (1H, m), 3.28-3.20 (2H, m), 2.86-2.79 (4H, m), 2.53 (1H, br s), 2.38-2.32 (2H, m), 2.29 (1H, appd, J = 11.6 Hz), 2.24 (1H, dd, J = 12.0, 4.0 Hz), 2.00 (1H, dd, J = 12.8, 4.4 Hz), 1.98-1.93 (2H, m), 1.81 (3H, s), 1.79-1.62 (9H, m),1.53 (3H, s), 1.41-1.36 (3H, m), 1.29-1.27 (6H, br s),1.17 (1H, d, J = 6.8 Hz), 0.96-0.92 (12H, m), 0.89-0.86 (4H, m), 0.81-0.79 (1H, m), 0.15 (6H, s). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 174.0, 172.7, 162.1, 160.5, 140.2, 137.5 (2C), 135.0 (2C), 134.8, 130.4, 127.9, 124.8, 119.3, 118.7, 118.4, 118.3, 117.2, 98.5, 97.5, 94.8, 81.9, 80.6, 80.4, 80.2, 80.0, 79.3, 79.2, 77.2, 76.5, 69.5, 68.7, 67.9, 67.2, 67.1, 56.8, 56.5, 51.8, 45.7, 41.1, 39.6, 36.8, 35.7, 35.4, 34.9, 34.5, 34.1, 33.2, 33.0, 31.2, 29.7, 28.1, 27.3, 25.8, 25.4, 20.3, 20.0, 18.4, 17.7, 17.4, 15.2, 12.4, 12.1, -4.5, -4.8. 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ: - 144.21, -144.30, -144.39, -144.48. HRMS (ESI) C71H106BF2N5O15Si [M-H]+ 계산치: m/z 1344.7516, 실측치 m/z 1344.3033. IR υmax (필름)/cm- 1: 3360, 2961, 2921, 2851, 1632.
4"-O-[3-(5-(3-아지도프로필)-4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)프로파노에이트]아버멕틴 B1a, 15
Figure pct00122
MeOH (2.0 mL) 중 4"-O-[3-(5-(3-아지도프로필)-4, 4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)프로파노에이트]-5-O-(3차-부틸디메틸실릴)아버멕틴 B1a (6 mg, 4 μmol)의 용액을 촉매량의 p-TsOH (3 mg)로 처리하였다. 반응 혼합물을 18oC에서 30분간 교반하였다. 그런 다음 반응물을 H2O (15 mL) 및 이어서 EtOAc (20 mL)로 희석하였다. 유기층을 H2O (3 x 20 mL) 및 염수 (20 mL)으로 세척하였다.유기상을 Na2SO4로 건조하고 감압 농축하였다. 조질의 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (0-40% EtOAc/페트롤륨 에테르) 4"-O-[3-(5-(3-아지도프로필)-4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)프로파노에이트]아버멕틴 B1a, 15를 적색 오일 (4 mg, 72%)로서 수득하였다. MS (ESI) C65H92BF2N5O15 [M-H]+ 계산치: m/z 1230.6651, 실측치 m/z 1230.1914.
단백질 컨쥬게이트 전구체를 반응시키기기 위한 일반적인 방법
10 mL 플라스크에 말레이미드 화합물 (12 mmol), iLOV 단백질 (10 mg, 0.7　mmol) 및 1　mL의 pH7 포스페이트 완충액을, 실온에서 1시간 교반하면서 첨가하였다. 이 시간 후 반응 혼합물을 1 mL의 Strep-Tactin Superflow 수지 (IBA Lifesciences) 및 1 mL의 pH　8 완충액(150　mM TRIS, 100　mM NaCl)이 로딩되어 있는 컬럼에 첨가하였다. 컬럼을 밀봉하고 4℃에서 18 시간 동안 로터 상에서 인큐베이션하였다. 미반응 화합물을 pH　8 완충액 (4 mL)으로 용리한 다음 SUMO 단백질 (15 μL) 및 pH 8 완충액 (100　mM TRIS, 150　mM NaCl)를 첨가하였다. 컬럼을 밀봉하고 4℃에서 18 시간 동안 로터 상에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 용액 (이제 녹색이 됨)을 시험관에서 수집한 다음 14,000 rpm에서 7분간 원심분리하여 농축하였다. Bradford 단백질 분석법으로 농도를 구하고 및 컨쥬게이트 용액을 필요시까지 -80℃에서 보관하였다.
화합물 P1 내지 P11은 다음 방식으로 생성하였다 (하기 표 1 참조).
컨쥬게이트 흡수 연구
다양한 유기체에 대해, 본 발명의 컨쥬게이트를 이용한 흡수 연구를, 특히 C. 엘레강스에 의한 흡수 연구에 초점을 맞추어 실시하였다.
시험된 컨쥬게이트를 비교를 위해, 참조 화합물과 함께 다음 표에 나타내었다.
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126
C. 엘레강스 테스트
C. 엘레강스를 함유하는 Nematode Growth Media(NGM) 플레이트를 1.0 - 1.5　mL의 표준 M9 완충액으로 세헤척하고 세척물을 에펜도르프 시험관에 모았다. 이어서 C. 엘레강스를 함유하는 액체를 실온에서 1분 동안 10,000 rpm으로 회전시켰다. 상등액을 제거하고, 신선한 M9 완충액을 추가하여(500 μL) C. 엘레강스를 함유하는 M9 완충액의 새로운 스톡 용액을 만들었다.
C. 엘레강스 현탁액 (100 μL)을 별도의 에펜도르프 시험관에 함유된 소정량의 M9 완충액 (테스트하고자 하는 화합물의 최종 목적하는 농도에 의해 정해짐: BODIPY 태그된 유도체의 경우 399 μL)에 첨가하였다. 이어서 여기에 DMSO (1 μL) 중 화합물의 25mM 용액을 첨가하였다. 결과적인 현탁액을 보텍스 장비를 이용하여 혼합하였다. 일단 혼합이 완결되면, 벌레가 시험관 바닥에 가라앉지 않도록 하고 테스트 화합물이 균일하게 분산되도록, 에펜도르프 시험관을 옆으로 뉘었다.
결과적인 혼합물을 실온에서 2 내지 4 시간 동안, 암실(시험관을 스크린하기 위해 알루미늄 호일 사용함, 캐비넷에도 보관하였다)에서 인큐베이션하였다.
다른 샘플들을 밤새 인큐베이션하였다. 여기서, OP50 세균 (3 μL)을 급식 목적으로 벌레에게 첨가하고, 벌레를 20℃의 암실에서 유지시켰다.
인큐베이션 후, 시험관 내용물을 손으로(전형적으로는 시험관을 가볍게 회전시켜서) 가볍게 혼합하여, 균질한 현탁액을 얻었다. 현탁액 샘플(250 μL)을 취하여 M9 완충액 (500 μL)과 혼합하였다. 결과적인 현탁액을 원심분리기에 넣고 실온에서 1분 동안 10,000 rpm으로 회전시켰다. 상등액을 제거하고 세척 공정을 2회 더 반복하되, 매번 새로운 M9 완충액(매회 500μL)을 추가로 사용하였다. 최종 세척 후 충분한 상등액을 제거하여 최종 샘플 부피가 약 30μL가 되도록 하였다.
표준 가정용 전자레인지(파워 4로 설정)를 이용하여 물에 녹인 1.5% 아가로스 용액을 60~90초 동안 예열하였다. 이 용액 두 방울을 제거하여 유리 슬라이드에 놓았다. 유리 슬라이드를 두 번째 유리 슬라이드로 덮었다. 1분 후 슬라이드를 조심스럽게 분리하고 슬라이드 중 하나에 아가로스를 남겼다. 이 슬라이드에 최종 C. 엘레강스 용액(15 ~ 20μL)의 분취량을 배치하였다. 여기에 선충의 이동성을 억제하기 위해 20mM 아지드화나트륨 용액(5μL)을 첨가하였다. 그런 다음 두 번째 슬라이드를 교체하기 전에 바셀린을 아가로스 영역 주위에 배치하였다. 슬라이드를 함께 누르지 않았다.
이어서 선충을 Hamamatsu Orca-ER (CA 742-95) 카메라가 구비된 Zeiss Axiskop 2 Plus 현미경을 이용하여 분석하였다. 이미지를 Mac 운영 체제에서 OpenLab을 사용하여 해상하였다.
흡수 연구 결과, 컨쥬게이트 구조의 변화에 의해 C. 엘레강스로의 흡수가 최적화될 수 있고 축적 위치가 변경될 수 있는 것으로 입증되었다. 이는 하기 기재된 화합물을 사용하여 예로서 제시된다.
C. 엘레강스에서의 염료 흡수
C. 엘레강스에 대해 설명된 일반 흡수 프로토콜을 사용하여 50 μM 농도에서 3시간 및 밤새 인큐베이션한 후 호합물 1-11을 평가하였다.
화합물 1 -- (R)-t-kCJ-BODIPY
3시간 인큐베이션한 후, 화합물 1은 성체 및 유충 단계의 인두, 장 내강 및 장 세포에서 관찰될 수 있었다. 이것은 3시간의 인큐베이션 기간 후 화합물 2 내지 8과 비교하여 관찰된 가장 큰 흡수였다. 20시간 동안 인큐베이션한 후, 강한 형광은 성체와 유충 모두의 인두, 장 내강 및 장 세포에 국한되었다.
화합물 2 - (R)-c-kCJ BODIPY
3시간 인큐베이션 후, 미량의 화합물 2가 유충 단계의 인두, 장 세포 및 장 내강에서 관찰되었다. 슬라이드에는 성충은 없었다. 20시간 동안 인큐베이션한 후, 형광은 장 세포, 장 내강에 국소화되었고 및 유충의 인두 내에 더 적은 정도로 국소화되었다.
화합물 3 - (S)-t-kCJ BODIPY
3시간 인큐베이션 후, 화합물 3은 유충 단계의 인두, 장 세포 및 장 내강에 존재하였다. 흡수는 활성 흡수와 일치하는 거울상 이성질체 유사체 화합물 1보다 훨씬 낮은 정도였다. 성충에서는 인두, 장 세포 및 장 내강에서 형광이 검출되었다. 형광은 또한 난자 발달의 초기 단계에 존재하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 형광은 유충의 인두, 장 세포 및 장 내강 내에서 볼 수 있었다.
화합물 4 - (S)-c-kCJ BODIPY
3시간 인큐베이션 후, 미량의 화합물 4가 유충 단계의 장 세포에 존재하였다. 20시간 인큐베이션 후, 유충 단계의 인두 및 장 세포 뿐만 아니라 난자 발달 초기 단계에서도 형광이 검출되었다.
화합물 5 - (R)-t-dCJ BODIPY
3시간 인큐베이션 후, 소량의 화합물 5가 장 세포, 유충 단계의 장 내강, 성체 선충의 인두, 장 내강 및 장 세포에 존재하였다. 화합물 5는 배아에서 검출되지 않았다. 20시간 동안 인큐베이션한 후, 형광은 유충 및 성체 단계 모두의 인두, 장 세포 및 장 내강에 남아 있었다. 형광은 난자 발달의 초기 단계에서도 감지되었지만 배아에서는 감지되지 않았다.
화합물 6 - (R)-c-dCJ BODIPY
3시간 인큐베이션 후, 화합물 6은 유충 단계의 장 세포 및 장 내강에서 볼 수 있었고 인두에서는 그 정도가 적었다. 성충에서 형광은 인두, 장 내강 및 장 세포에 위치하였다. 배아에서는 형광이 관찰되지 않았다. 흡수는 활성 흡수와 일치하는 거울상 이성질체 유사체 화합물 8보다 훨씬 낮은 정도였다. 20시간 동안 인큐베이션한 후, 형광은 장 내강과 장 세포에 존재했으며 유충의 인두에는 더 적은 정도로 존재하였다. 형광은 성체의 인두, 장 세포 및 장 내강과 난자 발달의 초기 단계에도 존재하였다. 배아에서는 형광이 관찰되지 않았다.
화합물 7 - (S)-t-dCJ BODIPY
3시간 배양 후, 소량의 화합물 7이 유충의 장 세포와 장 내강에서는 볼 수 있었지만 인두에서는 보이지 않았다. 성체에서 형광은 장 내강과 장 세포에 위치했으며 인두에는 더 적었다. 20시간 동안 인큐베이션한 후, 형광은 장 세포, 장 내강에 존재했지만 유충 단계의 인두에는 존재하지 않았다. 형광은 또한 장 내강, 장 세포 및 성인의 인두에서 더 적은 정도로 검출되었다. 형광은 또한 난자 발달의 초기 단계에도 위치하였다.
화합물 8 - (S)-c-dCJ BODIPY
3시간 인큐베이션 후, 화합물 8은 유충의 장 세포 및 장 내강에서 관찰가능하였고 인두에서는 더 적은 정도로 볼 수 있었다. 이것은 3시간의 인큐베이션 기간 후 화합물 1 내지 7과 비교하여 관찰된 두 번째로 큰 흡수였다. 성충의 경우 인두, 장 내강, 장 세포 및 난자에서 형광이 관찰되었다. 20시간 동안 인큐베이션한 후, 형광은 유충의 인두, 장 내강 및 장 세포에 존재하였다. 성체에서 형광은 인두, 장 내강 및 장 세포에서 검출되었지만 배아에서는 검출되지 않았다.
화합물 9 - 판토텐산 BODIPY
3시간 인큐베이션 후, 미량의 화합물 9가 get 세포에서 볼 수 있었고 유충과 성충 선충 모두의 인두에서는 그 정도가 적었다. 20시간 동안 인큐베이션한 후, 유충 및 성체 단계 모두의 장 세포에서 소량의 형광이 검출될 수 있었다. 두 경우 모두, 형광의 양은 화합물 1 내지 8인 엔아미드 유도체보다 낮았다.
화합물 10 - 케탈 판토텐산 BODIPY
3시간 배양 후, 미량의 화합물 10이 유충의 장 세포 및 장 내강에서 검출되었다. 화합물 10은 또한 유충의 인두에서 더 적은 정도로 관찰되었다. 슬라이드에는 성체는 없었다. 20시간 인큐베이션 후, 형광은 장 세포에서 볼 수 있었고 유충 단계의 인두에서는 더 적은 양으로 나타났다. 20시간 후에 존재하는 형광의 양은 최소 흡수를 나타내는 엔아미드 화합물과 비슷하였다.
화합물 11 - BODIPY 아지드
BODIPY 11에 노출된 벌레는 3시간 후 약간의 형광을 보였고, 장 내강과 장 세포에 집중되었으며 20시간 인큐베이션 후에도 형광이 크게 증가하지 않았다.
C. 엘레강스의 프라지콴텔 흡수
프라지콴텔 약물의 흡수를 향상시키는 컨쥬게이트의 능력을 비교하기 위해, 2개의 프라지콴텔 유도체를 생성하였다. 프라지콴텔을 BODIPY 형광 태그(화합물 12)로 태그하고 본 발명의 컨쥬게이트(화합물 13)에 통합시켰다. 화합물 12 및 13은 화합물 1-11에 대해 위에서 설명한 C. 엘레강스 흡수 프로토콜을 사용하여 50 μM의 농도에서 평가하였다. 현미경 판독은 3, 24 및 72시간 후에 실시하였다.
화합물 12 - 프라지콴텔 BODIPY
3시간 인큐베이션 후, 화합물 12는 C. 엘레강스 유충의 인두 및 장 세포에 약하게 흡수되었으며, 성충 선충의 장 세포에 주로, 그리고 인두에는 적은 양으로 흡수되었다. 24시간 인큐베이션 후, 유충은 흡수 증가를 나타내지 않았고, 극소량의 화합물 12가 인두 및 장 세포에 국소화되었다. 채취된 24시간 샘플에는 성체 선충이 없었다. 72시간 인큐베이션 후, 유충의 장 세포만이 소량의 형광의 존재를 나타냈다. 성체 단계의 경우, 장 내강, 장 세포 및 인두에서 형광을 볼 수 있었다. 선충은 명백한 해로운 영향 없이 생존 가능한 상태로 남아 있었다.
화합물 13 - 프라지콴텔-BODIPY와의 컨쥬게이트
3시간 인큐베이션 후, 화합물 13은 유충 단계의 인두, 장 세포 및 장 내강에 강하게 위치하였다. 성체 선충에서 화합물 13은 인두, 장 세포 및 장 내강에 강하게 위치했지만 배아에서는 보이지 않았다. 20시간 인큐베이션 후, 더 큰 분자량에도 불구하고 화합물 12에 비해 화합물 13의 흡수가 3배 증가하였다. 24시간 인큐베이션 후, 화합물 13은 유충의 인두, 장 세포 및 장 내강에서 강하게 관찰되었다. 이 시점에서 슬라이드에는 성체 선충이 없었다. 72시간 후, 화합물 13은 인두, 장 내강 및 유충 세포에서 여전히 강하게 관찰되었다. 성체충의 경우, 화합물 13은 배아와 난자뿐만 아니라 인두와 장 내강에서 강하게 관찰되었다. 선충은 명백한 해로운 영향 없이 생존 가능한 상태로 남아 있었다.
C. 엘레강스에서의 단백질 흡수
PhiLOV 단백질을 함유하는 컨쥬게이트를 C. 엘레강스에 대해 시험하였다.
M9 완충액의 효과적인 PhiLOV 단백질 컨쥬게이트는 화학적 결찰 및 정제 실험에서 가져왔다. M9 완충액의 첨가량은 필요한 최종 농도에 의해 결정되었다. 선충(분석할 단백질 샘플당 30-40개)를 선별하여 단백질 용액에 첨가하고, 결과적인 현탁액을 선충 유지를 위해 OP50 대장균 용액으로 처리하였다. 선충 현탁액을 20℃ 암실에서 인큐베이션하고 알루미늄 호일로 덮었다.
24, 48 및 72시간에 분취량(10~25μL)을 취하여 각 시점에서 새로운 에펜도르프 시험관으로 옮기고 M9 완충액(200 μL)로 희석하였다. 새로운 현탁액을 얼음에 넣은 다음(1-2분 동안) 10,000rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 농축된 선충을 다시 세척하였다(2 x 200 μL). 최종 세척에서 선충과 함께 잔여 부피(약 30μL)가 남았다.
현미경 연구를 위해 물에 녹인 1.5% 아가로스 용액을 표준 가정용 전자레인지(파워 4)에서 1-1.5분 동안 예열하였다. 아가로스 용액 두 방울을 유리 슬라이드에 놓고 다른 유리 슬라이드로 덮었다. 1분 후 두 슬라이드를 조심스럽게 분리하였다. 아가로스가 남아 있는 슬라이드에 최종 C. 엘레강스 용액 15~20μL를 넣었다. 여기에 선충의 이동성을 억제하기 위해 20mM 아지드화나트륨 용액(5μL)을 첨가하였다.
상단 커버 슬립을 교체하기 전에 바셀린을 영역 주위에 발랐다. 커버 슬립을 함께 누르지 않았다. 그런 다음 Hamamatsu Orca-ER(CA 742-95) 카메라를 이용하는 Zeiss Axiskop 2 Plus 현미경을 사용하여 선충을 분석하였다. Mac 운영 체제에서 OpenLab을 사용하여 이미지를 해상하였다.
48시간 후에 급식을 반복하였다. 2 μL의 OP50 세균을 섭식 목적으로 첨가하고 벌레를 2℃ 암실에서 계속 인큐베이션하였다.
전술한 접근 방식을 사용하여 11개의 단백질 컨쥬게이트를, phiLOV 단백질을 선충으로 전달하는 능력에 대해 시험하였다. 그 결과 컨쥬게이트는 선충의 여러 상이한 부분에 크기가 큰 생물학적 분자를 전달할 수 있는 것으로 나타났다. 전달 위치 및 효율성은 화합물 P1-P11(음성 대조군, 화합물 1을 사용한 양성 대조군 및 태그되지 않은 phiLOV 단백질 대조군 포함)에 의해 나타난 바와 같이 전달 비히클에 대한 작은 구조적 변형에 의해 조절될 수 있다.
음성 대조군 - M9 완충액
M9 완충 용액과만 24시간 인큐베이션 후, C. 엘레강스의 유충 및 성체 단계 모두 장 세포에서 소량의 세포 자가형광을 나타냈다. 48시간 후 및 72시간 동안 자가형광 수준에는 변화가 없었다. 72시간 시점에서 성체 선충은 죽었다.
양성 대조군 - 화합물 1 - (R)-t-kCJ BODIPY
화합물 1과 함께 24시간 인큐베이션 후 C. 엘레강스의 성체 및 유충 단계의 인두, 장 내강 및 장 세포에서 형광이 관찰될 수 있었다. 48시간 및 72시간 인큐베이션 후, 형광은 성체와 유충 모두의 인두, 장 내강 및 장 세포에 여전히 국한되어 있었다. 72시간 시점에서 성체 선충은 죽었다.
단백질 대조군 - phiLOV 단백질
태그되지 않은 phiLOV 단백질(236μM의 농도에서 사용된 13kDa 단백질)과 24시간 인큐베이션후, 성체 단계의 인두에서는 소량의 형광이 관찰되었지만 유충 단계에서는 형광이 없었다. 48시간 및 72시간 후, 유충 단계에 변화가 없었다(즉, 형광이 보이지 않음). 성체 단계의 인두에서 소량의 형광도 눈에 띄는 변화를 보이지 않았다.
화합물 P1
단백질 컨쥬게이트 P1 (305 μM)와의 24시간 인큐베이션 후, 유충 단계의 장 세포의 자가형광만이 검출될 수 있었다. 성체의 경우 인두에 소량의 단백질이 위치하였다. 단백질 컨쥬게이트 P1과 함께 48시간 인큐베이션 후, 유충 단계의 인두 및 장 세포에서 형광을 관찰할 수 있었다. 장 내강에서도 소량의 형광이 관찰되었다. 슬라이드에는 성체가 없었다. 72시간 후에도 형광 수준은 변하지 않았다.
화합물 P2
단백질 컨쥬게이트 P2(305μM)와 함께 24시간 인큐베이션 후, 유충 단계의 인두 및 장 내강에서 형광이 관찰되었다. 장 세포에서도 이 보다 작은 양의 형광이 관찰되었다. 단백질 컨쥬게이트 P2는 태그되지 않은 단백질 대조군에 비해 흡수에서 유의한 개선을 나타내지 않았다. 슬라이드에는 성체 단계가 없었다. 48시간 인큐베이션 인큐베이션, 유충 단계는 인두, 장 세포 및 장 내강에서 증가된 형광량을 보여주었다. 성체 단계는 인두 및 장 내강에서 형광의 국소화를 보여주었다. 72시간 후, 형광은 유충의 인두, 장 내강 및 장 세포에 국한된 채로 남아 있었다. 성체의 경우 인두와 장 내강에서 형광이 관찰되었다.
화합물 P3
단백질 컨쥬게이트 P3(305μM)와 함께 24시간 인큐베이션 후, 유충 단계의 인두 및 장 내강에서 소량의 형광이 관찰되었다. 성체 단계에서 형광은 인두, 장 내강 및 장 세포에서 볼 수 있었다. 48시간 인큐베이션 후, 형광량의 유의한 증가가 인두, 장 세포에서 검출되었고 유충의 장 내강에서 더 적은 정도로 감지되었다. 성체에서는 인두와 장 내강에서 형광 증가가 관찰되었다. 72시간 인큐베이션 후, 형광은 더 오래된 유충 단계의 인두, 장 내강 및 장 세포에서 볼 수 있었다. 성체 단계는 장 내강 및 장 세포에서 형광을 나타냈다.
화합물 P4
단백질 컨쥬게이트 P4(305μM)와 함께 인큐베이션한 후 인두, 장 내강 및 유충의 장 세포에서 형광을 볼 수 있었다. 성인에서는 인두, 장 내강 및 장 세포에서 형광이 관찰되었다. 단백질 컨쥬게이트 P4는 태그가 지정되지 않은 단백질 대조군에 비해 흡수에서 유의한 개선을 나타내지 않았다. 48시간 후 배양 시, 형광은 유충의 인두와 장 내강에 존재하였다. 성인에서 형광은 인두와 장 내강에 존재하였다. 72시간 후 배양 시 인두와 장 내강에 매우 많은 양의 형광이 존재했으며 유충 단계의 장 세포에는 적은 양의 형광이 있었다. 성체에서 형광은 장 세포, 장 내강 및 인두에서 명확하게 볼 수 있었다.
화합물 P5
단백질 컨쥬게이트 P5(305μM)와 함께 24시간 인큐베이션한 후, 형광은 유충의 장 내강과 장 세포에 존재하였다. 성인에서 형광은 장 내강과 인두에서 더 적은 정도로 관찰될 수 있었다. 48시간 인큐베이션 후, 형광은 장 세포와 장 내강에서 그리고 유충의 인두에서는 더 적은 양으로 관찰될 수 있었다. 슬라이드에 성체는 없었다. 72시간 후, 다양한 양의 유충의 장 내강과 장 세포에서 형광을 관찰할 수 있었다. 유충의 인두에서는 단백질이 검출되지 않았다. 슬라이드에는 성체가 없었다.
화합물 P6
단백질 컨쥬게이트 P6(305μM)와 함께 24시간 인큐베이션 후, 내인성 자가형광만 성체 또는 유충 단계에서 볼 수 있다. 48시간 인큐베이션 후, 형광은 장 내강과 장 세포뿐만 아니라 어린 유충의 인두에도 존재하였다. 성체에서는 장 내강에서 형광이 관찰되었다. 72시간 후, 형광은 유충 단계의 장 내강에 존재하였다. 슬라이드에는 성체가 없었다.
더 높은 농도의 단백질 컨쥬게이트 P6(435μM)에서 24시간 후 유충의 인두 및 장 내강에서 낮은 형광이 관찰되었다. 24시간 후에 성체에서는 내인성 자가형광만 볼 수 있었다. 48시간 후, 유충은 인두, 장 내강 및 장 세포에서 여전히 낮은 양의 형광을 나타냈다. 슬라이드에는 성체가 없었다. 72시간 후, 유충은 장 세포와 장 내강에서 소량의 형광을 보였다. 슬라이드에는 성체가 없었다.
화합물 P7
단백질 컨쥬게이트 P7(305μM)와 함께 24시간 인큐베이션한 결과, 형광은 유충의 장 내강에 존재하였다. 성체 단계의 경우, 형광은 장 세포에 존재하고 인두 내에는 더 적은 정도로 존재하였다. 48시간 인큐베이션 후에서 형광은 유충의 장 내강과 장 세포뿐만 아니라 유충의 더 어린 단계의 인두에서도 관찰될 수 있었다. 슬라이드에는 성체가 없었다. 72시간 인큐베이션 후, 형광은 유충 단계의 장 내강 및 장 세포에서 볼 수 있었다. 슬라이드에는 성체가 없었다.
더 높은 농도의 단백질 컨쥬게이트 P7(435μM)에서 형광은 24시간 인큐베이션 후 장 내강에서 그리고 유충의 인두에서 더 적은 정도로 볼 수 있었다. 성체의 경우 24시간 후에 장 내강과 인두에서 소량의 형광이 검출되었다. 48시간 인큐베이션 후 유충은 장 내강에서 높은 수준의 형광을 보였고 인두에서는 낮은 수준으로 형광을 보였다. 슬라이드에는 성체가 없었다. 72시간 후, 유충 단계의 장 내강에 높은 수준의 형광이 나타났다. 더 적은 양의 형광이 유충의 인두에서 관찰되었다. 슬라이드에는 성체가 없었다.
화합물 P8
단백질 컨쥬게이트 P8(305μM)와 함께 24시간 인큐베이션 후, 유충의 장 세포에서 소량의 형광이 관찰되었다. 소량의 형광은 성체의 인두에도 존재하였다. 단백질 컨쥬게이트 P8은 단백질 컨쥬게이트 P11에 비해 유의하게 감소된 흡수를 나타내었다. 48시간 후, 유충 단계의 장 내강 및 장 세포에서 소량의 형광이 검출될 수 있었다. 슬라이드에는 성체가 없었다. 72시간 후, 작은 수준의 형광이 유충 단계의 장 내강과 장 세포에 남아 있었다. 슬라이드에는 성체가 없었다.
더 높은 농도의 단백질 컨쥬게이트 P8(435μM)에서 형광은 24시간 후에 장 내강에서 그리고 더 낮은 정도로 유충의 인두에서 볼 수 있었다. 24시간 인큐베이션 후, 형광은 장 내강에서 관찰되었고 성체의 인두에서는 덜 관찰되었다. 단백질 컨쥬게이트 P8은 단백질 컨쥬게이트 P11에 비해 유의하게 감소된 흡수를 나타내었다. 48시간 인큐베이션 후, 형광은 장 세포에서 다양한 양과 인두에서 낮은 분포로 유충의 장 내강에서 볼 수 있었다. 성체의 경우 인두와 장 내강에서 형광을 볼 수 있다. 72시간 후, 유충은 장 내강에서 형광의 존재를 보여주었으며 인두에서는 더 적은 정도로 나타났다. 슬라이드에는 성체가 없었다.
화합물 P9
단백질 컨쥬게이트 P9(305μM)와 함께 24시간 인큐베이션 후 유충의 장 내강과 성충의 인두에서 소량의 형광이 관찰되었다. 48시간 인큐베이션 인큐베이션, 형광은 유충 및 성체 단계 모두의 장 내강 및 장 세포에서 관찰될 수 있었다. 72시간 인큐베이션 후, 형광은 어린 유충의 장 내강과 장 세포에 존재하였다. 형광은 성체의 인두, 장 세포 및 장 내강에서도 볼 수 있다.
고농도의 단백질 컨쥬게이트 P9(435μM)에서 24시간 인큐베이션 후 유충의 장 내강에서 형광을 볼 수 있다. 슬라이드에는 성체가 없었다. 48시간 인큐베이션 후, 유충 단계의 장 내강에서 형광 증가가 관찰되었다. 슬라이드에는 성체가 없었다. 72시간 인큐베이션 후, 유충은 장 내강에서 단백질 흡수를 나타냈고 인두와 장 세포에서는 더 적은 양의 단백질 흡수를 나타냈다. 슬라이드에는 성체가 없었다.
화합물 P10
단백질 컨쥬게이트 P10(305μM)과 함께 24시간 인큐베이션 후, 유충의 장 내강에 형광이 존재하였다. 성체의 인두에서도 낮은 형광이 감지되었다. 48시간 후, 유충은 장 내강과 장 세포에서 더 높은 수준의 형광을 보였다. 형광은 성인의 장 내강에서도 볼 수 있었다. 72시간 후, 형광은 장 세포, 장 내강 및 유충의 인두에서 더 적은 정도로 볼 수 있었다. 슬라이드에는 성체가 없었다.
고농도의 단백질 컨쥬게이트 P10(435μM)에서 24시간 후 유충 단계의 장 세포와 장 내강에서 형광을 볼 수 있었다. 성체의 경우 인두에서 낮은 형광을 보였다. 48시간 인큐베이션 후, 유충은 장 세포와 장 내강에서 형광을 보였고 인두에서는 더 적은 양의 형광을 나타냈다. 성체의 경우 장 내강에서 형광이 보였다. 72시간 후, 형광은 유충의 장 세포, 장 내강 및 인두에 존재하였다. 슬라이드에는 성체가 없었다.
화합물 P11
단백질 컨쥬게이트 P11(267μM)과 함께 24시간 인큐베이션 후, 장 내강에서 형광이 보였고 유충의 인두에서는 그 정도가 적었다. 단백질 컨쥬게이트 P11은 태그되지 않은 단백질 대조군 및 화합물 P8에 비해 흡수에서 유의한 개선을 보여주었다. 이것은 단백질 컨쥬게이트 P11이 벌레에 의해 섭취되는 것이 아니라 활발하게 수송되고 있다는 가설을 뒷받침한다. 성체 단계에서 형광은 인두에서 관찰되었고 장 내강에서는 더 적은 양으로 관찰되었다. 48시간 인큐베이션 후, 유충은 장 내강과 장 세포에서 형광을 보였고 인두에서는 더 적은 양을 보였다. 성체의 형광은 장 내강에 있었고 소량은 인두에 있었다. 72시간 후, 유충 단계는 장 세포, 장 내강 및 인두에서 소량의 형광을 나타냈다. 슬라이드에는 성체가 없었다.
플라스모디움 팔시파룸 테스트
10% Albumax II 혈청(Thermo Fisher)을 포함하는 RPMI 1640(Thermo Fisher)의 완전 배지를 사용하여 P. 팔시파룸을 배양하였다. 테스트에 사용된 화합물은 DMSO에서 100mM 용액으로 준비하고 완전 배지를 사용하여 적절한 농도로 희석하였다. 테스트를 위해 각각 200μL의 혈청과 50μL의 혈액을 포함하는 적절한 수의 웰이 있는 96웰 플레이트를 사용하였다. 기생충혈증 범위는 약 3-5%였다. 각 웰에 대해 혈청을 제거하고 시험할 화합물과 동일한 부피의 혈청으로 교체하였다. 그런 다음 96웰 플레이트를 45분 동안 96% N2, 3% CO2 및 1% O2의 분위기 하에 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 2,209 rpm에서 원심분리를 통해 농축하였다. 배지를 제거하고 세포를 또 다른 200μL의 신선한 혈청으로 재현탁하였다. 세포를 원심분리하고 이러한 방식으로 2회 더 세척하였다. 최종 세척 후 약 5-10 μL의 혈액을 슬라이드에 놓고 혈액을 도말하는 상단에 커버슬립을 놓다. 그런 다음 슬라이드의 가장자리를 네일 광택제로 밀봉하여 이미징 전에 세포가 포함되었는지 확인하였다. Zeiss Axioplan 2 현미경 시스템을 사용하여 슬라이드를 분석하고 FITC 형광 필터가 있는 Volocity 3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 촬영하였다.
화합물 1, 5, 9, 10 및 11은 25 μM 농도에서 동기화 단계 및 혼합 단계 배양 모두에서 흡수에 대해 테스트되었다. 예상대로, 화합물 11은 확산 제어 메커니즘으로 보이는 것을 통해 모든 적혈구(감염 및 비감염 모두)로 확산되었다. 화합물 1은 모든 배양에서 감염되거나 감염되지 않은 적혈구에 의해 흡수되지 않았다. 그러나, 화합물 5는 감염된 적혈구에 의해 선택적으로 흡수되었고, 형광 화합물은 기생충 자체 내에 축적되었다(즉, 화합물이 감염된 적혈구 내의 기생충으로 내재화됨). 화합물 10은 가시적인 정도까지 흡수되지 않은 반면, 화합물 9는 감염된 적혈구와 감염되지 않은 적혈구 모두에 의해 매우 빠르게 흡수되었으며 두 세트의 적혈구 사이의 흡수 차이는 거의 없었다.
부가적인 플라스모디움 팔시파룸 테스트
하기 표시된 BODIPY 유사체 - 아미드 컨쥬게이트 310 -은 HPLC에 의해 부분 정제되었다.
Figure pct00127
그런 다음 화합물을 45-60분 동안 영양체-감염된 적혈구(영양체 단계 P. 팔시파룸)의 50μL 분취량과 함께 25μM 농도에서 인큐베이션하였다. 영양체(Trophozoite) 단계 기생충은 크기 때문에 형광 현미경으로 이미징할 때 최상의 결과를 제공하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 세포를 적절한 완충액으로 세척하여 용액 중 화합물로부터 생성된 배경 형광을 제거하였다. 그런 다음 세척된 살아있는 세포로부터 슬라이드를 준비하고 Applied Precision DV Elite 현미경 시스템에서 형광 현미경을 사용하여 검사하였다. 도립현미경과 유침 100X 대물렌즈를 사용하였다. 이미지는 CoolSNAP_HQ2/HQ2-ICX285 카메라를 사용하여 촬영했으며 softWoRx 버전 5.5를 사용하여 획득하였다.
이미지는 화합물이 감염된 적혈구 내의 기생충에 의해 축적됨을 보여준다. 건강한 적혈구의 경우 형광이 없기 때문에 건강한 세포와 감염된 세포 사이에 선택성이 있는데, 이는 아마도 건강한 세포가 감염될 때 생성되는 새로운 투과 경로(NPP: new permeation pathways)를 통한 흡수로 인한 것일 수 있다 (참조: Saliba 등 및 Kirk 등). 형광은 소화 액포에는 없지만 기생충의 세포질 전체에 존재한다.
세포질 내에서 컨쥬게이트 농도가 높은 영역을 나타내는 고형광 스폿들이 관찰 가능하다. 이의 예를 도 1에 나타내었다.
트리파노조마 브루세이 테스트
T. 브루세이는 10% Albumax II(Thermo-Fisher) 혈청을 함유하는 RPMI 1640(Thermo-Fisher)의 완전 배지를 사용하여 배양하였다. 시험용 화합물은 DMSO 중 100mM 용액으로 제조하고 완전 배지를 사용하여 적절한 농도로 희석하였다. 테스트를 위해 각각 200μL의 혈청이 포함된 트리파노솜을 포함하는 적절한 수의 웰이 있는 96웰 플레이트를 사용하였다. 각 웰에 대해 혈청을 제거하고 시험할 화합물(10-25μM)이 포함된 동일한 부피의 혈청으로 교체하였다. 그런 다음 96웰 플레이트를 45분 동안 96% N2, 3% CO2 및 1% O2의 분위기 하에 37℃에서 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 트리파노솜은 2,209rpm에서 원심분리를 통해 농축되었다. 배지를 제거하고 세포를 또 다른 200μL의 신선한 혈청으로 재현탁하였다. 트리파노좀을 원심분리하고 이러한 방식으로 2회 더 세척하였다. 최종 세척 후 약 5-10 μL의 혈청을 슬라이드에 놓고 그 위에 커버슬립을 놓다. 그런 다음 슬라이드의 가장자리를 네일 광택제로 밀봉하여 이미징 전에 세포가 포함되었는지 확인하였다. 슬라이드를 Deltavision 디콘볼루션 현미경 시스템을 사용하여 분석하였다.
T. 브루세이에서 화합물 5 및 9의 흡수를 연구하였다.
이미지는 화합물 5가 T. 브루세이에 의해 흡수되어 트리파노솜 몸 전체에 작은 소포를 형성하는 반면 리소좀이나 핵에는 축적되지 않고 오히려 편모 주머니와 리소좀 사이의 소포에 축적됨을 시사한다.
반면에, 화합물 9는 화합물 5보다 훨씬 더 빠르고 훨씬 더 높은 농도로 흡수된다. 화합물 9는 또한 세포 전체에 퍼져 있지만 미토콘드리아 또는 소포체에서 더 높은 농도 영역을 갖는 것으로 보이다.
테일레리아 아눌라타 테스트
T.아눌라타는 10% Albumax II(Thermo-Fisher) 혈청과 함께 RPMI 1640을 사용하여 배양되었다. 표준 혈구계산기를 사용하여 모 배양물에서 세포의 농도를 계산하였다. 배양액을 RPMI 1640으로 2 Х 105 세포/mL 농도로 희석하였다. 테스트할 각 화합물 및 농도에 대해 배양액 2mL를 1,000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 배지를 제거한 후 원하는 농도로 시험할 화합물을 함유하는 950 μL의 완전 배지에 세포를 재현탁하였다. 이것은 DMSO에서 화합물의 100mM 스톡 용액으로부터 제조되었다. 일단 세포가 재현탁되면 5웰 플레이트(웰당 1mL 용량)로 옮겼다. 이어서 공기 중 5% CO2 분위기에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료된 후 각 웰의 내용물을 10mL 원심분리 튜브로 옮겼다. 차가운 RPMI 1640(Thermofisher) 또는 HBSS를 추가하여 5mL의 부피를 얻다. 그 다음, 현탁액을 1,000 rpm 및 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 그 다음 상등액을 제거하고 세포를 이러한 방식으로 2회 더 세척하였다. 최종 세척 후 세포의 펠릿을 최소량의 RPMI 1640에 재현탁한 다음 유리 슬라이드에 스포팅하였다. 그런 다음 슬라이드를 커버 슬립으로 덮고 Spot RT3 카메라가 있는 Olympus BX60 UV 현미경 시스템과 FITC 형광 필터가 있는 Spot Image 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
T. 아눌라타에서의 화합물 1, 5, 9, 10, 11의 흡수를 연구하였다. 이미지는 화합물 5와 9가 T. 아눌라타에 의해 흡수되었음을 시사한다. 화합물 9는 더 빠르게 흡수되고 형광은 감염된 림프구에도 존재하지만 더 낮은 농도에서 검출될 수 있다. 한편, 화합물 5는 세포내 기생충 내에 선택적으로 축적된다. 화합물 11은 무차별적으로 확산된 반면, 화합물 1 및 10은 매우 제한된 흡수를 나타냈다.
세균 테스트
목적 세균을 LB 배지(Thermo-Fisher)에 접종하고 37℃ 공기 분위기에서 밤새 인큐베이션하여 배양한 세균. 그런 다음 OD600을 측정하고 이로부터 세균 농도를 계산하였다. 그런 다음 배양액을 적절하게 희석하여 mL당 2 x 105 세포의 농도를 제공하였다. 이 배양액 1mL를 5mL 원심분리 튜브에 넣은 다음 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 배지에 있는 화합물의 25μM 용액 1mL로 교체하였다. 배양액을 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 배양액을 이전과 같이 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 펠렛을 1mL의 PBS에 재현탁시켰다. 세포를 이러한 방식으로 2회 더 세척하였다. 최종 세척 후 펠릿을 35 μL의 물에 재현탁하고 슬라이드에 스포팅하였다. 그런 다음 슬라이드를 FITC 형광 필터가 있는 Leica 이미징 분석 소프트웨어와 함께 Olympus UV 현미경 시스템을 사용하여 이미지를 분석하기 전에 커버슬라이드로 보호하였다.
세균 배양액의 경우, 화합물 5를 매번 테스트하였다. 그램-음성 및 그램-양성 세균 모두의 경우에서 흡수가 관찰되었다.
세포독성
본 발명의 컨쥬게이트는 판토텐산염 및 CJ-15,801에 기반한다. 전자는 필수 비타민이고, 및 인간 대상체의 생체내에서 관용된다.
컨쥬게이트의 세포독성은 하기에 기술된 방법을 사용하여 HEK 세포에 대한 측정치일 수 있다.
발광 출력을 제공하는 세포 생존력의 지표인 CellTitre-Glo®(Promega)를 첨가하기 전에, 샘플 화합물을 Greiner 384 세포 별 플레이트에서 인간 배아 신장 세포(HEK293)와 함께 100μM에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이 분석에서 100μM에서 2번의 테스트에서 40% 초과의 세포독성을 나타내는 화합물은 세포독성을 나타낸 것으로 간주된다.
흥미롭게도 아래에 표시된 대표적인 화합물은 100μM 농도에서 3.7 ± 0.6%로 스크린상에서 불활성이었다.
Figure pct00128
상기 화합물은 헥사플루오로포스페이트 벤조트리아졸 테트라메틸 우로늄(HBTU), N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA), CH2Cl2, μW 80℃에서 2.5시간 동안 아래와 같이 제조될 수 있다. 수율은 58%였다.
Figure pct00129
모 담체는 1.0 mL/min/g 간의 클리어런스를 나타내는 암컷 CD 1 마우스 마이크로좀에서 고유 클리어런스에 대해 테스트되었다. 여기서 담체는 아미드 결합이 있는 CJ-15,801 프레임워크이다.
로트마리아 파씸 테스트
지난 몇 년 동안 꿀벌 집락 붕괴 장애는 꿀벌의 생존에 대한 주요 문제 중 하나이다. 유럽의 꿀벌(Apis mellifera)은 농업에서 중요한 역할을 했으며 병원체와 공생자를 식별하는 유기체 모델이다. 키네토플라스테아 강에 속하는 로트마리아 파씸 (L. 파씸)은 전 세계적으로 꿀벌의 주요 기생충으로 부상하였다(Schwarz, 등, Ravoet 등, Paxton 등).
기생충 흡수 테스트 (BODIPY FL에 결합된 CJ-15,801 및 판토텐산 유도체).
BODIPY 유도체의 100mM 스톡 용액을 디메틸설폭사이드(DMSO)를 이용하여 제조되었다. L. 파씸 균주 PRA-403(ATCC)을 C. 봄비용 변형 배지(Tognazzo 등)에서 배양하였다. 기생충 배양물을 원심분리하고 상등액을 제거하고 화합물(BODIPY 유도체의 경우 최종 농도 500, 100, 10 또는 1μM) 또는 DMSO(0.1%) 대조군이 포함된 L. 파씸 배지 500μL를 첨가하였다. 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 원심분리하고 펠렛을 PBS(3 x 500 μL)로 세척하고, 샘플을 슬라이드로 옮기고 형광 현미경(NIKON ECLIPSE Ni)으로 관찰하거나 100 μL을 추가하여 96-웰 마이크로플레이트로 옮기고 Varioskan LUX 또는 BioTek 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 형광 강도를 측정하였다.
꿀벌 내장 흡수 테스트(BODIPY FL에 결합된 CJ-15,801 및 판토텐산 유도체).
꿀벌(A. mellifera) 벌집을 구하여 봄부터 가을까지 임의로 먹였다. 겨울철에는 충분한 먹이를 제공하기 위해 50%(v/v) 자당과 혼합된 꽃가루를 꿀벌 벌통에 첨가하였다. 꿀벌을 해부하고 크롭, 중장 및 직장을 포함한 위장 시스템을 제거하고 100 μM 최종 농도의 PBS 또는 DMSO(0.1%) 대조군으로 희석한 500 μL의 전달 비히클에 즉시 첨가하여 시험 샘플을 시험하였다. 혼합물을 33℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 원심분리하고 내장을 PBS 완충액(3 x 500 μL)으로 세척하고, 샘플을 슬라이드로 옮기고 형광 현미경(NIKON ECLIPSE Ni)으로 관찰하였다.
결과 - 기생충 흡수 테스트
CJ-BODIPY 유도체 세트를 10 및 500μM에서 L. 파씸 균주 PRA-403에서 테스트하고 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 형광 현미경으로 분석하였다. 500 μM의 (R)-트랜스-케탈 2로 처리된 기생충은 기생충의 세포질에서 형광을 나타내었고, 유도체는 형광 도트를 형성하였다. 반면, 10 μM의 디올 유도체(S)-시스-디올 8과 함께 인큐베이션된 기생충은 세포막 주변에서 형광을 나타내었지만 세포질에서는 그렇지 않았다 (도 3).
흡수 테스트는 CJ-BODIPY 유도체의 1μM 및 100μM 최종 농도에서 수행되었다. 실온에서 45분 동안 인큐베이션한 후, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 형광 강도를 평가하였다. 정량적 결과는 형광현미경 소견을 확인하였고, 이는 케탈 유도체의 우선적인 흡수를 시사하였다. 유도체 2는 테스트된 모든 화합물 중에서 가장 높은 판독값을 보인 반면, 유도체 4는 가장 낮은 흡수량 중 하나를 나타냈다. 화합물 1은 1μM에서 유도체 2의 형광도의 약 ¼을 나타냈다. 화합물 5와 8은 상대적으로 낮은 흡수율을 보였다(도 4).
결과 - 내장 흡수 테스트
성체 꿀벌의 위장관 시스템(크롭, 중장 및 직장)을 추출하고 100μM의 유도체 1, 2, 8 및 11과 함께 33℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 유도체 2 8은 중장과 직장에서 약간의 형광을 나타냈지만 크롭에서는 없었다. 화합물 2는 내장 표면에 국한되어 있지만 내부에는 위치하지 않다. BODIPY 11로 처리한 내장은 자가형광만을 보였다. 유도체 1과의 인큐베이션은 중장과 직장에서 높은 형광성을 나타내었지만 크롭에서는 그렇지 않았다(도 5).
이러한 결과는 100μM 미만의 농도에서 유도체를 사용하면 시험된 화합물이 꿀벌의 위장간 시스템 외부로 분포할 확률을 감소시키고 화합물을 기생충에 가깝게 유지할 수 있음을 시사하나 특정 이론에 구애되는 것은 아니다.
따라서 이러한 유도체는 꿀벌의 위장관 시스템을 통한 최소한의 투과성으로 분자를 로트마리아 파씸으로 전달하는 데 적합한 도구로 보이다.
바베시아 보비스 테스트
B. 보비스는 분류학적 그룹 측면에서 테일레리아와 공유되는 원생동물 기생충으로, 감염된 적혈구 내에서 배 모양의 모양으로 인해 피로플라스미다 목으로 분류된다. 바베시아는 이분법으로 번식하여 염색된 감염된 적혈구에서 쌍 또는 사분열의 특징적인 존재를 유발한다. B. 보비스와 B. 비게미나의 두 종은 축산업에 상당한 경제적 영향을 미친다(Yamagishi 등).
B. 보비스 단기 시험(phiLOV(R475G, K476C) 및 BODIPY FL에 결합된 CJ-15,801 및 판토텐산 유도체).
DMSO로 전달 비히클의 100mM 스톡 용액을 준비하였다. B. 보비스 텍사스 균주(University of Nagasaki)를 미호기성 정지상 배양 시스템(Bork 등) 의해 10% 소 적혈구(RBC)가 포함된 GIT 배지(Kohjin-bio Co)에서 배양하였다. 기생충 배양물을 원심분리하고 GIT 배지로 1회 세척하였다. RBC는 펠렛 다운되었고 20μl 감염된 RBC 혼합물(10μl 패킹됨 감염된 RBC+ 10μl GIT)이 준비되었다. 그런 다음, 평가할 화합물(BODIPY 유도체의 경우 최종 농도 25μM 및 phiLOV 유도체의 경우 100μM) 또는 DMSO(0.1%)/PBS 대조군이 포함된 180μl GIT 배지를 추가하였다. 샘플을 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. (샘플은 GIT 배지에서 1㎍/mL 희석된 Hoechst 33342로 염색되었다). 인큐베이션 후, 샘플을 원심분리하고 펠렛을 GIT 배지(3 x)로 세척하였다. 50% 헤마토크리트 감염된 RBC 혼합물의 최종 용액을 공초점 레이저 현미경(Nikon A1)으로 관찰할 슬라이드로 옮겼다. 기생충혈증의 수준은 Giemsa 용액으로 얇은 혈액 도말을 염색하여 모니터링하였다.
B. 보비스에서 FACS 실험(CJ-15,801 및 phiLOV(R475G, K476C)에 결합된 판토텐산 유도체).
B. 보비스 (phiLOV(R475G, K476C)에 연결된 CJ-15,801 및 판토텐산 유도체)에서 FACS 실험.
B. 보비스 텍사스 균주를 미호기성 정지상 배양 시스템(Bork 등)에 의해 10% Bovine RBC가 포함된 GIT 배지(Kohjin-bio Co)에서 배양하였다. 기생충 배양물을 원심분리하고 GIT 배지로 1회 세척하였다. RBC를 펠렛화하고 20μl의 감염된 RBC 혼합물(감염된 RBC+가 포장된 10μl 및 GIT로 포장된 10μl)을 준비하였다. 그런 다음 테스트 화합물(최종 농도 150-250μM) 또는 DMSO(0.1%)/PBS 대조군이 포함된 180μl GIT 배지를 추가하였다. 샘플을 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. (샘플을 GIT 배지에서 20 μM 최종 농도에서 DRAQ5를 사용하여 염색하였다). 인큐베이션 후, 샘플을 원심분리하고 펠렛을 GIT 배지(3 x)로 세척하고 BD FACSVerse로 분석하기 위해 FACS 튜브로 옮겼다.
B. 보비스 장기 시험(phiLOV(R475G, K476C)에 결합된 판토텐산 유도체 및 CJ-15,801).
B. 보비스 텍사스 균주는 미호기성 정지상 배양 시스템(Bork 등)에 의해 10% 소 RBC를 포함하는 GIT 배지에서 배양되었다. 기생충 배양물을 원심분리하고 GIT 배지로 1회 세척하였다. RBC를 펠렛화하고 20 μL 감염된 RBC 혼합물(10 μl 패킹된 감염된 RBC + 10 μl GIT)을 준비하였다. 그런 다음 테스트 화합물(phiLOV 유도체의 경우 최종 농도 100 또는 5μM) 또는 DMSO(0.1%)/PBS 대조군이 포함된 180μL의 GIT 배지를 추가하였다. 혼합물을 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 원심분리하고 펠렛을 GIT 배지(3 x)로 세척하였다. 그런 다음 180 μL의 GIT를 추가하고 샘플을 37℃에서 배양하였다. 샘플을 GIT 배지에서 200x 희석된 Hoechst 33342(Thermofisher)로 염색하고 50% 헤마토크릿 감염된 RBC 혼합물을 5시간 및 48시간 배양 후 공초점 레이저 현미경(Nikon A1)으로 관찰할 슬라이드로 옮겼다. 24시간 째에, 새로운 GIT 배지를 샘플에 추가하였다. 기생충 수준은 Giemsa 용액으로 얇은 혈액 도말을 염색하여 모니터링하였다.
결과
흡수 실험은 45분 동안 25μM 및 37℃에서 각 유도체와 함께 기생충(~5% 기생 적혈구(PPE))을 인큐베이션하여 수행하였다. 인큐베이션 후, 형광 강도는 공초점 현미경 이미지로부터 계산되었다. 이 이미지를 C. 엘레강스 (Miller 등 및 Fricker 등)에 적용된 동일한 절차에 따라 ImageJ 1.50b 소프트웨어로 분석하였다 (도 6).
화합물 1은 가장 높은 흡수율을 보였고, 유도체 3(50% 미만)보다 유의하게 높았고, 유사체 2 및 태그되지않은 BODIPY 대조군 11(90% 미만)은 화합물 1에 비해 훨씬 더 낮은 값을 나타냈다. 반면, 화합물 5는 또한 화합물 1과 비교하여 더 낮은 흡수(30% 더 적음)를 표시하였다.
phiLOV 이중 돌연변이체(R475G, K476C)를 사용하여 유도체 P11, P1, P8 및 P3을생성하고 phiLOV를 대조군으로 사용하여 B. 보비스 텍사스 균주에서의 흡수를 테스트하였다. 유도체와 대조군을 100μM 및 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 Hoeschst 33342(Thermofisher)를 공동 염색으로 사용하여 공초점 현미경으로 샘플을 분석하였다. 유도체 P3로 처리된 샘플만이 B. 보비스의 특징적인 이원 형태로 형광 흡수를 나타내었다(도 7).
별도의 연구에서 유도체 P11, P1, P8 및 P3과 태그되지 않은 phiLOV를 대조군으로 37℃에서 약 9% 기생 적혈구(PPE)에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 분류하기 위해 DRAQ5(Thermofisher)를 공동 염색으로 추가하였다. FACS 결과는 파생물 P3가 기생충 내에서 상당한 흡수 및 국소화를 나타내는 공초점 결과와 일치하였다.
기생충 성장 영향 분석은 B. 보비스에 감염된 RBC를 45분 동안 5μM 및 100μM에서 phiLOV 기능화된 유도체의 존재하에 인큐베이션하여 수행되었다. 초기 PPE는 ca. 각각 1% 및 3% 였다. 노출 후 48시간에 샘플을 채취하고 현미경 분석 전에 Giemsa 용액을 사용하여 PPE를 계산하였다. 모든 유도체는 대조군과 유의한 차이 없이 유사한 세포 성장을 나타냈다. 기생충 번식은 유도체 P3로 처리된 것을 포함하여 모든 배양물에서 비슷한 수준에 도달했으며 장기 실험에서 기생충에 대한 유도체의 무독성을 보여준다.
미코박테리움 테스트
M. 투베르클로시스에서의 흡수 테스트 (BODIPY FL에 연결된 판토텐산 유도체 및 CJ-15,801 ).
BODIPY 유도체 화합물 1-8 및 10의 20 mg/mL 스톡 용액을 DMSO로 제조하였다. M. 투베르클로시스 균주 H37Rv(University of Queensland에서 공급) 및 원심분리하고 배지를 제거한 다음 PBS/0.02% 틸록사폴로 펠렛 재현탁하고, 1mL 분취액을 Eppendorf 튜브로 옮기고, 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 펠릿을 1mL BODIPY 유도체(최종 농도 50μg/ml)와 함께 재현탁하고, 실온에서 45분 동안 인큐베이션하고 빛으로부터 보호한다. 인큐베이션 후, 샘플을 원심분리하고 펠렛을 PBS(3 x 100 μL)로 세척하고, 샘플을 96웰 마이크로플레이트로 옮겨 마이크로플레이트 판독기(Agilent)에서 형광 강도를 평가하였다. 25 μL를 유리 슬라이드에 스폿시킨 후 90℃에서 10분 동안 열 블록 상에서 건조시켰다. 세포를 10% 포르말린에 30분 동안 담가 고정시켰다. 그런 다음 슬라이드를 공기 건조하고 형광 현미경으로 관찰하기 전에 DAKO 장착 매체(Agilent)로 장착하였다.
결과
M. 투베르클로시스 균주 H37Rv를 사용하여 화합물 세트를 테스트하였다. 이 균주는 유전자 조작의 용이성으로 인해 생물의학 목적으로 광범위하게 연구되었지만 더 중요한 것은 세포가 결핵 및 약물에 대한 감수성에 대한 동물 모델에서 완전한 독성을 유지한다는 것이다.
흡수 실험은 위에서 설명한 대로 실온에서 50μg/mL(~80μM) 화합물 1-8, 10 및 대조군 PBS(인산염 완충 식염수)와 함께 세균을 45분 동안 배양하여 수행하였다.
도 9에 결과를 나타내었다.
결과는 엔아미드 케탈 유도체 (화합물 1-4)가 엔아미드 디올 (화합물 5-8)에 비해 더 높은 강도를 보였고 엔아미드 케탈 유도체의 R 거울상 이성질체(화합물 1 및 2)가 S 대응물(화합물 3 및 4)보다 선호됨을 보여주었다. 화합물 1과 2가 가장 높은 형광 신호를 보였으며, 화합물 2는 화합물 1에 비해 약 2.5배 더 큰 세기를 보였다. 흥미롭게도, 세균의 모양은 화합물 2의 경우 깨끗하고, 형광은 도 9(b)의 이미지가 나타낸 바와 같이, 극(poles)에 국소화되어 있다. 판토텐산 유도체 10은 최소한의 흡수를 보였다.
선충 테스트
선충류의 흡수 시험(이버멕틴 B1a, 이버멕틴에 결합된 판토텐산 유도체 및 BODIPY-이버멕틴 복합체)
Massey University의 양 농장에서 얻은 야생형 선충(회충, 촌충 및 흡충)의 혼합 배양물을 화합물 14, 화합물 15 및 상업적으로 이용가능한 이버멕틴 B1a를 대조군으로 하여 20시간 동안 인큐베이션하였다. 이어지는 프로토콜은 이전에 사용된 C. 엘레강스 프로토콜과 동일한다.
결과
화합물 14는 상업적으로 입수 가능한 이버멕틴 B1a에 비해 선충에 대해 향상된 활성을 나타내었다. 화합물 14로 처리된 선충은 이버멕틴 B1a의 경우 50μM에 비해 5μM에서 마비를 나타냈다. 화합물 15는 이버멕틴 B1a와 유사한 활성 프로파일을 나타냈다(도 8).
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Claims (61)

  1. 선충 또는 편충 감염을 치료하는 방법에 사용되기 위한, 화학식 (I)의 컨쥬게이트, 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태 또는 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물로서, 상기 화학식 (I)의 컨쥬게이트는:
    Figure pct00130

    식 중:
    -RA 및 -RB는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 시클로알킬알킬, 알카니올 및 아르알카노일로부터 선택되고;
    또는 -RA 및 -RB는 -C(RC1)(RC2)-와 함께, 6-원 고리를 형성하되, 여기서 -RC1은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선택되고및 -RC2는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아르알콕시 및 시클로알킬알콕시로부터 선택되며, 또는 -RC1 및 -RC2는 함께 옥소 (=O)를 형성한다;
    -RT1 및 -RT2는 각각 독립적으로 수소 또는 알킬;
    -R1 및 -R2는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선택되며;
    -R3는 수소 또는 알킬이고
    -D-는 C2-4 알케닐렌 또는 C1-4 알킬렌이며, 여기서 알케닐렌 또는 알킬렌은 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 치환되고;
    -X-는 공유 결합, -N(R4)-, -O-, -S-, 또는 -Se-이고, 여기서 -R4는 수소 또는 알킬이며;
    -L-은 링커 또는 공유 결합; 및
    A-는 전달을 위한 활성 제제이고, 염료, 소약물, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 다당류를 포함한다;
  2. 활성 제제를 선충 또는 편충에 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 화학식 (I)의 컨쥬게이트, 또는 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물을 선충 또는 편충과 접촉시키는 것을 포함하되;
    여기서 상기 방법은 인간 또는 동물의 신체를 치료하는 방법이 아니며, 화학식 (I)의 컨쥬게이트 및 의약 조성물은 제1항에서 정의된 바와 같은 것인 방법.
  3. 제1항의 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 제2항의 전달 방법에 있어서, 선충 또는 편충은 씨노랩디티스 선충, 예를 들어 C. 엘레강스; 헤몬쿠스 선충, 예를 들어 H. 콘토르투스; 및 시스토조마 편충, 예를 들어 S. 헤마토비움으로부터 선택되는 것인 제1항의 컨쥬게이트 또는 제2항의 전달 방법.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, A-는 소약물, 폴리펩타이드, 또는 다당류인, 사용을 위한 컨쥬게이트.
  5. 제1항, 제3항 또는 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, A-는 분자량이 1,000 Da 이하인 소약물인, 사용을 위한 컨쥬게이트.
  6. 제1항 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, A-는 분자량이 150 Da 이상인 소약물인, 사용을 위한 컨쥬게이트.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, 염료, 폴리펩타이드, 또는 다당류인 전달 방법에 사용되기 위한 컨쥬게이트.
  8. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, -D-는 C2　알케닐렌 또는 C2 알킬렌이고, 여기서 알케닐렌 또는 알킬렌은 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 치환되는 것인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  9. 제8항에 있어서, -D-는 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 치환된 C2　알케닐렌인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  10. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 알케닐렌기는 트랜스 배치를 갖는 것인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  11. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 알케닐렌기 시스 배치를 갖는 것인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  12. 제8항에 있어서, -D-는 C2　알킬렌인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  13. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, -RT1는 수소이고 -RT2는 수소 또는 알킬이며, 예를 들어 -RT1는 수소이고 -RT2는 수소인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  14. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, -R1 및 -R2는 각각 독립적으로 알킬, 알케닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선택되는 것인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  15. 제14항에 있어서, -R1 및 -R2는 각각 알킬, 예를 들어 메틸인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  16. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, -RA 및 -RB는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 시클로알킬알킬, 알카니올 및 아르알카노일로부터 선택되고, 예를 들어 -RA 및 -RB는 각각 수소인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  17. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, -RA 및 -RB는 -C(RC1)(RC2)-와 함께 6-원 고리를 형성하고, 여기서 -RC1은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선택되고, -RC2는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아르알콕시 및 시클로알킬알콕시로부터 선택되며, 또는 -RC1 및 -RC2는 함께 옥소 (=O)인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  18. 제17항에 있어서, -RC1 및 -RC2는 각각 메틸과 같은 알킬인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  19. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, -R3는 수소인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  20. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, -X-는 공유 결합 또는 -N(R4)-, 예를 들어 -X-는 -N(R4)-인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  21. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, -R4는 수소인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  22. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, -L-은 링커인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  23. 제22항에 있어서, -L-은 *-L3-B-L4-G-LA-기인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법:
    여기서 별표는 -X-에의 부착 지점을 나타내고;
    -L3-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
    -B-는 공유 결합, 아릴렌, 헤테로시클렌, 또는 시클로알킬렌;
    -L4-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌; 및
    -G-는 공유 결합, -O-, -S-, -N(RN)-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -N(RN)C(O)-, -OC(O)-, 및 말레이미드-유래된 기이고, 여기서 -RN는 수소 또는 알킬,
    -LA- 는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌이며
    여기서 -L3-, -B- 및 -L4- 중 적어도 하나는 공유 결합이 아니고, 및 -B-가 공유 결합이면, -L4- 는 공유 결합이다.
  24. 제22항에 있어서, -L-은 *-L3-B-L5-G-기인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법:
    식 중 별표는 -X-에의 부착 지점을 나타내고;
    -L3-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
    -B-는 공유 결합, 아릴렌, 헤테로시클렌, 또는 시클로알킬렌;
    -L5-는 아미드기 of 화학식 *-(NRNC(O)-L6)-이고, 여기서 별표는 -B-에 대한 부착 지점을 가리키고, 및 -L6-는 알킬렌이며
    G-는 공유 결합, -O-, -S-, -N(RN)-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -N(RN)C(O)-, -OC(O)-, 및 말레이미드-유래된 기,
    및 -RN은 수소 또는 알킬이다.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, -L-은 1,2,3-트리아졸을 함유하는 것인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  26. 제22항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, -L-은 말레이미드-유래된 기를 함유하는 것인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  27. 화학식 (I)의 컨쥬게이트 및 그의 염, 용매화합물 및 보호된 형태:
    Figure pct00131

    식 중:
    -RA 및 -RB는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 시클로알킬알킬, 알카니올 및 아르알카노일로부터 선택되고;
    또는 -RA 및 -RB는 -C(RC1)(RC2)-와 함께, 6-원 고리를 형성하되, 여기서 -RC1은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선택되고, -RC2는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아르알콕시 및 시클로알킬알콕시로부터 선택되며, 또는 -RC1 및 -RC2는 함께 옥소 (=O)이며;
    -RT1 및 -RT2는 각각 독립적으로 수소 또는 알킬;
    -R1 및 -R2는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선택되고;
    -R3는 수소 또는 알킬;
    -D-는 C2-4 알케닐렌이고, 여기서 알케닐렌은 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 치환되며;
    -X-는 공유 결합, -N(R4)-, -O-, -S-, 또는 -Se-이고, 여기서 -R4는 수소 또는 알킬이고;
    -L-은 링커 또는 공유 결합; 및
    A-는 전달을 위한 활성 제제이고 염료, 소약물, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 다당류를 포함한다.
  28. 제27항에 있어서, A-는 염료인 컨쥬게이트.
  29. 제27항에 있어서, A-는 분자량이 1,000 Da 이하인 소약물인 컨쥬게이트.
  30. 제27항 또는 제29항에 있어서, A-는 분자량이 150 Da 이상인 소약물인 컨쥬게이트.
  31. 제27항에 있어서, A-는 폴리펩타이드이거나 이를 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  32. 제27항에 있어서, A-는 폴리뉴클레오타이드이거나 이를 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  33. 제27항에 있어서, A-는 다당류이거나 이를 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  34. 제27항 또는 제33항에 있어서, A-는 이당류이거나 이를 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  35. 제27항 또는 제33항에 있어서, A-는 이당류가 아니거나 이를 포함하지 않는 것인 컨쥬게이트.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, -D-는 C2　알케닐렌이고, 여기서 상기 알케닐렌은 알킬 또는 할로에 의해 선택적으로 치환된 것인 컨쥬게이트.
  37. 제27항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 알케닐렌기는 트랜스 배치를 갖는 것인 컨쥬게이트.
  38. 제27항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 알케닐렌기는 시스 배치를 갖는 것인 컨쥬게이트.
  39. 제27항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, -RT1은 수소이고 -RT2는 수소 또는 알킬이며, 예를 들어 -RT1은 수소이고 -RT2는 수소인 컨쥬게이트.
  40. 제27항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, -RT1은 수소이고 -RT2는 수소 또는 알킬이며, 예를 들어 -RT1은 수소이고 -RT2는 수소인 컨쥬게이트.
  41. 제27항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, -R1 및 -R2는 각각 알킬, 예를 들어 메틸인 컨쥬게이트.
  42. 제27항 내지 제41항 중 어느 하나의 항에 있어서, -RA 및 -RB는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 시클로알킬알킬, 알카니올 및 아르알카노일로부터 선택되고, 예를 들어 -RA 및 -RB는 각각 수소인 컨쥬게이트.
  43. 제27항 내지 제42항 중 어느 하나의 항에 있어서, -RA 및 -RB는 -C(RC1)(RC2)-와 함께, 6-원 고리를 형성하고, 여기서 -RC1은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬 및 시클로알킬알킬로부터 선택되고, -RC2는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아르알콕시 및 시클로알킬알콕시로부터 선택되며, 또는 -RC1 및 -RC2는 함께 옥소 (=O)인 컨쥬게이트.
  44. 제27항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, -RC1 및 -RC2는 각각 알킬, 예를 들어 메틸인 컨쥬게이트.
  45. 제27항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, -R3는 수소인 컨쥬게이트.
  46. 제27항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, -X-는 공유 결합 또는 -N(R4)-인 컨쥬게이트.
  47. 제27항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, -X-는 -N(R4)-인 컨쥬게이트.
  48. 제27항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, -R4는 수소인 컨쥬게이트.
  49. 제27항 내지 제48항 중 어느 하나의 항에 있어서, -L-은 링커인 컨쥬게이트.
  50. 제27항 내지 제49항 중 어느 하나의 항에 있어서, -L-은 *-L3-B-L4-G-LA-기인 컨쥬게이트:
    식 중 별표는 -X-에의 부착 지점을 나타내고;
    -L3-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
    -B-는 공유 결합, 아릴렌, 헤테로시클렌, 또는 시클로알킬렌;
    -L4-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌; 및
    -G-는 공유 결합, -O-, -S-, -N(RN)-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -N(RN)C(O)-, -OC(O)-, 및 말레이미드-유래된 기이고, 여기서 -RN은 수소 또는 알킬,
    -LA-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌이며
    여기서 -L3-, -B- 및 -L4- 중 적어도 하나는 공유 결합이 아니고, -B-가 공유 결합이면, -L4-는 공유 결합이다.
  51. 제27항 내지 제49항 중 어느 하나의 항에 있어서, -L-은 *-L3-B-L5-G-기인 컨쥬게이트:,
    식 중 별표는 -X-에의 부착 지점을 나타내고;
    -L3-는 공유 결합, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌;
    -B-는 공유 결합, 아릴렌, 헤테로시클렌, 또는 시클로알킬렌;
    -L5-는 화학식 *-(NRNC(O)-L6)-의 아미드기이고, 여기서 별표는 -B-에 대한 부착 지점을 가리키며, -L6-는 알킬렌이며
    G-는 공유 결합, -O-, -S-, -N(RN)-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -N(RN)C(O)-, -OC(O)-, 및 말레이미드-유래된 기이고
    -RN은 수소 또는 알킬이다.
  52. 제27항 내지 제51항 중 어느 하나의 항에 있어서, -L-은 1,2,3-트리아졸을 함유하는 것인 컨쥬게이트.
  53. 제27항 내지 제51항 중 어느 하나의 항에 있어서, -L-은 말레이미드-유래된 기를 함유하는 것인 컨쥬게이트.
  54. 제27항 내지 제53항 중 어느 하나의 항에 기재된 화학식 (I)의 컨쥬게이트 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 의약 조성물.
  55. 치료 방법에 사용되기 위한 제27항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 기재된 화학식 (I)의 컨쥬게이트, 또는 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물.
  56. 인간 및 동물 신체의 기생충 감염의 치료 방법에 사용되기 위한 제27항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 기재된 화학식 (I)의 컨쥬게이트, 또는 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물.
  57. 활성 제제를 기생충에 전달하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 제27항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 기재된 화학식 (I)의 컨쥬게이트, 또는 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물을 기생충과 접촉시키는 것을 포함하되; 상기 방법은 인간 또는 동물 신체를 치료하기 위한 것이 아닌 방법.
  58. 제56항의 사용을 위한 컨쥬게이트, 또는 제57항의 전달 방법에 있어서, 기생충은 플라스모디움 기생충, 예를 들어 P. 팔시파룸, P. 비박스, P. 오발레, P. 말라리아 및 P. 놀레시; 테일레리아 기생충, 예를 들어 T.아눌라타 및 T. 파르바; 피토프로라 기생충, 예를 들어 P. 신나모미 및 P. 아가티디시다; 바베시아 기생충, 예를 들어 B. 보비스; 크리티디아 기생충, 예를 들어 C. 봄비; 로트마리아 기생충, 예를 들어 L. 파씸; 트리파노조마 기생충, 예를 들어 T. 브루세이; 또는 톡소플라즈마 기생충, 예를 들어 T. 곤디이로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
  59. 인간 및 동물 신체의 미생물 감염, 예를 들어 세균 감염을 치료하는 방법에 사용되기 위한, 제27항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 기재된 화학식 (I)의 컨쥬게이트, 또는 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물.
  60. 활성 제제를 미생물, 예를 들어 세균에 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 제27항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 기재된 화학식 (I)의 컨쥬게이트, 또는 화학식 (I)의 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물을 미생물, 예를 들어 세균과 접촉시키는 것을 포함하되; 여기서 상기 방법은 인간 또는 동물 신체를 치료하기 위한 것이 아닌 방법.
  61. 제59항의 사용을 위한 컨쥬게이트, 또는 제60항의 전달 방법에 있어서, 미생물, 예를 들어 세균은, 미코세균 세균, 예를 들어 M. 투베르클로시스; 에스케리치아 세균, 예를 들어 대장균; 스타필로코커스 세균, 예를 들어 S. 아우레우스; 또는 엔테로코커스 세균, 예를 들어 E. 페칼리스로부터 선택되는 것인, 사용을 위한 컨쥬게이트 또는 전달 방법.
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