KR20210104837A - 항체의 제어된 푸코실화 - Google Patents

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KR20210104837A
KR20210104837A KR1020217022526A KR20217022526A KR20210104837A KR 20210104837 A KR20210104837 A KR 20210104837A KR 1020217022526 A KR1020217022526 A KR 1020217022526A KR 20217022526 A KR20217022526 A KR 20217022526A KR 20210104837 A KR20210104837 A KR 20210104837A
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샨타 보다파티
아론 첸
스왑닐 바르가바
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씨젠 인크.
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Abstract

본 발명은 코어 푸코실화의 제어된 수준으로 항체들 및 항체 유도체들을 제조하는 방법을 제공한다. 일 측면에서, 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예들에서, 본 발명은 본 방법에 의해 생성된 항체들 또는 항체 유도체들의 조성물을 제공한다. 상기 항체들 및 유도체들은 치료적 또는 예방적 유효량의 상기 항체 또는 유도체 및 약학적으로 허용되는 성분들을 포함하는 약학 조성물로서 제형화 될 수 있다.

Description

항체의 제어된 푸코실화
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 12월 19일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/781,691호의 우선권의 이익을 주장하며, 이는 모든 목적을 위해 전체가 참조로서 통합된다.
재조합 치료 단백질은 많은 상이한 방법들에 의해 제조된다. 한 바람직한 방법은 포유류 숙주 세포주들로부터 재조합 단백질들을 생산하는 것이다. 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포들과 같은 세포주들은 관심있는 치료 단백질을 발현하도록 조작된다. 상이한 세포주들은 단백질 특성 및 생산성을 포함하여 재조합 단백질 생산에 대한 장점들 및 단점들을 갖는다. 상업적 생산을 위한 세포주의 선택은 종종 높은 생산성에 대한 필요성과 주어진 제품에 필요한 속성을 갖는 일관된 제품 품질을 제공하는 능력의 균형을 유지한다. 일관된 고품질 특성들과 높은 역가 공정을 필요로 하는 치료 재조합 단백질의 한 중요한 부류는 단일클론 항체들이다.
포유류 숙주 세포들에서 생산된 단일클론 항체들은 글리코실화를 포함하여 다양한 번역후 변형들을 가질 수 있다. IgG1들과 같은 단일클론 항체들은 각 중쇄의 아스파리긴 297(Asn297)에서 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는다(무손상 항체 당 2개). 항체들의 Asn297에 부착된 글리칸들은 일반적으로 매우 낮거나 없는 양분된 N-아세틸글루코사민(양분된 GlcNac)과 소량의 말단 시알산 및 다양한 양의 갈록토오스를 갖는 복합 이중안테나 구조이다. 또한 글리칸들은 보통 높은 수준의 코어 푸코실화를 갖는다. 항체들에서 코어 푸코실화의 감소는 Fc 효과기 기능들, 특히 Fc감마 수용체 결합 및 ADCC 활성을 변경하는 것으로 나타났다. 이 관찰은 조작 세포주들에 대한 관심을 이끌어 코어 푸코실화가 감소된 항체들을 생산한다.
코어 푸코실화를 감소시키기 위해 세포주를 조작하는 방법들은 유전자 녹아웃(gene knock-out), 유전자 녹인(gene knock-in) 및 RNA 간섭(RNAi)을 포함한다. 유전자 녹아웃에서, FUT8(알파 1,6-푸코실트랜스퍼라제 효소)를 인코딩하는 유전자는 비활성화된다. FUT8은 GDP-푸코스에서 N-글리칸의 Asn-연결된 (N-연결된) GlcNac의 위치 6으로 푸코실 잔기의 전달을 촉매한다. FUT8은 Asn297에서 N-연결된 이중안테나 탄수화물에 푸코스를 추가하는 유일한 효소로 보고되어 있다. 유전자 녹인은 GNTIII 또는 골지 알파 만나시다제 II와 같은 효소를 인코딩하는 유전자를 추가한다. 세포들에서 이러한 효소의 수준이 증가하면 푸코실화 경로로부터 단일클론 항체로 전환되고(코어 푸코실화 감소로 이어짐), 양분된 N-아세틸글루코사민의 양이 증가된다. RNAi는 일반적으로 또한 FUT8 유전자 발현을 표적으로하여 mRNA 전사 수준을 감소시키거나 유전자 발현을 완전히 녹아웃시킨다. 세포주들을 조작하는 대안은 글리코실화 경로에서 효소에 작용하는 소분자 억제제의 사용을 포함한다.
일부 적용에서, 코어 푸코실화 및 코어 어푸코실화 항체들 또는 항체 유도체들의 혼합된 집단을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 원하는 수준의 코어 어푸코실화를 초래할 배양 파라미터들을 예측하는 개선된 방법들이 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 코어 어푸코실화의 제어된 수준을 갖는 항체들 및 항체 유도체들을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법들은 주어진 푸코실화 억제제(예를 들어, 2-플루오로푸코스)를 사용한 항체 또는 항체 유도체 어푸코실화 수준의 정확한 예측 모델이 상응하는 배양 파라미터(예를 들어, 세포 면적 또는 항체 역가의 적분)와 쌍을 이룬 푸코실화 억제제와 관련된 파리미터(예를 들어, 푸코실화 억제제의 양 또는 푸코실화 억제제 첨가의 시간)를 예측 모델에 대한 입력으로 사용하여 생성될 수 있음을 보여주는 예들에 제시된 예상치 못한 결과를 부분적으로 전제로 한다.
일 측면에서, 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 숙주 세포를 미리 결정된 양의 푸코실화의 억제제(Ap)의 존재하에 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 숙주세포는 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민을 통해 Fc 도메인에 결합된 적어도 하나의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬을 갖는 Fc 도메인을 갖는 항체 또는 항체 유도체를 발현하는 것인 단계; 및 (b) 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계를 포함하고, 상기 Ap는 (b)의 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준이 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차를 초과하지 않는 어푸코실화의 수준을 갖도록 미리 결정된 것인 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 또는 항체 유도체들은 배양 완료시 분리된다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 Ap를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서,
일부 구현예들에서, 상기 설명된 Ap를 사용하는 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, Ap는 입력으로서 복수의 상이한 푸코실화 억제제 양과 배양에서의 숙주 세포의 세포 성장 파라미터 및 출력으로서 상기 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 사용하여 생성된 예측 모델에 기초하여 결정된다. 일부 구현예들에서, 상기 예측 모델은 입력으로서 세포 성장 파라미터에 대해 정규화된 푸코실화 억제제 양을 사용하여 생성된다. 일부 구현예들에서, 상기 세포 성장 파라미터는 적분 세포 면적(ICA)이다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 상기 예측 모델을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민을 통해 Fc 도메인에 결합된 적어도 하나의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬을 갖는 Fc 도메인을 갖는 항체 또는 항체 유도체를 발현하는 것인 단계; (b) 배양 동안 미리 결정된 시간(Tp)에서 배양 배지에 푸코실화 억제제의 포화량을 첨가하는 단계로서, 상기 푸코실화 억제제의 포화량은 배양의 d0에 첨가될 때 적어도 약 95%의 어푸코실화를 초래하는 것인 단계; 및 (c) 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계를 포함하고, 상기 Tp는 (c)의 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준이 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차를 초과하지 않는 어푸코실화의 수준을 갖도록 미리 결정된 것인 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 또는 항체 유도체는 배양 완료시 분리된다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 Tp를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 Tp를 사용하여 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법들에 따르면, Tp는 입력으로서 배양에서 복수의 상이한 포화 푸코실화 억제제 첨가 시간에서의 배양물에서의 항체 또는 항체 유도체의 역가 및 출력으로서 상기 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 사용하여 생성된 예측 모델에 기초하여 결정된다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 상기 예측 모델을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 푸코실화 억제제는 푸코스 유사체이다. 일부 구현예들에서, 상기 푸코스 유사체는 2-플루오로푸코스(2FF), 화학식 I의 화합물 또는 화학식 II의 화합물이다. 일부 구현예들에서, 상기 푸코스 유사체는 2FF이다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 어푸코실화의 목표 수준은 (a) 약 100% 내지 약 90%; (b) 약 90% 내지 약 80%; (c) 약 80% 내지 약 70%; (d) 약 70% 내지 약 60%; (e) 약 60% 내지 약 50%; (f) 약 50% 내지 약 40%; (g) 약 40% 내지 약 30%; (h) 약 30% 내지 약 20%; (i) 약 20% 내지 약 10%; 또는 (j) 약 10% 내지 약 0%이다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 어푸코실화의 목표 수준은 (a) 약 80% 초과; (b) 약 60% 초과; (c) 약 40% 초과; (d) 약 20% 초과; (e) 약 10% 초과; 또는 (f) 약 5% 초과이다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차는 10% 이하이다. 일부 구현예들에서, 상기 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차가 5% 이하이다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 숙주 세포는 하이브리도마(hybridoma)이다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 숙주 세포는 유가 배양(fed batch culture)에서 성장된다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 숙주 세포는 연속 공급 배양(continuous feed culture)에서 성장된다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 배양 배지는 적어도 100 리터의 부피를 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 배양 배지는 적어도 500 리터의 부피를 갖는다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 배양 배지는 동물성 단백질이 없는 배지이다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계는 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계는 단백질 A 컬럼을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계는 양이온 또는 음이온 교환 컬럼 또는 소수성 상호작용 컬럼을 사용하는 것을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 항체 또는 항체 유도체는 무손상 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 무손상 항체는 IgG1 항체이다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 항체 또는 항체 유도체는 단일 사슬 항체이다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 항체 또는 항체 유도체는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법에 따르면, 상기 항체 또는 항체 유도체는 항체 Fc 영역 및 비면역글로불린 단백질의 리간드 결합 도메인을 포함하는 항체 유도체이다.
본 발명의 이들 및 다른 측면들은 다음의 상세한 설명, 특정 구현예들의 비제한적인 예들 및 첨부된 도면들을 참조하여 보다 완전히 이해될 수 있다.
도 1a는 다양한 농도의 2-플루오로푸코스(2FF)로 처리된 세포주의 성장을 보여주는 생존 세포 밀도(VCD) 곡선을 나타낸다.
도 1b는 상이한 성장 특성을 갖는 다수의 CHO 세포주를 결합하는 [2FF 농도]/ICA의 함수로서 % 어푸코실화에 대한 포화 모델을 나타낸다.
도 2a는 지연된 스케줄에서 2FF로 처리된 두 다른 세포주들에 대한 평균 역가를 나타낸다.
도 2b는 대조군, 세포주 A에 대한 2FF의 0일(d0) 첨가 및 3일(d3) 첨가(생산 시작부터 계산된 모든 날)에 대한 어푸코실화의 비교를 나타낸다.
도 2c는 대조군, 세포주 B에 대한 2FF의 0일(d0) 첨가 및 3일(d3) 첨가(생산 시작부터 계산된 모든 날)에 대한 어푸코실화의 비교를 나타낸다.
정의
용어 "항체"는 (a) 특정 항원(예를 들어, CD70)에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위 및 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬(들)을 포함하는 Fc 도메인을 함유하는 면역글로불린 폴리펩타이드들 및 면역글로불린 폴리펩타이드들의 면역학적 활성 부분들, 즉, 면역글로불린 군의 폴리펩타이드들, 또는 이들의 단편들, 또는 (b) 항원(예를 들어, CD70)에 면역특이적으로 결합하는 이러한 면역글로불린 폴리펩타이드들 또는 단편들의 보존적으로 치환된 유도체들을 지칭한다. 항체들은 일반적으로, 예를 들어, Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)에 설명되어 있다. 문맥에서 달리 명백하지 않는 한, 항체에 대한 언급은 또한 하기에 더욱 상세히 설명되는 항체 유도체들을 포함한다.
"항체 유도체"는, 예를 들어, 이종 폴리펩타이드(예를 들어, 이종 단백질의 리간드 결합 도메인)의 부착에 의해 또는 글리코실화(코어 푸코실화 제외), 디글리코실화(비-코어 푸코실화 제외), 아세틸화, 인산화 또는 항체 또는 Fc 도메인 또는 영역과 일반적으로 연관되지 않은 다른 변형에 의한 것과 같은, 이종 분자의 공유 결합에 의해 변형된 상기 설명된 같은 항체(항체 단편 포함), 또는 복합체 N-글리코사이드 연결된 당 사슬을 포함하는 항체의 Fc 도메인 또는 영역을 의미한다.
용어 "단일클론 항체(monoclonal antibody)"는 임의의 진핵 또는 원핵 세포 클론, 또는 파지 클론을 포함하는 단일 세포 클론으로부터 유래된 항체를 지칭하는 것으로 그것이 제조되는 방법에 의하는 것이 아니다. 따라서, 용어 "단일클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 제조된 항체들로 제한되지 않는다.
용어 "Fc 영역"은 항체의 불변 영역, 예를 들어, 선택적으로 CH4 도메인을 갖는 CH1-힌지-CH2-CH3 도메인, 또는 이러한 Fc 영역의 보존적으로 치환된 유도체를 지칭한다.
용어 "Fc 도메인"은 항체의 불변 영역 도메인, 예를 들어, CH1, 힌지, CH2, CH3 또는 CH4 도메인, 또는 이러한 Fc 도메인의 보존적으로 치환된 유도체를 지칭한다.
"항원"은 항체가 특이적으로 결합하는 분자이다.
용어 "특이적으로 결합하는" 및 "특이적으로 결합한다"는 항체 또는 항체 유도체가 다수의 다른 항원들이 아닌 그의 상응하는 목표 항원과 고도로 선택적인 방식으로 결합할 것임을 의미한다. 일반적으로, 항체 또는 항체 유도체는 적어도 약 1x10-7 M, 바람직하게는 10-8 M 내지 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 또는 10-12 M의 친화도로 결합하고 밀접하게 관련된 항원 이외의 비특이적 항원(예를 들어, BSA, 카제인)에 대한 결합의 친화도보다 적어도 2배 보다 큰 친화도로 미리결정된 항원에 결합한다.
용어 "억제하다" 또는 "의 억제"는 측정 가능한 양만큼 감소시키거나 완전히 막는 것을 의미한다.
용어 "적분 세포 영역" 또는 "ICA"는 도 1a에 나타난 바와 같이 주어진 세포주에 대한 생존 세포 밀도(VCD) 곡선 아래의 영역을 나타내며, 예를 들어, VCD 곡선을 적분하여 계산될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는"은 동물, 특히 안간에서 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 등재된 것을 의미한다. 용어 "약학적으로 호환되는 성분"은 항체 또는 항체 유도체가 투여되는 약학적으로 허용되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다.
용어 "생물학적으로 허용되는"은 항체들의 제조를 위한 세포주의 배양에서 사용하기에 적합함을 의미한다. 예시적인 생물학적으로 허용되는 염들은 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 니트레이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레이트, 젠티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 및 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌 비스-(2 하이드록시 3-나프토에이트)) 염들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 생물학적으로 허용되는 염들은 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 기타 반대이온들과 같은 다른 분자의 포함을 포함할 수 있다. 상기 반대이온은 모 화합물의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 또한, 생물학적으로 허용되는 염은 그 구조에 하나 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자들이 생물학적으로 허용되는 염의 일부인 경우 다수의 반대 이온들을 가질 수 있다. 따라서, 생물학적 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대이온을 가질 수 있다.
본 발명의 치료 제제들은 통상적으로 바람직하지 않은 오염물로부터 실질적으로 순수하다. 이것은 제제가 통상적으로 적어도 약 50% w/w(중량/중량) 순도일 뿐만 아니라 간섭 단백질들 및 오염물질들이 실질적으로 없음을 의미한다. 때때로 상기 제제들은 적어도 80% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 90% 또는 약 95% w/w 순도이다. 기존의 단백질 정제 기술들을 사용하여 적어도 99% w/w의 균질한 펩타이드를 수득할 수 있다.
본원에 사용된 "알키닐 푸코스 퍼아세테이트"는 위치 R1-4에 아세테이트 그룹들이 있는 임의의 또는 모든 형태의 알키닐 푸코스(5-에티닐아라비노스) (하기 화학식 I 및 II 참조)를 지징하며, 이는 문맥에 달리 명시되지 않는 한 6-에티닐-테트라하이드로-2H-피란-2,3,4,5-테트라일 테트라아세테이트((2S,3S,4R,5R,6S) 및 (2R,3S,4R,5R,6S) 이성질체들을 포함), 및 5-((S)-1-하이드록시프로프-2-이닐)-테트라하이드로푸란-2,3,4-트리일 테트라아세테이트((2S,3S,4R,5R) 및 (2R,3S,4R,5R) 이성질체들을 포함) 및 알도스 형태를 포함한다. 용어 "알키닐 푸코스 트리아세테이트", "알키닐 푸코스 디아세테이트" 및 "알키닐 푸코스 모노아세테이트"는 각각 알키닐 푸코스의 트리(tri)-, 디(di)- 및 모노(mono)-아세테이트 형태를 지칭한다.
문맥에 의해 달리 지시되지 않는 한, 용어 "알킬"은 1 내지 20의 탄소원자들(및 이 탄소 원자들의 범위 및 특정 수들의 모든 조합 및 하위 조합)을 갖는 치환 또는 비치환된 포화 직쇄형 또는 분지형 탄화수소를 지칭하며, 1 내지 3, 1 내지 8 또는 1 내지 10의 탄소 원자들이 바람직하다. 알킬 그룹들의 예들은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, 세크-부틸, 터트-부틸, n-펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, 2-메틸-2-부틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, 3-메틸-2-부틸, 3-메틸-1-부틸, 2-메틸-1-부틸, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3-메틸-3-펜틸, 2-메틸-3-펜틸, 2,3-디메틸-2-부틸, 및 3,3-디메틸-2-부틸이다.
알킬 그룹들은 단독으로 또는 다른 그룹의 일부로서 하나 이상의 그룹, 바람직하게는 1 내지 3의 그룹(및 할로겐으로부터 선택되는 임의의 추가 치환기)으로 선택적으로 치환될 수 있으며, 이는 할로겐, -O-(C1-C8 알킬, -O-(C2-C8 알케닐), O-(C2-C8 알키닐), 아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -NH2, -NH(R'), N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 여기서 각 R' 은 독립적으로 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), 아릴, 및 R' 그룹들은 추가로 치환될 수 있다. 이러한 추가 치환기는, 예를 들어, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R'', -OC(O)R'', -C(O)OR'', -C(O)NH2, -C(O)NHR'', -C(O)N(R'')2, -NHC(O)R'', -SR'', -SO3R'', -S(O)2R'', -S(O)R'', -OH, -NH2, -NH(R''), -N(R'')2 및 -CN을 포함하며, 여기서 각 R''은 독립적으로 H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 선택되고, 상기 추가 치환기들은 바람직하게는 치환되지 않는다. 일부 구현예들에서, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), 아릴, 및 R' 그룹들은 추가로 치환되지 않는다.
문맥에 의해 달리 지시되지 않는 한, 용어 "알케닐" 및 "알키닐"은 2 내지 20의 탄소원자들(및 이 탄소 원자들의 범위 및 특정 수들의 모든 조합 및 하위 조합)을 갖는 치환 또는 비치환된 직쇄형 및 분지형 탄소 사슬들을 지칭하며, 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 8 또는 2 내지 10의 탄소 원자들이 바람직하다. 알케닐 사슬은 사슬에 적어도 하나의 이중 결합을 갖고 알키닐 사슬은 사슬에 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는다. 알케닐 그룹들의 예들은 에틸렌 또는 비닐, 알릴, -1　부테닐, -2 부테닐, -이소부틸레닐, -1 펜테닐, -2 펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, -2 메틸 2 부테닐, 및 -2,3 디메틸 2 부테닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 알키닐 그룹들의 예들은 아세틸렌, 프로파길, 아세틸레닐, 프로피닐, -1 부티닐, -2 부티닐, -1 펜티닐, -2 펜티닐, 및 -3 메틸 1 부티닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
알케닐 및 알키닐 그룹들은 단독으로 또는 다른 그룹의 일부로서 하나 이상의 그룹, 바람직하게는 1 내지 3의 그룹(및 할로겐으로부터 선택되는 임의의 추가 치환기)으로 선택적으로 치환될 수 있으며, 이는 할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), 아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -NH2, -NH(R'), N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 여기서 각 R' 은 독립적으로 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), 아릴, 및 R' 그룹들은 추가로 치환될 수 있다. 이러한 추가 치환기들은, 예를 들어, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R'', -OC(O)R'', -C(O)OR'', -C(O)NH2, -C(O)NHR'', -C(O)N(R'')2, -NHC(O)R'', -SR'', -SO3R'', -S(O)2R'', -S(O)R'', -OH, -NH2, -NH(R''), -N(R'')2 및 -CN을 포함하며, 여기서 각 R''은 독립적으로 H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 선택되고, 상기 추가 치환기들은 바람직하게는 치환되지 않는다. 일부 구현예들에서, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, 및 R' 그룹들은 추가로 치환되지 않는다.
문맥에 의해 달리 지시되지 않는 한, 용어 "알킬렌"은 1 내지 20의 탄소원자들(및 이 탄소 원자들의 범위 및 특정 수들의 모든 조합 및 하위 조합)을 갖는 치환 또는 비치환된 포화 분지형 또는 직쇄형 탄화수소 라디칼을 지칭하며, 1 내지 8 또는 1 내지 10의 탄소 원자들이 바람직하며 모 알칸의 동일하거나 두 다른 탄소 원자들로부터의 두 수소 원자들을 제거함으로써 유도된 두 1가 라디칼 중심을 갖는다. 전형적인 알킬렌들은 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌, 옥틸렌, 노닐렌, 데칼렌, 1,4-사이클로헥실렌 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
알킬렌 그룹들은 단독으로 또는 다른 그룹의 일부로서 하나 이상의 그룹, 바람직하게는 1 내지 3의 그룹(및 할로겐으로부터 선택되는 임의의 추가 치환기)으로 선택적으로 치환될 수 있으며, 이는 할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), 아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -NH2, -NH(R'), N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 여기서 각 R' 은 독립적으로 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), 아릴, 및 R' 그룹들은 추가로 치환될 수 있다. 이러한 추가 치환기들은, 예를 들어, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R'', -OC(O)R'', -C(O)OR'', -C(O)NH2, -C(O)NHR'', -C(O)N(R'')2, -NHC(O)R'', -SR'', -SO3R'', -S(O)2R'', -S(O)R'', -OH, -NH2, -NH(R''), -N(R'')2 및 -CN을 포함하며, 여기서 각 R''은 독립적으로 H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 선택되고, 상기 추가 치환기들은 바람직하게는 치환되지 않는다. 일부 구현예들에서, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, 및 R' 그룹들은 추가로 치환되지 않는다.
문맥에 의해 달리 지시되지 않는 한, 용어 "아릴"은 모 방향족 고리 시스템의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 6 내지 20의 탄소원자들(및 이 탄소 원자들의 범위 및 특정 수들의 모든 조합 및 하위 조합)의 치환된 또는 비치환된 1가 방향족 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 일부 아릴 그룹들은 예시적인 구조들에서 "Ar"로 표시된다. 전형적인 아릴 그룹들은 벤젠, 치환된 벤젠, 페닐, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐 등으로부터 유도된 라디칼들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
아릴 그룹들은 단독으로 또는 다른 그룹의 일부로서 하나 이상의 그룹, 바람직하게는 1 내지 5, 또는 심지어 1 내지 2의 그룹들로 선택적으로 치환될 수 있으며, 이는 할로겐, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -NH2, -NH(R'), N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 여기서 각 R'은 독립적으로 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), 아릴, 및 R' 그룹들은 추가로 치환될 수 있다. 이러한 추가 치환기들은, 예를 들어, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R'', -OC(O)R'', -C(O)OR'', -C(O)NH2, -C(O)NHR'', -C(O)N(R'')2, -NHC(O)R'', -SR'', -SO3R'', -S(O)2R'', -S(O)R'', -OH, -NH2, -NH(R''), -N(R'')2 및 -CN을 포함하며, 여기서 각 R''은 독립적으로 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 선택되고, 상기 추가 치환기들은 바람직하게는 치환되지 않는다. 일부 구현예들에서, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), 아릴, 및 R' 그룹들은 추가로 치환되지 않는다.
문맥에 의해 달리 지시되지 않는 한, 용어 "헤테로사이클"은 3 내지 7, 또는 3 내지 10의 고리 원자들(고리 구성원이라고도 함)을 갖는 치환된 또는 비치환된 모노사이클릭 고리 시스템을 지칭하며, 여기서 적어도 하나의 고리 원자는 N, O, P 또는 S(및 이 탄소 원자들 및 헤테로원자들의 범위 및 특정 수들의 모든 조합 및 하위 조합)로부터 선택되는 헤테로원자이다. 헤테로사이클은 N, O, P 또는 S로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4의 고리 헤테로원자들을 가질 수 있다. 헤테로사이클에서 하나 이상의 N, C, 또는 S원자들은 산화될 수 있다. 모노사이클릭 헤테로사이클은 바람직하게는 3 내지 7 고리 구성원들을 갖는다(예를 들어, 2 내지 6의 탄소 원자들 및 N, O, P 또는 S로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 3의 헤테로원자들). 헤테로원자를 포함하는 고리는 방향족 또는 비방향족일 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 헤테로사이클은 안정한 구조를 생성하는 임의의 헤테로원자 또는 탄소원자에서 펜던트 그룹에 부착된다.
헤테로사이클들은 Paquette, "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), 특히 Chapters 1, 3, 4, 6, 7, 및 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), 특히 Volumes 13, 14, 16, 19, 및 28; 및 J. Am. Chem. Soc. 82:5566 (1960)에서 설명된다.
"헤테로사이클" 그룹들의 예들은 피리딜, 디하이드로피리딜, 테트라하이드로피리딜 (피페리딜), 티아졸릴, 피리미디닐, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 테트라졸릴, 푸코실, 아지르디닐, 아제티디닐, 옥시라닐, 옥세타닐 및 테트라하이드로푸라닐을 제한이 아닌 예로서 포함한다.
헤테로사이클 그룹은 단독으로 또는 다른 그룹의 일부로서 하나 이상의 그룹들, 바람직하게는 1 내지 2의 그룹들로 선택적으로 치환될 수 있으며, 이는 -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -NH2, -NH(R'), N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 여기서 각 R' 은 독립적으로 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 아릴, 및 R' 그룹들은 추가로 치환될 수 있다. 이러한 추가 치환기들은, 예를 들어, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R'', -OC(O)R'', -C(O)OR'', -C(O)NH2, -C(O)NHR'', -C(O)N(R'')2, -NHC(O)R'', -SR'', -SO3R'', -S(O)2R'', -S(O)R'', -OH, -NH2, -NH(R''), -N(R'')2 및 -CN을 포함하며, 여기서 각 R''은 독립적으로 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 선택되고, 상기 추가 치환기들은 바람직하게는 치환되지 않는다. 일부 구현예들에서, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 아릴, 및 R' 그룹들은 추가로 치환되지 않는다.
제한이 아닌 예로서, 탄소-결합된 헤테로사이클들은 다음의 위치에서 결합될 수 있다: 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6; 피리다진의 위치 3, 4, 5, 또는 6; 피리미딘의 위치 2, 4, 5, 또는 6; 피라진의 위치 2, 3, 5, 또는 6; 푸란, 테트라하이드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라하이드로피롤의 위치 2, 3, 4, 또는 5; 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4, 또는 5; 이속사졸, 피라졸 또는 이소티아졸의 위치 3, 4, 또는 5; 아지리딘의 위치 2 또는 3; 아제티딘의 위치 2, 3, 또는 4. 예시적인 탄소 결합된 헤테로사이클들은 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 5-피리딜, 6-피리딜, 3-피리다지닐, 4-피리다지닐, 5-피리다지닐, 6-피리다지닐, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐, 6-피리미디닐, 2-피라지닐, 3-피라지닐, 5-피라지닐, 6-피라지닐, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 또는 5-티아졸릴을 포함할 수 있다.
제한이 아닌 예로서, 질소 결합된 헤테로사이클들은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 또는 1H-인다졸의 위치 1; 이소인돌, 또는 이소인돌린의 위치 2; 및 모르폴린의 위치 4에서 결합될 수 있다. 더욱 더 전형적으로 질소 결합된 헤테로사이클들은 1-아지리딜, 1-아제티딜, 1-피롤릴, 1-이미다졸릴, 1-피라졸릴 및 1-페리디닐을 포함한다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "카보사이클"은 3 내지 6의 고리 원자들(이 탄소 원자들의 범위 및 특정 수의 모든 조합들 및 하위 조합들)을 갖는 치환된 또는 비치환된, 포화 또는 불포화 비방향족 모노사이클릭 고리 시스템을 지칭하며, 여기서 모든 고리 원자들은 탄소 원자들이다.
카보사이클 그룹들은 단독으로 또는 다른 그룹의 일부로서, 예를 들어, 하나 이상의 그룹들, 바람직하게는 1 또는 2의 그룹들(및 할로겐으로부터 선택되는 임의의 추가 치환기들)로 선택적으로 치환될 수 있으며, 이는 할로겐, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -NH2, -NH(R'), N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 여기서 각 R' 은 독립적으로 H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, 및 R' 그룹들은 추가로 치환될 수 있다. 이러한 추가 치환기들은, 예를 들어, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R'', -OC(O)R'', -C(O)OR'', -C(O)NH2, -C(O)NHR'', -C(O)N(R'')2, -NHC(O)R'', -SR'', -SO3R'', -S(O)2R'', -S(O)R'', -OH, -NH2, -NH(R''), -N(R'')2 및 -CN을 포함하며, 여기서 각 R''은 독립적으로 H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 선택되고, 상기 추가 치환기들은 바람직하게는 치환되지 않는다. 일부 구현예들에서, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), 아릴, 및 R' 그룹들은 추가로 치환되지 않는다.
모노사이클릭 카보사이클릭 치환기들의 예들은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 1-사이클로펜트-1-에닐, 1-사이클로펜트-2-에닐, 1-사이클로펜트-3-에닐, 사이클로헥실, 1-사이클로헥스-1-에닐, 1-사이클로헥스-2-에닐, 1-사이클로헥스-3-에닐, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, -1,3-사이클로헥사디에닐, -1,4-사이클로헥사디에닐, -1,3-사이클로헵타디에닐, -1,3,5-사이클로헵타트리에닐 및
-사이클로옥타디에닐을 포함한다.
임의의 구성요소 또는 임의의 식에서 임의의 변수가 1회 보다 많이 발생하는 경우, 각 발생에서의 정의는 서로에 대한 정의와 독립적이다. 치환기들 및/또는 변수들의 조합들은 이러한 조합들이 안정적인 화합물을 생성하는 경우에만 허용된다.
문맥에 의해 달리 지시되지 않는 한, 하이픈 (-)은 펜던트 분자에 대한 부착 지점을 지정한다. 따라서, 용어 "-(C1-C10 알킬렌)아릴" 또는 "-C1-C10 알킬렌(아릴)"은 본원에 정의된 바와 같은 C1-C10 알킬렌 라디칼을 지칭하며, 여기서 알킬렌 라디칼은 알킬렌 라디칼의 탄소 원자들 중 임의에 부착되고 알킬렌 라디칼의 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 하나는 본원에 정의된 아릴 라디칼로 대체된다.
특정 그룹이 "치환"되는 경우, 그 그룹은 하나 이상의 치환기, 바람직하게는 1 내지 5의 치환기, 더욱 바람직하게는 1 내지 3의 치환기, 가장 바람직하게는 1 내지 2의 치환기를 가질 수 있으며, 이는 치환기들의 리스트로부터 독립적으로 선택된다. 그러나, 상기 그룹은 일반적으로 할로겐으로부터 선택된 임의의 수의 치환기를 가질 수 있다.
분자의 특정 위치에서 임의의 치환기 또는 변수의 정의는 해당 분자의 다른 위치에서의 정의와 독립적인 것으로 의도된다. 본 발명의 화합물들 상의 치환기들 및 치환 패턴들은 화학적으로 안정하고 당업계 공지된 기술뿐만 아니라 본원에 제시된 이 방법들에 의해 쉽게 합성될 수 있는 화합물을 제공하기 위해 당업자에 의해 선택될 수 있음이 이해된다.
코어 푸코실화를 제어하는 방법
본 발명은 특정 수준의 코어 어푸코실화를 갖는 항체 및 항체 유도체를 제조하는 방법들을 제공한다. 상기 방법들은 주어진 푸코실화 억제제(예를 들어, 2-플루오로푸코스)를 사용한 항체 또는 항체 유도체 어푸코실화 수준의 정확한 예측 모델이 상기 예측 모델의 입력으로서 상응하는 배양 파라미터(예를 들어, 세포 영역의 적분 또는 항체 역가)와 쌍을 이룬 푸코실화 억제제와 관련된 파라미터들(예를 들어, 푸코실화 억제제의 양 또는 푸코실화 억제제 첨가 시간)을 사용하여 생성될 수 있음을 보여주는 예들에 제시된 예상치 못한 결과를 부분적으로 전제로 한다. 본원에 사용된 "코어 푸코실화"는 N-연결된 글리칸의 환원 말단에서 N-아세틸글루코사민("GlcNac")에 푸코스를 첨가("푸코실화(fucosylation)")하는 것을 지칭한다. 또한 이러한 방법들에 의해 생성된 항체들 및 항체 유도체들이 제공된다.
일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체의 Fc 영역(또는 도메인)에 결합된 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬들의 어푸코실화의 수준은 특정양의 푸코실화 억제제를 사용하거나 항체 또는 항체 유도체 배양 동안 특정 시간에서 푸코실화 억제제를 첨가함으로써 제어된다. 본원에 사용된 바와 같이 "복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬"은 일반적으로 아스파라긴 297(Kabat의 수에 따른)에 결합되지만 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬은 또한 다른 아스파라긴 잔기에 연결될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬은 주로 다음의 구조를 갖는 이중안테나 복합 당 사슬을 갖는다:
Figure pct00001
여기서 ±는 당 분자가 있거나 없을 수 있음을 나타내고 숫자는 당 분자 사이의 연결 위치를 나타낸다. 상기 구조에서, 아스파라긴에 결합하는 당 사슬 말단은 환원 말단(오른쪽에서)이라하고 반대쪽은 비-환원 말단이라 한다. 푸코스는 통상적으로 α1,6 결합 (GlcNAc의 6-위치는 푸코스의 1-위치에 연결된다)에 의해 일반적으로 환원 말단의 N-아세틸글루코사민("GlcNac")에 결합된다. "Gal"은 갈락토스를 지칭하고 "Man"은 만노스를 지칭한다.
"복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬"은 코어 구조의 비-환원 말단에 만노스만 혼입된 고 만노스 유형의 당 사슬을 제외하지만, 1) 코어 구조의 비-환원 말단 측이 갈락토스-N-아세틸글루코사민("gal-GlcNac"라고도 함)의 하나 이상의 가지를 갖고 Gal-GlcNAc의 비-환원 말단 측이 선택적으로 시알산, 양분된 N-아세틸글루코사민 등을 갖는 복합체 유형; 또는 2) 코어 구조의 비-환원 말단 측이 고 만노스 N-글리코사이드-연결된 당 사슬 및 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬의 가지 모두를 갖는 하이브리드 유형을 포함한다.
일부 구현예들에서, "복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬"은 코어 구조의 비환원 말단 측이 0 또는 하나 이상의 갈락토스-N-아세틸글루코사민("gal-GlcNac"라고도 함)의 가지를 갖고 Gal-GlcNAc의 비환원 말단 측이 선택적으로 시알산, 양분된 N-아세틸글루코사민 등과 같은 구조를 추가로 갖는 복합체 유형을 포함한다.
본 방법들에 따르면, 세포주 배양에 의해 생성되는 항체 또는 항체 유도체의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬(들)에 혼입되는 푸코스의 양이 조절될 수 있다. 예를 들어, 다양한 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 임의의 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5%(이 값들의 사이의 임의의 범위들을 포함) 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 임의의 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 보다 큰 코어 어푸코실화를 갖는다.
항체 또는 항체 유도체의 코어 푸코실화/어푸코실화 백분율은 이러한 계산을 수행하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 계산될 수 있다. 예를 들어, 4중극 비행시간(Quadrupole Time of Flight, Qtof) 질량 분광계 분석이 항체 코어 푸코실화/어푸코실화 백분율 계산을 위해 사용될 수 있다. Qtof는 항체 중쇄의 특징적인 피크들의 질량 단위들과 강도들을 제공한다. 항체 코어 푸코실화 Qtof 분석에서, 스펙트럼들은 다음을 포함하는 여러 피크들을 포함한다: 두 비환원 말단에 갈락토스가 없고 코어 푸코실화를 갖는 탄수화물 구조에 해당하는 피크(본원에서 "G0"라고도 함); 비환원 말단들 중 하나가 갈락토스를 갖고(2 개의 이성질체 혼합물) 코어 푸코실화를 갖는 탄수화물 구조에 해당하는 피크(본원에서 "G1"라고도 함); 비환원 말단들 모두가 갈라토스를 갖고 코어 푸코실화를 갖는 탄수화물 구조에 해당하는 피크 (본원에서 "G2"라고도 함); 두 비환원 말단들 중 어느 하나에 갈락토스가 없고 코어 푸코실화가 없는 탄수화물 구조에 해당하는 피크(본원에서 "G0-F"라고도 함); 비환원 말단들 중 하나가 갈락토스를 갖고(2개의 이성질체 혼합물) 푸코실화가 없는 탄수화물 구조에 해당하는 피크(본원에서 "G1-F"라고도 함); 및 비환원 말단들 모두가 갈락토스를 갖고 코어 푸코실화가 없는 탄수화물 구조에 해당하는 피크(본원에서 "G1-F"라고도 함). 푸코실화의 억제는 G0 피크의 강도 감소 및 G0-F 피크의 증가로 나타낼 수 있다. 따라서, 어푸코실화 백분율은 다음의 식을 사용하여 계산될 수 있다:
Figure pct00002
푸코실화 억제제의 양
일부 구현예들에서, 숙주 세포를 배양함으로써 생성된 항체 또는 항체 유도체의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬(들)에 혼입된 푸코스의 양은 배양 배지에 포함된 푸코실화 억제제의 양을 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 푸코스 유사체이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF, 화학식 I의 화합물, 또는 화학식 II 의 화합물이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF이다. 일부 구현예들에서, 첨가된 푸코실화 억제제의 양은 배양의 d0에 첨가될 때 적어도 약 95%(예를 들어, 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 포화량 미만이다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제의 양은 입력으로서 배양 배지에 존재하는 푸코실화 억제제의 농도 및 배양 파리미터를 갖는 예측 모델을 사용하여 결정된다. 일부 구현예들에서, 배양 파라미터는 적분 세포 영역(ICA)이다. 일부 구현예들에서, 하나 이상(예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 그 초과)의 추가량의 푸코실화 억제제가 배양 동안 첨가된다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포를 배양함으로써 생성된 항체 또는 항체 유도체의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬(들)에 혼입된 푸코스의 양은 배양 동안 특정 시간, Ta에 첨가되는 푸코실화 억제제의 양을 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 일부 구현예들에서, Ta는 배양의 d0, d1, d2, d3, d4, d5 또는 그 이후 중 임의의 것일 수 있다. 일부 구현예들에서, Ta는 배양의 d5 보다 늦지 않다(예를 들어, d4, d3, d2, d1, 또는 d0 중 임의의 것 보다 늦지 않다). 일부 구현예들에서, Ta는 배양의 d0이다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 푸코스 유사체이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF, 화학식 I의 화합물 또는 화학식 II의 화합물이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF이다. 일부 구현예들에서, 첨가된 푸코실화 억제제의 양은 배양의 d0에서 첨가될 때 적어도 약 95%(예를 들어, 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 포화량 미만이다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제의 양은 입력으로서 Ta에서 첨가된 푸코실화 억제제의 농도 및 배양 파리미터를 갖는 예측 모델을 사용하여 결정된다. 일부 구현예들에서, 배양 파라미터는 적분 세포 영역(ICA)이다. 일부 구현예들에서, 하나 이상(예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 그 초과)의 추가량의 푸코실화 억제제가 Ta 후에 첨가된다.
따라서, 일부 구현예들에서, 본원에는 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준(예를 들어, 백분율)을 제어하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 숙주 세포를 미리 결정된 양의 푸코실화의 억제제(Ap)의 존재하에 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 숙주세포는 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민을 통해 Fc 도메인에 결합된 적어도 하나의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬을 갖는 Fc 도메인을 갖는 항체 또는 항체 유도체를 발현하는 것인 단계; 및 (b) 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 배양 완료시 분리된다. 일부 구현예들에서, Ap는 (b)의 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준이 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차를 초과하지 않는 어푸코실화의 수준을 갖도록 결정된다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 Ap를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 푸코스 유사체이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF, 화학식 I의 화합물 또는 화학식 II의 화합물이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF이다. 일부 구현예들에서, Ap는 배양의 d0에서 첨가될 때 적어도 약 95%(예를 들어, 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 포화량 미만이다. 일부 구현예들에서, 하나 이상(예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 그 초과)의 추가량의 푸코실화 억제제가 배양 동안 첨가된다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 추가량의 푸코실화 억제제는 독립적으로 Ap와 동일하거나 거의 동일하다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 추가량의 푸코실화 억제제는 독립적으로 약 Ap 미만이다.
일부 구현예들에서, 본원에는 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준(예를 들어, 백분율)을 제어하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 배양 배지에서 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주세포는 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민을 통해 Fc 도메인에 결합된 적어도 하나의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬을 갖는 Fc 도메인을 갖는 항체 또는 항체 유도체를 발현하고, 여기서 미리 결정된 양의 푸코실화 억제제(Ap)가 시간 Ta에서 배양 배지에 첨가되는 단계; 및 (b) 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 배양 완료시 분리된다. 일부 구현예들에서, Ap는 (b)의 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준이 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차를 초과하지 않는 어푸코실화의 수준을 갖도록 결정된다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 Ap를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 푸코스 유사체이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF, 화학식 I의 화합물 또는 화학식 II의 화합물이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF이다. 일부 구현예들에서, Ap는 배양의 d0에서 첨가될 때 적어도 약 95%(예를 들어, 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 포화량 미만이다. 일부 구현예들에서, Ta는 배양의 d0, d1, d2, d3, d4, d5, 또는 그 이후 중 임의의 것이다. Ta는 배양의 d5 보다 늦지 않다(예를 들어, d4, d3, d2, d1, 또는 d0 중 임의의 것 보다 늦지 않다). 일부 구현예들에서, Ta는 배양의 d0이다. 일부 구현예들에서, 하나 이상(예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 그 초과)의 추가량의 푸코실화 억제제가 Ta 후에 첨가된다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 추가량의 푸코실화 억제제는 독립적으로 Ap와 동일하거나 거의 동일하다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 추가량의 푸코실화 억제제는 독립적으로 약 Ap 미만이다.
일부 구현예들에서, Ap를 사용하는 본원에 설명된 임의의 방법들에 따르면, Ap는 입력으로서 복수의 상이한 푸코실화 억제제 양(예를 들어, d0으로부터 배양 배지에 존재하거나 Ta에 첨가된) 및 배양에서 숙주 세포의 세포 성장 파라미터 및 출력으로서 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 사용하여 생성된 예측 모델에 기초하여 결정된다. 일부 구현예들에서, 상기 예측 모델은 입력으로서 세포 성장 파리미터에 대해 정규화된 푸코실화 억제제 양을 사용하여 생성된다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 상기 예측 모델을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 세포 성장 파라미터는 적분 세포 영역(ICA)이다.
일부 구현예들에서, 복수의 상이한 푸코실화 억제제 양(예를 들어, d0으로부터 배양 배지에 존재하거나 또는 Ta에 첨가된)을 사용하는 본원에 설명된 임의의 방법들에 따르면, 적어도 3(예컨데 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 초과)의 상이한 양의 푸코실화 억제제가 사용된다. 일부 구현예들에서, 복수의 상이한 푸코실화 억제제 양들은 농도에서 적어도 약 10 배(예컨데 적어도 약 임의의 25배, 50 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1,000 배, 2,000 배, 3,000 배, 4,000 배, 5,000 배, 6,000 배, 7,000 배, 8,000 배, 9,000 배, 10,000 배 또는 그 보다 많은) 차이의 범위를 포괄한다. 일부 구현예들에서, 복수의 상이한 푸코실화 억제제 양은 농도에 적어도 약 1,000 배 차이의 범위를 포괄한다. 일부 구현예들에서, 복수의 상이한 푸코실화 억제제 양은 d0에서 첨가될 때 적어도 약 95%(예컨데 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 포화량을 초과하는 임의의 양의 푸코실화 억제제를 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 푸코스 유사체이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF, 화학식 I의 화합물 또는 화학식 II의 화합물이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF이다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 2FF이고, 복수의 상이한 2FF 양은 약 100 μM보다 큰 임의의 농도를 포함하지 않는다.
일부 구현예들에서, Ap를 사용하는 본원에 설명된 임의의 방법들에 따르면, Ap는 d0에서 첨가될 때 적어도 약 95%(예컨데 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 포화량 미만이다. 일부 구현예들에서, Ap는 약 1 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM, 45 μM, 50 μM, 55 μM, 60 μM, 65 μM, 70 μM, 75 μM, 80 μM, 85 μM, 90 μM, 95 μM, 100 μM, 120 μM, 140 μM, 160 μM, 180 μM, 200 μM, 220 μM, 240 μM, 260 μM, 280 μM, 300 μM, 320 μM, 340 μM, 360 μM, 380 μM, 400 μM, 420 μM, 440 μM, 460 μM, 480 μM, 500 μM, 520 μM, 540 μM, 560 μM, 580 μM, 600 μM, 620 μM, 640 μM, 660 μM, 680 μM, 700 μM, 720 μM, 740 μM, 760 μM, 780 μM, 800 μM, 820 μM, 840 μM, 860 μM, 880 μM, 900 μM, 920 μM, 940 μM, 960 μM, 980 μM, 1,000 μM, 또는 그 초과(이 값들 사이의 임의의 범위 포함) 중 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 푸코스 유사체이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF, 화학식 I의 화합물 또는 화학식 II의 화합물이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF이다.
일부 구현예들에서, Ap를 사용하는 본원에 설명된 임의의 방법들에 따르면, 푸코실화 억제제는 2FF이고, Ap는 약 100 μM 미만 (예컨데, 약 99 μM, 98 μM, 97 μM, 96 μM, 95 μM, 94 μM, 93 μM, 92 μM, 91 μM, 90 μM, 89 μM, 88 μM, 87 μM, 86 μM, 85 μM, 84 μM, 83 μM, 82 μM, 81 μM, 80 μM, 79 μM, 78 μM, 77 μM, 76 μM, 75 μM, 74 μM, 73 μM, 72 μM, 71 μM, 70 μM, 69 μM, 68 μM, 67 μM, 66 μM, 65 μM, 64 μM, 63 μM, 62 μM, 61 μM, 60 μM, 59 μM, 58 μM, 57 μM, 56 μM, 55 μM, 54 μM, 53 μM, 52 μM, 51 μM, 50 μM, 49 μM, 48 μM, 47 μM, 46 μM, 45 μM, 44 μM, 43 μM, 42 μM, 41 μM, 40 μM, 39 μM, 38 μM, 37 μM, 36 μM, 35 μM, 34 μM, 33 μM, 32 μM, 31 μM, 30 μM, 29 μM, 28 μM, 27 μM, 26 μM, 25 μM, 24 μM, 23 μM, 22 μM, 21 μM, 20 μM, 19 μM, 18 μM, 17 μM, 16 μM, 15 μM, 14 μM, 13 μM, 12 μM, 11 μM, 10 μM, 9 μM, 8 μM, 7 μM, 6 μM, 5 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 또는 1 μM 중 임의의 것 미만)이다.
일부 구현예들에서, 예측 모델은 ICA로 정규화된 배양 배지에 존재하는 2FF 농도에 대한 % 어푸코실화를 플로팅하고 곡선을 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 동역학 식에 맞춰 식의 상수를 결정함으로써 생성된 통계 모델이다.
일부 구현예들에서, Ap 및 Ta를 사용하는 본원에 설명된 임의의 방법들에 따르면, Ta는 배양의 d0, d1, d2, d3, d4, d5 또는 그 이후 중 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, Ta는 배양의 d5보다 늦지 않다(예컨데 d4, d3, d2, d1, 또는 d0 중 임의의 것 보다 늦지 않음). 일부 구현예들에서, Ta는 배양의 d0이다.
일부 구현예들에서, Ap를 사용하는 본원에 설명된 임의의 방법들에 따르면, 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차는 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 중 임의의 것보다 크지 않다. 일부 구현예들에서, 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차는 약 5% 보다 크지 않다.
일부 구현예들에서, Ap를 사용하는 본원에 설명된 임의의 방법들에 따르면, 항체 또는 항체 유도체는 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 중 임의의(이 값들 사이의 임의의 범위 포함) 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것 보다 큰 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 100% 내지 약 95% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 95% 내지 약 90% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 90% 내지 약 85% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 85% 내지 약 80% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 80% 내지 약 75% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 75% 내지 약 70% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 70% 내지 약 65% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 65% 내지 약 60% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 60% 내지 약 55% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 55% 내지 약 50% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 50% 내지 약 45% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 45% 내지 약 40% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 40% 내지 약 35% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 35% 내지 약 30% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 30% 내지 약 25% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 25% 내지 약 20% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 20% 내지 약 15% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 15% 내지 약 10% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 10% 내지 약 5% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 5% 내지 약 0% 코어 어푸코실화를 갖는다.
일부 구현예들에서, 본원에는 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준(예를 들어, 백분율)을 제어하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 숙주 세포를 미리 결정된 양의 2FF(Ap)를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 숙주세포는 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민을 통해 Fc 도메인에 결합된 적어도 하나의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬을 갖는 Fc 도메인을 갖는 항체 또는 항체 유도체를 발현하는 것인 단계; 및 (b) 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 배양 완료시 분리된다. 일부 구현예들에서, Ap는 (b)의 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준이 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차를 초과하지 않는 어푸코실화의 수준을 갖도록 결정된다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 Ap를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, Ap는 d0에서 첨가될 때 적어도 약 95%(예컨데 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 포화량 미만이다. Ap는 약 100 μM 미만(예컨데, 약 90 μM, 80 μM, 70 μM, 60 μM, 50 μM, 40 μM, 30 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM, 또는 그 미만 중 임의의 것 보다 적음)이다.
일부 구현예들에서, 본원에는 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준(예를 들어, 백분율)을 제어하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 숙주 세포를 미리 결정된 양의 2FF(Ap)를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 숙주세포는 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민을 통해 Fc 도메인에 결합된 적어도 하나의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬을 갖는 Fc 도메인을 갖는 항체 또는 항체 유도체를 발현하는 것인 단계; 및 (b) 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계를 포함하고, 여기서 Ap는 입력으로서 Ta에서 첨가된 복수의 상이한 2FF 양과 배양에서의 숙주 세포의 세포 성장 파라미터 및 출력으로서 상기 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 사용하여 생성된 예측 모델에 기초하여 결정되는 방법이 제공된다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 배양 완료시 분리된다. 일부 구현예들에서, 예측 모델은 입력으로서 세포 성장 파라미터로 정규화된 2FF 양들을 사용하여 생성된다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 예측 모델을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 세포 성장 파라미터는 적분 세포 영역 (ICA)이다. 일부 구현예들에서, Ap는 (b)의 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준이 어푸코실화의 목표 수준으로부터 최대 편차를 초과하지 않는 어푸코실화 수준을 갖도록 결정된다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 Ap를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. Ap는 d0에서 첨가될 때 적어도 약 95%(예컨데 약 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 포화량 미만이다. 일부 구현예들에서, Ap는 약 100 μM 미만(예컨데, 약 90 μM, 80 μM, 70 μM, 60 μM, 50 μM, 40 μM, 30 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM, 또는 그 미만 중 임의의 것 보다 적음)이다.
푸코실화 억제제 첨가 시간
일부 구현예들에서, 숙주 세포를 배양함으로써 생성된 항체 또는 항체 유도체의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬(들)에 혼입된 푸코스의 양은 푸코실화 억제제가 존재하는 배양 동안 푸코실화 억제제가 첨가되는 시간을 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 배양의 d0 후에 첨가된다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 푸코스 유사체이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2-플루오로푸코스(2FF), 화학식 I의 화합물 또는 화학식 II의 화합물이다. 일부 구현예들에서, 푸코시 유사체는 2FF이다. 일부 구현예들에서, 첨가된 푸코실화 억제제의 양은 d0에서 첨가될 때 적어도 약 95%(예컨데, 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 포화량 또는 그 정도이다. 일부 구현예들에서, 첨가된 푸코실화 억제제의 양은 d0에서 첨가될 때 적어도 약 95%(예컨데, 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 대략적인 포화량보다 적다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제의 첨가 시간은 입력으로서 푸코실화 억제제 첨가 시간 및 배양 파라미터를 갖는 예측 모델을 사용하여 결정된다. 일부 구현예들에서, 배양 파라미터는 항체 역가이다. 일부 구현예들에서, 항체 역가는 푸코실화 억제제의 첨가 시간에서의 항체 역가이다. 일부 구현예들에서, 하나 이상(예컨데 2, 3, 4, 5 또는 그 초과)의 추가 양의 푸코실화 억제제가 제1 첨가 후에 첨가된다.
따라서, 일부 구현예들에서, 본원에는 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민을 통해 Fc 도메인에 결합된 적어도 하나의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬을 갖는 Fc 도메인을 갖는 항체 또는 항체 유도체를 발현하는 것인 단계; (b) 배양 동안 미리 결정된 시간(Tp)에서 배양 배지에 푸코실화 억제제의 양을 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 배양 완료시 분리된다. 일부 구현예들에서, 상기 Tp는 (c)의 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준이 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차를 초과하지 않는 어푸코실화의 수준을 갖도록 결정된다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 Tp를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 푸코스 유사체이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF, 화학식 I의 화합물 또는 화학식 II의 화합물이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF이다. 일부 구현예들에서, 첨가된 푸코실화 억제제의 양은 d0에서 첨가될 때 적어도 약 95%(예컨데, 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 포화량 또는 그 정도이다. 일부 구현예들에서, 첨가된 푸코실화 억제제의 양은 d0에서 첨가될 때 적어도 약 95%(예컨데, 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 대략적인 포화량 보다 적다. 일부 구현예들에서, 하나 이상(예컨데 2, 3, 4, 5 또는 그 초과)의 추가 양의 푸코실화 억제제가 제1 첨가 후에 첨가된다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 추가량의 푸코실화 억제제는 독립적으로 제1 첨가에서 푸코실화 억제제의 양과 동일하거나 거의 동일하다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 추가량의 푸코실화 억제제는 독립적으로 제1 첨가에서 푸코실화 억제제의 대략적인 양보다 적다.
일부 구현예들에서, Tp를 사용하는 본원에 설명된 임의의 방법들에 따르면, Tp는 입력으로서 배양에서 복수의 상이한 푸코실화 억제제 첨가 시간에서의 배양물에서의 항체 또는 항체 유도체의 역가 및 출력으로서 상기 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 사용하여 생성된 예측 모델에 기초하여 결정된다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 상기 예측 모델을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 복수의 상이한 푸코실화 억제제 첨가 시간을 사용하는 본원에 설명된 임의의 방법들에 따르면, 푸코실화 억제제의 적어도 3(예컨데 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과)의 상이한 첨가 시간이 사용된다. 일부 구현예들에서, 복수의 상이한 푸코실화 억제제 첨가 시간은 적어도 약 24시간의 (예컨데, 적어도 약 36 시간, 48 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간, 120 시간, 132 시간, 144 시간, 156 시간, 168 시간, 180 시간, 192 시간, 204 시간, 216 시간, 228 시간, 240 시간, 또는 그 초과 중 임의의) 범위를 포괄한다. 일부 구현예들에서, 복수의 상이한 푸코실화 억제제 첨가 시간은 적어도 약 72시간의 범위를 포괄한다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 푸코스 유사체이다. 일부 구현예들에서, 푸코시 유사체는 2FF, 화학식 I의 화합물 또는 화학식 II의 화합물이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF이다.
일부 구현예들에서, Tp를 사용하는 본원에 설명된 임의의 방법들에 따르면, Tp에서 첨가된 푸코실화 억제제의 양은 약 1 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM, 45 μM, 50 μM, 55 μM, 60 μM, 65 μM, 70 μM, 75 μM, 80 μM, 85 μM, 90 μM, 95 μM, 100 μM, 120 μM, 140 μM, 160 μM, 180 μM, 200 μM, 220 μM, 240 μM, 260 μM, 280 μM, 300 μM, 320 μM, 340 μM, 360 μM, 380 μM, 400 μM, 420 μM, 440 μM, 460 μM, 480 μM, 500 μM, 520 μM, 540 μM, 560 μM, 580 μM, 600 μM, 620 μM, 640 μM, 660 μM, 680 μM, 700 μM, 720 μM, 740 μM, 760 μM, 780 μM, 800 μM, 820 μM, 840 μM, 860 μM, 880 μM, 900 μM, 920 μM, 940 μM, 960 μM, 980 μM, 1,000 μM, 또는 그 초과(이 값들 사이의 임의의 범위들 포함) 중 임의의 것이다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 푸코스 유사체이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF, 화학식 I의 화합물 또는 화학식 II의 화합물이다. 일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2FF이다.
일부 구현예들에서, Tp를 사용하는 본원에 설명된 임의의 방법들에 따르면, 푸코실화 억제제는 2FF이고 Tp에서 첨가된 2FF의 양은 약 100 μM 이하(예컨데, 약 99 μM, 98 μM, 97 μM, 96 μM, 95 μM, 94 μM, 93 μM, 92 μM, 91 μM, 90 μM, 89 μM, 88 μM, 87 μM, 86 μM, 85 μM, 84 μM, 83 μM, 82 μM, 81 μM, 80 μM, 79 μM, 78 μM, 77 μM, 76 μM, 75 μM, 74 μM, 73 μM, 72 μM, 71 μM, 70 μM, 69 μM, 68 μM, 67 μM, 66 μM, 65 μM, 64 μM, 63 μM, 62 μM, 61 μM, 60 μM, 59 μM, 58 μM, 57 μM, 56 μM, 55 μM, 54 μM, 53 μM, 52 μM, 51 μM, 50 μM, 49 μM, 48 μM, 47 μM, 46 μM, 45 μM, 44 μM, 43 μM, 42 μM, 41 μM, 40 μM, 39 μM, 38 μM, 37 μM, 36 μM, 35 μM, 34 μM, 33 μM, 32 μM, 31 μM, 30 μM, 29 μM, 28 μM, 27 μM, 26 μM, 25 μM, 24 μM, 23 μM, 22 μM, 21 μM, 20 μM, 19 μM, 18 μM, 17 μM, 16 μM, 15 μM, 14 μM, 13 μM, 12 μM, 11 μM, 10 μM, 9 μM, 8 μM, 7 μM, 6 μM, 5 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 또는 1 μM 중 임의의 것 미만)이다.
일부 구현예들에서, Tp를 사용하는 본원에 설명된 임의의 방법들에 따르면, 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차는 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 중 임의의 것 이하이다. 일부 구현예들에서, 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차는 약 5% 이하이다.
일부 구현예들에서, Tp를 사용하는 본원에 설명된 임의의 방법들에 따르면, 항체 또는 항체 유도체는 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 중 임의의(이 값들 사이의 임의의 범위들 포함) 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 중 임의의 것 보다 큰 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 100% 내지 약 95% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 95% 내지 약 90% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 90% 내지 약 85% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 85% 내지 약 80% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 80% 내지 약 75% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 75% 내지 약 70% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 70% 내지 약 65% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 65% 내지 약 60% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 60% 내지 약 55% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 55% 내지 약 50% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 50% 내지 약 45% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 45% 내지 약 40% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 40% 내지 약 35% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 35% 내지 약 30% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 30% 내지 약 25% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 25% 내지 약 20% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 20% 내지 약 15% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 15% 내지 약 10% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 10% 내지 약 5% 코어 어푸코실화를 갖는다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 약 5% 내지 약 0% 코어 어푸코실화를 갖는다.
일부 구현예들에서, 본원에는 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민을 통해 Fc 도메인에 결합된 적어도 하나의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬을 갖는 Fc 도메인을 갖는 항체 또는 항체 유도체를 발현하는 것인 단계; (b) 배양 동안 미리 결정된 시간(Tp)에서 배양 배지에 2FF를 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 배양 완료시 분리된다. 일부 구현예들에서, Tp는 (c)의 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준이 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차를 초과하지 않는 어푸코실화의 수준을 갖도록 결정된다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 Tp를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 첨가된 2FF의 양은 d0에서 첨가될 때 적어도 약 95%(예컨데, 약 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 포화량 또는 그 정도이다. 일부 구현예들에서, 첨가된 2FF의 양은 약 100 μM이다.
일부 구현예들에서, 본원에는 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민을 통해 Fc 도메인에 결합된 적어도 하나의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬을 갖는 Fc 도메인을 갖는 항체 또는 항체 유도체를 발현하는 것인 단계; (b) 배양 동안 미리 결정된 시간(Tp)에서 배양 배지에 2FF를 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계를 포함하고, Tp는 입력으로서 배양에서 복수의 상이한 2FF 첨가 시간에서의 배양물에서의 항체 또는 항체 유도체의 역가 및 출력으로서 상기 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 사용하여 생성된 예측 모델에 기초하여 결정되는 방법이 제공된다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 배양 완료시 분리된다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 상기 예측 모델을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, Tp는 (c)의 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준이 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차를 초과하지 않는 어푸코실화의 수준을 갖도록 결정된다. 일부 구현예들에서, 첨가된 2FF의 양은 d0에서 첨가될 때 적어도 약 95%(예컨데, 약 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과 중 임의의) 어푸코실화를 초래하는 포화량 또는 그 정도이다. 일부 구현예들에서, 첨가된 2FF의 양은 약 100 μM이다.
일부 구현예들에서, 본원에 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법들에 따르면, 숙주 세포는 재조합 숙주세포이다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.
일부 구현예들에서, 본원에 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법들에 따르면, 숙주 세포는 하이브리도마이다.
일부 구현예들에서, 본원에 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법들에 따르면, 숙주 세포는 유가 배양에서 성장된다.
일부 구현예들에서, 본원에 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법들에 따르면, 숙주 세포는 연속 공급 배양에서 성장된다.
일부 구현예들에서, 본원에 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법들에 따르면, 배양 배지는 적어도 100 리터의 부피를 갖는다. 일부 구현예들에서, 배양 배지는 적어도 500 리터의 부피를 갖는다.
일부 구현예들에서, 본원에 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법들에 따르면, 배양 배지는 동물성 단백질이 없는 배지이다.
일부 구현예들에서, 본원에 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법들에 따르면, 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계는 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계는 단백질 A 컬럼을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계는 양이온 또는 음이온 교환 컬럼 또는 소수성 상호작용 컬럼을 사용하는 것을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본원에 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법들에 따르면, 항체 또는 항체 유도체는 무손상 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 무손상 항체는 IgG1 항체이다.
일부 구현예들에서, 본원에 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법들에 따르면, 항체 또는 항체 유도체는 단일 사슬 항체이다.
일부 구현예들에서, 본원에 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법들에 따르면, 항체 또는 항체 유도체는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예들에서, 본원에 설명된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 임의의 방법들에 따르면, 항체 또는 항체 유도체는 항체 Fc 영역 및 비면역글로불린 단백질의 리간드 결합 도메인을 포함하는 항체 유도체이다.
푸코실화 억제제
일부 구현예들에서, 본원에 설명된 방법들은 푸코실화 억제제를 사용한다. 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 2-플루오로푸코스 (2FF) 또는 대상에게 투여될 때 생체 내에서 2FF로 전환되는 푸코스 유사체이다. 고려되는 추가 푸코실화 억제제들은 그 전체가 본원에 참조로서 통합되는 미국 특허 번호 8,163,551호 및 미국 특허 공개 번호 20150238509호에 개시된 것들을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예들에서, 푸코실화 억제제는 아래에서 확인되는 화학식 I 또는 II의 푸코스 유사체이다.
일부 구현예들에서, 푸코스 유사체는 다음의 화학식 (I) 또는 (II):
Figure pct00003
또는 이의 생물학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 가지며; 여기서 화학식 (I) 또는 (II) 각각은 알파 또는 베타 아노머 또는 상응하는 알도오스 형태일 수 있으며; 각각의 R1, R2, R2a, R3, R3a 및 R4 는 독립적으로 OH, 가수분해성 에스테르 그룹, 가수분해성 에테르 그룹 및 작은 전자 끄는 그룹으로부터 선택되고; R5는 치환되지 않거나 할로겐으로 치환된 -CH3, -CHX2, -CH2X, -CH(X')-C1-C4 알킬, 치환되지 않거나 할로겐으로 치환된 -CH(X')-C2-C4 알켄,　치환되지 않거나 할로겐으로 치환된 -CH(X')-C2-C4 알킨, 치환되지 않거나 할로겐으로 치환된 -CH=C(R10)(R11),　 -C(CH3)=C(R12)(R13),　 -C(R14)=C=C(R15)(R16),　-C3 카보사이클, 치환되지 않거나 메틸 또는 할로겐으로 치환된 -CH(X')-C3 카보사이클,　치환되지 않거나 메틸 또는 할로겐으로 치환된 C3 헤테로사이클,　치환되지 않거나 메틸 또는 할로겐으로 치환된 -CH(X')-C3 헤테로사이틀, -CH2N3, -CH2CH2N3, 및 벤질옥시메틸로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 구성원이거나, 또는 R5 는 작은 전자 끄는 그룹이고; 여기서 R10은 할로겐 또는 치환되지 않거나 할로겐으로 치환된 C1-C3알킬이고; R11은 치환되지 않거나 할로겐으로 치환된 C1-C3 알킬이고 R12는 수소, 할로겐 또는 치환되지 않거나 할로겐으로 치환된 C1-C3 알킬이고; R13은 수소 또는 치환되지 않거나 할로겐으로 치환된 C1-C3 알킬이고; R14는 수소 또는 메틸이고; R15 및 R16은 수소, 메틸 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택되고; X는 할로겐이고; X'는 할로겐 또는 수소이고; 추가적으로, 각각의 R1, R2, R2a, R3 및 R3a은 선택적으로 수소이고; 선택적으로 인접한 탄소 원자들 상의 두 R1, R2, R2a, R3 및 R3a는 조합되어 상기 인접한 탄소 원자들 사이에 이중 결합을 형성하고; 단 R1, R2, R2a, R3, R3a, R4 및 R5 중 적어도 하나는 작은 전자 끌기 그룹이거나, R5는 할로겐, 불포화 부위, 카보사이클, 헤테로사이클 또는 아지드를 포함한다.
일부 선택된 구현예들에서, 푸코스 유사체는 다음의 화학식:
Figure pct00004
또는 이의 알도스 형태를 갖고, 여기서 각각의 R1, R3, 및 R4은 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르 그룹이다. 일부 구현예들에서, 상기 가수분해성 에스테르 그룹은 -OC(O)C1-C10알킬이다. 일부 선택된 구현예들에서, 가수분해성 에스테르 그룹은 -OC(O)CH3이다. 일부 구현예들에서, 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)C1-C10 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예들에서, 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)CH3으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예들에서, 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH 이다. 일부 선택된 구현예들에서, 푸코스 유사체는 2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스이다.
항체들 및 항체 유도체들
본 방법들에 의해 생성될 수 있는 항체들은 단일클론, 키메라, 인간화(베니어 포함) 또는 인간 항체들일 수 있다. 적합한 항체들은 또한 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬을 갖는 Fc 영역 또는 도메인(예를 들어, 인간 IgG1 Fc 영역 또는 도메인)을 갖는 단일 사슬 항체 등과 같은 항체 단편들을 포함한다. Fc 영역 또는 도메인은 Fc감마 수용체 결합 부위를 포함할 수 있다. 통상적으로 상기 항체들은 인간 또는 인간화된 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체들은 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타 말 또는 닭일 수 있다.
상기 항체들은 단일-특이적, 이중-특이적, 삼중-특이적, 또는 보다 많은 다중-특이적일 수 있다. 다중-특이적 항체들은 상이한 표적 항원들의 상이한 에피토프들에 대해 특이적일 수 있거나 동일한 표적 항원 상의 상이한 에피토프들에 특이적일 수 있다(예를 들어, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; U.S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 및 5,601,819; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553.을 참조).
상기항체들은 또한 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M의 표적 항원에 대한 결합 친화성의 측면에서 설명될 수 있다.
일부 구현예들에서, 상기 항체는 키메라 항체이다. 키메라 항체는 뮤린 단일클론 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체와 같이 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자이다. 키메라 항체들를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Morrison, Science, 1985, 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816,397 참조).
일부 구현예들에서, 상기 항체는 베니어(vneered) 항체를 포함하는 인간화 항체일 수 있다. 인간화 항체들은 원하는 항원에 결합하고 비인간 종의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR), 및 인간 면역글로불린 분자의 프레임워크 및 불변 영역들을 갖는 항체 분자들이다. 종종, 인간 프레임워크 영역들의 프레임워크 잔기들은항원 결합을 변경하거나, 바람직하게는 개선하기 위해 CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 대체될 것이다. 이 프레임워크 치환기들은, 예를 들어, 항원 프레임워크 잔기들을 확인하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기들의 상호 작용들을 모델링하고 특정 위치들에서 비정상적인 프레임워크 잔기들을 확인하기 위한 서열 비교에 의한 당업계에 잘 알려진 방법들에 의해 확인된다(예를 들어, Queen et al., 미국 특허 번호. 5,585,089; Riecbmann et al., 1988, Nature 332:323. 참조). 항체들은 CDR-그래프팅(EP 0 239 400; WO 91/09967; 미국 특버 번호. 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 베니어링(veneering) 또는 리서피싱(resurfacing) (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973), 및 사슬 셔플링(미국 특허 번호. 5,565,332)과 같은 당업계에 알려진 다양한 기술들 사용하여 인간화될 수 있다(이러한 모든 참고 문헌들은 본원에 참조로 통합됨).
상기 항체는 또한 인간 항체일 수 있다. 인간 항체들은 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법들과 같은 당업계에 알려진 다양한 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호. 4,444,887 및 4,716,111; WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741을 참조한다. 또한, 선택된 에피토프를 인식하는 인간 항체는 선택된 비인간 단일클론 항체, 예를 들어, 마우스 항체가 사용되어 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 안내하는 "안내된 선택"이라고 지칭되는 기술을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903를 참조). 인간 항체들은 또한 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 유전자이식 마우스들을 사용하여 생산될 수 있다. 단일클론 항체들은 기존의 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 유전자이식 마우스들로부터 수득될 수 있다. 인간 항체들을 생산하기 위한 기술의 개요 Lonberg and Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93을 참조한다. 인간 항체들 및 인간 단일클론 항체들을 생산하기 위한 이 기술 및 이러한 항체들을 생산하기 위한 프로토콜에 대한 자세한 논의는, 예를 들어, PCT 공보 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 유럽 특허 번호. 0 598, 877; 미국 특허 번호. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; 및 5,939,598을 참조한다.
항체들의 예들은 HERCEPTIN® (트라스투주맙(trastuzumab); Genentech), RITUXAN® (리툭시맙(rituximab); Genentech), 린투주맙(lintuzumab) (Seattle Genetics, Inc.), 팔리비주맙(Palivizumab) (Medimmune), 알렘주투맙(Alemtuzumab) (BTG) 및 에프라투주맙(Epratuzumab) (Immunomedics)을 포함한다.
예시적인 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체는 CD19, CD20, CD21, CD22, CD30, CD33, CD38, CD40, CD70, CD133, CD138, 또는 CD276에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예들에서, 항체 또는 항체 유도체들은 BMPR1B, LAT1 (SLC7A5), STEAP1, MUC16, 거핵세포 상승 인자 (MPF), Napi3b, Sema 5b, PSCA hlg, ETBR (엔도텔린 타입 B 수용체), STEAP2, TrpM4, CRIPTO, CD21, CD79a, CD79b, FcRH2, HER2, HER3, HER4, NCA, MDP, IL20Rα, Brevican, Ephb2R, ASLG659, PSCA, PSMA, GEDA, BAFF-R, CXCR5, HLA-DOB, P2X5, CD72, LY64, FCRH1, 또는 IRTA2에 특이적으로 결합한다.
항체들은, 예를 들어, 웨스턴 블롯, 방사면역분석, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 면역방사 분석, 형광 면역분석, 및 단백질 A 면역분석과 같은 기술들을 사용하는 경쟁 및 비경쟁 면역분석 시스템과 같은 통상적인 방법들에 의해 표적 항원에 대한 특이적 결합에 대해 분석될 수 있다(예를 들어, Ausubel et al., eds., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., New York, 4th ed. 1999); Harlow & Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999. 참조).
추가로, 표적 항원에 대한 항체의 결합 친화도 및 항체-항원 상호작용의 오프-율(off-rate)는 표지된 항체들 사용하는 경쟁 FACS 또는 다른 경쟁 결합 분석에 의해 결정될 수 있다. 경쟁 결합 분석의 한 예는 증가하는 양의 비표지된 항체의 존재 하에 관심 항체와 함께 표지된 항원(예를 들어, 3H 또는 125I)의 배양, 및 표지된 항원에 결합된 항체의 검출을 포함하는 방사면역 분석이다. 그 다음 항체의 친화도 및 결합 오프율이 Scatchard 플롯 분석에 의해 데이터로부터 결정될 수 있다. 제2 항체와의 경쟁은 또한 방사면역 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 이 경우, 항원은 증가하는 양의 표지되지 않은 제2 항체의 존재 하에 표지된 화합물(예를 들어, 3H 또는 125I)에 접합된 관심 항체와 함께 배양된다. 대안적으로, 항체의 결합 친화도 및 항체-항원 상호작용의 온- 및 오프-율은 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 수 있다.
항체들은 항체의 유형에 따라 표준절차에 의해 표적 항원의 항원-함유 단편들로부터 제조될 수 있다(예를 들어, Kohler, et al., Nature, 256:495, (1975); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (C.S.H.P., NY, 1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) 및 WO 90/07861; Dower et al., WO 91/17271 및 McCafferty et al., WO 92/01047을 참조 (이들 각각은 모든 목적을 위해 참조로 통합됨)). 한 예로서, 단일클론 항체들은 예들 들어 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술들 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 기술들을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 기술들은 일반적으로, 예를 들어, Harlow et al., supra, and Hammerling, et al., In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)에서 논의된다. 항체 제조에 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법들의 예들은, 예를 들어, Briinnan et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; PCT 출원번호 PCT/GB91/01 134; PCT 공보 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 번호. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108 (이 개시들은 본원에 참조로 통합됨)에 개시된 것들이다.
단일 사슬 Fv들 및 항체들을 생산하는데 사용될 수 있는 기술들의 예들은 미국 특허 번호. 4,946,778 및 5,258,498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999; 및 Skerra et al., 1988, Science 240:1038-1040에 설명된 것들을 포함한다.
항체 유도체들의 예들은 결합 도메인-Ig 융합들을 포함하며, 여기서 결합 도메인은, 예를 들어, 리간드, 수용체의 세포외 도메인, 펩타이드, 비천연 발생 펩타이드 등일 수있다. 면역글로불린 또는 Fc 영역들과의 예시적인 융합들은 다음을 포함한다: sTNFRII 과 Fc 영역의 융합 단백질인 에타너셉트 (미국 특허 번호. 5,605,690), Fc 영역을 갖는 항원 제시 세포에서 발현되는 LFA-3의 융합 단백질인 알레파셉트 (미국 특허 번호. 5,914,111), 세포독성 T 림프구-관련 항원-4(CTLA-4)와 Fc 영역의 융합 단백질 (J. Exp. Med. 181:1869 (1995)), 인터루킨 15와 Fc 영역의 융합 단백질 (J. Immunol. 160:5742 (1998)), 제VII인자와 Fc 영역의 융합 단백질 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:12180 (2001)), 인터루킨 10과 Fc 영역의 융합 단백질 (J. Immunol. 154:5590 (1995)), 인터루킨 2와 Fc 영역의 융합 단백질 (J. Immunol. 146:915 (1991)), CD40과 Fc 영역의 융합 단백질 (Surgery 132:149 (2002)), Flt-3 (fms-유사 티로신 키나제)와 항체 Fc 영역의 융합 단백질 (Acta. Haemato. 95:218 (1996)), OX40 와 항체 Fc 영역의 융합 단백질 (J. Leu. Biol. 72:522 (2002)), 및 다른 CD 분자들과의 융합 단백질 (예를 들어, CD2, CD30 (TNFRSF8), CD95 (Fas), CD106 (VCAM-I), CD137), 접착 분자들(예를 들어, ALCAM (활성화된 백혈구 세포 접착 분자), 카데린, ICAM (세포간 접착 분자)-1, ICAM-2, ICAM-3) 사이토카인 수용체 (예를 들어, 인터루킨-4R, 인터루킨-5R, 인터루킨-6R, 인터루킨-9R, 인터루킨-10R, 인터루킨-12R, 인터루킨-13Ralpha1, 인터루킨-13Ralpha2, 인터루킨-15R, 인터루킨-21Ralpha), 케모카인, 세포 사멸 유도 신호 분자들 (예를 들어, B7-H1, DR6 (사멸 수용체 6), PD-1 (예정된 사멸- 1), TRAIL R1), 공동자극 분자들 (예를 들어, B7-1, B7-2, B7-H2, ICOS (유도성 공동자극자)), 성장 인자 (예를 들어, ErbB2, ErbB3, ErbB4, HGFR), 분화 유도 인자 (예를 들어, B7-H3), 활성 인자 (예를 들어, NKG2D), 신호 전달 분자 (예를 들어, gpl30), BCMA, 및 TACI.
항체 및 항체 유도체의 제조 방법
본 방법들에 유용한 항체들 및 이들의 유도체들은 하이브리도마, 골수종 또는 포유동물 세포들이 발현하는 다른 항체들로부터의 재조합 발현 기술들에 의해 제조될 수 있다. 표적 항원에 결합하는 항체 또는 이의 유도체의 재조합 발현은 통상적으로 상기 항체 또는 이의 유도체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터의 구축을 포함한다. 이러한 단백질을 코딩하는 핵산이 수득되면, 단백질 분자의 생산을 위한 벡터는 당업계에 잘 알려진 기술들을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3rd ed., 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2nd ed., 1989); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 4th ed., 1999); 및 Glick & Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 2nd ed., 1998)에서 설명된 것들과 같은 표쥰 기술들이 재조합 핵산 방법들, 핵산 합성, 세포 배양, 이식유전자 통합 및 재조합 단백질 발현에 사용될 수 있다.
예를 들어, 항체의 재조합 발현을 위해, 발현 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인을 코딩할 수 있다. 발현 벡터는, 예를 들어, 항체 분자의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고(예를 들어, WO 86/05807; WO 89/01036; 및 미국 특허 번호. 5,122,464 참조), 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위한 이러한 벡터로 크로닝될 수 있다. 발현 벡터는 당업계에 공지된 기술들에 의해 숙주 세포로 전달되고, 그 다음 형질감염된 세포는 푸코실화 억제제의 존재 하에 당업계에 공지된 기술들에 의해 배양되어 항체를 생산한다. 통상적으로, 이중 사슬 항체들의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄 모두를 코딩하는 벡터가 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙수 세포에서 공발현될 수 있다.
다양한 포유류 세포들 및 세포주들은 항체 또는 이의 유도체를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유류 세포들(예를 들어, DG44, Dxb11, CHO-K, CHO-K1 및 CHO-S)이 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 인간 세포주들이 사용된다. 적합한 골수종 세포주들은 SP2/0 및 IR983F 및 인간 골수종 세포주, 예컨데 Namalwa를 포함한다. 다른 적합한 세포들은 인간 배아 신장 세포들(예를 들어, HEK293), 원숭이 신장 세포들(예를 들어, COS), 인간 상피 세포(예를 들어, HeLa), PERC6, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, BHK, 및 K6H6을 포함한다. 다른 적합한 숙주 세포들은 YB2/0 세포들을 포함한다. 다른 구현예들에서, 숙주 세포들은 YB2/0 세포들이 아니다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포들은 하이브리도마 유래이다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포들은 NS0 골수종 세포들과 생성된 융합에 의해 제조된 하이브리도마가 아니다. 다른 구현예들에서, 숙주 세포들은 하이브리도마 유래가 아니다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포들은 푸코스 전달 유전자 녹아웃을 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포들은 푸코실트랜스퍼라제(예를 들어, FUT8) 유전자 녹아웃을 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포들은 GnTII 인코딩 핵산의 녹-인을 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포들은 골지 알파 만노시다제 II 인코딩 핵산의 녹-인을 포함하지 않는다.
다양한 포유류 숙주-발현 벡터 시스템들은 항체 또는 이의 유도체를 발현시키는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스 또는 중국 햄스터 난소 EF-1α 프로모터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터와 같은 벡터와 접합에서의 중국 햄스터 난소 세포(CHO) (예를 들어, DG44, Dxb11, CHO-K1 및 CHO-S)과 같은 포유류 세포들은 항체들 및 이들의 유도체들의 생산일 위한 효과적인 발현 시스템이다(예를 들어, Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2; Allison, 미국 특허 번호. 5,888,809 참조).
상기 세포주들은 적절한 배양 배지에서 배양된다. 적합한 배양 배지는 예를 들어, 성장에 필요한 염들, 탄소 공급원(예를 들어, 당들), 질소 공급원, 아미노산들, 미량원소들, 항생제들, 선별제들 등을 함유하는 것들을 포함한다. 예를 들어, Ham's FlO (Sigma), 최소 필수 배지 (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 둘베코 수정 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM, Sigma), PowerCHOTM 세포 배양 배지 (Lonza Group Ltd.) 하이브리도마 무혈청 배지 (HSFM) (GIBCO)와 같은 상업적으로 이용가능한 배지가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 이 배지들 중 임의의 것들은 필요에 따라 호르몬들 및/또는 다른 성장 인자들(예를 들어, 인슐린, 프랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염들(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 인삼염), 완충제들(예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들어, GENTAMYCINTM), 미량원소들(일반적으로 마이크로 몰 범위에서 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨) 및 포도당 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제들은 또한 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건들은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들일 수 있으며, 당업자에게 명백할 것이다.
항체 또는 항체 유도체를 발현하는 세포들은 임의의 적합한 부피의 배양 배지에서 숙수 세포를 성장시킴으로써 배양될 수 있다. 상기 세포들은 임의의 적절한 배양 시스템에서 당업계에 알려진 임의의 방법에 따라 배양될 수 있으며, 이는 T-플라스크, 스피너 및 진탕 플라스크, WaveBag® 백, 롤러병, 생물반응기 및 교반-탱크 생물반응기를 포함한다. 부착-의존 세포(Anchorage-dependent cell)들은 또한 교반-탱크 생물반응기들에서 현탁액 상태로 유지되는 미세담체(microcarrier), 예를 들어, 폴리머 구체에서 배양될 수 있다. 대안적으로 세포들은 단일-세포 현탁액에서 성장될 수 있다. 배양 배지는, 예를 들어, 배양 배지가 단일 배치로 또는 소량의 배양 배지가 주기적으로 첨가되는 유가 배양 공정으로 세포에 한번씩 첨가되는 배치 공정으로 첨가 될 수 있다. 배지는 배양이 끝날 때 또는 배양동안 여러 번 수확될 수 있다. 연속 관류 배양 공정은 또한 당업계에 알려져 있으며, 동일한 부피가 반응기로부터 연속적으로 회수되는 동안 새로운 배지를 배양물에 연속적으로 공급하는 것을 포함한다. 관류 배양들은 일반적으로 배치 배양보다 높은 세포 밀도를 달성하고 반복 수확으로 몇 주 또는 몇 달 동안 유지될 수 있다.
배치 배양에서 성장된 세포의 경우, 배양 배지의 부피는 통상적으로 적어도 750 mL, 1 리터, 2 리터, 3 리터, 4 리터, 5 리터, 10 리터, 15 리터, 20 리터 또는 그 초과이다. 산업적 적용을 위해, 배양 배지는 적어도 100 리터, 적어도 200 리터, 적어도 250 리터, 적어도 500 리터, 적어도 750 리터, 적어도 1000 리터, 적어도 2000 리터, 적어도 5000 리터 또는 적어도 10,000 리터일 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 방법들에 의해 제조된 항체들 또는 항체 유도체들은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 비코어 푸코실화 단백질을 포함한다(예를 들어, 코어 푸코실화 부족). 일부 구현예들에서, 본 방법들에 의해 제조된 항체들 또는 항체 유도체들은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 비코어 푸코실화 항체 또는 항체 유도체를 포함한다. 일부 구현예들에서, 본 방법들에 의해 제조된 항체들 또느 항체 유도체들의 조성물은 100% 미만의 비코어 푸코실화 항체들 및/또는 항체 유도체들을 포함한다.
당 사슬의 환원 말단에서 푸코스가 N-아세틸글루코사민에 결합되지 않은 당 사슬 대 당 사슬의 환원 말단에서 푸코스가 N-아세틸클루코사민에 결합된 당 사슬의 함량(예를 들어, 비율)은 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 결정될 수 있다. 이러한 방법들은 하이드라진분해 또는 효소 소화(예를 들어, Biochemical Experimentation Methods 23: Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (Japan Scientific Societies Press), edited by Reiko Takahashi (1989) 참조), 방출된 당 사슬의 형관 표지 또는 방사성 동위원소 표지 후 크로마토그래프에 의한 표지된 당 사슬의 분리를 포함한다. 또한, 방출된 당 사슬의 조성은 HPAEC-PAD 방법(예를 들어, see, e.g., J. Liq Chromatogr. 6:1557 (1983) 참조)에 의해 사슬을 분석함으로써 결정될 수 있다(일반적으로 미국 특허출원공보 번호. 2004-0110282 참조).
일부 구현예들에서, 본 방법들에 의해 제조된 항체들 또는 항체 유도체들은 푸코실화 억제제 없이 제조된 항체들 또는 항체 유도체들 보다 높은 효과기 기능(예를 들어, ADCC 활성)을 갖는다. 상기 효과기 기능 활성은 본원에 설명된 임의의 방법들에 따라 어푸코실화의 수준을 제어함으로써 조절될 수 있다. ADCC 활성은 당업계에 알려진 분석을 사용하여 측정될 수 있으며, 예시적인 구현예들에서, 코어 푸코실화 모 항체와 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 15 배 또는 20 배 증가한다. 항원-양성 배양 세포주에 대한 세포 독성 활성은 효과기 기능을 측정함으로써 평가될 수 있다(예를 들어, Cancer Immunol. Immunother. 36:373 (1993)에 설명됨).
항체들 및 항체 유도체는 예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피는 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 또는 항체 유도체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 따라 다르다. 단백질 A는 인간 IgG1, 2 또는 4 중쇄를 기반으로 하는 항체들 또는 항체 유도체들을 정제하는데 사용될 수 있다.
단백질 G는 마우스 이소타입들 및 일부 인간 항체들 및 항체 유도체들을 위해 사용될 수 있다. 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 대부분 아가로스이지만 다른 매트릭스들을 사용할 수 있다. 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정된 매트릭스들은 아가로스로 얻을 수 있는 것보다 빠른 유속 및 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체 또는 항체 유도체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABXTM수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)는 정제에 유용하다. 이온교환 컬럼(양이온 또는 음이온 교환)에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSETM 에서의 크로마토그래피 음이완 또는 양이온 교환 수지(예를 들어, 폴리아스파틱산 컬럼)에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산 암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술들은 또한 회수될 상체 또는 항체 유도체들에 따라 사용할 수 있다.
임의의 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 또는 항체 유도체 및 오염물들을 포함하는 혼합물이 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래프에 적용될 수 있다(예를 들어, 약 2.5-4.5 사이의 pH에서 용출 버퍼를 사용하고, 바람직하게는 낮은 염 농도(예를 들어 약 0-0.25M 염)에서 수행됨).
항체들 및 항체 유도체들의 용도
본 방법들에 따라 제조된 항체들 및 항체 유도체들은 다양한 치료 및 비치료적 적용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체들은 치료적 항체들로서 사용될 수 있다. 항체 유도체들(예를 들어, 수용체-Fc 융합)은 치료적 분자로서 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 또는 항체 유도체는 다른 분자에 접합되지 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 적합한 약물(예를 들어, 항체 약물 접합체) 또는 다른 활성제와 접합된다. 상기 항체들 및 항체 유도체들은 또한 진단 분석, 예후 분석, 방출 분석 등과 같은 비치료적 목적으로 사용될 수 있다.
약학 조성물
본 방법들에 따라 제조된 항체들 및 항체 유도체들은 치료 및 비치료적 적용을 위해 제형화될 수 있다. 상기 항체들 및 유도체들은 치료적 또는 예방적 유효량의 항체 또는 유도체 및 하나 이상의 약학적으로 호환되는(허용되는) 성분들을 포함하는 약학 조성물로서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 약학 또는 비약학 조성물은 통상적으로 하나 이상의 담체(예를 들어, 물 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것들, 예컨데 땅콩 오일, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등을 포함하는 오일과 같은 멸균 액체)를 포함한다. 약학 조성물이 정맥내로 투여될 때 물은 보다 통상적인 담체이다. 또한 식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은, 액체 담체, 특히 주사 용액용으로서 사용될 수 있다. 적합한 부형제들은, 예를 들어, 아미노산, 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크(chalk), 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐 클로라이드, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 상기 조성물은 원한다면 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 유제, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방형 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 적합한 약학 담체들의 예들은 E.W. Martin의 “Remington's Pharmaceutical Sciences" 에 설명되어 있다. 이러한 조성물들은 통상적으로 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 담체와 함께 통상적으로 정제된 형태의 치료적 유효량의 단백질을 함유할 것이다. 상기 제형들은 투여 방식에 해당된다.
통상적으로, 정맥내 투여용 조성물들은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액들이다. 필요한 경우, 약제는 또한 가용화제 및 주사 부위의 통증을 완화하기 위한 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들은 개별적으로 또는 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 봉지와 같은 밀폐 용기에 동결건조 분말 또는 물이 없는 농축물로서 단위 투여 형태와 함께 혼합되어 공급된다. 약제가 주입에 의해 투여되는 경우, 그것은 멸균 의약 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병과 함께 분배될 수 있다. 약제가 주사로 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수 앰플이 제공되어 투여전 상기 성분들이 혼합될 수 있다.
본 발명은 다음의 실시예들에서 추가로 설명되며, 이는 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 2FF 농도 및 ICA에 대한 mAb% 어푸코실화의 의존성
산업 관련 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주들이 이 연구에서 사용되었다. 상기 세포주은 디하이드로폴레이트 마이너스(dhfr-) CHO 숙주 (Urlaub G, Chasin LA, Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity activity. Proc Natl Acad Sci USA 77:4216-4220, 1980)로부터 유래되었다. 세포들은 산업-표준 독점적인 화학적으로 정의된 기본 배지를 사용하여 진탕 플라스크에서 배양 및 유지되었다. 진탕 플라스크 배양 조건은 스케일 업 및 배양의 종료까지 37℃, 5% CO2였다. 산업-표준 독점 기본 및 공급 배지는 세포 배양을 위해 사용되었다. 다양한 공급 부피들이 배양에 추가되었다. 글루코스 농도는 배양 내내 유지되었다.
2-플루오로푸코스 (2FF)가 세포 배양 과정의 시작 시에 10-100 mM 스톡 용액으로부터의 세포 배양 배지에 첨가되었다. 0 내지 100 μM 범위의 여러 농도들이 상이한 항체 서열들을 생성하는 여러 세포주들에 대해 시험되었다. 세포 배양 과정을 모니터링하고 자동화된 세포 계수기를 사용하여 생존 세포 밀도(VCD)를 측정하기 위해 전체 배양 기간 동안 매일 1 ml의 샘플들이 채취되었다. 도 1a는 시험된 예시적인 세포주에 대핸 대표적인 성장 곡선을 나타낸다. 배양 종료 시, 세포 배양액이 채취되고, 원심분리되고, 단백질-A 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제되었다. 비율로서 mAb에서 % 어푸코실화된 종을 정량하기 위해 글리코실화가 HILIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) 분석을 사용하여 단백질-A 정제된 샘플에서 측정되었다.
2FF 농도 및 세포 밀도를 사용한 조정
2FF의 소비 비율(적분 세포 영역(ICA)에 대한 2FF 농도의 비율, 생존 세포 밀도 곡선 아래의 영역)은 시험되는 농도의 범위로 추정되었다. % 어푸코실화는 [2FF 농도]/ICA에 대해 플로팅되어 여러 세포주에 대한 어푸코실화의 단일 포화 곡선을 생성하였다(도 1b 참조). 이 곡선은 여러 세포주들에 걸친 어푸코실화의 예측을 통합한다. 이 곡선은 방정식의 상수를 결정하기 위한 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 동역학 방정식에 적합했다.
도 1b에 나타난 것과 같이, 추가 2FF가 어푸코실화를 증가시키지 않는 포화 한계가 관찰되었다. 이 경험적 모델은 ICA가 알려져 있고 여러 CHO 세포주들에 걸쳐 관계를 통합하는 경우 특정 세포주에 대한 어푸코실화의 추정을 가능하게 한다. 또한, 상기 모델은 완전 또는 부분 포화를 달성하기 위해 어푸코실화를 조정하는 도구를 제공한다.
실시예 2: 포화 2FF 첨가 시간에 대한 mAb % 어푸코실화 및 포화 2FF 첨가 시간에서의 항체 역가의 의존성
산업-관련 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주들이 이 연구에 사용되었다. 상기 세포주은 디하이드로폴레이트 마이너스(dhfr-) CHO 숙주 (Urlaub G, Chasin LA, Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity activity. Proc Natl Acad Sci USA 77:4216-4220, 1980)로부터 유래되었다. 세포들은 산업-표준 독점적인 화학적으로 정의된 기본 배지를 사용하여 진탕 플라스크에서 배양 및 유지되었다. 진탕 플라스크 배양 조건은 스케일 업 및 배양의 종료까지 37℃, 5% CO2였다. 산업-표준 독점 기본 및 공급 배지를 사용하여 세포를 배양하였고 다양한 공급 부피들이 배양에 첨가되었다. 글루코스 농도는 배양 내내 유지되었다.
2FF 첨가 시간을 사용한 조정
어푸코실화에 대한 푸코실화 억제제 2FF의 첨가 시기의 효과는 상이한 항체들을 생산하는 두 산업 관련 CHO 세포주들(세포주 A 및 세포주 B)를 사용하여 시험되었다. 도 2a에 나타난 것과 같이, 상기 두 세포주들에 대한 항체 생산 곡선은 상이한 동역학을 갖는다. 2FF는 100 mM 스톡의 세포 배양 배지에 첨가되어 100 μM의 최종 농도에 도달했다. 첨가는 배양 공정의 0 일 또는 2일에 수행되었다. 배양 종료시 세포 배양액이 수확되고, 원심분리되고, 단백질-A 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제되었다. 샘플들이 실시예 1에 설명된 HILIC 분석을 사용하여 어푸코실화 수준에 대해 분석되었다. 3일까지 상당한 부분의 항체를 생산한 세포주 A의 경우, 3일까지 최종일 항체 역가의 상당한 부분을 생산하지 않은 세포주 3과 달리 부분적 어푸코실화가 관찰되었다(도 2b). 이 경험적 모델은 항체 생산 곡선이 알려진 경우 특정 세포주에 대한 어푸코실화의 추정을 가능하게 한다.
본 발명은 본원에 설명된 특정 구현예들에 의해 범위가 제한되지 않는다. 본원에 설명된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형들은 상술한 설명 및 첨부 도면들로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형들은 첨부된 청구항들의 범위 내에 속하도록 의도된다. 문맥상 달리 명백하지 않는 한, 본 발명의 임의의 단계, 요소, 구현예, 특징 또는 측면이 임의의 다른 것과 조합되어 사용될 수 있다. 본 출원에 언급된 모든 특허 출원 및 과학 간행물, 수탁 번호 등은 개별적으로 표시된 거소가 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체가 참조로 통합된다.

Claims (42)

  1. 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화(afucosylation)의 수준을 제어하는 방법으로서,
    상기 방법은
    (a) 숙주 세포를 미리 결정된 양의 푸코실화의 억제제(Ap)의 존재하에 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 숙주세포는 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민을 통해 Fc 도메인에 결합된 적어도 하나의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬을 갖는 Fc 도메인을 갖는 항체 또는 항체 유도체를 발현하는 것인 단계; 및
    (b) 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계를 포함하고,
    상기 Ap는 (b)의 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준이 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차를 초과하지 않는 어푸코실화의 수준을 갖도록 미리 결정된 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 유도체는 배양 완료시 분리되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 방법은 Ap를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Ap는 입력(input)으로서 복수의 상이한 푸코실화 억제제 양과 배양에서의 숙주 세포의 세포 성장 파라미터, 및 출력(output)으로서 상기 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 사용하여 생성된 예측 모델에 기초하여 결정되는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 예측 모델은 입력으로서 세포 성장 파라미터에 대해 정규화된 푸코실화 억제제 양을 사용하여 생성되는 것인, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 세포 성장 파라미터는 적분 세포 면적(ICA)인, 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 예측 모델을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 푸코실화 억제제는 푸코스 유사체인 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 푸코스 유사체는 2-플루오로푸코스(2FF), 화학식 I의 화합물 또는 화학식 II의 화합물인 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 푸코스 유사체는 2FF인 방법
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 어푸코실화의 목표 수준이
    (a) 약 100% 내지 약 90%;
    (b) 약 90% 내지 약 80%;
    (c) 약 80% 내지 약 70%;
    (d) 약 70% 내지 약 60%;
    (e) 약 60% 내지 약 50%;
    (f) 약 50% 내지 약 40%;
    (g) 약 40% 내지 약 30%;
    (h) 약 30% 내지 약 20%;
    (i) 약 20% 내지 약 10%; 또는
    (j) 약 10% 내지 약 0%인, 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 어푸코실화의 목표 수준이
    (a) 약 80% 초과;
    (b) 약 60% 초과;
    (c) 약 40% 초과;
    (d) 약 20% 초과;
    (e) 약 10% 초과; 또는
    (f) 약 5% 초과인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차가 10% 이하인 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차가 5% 이하인 방법.
  15. 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 제어하는 방법으로서,
    상기 방법은
    (a) 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는 당 사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민을 통해 Fc 도메인에 결합된 적어도 하나의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당 사슬을 갖는 Fc 도메인을 갖는 항체 또는 항체 유도체를 발현하는 것인 단계;
    (b) 배양 동안 미리 결정된 시간(Tp)에서 배양 배지에 푸코실화 억제제의 포화량을 첨가하는 단계로서, 상기 푸코실화 억제제의 포화량은 배양의 d0에 첨가될 때 적어도 약 95%의 어푸코실화를 초래하는 것인 단계; 및
    (c) 상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계를 포함하고,
    상기 Tp는 (c)의 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준이 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차를 초과하지 않는 어푸코실화의 수준을 갖도록 미리 결정된 것인, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 유도체는 배양 완료시 분리되는 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    상기 방법은 Tp를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Tp는 입력으로서 배양에서 복수의 상이한 포화 푸코실화 억제제 첨가 시간에서의 배양물에서의 항체 또는 항체 유도체의 역가, 및 출력으로서 상기 분리된 항체 또는 항체 유도체의 어푸코실화의 수준을 사용하여 생성된 예측 모델에 기초하여 결정되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 방법은 상기 예측 모델을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 푸코실화 억제제는 푸코스 유사체인 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 푸코스 유사체는 2FF, 화학식 I의 화합물 또는 화학식 II의 화합물인 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 푸코스 유사체는 2FF인 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 어푸코실화의 목표 수준은
    (a) 약 100% 내지 약 90%;
    (b) 약 90% 내지 약 80%;
    (c) 약 80% 내지 약 70%;
    (d) 약 70% 내지 약 60%;
    (e) 약 60% 내지 약 50%;
    (f) 약 50% 내지 약 40%;
    (g) 약 40% 내지 약 30%;
    (h) 약 30% 내지 약 20%;
    (i) 약 20% 내지 약 10%; 또는
    (j) 약 10% 내지 약 0%인, 방법.
  24. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 어푸코실화의 목표 수준은
    (a) 약 80% 초과;
    (b) 약 60% 초과;
    (c) 약 40% 초과;
    (d) 약 20% 초과;
    (e) 약 10% 초과; 또는
    (f) 약 5% 초과인, 방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차는 10% 이하인 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 어푸코실화의 목표 수준으로부터의 최대 편차는 5% 이하인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 재조합 숙주 세포인 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 방법.
  29. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 하이브리도마인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 유가 배양에서 성장되는 방법.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 연속 공급 배양에서 성장되는 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 배지는 적어도 100 리터의 부피를 갖는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 배양 배지는 적어도 500 리터의 부피를 갖는 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 배지는 동물성 단백질이 없는 배지인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계는 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 것을 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계는 단백질 A 컬럼을 사용하는 것을 포함하는 방법.
  37. 제35항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 유도체를 분리하는 단계는 양이온 또는 음이온 교환 컬럼 또는 소수성 상호작용 컬럼을 사용하는 것을 포함하는 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 유도체는 무손상 항체(intact antibody)인 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 무손상 항체는 IgG1 항체인 방법.
  40. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 유도체는 단일 사슬 항체인 방법.
  41. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 유도체는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 Fc 영역을 포함하는 방법.
  42. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 유도체는 항체 Fc 영역 및 비면역글로불린 단백질의 리간드 결합 도메인을 포함하는 항체 유도체인 방법.
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