CN113438951A - 抗体的受控岩藻糖基化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于制备具有受控的核心岩藻糖基化水平的抗体和抗体衍生物的方法。在一方面，本文提供了一种控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的方法。在一些实施方案中，本发明提供了一种通过本发明方法产生的抗体或抗体衍生物的组合物。所述抗体和衍生物可以被配制成药物组合物，所述药物组合物包含治疗或预防有效量的所述抗体或衍生物和一种或多种药学上可接受的成分。

Description

抗体的受控岩藻糖基化
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年12月19日提交的美国临时申请号62/781,691的优先权权益，将所述临时申请出于所有目的通过引用以其整体并入。
背景技术
重组治疗性蛋白是通过许多不同的方法产生的。一种优选的方法是从哺乳动物宿主细胞系生产重组蛋白。诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的细胞系经过工程改造以表达目的治疗性蛋白。不同的细胞系对于重组蛋白生产具有优势和劣势，包括蛋白质特征和生产力。用于商业生产的细胞系的选择通常平衡高生产力需求与提供一致的产品质量与给定产品所需的属性的能力。需要一致的高质量特征和高滴度过程的一类重要的治疗性重组蛋白是单克隆抗体。
在哺乳动物宿主细胞中产生的单克隆抗体可以具有多种翻译后修饰，包括糖基化。单克隆抗体(诸如IgG1)在每条重链(每个完整抗体有两条)的天冬酰胺297(Asn297)处具有N-连接的糖基化位点。与抗体上的Asn297附接的聚糖典型地是复合双触角结构，其具有非常低或没有两分型N-乙酰基氨基葡萄糖(两分型GlcNAc)，具有少量的末端唾液酸和不同量的半乳糖。所述聚糖通常也具有高水平的核心岩藻糖基化。已显示抗体中核心岩藻糖基化的减少会改变Fc效应子功能，特别是Fcγ受体结合和ADCC活性。这一观察结果引起了工程改造细胞系的兴趣，因此它们产生了核心岩藻糖基化减少的抗体。
用于工程改造细胞系以减少核心岩藻糖基化的方法包括基因敲除、基因敲入和RNA干扰(RNAi)。在基因敲除中，将编码FUT8(α1,6-岩藻糖基转移酶)的基因失活。FUT8催化岩藻糖残基从GDP-岩藻糖转移到N-聚糖的Asn-连接的(N-连接的)GlcNac的6位。据报道，FUT8是唯一负责在Asn297处将岩藻糖添加到N-连接的双触角碳水化合物的酶。基因敲入添加编码酶(诸如GNTIII或高尔基体α甘露糖苷酶II)的基因。细胞中此类酶水平的增加使单克隆抗体从岩藻糖基化通路转移(导致核心岩藻糖基化减少)，并且两分型N-乙酰基氨基葡糖的量增加。RNAi典型地还针对FUT8基因表达，导致降低mRNA转录水平或完全敲除基因表达。工程改造细胞系的替代方案包括使用作用于糖基化通路中的酶的小分子抑制剂。
在一些应用中，可能希望使用核心岩藻糖基化抗体和核心去岩藻糖基化抗体或抗体衍生物的混合群体。因此，需要改善的用于预测将导致所希望的核心去岩藻糖基化水平的培养参数的方法。
发明内容
本发明提供了用于制备具有受控的核心去岩藻糖基化水平的抗体和抗体衍生物的方法。所述方法部分以实施例中呈现的出乎意料的结果为前提，所述结果显示可以使用与对应的培养参数(例如，细胞面积或抗体滴度的积分)配对的与岩藻糖基化抑制剂有关的参数(例如，岩藻糖基化抑制剂量或岩藻糖基化抑制剂添加时间)作为预测模型的输入生成在给定岩藻糖基化抑制剂(例如，2-氟岩藻糖)的情况下抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的准确预测模型。
在一方面，本文提供了一种控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的方法，其包括：(a)在预定量的岩藻糖基化抑制剂(Ap)的存在下在培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞表达具有Fc结构域的抗体或抗体衍生物，所述Fc结构域具有至少一个复合N-糖苷连接的糖链，所述至少一个复合N-糖苷连接的糖链通过所述糖链的还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖与所述Fc结构域结合；以及(b)分离所述抗体或抗体衍生物，其中Ap是预先确定的，使得(b)的分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平具有不超过相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差的去岩藻糖基化水平。在一些实施方案中，在培养完成后分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定Ap。在一些实施方案中，
在一些实施方案中，根据使用上述Ap控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，基于预测模型来确定Ap，所述预测模型是使用多种不同的岩藻糖基化抑制剂量和在所述培养中所述宿主细胞的细胞生长参数作为输入以及所述分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平作为输出生成的。在一些实施方案中，所述预测模型是使用归一化至所述细胞生长参数的岩藻糖基化抑制剂量作为输入生成的。在一些实施方案中，所述细胞生长参数是积分细胞面积(ICA)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括包括生成预测模型。
在另一方面，本文提供了一种控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的方法，其包括：(a)在培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞表达具有Fc结构域的抗体或抗体衍生物，所述Fc结构域具有至少一个复合N-糖苷连接的糖链，所述至少一个复合N-糖苷连接的糖链通过所述糖链的还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖与所述Fc结构域结合；(b)在所述培养期间在预定时间(Tp)将饱和量的岩藻糖基化抑制剂添加到所述培养基中，其中所述饱和量的所述岩藻糖基化抑制剂当在所述培养的d0时添加时导致至少约95％的去岩藻糖基化；以及(c)分离所述抗体或抗体衍生物，其中Tp是预先确定的，使得(b)的分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平具有不超过相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差的去岩藻糖基化水平。在一些实施方案中，在培养完成后分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定Tp。
在一些实施方案中，根据使用上述Tp控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，基于预测模型来确定Tp，所述预测模型是使用在所述培养中的多种不同饱和岩藻糖基化抑制剂添加时间在所述培养中所述抗体或抗体衍生物的滴度作为输入以及所述分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平作为输出生成的。在一些实施方案中，所述方法进一步包括生成预测模型。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述岩藻糖基化抑制剂是岩藻糖类似物。在一些实施方案中，所述岩藻糖类似物是2-氟岩藻糖(2FF)、式I的化合物、或式II的化合物。在一些实施方案中，所述岩藻糖类似物是2FF。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，目标去岩藻糖基化水平是：(a)约100％至约90％；(b)约90％至约80％；(c)约80％至约70％；(d)约70％至约60％；(e)约60％至约50％；(f)约50％至约40％；(g)约40％至约30％；(h)约30％至约20％；(i)约20％至约10％；或(j)约10％至约0％。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，目标去岩藻糖基化水平是：(a)大于约80％；(b)大于约60％；(c)大于约40％；(d)大于约20％；(e)大于约10％；或(f)大于约5％。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差不大于10％。在一些实施方案中，相对于所述目标去岩藻糖基化水平的最大偏差不大于5％。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述宿主细胞是重组宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述宿主细胞是杂交瘤。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，在加料分批培养物中生长所述宿主细胞。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，在连续加料培养物中生长所述宿主细胞。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述培养基具有至少100升的体积。在一些实施方案中，所述培养基具有至少500升的体积。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述培养基是无动物蛋白培养基。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述抗体或抗体衍生物的分离包括从所述细胞和/或所述培养基分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，所述抗体或抗体衍生物的分离包括使用蛋白A柱。在一些实施方案中，所述抗体或抗体衍生物的分离包括使用阳离子或阴离子交换柱或疏水相互作用柱。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述抗体或抗体衍生物是完整抗体。在一些实施方案中，所述完整抗体是IgG1抗体。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述抗体或抗体衍生物是单链抗体。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述抗体或抗体衍生物包含重链可变区、轻链可变区、和Fc区。
在一些实施方案中，根据控制上述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述抗体或抗体衍生物是包含抗体Fc区和非免疫球蛋白蛋白质的配体结合结构域的抗体衍生物。
通过参考以下具体实施方式、特定实施方案的非限制性实施例、以及附图，可以更全面地理解本发明的这些和其他方面。
附图说明
图1A示出了活细胞密度(VCD)曲线，其示出了用不同浓度的2-氟岩藻糖(2FF)处理的细胞系的生长。
图1B示出了去岩藻糖基化％随[2FF浓度]/ICA的变化的饱和模型，其组合了具有不同生长特征的多种CHO细胞系。
图2A示出了以延迟的时间表用2FF处理的两种不同细胞系的平均滴度。
图2B示出了对于细胞系A，对照、第0天(d0)添加和第3天(d3)添加2FF(所有天数均从生产开始计数)的去岩藻糖基化的比较。
图2C示出了对于细胞系B，对照、第0天(d0)添加和第3天(d3)添加2FF(所有天数均从生产开始计数)的去岩藻糖基化的比较。
具体实施方式
定义
术语“抗体”是指(a)免疫球蛋白多肽和免疫球蛋白多肽的免疫活性部分，即免疫球蛋白家族的多肽或其片段，其含有与特定抗原(例如，CD70)免疫特异性结合的抗原结合位点和包含一个或多个复合N-糖苷连接的糖链的Fc结构域，或(b)与抗原(例如，CD70)免疫特异性结合的此类免疫球蛋白多肽或片段的保守取代衍生物。抗体通常描述在例如Harlow&Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1988)中。除非从上下文中另外显而易见，否则对抗体的提及还包括如下文更详细描述的抗体衍生物。
“抗体衍生物”意指如上定义的抗体(包括抗体片段)或包含复合N-糖苷连接的糖链的抗体的Fc结构域或区，所述Fc结构域或区是通过共价附接异源分子，例如像通过附接异源多肽(例如，异源蛋白的配体结合结构域)，或者通过糖基化(核心岩藻糖基化除外)、去糖基化(非核心岩藻糖基化除外)、乙酰化、磷酸化或通常与抗体或Fc结构域或区不相关的其他修饰进行修饰的。
术语“单克隆抗体”是指源自单一细胞克隆(包括任何真核或原核细胞克隆、或噬菌体克隆)的抗体，而不是产生它的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。
术语“Fc区”是指抗体的恒定区，例如CH1-铰链-CH2-CH3结构域，任选地具有CH4结构域，或此类Fc区的保守取代衍生物。
术语“Fc结构域”是指抗体的恒定区结构域，例如CH1、铰链、CH2、CH3或CH4结构域，或此类Fc结构域的保守取代衍生物。
“抗原”是抗体特异性结合的分子。
术语“特异性结合”和“特异性地结合”意指抗体或抗体衍生物将以高度选择性的方式与其对应的靶抗原结合，而不与大量的其他抗原结合。典型地，抗体或抗体衍生物以至少约1x10-7M并且优选10-8M至10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的亲和力结合，并且以其与除预定抗原或密切相关的抗原外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力的至少两倍的亲和力与预定抗原结合。
术语“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibition of)”意指减少可测量的量或完全防止。
术语“积分细胞面积”或“ICA”表示如图1A中所示给定细胞系的活细胞密度(VCD)曲线下的面积并且可以例如通过积分VCD曲线来计算。
术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的用于在动物体内、更特别地在人体内使用。术语“药学上相容的成分”是指与抗体或抗体衍生物一起施用的药学上可接受的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。
术语“生物学上可接受的”意指适用于培养细胞系以制造抗体。示例性的生物学上可接受的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲基磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1,1’-亚甲基双-(2羟基3-萘甲酸))盐。生物学上可接受的盐可以涉及包含另一种分子，例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子。抗衡离子可以是使母体化合物上的电荷稳定的任何有机或无机部分。此外，生物学上可接受的盐在其结构中可以具有多于一个带电荷的原子。在多个带电荷原子是生物学上可接受的盐的一部分的情况下，可以有多个抗衡离子。因此，生物学盐可以具有一个或多个带电荷原子和/或一个或多个抗衡离子。
本发明的治疗剂典型地是基本上纯的，不含不希望的污染物。这意指药剂典型地具有至少约50％w/w(重量/重量)的纯度，并且基本上不含干扰性蛋白质和污染物。有时，药剂具有至少约80％w/w并且更优选至少90％或约95％w/w的纯度。使用常规的蛋白质纯化技术，可以获得至少99％w/w的同质肽。
如本文所用，除非上下文另外指示，“炔基岩藻糖过乙酸酯”是指在位置R1-4上具有乙酸酯基团的任何或所有形式的炔基岩藻糖(5-乙炔基阿拉伯糖)(参见下文式I和II)，包括四乙酸6-乙炔基-四氢-2H-吡喃-2,3,4,5-四酯(包括(2S,3S,4R,5R,6S)和(2R,3S,4R,5R,6S)异构体)和四乙酸5-((S)-1-羟基丙-2-炔基)-四氢呋喃-2,3,4-三酯(包括(2S,3S,4R,5R)和(2R,3S,4R,5R)异构体)以及醛糖形式。术语“炔基岩藻糖三乙酸酯”、“炔基岩藻糖二乙酸酯”和“炔基岩藻糖单乙酸酯”分别是指炔基岩藻糖的所指示的三乙酸酯、二乙酸酯和单乙酸酯形式。
除非上下文另有指示，否则术语“烷基”是指经取代或未经取代的饱和直链或支链烃，其具有从1至20个碳原子(以及其中碳原子的范围和特定数量的所有组合和亚组合)，其中从1至3、1至8或1至10个碳原子是优选的。烷基的例子是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基和3,3-二甲基-2-丁基。
无论是单独的还是作为另一个基团的一部分，烷基可以任选地被一个或多个基团、优选1至3个基团(以及选自卤素的任何另外的取代基)取代，所述基团包括但不限于：卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、＝O、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或芳基。在一些实施方案中，-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基、和R’基团可以被进一步取代。此类进一步的取代基包括例如-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2和-CN，其中每个R”独立地选自H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或芳基，其中所述进一步的取代基优选是未经取代的。在一些实施方案中，-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基、和R’基团可以是未经进一步取代的。
除非上下文另外指示，否则术语“烯基”和“炔基”是指经取代或未经取代的直链和支链碳链，其具有从2至20个碳原子(以及其中碳原子的范围和特定数量的所有组合和亚组合)，其中从2至3、2至4、2至8或2至10个碳原子是优选的。烯基链在链中具有至少一个双键，并且炔基链在链中具有至少一个三键。烯基的例子包括但不限于亚乙基或乙烯基、烯丙基、-1丁烯基、-2丁烯基、-异丁烯基、-1戊烯基、-2戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、-2甲基2丁烯基和-2,3二甲基2丁烯基。炔基的例子包括但不限于炔属的(acetylenic)、炔丙基、乙炔基、丙炔基、-1丁炔基、-2丁炔基、-1戊炔基、-2戊炔基和-3甲基1丁炔基。
无论是单独的还是作为另一基团的一部分，烯基和炔基可以任选地被一个或多个基团、优选1至3个基团(以及选自卤素的任何另外的取代基)取代，所述基团包括但不限于：卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、＝O、-NH2、-NH(R')、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立地选自H、-C1-C8烷基、-C2-C烯基、-C2-C8炔基、或芳基。在一些实施方案中，-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基、和R’基团可以被进一步取代。此类进一步的取代基包括例如-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2和-CN，其中每个R”独立地选自H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或芳基，其中所述进一步的取代基优选是未经取代的。在一些实施方案中，-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、和R’基团可以是未经进一步取代的。
除非上下文另外指示，否则术语“亚烷基”是指经取代或未经取代的饱和支链或直链烃基，其具有从1至20个碳原子(以及其中的碳原子的范围和特定数目的所有组合和子组合)，其中从1至8或1至10个碳原子是优选的，并且具有通过从母体烷烃的同一个或两个不同碳原子上去除两个氢原子而衍生的两个单价基团中心。典型的亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、1,4-亚环己基等。
无论是单独的还是作为另一个基团的一部分，亚烯基可以任选地被一个或多个基团、优选1至3个基团(以及选自卤素的任何另外的取代基)取代，所述基团包括但不限于：卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、＝O、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立地选自H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基。在一些实施方案中，-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基、和R’基团可以被进一步取代。此类进一步的取代基包括例如C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2和-CN，其中每个R”独立地选自H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或芳基，其中所述进一步的取代基优选是未经取代的。在一些实施方案中，-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、和R’基团可以是未经进一步取代的。
除非上下文另外指示，否则术语“芳基”是指通过从母体芳族环体系的单个碳原子中去除一个氢原子而衍生的6-20个碳原子(以及其中的碳原子的范围和特定数目的所有组合和子组合)的经取代的或未经取代的单价芳族烃基团。一些芳基在示例性结构中表示为“Ar”。典型的芳基包括但不限于衍生自苯、经取代的苯、苯基、萘、蒽、联苯等基团。
无论是单独的还是作为另一个基团的一部分，芳基可以任选地被一个或多个基团、优选1至5个基团、或甚至1至2个基团取代，所述基团包括但不限于：卤素、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-NO2、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立地选自H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或芳基。在一些实施方案中，C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基和R’基团可以被进一步取代。此类进一步的取代基包括例如-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2和-CN，其中每个R”独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或芳基，其中所述进一步的取代基优选是未经取代的。在一些实施方案中，-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基和R’基团可以是未经进一步取代的。
除非上下文另外指示，否则术语“杂环”是指具有3至7或3至10个环原子(也称为环成员)(以及其中的碳原子和杂原子的范围和特定数目的所有组合和子组合)的经取代的或未经取代的单环的环体系，其中至少一个环原子是选自N、O、P或S的杂原子。杂环可以具有1至4个独立地选自N、O、P或S的环杂原子。杂环中的一个或多个N、C或S原子可以被氧化。单环的杂环优选具有3至7个环成员(例如，2至6个碳原子和1至3个独立地选自N、O、P或S的杂原子)。包含杂原子的环可以是芳族的或非芳族的。除非另外指出，否则杂环在任何杂原子或碳原子处与其侧基附接，这产生稳定的结构。
杂环描述于Paquette,“Principles of Modern Heterocyclic Chemistry”(W.A.Benjamin,纽约,1968)，特别是第1、3、4、6、7和9章；“The Chemistry ofHeterocyclic Compounds,A series of Monographs”(John Wiley&Sons,纽约,1950年至今)，特别是第13、14、16、19和28卷；以及J.Am.Chem.Soc.82:5566(1960)。
通过举例的方式，“杂环”基团的例子包括但不限于吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、岩藻糖基、氮丙啶基、氮杂环丁烷基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基和四氢呋喃基。
无论是单独的还是作为另一个基团的一部分，杂环基团可以任选地被一个或多个基团、优选1至2个基团取代，所述基团包括但不限于：-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立地选自H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基。在一些实施方案中，O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、芳基、和R’基团可以被进一步取代。此类进一步的取代基包括例如-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2和-CN，其中每个R”独立地选自H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或芳基，其中所述进一步的取代基优选是未经取代的。在一些实施方案中，-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、芳基、和R’基团是未经取代的。
通过举例而非限制的方式，碳键合的杂环可以在以下位置处键合：吡啶的2、3、4、5或6位；哒嗪的3、4、5或6位；嘧啶的2、4、5或6位；吡嗪的2、3、5或6位；呋喃、四氢呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位；噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位；异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位；氮杂环丙烷的2或3位；氮杂环丁烷的2、3或4位。示例性的碳键合的杂环可以包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
通过举例而非限制的方式，氮键合的杂环可以在以下位置处键合：氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑的1位；异吲哚或异吲哚啉的2位；和吗啉的4位。仍更典型地，氮键合的杂环包括1-氮丙啶基、1-吖丁啶基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基和1-哌啶基。
除非另外指出，否则术语“碳环”是指具有3至6个环原子(以及其中的碳原子的范围和特定数目的所有组合和子组合)的经取代的或未经取代的、饱和的或不饱和的非芳族单环的环体系，其中所有的环原子都是碳原子。
无论是单独的还是作为另一个基团的一部分，碳环基团可以被例如一个或多个基团、优选1或2个基团(以及选自卤素的任何另外的取代基)取代，所述基团包括但不限于：卤素、C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、＝O、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立地选自H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或芳基。在一些实施方案中，-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基和R’基团可以被进一步取代。此类进一步的取代基包括例如-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、卤素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R”、-OC(O)R”、-C(O)OR”、-C(O)NH2、-C(O)NHR”、-C(O)N(R”)2、-NHC(O)R”、-SR”、-SO3R”、-S(O)2R”、-S(O)R”、-OH、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2和-CN，其中每个R”独立地选自H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或芳基，其中所述进一步的取代基优选是未经取代的。在一些实施方案中，-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基和R’基团是未经取代的。
单环的碳环取代基的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环庚基、环辛基、-1,3-环己二烯基、-1,4-环己二烯基、-1,3-环庚二烯基、-1,3,5-环庚三烯基和-环辛二烯基。
当任何变量在任何成分中或在任何式中出现超过一次时，其在每次出现时的定义与其在每次其他出现时的定义无关。只有当取代基和/或变量的组合产生稳定的化合物时，此类组合才是允许的。
除非上下文另外指示，否则连字符(-)表示与侧链分子的附接点。因此，术语“-(C1-C10亚烷基)芳基”或“-C1-C10亚烷基(芳基)”是指如本文定义的C1-C10亚烷基，其中亚烷基在亚烷基的任何碳原子处与侧链分子附接，并且与亚烷基的碳原子键合的氢原子之一被如本文所定义的芳基替代。
当特定的基团被“取代”时，该基团可以具有独立地选自取代基列表的一个或多个取代基、优选1至5个取代基、更优选1至3个取代基、最优选1至2个取代基。然而，所述基团通常具有选自卤素的任何数目的取代基。
意图是在分子的特定位置处的任何取代基或变量的定义独立于其在该分子的其他地方的定义。应当理解，本发明的化合物的取代基和取代方式可以由本领域普通技术人员选择，以提供具有化学稳定性并且可以通过本领域已知的技术以及本文阐述的那些方法容易地合成的化合物。
控制核心岩藻糖基化的方法
本发明提供了用于制备具有特定的核心岩藻糖基化水平的抗体和抗体衍生物的方法。所述方法部分以实施例中呈现的出乎意料的结果为前提，所述结果显示可以使用与对应的培养参数(例如，细胞面积或抗体滴度的积分)配对的与岩藻糖基化抑制剂有关的参数(例如，岩藻糖基化抑制剂量或岩藻糖基化抑制剂添加时间)作为预测模型的输入生成在给定岩藻糖基化抑制剂(例如，2-氟岩藻糖)的情况下抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的准确预测模型。如本文所用，“核心岩藻糖基化”指在N连接的聚糖的还原末端对N-乙酰基氨基葡萄糖(“GlcNAc”)添加岩藻糖(“岩藻糖基化”)。还提供了通过此类方法产生的抗体和抗体衍生物。
在一些实施方案中，通过使用特定量的岩藻糖基化抑制剂或在抗体或抗体衍生物培养期间的特定时间添加岩藻糖基化抑制剂来控制与抗体或抗体衍生物的Fc区(或结构域)结合的复合N-糖苷连接的糖链的去岩藻糖基化水平。如本文所用，“复合N-糖苷连接的糖链”典型地结合至天冬酰胺297(根据Kabat编号)，尽管复合N-糖苷连接的糖链也可以连接至其他天冬酰胺残基。如本文所用，复合N-糖苷连接的糖链具有双触角复合糖链，主要具有以下结构：
Figure BDA0003211087380000141
其中±指示糖分子可以存在或不存在，并且数字指示糖分子之间的连接的位置。在以上结构中，与天冬酰胺结合的糖链末端称为还原末端(右)，并且相反一侧称为非还原末端。岩藻糖通常与还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖(“GlcNAc”)结合，典型地通过α1,6键(GlcNAc的6位连接至岩藻糖的1位)。“Gal”是指半乳糖，并且“Man”是指甘露糖。
“复合N-糖苷连接的糖链”排除高甘露糖型糖链，其中在核心结构的非还原末端只掺入甘露糖，但是包括1)复合型，其中核心结构的非还原末端侧具有一个或多个半乳糖-N-乙酰基氨基葡萄糖(也称为“gal-GlcNAc”)分支并且Gal-GlcNAc的非还原末端侧任选具有唾液酸、两分型N-乙酰基氨基葡萄糖等；或2)杂合型，其中核心结构的非还原末端侧具有高甘露糖N-糖苷连接的糖链和复合N-糖苷连接的糖链两种分支。
在一些实施方案中，“复合N-糖苷连接的糖链”包括复合型，其中核心结构的非还原末端侧具有零个、一个或多个半乳糖-N-乙酰基氨基葡萄糖(也称为“gal-GlcNAc”)分支并且Gal-GlcNAc的非还原末端侧任选地进一步具有诸如唾液酸、两分型N-乙酰基氨基葡萄糖等结构。
根据本发明方法，可以控制掺入通过培养细胞系生成的抗体或抗体衍生物的一个或多个复合N-糖苷连接的糖链中的岩藻糖的量。例如，在各种实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、或5％(包括这些值之间的任何范围)中的任一个的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有大于约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、或5％中的任一个的核心岩藻糖基化。
抗体或抗体衍生物的核心岩藻糖基化/去岩藻糖基化百分比可以使用本领域已知的用于进行此类确定的任何方法来计算。例如，可以使用四极杆飞行时间(Qtof)质谱仪分析来计算抗体核心岩藻糖基化/去岩藻糖基化百分比。Qtof提供了抗体重链的特征峰的质量单位和强度。在抗体核心岩藻糖基化Qtof分析中，光谱含有若干个峰，包括：对应于碳水化合物结构的峰，其中在两个非还原末端没有半乳糖，并且具有核心岩藻糖基化(在本文中也称为“G0”)；对应于碳水化合物结构的峰，其中一个非还原末端具有半乳糖(两种异构体的混合物)，并且具有核心岩藻糖基化(在本文中也称为“G1”)；对应于碳水化合物结构的峰，其中两个非还原末端具有半乳糖，并且具有核心岩藻糖基化(在本文中也称为“G2”)；对应于碳水化合物结构的峰，其中在两个非还原末端的任一个均没有半乳糖，并且没有核心岩藻糖基化(在本文中也称为“G0-F”)；对应于碳水化合物结构的峰，其中一个非还原末端具有半乳糖(两种异构体的混合物)，并且没有核心岩藻糖基化(在本文中也称为“G1-F”)；以及对应于碳水化合物结构的峰，其中两个非还原末端具有半乳糖，并且没有核心岩藻糖基化(在本文中也称为“G2-F”)。岩藻糖基化的抑制可以通过G0峰强度的降低和G0-F峰的增加来表示。因此，去岩藻糖基化百分比可以使用下式来计算：
Figure BDA0003211087380000151
岩藻糖基化抑制剂的量
在一些实施方案中，可以通过改变培养基中包含的岩藻糖基化抑制剂的量来控制掺入通过培养宿主细胞生成的抗体或抗体衍生物的一个或多个复合N-糖苷连接的糖链的岩藻糖的量。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂是岩藻糖类似物。在一些实施方案中，岩藻糖类似物是2FF、式I的化合物、或式II的化合物。在一些实施方案中，所述岩藻糖类似物是2FF。在一些实施方案中，当在培养的d0时添加时，添加的岩藻糖基化抑制剂的量小于导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化的饱和量。在一些实施方案中，使用预测模型来确定岩藻糖基化抑制剂的量，所述预测模型具有存在于培养基中的岩藻糖基化抑制剂的浓度和培养参数作为输入。在一些实施方案中，培养参数是积分细胞面积(ICA)。在一些实施方案中，在培养期间添加一个或多个(诸如2、3、4、5或更多个)另外量的岩藻糖基化抑制剂。
在一些实施方案中，可以通过改变在培养期间在指定时间Ta添加的岩藻糖基化抑制剂的量来控制掺入通过培养宿主细胞生成的抗体或抗体衍生物的一个或多个复合N-糖苷连接的糖链的岩藻糖的量。在一些实施方案中，Ta是培养的d0、d1、d2、d3、d4、d5或以后中的任一个。在一些实施方案中，Ta不迟于培养的d5(诸如不迟于d4、d3、d2、d1或d0中的任一个)。在一些实施方案中，Ta是培养的d0。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂是岩藻糖类似物。在一些实施方案中，岩藻糖类似物是2FF、式I的化合物、或式II的化合物。在一些实施方案中，所述岩藻糖类似物是2FF。在一些实施方案中，当在d0时添加时，添加的岩藻糖基化抑制剂的量小于导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化的饱和量。在一些实施方案中，使用预测模型来确定岩藻糖基化抑制剂的量，所述预测模型具有在Ta时添加的岩藻糖基化抑制剂的浓度和培养参数作为输入。在一些实施方案中，培养参数是积分细胞面积(ICA)。在一些实施方案中，在Ta后添加一个或多个(诸如2、3、4、5或更多个)另外量的岩藻糖基化抑制剂。
因此，在一些实施方案中，本文提供了一种控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平(例如，百分比)的方法，其包括：(a)在预定量的岩藻糖基化抑制剂(Ap)的存在下在培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞表达具有Fc结构域的抗体或抗体衍生物，所述Fc结构域具有至少一个复合N-糖苷连接的糖链，所述至少一个复合N-糖苷连接的糖链通过所述糖链的还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖与所述Fc结构域结合；以及(b)分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，在培养完成后分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，Ap是确定的，使得(b)的分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平具有不超过相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差的去岩藻糖基化水平。在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定Ap。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂是岩藻糖类似物。在一些实施方案中，岩藻糖类似物是2FF、式I的化合物、或式II的化合物。在一些实施方案中，所述岩藻糖类似物是2FF。在一些实施方案中，当在d0时添加时，Ap小于导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化的饱和量。在一些实施方案中，在培养期间添加一个或多个(诸如2、3、4、5或更多个)另外量的岩藻糖基化抑制剂。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂的一个或多个另外量独立地与Ap相同或大致相同。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂的一个或多个另外量独立地小于约Ap。
在一些实施方案中，本文提供了一种控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平(例如，百分比)的方法，其包括：(a)在培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞表达具有Fc结构域的抗体或抗体衍生物，所述Fc结构域具有至少一个复合N-糖苷连接的糖链，所述至少一个复合N-糖苷连接的糖链通过所述糖链的还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖与所述Fc结构域结合，并且其中在时间Ta时将预定量的岩藻糖基化抑制剂(Ap)添加到培养基中；(b)分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，在培养完成后分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，Ap是确定的，使得(b)的分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平具有不超过相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差的去岩藻糖基化水平。在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定Ap。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂是岩藻糖类似物。在一些实施方案中，岩藻糖类似物是2FF、式I的化合物、或式II的化合物。在一些实施方案中，所述岩藻糖类似物是2FF。在一些实施方案中，当在d0时添加时，Ap小于导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化的饱和量。在一些实施方案中，Ta是培养的d0、d1、d2、d3、d4、d5或以后中的任一个。在一些实施方案中，Ta不迟于培养的d5(诸如不迟于d4、d3、d2、d1或d0中的任一个)。在一些实施方案中，Ta是培养的d0。在一些实施方案中，在Ta后添加一个或多个(诸如2、3、4、5或更多个)另外量的岩藻糖基化抑制剂。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂的一个或多个另外量独立地与Ap相同或大致相同。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂的一个或多个另外量独立地小于约Ap。
在一些实施方案中，根据使用Ap的本文所述的任何方法，基于预测模型来确定Ap，所述预测模型是使用多种不同的岩藻糖基化抑制剂量(例如，从d0起存在于培养基中或在Ta时添加的)和在所述培养中所述宿主细胞的细胞生长参数作为输入以及所述分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平作为输出生成的。在一些实施方案中，所述预测模型是使用归一化至所述细胞生长参数的岩藻糖基化抑制剂量作为输入生成的。在一些实施方案中，所述方法进一步包括生成预测模型。在一些实施方案中，所述细胞生长参数是积分细胞面积(ICA)。
在一些实施方案中，根据使用多种不同的岩藻糖基化抑制剂量(例如，从d0起存在于培养基中或在Ta时添加的)的本文所述的任何方法，使用至少3(诸如至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)不同量的岩藻糖基化抑制剂。在一些实施方案中，多种不同的岩藻糖基化抑制剂量的跨度的范围为至少约10倍(诸如至少约25倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、2,000倍、3,000倍、4,000倍、5,000倍、6,000倍、7,000倍、8,000倍、9,000倍、10,000倍或更多倍中的任一个)的浓度差异。在一些实施方案中，多种不同的岩藻糖基化抑制剂量的跨度的范围为至少约1,000倍的浓度差异。在一些实施方案中，当在d0时添加时，多种不同的岩藻糖基化抑制剂量不包括超过饱和量的任何岩藻糖基化抑制剂量，所述饱和量导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂是岩藻糖类似物。在一些实施方案中，岩藻糖类似物是2FF、式I的化合物、或式II的化合物。在一些实施方案中，所述岩藻糖类似物是2FF。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂是2FF，并且多种不同的2FF量不包括大于约100μM的任何浓度。
在一些实施方案中，根据使用Ap的本文所述的任何方法，当在d0时添加时，Ap小于导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化的饱和量。在一些实施方案中，Ap是约1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、120μM、140μM、160μM、180μM、200μM、220μM、240μM、260μM、280μM、300μM、320μM、340μM、360μM、380μM、400μM、420μM、440μM、460μM、480μM、500μM、520μM、540μM、560μM、580μM、600μM、620μM、640μM、660μM、680μM、700μM、720μM、740μM、760μM、780μM、800μM、820μM、840μM、860μM、880μM、900μM、920μM、940μM、960μM、980μM、1,000μM、或更多(包括这些值之间的任何范围)中的任一个。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂是岩藻糖类似物。在一些实施方案中，岩藻糖类似物是2FF、式I的化合物、或式II的化合物。在一些实施方案中，所述岩藻糖类似物是2FF。
在一些实施方案中，根据使用Ap的本文所述的任何方法，岩藻糖基化抑制剂是2FF，并且Ap小于约100μM(诸如小于约99μM、98μM、97μM、96μM、95μM、94μM、93μM、92μM、91μM、90μM、89μM、88μM、87μM、86μM、85μM、84μM、83μM、82μM、81μM、80μM、79μM、78μM、77μM、76μM、75μM、74μM、73μM、72μM、71μM、70μM、69μM、68μM、67μM、66μM、65μM、64μM、63μM、62μM、61μM、60μM、59μM、58μM、57μM、56μM、55μM、54μM、53μM、52μM、51μM、50μM、49μM、48μM、47μM、46μM、45μM、44μM、43μM、42μM、41μM、40μM、39μM、38μM、37μM、36μM、35μM、34μM、33μM、32μM、31μM、30μM、29μM、28μM、27μM、26μM、25μM、24μM、23μM、22μM、21μM、20μM、19μM、18μM、17μM、16μM、15μM、14μM、13μM、12μM、11μM、10μM、9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、或1μM中的任一个)。
在一些实施方案中，预测模型是通过以下方式生成的统计模型：通过绘制去岩藻糖基化％相对于归一化至ICA的存在于培养基中的2FF浓度的曲线图，并且将曲线拟合到米曼氏(Michaelis-Menten)动力学方程以确定方程中的常数。
在一些实施方案中，根据使用Ap和Ta的本文所述的任何方法，Ta是培养的d0、d1、d2、d3、d4、d5或更迟中的任一个。在一些实施方案中，Ta不迟于培养的d5(诸如不迟于d4、d3、d2、d1或d0中的任一个)。在一些实施方案中，Ta是培养的d0。
在一些实施方案中，根据使用Ap的本文所述的任何方法，相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差不大于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更少中的任一个。在一些实施方案中，相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差不大于约5％。
在一些实施方案中，根据使用Ap的本文所述的任何方法，抗体或抗体衍生物具有约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、或5％(包括这些值之间的任何范围)中的任一个的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有大于约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、或5％中的任一个的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约100％至约95％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约95％至约90％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约90％至约85％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约85％至约80％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约80％至约75％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约75％至约70％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约70％至约65％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约65％至约60％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约60％至约55％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约55％至约50％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约50％至约45％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约45％至约40％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约40％至约35％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约35％至约30％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约30％至约25％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约25％至约20％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约20％至约15％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约15％至约10％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约10％至约5％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约5％至约0％的核心岩藻糖基化。
在一些实施方案中，本文提供了一种控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平(例如，百分比)的方法，其包括：(a)在包含预定量的2FF(Ap)的培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞表达具有Fc结构域的抗体或抗体衍生物，所述Fc结构域具有至少一个复合N-糖苷连接的糖链，所述至少一个复合N-糖苷连接的糖链通过所述糖链的还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖与所述Fc结构域结合；以及(b)分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，在培养完成后分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，Ap是确定的，使得(b)的分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平具有不超过相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差的去岩藻糖基化水平。在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定Ap。在一些实施方案中，当在d0时添加时，Ap小于导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化的饱和量。在一些实施方案中，Ap小于约100μM(诸如小于约90μM、80μM、70μM、60μM、50μM、40μM、30μM、20μM、10μM、5μM或更少中的任一个)。
在一些实施方案中，本文提供了一种控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平(例如，百分比)的方法，其包括：(a)在包含预定量的2FF(Ap)的培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞表达具有Fc结构域的抗体或抗体衍生物，所述Fc结构域具有至少一个复合N-糖苷连接的糖链，所述至少一个复合N-糖苷连接的糖链通过所述糖链的还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖与所述Fc结构域结合；以及(b)分离所述抗体或抗体衍生物，其中基于预测模型来确定Ap，所述于预测模型是使用在Ta时添加的多种不同的2FF量和在培养中宿主细胞的细胞生长参数作为输入以及分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平作为输出生成的。在一些实施方案中，在培养完成后分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，所述预测模型是使用归一化至所述细胞生长参数的2FF量作为输入生成的。在一些实施方案中，所述方法进一步包括生成预测模型。在一些实施方案中，所述细胞生长参数是积分细胞面积(ICA)。在一些实施方案中，Ap是确定的，使得(b)的分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平具有不超过相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差的去岩藻糖基化水平。在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定Ap。在一些实施方案中，当在d0时添加时，Ap小于导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化的饱和量。在一些实施方案中，Ap小于约100μM(诸如小于约90μM、80μM、70μM、60μM、50μM、40μM、30μM、20μM、10μM、5μM或更少中的任一个)。
岩藻糖基化抑制剂添加时间
在一些实施方案中，可以通过改变培养期间添加岩藻糖基化抑制剂的时间来控制掺入通过培养宿主细胞生成的抗体或抗体衍生物的一个或多个复合N-糖苷连接的糖链的岩藻糖的量。在一些实施方案中，在培养的d0后添加岩藻糖基化抑制剂。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂是岩藻糖类似物。在一些实施方案中，所述岩藻糖类似物是2-氟岩藻糖(2FF)、式I的化合物、或式II的化合物。在一些实施方案中，所述岩藻糖类似物是2FF。在一些实施方案中，当在d0时添加时，添加的岩藻糖基化抑制剂的量等于或约是导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化的饱和量。在一些实施方案中，当在d0时添加时，添加的岩藻糖基化抑制剂的量小于或约是导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化的饱和量。在一些实施方案中，使用预测模型来确定岩藻糖基化抑制剂的添加时间，所述预测模型具有岩藻糖基化抑制剂添加时间和培养参数作为输入。在一些实施方案中，培养参数是抗体滴度。在一些实施方案中，抗体滴度是在岩藻糖基化抑制剂的添加时间的抗体滴度。在一些实施方案中，在第一添加后添加一个或多个(诸如2、3、4、5或更多个)另外量的岩藻糖基化抑制剂。
因此，在一些实施方案中，本文提供了一种控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的方法，其包括：(a)在培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞表达具有Fc结构域的抗体或抗体衍生物，所述Fc结构域具有至少一个复合N-糖苷连接的糖链，所述至少一个复合N-糖苷连接的糖链通过所述糖链的还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖与所述Fc结构域结合；(b)在培养期间的预定时间(Tp)将一定量岩藻糖基化抑制剂添加到培养基中；以及(c)分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，在培养完成后分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，Tp是确定的，使得(c)的分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平具有不超过相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差的去岩藻糖基化水平。在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定Tp。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂是岩藻糖类似物。在一些实施方案中，岩藻糖类似物是2FF、式I的化合物、或式II的化合物。在一些实施方案中，所述岩藻糖类似物是2FF。在一些实施方案中，当在d0时添加时，添加的岩藻糖基化抑制剂的量等于或约是导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化的饱和量。在一些实施方案中，当在d0时添加时，添加的岩藻糖基化抑制剂的量小于或约是导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化的饱和量。在一些实施方案中，在第一添加后添加一个或多个(诸如2、3、4、5或更多个)另外量的岩藻糖基化抑制剂。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂的一个或多个另外量独立地与在第一添加中岩藻糖基化抑制剂的量相同或大致相同。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂的一个或多个另外量独立地小于约在第一添加中岩藻糖基化抑制剂的量。
在一些实施方案中，根据使用Tp的本文所述的任何方法，基于预测模型来确定Tp，所述预测模型是使用在所述培养中的多种不同岩藻糖基化抑制剂添加时间在所述培养中所述抗体或抗体衍生物的滴度作为输入以及分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平作为输出生成的。在一些实施方案中，所述方法进一步包括生成预测模型。
在一些实施方案中，根据使用多种不同的岩藻糖基化抑制剂添加时间的本文所述的任何方法，使用至少3(诸如至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)不同的岩藻糖基化抑制剂添加时间。在一些实施方案中，多种不同的岩藻糖基化抑制剂添加时间的跨度的范围为至少约24小时(诸如至少约36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时、132小时、144小时、156小时、168小时、180小时、192小时、204小时、216小时、228小时、240小时或更多中的任一个)。在一些实施方案中，多种不同的岩藻糖基化抑制剂添加时间的跨度的范围为至少约72小时。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂是岩藻糖类似物。在一些实施方案中，岩藻糖类似物是2FF、式I的化合物、或式II的化合物。在一些实施方案中，所述岩藻糖类似物是2FF。
在一些实施方案中，根据使用Tp的本文所述的任何方法，在Tp时添加的岩藻糖基化抑制剂的量是约1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、120μM、140μM、160μM、180μM、200μM、220μM、240μM、260μM、280μM、300μM、320μM、340μM、360μM、380μM、400μM、420μM、440μM、460μM、480μM、500μM、520μM、540μM、560μM、580μM、600μM、620μM、640μM、660μM、680μM、700μM、720μM、740μM、760μM、780μM、800μM、820μM、840μM、860μM、880μM、900μM、920μM、940μM、960μM、980μM、1,000μM或更多(包括这些值之间的任何范围)中的任一个。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂是岩藻糖类似物。在一些实施方案中，岩藻糖类似物是2FF、式I的化合物、或式II的化合物。在一些实施方案中，所述岩藻糖类似物是2FF。
在一些实施方案中，根据使用Tp的本文所述的任何方法，岩藻糖基化抑制剂是2FF，并且在Tp时添加的2FF的量是约或小于约100μM(诸如小于约99μM、98μM、97μM、96μM、95μM、94μM、93μM、92μM、91μM、90μM、89μM、88μM、87μM、86μM、85μM、84μM、83μM、82μM、81μM、80μM、79μM、78μM、77μM、76μM、75μM、74μM、73μM、72μM、71μM、70μM、69μM、68μM、67μM、66μM、65μM、64μM、63μM、62μM、61μM、60μM、59μM、58μM、57μM、56μM、55μM、54μM、53μM、52μM、51μM、50μM、49μM、48μM、47μM、46μM、45μM、44μM、43μM、42μM、41μM、40μM、39μM、38μM、37μM、36μM、35μM、34μM、33μM、32μM、31μM、30μM、29μM、28μM、27μM、26μM、25μM、24μM、23μM、22μM、21μM、20μM、19μM、18μM、17μM、16μM、15μM、14μM、13μM、12μM、11μM、10μM、9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、或1μM中的任一个)。
在一些实施方案中，根据使用Tp的本文所述的任何方法，相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差不大于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更少中的任一个。在一些实施方案中，相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差不大于约5％。
在一些实施方案中，根据使用Tp的本文所述的任何方法，抗体或抗体衍生物具有约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、或5％(包括这些值之间的任何范围)中的任一个的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有大于约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、或5％中的任一个的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约100％至约95％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约95％至约90％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约90％至约85％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约85％至约80％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约80％至约75％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约75％至约70％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约70％至约65％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约65％至约60％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约60％至约55％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约55％至约50％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约50％至约45％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约45％至约40％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约40％至约35％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约35％至约30％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约30％至约25％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约25％至约20％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约20％至约15％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约15％至约10％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约10％至约5％的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物具有约5％至约0％的核心岩藻糖基化。
在一些实施方案中，本文提供了一种控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的方法，其包括：(a)在培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞表达具有Fc结构域的抗体或抗体衍生物，所述Fc结构域具有至少一个复合N-糖苷连接的糖链，所述至少一个复合N-糖苷连接的糖链通过所述糖链的还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖与所述Fc结构域结合；(b)在培养期间的预定时间(Tp)将一定量2FF添加到培养基中；以及(c)分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，在培养完成后分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，Tp是确定的，使得(c)的分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平具有不超过相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差的去岩藻糖基化水平。在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定Tp。在一些实施方案中，当在d0时添加时，添加的2FF的量等于或约是导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化的饱和量。在一些实施方案中，添加的2FF的量是约100μM。
在一些实施方案中，本文提供了一种控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的方法，其包括：(a)在培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞表达具有Fc结构域的抗体或抗体衍生物，所述Fc结构域具有至少一个复合N-糖苷连接的糖链，所述至少一个复合N-糖苷连接的糖链通过所述糖链的还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖与所述Fc结构域结合；(b)在培养期间的预定时间(Tp)将一定量2FF添加到培养基中；以及(c)分离所述抗体或抗体衍生物，其中基于预测模型来确定Tp，所述预测模型是使用在所述培养中的多种不同饱和2FF添加时间在所述培养中所述抗体或抗体衍生物的滴度作为输入以及所述分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平作为输出生成的。在一些实施方案中，在培养完成后分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括生成预测模型。在一些实施方案中，Tp是确定的，使得(c)的分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平具有不超过相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差的去岩藻糖基化水平。在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定Tp。在一些实施方案中，当在d0时添加时，添加的2FF的量等于或约是导致至少约95％(诸如至少约96％、97％、98％、99％或更大中的任一个)去岩藻糖基化的饱和量。在一些实施方案中，添加的2FF的量是约100μM。
在一些实施方案中，根据控制本文所述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述宿主细胞是重组宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在一些实施方案中，根据控制本文所述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述宿主细胞是杂交瘤。
在一些实施方案中，根据控制本文所述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，在加料分批培养物中生长所述宿主细胞。
在一些实施方案中，根据控制本文所述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，在连续加料培养物中生长所述宿主细胞。
在一些实施方案中，根据控制本文所述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述培养基具有至少100升的体积。在一些实施方案中，所述培养基具有至少500升的体积。
在一些实施方案中，根据控制本文所述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述培养基是无动物蛋白培养基。
在一些实施方案中，根据控制本文所述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述抗体或抗体衍生物的分离包括从所述细胞和/或所述培养基分离所述抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，所述抗体或抗体衍生物的分离包括使用蛋白A柱。在一些实施方案中，所述抗体或抗体衍生物的分离包括使用阳离子或阴离子交换柱或疏水相互作用柱。
在一些实施方案中，根据控制本文所述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述抗体或抗体衍生物是完整抗体。在一些实施方案中，所述完整抗体是IgG1抗体。
在一些实施方案中，根据控制本文所述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述抗体或抗体衍生物是单链抗体。
在一些实施方案中，根据控制本文所述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述抗体或抗体衍生物包含重链可变区、轻链可变区、和Fc区。
在一些实施方案中，根据控制本文所述抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的任何方法，所述抗体或抗体衍生物是包含抗体Fc区和非免疫球蛋白蛋白质的配体结合结构域的抗体衍生物。
岩藻糖基化抑制剂
在一些实施方案中，本文所述的方法使用岩藻糖基化抑制剂。在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂是2-氟岩藻糖(2FF)或当施用于受试者时在体内转化为2FF的岩藻糖类似物。所考虑的另外的岩藻糖基化抑制剂包括在美国专利号8,163,551和美国专利公开号20150238509中公开的那些，将所述专利通过引用以其整体并入本文。例如，在一些实施方案中，岩藻糖基化抑制剂是以下鉴定的式I或II的岩藻糖类似物。
在一些实施方案中，岩藻糖类似物具有下式(I)或(II)：
Figure BDA0003211087380000271
或其生物学上可接受的盐或溶剂化物，其中式(I)或(II)各自可以是α或β端基异构体或相应的醛糖形式；
R1、R2、R2a、R3、R3a和R4中的每个独立地选自OH、可水解酯基团、可水解醚基团、和小吸电子基团；
R5是选自以下的成员：-CH3、-CHX2、-CH2X、未经取代或被卤素取代的-CH(X')-C1-C4烷基、未经取代或被卤素取代的-CH(X')-C2-C4烯烃、未经取代或被卤素取代的-CH(X')-C2-C4炔烃、-CH＝C(R10)(R11)、-C(CH3)＝C(R12)(R13)、-C(R14)＝C＝C(R15)(R16)、未经取代或被甲基或卤素取代的-C3碳环、未经取代或被甲基或卤素取代的-CH(X')-C3碳环、未经取代或被甲基或卤素取代的C3杂环、未经取代或被甲基或卤素取代的-CH(X')-C3杂环、-CH2N3、-CH2CH2N3和苄氧基甲基，或R5是小吸电子基团；其中
R10是氢或未经取代或被卤素取代的C1-C3烷基；
R11是未经取代或被卤素取代的C1-C3烷基；
R12是氢、卤素或未经取代或被卤素取代的C1-C3烷基；并且
R13是氢、或未经取代或被卤素取代的C1-C3烷基；
R14是氢或甲基；
R15和R16独立地选自氢、甲基和卤素；
X是卤素；并且
X'是卤素或氢；并且
另外，R1、R2、R2a、R3和R3a中的每个任选地是氢；任选地，相邻碳原子上的两个R1、R2、R2a、R3和R3a组合以在所述相邻碳原子之间形成双键；并且
条件是R1、R2、R2a、R3、R3a、R4和R5中的至少一个是小吸电子基团，或R5包括卤素、不饱和位点、碳环、杂环或叠氮化物。
在一些选择的实施方案中，岩藻糖类似物具有式：
Figure BDA0003211087380000281
或其醛糖形式，其中R1、R3和R4中的每个独立地是-OH或可水解酯基团。在一些实施方案中，可水解酯基团是-OC(O)C1-C10烷基。在一些选择的实施方案中，可水解酯基团是-OC(O)CH3。在一些实施方案中，R1、R3和R4中的每个独立地选自-OH和-OC(O)C1-C10烷基。在一些实施方案中，R1、R3和R4中的每个独立地选自-OH和-OC(O)CH3。在一些实施方案中，R1、R3和R4中的每个是-OH。在一些选择的实施方案中，岩藻糖类似物是2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖。
抗体和抗体衍生物
可以通过本发明方法产生的抗体可以是单克隆、嵌合、人源化(包括镶饰)或人抗体。合适的抗体还包括具有Fc区或结构域的抗体片段，诸如单链抗体等，所述Fc区或结构域具有复合N-糖苷连接的糖链(例如，人IgG1 Fc区或结构域)。Fc区或结构域可以包含Fcγ受体结合位点。典型地，抗体是人或人源化的。在一些实施方案中，抗体可以是啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。
抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或具有更大的多特异性。多特异性抗体可以对不同靶抗原的不同表位具有特异性或可以对同一靶抗原上的不同表位具有特异性。(参见例如，WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人,1991,J.Immunol.147:60-69；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；和5,601,819；Kostelny等人,1992,J.Immunol.148:1547-1553)。
抗体也可以根据10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M、或10-15M的其与靶抗原的结合亲和力来描述。
在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分衍生自不同动物物种的分子，诸如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于生产嵌合抗体的方法是本领域中已知的。(参见例如，Morrison,Science,1985,229:1202；Oi等人,1986,BioTechniques 4:214；Gillies等人,1989,J.Immunol.Methods125:191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397)。
在一些实施方案中，抗体可以是人源化抗体，包括镶饰抗体。人源化抗体是这样的抗体分子，其结合至所希望的抗原并且具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区和恒定区。通常，人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的对应残基取代以改变或优选改善抗原结合。这些框架取代是通过本领域中熟知的方法来鉴定，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对于抗原结合而言重要的框架残基，以及序列比较以鉴定在特定位置的不寻常的框架残基。(参见例如，Queen等人,美国专利号5,585,089；Riecbmann等人,1988,Nature 332:323)。抗体可以使用本领域中已知的多种技术进行人源化，所述多种技术诸如CDR移植(EP 0 239 400；WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、镶饰(veneering)或表面重修(resurfacing)(EP 0 592 106；EP 0 519 596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering 7(6):805-814；Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969-973)、和链改组(美国专利号5,565,332)(将所有这些参考文献通过引用并入本文)。
抗体也可以是人抗体。人抗体可以通过本领域中已知的多种方法来制造，所述多种方法诸如使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见例如，美国专利号4,444,887和4,716,111；WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741。另外，可以使用称为“引导选择”的技术生成识别选定表位的人抗体，在所述引导选择中使用选定的非人单克隆抗体(例如，小鼠抗体)来引导对识别相同表位的完全人抗体的选择(参见例如，Jespers等人,1994,Biotechnology 12:899-903)。也可以使用表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。可以使用常规杂交瘤技术从经免疫的转基因小鼠中获得针对抗原的单克隆抗体。对于用于生产人抗体的技术的概述，参见Lonberg和Huszar,1995,Int.Rev.Immunol.13:65-93。对于用于生产人抗体和人单克隆抗体的这种技术以及用于生产此类抗体的方案的详细论述，参见例如，PCT公开WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；欧洲专利号0 598,877；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。
抗体的例子包括
Figure BDA0003211087380000301
(曲妥珠单抗；Genentech)、
Figure BDA0003211087380000302
(利妥昔单抗；Genentech)、林妥珠单抗(lintuzumab)(Seattle Genetics,Inc.)、帕利珠单抗(Medimmune)、阿仑单抗(BTG)和依帕珠单抗(Immunomedics)。
在示例性实施方案中，抗体或抗体衍生物与CD19、CD20、CD21、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD70、CD133、CD138、或CD276特异性结合。在其他实施方案中，抗体或抗体衍生物与BMPR1B、LAT1(SLC7A5)、STEAP1、MUC16、巨核细胞强化因子(MPF)、Napi3b、Sema 5b、PSCA hlg、ETBR(内皮素B型受体)、STEAP2、TrpM4、CRIPTO、CD21、CD79a、CD79b、FcRH2、HER2、HER3、HER4、NCA、MDP、IL20Rα、短蛋白聚糖(Brevican)、Ephb2R、ASLG659、PSCA、PSMA、GEDA、BAFF-R、CXCR5、HLA-DOB、P2X5、CD72、LY64、FCRH1、或IRTA2特异性结合。
可以通过常规方法(例如像，使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定的技术的竞争性和非竞争性免疫测定系统)来测定抗体的与靶抗原的特异性结合。(参见例如，Ausubel等人编辑,Short Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.,纽约,第4版1999)；Harlow&Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press,冷泉港,纽约,1999)。
此外，抗体对靶抗原的结合亲和力和抗体-抗原相互作用的解离速率可以通过表面等离子共振、使用标记抗体的竞争性FACS或其他竞争性结合测定来确定。竞争性结合测定的一个例子是放射免疫测定，其包括在递增量的未经标记的抗体的存在下用目的抗体孵育经标记的抗原(例如，3H或125I)，并且检测与经标记的抗原结合的抗体。然后，抗体的亲和力和结合解离速率可以通过Scatchard绘图分析的数据来测定。与第二抗体的竞争也可以使用放射免疫测定来确定。在这种情况下，在递增量的未经标记的第二抗体的存在下，抗原与目的抗体一起孵育，所述目的抗体与经标记的化合物(例如，3H或125I)缀合。可替代地，抗体的结合亲和力以及抗体-抗原相互作用的结合和解离速率可以通过表面等离子体共振来确定。
可以根据抗体的类型通过标准程序从目标抗原的含抗原片段制备抗体(参见例如，Kohler等人,Nature,256:495,(1975)；Harlow&Lane,Antibodies,A LaboratoryManual(C.S.H.P.,纽约,1988)；Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)和WO 90/07861；Dower等人,WO 91/17271和McCafferty等人,WO 92/01047(将其中每个出于所有目的通过引用并入))。例如，可以使用本领域中已知的各种技术来制备单克隆抗体，所述各种技术包括例如使用杂交瘤、重组体及噬菌体展示技术或其组合。杂交瘤技术一般在例如Harlow等人(同上)和Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,第563-681页(Elsevier,纽约,1981)中讨论。可以用于制造抗体的噬菌体展示方法的例子包括例如在Briinnan等人,1995,J.Immunol.Methods 182:41-50；Ames等人,1995,J.Immunol.Methods 184:177-186；Kettleborough等人,1994,Eur.J.Immunol.24:952-958；Persic等人,1997,Gene 187:9-18；Burton等人,1994,Advances in Immunology 57:191-280；PCT申请号PCT/GB91/01 134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108(将其公开内容通过引用并入本文)中公开的那些。
可以用于生产单链Fv和抗体的技术的例子包括在美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人,1991,Methods in Enzymology 203:46-88；Shu等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7995-7999；和Skerra等人,1988,Science 240:1038-1040中描述的那些。
抗体衍生物的例子包括结合结构域-Ig融合物，其中结合结构域可以是例如配体、受体的胞外域、肽、非天然存在的肽等。与免疫球蛋白或Fc区的示例性融合物包括：作为sTNFRII与Fc区的融合蛋白的依那西普(美国专利号5,605,690)；作为在抗原呈递细胞上表达的LFA-3与Fc区的融合蛋白的阿法西普(美国专利号5,914,111)；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)与Fc区的融合蛋白(J.Exp.Med.181:1869(1995))；白介素15与Fc区的融合蛋白(J.Immunol.160:5742(1998))；因子VII与Fc区的融合蛋白(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:12180(2001))；白介素10与Fc区的融合蛋白(J.Immunol.154:5590(1995))；白介素2与Fc区的融合蛋白(J.Immunol.146:915(1991))；CD40与Fc区的融合蛋白(Surgery 132:149(2002))；Flt-3(fms样酪氨酸激酶)与抗体Fc区的融合蛋白(Acta.Haemato.95:218(1996))；OX40与抗体Fc区的融合蛋白(J.Leu.Biol.72:522(2002))；以及与其他CD分子(例如，CD2、CD30(TNFRSF8)、CD95(Fas)、CD106(VCAM-I)、CD137)、粘附分子(例如，ALCAM(激活的白细胞粘附分子)、钙粘蛋白、ICAM(细胞间粘附分子)-1、ICAM-2、ICAM-3)细胞因子受体(例如，白介素-4R、白介素-5R、白介素-6R、白介素-9R、白介素-10R、白介素-12R、白介素-13Rα1、白介素-13Rα2、白介素-15R、白介素-21Rα)、趋化因子、细胞死亡诱导信号分子(例如，B7-H1、DR6(死亡受体6)、PD-1(程序性死亡-1)TRAILR1)、共刺激分子(例如，B7-1、B7-2、B7-H2、ICOS(诱导型共刺激因子))、生长因子(例如，ErbB2、ErbB3、ErbB4、HGFR)、分化诱导因子(例如，B7-H3)、激活因子(例如，NKG2D)、信号转移分子(例如，gpl30)、BCMA和TACI的融合蛋白。
制造抗体和抗体衍生物的方法
可用于本发明方法的抗体及其衍生物可以通过重组表达技术从杂交瘤、骨髓瘤或其他表达抗体的哺乳动物细胞产生。与靶抗原结合的抗体或其衍生物的重组表达典型地涉及构建含有编码抗体或其衍生物的核酸的表达载体。一旦获得了编码此类蛋白质的核酸，就可以使用本领域众所周知的技术通过重组DNA技术来生产用于生产蛋白质分子的载体。标准技术诸如在Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press,冷泉港,纽约,第3版,2001)；Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,冷泉港,纽约,第2版,1989)；Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,纽约,第4版,1999)；和Glick&Pasternak,Molecular Biotechnology:Principles andApplications of Recombinant DNA(ASM Press,华盛顿特区,第2版,1998)中描述的那些可以用于重组核酸方法、核酸合成、细胞培养、转基因掺入和重组蛋白表达。
例如，对于抗体的重组表达，表达载体可以编码其重链或轻链，或重链或轻链可变结构域，其可操作地连接至启动子。表达载体可以包括例如，可以将编码抗体分子恒定区(参见例如，WO 86/05807；WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)和抗体的可变结构域的核苷酸序列克隆到此类载体中以表达整个重链或轻链。通过本领域已知的技术将表达载体转移至宿主细胞，并且然后在岩藻糖基化抑制剂的存在下通过本领域已知的技术培养转染的细胞以产生抗体。典型地，为了表达双链抗体，可以在宿主细胞中共表达编码重链和轻链的载体以表达整个免疫球蛋白分子。
可以使用多种哺乳动物细胞和细胞系来表达抗体或其衍生物。例如，可以使用哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(例如，DG44、Dxb11、CHO-K、CHO-K1和CHO-S)。在一些实施方案中，使用人细胞系。合适的骨髓瘤细胞系包括SP2/0和IR983F以及人骨髓瘤细胞系诸如Namalwa。其他合适的细胞包括人胚胎肾细胞(例如，HEK293)、猴肾细胞(例如，COS)、人上皮细胞(例如，HeLa)、PERC6、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、BHK和K6H6。其他合适的宿主细胞包括YB2/0细胞。在其他实施方案中，宿主细胞不是YB2/0细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞来自杂交瘤。在一些实施方案中，宿主细胞不是由用NS0骨髓瘤细胞产生的融合体产生的杂交瘤。在其他实施方案中，宿主细胞不来自杂交瘤。
在一些实施方案中，宿主细胞不含岩藻糖转运蛋白基因敲除。在一些实施方案中，宿主细胞不含岩藻糖基转移酶(例如，FUT8)基因敲除。在一些实施方案中，宿主细胞不含GnTIII编码核酸的敲入。在一些实施方案中，宿主细胞不含高尔基α甘露糖苷酶II编码核酸的敲入。
可以使用多种哺乳动物宿主-表达载体系统来表达抗体或其衍生物。例如，与载体(诸如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件或中国仓鼠卵巢EF-1α启动子)结合的哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(例如，DG44、Dxb11、CHO-K1和CHO-S)是用于生产抗体及其衍生物的有效表达系统(参见例如，Foecking等人,1986,Gene 45:101；Cockett等人,1990,Bio/Technology 8:2；Allison,美国专利号5,888,809)。
在适当的培养基中培养细胞系。合适的培养基包括含有例如生长所需的盐、碳源(例如，糖)、氮源、氨基酸、微量元素、抗生素、选择剂等的那些。例如，诸如Ham's FlO(Sigma)、最低必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM，Sigma)、PowerCHOTM细胞培养基(LonzaGroup Ltd.)杂交瘤无血清培养基(HSFM)(GIBCO)的可商购培养基适用于培养宿主细胞。这些培养基中的任一种可以根据需要补充有激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。还可以适当浓度包含本领域技术人员将知的任何其他必需的补充物。培养条件(诸如温度、pH等)可以是先前选择用于表达的宿主细胞所使用的那些条件，并且对于普通技术人员是清楚的。
可以通过在任何合适体积的培养基中生长宿主细胞来培养表达抗体或抗体衍生物的细胞。可以在任何合适的培养系统中并且根据本领域已知的任何方法(包括T形烧瓶、旋转器和摇瓶、
Figure BDA0003211087380000341
袋、滚瓶、生物反应器和搅拌罐生物反应器)培养细胞。锚定依赖性细胞也可以在微载体(例如，聚合物球体)上培养，所述微载体在搅拌罐生物反应器中保持悬浮。可替代地，细胞可以在单细胞悬浮液中生长。培养基可以以分批过程添加，例如，其中将培养基以单一批次一次添加到细胞中，或者以加料分批过程添加，其中定期添加小批量培养基。可以在培养结束时或在培养过程中多次收获培养基。连续灌注培养过程也是本领域已知的，并且涉及将新鲜培养基连续加料到培养物中，同时从反应器中连续撤出相同的体积。灌注培养通常比分批培养获得更高的细胞密度，并且可以在重复收获的情况下维持数周或数月。
对于分批培养的细胞，培养基的体积典型地是至少750mL、1升、2升、3升、4升、5升、10升、15升、20升或更多。对于工业应用，培养基的体积可以是至少100升、至少200升、至少250升、至少500升、至少750升、至少1000升、至少2000升、至少5000升或至少10,000升。
在一些实施方案中，通过本发明方法产生的抗体或抗体衍生物包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的非核心岩藻糖基化蛋白(例如，缺乏核心岩藻糖基化)。在一些实施方案中，通过本发明方法产生的抗体或抗体衍生物包含至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的非核心岩藻糖基化抗体或抗体衍生物。在一些实施方案中，通过本发明方法产生的抗体或抗体衍生物的组合物包含少于100％的非核心岩藻糖基化抗体和/或抗体衍生物。
可以根据本领域已知的任何方法来确定其中岩藻糖不与糖链的还原末端中的N-乙酰基氨基葡萄糖结合的糖链的含量与其中岩藻糖不与糖链的还原末端中的N-乙酰基氨基葡萄糖结合的糖链的含量(例如，比率)。此类方法包括肼解或酶消化(参见例如，Biochemical Experimentation Methods23:Method for Studying Glycoprotein SugarChain(Japan Scientific Societies Press),Reiko Takahashi编辑(1989))，荧光标记或放射性同位素标记释放的糖链，然后通过层析分出已标记的糖链。还有，可以通过用HPAEC-PAD法分析链来确定释放的糖链的组成(参见例如，J.Liq Chromatogr.6:1557(1983))。(通常参见，美国专利申请公开号2004-0110282)。
在一些实施方案中，通过本发明方法产生的抗体或抗体衍生物具有比在不存在岩藻糖基化抑制剂的情况下产生的抗体或抗体衍生物更高的效应子功能(例如，ADCC活性)。可以通过根据本文所述的任何方法控制去岩藻糖基化水平来调节效应子功能活性。ADCC活性可以使用本领域已知的测定来测量并且在示例性实施方案中与核心岩藻糖基化亲本抗体相比增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。可以通过测量效应子功能来评估针对抗原阳性培养细胞系的细胞毒性活性(例如，如在Cancer Immunol.Immunother.36:373(1993)中所述)。
抗体和抗体衍生物可以使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法来纯化，其中亲和色谱法是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于存在于抗体或抗体衍生物中的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人IgGl、2或4重链的抗体或抗体衍生物。
蛋白G可以用于小鼠同种型以及一些人抗体和抗体衍生物。亲和配体所附接的基质最常见是琼脂糖，但是其他基质是可用的。机械稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯允许比可以用琼脂糖实现的流速和加工时间更快的流速和更短的加工时间。在抗体或抗体衍生物包含CH3结构域的情况下，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,菲利普斯堡,新泽西)可用于纯化。取决于待回收的抗体或抗体衍生物，也可使用其他蛋白质纯化技术(诸如在离子交换柱(阳离子或阴离子交换)上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上的色谱法、在肝素SEPHAROSETM上的色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何一个或多个纯化步骤之后，可以使包含目的抗体或抗体衍生物和污染物的混合物经受低pH疏水相互作用色谱法(例如，使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如，从约0-0.25M盐)下进行)。
抗体和抗体衍生物的用途
根据本发明方法制备的抗体和抗体衍生物可以用于多种治疗性和非治疗性应用。例如，所述抗体可以用作治疗性抗体。抗体衍生物(例如，受体-Fc融合体)可以用作治疗性分子。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物不与另一种分子缀合。在一些实施方案中，抗体与合适的药物(例如，抗体药物缀合物)或其他活性剂缀合。抗体和抗体衍生物也可以用于非治疗性目的，诸如诊断测定、预后测定、释放测定等。
药物组合物
根据本发明方法制备的抗体和抗体衍生物可以被配制用于治疗性和非治疗性应用。所述抗体和衍生物可以配制成药物组合物，所述药物组合物包含治疗或预防有效量的所述抗体或衍生物和一种或多种药学上相容(可接受)的成分。例如，药物或非药物组合物典型地包含一种或多种载体(例如，无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。当静脉内施用药物组合物时，水是更典型的载体。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括例如，氨基酸、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果希望，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释配制品等形式。合适的药物载体的例子由E.W.Martin描述于“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。此类组合物将典型地含有治疗有效量的典型地呈纯化形式的蛋白质连同合适量的载体，以便提供适当施用于患者的形式。配制品与施用方式相对应。
典型地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，所述药物组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂(诸如利多卡因)以缓解注射部位的疼痛。通常，成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在气密密封容器中的干燥的冻干粉或无水浓缩物，所述气密密封容器例如是指明活性剂的量的安瓿瓶或小药囊。在通过输注施用药物时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶进行分配。在通过注射施用药物时，可以提供一安瓿瓶的无菌注射用水或盐水，使得可以在施用前将成分混合。
本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例不旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1：mAb的去岩藻糖基化％对2FF浓度和ICA的依赖性
本研究中使用了工业相关的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。细胞系来源于二氢叶酸-(dhfr-)CHO宿主(Urlaub G,Chasin LA,Isolation of Chinese hamster cell mutantsdeficient in dihydrofolate reductase activity.Proc Natl Acad Sci USA 77:4216-4220,1980)。使用行业标准的专有的化学成分明确的基础培养基在摇瓶中培养和维持细胞。从放大到培养结束，摇瓶培养条件为37℃、5％CO2。使用工业标准的专有基础培养基和加料培养基培养细胞。将不同的加料体积添加到培养物中。在整个培养过程中保持葡萄糖浓度。
在细胞培养过程开始时，将2-氟岩藻糖(2FF)从10-100mM储备溶液添加到细胞培养基中。针对产生不同抗体序列的多种细胞系，测试范围为从0至100μM的多种浓度。在培养的整个持续时间内每天采集1ml样品以监测细胞培养过程并且使用自动细胞计数器测量活细胞密度(VCD)。图1A示出了测试的示例性细胞系的代表性生长曲线。在培养结束时，收获细胞培养液，离心，并且使用蛋白A色谱法纯化。使用HILIC(疏水相互作用色谱法)测定测量蛋白A纯化样品上的糖基化，以定量作为比率的在mAb中的去岩藻糖基化物质％。
使用2FF浓度和细胞密度进行调整
用所测试的浓度范围估计2FF的消耗率(2FF浓度与积分细胞面积(ICA)(活细胞密度曲线下的面积)的比率)。绘制去岩藻糖基化％相对于[2FF浓度]/ICA的曲线图以生成多种细胞系的去岩藻糖基化的单一饱和曲线(参见图1B)。此曲线统一了对多种细胞系中去岩藻糖基化的预测。将此曲线拟合到米曼氏动力学方程以确定方程中的常数。
如图1B所示，观察到饱和极限，超过所述极限，另外的2FF将不增加去岩藻糖基化。如果此经验模型的ICA已知并且统一了多种CHO细胞系之间的关系，则此经验模型能够估计特定细胞系的去岩藻糖基化。另外，所述模型提供了一种调整去岩藻糖基化以实现完全或部分饱和的工具。
实施例2：mAb的去岩藻糖基化％对饱和2FF的添加时间和在饱和2FF的添加时间的抗体滴度的依赖性
本研究中使用了工业相关的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。细胞系来源于二氢叶酸-(dhfr-)CHO宿主(Urlaub G,Chasin LA,Isolation of Chinese hamster cell mutantsdeficient in dihydrofolate reductase activity.Proc Natl Acad Sci USA 77:4216-4220,1980)。使用行业标准的专有的化学成分明确的基础培养基在摇瓶中培养和维持细胞。从放大到培养结束，摇瓶培养条件为37℃、5％CO2。使用工业标准的专有的基础和加料培养基培养细胞，并且向培养物中添加可变加料体积。在整个培养过程中保持葡萄糖浓度。
使用2FF添加时间进行调整
使用产生不同抗体的两种工业相关CHO细胞系(细胞系A和细胞系B)测试岩藻糖基化抑制剂2FF的添加时间对去岩藻糖基化的影响。如图2A所示，2种细胞系的抗体产生曲线具有不同的动力学。从100mM储备溶液将2FF添加到细胞培养基中，以达到100μM的最终浓度。在培养过程的第0天或第3天进行添加。在培养结束时，收获细胞培养液，离心，并且使用蛋白A色谱法纯化。如实施例1中所述，使用HILIC测定分析样品的去岩藻糖基化水平。对于到第3天产生显著分数的抗体的细胞系A，观察到部分去岩藻糖基化(图2B)，与到第3天未产生显著分数的最后一天抗体滴度的细胞系B(图2C)不同。如果此经验模型的抗体生产曲线已知，则此经验模型能够估计特定细胞系的去岩藻糖基化。
本发明的范围不受本文所述的具体实施方案的限制。除了在本文所述的那些外，从上文描述和附图，本发明的各种修改对本领域普通技术人员而言将是显而易见的。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。除非从上下文中另外明显看出，本发明的任何步骤、要素、实施方案、特征或方面可以与任何其他组合使用。出于所有目的将本申请中提及的所有专利申请和科学出版物、登录号等均通过引用以其整体并入本文，其程度与其单独表示的程度相同。

Claims (42)

1.一种控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的方法，其包括：
(a)在预定量的岩藻糖基化抑制剂(Ap)的存在下在培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞表达具有Fc结构域的抗体或抗体衍生物，所述Fc结构域具有至少一个复合N-糖苷连接的糖链，所述至少一个复合N-糖苷连接的糖链通过所述糖链的还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖与所述Fc结构域结合；以及
(b)分离所述抗体或抗体衍生物，
其中Ap是预先确定的，使得(b)的分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平具有不超过相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差的去岩藻糖基化水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在培养完成后分离所述抗体或抗体衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括确定Ap。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中基于预测模型来确定Ap，所述预测模型是使用多种不同的岩藻糖基化抑制剂量和在所述培养中所述宿主细胞的细胞生长参数作为输入以及所述分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平作为输出生成的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述预测模型是使用归一化至所述细胞生长参数的岩藻糖基化抑制剂量作为输入生成的。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述细胞生长参数是积分细胞面积(ICA)。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其进一步包括生成所述预测模型。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述岩藻糖基化抑制剂是岩藻糖类似物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述岩藻糖类似物是2-氟岩藻糖(2FF)、式I的化合物、或式II的化合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述岩藻糖类似物是2FF。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述目标去岩藻糖基化水平是：
(a)约100％至约90％；
(b)约90％至约80％；
(c)约80％至约70％；
(d)约70％至约60％；
(e)约60％至约50％；
(f)约50％至约40％；
(g)约40％至约30％；
(h)约30％至约20％；
(i)约20％至约10％；或
(j)约10％至约0％。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述目标去岩藻糖基化水平是：
(a)大于约80％；
(b)大于约60％；
(c)大于约40％；
(d)大于约20％；
(e)大于约10％；或
(f)大于约5％。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述相对于所述目标去岩藻糖基化水平的最大偏差不大于10％。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述相对于所述目标去岩藻糖基化水平的最大偏差不大于5％。
15.一种控制抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平的方法，其包括：
(a)在培养基中培养宿主细胞，其中所述宿主细胞表达具有Fc结构域的抗体或抗体衍生物，所述Fc结构域具有至少一个复合N-糖苷连接的糖链，所述至少一个复合N-糖苷连接的糖链通过所述糖链的还原末端的N-乙酰基氨基葡萄糖与所述Fc结构域结合；
(b)在所述培养期间在预定时间(Tp)将饱和量的岩藻糖基化抑制剂添加到所述培养基中，其中所述饱和量的所述岩藻糖基化抑制剂当在所述培养的d0时添加时导致至少约95％的去岩藻糖基化；以及
(c)分离所述抗体或抗体衍生物，
其中Tp是预先确定的，使得(b)的分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平具有不超过相对于目标去岩藻糖基化水平的最大偏差的去岩藻糖基化水平。
16.根据权利要求15所述的方法，其中在培养完成后分离所述抗体或抗体衍生物。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其进一步包括确定Tp。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中基于预测模型来确定Tp，所述预测模型是使用在所述培养中的多种不同饱和岩藻糖基化抑制剂添加时间在所述培养中所述抗体或抗体衍生物的滴度作为输入以及所述分离的抗体或抗体衍生物的去岩藻糖基化水平作为输出生成的。
19.根据权利要求18所述的方法，其进一步包括：生成所述预测模型。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述岩藻糖基化抑制剂是岩藻糖类似物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述岩藻糖类似物是2FF、式I的化合物、或式II的化合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述岩藻糖类似物是2FF。
23.根据权利要求15-22中任一项所述的方法，其中所述目标去岩藻糖基化水平是：
(a)约100％至约90％；
(b)约90％至约80％；
(c)约80％至约70％；
(d)约70％至约60％；
(e)约60％至约50％；
(f)约50％至约40％；
(g)约40％至约30％；
(h)约30％至约20％；
(i)约20％至约10％；或
(j)约10％至约0％。
24.根据权利要求15-22中任一项所述的方法，其中所述目标去岩藻糖基化水平是：
(a)大于约80％；
(b)大于约60％；
(c)大于约40％；
(d)大于约20％；
(e)大于约10％；或
(f)大于约5％。
25.根据权利要求15-24中任一项所述的方法，其中所述相对于所述目标去岩藻糖基化水平的最大偏差不大于10％。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述相对于所述目标去岩藻糖基化水平的最大偏差不大于5％。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是重组宿主细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
29.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是杂交瘤。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中在加料分批培养物中生长所述宿主细胞。
31.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中在连续加料培养物中生长所述宿主细胞。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述培养基具有至少100升的体积。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述培养基具有至少500升的体积。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述培养基是无动物蛋白培养基。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体衍生物的分离包括从所述细胞和/或所述培养基分离所述抗体或抗体衍生物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述抗体或抗体衍生物的分离包括使用蛋白A柱。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述抗体或抗体衍生物的分离包括使用阳离子或阴离子交换柱或疏水相互作用柱。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体衍生物是完整抗体。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述完整抗体是IgG1抗体。
40.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体衍生物是单链抗体。
41.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体衍生物包含重链可变区、轻链可变区、和Fc区。
42.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体衍生物是包含抗体Fc区和非免疫球蛋白蛋白质的配体结合结构域的抗体衍生物。
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