KR20210102313A - 화학적으로 변형된 RNAi 작제물 및 이의 용도 - Google Patents

화학적으로 변형된 RNAi 작제물 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20210102313A
KR20210102313A KR1020217020966A KR20217020966A KR20210102313A KR 20210102313 A KR20210102313 A KR 20210102313A KR 1020217020966 A KR1020217020966 A KR 1020217020966A KR 20217020966 A KR20217020966 A KR 20217020966A KR 20210102313 A KR20210102313 A KR 20210102313A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleotides
nucleotide
rnai construct
modified
antisense strand
Prior art date
Application number
KR1020217020966A
Other languages
English (en)
Inventor
저스틴 케이. 머레이
빈 우
유안 쳉
브래들리 제이. 허버릭
Original Assignee
암젠 인크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 암젠 인크 filed Critical 암젠 인크
Publication of KR20210102313A publication Critical patent/KR20210102313A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3523—Allyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위한 화학적으로 변형된 RNAi 작제물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생체내 안정성 및 효능을 개선하기 위하여 RNAi 작제물 내로 혼입되는 변형된 뉴클레오티드의 특정 패턴에 관한 것이다. 또한, 화학적으로 변형된 RNAi 작제물을 포함하는 약제학적 조성물 및 예를 들어, 다양한 질환 상태를 치료 또는 개선하기 위하여, 화학적으로 변형된 RNAi 작제물을 투여함으로써, 생체내에서 표적 유전자 발현을 억제하는 방법이 기술된다.

Description

화학적으로 변형된 RNAi 작제물 및 이의 용도
[관련 출원의 상호 참조]
본 출원은 2018년 12월 10일에 출원된 미국 가출원 제62/777,677호의 이익을 주장하며, 이는 전체가 본원에 참고로 포함된다.
[전자로 제출된 텍스트 파일의 설명]
본 출원은 전체가 본원에 참고로 포함된 ASCII 포맷으로 전자로 제출된 서열 목록을 포함한다. 2019년 12월 9일에 생성된 서열 목록의 컴퓨터로 읽을 수 있는 포맷의 사본은 A-2327-WO-PCT_SeqList_ST25로 명명되며 24.7킬로바이트 크기이다.
[기술분야]
본 발명은 생체내에서 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위한 화학적으로 변형된 RNAi 작제물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 생체내에서 RNAi 작제물의 개선된 효능 및 안정성을 부여하는 변형된 뉴클레오티드의 특정 패턴에 관한 것이다. 이러한 RNAi 작제물은 치료 목적으로 표적 유전자 발현을 억제시키는 데 유용하다.
RNA 간섭(RNAi)은 대부분의 모든 생물에서 발견되는 전사 후 유전자 사일런싱 메카니즘으로, 진화적으로 보존된 세포 방어 메카니즘으로 여겨진다(Fire et al., Nature, Vol. 391; 806-811, 1998; Fire et al., Trends Genet, Vol. 15: 358-363, 1999; 및 Hamilton and Baulcombe, Science, Vol. 286, 950-952, 1999). 생리적으로, RNAi 메카니즘은 더 긴 비 암호화 RNA로부터 18 내지 25개의 염기쌍으로 구성된 이중체의 다이서(Dicer) 효소 매개 생성에 의해 개시된다. 이들 짧은 RNA 분자는 RNA 유도된 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC) 내로 로딩되는데, 여기서 센스 가닥 또는 패신저 가닥은 버려지고, 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥은 완전히 또는 부분적으로 상보적인 mRNA 서열과 하이브리드화한다(Nakanishi, Wiley Interdiscip. Rev. RNA, Vol. 7: 637-660, 2016). 그 후, mRNA의 사일런싱이 Ago2 매개 분해 또는 번역 억제를 통해 유도된다(Bobbin and Rossi, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol. 56:103-122, 2016).
RNAi 기술 및 전달 방법의 발전은 RNAi 기반 치료법을 이용해 점점 더 많은 긍정적인 결과를 초래하였다. 이러한 치료법은 특히 소분자 또는 생물제제 양식에 의해 "약물로 발굴 불가능(undruggable)"한 것으로 간주되었던 표적에 맞서, 전도 유망한 치료제 부류를 대표한다. 화학적 변형 및 개선된 전달 방법의 개발을 통해 천연 RNA의 고유한 대사적 취약성을 극복하려는 많은 진전이 이루어졌지만, 치료 목적으로 투여에 적합한, 생체내 효능 및 안정성이 증진된 RNAi 작용제가 당해 분야에 여전히 필요하다.
본 발명은, 부분적으로는, 생체내에서 작제물의 효능 및/또는 유전자 사일런싱 활성의 지속시간을 개선하는 RNAi 작제물에 대한 화학적 변형 패턴의 설계를 기초로 한다. 본원에 기술된 화학 패턴은 상이한 서열 및 표적을 갖는 다양한 RNAi 작제물에 보편적으로 적용될 수 있다. RNAi 작제물은 예를 들어, 치료 목적으로, 생체내에서 표적 유전자 발현을 억제시키는 데 유용하다.
따라서, 본 발명은 표적 유전자 서열의 발현을 억제하는 RNAi 작제물을 제공하며, 이때, RNAi 작제물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 표적 유전자 서열에 상보적인 서열을 포함하고 센스 가닥은 이중체 영역을 형성하도록 안티센스 가닥의 서열에 충분히 상보적인 서열을 포함하고, RNAi 작제물은 본원에 기술된 식 중 하나로 표시되는 구조를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작제물은 본원에 기술된 바와 같이 P1 내지 P30으로 지정된 패턴 중 하나로부터 선택된 화학적 변형 패턴을 갖는다.
일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 식 (A)로 표시되는 구조를 포함한다:
5′-(NA)x NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NM NL NM NL NT(n)y-3′
3′-(NB)z NL NL NL NL NL NF NL NM NL NM NL NL NF NM NL NM NL NF NL-5′
(A)
식 (A)에서, 5'에서 3'의 방향으로 열거된 윗 가닥은 센스 가닥이고 3'에서 5'의 방향으로 열거된 아랫 가닥은 안티센스 가닥이고; 각각의 NF는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; 각각의 NM은 독립적으로 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, 이환식 핵산(BNA), 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고; 각각의 NL은 독립적으로 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고; NT는 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타낸다. x는 0 내지 4의 정수일 수 있으나, 단, x가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이다. NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 안티센스 가닥의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있다. y는 0 내지 4의 정수일 수 있으나, 단, y가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, 1개 이상의 n 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 변형된 또는 변형되지 않은 오버행 뉴클레오티드이다. z는 0 내지 4의 정수일 수 있으나, 단, z가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이다. NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 센스 가닥에 존재할 때 NA 뉴클레오티드에 상보적일 수 있거나, 또는 센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 오버행 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 19 내지 23개의 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥 및 19 내지 23개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 서열은 19 내지 21개의 염기쌍의 이중체 영역을 형성하도록 서로에 대해 충분히 상보적이며, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 7, 및 14번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 8 내지 11 및 13번과 쌍을 이룬 위치에서의 센스 가닥의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; 센스 가닥과 안티센스 가닥은 각각 총 7개를 초과하는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드를 갖지 않는다. RNAi 작제물은 센스 가닥과 안티센스 가닥의 3' 말단의 하나 또는 둘 다에서 뉴클레오티드 오버행을 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행을, 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
본 발명의 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 식 (D)로 표시되는 구조를 포함한다:
5′-(NA)x NL NL NL NL NM NL NF NF NF NF NL NL NL NL NL NL NL NL NT(n)y-3′
3′-(NB)z NL NL NL NM NL NF NL NM NL NL NM NM NM NM NL NM NL NF NL-5′
(D)
식 (D)에서, 5'에서 3'의 방향으로 열거된 윗 가닥은 센스 가닥이고 3'에서 5'의 방향으로 열거된 아랫 가닥은 안티센스 가닥이고; 각각의 NF는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; 각각의 NM은 독립적으로 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고; 각각의 NL은 독립적으로 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고; NT는 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타낸다. x는 0 내지 4의 정수일 수 있으나, 단, x가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이다. NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 안티센스 가닥의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있다. y는 0 내지 4의 정수일 수 있으나, 단, y가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, 1개 이상의 n 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 변형된 또는 변형되지 않은 오버행 뉴클레오티드이다. z는 0 내지 4의 정수일 수 있으나, 단, z가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이다. NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 센스 가닥에 존재할 때 NA 뉴클레오티드에 상보적일 수 있거나, 또는 센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 오버행 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 19 내지 23개의 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥 및 19 내지 23개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 서열은 19 내지 21개의 염기쌍의 이중체 영역을 형성하도록 서로에 대해 충분히 상보적이며, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 14, 및 16번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 10 내지 13번과 쌍을 이룬 위치에서의 센스 가닥의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; 센스 가닥과 안티센스 가닥은 각각 총 7개를 초과하는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드를 갖지 않는다. RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행을, 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 가질 수 있다. 대안적으로, RNAi 작제물은 센스 가닥과 안티센스 가닥의 3' 말단의 둘 다에서 뉴클레오티드 오버행을 가질 수 있다.
본 발명의 RNAi 작제물은 적어도 하나의 골격 변형, 예컨대 변형된 뉴클레오티드간 또는 뉴클레오시드간 연결을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 RNAi 작제물은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 실시형태에서, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 센스 및/또는 안티센스 가닥의 3' 또는 5' 말단에 위치될 수 있다.
RNAi 작제물은 특정 조직 또는 세포, 예컨대, 간세포로의 RNAi 작제물의 전달 또는 흡수를 촉진하는 리간드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 리간드는 간세포로 RNAi 작제물을 전달하는 것을 표적화한다. 이러한 실시형태 및 다른 실시형태에서, 리간드는 갈락토스, 갈락토사민, 또는 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 리간드는 다가 갈락토스 또는 다가 GalNAc 모이어티, 예컨대, 3가 또는 4가 갈락토스 또는 GalNAc 모이어티를 포함한다. 리간드는 선태적으로 링커를 통해, RNAi 작제물의 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에 공유적으로 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 본원에 기술된 화학식 I 내지 IX 중 임의의 화학식에 따른 구조를 갖는 리간드 및 링커를 포함한다. 일 실시형태에서, RNAi 작제물은 화학식 VI에 따른 구조를 갖는 리간드 및 링커를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 화학식 VII에 따른 구조를 갖는 리간드 및 링커를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 화학식 IX에 따른 구조를 갖는 리간드 및 링커를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 RNAi 작제물 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 약제학적 조성물은 특히 대상체에서 표적 유전자 생성물의 과발현이 병리적 표현형과 관련이 있을 때, 대상체의 세포(예를 들어, 간세포)에서 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 억제하는 데 특히 유용하다.
본 발명은 세포, 조직, 또는 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 억제하는 방법을 포함한다. 일 실시형태에서, 방법은 세포 또는 조직을 본원에 기술된 RNAi 작제물 중 임의의 하나와 접촉시키는 단계를 포함한다. 세포 또는 조직은 시험관내 또는 생체내에 있을 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 본원에 기술된 RNAi 작제물 중 임의의 하나를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. RNAi 작제물은 대상체에게 비경구(예를 들어, 정맥 내 또는 피하)로 투여될 수 있다.
도 1은 RNAi 작제물에 대한 화학적 변형 패턴의 몇몇 대표적인 실시형태를 보여준다. 각각의 개략도에서, 윗 가닥은 5'에서 3'의 방향의 센스 가닥을 나타내고, 아랫 가닥은 3'에서 5' 방향의 안티센스 가닥을 나타낸다. 검은색 원은 2′-O-메틸(2′-OMe) 변형된 뉴클레오티드를 나타내고, 줄무늬가 있는 원은 2′-플루오로(2′-F) 변형된 뉴클레오티드를 나타내고, 흰색 원은 반전된 무염기 뉴클레오티드(invAb) 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드(invdN)를 나타낸다. 원을 연결하는 연회색 선은 포스포디에스테르 연결을 나타내고, 원을 연결하는 검은색 선은 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다. 검은색 상자는 RNAi 작제물 내의 추정되는 Ago2 절단 부위를 나타낸다.
도 2는 인간 PNPLA3 변이체를 암호화하는 AAV를 주입하고 P1 또는 CM1 화학적 변형 패턴을 갖는 표시된 RNAi 작제물의 5 mg/kg의 피하 주사를 처리한 마우스의 간에서의 인간 PNPLA3 변이체의 발현 수준의 막대 그래프이다. 인간 PNPLA3 발현을 qPCR에 의해 측정하였고, 비히클 처리 동물에 대한 발현 수준으로 보고한다. RNAi 작제물 투여 후 제8일의 발현 수준을 제시하였다.
도 3은 인간 PNPLA3 변이체를 암호화하는 AAV를 주입하고 P1, P2, P3, 또는 P4 화학적 변형 패턴을 갖는 표시된 RNAi 작제물의 5 mg/kg의 피하 주사를 처리한 마우스의 간에서의 인간 PNPLA3 변이체의 발현 수준의 막대 그래프이다. 인간 PNPLA3 발현을 qPCR에 의해 측정하였고, 비히클 처리 동물에 대한 발현 수준으로 보고한다. RNAi 작제물 투여 후 제15일의 발현 수준을 제시하였다.
도 4a 및 4b는 RNAi 작제물 주입 후 경과한 주(week) 수에 대한 1 mg/kg(도 4a) 또는 3 mg/kg(도 4b)의 용량으로 P9 화학적 변형 패턴을 갖는 표시된 RNAi 작제물 또는 비히클의 피하 주사를 받는 마우스에서 총 플럭스(초당 광자)를 나타내는 선 그래프이다. 총 플럭스는 마우스에 의해 발현된, RNAi 작제물의 서열에 상보적인 서열을 함유하는 루시퍼라제 리포터로부터의 신호를 나타낸다. 총 플럭스의 감소는 루시퍼라제 리포터의 발현 감소를 나타낸다.
도 5는 인간 PNPLA3 변이체를 암호화하는 AAV를 주입하고 P9(이중체 번호 7318 및 8709), CM2(이중체 번호 8103), CM3(이중체 번호 8104), 또는 CM4(이중체 번호 8105)의 화학적 변형 패턴을 갖는 표시된 RNAi 작제물의 3 mg/kg의 피하 주사를 처리한 마우스의 간에서의 인간 PNPLA3 변이체의 발현 수준의 막대 그래프이다. 인간 PNPLA3 발현을 qPCR에 의해 측정하였고, 비히클 처리 동물에 대한 발현 수준으로 보고한다. RNAi 작제물 투여 후 제28일의 발현 수준을 제시하였다.
도 6은 표시된 ASGR1 RNAi 작제물의 5 mg/kg의 피하 주사를 처리한 마우스의 간에서의 마우스 ASGR1 발현 수준의 막대 그래프이다. 마우스 ASGR1 발현을 qPCR에 의해 측정하였고, Gapdh 발현 수준에 의해 정규화된 발현 수준으로 보고한다. RNAi 작제물 또는 완충액(인산염 완충 식염수, PBS) 투여 후 제4일, 제8일, 및 제15일의 발현 수준을 제시하였다.
도 7은 표시된 LPA 표적화 RNAi 작제물의 0.5 mg/kg의 피하 주사를 투여한 이중 형질전환 마우스에서 기준선에 대한 혈청 Lp(a) 수준의 변화 백분율을 보여주는 선 그래프이다. 두 RNAi 작제물은 동일한 서열을 가졌고, 화학적 변형의 패턴만 상이하였다. 이중체 번호 3632는 CM1의 변형 패턴을 가졌고, 이중체 번호 3635는 P1의 변형 패턴을 가졌다. RNAi 작제물의 단일 피하 주사 후 제14일(D14) 및 제28일(D28)의 Lp(a) 혈청 수준의 변화 백분율을 제시하였다.
본 발명은, 부분적으로는, 다양한 서열 및 표적에 걸쳐 생체내에서 표적 유전자의 발현의 강력하고도 오래 지속되는 녹다운을 초래하는 RNAi 작제물에 대한 화학적 변형 패턴의 설계를 기초로 한다. 본원에 기술된 화학적으로 변형된 RNAi 작제물은 대안적인 화학적 변형 패턴을 갖는 이전에 기술된 치료적 RNAi 작용제와 비교하여 개선된 효능 및/또는 생체내에서 유전자 사일런싱 활성의 지속시간을 갖는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 변형된 RNAi 작제물은 생체내에서 표적 유전자 발현을 억제하는 데, 예를 들어, 다양한 질환 상태를 치료하거나 개선하는 데 유용하다. 따라서, 본 발명은 표적 유전자 서열의 발현을 억제하는 RNAi 작제물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "RNAi 작제물"은 세포 내로 도입될 때 RNA 간섭 메카니즘을 통해 표적 유전자의 발현을 하향조절할 수 있는 RNA 분자를 포함하는 작용제를 지칭한다. RNA 간섭은 핵산 분자가 표적 RNA 분자(예를 들어, 메신저 RNA 또는 mRNA 분자)의 절단 및 분해를 서열-특이적 방식으로, 예를 들어 RNA 유도된 사일런싱 복합체(RISC) 경로를 통해 유도하는 방법이다. 일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 이중체 영역을 형성하도록 하이브리드화하기 위해 서로에 대해 충분히 상보적인 인접 뉴클레오티드의 2개의 역평행 가닥을 포함하는 이중-가닥 RNA 분자를 포함한다. "하이브리드화하는" 또는 "하이브리드화"는 통상적으로 2개의 폴리뉴클레오티드의 상보적 염기들 사이의 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 수소 결합)을 통해 상보적인 폴리뉴클레오티드의 짝형성(pairing)을 지칭한다. 표적 서열(예를 들어, 표적 mRNA)에 실질적으로 상보적인 서열을 갖는 영역을 포함하는 가닥은 "안티센스 가닥"으로 지칭된다. "센스 가닥"은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 가닥을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥은 표적 서열과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 영역을 포함할 수 있다.
이중-가닥 RNA 분자는 리보뉴클레오티드의 리보스 당, 염기 또는 백본 성분, 예컨대 본 명세서에 기술되거나 당 업계에 공지된 것에 대한 변형을 포함하는, 리보뉴클레오티드에 대한 화학적 변형을 포함할 수 있다. 이중-가닥 RNA 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, 등)에 사용된, 임의의 상기 변형은 본 개시내용의 목적 상 용어 "이중-가닥 RNA"에 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 제1 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제2 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되어 특정 조건, 예컨대 생리학적 조건하에 이중체 영역을 형성할 수 있는 경우, 제1 서열은 제2 서열에 대해 "상보적"이다. 다른 이러한 조건은 당업자에게 공지된 보통 또는 엄격한 하이브리드화 조건을 포함할 수 있다. 제1 서열 염기쌍을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 임의의 미스매치 없이 하나 또는 두 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 제2 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 쌍을 이루는 경우, 제1 서열은 제2 서열에 대해 완전히 상보적인(100% 상보적인) 것으로 간주된다. 서열이 표적 서열에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적인 경우, 서열은 표적 서열에 대해 "실질적으로 상보적"이다. 상보성 백분율은 제2 또는 표적 서열의 상응하는 위치에서 염기에 상보적인 제1 서열의 염기 수를 제1 서열의 총 길이로 나눔으로써 계산될 수 있다. 또한, 2개의 서열이 하이브리드화될 때 30개의 염기쌍 이중체 영역에 대해 5, 4, 3, 또는 2개 이하의 미스매치가 존재하면, 서열은 또 다른 서열에 실질적으로 상보적이라고 말할 수 있다. 일반적으로, 본원에 정의된 바와 같이, 임의의 뉴클레오티드 오버행이 존재하는 경우, 이러한 오버행의 서열은 두 서열 사이의 상보성 정도를 결정할 때 고려되지 않는다. 예를 들어, 하이브리드화하여 각 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는 19개의 염기쌍 이중체 영역을 형성하는 21개 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥 및 21개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥은 본 명세서에서 사용되는 용어와 완전히 상보적인 것으로 간주된다.
일부 실시형태에서, 안티센스 가닥의 영역은 표적 유전자 서열(예를 들어, 표적 mRNA)의 영역에 완전히 상보적인 서열을 포함한다. 상기 실시형태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 서열에 완전히 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 다른 이러한 실시형태에서, 센스 가닥은 센스 및 안티센스 가닥에 의해 형성된 이중체 영역에서 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 미스매치를 갖는 안티센스 가닥의 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 임의의 미스매치는 말단 영역내에서 (예를 들어, 가닥의 5' 및/또는 3' 말단의 6, 5, 4, 3, 또는 2개의 뉴클레오티드내에서) 발생하는 것이 바람직하다. 일 실시형태에서, 센스 및 안티센스 가닥으로부터 형성된 이중체 영역에서 임의의 미스매치는 안티센스 가닥의 5' 말단의 6, 5, 4, 3, 또는 2개의 뉴클레오티드 내에서 발생한다.
특정 실시형태에서, 이중-가닥 RNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 이중체 영역을 형성하기 위해 하이브리드화되지만 그렇지 않으면 연결되지 않은 2개의 분리된 분자일 수 있다. 2개의 분리된 가닥으로부터 형성된 이러한 이중-가닥 RNA 분자는 "작은 간섭 RNA" 또는 "짧은 간섭 RNA"(siRNA)로 지칭된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작제물은 siRNA를 포함한다.
다른 실시형태에서, 하이브리드화하여 이중체 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 단일 RNA 분자의 일부일 수 있으며, 즉 센스 및 안티센스 가닥은 단일 RNA 분자의 자기-상보성 영역의 일부이다. 이러한 경우에, 단일 RNA 분자는 이중체 영역(줄기 영역으로도 지칭됨) 및 루프 영역을 포함한다. 센스 가닥의 3' 말단은 짝없는 뉴클레오티드의 인접 서열에 의해 안티센스 가닥의 5' 말단에 연결되며, 이는 루프 영역을 형성할 것이다. 루프 영역은 전형적으로 안티센스 가닥이 센스 가닥과 염기쌍을 형성하여 이중체 또는 줄기 영역을 형성할 수 있도록 RNA 분자가 그 자체로 접히는 것을 허용하기에 충분한 길이를 갖는다. 루프 영역은 약 3 내지 약 25개, 약 5 내지 약 15개, 또는 약 8 내지 약 12개의 짝없는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 적어도 부분적으로 자기-상보성 영역을 갖는 이러한 RNA 분자는 "짧은 헤어핀 RNA"(shRNAs)으로 지칭된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작제물은 shRNA를 포함한다. 단일한, 적어도 부분적으로 자기-상보성 RNA 분자의 길이는 약 40개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 약 45개의 뉴클레오티드 내지 약 85개의 뉴클레오티드, 또는 약 50의 뉴클레오티드 내지 약 60개의 뉴클레오티드일 수 있으며, 각각 본원에 인용된 길이를 갖는 이중체 영역 및 루프 영역을 포함한다.
본 발명의 RNAi 작제물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 표적 유전자 서열에 실질적으로 또는 완전히 상보적인 서열을 갖는 영역을 포함한다. 표적 유전자 서열은 일반적으로 폴리펩타이드에 대한 불완전한 또는 완전한 암호화 서열을 포함하는 핵산 서열을 지칭한다. 표적 유전자 서열은 또한 5' 또는 3'의 비 번역 영역(UTR)과 같은 비 암호화 영역을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 표적 유전자 서열은 메신저 RNA(mRNA) 서열이다. mRNA 서열은 단백질, 단백질 변이체, 또는 임의의 종(예를 들어, 마우스, 래트, 비-인간 영장류, 인간)으로부터의 이소형을 암호화하는, 스플라이스 변이체를 포함하는 임의의 메신저 RNA 서열을 지칭한다. 일 실시형태에서, 표적 유전자 서열은 인간 단백질을 암호화하는 mRNA 서열이다. 표적 유전자 서열은 또한 tRNA 서열, 마이크로RNA 서열, 또는 바이러스 RNA 서열과 같은, mRNA 서열 이외의 RNA 서열일 수 있다.
RNAi 작제물의 안티센스 가닥의 영역은 표적 유전자 서열의 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적이거나 완전히 상보적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥이 상보성 영역을 포함하는 유전자 서열의 표적 영역은 약 15 내지 약 30개의 연속 뉴클레오티드, 약 16 내지 약 28개의 연속 뉴클레오티드, 약 18 내지 약 26개의 연속 뉴클레오티드, 약 17 내지 약 24개의 연속 뉴클레오티드, 약 19 내지 약 30개의 연속 뉴클레오티드, 약 19 내지 약 25개의 연속 뉴클레오티드, 약 19 내지 약 23개의 연속 뉴클레오티드, 또는 약 19 내지 약 21개의 연속 뉴클레오티드의 범위일 수 있다.
RNAi 작제물의 센스 가닥은 전형적으로 안티센스 가닥의 서열에 충분히 상보적인 서열을 포함하여, 2개의 가닥이 생리학적 조건 하에서 하이브리드화하여 이중체 영역을 형성한다. "이중체 영역"은 두 폴리뉴클레오티드 사이에 이중체를 생성하기 위해 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍형성 또는 다른 수소 결합 상호작용에 의해 서로 염기쌍을 형성하는 2개의 상보적 또는 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 예를 들어, 다이서(Dicer) 효소 및/또는 RISC 복합체를 관여시킴으로써 RNAi 작제물의 이중체 영역은 RNAi 작제물이 RNA 간섭 경로에 진입할 수 있도록 충분한 길이를 가져야 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이중체 영역은 길이가 약 15 내지 약 30개의 염기쌍이다. 이 범위 내의 이중체 영역에 대한 다른 길이도 또한 적합하며, 예컨대 약 15 내지 약 28개의 염기쌍, 약 15 내지 약 26개의 염기쌍, 약 15 내지 약 24개의 염기쌍, 약 15 내지 약 22개의 염기쌍, 약 17 내지 약 28개의 염기쌍, 약 17 내지 약 26개의 염기쌍, 약 17 내지 약 24개의 염기쌍, 약 17 내지 약 23개의 염기쌍, 약 17 내지 약 21개의 염기쌍, 약 19 내지 약 25개의 염기쌍, 약 19 내지 약 23개의 염기쌍, 또는 약 19 내지 약 21개의 염기쌍이다. 일 실시형태에서, 이중체 영역은 길이가 약 17 내지 약 24개의 염기쌍이다. 또 다른 실시형태에서, 이중체 영역은 길이가 약 19 내지 약 21개의 염기쌍이다. 특정 실시형태에서, 이중체 영역은 길이가 약 19개의 염기쌍이다. 다른 실시형태에서, 이중체 영역은 길이가 약 21개의 염기쌍이다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥이 2개의 별개의 분자(예를 들어, RNAi 작제물이 siRNA를 포함함)인 실시형태의 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 이중체 영역의 길이와 동일한 길이일 필요는 없다. 예를 들어, 하나 또는 양쪽 모두의 가닥은 이중체 영역보다 길 수 있고, 이중체 영역에 인접한 하나 이상의 짝없는 뉴클레오티드 또는 미스매치를 갖는다. 따라서, 일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 적어도 하나의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "뉴클레오티드 오버행"은 가닥의 말단에서 짝없는 뉴클레오티드 또는 이중체 영역을 넘어 연장되는 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 오버행은 전형적으로 한 가닥의 3' 말단이 다른 가닥의 5' 말단을 넘어 연장될 때 또는 한 가닥의 5' 말단이 다른 가닥의 3' 말단을 넘어 연장될 때 생성된다. 뉴클레오티드 오버행의 길이는 일반적으로 1 내지 6개의 뉴클레오티드, 1 내지 5개의 뉴클레오티드, 1 내지 4개의 뉴클레오티드, 1 내지 3개의 뉴클레오티드, 2 내지 6개의 뉴클레오티드, 2 내지 5개의 뉴클레오티드, 또는 2 내지 4개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오티드 오버행은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 뉴클레오티드를 포함한다. 하나의 특정 실시형태에서, 뉴클레오티드 오버행은 1 내지 4개의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 뉴클레오티드 오버행은 2개의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정한 다른 실시형태에서, 뉴클레오티드 오버행은 단일 뉴클레오티드를 포함한다.
오버행 내의 뉴클레오티드는 본원에 기재된 리보뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 오버행의 뉴클레오티드는 2'-변형된 뉴클레오티드(예를 들어 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드), 데옥시리보뉴클레오티드, 반전된 뉴클레오티드(예를 들어 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드), 또는 이들의 조합이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 오버행의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어, 데옥시티미딘이다. 다른 실시형태에서, 오버행의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합이다. 다른 실시형태에서, 오버행은 5'-우리딘-우리딘-3'(5'-UU-3') 디뉴클레오티드를 포함한다. 상기 실시형태에서, UU 디뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 2'-변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 오버행은 5'-데옥시티미딘-데옥시티미딘-3'(5'-dTdT-3') 디뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드 오버행이 안티센스 가닥에 존재할 경우, 오버행의 뉴클레오티드는 표적 유전자 서열에 상보적일 수 있거나, 표적 유전자 서열과 미스매치를 형성할 수 있거나, 또는 일부 다른 서열(예를 들어, 폴리피리미딘 또는 폴리퓨린 서열, 예컨대, UU, TT, AA, GG 등)을 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 오버행은 하나 또는 양쪽 모두의 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단에 있을 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥의 5' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행을 포함한다.
RNAi 작제물은 이중-가닥 RNA 분자의 한쪽 말단에 뉴클레오티드 오버행을 포함하고, 다른 쪽에 평활 말단을 포함할 수 있다. "평활 말단"은 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 분자의 말단에서 완전히 염기쌍을 이루고 이중체 영역을 넘어 연장되는 짝없는 뉴클레오티드가 없음을 의미한다. 일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행을 포함하고, 센스 가닥의 5' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 평활 말단을 포함한다. 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행을 포함하고, 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단에 평활 말단을 포함한다. 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 이중-가닥 RNA 분자의 양쪽 말단에 평활 말단을 포함한다. 상기 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 길이가 동일하고, 이중체 영역은 센스 및 안티센스 가닥과 길이가 동일하다(즉, 분자는 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥임).
본 발명의 RNAi 작제물의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이, 약 19 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이, 약 18 내지 약 28개의 뉴클레오티드 길이, 약 19 내지 약 27개의 뉴클레오티드 길이, 약 19 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이, 약 19 내지 약 23개의 뉴클레오티드 길이, 약 19 내지 약 21개의 뉴클레오티드 길이, 약 21 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이, 또는 약 21 내지 약 23개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 또는 약 25개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 길이가 동일하지만, RNAi 작제물이 2개의 뉴클레오티드 오버행을 갖도록 가닥보다 짧은 이중체 영역을 형성한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, RNAi 작제물은 (i) 각각 21개 뉴클레오티드 길이인 센스 가닥 및 안티센스 가닥, (ii) 19개 염기쌍 길이인 이중체 영역, 및 (iii) 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단 모두의 2개의 짝없는 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 (i) 각각 23개 뉴클레오티드 길이인 센스 가닥 및 안티센스 가닥, (ii) 21개 염기쌍 길이인 이중체 영역, 및 (iii) 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단 모두의 2개의 짝없는 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 다른 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 동일한 길이를 가지며, 이중-가닥 분자의 양쪽 말단에 뉴클레오티드 오버행이 없도록 전체 길이에 걸쳐 이중체 영역을 형성한다. 하나의 이러한 실시형태에서, RNAi 작제물은 평활 말단이며, (i) 각각 21개의 뉴클레오티드 길이인, 센스 가닥 및 안티센스 가닥, 및 (ii) 21개 염기쌍 길이의 이중체 영역을 포함한다. 또 다른 이러한 실시형태에서, RNAi 작제물은 평활 말단이며, (i) 각각 23개의 뉴클레오티드 길이인, 센스 가닥 및 안티센스 가닥, 및 (ii) 23개의 염기쌍 길이의 이중체 영역을 포함한다.
다른 실시형태에서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 다른 가닥보다 길고, 두 가닥은 RNAi 작제물이 적어도 하나의 뉴클레오티드 오버행을 포함하도록 짧은 가닥의 길이와 동일한 길이를 갖는 이중체 영역을 형성한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, RNAi 작제물은 (i) 19개의 뉴클레오티드 길이인, 센스 가닥, (ii) 21개의 뉴클레오티드 길이인, 안티센스 가닥, (iii) 19개의 염기쌍 길이의 이중체 영역, 및 (iv) 안티센스 가닥의 3' 말단에서 2개의 짝없는 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 (i) 21개의 뉴클레오티드 길이인, 센스 가닥, (ii) 23개의 뉴클레오티드 길이인, 안티센스 가닥, (iii) 21개의 염기쌍 길이의 이중체 영역, 및 (iv) 안티센스 가닥의 3' 말단에서 2개의 짝없는 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다.
본 발명의 RNAi 작제물은 바람직하게는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. "변형된 뉴클레오티드"는 뉴클레오시드, 핵염기, 펜토스 고리, 또는 포스페이트 기에 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 변형된 뉴클레오티드는 아데노신 모노포스페이트, 구아노신 모노포스페이트, 우리딘 모노포스페이트, 및 시티딘 모노포스페이트를 함유하는 리보뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 그러나 RNAi 작제물은 변형된 뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 조합을 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드를 이중-가닥 RNA 분자의 하나 또는 양쪽 가닥에 통합하면, 예를 들어, 뉴클레아제 및 다른 분해 과정에 대한 분자의 감수성을 감소시킴으로써 RNA 분자의 생체내 안정성을 향상시킬 수 있다. 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위한 RNAi 작제물의 효능은 또한 변형된 뉴클레오티드의 혼입에 의해, 특히 본원에 더욱 상세히 기술된 바와 같이 특정 패턴으로 혼입될 때, 향상될 수 있다.
특정 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 리보스 당의 변형을 갖는다. 이러한 당 변형은 펜토스 고리의 2' 및/또는 5' 위치에서의 변형뿐만 아니라 이환식 당 변형을 포함할 수 있다. 2'-변형된 뉴클레오티드는 OH 이외의 2' 위치에 치환기를 갖는 펜토스 고리를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 2'-변형은 2'-H(예를 들어 데옥시리보뉴클레오티드), 2'-O-알킬(예를 들어 O-C1-C10 또는 O-C1-C10 치환된 알킬), 2'-O-알릴(O-CH2CH=CH2), 2'-C-알릴, 2'-데옥시-2'-플루오로(또한 2'-F 또는 2'-플루오로로 지칭됨), 2'-O-메틸(OCH3), 2'-O-메톡시에틸(O-(CH2)2OCH3), 2'-OCF3, 2'-O(CH2)2SCH3, 2'-O-아미노알킬, 2'-아미노(예를 들어 NH2), 2'-O-에틸아민, 및 2'-아지도를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 펜토스 고리의 5' 위치에서의 변형은 5'-메틸 (R 또는 S); 5'-비닐, 및 5'-메톡시를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"이환식 당 변형"은 브릿지가 고리의 두 원자를 연결하여 제2 고리를 형성하여 이환식 당 구조를 생성하는 펜토스 고리의 변형을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이환식 당 변형은 펜토스 고리의 4' 및 2' 탄소 사이의 브릿지를 포함한다. 이환식 당 변형을 갖는 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드는 본원에서 이환식 핵산 또는 BNA로 지칭된다. 예시적인 이환식 당 변형은 α-L-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') 이환식 핵산(BNA); β-D-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') BNA(잠금 핵산(locked nucleic acid) 또는 LNA로도 지칭됨); 에틸렌옥시(4'-(CH2)2-O-2') BNA; 아미노옥시(4'-CH2-O-N(R)- 2') BNA; 옥시아미노(4'-CH2-N(R)-O-2') BNA; 메틸(메틸렌옥시)(4'-CH(CH3)-O-2') BNA(구속된 에틸(constrained ethyl) 또는 cEt로도 지칭됨); 메틸렌-티오(4'-CH2-S-2') BNA; 메틸렌-아미노(4'-CH2-N(R)-2') BNA; 메틸 탄소환식(4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA; 프로필렌 탄소환식(4'-(CH2)3-2') BNA; 및 메톡시(에틸렌옥시)(4'-CH(CH2OMe)-O-2') BNA(구속된 MOE 또는 cMOE로도 지칭됨)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 RNAi 작제물에 포함될 수 있는 이들 및 다른 당-변형된 뉴클레오티드는 미국 특허 제9,181,551호, 미국 특허 공개 번호 2016/0122761, 및 Deleavey and Damha, Chemistry and Biology, Vol. 19: 937-954, 2012에 기재되어 있으며, 이들은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 하나 이상의 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, 이환식 핵산(BNA), 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 하나 이상의 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 하나 이상의 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함한다.
RNAi 작제물의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다는 1개 또는 다수의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥내 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥내 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 특정 다른 실시형태에서, 센스 가닥내 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥내 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 이들 및 다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작제물의 가닥 중 하나 또는 둘 모두에 혼입된 변형된 뉴클레오티드는 핵염기(본원에서 "염기"로도 지칭됨)의 변형을 갖는다. "변형된 핵염기" 또는 "변형된 염기"는 자연 발생 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G) 및 피리미딘 염기 타이민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U) 이외의 염기를 지칭한다. 변형된 핵염기는 합성 및 천연 변형일 수 있고, 유니버셜 염기, 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 잔틴(X), 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸아데닌, 6-메틸구아닌, 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오타이민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 타이민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 변형된 염기는 유니버셜 염기이다. "유니버셜 염기"는 이중체 영역의 이중 나선 구조를 변경하지 않고 RNA 및 DNA에서 모든 천연 염기와 염기쌍을 무차별적으로 형성하는 염기 유사체를 지칭한다. 유니버셜 염기는 당업자에게 공지되어 있으며, 이노신, C-페닐, C-나프틸 및 다른 방향족 유도체, 아졸 카르복사미드, 및 니트로아졸 유도체, 예컨대 3-니트로피롤, 4-니트로인돌, 5-니트로인돌, 및 6-니트로인돌을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 RNAi 작제물에 포함될 수 있는 다른 적합한 변형된 염기는 Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., Vol. 10: 297-310, 2000 및 Peacock et al., J. Org. Chem., Vol. 76: 7295-7300, 2011에 기재된 것들을 포함하며, 이들은 둘 다 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 당업자는 구아닌, 시토신, 아데닌, 타이민, 및 우라실이 이러한 대체 핵 염기를 보유하는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 염기쌍 특성을 실질적으로 변경시키지 않으면서 다른 핵염기, 예컨대 상기 기재된 변형된 핵염기에 의해 대체될 수 있음을 잘 알고 있다.
일부 실시형태에서, RNAi 작제물의 센스 및 안티센스 가닥은 1개 이상의 무염기 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. "무염기 뉴클레오티드" 또는 "무염기 뉴클레오시드"는 리보스 당의 1' 위치에 핵염기가 결여된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드이다. 특정 실시형태에서, 무염기 뉴클레오티드는 RNAi 작제물의 센스 및/또는 안티센스 가닥의 말단으로 혼입된다. 일 실시형태에서, 센스 가닥은 이의 3' 말단, 이의 5' 말단, 또는 이의 3' 및 5' 말단 둘 다에서 말단 뉴클레오티드로서 무염기 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥은 이의 3' 말단, 이의 5' 말단, 또는 이의 3' 및 5' 말단 둘 다에서 말단 뉴클레오티드로서 무염기 뉴클레오티드를 포함한다. 무염기 뉴클레오티드가 말단 뉴클레오티드인 이러한 실시형태에서, 이는 반전된 뉴클레오티드일 수 있다 - 즉, 천연의 3'-5' 뉴클레오티드간 연결 대신 3'-3' 뉴클레오티드간 연결(가닥의 3' 말단에 있을 때)을 통해 또는 5'-5' 뉴클레오티드간 연결(가닥의 5' 말단에 있을 때)을 통해 인접한 뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 또한, 무염기 뉴클레오티드는 당 변형, 예컨대, 전술한 임의의 당 변형을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 무염기 뉴클레오티드는 2'-변형, 예컨대, 2'-플루오로 변형, 2'-O-메틸 변형, 또는 2'-H (데옥시) 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 무염기 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 무염기 뉴클레오티드는 2'-H 변형을 포함한다(즉, 데옥시 무염기 뉴클레오티드임).
본 발명자들은 특정 패턴에 따라 RNAi 작제물로 변형된 뉴클레오티드를 혼입하자 생체내에서 개선된 유전자 사일런싱 활성을 갖는 RNAi 작제물이 생성됨을 발견하였다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작제물은 적어도 15개의 염기쌍의 이중체 영역을 형성하도록 서로에 대해 충분히 상보적인 서열을 포함하는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하고,
* (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 7, 및 14번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고;
* (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 8 내지 11 및 13번과 쌍을 이룬 위치에서의 센스 가닥의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고;
* 센스 가닥과 안티센스 가닥은 각각 총 7개를 초과하는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드를 갖지 않는다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작제물은 적어도 19개의 염기쌍의 이중체 영역을 형성하도록 서로에 대해 충분히 상보적인 서열을 포함하는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하고,
* (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 7, 및 14번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고, (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 4, 6, 10, 및 12번의 뉴클레오티드는 선택적으로 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥의 다른 모든 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드가 아닌 변형된 뉴클레오티드이고;
* (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 8 내지 11, 및 13번과 쌍을 이룬 위치에서의 센스 가닥의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 3 및 5번과 쌍을 이룬 위치에서의 센스 가닥의 뉴클레오티드는 선택적으로 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; 센스 가닥의 다른 모든 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드가 아닌 변형된 뉴클레오티드이다.
이러한 실시형태에서, 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드가 아닌 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택될 수 있다. 이러한 실시형태 및 다른 실시형태에서, 센스 가닥의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3' 말단과 5' 말단 둘 다에서의 말단 뉴클레오티드는 무염기 뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 실시형태에서, 무염기 뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드는 반전될 수 있다 - 즉, 천연의 3'-5' 뉴클레오티드간 연결 대신 3'-3' 뉴클레오티드간 연결(가닥의 3' 말단에 있을 때)을 통해 또는 5'-5' 뉴클레오티드간 연결(가닥의 5' 말단에 있을 때)을 통해 인접한 뉴클레오티드에 연결될 수 있다.
임의의 전술한 실시형태에서, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 7, 12, 및 14번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에서, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 4, 7,12, 및 14번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시형태에서, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 4, 6, 7, 12, 및 14번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시형태에서, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 4, 6, 7, 10, 12, 및 14번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. 대안적인 실시형태에서, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 7, 10, 12, 및 14번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. 특정한 다른 실시형태에서, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 4, 7, 10, 12, 및 14번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다.
임의의 전술한 실시형태에서, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 3, 8 내지 11, 및 13번과 쌍을 이룬 위치에서의 센스 가닥의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 5, 8 내지 11, 및 13번과 쌍을 이룬 위치에서의 센스 가닥의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에서, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 3, 5, 8 내지 11, 및 13번과 쌍을 이룬 위치에서의 센스 가닥의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다.
본 발명의 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 표적 유전자 서열에 상보적인 서열을 포함하고 센스 가닥은 이중체 영역을 형성하도록 안티센스 가닥의 서열에 충분히 상보적인 서열을 포함하고, RNAi 작제물은 식 (A)로 표시되는 구조를 포함하고,
5′-(NA)x NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NM NL NM NL NT(n)y-3′
3′-(NB)z NL NL NL NL NL NF NL NM NL NM NL NL NF NM NL NM NL NF NL-5′
(A)
식에서,
5'에서 3'의 방향으로 열거된 윗 가닥은 센스 가닥이고 3'에서 5'의 방향으로 열거된 아랫 가닥은 안티센스 가닥이고;
각각의 NF는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고;
각각의 NM은 독립적으로 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, 이환식 핵산(BNA), 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
각각의 NL은 독립적으로 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
NT는 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
x는 0 내지 4의 정수이나, 단, x가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이고, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 안티센스 가닥의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있고;
y는 0 내지 4의 정수이나, 단, y가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, 1개 이상의 n 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 변형된 또는 변형되지 않은 오버행 뉴클레오티드이고;
z는 0 내지 4의 정수이나, 단, z가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이고, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 센스 가닥에 존재할 때 NA 뉴클레오티드에 상보적일 수 있거나, 또는 센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 오버행 뉴클레오티드일 수 있다.
RNAi 작제물이 식 (A)로 표시되는 구조를 포함하는 일부 실시형태에서, 센스 가닥의 3' 말단에는 뉴클레오티드 오버행이 존재한다 - 즉, y는 1, 2, 3, 또는 4이다. 하나의 이러한 실시형태에서, y는 2이다. 센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드의 오버행이 존재하는(즉, y가 2인) 실시형태에서, x는 0이고 z는 2이거나, x는 1이고 z는 2이다. RNAi 작제물이 식 (A)로 표시되는 구조를 포함하는 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 포함한다(즉, y는 0이다). 센스 가닥의 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행이 존재하지 않는(즉, y가 0인) 이러한 실시형태에서, (i) x는 2, z는 4, (ii) x는 3, z는 4, (iii) x는 0, z는 2, (iv) x는 1, z는 2이거나, 또는 (v) x는 2, z는 2이다. x가 0보다 큰 임의의 실시형태에서, 센스 가닥의 5' 말단의 말단 뉴클레오티드인 NA 뉴클레오티드는 반전된 뉴클레오티드, 예컨대 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다.
RNAi 작제물이 식 (A)로 표시되는 구조를 포함하는 특정 실시형태에서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4 및 12번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4, 6, 및 12번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시형태에서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4, 6, 10, 및 12번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. 대안적인 실시형태에서, RNAi 작제물이 식 (A)로 표시되는 구조를 포함하는 특정 실시형태에서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 10 및 12번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. 관련 실시형태에서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4, 10, 및 12번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. RNAi 작제물이 식 (A)로 표시되는 구조를 포함하는 다른 대안적인 실시형태에서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4, 6, 및 10번의 NM은 각각 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이고, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 12번의 NM은 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. RNAi 작제물이 식 (A)로 표시되는 구조를 포함하는 일부 실시형태에서, 센스 가닥의 각각의 NM은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에서, 센스 가닥의 각각의 NM은 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. RNAi 작제물이 식 (A)로 표시되는 구조를 포함하는 또 다른 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다의 각각의 NM은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이다.
RNAi 작제물이 식 (A)로 표시되는 구조를 포함하는 임의의 전술한 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다의 각각의 NL은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 실시형태 및 전술한 임의의 실시형태에서, 식 (A)의 NT는 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 표적 유전자 서열에 상보적인 서열을 포함하고 센스 가닥은 이중체 영역을 형성하도록 안티센스 가닥의 서열에 충분히 상보적인 서열을 포함하고, RNAi 작제물은 식 (B)로 표시되는 구조를 포함하고,
5′-(NA)x NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NL NL NL NL NT(n)y-3′
3′-(NB)z NL NL NL NL NL NF NL NF NL NL NL NL NF NF NL NF NL NF NL-5′
(B)
식에서,
5'에서 3'의 방향으로 열거된 윗 가닥은 센스 가닥이고 3'에서 5'의 방향으로 열거된 아랫 가닥은 안티센스 가닥이고;
각각의 NF는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
각각의 NL은 독립적으로 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
NT는 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
x는 0 내지 4의 정수이나, 단, x가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이고, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 안티센스 가닥의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있고;
y는 0 내지 4의 정수이나, 단, y가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, 1개 이상의 n 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 변형된 또는 변형되지 않은 오버행 뉴클레오티드이고;
z는 0 내지 4의 정수이나, 단, z가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이고, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 센스 가닥에 존재할 때 NA 뉴클레오티드에 상보적일 수 있거나, 또는 센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 오버행 뉴클레오티드일 수 있다.
RNAi 작제물이 식 (B)로 표시되는 구조를 포함하는 일부 실시형태에서, 센스 가닥의 3' 말단에는 뉴클레오티드 오버행이 존재한다 - 즉, y는 1, 2, 3, 또는 4이다. 하나의 이러한 실시형태에서, y는 2이다. 센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드의 오버행이 존재하는(즉, y가 2인) 실시형태에서, x는 0이고 z는 2이거나, x는 1이고 z는 2이다. RNAi 작제물이 식 (B)로 표시되는 구조를 포함하는 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 포함한다(즉, y는 0이다). 센스 가닥의 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행이 존재하지 않는(즉, y가 0인) 이러한 실시형태에서, (i) x는 2, z는 4, (ii) x는 3, z는 4, (iii) x는 0, z는 2, (iv) x는 1, z는 2이거나, 또는 (v) x는 2, z는 2이다. x가 0보다 큰 임의의 실시형태에서, 센스 가닥의 5' 말단의 말단 뉴클레오티드인 NA 뉴클레오티드는 반전된 뉴클레오티드, 예컨대 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다.
RNAi 작제물이 식 (B)로 표시되는 구조를 포함하는 임의의 전술한 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다의 각각의 NL은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 실시형태 및 전술한 임의의 실시형태에서, 식 (B)의 NT는 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 표적 유전자 서열에 상보적인 서열을 포함하고 센스 가닥은 이중체 영역을 형성하도록 안티센스 가닥의 서열에 충분히 상보적인 서열을 포함하고, RNAi 작제물은 식 (C)로 표시되는 구조를 포함하고,
5′-(Ab)x NL NL NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NM NL NM NL NT-3′
3′-NL NL NL NL NL NL NL NL NL NF NL NF NL NL NL NL NF NL NL NM NL NF NL-5′
(C)
식에서,
5'에서 3'의 방향으로 열거된 윗 가닥은 센스 가닥이고 3'에서 5'의 방향으로 열거된 아랫 가닥은 안티센스 가닥이고;
각각의 NF는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고;
각각의 NL은 독립적으로 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
각각의 NM은 독립적으로 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
NT는 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
x는 0 또는 1이고, Ab는 반전된 무염기 뉴클레오티드이다.
RNAi 작제물이 식 (C)로 표시되는 구조를 포함하는 특정 실시형태에서, 안티센스 가닥의 NM은 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. 이러한 실시형태 및 다른 실시형태에서, 센스 가닥의 각각의 NM은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이다. 대안적인 실시형태에서, 센스 가닥의 각각의 NM은 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. RNAi 작제물이 식 (C)로 표시되는 구조를 포함하는 일부 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다의 각각의 NM은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이다.
RNAi 작제물이 식 (C)로 표시되는 구조를 포함하는 임의의 전술한 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다의 각각의 NL은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 실시형태 및 전술한 임의의 실시형태에서, 식 (C)의 NT는 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, NT는 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드이고, x는 0이다. 또 다른 실시형태에서, NT는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이고, x는 1이다. 또 다른 실시형태에서, NT는 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드이고, x는 1이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작제물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 표적 유전자 서열에 상보적인 서열을 포함하고 센스 가닥은 이중체 영역을 형성하도록 안티센스 가닥의 서열에 충분히 상보적인 서열을 포함하고, RNAi 작제물은 식 (D)로 표시되는 구조를 포함하고,
5′-(NA)x NL NL NL NL NM NL NF NF NF NF NL NL NL NL NL NL NL NL NT(n)y-3′
3′-(NB)z NL NL NL NM NL NF NL NM NL NL NM NM NM NM NL NM NL NF NL-5′
(D)
식에서,
5'에서 3'의 방향으로 열거된 윗 가닥은 센스 가닥이고 3'에서 5'의 방향으로 열거된 아랫 가닥은 안티센스 가닥이고;
각각의 NF는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고;
각각의 NM은 독립적으로 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, 이환식 핵산(BNA), 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
각각의 NL은 독립적으로 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
NT는 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
x는 0 내지 4의 정수이나, 단, x가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이고, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 안티센스 가닥의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있고;
y는 0 내지 4의 정수이나, 단, y가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, 1개 이상의 n 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 변형된 또는 변형되지 않은 오버행 뉴클레오티드이고;
z는 0 내지 4의 정수이나, 단, z가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이고, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 센스 가닥에 존재할 때 NA 뉴클레오티드에 상보적일 수 있거나, 또는 센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 오버행 뉴클레오티드일 수 있다.
RNAi 작제물이 식 (D)로 표시되는 구조를 포함하는 일부 실시형태에서, 센스 가닥의 3' 말단에는 뉴클레오티드 오버행이 존재한다 - 즉, y는 1, 2, 3, 또는 4이다. 하나의 이러한 실시형태에서, y는 2이다. 센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드의 오버행이 존재하는(즉, y가 2인) 실시형태에서, x는 0이고 z는 2이거나, x는 1이고 z는 2이다. RNAi 작제물이 식 (D)로 표시되는 구조를 포함하는 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 포함한다(즉, y는 0이다). 센스 가닥의 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행이 존재하지 않는(즉, y가 0인) 이러한 실시형태에서, (i) x는 2, z는 4, (ii) x는 3, z는 4, (iii) x는 0, z는 2, (iv) x는 1, z는 2이거나, 또는 (v) x는 2, z는 2이다. x가 0보다 큰 임의의 실시형태에서, 센스 가닥의 5' 말단의 말단 뉴클레오티드인 NA 뉴클레오티드는 반전된 뉴클레오티드, 예컨대 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다.
RNAi 작제물이 식 (D)로 표시되는 구조를 포함하는 특정 실시형태에서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4, 6, 8, 9, 및 16번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 7 및 12번의 NM은 각각 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4 및 6번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 7 내지 9번의 NM은 각각 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시형태에서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4, 6, 8, 9, 및 16번의 NM은 각각 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이고, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 7 및 12번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. RNAi 작제물이 식 (D)로 표시되는 구조를 포함하는 대안적인 실시형태에서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4, 6, 8, 9, 및 12번의 NM은 각각 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이고, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 7 및 16번의 NM은 각각 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. RNAi 작제물이 식 (D)로 표시되는 구조를 포함하는 특정한 다른 실시형태에서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 7, 8, 9, 및 12번의 NM은 각각 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이고, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4, 6, 및 16번의 NM은 각각 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. RNAi 작제물이 식 (D)로 표시되는 구조를 포함하는 이러한 실시형태 및 다른 실시형태에서, 센스 가닥의 NM은 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이다. 대안적인 실시형태에서, 센스 가닥의 NM은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이다.
RNAi 작제물이 식 (D)로 표시되는 구조를 포함하는 임의의 전술한 실시형태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다의 각각의 NL은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 실시형태 및 전술한 임의의 실시형태에서, 식 (D)의 NT는 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 RNAi 작제물은 또한, 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오티드간 연결"은 천연 3'에서 5'의 포스포디에스테르 연결 이외의 뉴클레오티드간 연결을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 인-함유 뉴클레오티드간 연결, 예컨대 포스포트리에스테르, 아미노알킬 포스포트리에스테르, 알킬포스포네이트(예를 들어, 메틸포스포네이트, 3'-알킬렌 포스포네이트), 포스피네이트, 포스포라미데이트(예를 들어, 3'-아미노포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트), 포스포로티오에이트(P=S), 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 보라노포스페이트이다. 일 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 2' 내지 5' 포스포디에스테르 연결이다. 다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 비-인-함유 뉴클레오티드간 연결이므로, 변형된 뉴클레오시드간 연결로 지칭될 수 있다. 이러한 비-인-함유 연결은 모르폴리노 연결 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 연결 (-O-Si(H)2-O-); 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 연결; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 연결; 알켄 함유 골격; 설파메이트 백본; 메틸렌메틸이미노(-CH2-N(CH3)-O-CH2-) 및 메틸렌히드라지노 연결; 설포네이트 및 설폰아미드 연결; 아미드 연결; 및 N, O, S 및 CH2 성분 부분이 혼합된 다른 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 펩타이드-기반 연결 (예를 들어, 아미노에틸글리신)이어서, 펩타이드 핵산 또는 PNA, 예컨대 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호에 기재된 것들을 생성한다. 다른 적당한 변형된 뉴클레오티드간 및 본 발명의 RNAi 작제물에 사용될 수 있는 뉴클레오시드간 연결은 미국 특허 제6,693,187호, 미국 특허 제9,181,551호, 미국 특허 공개 번호 2016/0122761, 및 Deleavey and Damha, Chemistry and Biology, Vol. 19: 937-954, 2012에 기재되어 있으며, 이들은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작제물은 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 RNAi 작제물의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 양쪽 가닥에 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 양쪽 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. RNAi 작제물은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 양쪽 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 3'- 및 5'-말단 양쪽에 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 양쪽 가닥의 3'-말단에 약 1 내지 약 6개 또는 그 이상의 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의) 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 양쪽 가닥의 5'-말단에 약 1 내지 약 6개 또는 그 이상의 (예를 들어, 약 1, 2, 5, 4, 5, 6개 또는 그 이상의) 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단의 말단 뉴클레오티드들 사이에 단일 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단의 말단 뉴클레오티드들 사이에 2개의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단의 말단 뉴클레오티드들 사이에 단일 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 및 안티센스 가닥의 3' 말단의 말단 뉴클레오티드들 사이에 단일 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단의 말단 뉴클레오티드들 사이에 2개의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결(즉, 안티센스 가닥의 3' 말단에 있는 제1 및 제2 뉴클레오티드간 연결에 있는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 및 5' 말단 둘 다의 말단 뉴클레오티드들 사이에 2개의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 및 5' 말단 둘 다의 말단 뉴클레오티드들 사이에 2개의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 및 센스 가닥의 5' 말단에 2개의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 및 5' 말단 둘 다의 말단 뉴클레오티드들 사이에 2개의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 및 센스 가닥의 3' 말단의 말단 뉴클레오티드들 사이에 2개의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 및 5' 말단 둘 다의 말단 뉴클레오티드들 사이에 2개의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및 센스 가닥의 3' 및 5' 말단 둘 다의 말단 뉴클레오티드들 사이에 2개의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결(즉, 안티센스 가닥의 5' 및 3' 말단 양쪽에서의 제1 및 제2 뉴클레오티드간 연결에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 및 센스 가닥의 5' 및 3' 말단 양쪽에서의 제1 및 제2 뉴클레오티드간 연결에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 및 5' 말단 둘 다의 말단 뉴클레오티드들 사이에 2개의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 및 센스 가닥의 3' 말단의 말단 뉴클레오티드들 사이에 단일 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 하나 또는 둘 모두의 가닥이 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결을 포함하는 임의의 실시형태에서, 가닥 내의 나머지 뉴클레오티드간 연결은 천연 3'에서 5'의 포스포디에스테르 연결일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 센스 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오티드간 연결은 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트로부터 선택되며, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트이다.
RNAi 작제물이 뉴클레오티드 오버행을 포함하는 실시형태에서, 오버행에서의 2개 이상의 짝없는 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결될 수 있다. 특정 실시형태에서, 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥의 3' 말단에서 뉴클레오티드 오버행 내의 모든 짝없는 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결된다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오티드 오버행 내의 모든 짝없는 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 임의의 뉴클레오티드 오버행에서 모든 짝없는 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결된다.
본 발명의 RNAi 작제물은 도 1에 도시된 화학적 변형 패턴 P1 내지 P30 중 임의의 하나를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 19 내지 23개의 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥 및 19 내지 23개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 서열은 19 내지 21개의 염기쌍의 이중체 영역을 형성하도록 서로에 대해 충분히 상보적이며, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 7, 및 14번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 8 내지 11 및 13번과 쌍을 이룬 위치에서의 센스 가닥의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; 센스 가닥과 안티센스 가닥은 각각 총 7개를 초과하는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드를 갖지 않고; RNAi 작제물은 센스 가닥과 안티센스 가닥의 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행을 갖는다.
일 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 7 및 9 내지 12번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1 내지 6, 8, 및 13 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 6, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 22개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드; 위치 8 및 10 내지 13번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 2 내지 7, 9, 및 14 내지 22번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 6, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 1 또는 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 7 및 9 내지 12번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1 내지 6, 8, 및 13 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 10, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8, 9, 11, 13, 및 15 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 7 및 9 내지 12번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1 내지 6, 8, 및 13 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 6, 7, 10, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 8, 9, 11, 13, 및 15 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행을 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 7 및 9 내지 12번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1 내지 6, 8, 및 13 내지 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행을 갖는다.
특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 19 내지 21개의 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥 및 21 내지 23개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 서열은 19 내지 21개의 염기쌍의 이중체 영역을 형성하도록 서로에 대해 충분히 상보적이며, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 7, 및 14번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 8 내지 11 및 13번과 쌍을 이룬 위치에서의 센스 가닥의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; 센스 가닥과 안티센스 가닥은 각각 총 7개를 초과하는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드를 갖지 않고; RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단/센스 가닥의 3' 말단에 평활 말단을 갖는다.
일 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 9 및 11 내지 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 8, 10, 및 15 내지 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 6, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 22개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드; 위치 10 및 12 내지 15번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 2 내지 9, 11, 및 16 내지 22번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 6, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 1 또는 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 9 및 11 내지 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1 내지 8, 10, 및 15 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 6, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 22개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1 및 22번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드; 위치 10 및 12 내지 15번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 2 내지 9, 11, 및 16 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 6, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 1 또는 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
하나의 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 19개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 7 및 9 내지 12번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1 내지 6, 8, 및 13 내지 19번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 17과 18번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 18과 19번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 6, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 19개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 7 및 9 내지 12번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 6, 8, 및 13 내지 18번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 19번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 17과 18번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 18과 19번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 6, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 9 및 11 내지 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 8, 10, 및 15 내지 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 22개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드; 위치 10 및 12 내지 15번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 2 내지 9, 11, 및 16 내지 22번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 1 또는 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 9 및 11 내지 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 8, 10, 및 15 내지 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 6, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 9, 11 내지 14, 17, 및 19번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 8, 10, 15, 16, 18 및 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 6, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 19개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 7 및 9 내지 12번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 6, 8, 및 13 내지 18번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 19번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 18과 19번의 뉴클레오티드들 사이 및 선택적으로 위치 17과 18번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 9 및 11 내지 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 8, 10, 및 15 내지 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 6, 7, 10, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 8, 9, 11, 13, 및 15 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 9 및 11 내지 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 8, 10, 및 15 내지 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 10, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8, 9, 11, 13, 및 15 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 9, 11 내지 14, 17, 및 19번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 8, 10, 15, 16, 18 및 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 10, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8, 9, 11, 13, 및 15 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 9 및 11 내지 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 8, 10, 및 15 내지 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 7, 10, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 13, 및 15 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
본 발명의 일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 19 내지 23개의 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥 및 19 내지 23개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 서열은 19 내지 21개의 염기 쌍의 이중체 영역을 형성하도록 서로에 대해 충분히 상보적이며, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 14, 및 16번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 10 내지 13번과 쌍을 이룬 위치에서의 센스 가닥의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; 센스 가닥과 안티센스 가닥은 각각 총 7개를 초과하는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드를 갖지 않는다. 이러한 실시형태에서, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단/센스 가닥의 3' 말단에 평활 말단을 갖는다. 대안적인 실시형태에서, RNAi 작제물은 센스 가닥과 안티센스 가닥의 3' 말단의 둘 다에서 뉴클레오티드 오버행을 갖는다.
하나의 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 7 및 9 내지 12번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 6, 8, 및 13 내지 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 6, 8, 9, 14 및 16번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 7, 10 내지 13, 15, 및 17 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 7 및 9 내지 12번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 6, 8, 및 13 내지 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 14 및 16번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8 내지 13, 15, 및 17 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 7 및 9 내지 12번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 6, 8, 및 13 내지 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 6, 14 및 16번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 7 내지 13, 15, 및 17 내지 23번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 22와 23번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 19개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 5 및 7 내지 10번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 위치 1 내지 4, 6, 및 11 내지 18번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 19번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 18과 19번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 4, 6, 8, 9, 14 및 16번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3, 5, 7, 10 내지 13, 15, 및 17 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 20개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드; 위치 8 내지 11번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 2 내지 7 및 12 내지 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 18과 19번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 19과 20번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 14 및 16번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8 내지 13, 15, 및 17 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 안티센스 가닥의 3' 말단에 1 또는 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 평활 말단을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 22개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드; 위치 8 내지 11번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 2 내지 7 및 12 내지 22번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 14 및 16번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8 내지 13, 15, 및 17 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 1 또는 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행을 갖는다.
본 발명의 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 19 내지 23개의 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥 및 19 내지 23개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 서열은 19 내지 21개의 염기쌍의 이중체 영역을 형성하도록 서로에 대해 충분히 상보적이며, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 7, 12, 및 14번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 10 내지 13번과 쌍을 이룬 위치에서의 센스 가닥의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; 센스 가닥과 안티센스 가닥은 각각 총 7개를 초과하는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드를 갖지 않고; RNAi 작제물은 센스 가닥과 안티센스 가닥의 3' 말단에 뉴클레오티드 오버행을 갖는다.
예를 들어, 일 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 7 내지 10번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 1 내지 6, 및 11 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 22개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드; 위치 8 내지 11번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 2 내지 7 및 12 내지 22번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 21과 22번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 센스 가닥의 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 1 또는 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행을 갖는다.
본 발명의 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 19 내지 21개의 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥 및 19 내지 21개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 서열은 19 내지 21개의 염기쌍의 이중체 영역을 형성하도록 서로에 대해 충분히 상보적이며, (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 2, 7, 12, 및 14번의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; (5' 말단으로부터 계산하는) 안티센스 가닥의 위치 10, 11, 및 13번과 쌍을 이룬 위치에서의 센스 가닥의 뉴클레오티드는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고; 센스 가닥과 안티센스 가닥은 각각 총 7개를 초과하는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드를 갖지 않는다. 하나의 이러한 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 9 및 11 내지 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 1 내지 8, 10, 및 15 내지 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 2개의 평활 말단을 갖는다.
또 다른 이러한 실시형태에서, RNAi 작제물은
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는); 위치 9 내지 12번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드; 및 위치 1 내지 8 및 13 내지 20번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드 및 위치 21번에 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 센스 가닥;
및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오티드 길이이고;
(ii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 2, 7, 12 및 14번에 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 위치 1, 3 내지 6, 8 내지 11, 13, 및 15 내지 21번에 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 갖고;
(iii) (5' 말단으로부터 계산하는) 위치 1과 2번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 2와 3번의 뉴클레오티드들 사이, 위치 19와 20번의 뉴클레오티드들 사이 및 위치 20과 21번의 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 안티센스 가닥;을 포함하고,
이때, RNAi 작제물은 2개의 평활 말단을 갖는다.
본 발명의 일부 실시형태에서, RNAi 작제물의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 안티센스 및 센스 가닥 둘 다의 5' 말단은 포스페이트 모이어티를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "포스페이트 모이어티"는 변형되지 않은 포스페이트(-O-P=O)(OH)OH) 뿐만 아니라 변형된 포스페이트를 포함하는 말단 포스페이트 기를 지칭한다. 변형된 포스페이트는 하나 이상의 O 및 OH 기가 H, O, S, N(R) 또는 알킬로 대체된 포스페이트를 포함하며, 여기서 R은 H, 아미노 보호 기 또는 치환되지 않은, 또는 치환된 알킬이다. 예시적인 포스페이트 모이어티는 5'-모노포스페이트; 5'디포스페이트; 5'-트리포스페이트; (7-메틸화 또는 비-메틸화된) 5'-구아노신 캡; 5'-아데노신 캡 또는 임의의 다른 변형된 또는 변형되지 않은 뉴클레오티드 캡 구조; 5'-모노티오포스페이트(포스포로티오에이트); 5'-모노디티오포스페이트(포스포로디티오에이트); 5'-알파-티오트리포스페이트; 5'-감마-티오트리포스페이트, 5'-포스포라미데이트; 5'-비닐포스페이트; 5'-알킬포스포네이트(예를 들어, 알킬= 메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필 등); 및 5'-알킬에테르포스포네이트(예를 들어, 알킬에테르 =메톡시메틸, 에톡시메틸, 등)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 RNAi 작제물에 통합될 수 있는 변형된 뉴클레오티드는 본원에 기재된 하나 이상의 화학적 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 리보스 당에 대한 변형뿐만 아니라 핵염기에 대한 변형을 가질 수 있다. 예로서, 변형된 뉴클레오티드는 2' 당 변형(예를 들어, 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸)을 포함할 수 있으며, 변형된 염기(예를 들어, 5-메틸 시토신 또는 슈도우라실)를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드에 통합될 때 변형된 뉴클레오티드간 또는 뉴클레오시드간 연결을 생성하는 5' 포스페이트에 대한 변형과 조합된 당 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 당 변형, 예컨대 2'-플루오로 변형, 2'-O-메틸 변형, 또는 이환식 당 변형, 뿐만 아니라 5' 포스포로티오에이트 기를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작제물의 하나 또는 둘 모두의 가닥은 2' 변형된 뉴클레오티드 또는 BNA 및 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결의 조합을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작제물의 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두는 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 및 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결의 조합을 포함한다.
특정 실시형태에서, RNAi 작제물의 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 1번의 뉴클레오티드는 A, dA, dU, U, 또는 dT를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 이중체 영역 내의 처음 세 개의 염기쌍 중 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 하나의 특정 실시형태에서, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 이중체 영역 내의 첫 번째 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
본 발명의 RNAi 작제물은 당 업계에 공지된 기술, 예를 들어 통상적인 핵산 고상 합성법을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다. RNAi 작제물의 폴리뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 전구체(예를 들어, 포스포라미다이트)를 사용하여 적합한 핵산 합성기에 조립될 수 있다. 자동화된 핵산 합성기는 Applied Biosystems(Foster City, CA)로부터의 DNA/RNA 합성기, BioAutomation(Irving,TX)로부터의 MerMade 합성기, 및 GE Healthcare Life Sciences(Pittsburgh, PA)로부터의 OligoPilot 합성기를 포함하여, 여러 공급업체에서 상업적으로 시판된다. 본 발명의 RNAi 작제물을 합성하는 예시적인 방법은 실시예 1에 기술되어 있다.
2' 실릴 보호기는 포스포라미다이트 화학을 통해 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 리보뉴클레오시드의 5' 위치에서 산 불안정한 디메톡시트리틸(DMT)과 함께 사용될 수 있다. 최종 탈보호 조건은 RNA 생성물을 현저하게 분해하지 않는 것으로 알려져 있다. 모든 합성은 임의의 자동 또는 수동 합성기에서 대규모, 중규모 또는 소규모로 수행될 수 있다. 합성은 또한 다수의 웰 플레이트, 컬럼 또는 유리 슬라이드에서 수행될 수 있다.
2'-O-실릴기는 플루오라이드 이온에의 노출을 통해 제거될 수 있으며, 플루오라이드 이온의 임의의 공급원, 예를 들어, 무기 반대이온과 짝을 이루는 플루오라이드 이온을 함유하는 염, 예를 들어, 세슘 플루오라이드 및 칼륨 플루오라이드 또는 유기 반대이온과 짝을 이루는 플루오라이드 이온을 함유하는 염, 예를 들어, 테트라알킬암모늄 플루오라이드를 포함할 수 있다. 탈보호 반응에서 크라운 에테르 촉매가 무기 플루오라이드와 함께 사용될 수 있다. 바람직한 플루오라이드 이온 공급원은 테트라부틸암모늄 플루오라이드 또는 아미노하이드로플루오라이드(예를 들어, 이극성 비양자성 용매, 예를 들어, 디메틸포름아미드에서 수성 HF를 트리에틸아민과 조합함)이다.
포스파이트 트리에스테르 및 포스포트리에스테르에 사용하기 위한 보호기의 선택은 플루오라이드에 대한 트리에스테르의 안정성을 변경할 수 있다. 포스포트리에스테르 또는 포스파이트 트리에스테르의 메틸 보호는 플루오라이드 이온에 대한 연결을 안정화시키고 공정 수율을 향상시킬 수 있다.
리보뉴클레오시드는 반응성 2' 히드록실 치환기를 갖기 때문에, 5'-O-디메톡시트리틸 보호기에 직교하는 보호기, 예를 들어, 산으로 처리하기에 안정적인 보호기로 RNA에서 반응성 2' 위치를 보호하는 것이 바람직할 수 있다. 실릴 보호기는 이 기준을 만족시키며, 최종 플루오르화물 탈보호 단계에서 용이하게 제거되어 최소 RNA 분해를 초래할 수 있다.
테트라졸 촉매는 표준 포스포라미다이트 커플링 반응에 사용될 수 있다. 바람직한 촉매는 예를 들어, 테트라졸, S-에틸-테트라졸, 벤질티오테트라졸, p-니트로페닐테트라졸을 포함한다.
당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 본원에 기재된 RNAi 작제물을 합성하는 추가의 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 원하는 화합물을 제공하기 위해 다양한 합성 단계가 교대 서열 또는 순서로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 RNAi 작제물을 합성하는데 유용한 다른 합성 화학 변형, (예를 들어, 염기에 존재하는 히드록실, 아미노, 등을 위한) 보호기 및 보호기 방법론(보호 및 탈 보호)은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 예컨대 문헌[R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); and L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)] 및 이들의 후속판에 기술된 것들을 포함한다. RNAi 작용제의 맞춤형 합성은 Dharmacon, Inc.(Lafayette, CO), AxoLabs GmbH(Kulmbach, 독일) 및 Ambion, Inc.(Foster City, CA)를 포함한 여러 판매회사에서도 이용 가능하다.
본 발명의 RNAi 작제물은 리간드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "리간드"는 다른 화합물 또는 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용할 수 있는 임의의 화합물 또는 분자를 지칭한다. 리간드와 또 다른 화합물 또는 분자의 상호작용은 생물학적 반응을 유발할 수 있거나(예를 들어, 신호 전달 캐스케이드를 개시하거나, 수용체 매개된 세포내이입을 유도하거나) 또는 물리적 연관일 수 있다. 리간드는 부착된 이중-가닥 RNA 분자의 하나 이상의 특성, 예컨대 RNA 분자의 약력학적, 약동학적, 결합, 흡수, 세포 분포, 세포 흡수, 전하 및/또는 제거 특성을 변형시킬 수 있다.
리간드는 혈청 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민, 저밀도 지단백질, 글로불린), 콜레스테롤 모이어티, 비타민(비오틴, 비타민 E, 비타민 B12), 폴레이트 모이어티, 스테로이드, 담즙산(예를 들어, 콜린 산), 지방산(예를 들어, 팔미트 산, 미리스트 산), 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 시클로덱스트린 또는 히알루론산), 글리코시드, 인지질 또는 항체 또는 이의 결합 단편(예를 들어, 특정 세포 유형, 예컨대 간에 RNAi 작제물을 표적화하는 항체 또는 결합 단편)을 포함할 수 있다. 리간드의 다른 예는 염료, 삽입제(예를 들어, 아크리딘), 가교제(예를 들어, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다환 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예를 들어, EDTA), 친유성 분자, 예를 들어 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜레산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진), 펩타이드(예를 들어, 안테나피디아 펩타이드, Tat 펩타이드, RGD 펩타이드), 알킬화제, 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예를 들어, PEG-40K), 폴리아미노산, 및 폴리아민(예를 들어, 스페르민, 스퍼미딘)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 리간드는 엔도좀분해 특성을 갖는다. 엔도좀분해 리간드는 엔도좀의 용해 및/또는 본 발명의 RNAi 작제물 또는 이의 성분의 엔도좀에서 세포의 세포질로의 이동을 촉진한다. 엔도좀분해 리간드는 pH 의존적 막 활성 및 발암성을 나타내는 다중 양이온성 펩타이드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 일 실시형태에서, 엔도좀분해 리간드는 엔도좀 pH에서 이의 활성 형태를 가정한다. "활성" 입체형태는 엔도좀분해 리간드가 엔도좀의 용해 및/또는 본 발명의 RNAi 작제물 또는 이의 성분의 엔도좀에서 세포의 세포질로의 이동을 촉진하는 입체형태이다. 예시적인 엔도좀분해 리간드는 GALA 펩타이드(Subbarao et al., Biochemistry, Vol. 26: 2964-2972, 1987), EALA 펩타이드(Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 118: 1581-1586, 1996), 및 이들의 유도체(Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1559: 56-68, 2002)를 포함한다. 일 실시형태에서, 엔도좀분해 성분은 pH의 변화에 반응하여 전하의 변화 또는 양자화를 겪을 화학기(예를 들어, 아미노산)를 함유할 수 있다. 엔도좀분해 성분은 선형 또는 분지형일 수 있다.
일부 실시형태에서, 리간드는 지질 또는 다른 소수성 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 리간드는 콜레스테롤 부분 또는 다른 스테로이드를 포함한다. 콜레스테롤 접합된 올리고뉴클레오티드는 이들의 비접합된 것보다 더 활성인 것으로 보고되었다(Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Development, Vol. 12: 103-228, 2002). 콜레스테롤 모이어티 및 핵산 분자와의 접합을 위한 다른 지질을 포함하는 리간드가 또한, 미국 특허 제7,851,615호; 제7,745,608호; 및 제7,833,992호에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또 다른 실시형태에서, 리간드는 폴레이트 모이어티를 포함한다. 폴레이트 모이어티에 접합된 폴리뉴클레오티드는 수용체-매개 세포내이입 경로를 통해 세포에 의해 흡수될 수 있다. 이러한 폴레이트-폴리뉴클레오티드 접합체는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는, 미국 특허 번호 제8,188,247호에 기재되어 있다.
리간드는 RNAi 작제물을 특정 조직 또는 세포 유형으로 표적화하여 해당 특정 조직 또는 세포 유형에서 표적 유전자의 발현을 선택적으로 억제할 수 있다. 일 실시형태에서, 리간드는 아래에서 더욱 상세히 기술된 바와 같은 다양한 접근법을 이용하여 간세포로 RNAi 작제물을 전달하는 것을 표적화한다. 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 표면 발현된 아시알로당단백질 수용체(ASGR) 또는 이의 성분(예를 들어, ASGR1, ASGR2)에 결합하는 리간드로 간세포로 표적화된다.
일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 간 세포 표면에 발현된 단백질에 결합하거나 이와 상호작용하는 리간드를 사용함으로써 간을 특이적으로 표적화할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 리간드는 간세포상에서 발현된 수용체, 예컨대 아시알로당단백질 수용체 및 LDL 수용체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 결합 단편(예를 들어, Fab, scFv))을 포함할 수 있다. 하나의 특정 실시형태에서, 리간드는 ASGR1 및/또는 ASGR2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 리간드는 ASGR1 및/또는 ASGR2에 특이적으로 결합하는 항체의 Fab 단편을 포함한다. "Fab 단편"은 1개의 면역글로불린 경쇄(즉, 경쇄 가변 영역(VL) 및 불변 영역(CL)) 및 1개의 면역글로불린 중쇄의 CH1 영역 및 가변 영역(VH)으로 구성된다. 또 다른 실시형태에서, 리간드는 ASGR1 및/또는 ASGR2에 특이적으로 결합하는 항체의 단쇄 가변 항체 단편(scFv 단편)을 포함한다. "scFv 단편"은 항체의 VH 및 VL 영역을 포함하고, 여기서 이들 영역은 단일 폴리펩타이드 쇄에 존재하고, 선택적으로 Fv가 항원 결합을 위하여 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 펩타이드 링커를 VH 및 VL 영역 사이에 포함한다. 본 발명의 RNAi 작제물을 간으로 표적화하는 리간드로서 이용될 수 있는 ASGR1에 특이적으로 결합하는 예시적인 항체 및 이의 결합 단편은 WIPO 공개 번호 제2017/058944호에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. ASGR1, LDL 수용체, 또는 본 발명의 RNAi 작제물에서 리간드로 사용하기에 적합한 기타 간 표면 발현 단백질에 특이적으로 결합하는 기타 항체 또는 이의 결합 단편은 상업적으로 이용 가능하다.
특정 실시형태에서, 리간드는 탄수화물을 포함한다. "탄수화물"은 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자를 갖는 적어도 6개의 탄소 원자(직쇄, 분지쇄 또는 환형일 수 있음)를 갖는 하나 이상의 단당류 단위로 이루어진 화합물을 지칭한다. 탄수화물은 당(예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류 및 약 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 단당류 단위를 함유하는 올리고당류) 및 다당류, 예컨대 전분, 글리코겐, 셀룰로오스 및 다당류 검을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 탄수화물은 펜토스, 헥소오스, 또는 헵토스로부터 선택된 단당류 및 이러한 단당류 단위를 포함하는 이당류 및 삼당류이다. 다른 실시형태에서, 리간드에 혼입된 탄수화물은 아미노 당, 예컨대 갈락토사민, 글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 및 N-아세틸글루코사민이다.
일부 실시형태에서, 리간드는 헥소오스 또는 헥소사민을 포함한다. 헥소오스는 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 또는 프룩토스로부터 선택될 수 있다. 헥소사민은 프룩토사민, 갈락토사민, 글루코사민, 또는 만노사민으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 리간드는 글루코스, 갈락토스, 갈락토사민, 또는 글루코사민을 포함한다. 일 실시형태에서, 리간드는 글루코스, 글루코사민, 또는 N-아세틸글루코사민을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 리간드는 갈락토스, 갈락토사민, 또는 N-아세틸-갈락토사민을 포함한다. 특정 실시형태에서, 리간드는 N-아세틸-갈락토사민을 포함한다. 글루코스, 갈락토스, 및 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)을 포함하는 리간드는 간세포의 표면에서 발현된 ASGR에 결합하므로 이러한 리간드가 화합물을 간세포로 표적화하는 데 특히 효과적이다. 예를 들어, D'Souza and Devarajan, J. Control Release, Vol. 203: 126-139, 2015 참고. 본 발명의 RNAi 작제물에 혼입될 수 있는 GalNAc- 또는 갈락토스-함유 리간드의 예는 미국 특허 제7,491,805호; 제8,106,022호; 및 제8,877,917호; 미국 특허 공개 번호 20030130186; 및 WIPO 공개 번호 WO2013166155에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시형태에서, 리간드는 다가 탄수화물 모이어티를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "다가 탄수화물 모이어티"는 다른 분자와 독립적으로 결합하거나 상호작용할 수 있는 2개 이상의 탄수화물 단위를 포함하는 모이어티를 지칭한다. 예를 들어, 다가 탄수화물 모이어티는 2개 이상의 상이한 분자 또는 동일한 분자 상의 2개 이상의 상이한 부위에 결합할 수 있는 탄수화물로 조성된 둘 이상의 결합 도메인을 포함한다. 탄수화물 모이어티의 원자가는 탄수화물 모이어티 내의 개별 결합 도메인의 수를 나타낸다. 예를 들어, 탄수화물 모이어티와 관련하여 용어 "1가," "2가," "3가," 및 "4가"는 각각 1, 2, 3 및 4개의 결합 도메인을 갖는 탄수화물 모이어티를 지칭한다. 다가 탄수화물 모이어티는 다가 락토오스 모이어티, 다가 갈락토스 모이어티, 다가 글루코스 모이어티, 다가 N-아세틸-갈락토사민 모이어티, 다가 N-아세틸-글루코사민 모이어티, 다가 만노스 모이어티, 또는 다가 푸코스 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 리간드는 다가 갈락토스 모이어티를 포함한다. 다른 실시형태에서, 리간드는 다가 N-아세틸-갈락토사민 모이어티를 포함한다. 이들 및 다른 실시형태에서, 다가 탄수화물 모이어티는 2가, 3가, 또는 4가일 수 있다. 상기 실시형태에서, 다가 탄수화물 모이어티는 바이-안테너리(bi-antennary) 또는 트리-안테너리(tri-antennary)일 수 있다. 하나의 특정 실시형태에서, 다가 N-아세틸-갈락토사민 모이어티는 3가 또는 4가이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 다가 갈락토스 모이어티는 3가 또는 4가이다. 본 발명의 RNAi 작제물에 혼입하기 위한 예시적인 3가 및 4가 GalNAc-함유 리간드는 하기에 상세하게 기재되어 있다.
리간드는 RNAi 작제물의 RNA 분자에 직접 또는 간접적으로 부착되거나 접합될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 리간드는 RNAi 작제물의 센스 또는 안티센스 가닥에 직접 공유적으로 부착된다. 다른 실시형태에서, 리간드는 링커를 통해 RNAi 작제물의 센스 또는 안티센스 가닥에 공유적으로 부착된다. 리간드는 본 발명의 RNAi 작제물의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥)의 핵염기, 당 모이어티, 또는 뉴클레오티드간 연결에 부착될 수 있다. 퓨린 핵염기 또는 이의 유도체에 대한 접합 또는 부착은 내환식 및 외환식 원자를 포함하는 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 특정 실시형태에서, 퓨린 핵염기의 2-, 6-, 7-, 또는 8-위치는 리간드에 부착된다. 피리미딘 핵염기 또는 이의 유도체에 대한 접합 또는 부착은 또한 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 일부 실시형태에서, 피리미딘 핵염기의 2-, 5-, 및 6-위치는 리간드에 부착될 수 있다. 뉴클레오티드의 당 모이어티에 대한 접합 또는 부착은 임의의 탄소 원자에서 일어날 수 있다. 리간드에 부착될 수 있는 당 모이어티의 예시적인 탄소 원자는 2', 3', 및 5' 탄소 원자를 포함한다. 1' 위치는 또한 무염기 뉴클레오티드와 같은 리간드에 부착될 수 있다. 뉴클레오티드간 연결은 또한 리간드 부착을 지지할 수 있다. 인-함유 연결(예를 들어, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오테이트, 포스포로아미데이트 등)의 경우, 리간드는 인 원자에 직접 또는 인 원자에 결합된 O, N 또는 S 원자에 부착될 수 있다. 아민- 또는 아미드-함유 뉴클레오시드간 연결(예를 들어, PNA)의 경우, 리간드는 아민 또는 아미드의 질소 원자 또는 인접한 탄소 원자에 부착될 수 있다.
특정 실시형태에서, 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 3' 또는 5' 말단에 부착될 수 있다. 특정 실시형태에서, 리간드는 센스 가닥의 5' 말단에 공유적으로 부착된다. 이러한 실시형태에서, 리간드는 센스 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드에 부착된다. 이러한 실시형태 및 다른 실시형태에서, 리간드는 센스 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드의 5'-위치에 부착된다. 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드가 센스 가닥의 5' 말단 뉴클레오티드이고 5'-5' 뉴클레오티드간 연결을 통해 인접 뉴클레오티드에 연결되는 실시형태에서, 리간드는 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드의 3'-위치에 부착될 수 있다. 다른 실시형태에서, 리간드는 센스 가닥의 3' 말단에 공유적으로 부착된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 리간드는 센스 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드에 부착된다. 이러한 특정 실시형태에서, 리간드는 센스 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드의 3'-위치에 부착된다. 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드가 센스 가닥의 3' 말단 뉴클레오티드이고 3'-3' 뉴클레오티드간 연결을 통해 인접 뉴클레오티드에 연결되는 실시형태에서, 리간드는 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드의 5'-위치에 부착될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 리간드는 센스 가닥의 3' 말단 근처에, 그러나 하나 이상의 말단 뉴클레오티드 전에(즉 1, 2, 3, 또는 4 말단 뉴클레오티드 전에) 부착된다. 일부 실시형태에서, 리간드는 센스 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드의 당의 2'-위치에 부착된다. 일부 실시형태에서, 리간드는 센스 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드의 당의 2'-위치에 부착된다.
특정 실시형태에서, 리간드는 링커를 통해 센스 또는 안티센스 가닥에 부착된다. "링커"는 리간드를 RNAi 작제물의 폴리뉴클레오티드 성분에 공유 결합시키는 원자 또는 원자 그룹이다. 링커는 약 1 내지 약 30개의 원자 길이, 약 2 내지 약 28개의 원자 길이, 약 3 내지 약 26개의 원자 길이, 약 4 내지 약 24개의 원자 길이, 약 6 내지 약 20개의 원자 길이, 약 7 내지 약 20개의 원자 길이, 약 8 내지 약 20개의 원자 길이, 약 8 내지 약 18개의 원자 길이, 약 10 내지 약 18개의 원자 길이, 및 약 12 내지 약 18개의 원자 길이일수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 이작용성 연결 모이어티를 포함할 수 있으며, 이는 일반적으로 2개의 작용기를 갖는 알킬 모이어티를 포함한다. 작용기 중 하나는 관심 화합물(예를 들어, RNAi 작제물의 센스 또는 안티센스 가닥)에 결합하도록 선택되고, 다른 하나는 본원에 기재된 리간드와 같은 임의의 선택된 기를 본질적으로 결합하도록 선택된다. 특정 실시형태에서, 링커는 사슬 구조 또는 반복 단위의 올리고머, 예컨대 에틸렌 글리콜 또는 아미노산 단위를 포함한다. 이작용성 연결 모이어티에 전형적으로 사용될 수 있는 작용기의 예는 친핵성 기와 반응하기 위한 친전자체 및 친전자성기와 반응하기 위한 친핵체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 이작용성 연결 모이어티는 아미노, 히드록실, 카르복실산, 티올, 불포화(예를 들어, 이중 또는 삼중 결합) 등을 포함한다.
본 발명의 RNAi 작제물에서 센스 또는 안티센스 가닥에 리간드를 부착시키는데 사용될 수 있는 링커는 피롤리딘, 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 6-아미노헥산산, 치환된 C1-C10 알킬, 치환된 또는 비치환된 C2-C10 알케닐 또는 치환된 또는 비치환된 C2-C10 알키닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 링커에 대한 바람직한 치환기는 히드록실, 아미노, 알콕시, 카르복시, 벤질, 페닐, 니트로, 티올, 티오알콕시, 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시형태에서, 링커는 절단가능하다. 절단성 링커는 세포 외부에서 충분히 안정하지만, 표적 세포로 진입시 절단되어, 링커가 함께 유지되는 두 부분을 해제하는 링커이다. 일부 실시형태에서, 절단성 링커는 표적 세포에서, 또는 대상체의 혈액에서보다 제1 기준 조건(예를 들어, 세포내 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있음) 하에, 또는 제2 기준 조건(예를 들어, 혈액 또는 혈청에서 발견된 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있음) 하에, 적어도 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 그 이상, 또는 적어도 100배 더 빨리 절단된다.
절단성 링커는 절단제, 예를 들어 pH, 산화환원 전위 또는 분해성 분자의 존재에 민감하다. 일반적으로, 절단제는 혈청 또는 혈액보다 세포 내에서 더 우세하거나 더 높은 수준 또는 활성으로 발견된다. 이러한 분해제의 예에는, 특정 기질에 대해 선택되거나, 또는 기질 특이성이 없는 산화환원제, 예를 들어 산화 또는 환원성 효소 또는 환원에 의해 산화환원 절단성 링커를 분해할 수 있는, 세포에 존재하는 환원제 예컨대 머캅탄; 에스테라제; 산성 환경, 예를 들어 pH 5 이하를 야기하는 환경을 생성할 수 있는 엔도좀 또는 작용제; 일반적인 산, 펩티다제(기질 특이적일 수 있음) 및 포스파타제로서 작용함으로써 산 절단성 링커를 가수분해 또는 분해할 수 있는 효소가 포함된다.
절단성 링커는 pH에 민감한 모이어티를 포함할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4인 반면, 평균 세포내 pH는 약 7.1~7.3 범위로, 약간 더 낮다. 엔도좀은 5.5~6.0의 범위의 더 산성인 pH를 가지며, 리소좀은 약 5.0의 훨씬 더 산성인 pH를 갖는다. 일부 링커는 바람직한 pH에서 절단되는 절단성 기를 가질 것이며, 이로써 세포 내부의 리간드로부터 또는 세포의 원하는 구획으로 RNA 분자를 방출할 수 있다.
링커는 특정 효소에 의해 절단될 수 있는 절단성 기를 포함할 수 있다. 링커에 포함된 절단성 기의 유형은 표적화될 세포에 의존할 수 있다. 예를 들어, 간-표적 리간드는 에스테르기를 포함하는 링커를 통해 RNA 분자에 연결될 수 있다. 간 세포는 에스테라제가 풍부하기 때문에, 링커는 에스테라제가 풍부하지 않은 세포 유형에서보다 간 세포에서 보다 효율적으로 절단될 것이다. 에스테라아제가 풍부한 다른 유형의 세포는 폐, 신장 피질 및 고환의 세포를 포함한다. 펩타이드 결합을 함유하는 링커는 간 세포 및 활막세포와 같은 펩티다아제가 풍부한 세포를 표적화할 때 사용될 수 있다.
일반적으로, 후보 절단성 링커의 적합성은 후보 링커를 절단하는 분해제(또는 조건)의 능력을 테스트함으로써 평가될 수 있다. 또한 혈액에서 또는 비-표적 조직과 접촉할 때 절단에 저항하는 능력에 대해 후보 절단성 링커를 시험하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 제1 조건과 제2 조건 사이의 절단에 대한 상대적 민감성을 결정할 수 있으며, 여기서 첫 번째 조건은 표적 세포에서 절단을 나타내는 것으로 선택되고, 두 번째는 다른 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들어 혈액 또는 혈청에서의 절단을 나타내는 것으로 선택된다. 평가는 무 세포 시스템, 세포, 세포 배양, 기관 또는 조직 배양, 또는 전체 동물에서 수행될 수 있다. 무 세포 또는 배양 조건에서 초기 평가를 수행하고 전체 동물에서 추가 평가를 통해 확인하는 것이 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유용한 후보 링커는 혈액 또는 혈청과 비교하여 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서) 세포에서(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서) 적어도 2, 4, 10, 20, 50, 70, 또는 100배 더 빨리 절단된다.
다른 실시형태에서, 산화환원 절단성 링커가 사용된다. 산화환원 절단성 링커는 환원 또는 산화시 절단된다. 환원성 절단기의 예는 이황화 연결기(-S-S-)이다. 후보 절단성 링커가 적합한 "환원적으로 절단성 링커,"인지, 또는 예를 들어 특정 RNAi 작제물 및 특정 리간드와 함께 사용하기에 적합한지를 결정하기 위해, 본원에 기재된 하나 이상의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 후보 링커는 디티오트레이톨 (DTT), 또는 당 업계에 공지된 다른 환원제와의 인큐베이션에 의해 평가될 수 있으며, 이는 세포, 예를 들어 표적 세포에서 관찰될 절단 속도를 모방한다. 후보 링커는 또한 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에서 평가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 후보 링커는 혈액에서 최대 10%까지 절단된다. 다른 실시형태에서, 유용한 후보 링커는 혈액과 비교하여 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서) 세포에서(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서) 적어도 2, 4, 10, 20, 50, 70, 또는 100배 더 빨리 분해된다.
또 다른 실시형태에서, 포스페이트기를 분해하거나 가수분해하는 작용제에 의해 절단되는 포스페이트 기반의 절단성 링커가 RNAi 작제물의 센스 또는 안티센스 가닥에 리간드를 공유적으로 부착시키는 데 이용된다. 세포에서 포스페이트기를 가수분해하는 작용제의 예는 세포에서 포스파타제와 같은 효소이다. 포스페이트-기반 절단성 기의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, 및 -O-P(S)(Rk)-S-이고, 여기서 Rk는 수소 또는 알킬일 수 있다. 특정 실시형태는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, 및 -O-P(S)(H)-S-를 포함한다. 다른 특정 실시형태는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이들 후보 링커는 상기 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
다른 실시형태에서, 링커는 산성 조건 하에서 절단되는 기인, 산 절단성 기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 산 절단성 기는 pH가 약 6.5 이하(예를 들어, 약 6.0, 5.5, 5.0 이하)인 산성 환경에서, 또는 일반적인 산으로서 작용할 수 있는 효소와 같은 작용제에 의해 절단된다. 세포에서, 엔도좀 및 리소좀과 같은 특정 저 pH 소기관은 산 절단성 기에 대한 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단성 연결기의 예는 히드라존, 에스테르 및 아미노산의 에스테르를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 산 절단성 기는 일반 화학식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)를 가질 수 있다. 특정 실시형태는 에스테르(알콕시 기)의 산소에 부착된 탄소가 아릴 기, 치환된 알킬기 또는 3차 알킬기, 예컨대 디메틸, 펜틸 또는 t-부틸인 경우이다. 이들 후보는 상기 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
다른 실시형태에서, 링커는 에스테르-기반 절단성 기를 포함할 수 있으며, 이는 효소, 예컨대 세포에서 에스테라제 및 아미다제에 의해 절단된다. 에스테르-기반 절단성 기의 예는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 기의 에스테르를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 에스테르 절단성 기는 일반 화학식 -C(O)O-, 또는 -OC(O)-를 가진다. 이들 후보 링커는 상기 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 링커는 펩타이드-기반 절단성 기를 포함할 수 있으며, 이는 세포에서 효소, 예컨대 펩티다제 및 프로테아제에 의해 절단된다. 펩타이드-기반 절단성 기는 아미노산 사이에 형성되어 올리고펩타이드(예를 들어, 디펩타이드, 트리펩타이드 등) 및 폴리펩타이드를 생성하는 펩타이드 결합이다. 펩타이드-기반 절단성 기는 아미드 기(-C(O)NH-)를 포함한다. 아미드 기는 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키닐렌 사이에서 형성될 수 있다. 펩타이드 결합은 아미노산 사이에 형성된 특별한 유형의 아미드 결합이며, 펩타이드 및 단백질을 생성한다. 펩타이드 기반 절단 기는 일반적으로 아미노산 사이에서 형성되어 펩타이드 및 단백질을 형성하는 펩타이드 결합(즉, 아미드 결합)에 제한된다. 펩타이드-기반 절단성 연결기는 일반 화학식 -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-을 가지며, 여기서 RA 및 RB는 2개의 인접한 아미노산의 측쇄이다. 이들 후보는 상기 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
본 발명의 RNAi 작제물에서 센스 또는 안티센스 가닥에 리간드를 부착하기에 적합한 다른 유형의 링커는 당 업계에 공지되어 있으며, 미국 특허 제7,723,509호; 제8,017,762호; 제8,828,956호; 제8,877,917호; 및 제9,181,551호에 기재되어 있는 링커를 포함할 수 있으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작제물의 센스 또는 안티센스 가닥에 공유적으로 부착된 리간드는 GalNAc 모이어티, 예를 들어 다가 GalNAc 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다가 GalNAc 모이어티는 3가 GalNAc 모이어티이며, 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다. 다른 실시형태에서, 다가 GalNAc 모이어티는 3가 GalNAc 모이어티이며, 센스 가닥의 5' 말단에 부착된다. 또 다른 실시형태에서, 다가 GalNAc 모이어티는 4가 GalNAc 모이어티이며, 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다. 또 다른 실시형태에서, 다가 GalNAc 모이어티는 4가 GalNAc 모이어티이며, 센스 가닥의 5' 말단에 부착된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작제물은 다음의 구조를 갖는 리간드를 포함한다:
Figure pct00001
바람직한 실시형태에서, 이 구조를 갖는 리간드는 링커, 예컨대, 본원에 기술된 링커를 통해 센스 가닥의 5' 말단에 공유적으로 부착된다. 일 실시형태에서, 링커는 아미노헥실 링커이다.
본 발명의 RNAi 작제물의 이중 가닥 RNA 분자에 부착될 수 있는 예시적인 3가 및 4가 GalNAc 모이어티 및 링커는 아래의 구조식 I 내지 IX에 제공된다. 본원에 열거된 식에서 "Ac"는 아세틸기를 나타낸다.
일 실시형태에서, RNAi 작제물은 다음의 화학식 I의 구조를 갖는 리간드 및 링커를 포함하고, 식에서 각각의 n은 독립적으로 1 내지 3, k는 1 내지 3, m은 1 또는 2, j는 1 또는 2이고, 리간드는 (물결 모양의 실선으로 표시된) 이중 가닥의 RNA 분자의 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다:
[화학식 I]
Figure pct00002
또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 다음의 화학식 II의 구조를 갖는 리간드 및 링커를 포함하고, 식에서 각각의 n은 독립적으로 1 내지 3, k는 1 내지 3, m은 1 또는 2, j는 1 또는 2이고, 리간드는 (물결 모양의 실선으로 표시된) 이중 가닥의 RNA 분자의 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다:
[화학식 II]
Figure pct00003
또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 다음의 화학식 III의 구조를 갖는 리간드 및 링커를 포함하고, 리간드는 (물결 모양의 실선으로 표시된) 이중 가닥의 RNA 분자의 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다:
[화학식 III]
Figure pct00004
또 다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 다음의 화학식 IV의 구조를 갖는 리간드 및 링커를 포함하고, 리간드는 (물결 모양의 실선으로 표시된) 이중 가닥의 RNA 분자의 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다:
[화학식 IV]
Figure pct00005
특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 다음의 화학식 V의 구조를 갖는 리간드 및 링커를 포함하고, 식에서 각각의 n은 독립적으로 1 내지 3, k는 1 내지 3이고, 리간드는 (물결 모양의 실선으로 표시된) 이중 가닥의 RNA 분자의 센스 가닥의 5' 말단에 부착된다:
[화학식 V]
Figure pct00006
다른 실시형태에서, RNAi 작제물은 다음의 화학식 VI의 구조를 갖는 리간드 및 링커를 포함하고, 식에서 각각의 n은 독립적으로 1 내지 3, k는 1 내지 3이고, 리간드는 (물결 모양의 실선으로 표시된) 이중 가닥의 RNA 분자의 센스 가닥의 5' 말단에 부착된다:
[화학식 VI]
Figure pct00007
하나의 특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 다음의 화학식 VII의 구조를 갖는 리간드 및 링커를 포함하고, 식에서 X = O 또는 S이고, 리간드는 (구불구불한 선으로 표시된) 이중 가닥의 RNA 분자의 센스 가닥의 5' 말단에 부착된다:
[화학식 VII]
Figure pct00008
일부 실시형태에서, RNAi 작제물은 다음의 화학식 VIII의 구조를 갖는 리간드 및 링커를 포함하고, 식에서 각각의 n은 독립적으로 1 내지 3이고, 리간드는 (물결 모양의 실선으로 표시된) 이중 가닥의 RNA 분자의 센스 가닥의 5' 말단에 부착된다:
[화학식 VIII]
Figure pct00009
특정 실시형태에서, RNAi 작제물은 다음의 화학식 IX의 구조를 갖는 리간드 및 링커를 포함하고, 리간드는 (물결 모양의 실선으로 표시된) 이중 가닥의 RNA 분자의 센스 가닥의 5' 말단에 부착된다:
[화학식 IX]
Figure pct00010
포스포로티오에이트 결합은 화학식 I 내지 IX 중 임의의 하나에 제시된 포스포디에스테르 결합을 대신하여 리간드 및 링커를 핵산 가닥에 공유적으로 연결할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 RNAi 작제물 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형을 포함한다. 이러한 조성물 및 제형은 이를 필요로 하는 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키는 데 유용하다. 임상적 적용이 고려되는 경우, 약제학적 조성물 및 제형은 의도한 적용에 적절한 형태로 제조될 수 있다. 일반적으로, 이것은 본질적으로 발열원뿐만 아니라 인간 또는 동물에게 해로울 수 있는 다른 불순물이 없는 조성물의 제조를 수반할 것이다.
구절 "제약상 허용가능한" 또는 "약리학적으로 허용가능한"은 동물 또는 인간에 투여시 이상 반응, 알러지 반응, 또는 다른 부작용을 생성하지 않는 분자 엔티티(entity) 및 조성물을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제"는 약제, 예컨대 인간에게 투여하기에 적합한 약제를 제형화하는데 사용하는데 허용가능한 용매, 완충제, 용액, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 활성인 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 본 발명의 RNAi 작제물과 불상용성인 경우를 제외하고, 치료적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충 활성 성분은 또한 조성물의 RNAi 작제물을 불활성화시키지 않는다면 조성물에 혼입될 수 있다.
약제학적 조성물의 제형화를 위한 조성물 및 방법은 투여 경로, 치료될 질환 또는 장애의 유형 및 정도, 또는 투여량을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 기준에 의존한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 의도된 전달 경로에 기초하여 제형화된다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 비경구 전달용으로 제형화된다. 비경구 전달 형태는 정맥 내, 동맥 내, 피하, 척수강 내, 복강 내 또는 근육 내 주사 또는 주입을 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥 내 전달용으로 제형화된다. 상기 실시형태에서, 약제학적 조성물은 지질-계 전달 비히클을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 피하 전달용으로 제형화된다. 상기 실시형태에서, 약제학적 조성물은 표적화 리간드(예를 들어, 본원에 기재된 GalNAc 함유 또는 항체 함유 리간드)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본원에 기재된 유효량의 RNAi 작제물을 포함한다. "유효량"은 유익하거나 바람직한 임상 결과를 생성하기에 충분한 양이다. 일부 실시형태에서, 유효량은 대상체의 특정 조직 또는 세포 유형(예를 들어, 간 또는 간세포)에서 표적 유전자 발현을 감소시키기에 충분한 양이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여는 표적 조직이 상기 경로를 통해 이용 가능한 한 임의의 공통 경로를 통해 이루어질 수 있다. 이러한 경로는 비경구(예를 들어, 피하, 근육 내, 복강 내 또는 정맥 내), 경구, 비강, 협측, 피내, 경피 및 설하 경로, 또는 간 조직으로의 직접 주사 또는 간문맥을 통한 전달을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 비경구 투여된다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥 내 투여된다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 피하 투여된다.
콜로이드 분산 시스템, 예컨대 거대 분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함한 지질-기반 시스템이 본 발명의 RNAi 작제물의 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 본 발명의 핵산의 전달에 적합한, 상업적으로 이용 가능한 지방 에멀젼은 Intralipid®(Baxter International Inc.), Liposyn®(Abbott Pharmaceuticals), Liposyn®II(Hospira), Liposyn®III(Hospira), Nutrilipid(B. Braun Medical Inc.), 및 기타 유사한 지질 에멀젼을 포함한다. 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기에 바람직한 콜로이드 시스템은 리포좀(즉, 인공 막 비히클)이다. 본 발명의 RNAi 작제물은 리포좀 내에 캡슐화될 수 있거나, 또는 리포좀, 특히 양이온성 리포좀과 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 RNAi 작제물은 지질, 특히 양이온성 지질에 복합체화될 수 있다. 적합한 지질 및 리포좀은 중성(예를 들어, 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE), 디미리스토일포스파티딜 콜린(DMPC), 및 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)), 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성(예를 들어, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤(DMPG)), 및 양이온성(예를 들어, 디올레오일테트라메틸아미노프로필(DOTAP) 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOTMA))을 포함한다. 이러한 콜로이드 분산 시스템의 제조 및 사용은 당 업계에 잘 알려져 있다. 예시적인 제형은 또한 미국 특허 제5,981,505호; 미국 특허 제6,217,900호; 미국 특허 제6,383,512호; 미국 특허 제5,783,565호; 미국 특허 제7,202,227호; 미국 특허 제6,379,965호; 미국 특허 제6,127,170호; 미국 특허 제5,837,533호; 미국 특허 제6,747,014호; 및 WO03/093449에 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작제물은 예를 들어, SNALP 또는 다른 핵산-지질 입자를 형성하기 위해 지질 제형으로 완전히 캡슐화된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "SNALP"는 안정한 핵산-지질 입자를 지칭한다. SNALP는 일반적으로 양이온성 지질, 비 양이온성 지질, 및 입자의 응집을 방지하는 지질(예를 들어, PEG-지질 접합체)을 함유한다. SNALP는 정맥 주사 후 연장된 순환 수명을 나타내고 말단 부위(예를 들어, 투여 부위와 물리적으로 분리된 부위)에 축적되기 때문에 전신 적용에 매우 유용하다. 핵산-지질 입자는 전형적으로 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 또는 약 70 nm 내지 약 90 nm의 평균 직경을 가지며, 실질적으로 비독성이다. 또한, 핵산-지질 입자에 존재할 때 핵산은 수용액에서 뉴클레아제에 의한 분해에 내성이 있다. 핵산-지질 입자 및 이의 제조 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,976,567호; 제5,981,501호; 제6,534,484호; 제6,586,410호; 제6,815,432호; 및 PCT 공개 번호 WO96/40964에 개시되어 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 예를 들어, 멸균 수용액 또는 분산액 그리고 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 일반적으로, 이들 제제는 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도로 멸균되고 유동적이다. 제제는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 적당한 용매 또는 분산 매질은 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유할 수 있다. 적절한 유동도(fluidity)는 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등에 의해 초래될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 조성물 중 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 초래될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 원하는 양의 임의의 다른 성분과 함께(예를 들어 상기 열거한 바와 같이) 적절한 양의 활성 화합물을 용매에 혼입시킨 후 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 예를 들어, 위에 열거된 것들로부터 원하는 다른 성분을 함유하는 살균 비히클 내에 다양한 살균된 활성 성분을 포함시키는 것에 의해 제조된다. 살균 주사가능 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분(들)에 더하여 임의의 부가적인 요망되는 성분의 분말을 미리 살균-여과한 이의 용액으로부터 생산하는 진공-건조 및 동결-건조 기법을 포함한다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로-허용가능한 염은 예를 들어, 무기산(예를 들어, 염산 또는 인산) 또는 유기산(예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등)으로부터 유도된 산 부가 염(유리 아미노기로 형성됨)을 포함한다. 유리 카르복실기로 형성된 염은 또한 무기 염기 (예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화 제2철)로부터 또는 유기 염기 (예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등)로부터 유래될 수 있다.
수용액에서의 비경구 투여를 위해, 예를 들어, 용액은 일반적으로 적절하게 완충되고, 액체 희석제는 먼저 예를 들어 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성이 된다. 이러한 수용액은 예를 들어, 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복강 내 투여에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 특히 본 발명에 비추어 당업자에게 공지된 멸균 수성 매질이 사용된다. 예를 들어, 단일 용량을 등장성 NaCl 용액 1 ml에 용해시키고 1000 ml의 피하주사액에 첨가하거나, 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 페이지 1035-1038 및 1570-1580 참고). 인간 투여의 경우, 제제는 FDA 표준에서 요구하는 무균성, 발열성, 일반적인 안전 및 순도 표준을 충족해야 한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 멸균 식염수 용액 및 본원에 기재된 RNAi 작제물을 포함하거나 이로 구성된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본원에 기재된 RNAi 작제물 및 멸균 수(예를 들어, 주사용수, WFI)를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본원에 기재된 RNAi 작제물 및 포스페이트-완충 식염수(PBS)를 포함하거나 이로 구성된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 투여용 장치와 함께 패키징되거나 그 안에 저장된다. 주사용 제형을 위한 장치는 주사 포트, 사전충전형 주사기, 자동 주사기, 주사 펌프, 체내 주사기 및 주사 펜을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 에어로졸화 또는 분말 제형을 위한 장치는 흡입기, 취입기, 흡인기 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 투여 장치를 포함한다.
본 발명은 본원에 기재된 RNAi 작제물 중 임의의 하나와 세포를 접촉시켜 세포에서 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 세포는 시험관내 또는 생체내에 있을 수 있다. 표적 유전자 발현은 표적 mRNA, 표적 단백질, 또는 표적 유전자의 발현에 연결된 또 다른 바이오마커의 양 또는 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 본 발명의 RNAi 작제물로 처리된 세포 또는 동물에서 표적 유전자 발현의 감소는 RNAi 작제물로 처리되지 않거나 대조군 RNAi 작제물로 처리된 세포 또는 동물에서의 표적 유전자 발현과 관련하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 표적 유전자 발현의 감소 또는 억제는 (a) 본 발명의 RNAi 작제물로 처리된 세포에서 표적 mRNA의 양 또는 수준을 측정하고, (b) 대조군 RNAi 작제물(예를 들어, 세포에서 발현되지 않는 RNA 분자 또는 논센스 또는 스크램블링된 서열을 갖는 RNAi 작제물을 지향하는 RNAi 작용제)로 처리된 또는 작제물이 없는 세포에서 표적 mRNA의 양 또는 수준을 측정하고, 및 (c) (a)에서의 처리된 세포로부터 측정된 표적 mRNA 수준을 (b)에서의 대조군 세포로부터 측정된 표적 mRNA 수준과 비교함으로써 평가된다. 처리된 세포 및 대조군 세포에서의 표적 mRNA 수준은 비교 전에 대조군 유전자(예를 들어, 18S 리보솜 RNA 또는 하우스키핑 유전자)에 대한 RNA 수준으로 정규화될 수 있다. 표적 mRNA 수준은 노던 블롯 분석, 뉴클레아제 보호 분석, 형광동소보합법(FISH), 역전사 효소(RT)-PCR, 실시간 RT-PCR, 정량적 PCR, 미세방울 디지털 PCR 등을 포함하는 다양한 방법으로 측정될 수 있다.
다른 실시형태에서, 표적 유전자 발현의 감소 또는 억제는 (a) 본 발명의 RNAi 작제물로 처리된 세포에서 표적 단백질의 양 또는 수준을 측정하고, (b) 대조군 RNAi 작제물(예를 들어, 세포에서 발현되지 않는 RNA 분자 또는 논센스 또는 스크램블링된 서열을 갖는 RNAi 작제물을 지향하는 RNAi 작용제)로 처리된 또는 작제물이 없는 세포에서 표적 단백질의 양 또는 수준을 측정하고, 및 (c) (a)에서의 처리된 세포로부터 측정된 표적 단백질 수준을 (b)에서의 대조군 세포로부터 측정된 표적 단백질 수준과 비교함으로써 평가된다. 표적 단백질 수준을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 웨스턴 블롯, 면역 분석(예를 들어, ELISA), 및 유세포 분석을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 RNAi 작제물 중 임의의 하나를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 RNAi 작제물은 예를 들어, 유전자 생성물의 과발현이 병리적 표현형을 유발하는, 비정상 표적 유전자 발현 또는 활성과 관련된 병태, 질환, 또는 장애를 치료 또는 개선하는 데 이용될 수 있다. 예시적인 표적 유전자는 LPA, PNPLA3, ASGR1, F7, F12, FXI, APOCIII, APOB, APOL1, TTR, PCSK9, SCAP, KRAS, CD274, PDCD1, C5, ALAS1, HAO1, LDHA, ANGPTL3, SERPINA1, AGT, HAMP, LECT2, EGFR, VEGF, KIF11, AT3, CTNNB1, HMGB1, HIF1A, 및 STAT3을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 표적 유전자는 바이러스 유전자, 예컨대, B형 간염 및 C형 간염 바이러스 유전자, 인간 면역결핍증 바이러스 유전자, 헤르페스 바이러스 유전자 등을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자는 인간 마이크로 RNA(miRNA)를 암호화하는 유전자이다.
특정 실시형태에서, 표적 유전자의 발현은 본 발명의 RNAi 작제물에 의해 세포 또는 대상체에서 적어도 50% 감소된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자의 발현은 세포 또는 대상체에서 본 발명의 RNAi 작제물에 의해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 감소된다. 다른 실시형태에서, 표적 유전자의 발현은 간세포에서 본 발명의 RNAi 작제물에 의해 약 90% 또는 그 이상, 예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상 감소된다. 표적 유전자 발현의 감소 백분율은 본원에 기재된 임의의 방법뿐만 아니라 당 업계에 공지된 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.
수행된 실험 및 달성된 결과를 포함하는 다음의 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되며 첨부되는 청구범위의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1. 상이한 화학적 변형 패턴이 있는 PNPLA3 RNAi 작제물의 생체내 활성
RNAi 작제물의 생체내 효능에 미치는 상이한 화학적 변형 패턴의 영향을 평가하기 위하여, 파타틴 유사 포스포리파아제 도메인 함유 3(patatin-like phospholipase domain-containing 3, PNPLA3) 유전자를 표적화하는 RNAi 작제물을 다양한 패턴의 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드 및 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드로 합성하고, 아래에서 상세히 기술된 바와 같이 PNPLA3을 발현하는 인간화 마우스 모델에서 평가하였다.
고상 포스포라미다이트 화학을 이용하여 RNAi 작제물을 합성하였다. MerMade12(Bioautomation) 장비에서 합성을 수행하였다.
재료
아세토니트릴(DNA 합성 등급, AXO152-2505, EMD)
캡핑 시약 A(80:10:10 (v/v/v) 테트라하이드로퓨란/루티딘/무수 아세트산, BIO221/4000, EMD)
캡핑 시약 B(16%의 1-메틸이미다졸/테트라하이드로퓨란, BIO345/4000, EMD)
활성화제 용액(아세토니트릴 중 0.25 M의 5-(에틸티오)-1H-테트라졸(ETT), BIO152/0960, EMD)
탈트리틸화 시약(디클로로메탄 중 3%의 디클로로아세트산, BIO830/4000, EMD)
산화 시약(70:20:10(v/v/v)의 테트라하이드로퓨란/피리딘/물 중 0.02 M의 요오드, BIO420/4000, EMD)
디에틸아민 용액(아세토니트릴 중 20%의 DEA, NC0017-0505, EMD)
티올화 시약(40:60(v/v)의 피리딘/아세토니트릴 중 0.05 M의 5-N-[(디메틸아미노)메틸렌]아미노-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온(BIOSULII/160K))
5′-아미노헥실 링커 포스포라미다이트, 포스포릴화 포스포라미다이트, 2′-데옥시티미딘 포스포라미다이트, 및 아데노신, 구아노신, 시토신, 및 우리딘의 2′-메톡시 및 2′-플루오로 포스포라미다이트(Thermo Fisher Scientific), 약 10 mL의 분자체(3 Å, J. T. Baker)에 대한 아세토니트릴 중 0.10 M
CPG 지지체(Hi-Load Universal Support, 500A (BH5-3500-G1), 79.6 μmol/g, 0.126 g (10 μmol))
수산화암모늄(농축형, J. T. Baker)
합성
시약 용액, 포스포라미다이트 용액, 및 용매를 MerMade12 장비에 부착하였다. 고체 지지체를 각 컬럼(상부 및 하부의 프릿이 있는 4 mL의 SPE 튜브)에 첨가하고, 컬럼을 장비에 고정시켰다. 컬럼을 아세토니트릴로 2회 세척하였다. 포스포라미다이트 및 시약 용액 라인을 퍼징시켰다. 포세이돈 소프트웨어를 이용하여 합성을 개시하였다. 탈보호/커플링/산화/캡핑 합성 사이클을 반복하여 합성을 달성하였다. 구체적으로, 고체 지지체에 탈트리틸화 시약을 첨가하여 5'-디메톡시트리틸(DMT) 보호기를 제거하였다. 고체 지지체를 아세토니트릴로 세척하였다. 지지체에 포스포라미다이트 및 활성화제 용액을 첨가한 후, 인큐베이션시켜 유입되는 뉴클레오티드를 유리 5'-하이드록실기에 커플링시켰다. 지지체를 아세토니트릴로 세척하였다. 지지체에 산화 또는 티올화 시약을 첨가하여 포스파이트 트리에스테르를 포스페이트 트리에스테르 또는 포스포로티오에이트로 전환시켰다. 지지체에 캡핑 시약 A 및 B를 첨가하여 임의의 반응하지 않은 올리고뉴클레오티드 쇄를 차단하였다. 지지체를 아세토니트릴로 세척하였다. 최종 반응 사이클 후, 수지를 디에틸아민 용액으로 세척하여 2-시아노에틸 보호기를 제거하였다. 지지체를 아세토니트릴로 세척하고, 진공 건조시켰다.
GalNAc 접합
3가 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc) 모이어티(아래 화학식 VII에 도시된 구조)에 접합시키기 위한 센스 가닥을 5'-아미노헥실 링커로 제조하였다. 자동화된 합성 후, 장비로부터 컬럼을 제거하여 후드 안의 진공 매니폴드로 옮겼다. 진공 여과와 함께 디클로로메탄(DCM) 중 1%의 트리플루오로아세트산(TFA)의 2 mL의 분취량으로 연속 처리하여 고체 지지체로부터 5'-모노메톡시트리틸(MMT) 보호기를 제거하였다. 용출액에서 주황색/황색을 더 이상 관찰할 수 없을 때, 수지를 디클로로메탄으로 세척하였다. 수지를 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 중 2%의 디이소프로필에틸아민 5 mL로 세척하였다. 별도의 바이알에서 DMF(0.5 mL) 중 GalNAc3-Lys2-Ahx(67 mg, 40 μmol)의 용액(이의 구조 및 합성은 아래에 기술됨)을 1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TATU, 12.83 mg, 40 μmol) 및 디이소프로필에틸아민(DIEA)(10.5 μL, 360 μmol)으로 제조하였다. 활성화된 커플링 용액을 수지에 첨가하고, 컬럼을 캡핑하고 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 수지를 DMF, DCM으로 세척하고, 진공 건조시켰다.
절단
합성 컬럼을 합성기 또는 진공 매니폴더로부터 제거하였다. 각 컬럼으로부터 고체 지지체를 10 mL의 바이알로 옮겼다. 고체 지지체에 4 mL의 농축 수산화암모늄을 첨가하였다. 뚜껑을 병에 단단히 고정시키고, 혼합물을 4시간 동안 55℃에서 가열하였다. 병을 냉동고로 옮기고 후드에서 개봉하기 전에 20분 동안 냉각시켰다. 혼합물을 8 mL의 SPE 튜브를 통해 여과하여 고체 지지체를 제거하였다. 바이알과 고체 지지체를 1 mL의 50:50 에탄올/물로 헹구었다.
분석 및 정제
합한 여과액의 일부분을 분석하고, 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 모은 분획을 크기 배제 크로마토그래피로 탈염시키고, 이온쌍 역상 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법(HPLC-MS)으로 분석하였다. 모은 분획을 동결건조시켜 흰색의 무정형 분말을 수득하였다.
분석적 음이온 교환 크로마토그래피(AEX):
컬럼: Thermo DNAPac PA200RS(4.6 x 50 mm, 4 μm)
기기: Agilent 1100 HPLC
완충액 A: 20 mM의 인산나트륨, 10%의 아세토니트릴, pH 8.5
완충액 B: 20 mM의 인산나트륨, 10%의 아세토니트릴, pH 8.5, 1 M의 브롬화나트륨
유속: 40℃에서 1 mL/분
구배: 6.2분 내에 20~65% B
분취용 음이온 교환 크로마토그래피(AEX):
컬럼: Tosoh TSK Gel SuperQ-5PW, 21 x 150 mm, 13 μm
기기: Agilent 1200 HPLC
완충액 A: 20 mM의 인산나트륨, 10%의 아세토니트릴, pH 8.5
완충액 B: 20 mM의 인산나트륨, 10%의 아세토니트릴, pH 8.5, 1 M의 브롬화나트륨
유속: 8 mL/분
주입량: 5 mL
구배: 20분에 걸쳐 35~55% B
분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC):
컬럼: GE Hi-Prep 26/10
기기: GE AKTA Pure
완충액 물 중 20%의 에탄올
유속: 10 mL/분
주입량: 샘플 로딩 펌프를 이용, 15 mL
이온쌍-역상(IP-RP) HPLC:
컬럼: Water Xbridge BEH OST C18, 2.5 μm, 2.1 x 50 mm
기기: Agilent 1100 HPLC
완충액 A: 물 중 15.7 mM의 DIEA, 50 mM의 헥사플루오로이소프로판올(HFIP)
완충액 B: 50:50의 물/아세토니트릴 중 15.7 mM의 DIEA, 50 mM의 HFIP
유속: 0.5 mL/분
구배: 6분에 걸쳐 10~30% B
어닐링
소량의 센스 가닥과 안티센스 가닥을 개별 바이알에 칭량하였다. 바이알에 siRNA 재구성 완충액(Qiagen) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 건조 중량을 기준으로 대략 2 mM의 농도까지 첨가하였다. 실제 샘플 농도를 NanoDrop One(ssDNA, 흡광 계수 = 33 μg/OD260)에서 측정하였다. 그 후, 두 가닥을 등몰 비율로 혼합하고, 샘플을 90℃의 인큐베이터에서 5분 동안 가열하고, 실온까지 서서히 냉각되게 하였다. 샘플을 AEX로 분석하였다. 이중체를 등록하고, 아래에 더욱 상세히 기술한 바와 같이 생체내 시험을 위해 제출하였다.
GalNAc3-Lys2-Ahx의 제조
화학식 VII
Figure pct00011
식에서 X = O 또는 S임. 구불구불한 선은 RNAi 작제물의 센스 가닥의 5' 말단 뉴클레오티드에 대한 부착점을 나타낸다.
50 mL의 팔콘 튜브에 DCM(30 mL) 중 Fmoc-Ahx-OH(1.13 g, 3.19 mmol)를 첨가하고, DIEA(2.23 mL, 12.78 mmol)를 첨가하였다. 용액을 50 mL의 원심분리 튜브의 2-Cl 염화트리틸 수지(3.03 g, 4.79 mmol)에 첨가하고, 2시간 동안 진탕기에 로딩하였다. 용매를 따라내고, 수지를 17:2:1의 DCM/MeOH/DIEA(30 ml x 2), DCM(30 ml x 4)으로 세척하고 건조시켰다. 로딩은 290 nm에서 UV 분광광도계 검출로 0.76 mmol/g으로 확인되었다.
로딩된 2-Cl 트리틸 수지 3 g을 DMF(20 mL) 중 20%의 4-메틸피페리딘에 현탁시키고, 30분 후 용매를 따라냈다. 이 과정을 한 번 더 반복하고, 수지를 DMF(30 mL x 3) 및 DCM(30 mL x 3)으로 세척하였다.
DMF(20 mL) 중의 Fmoc-Lys(ivDde)-OH(3.45 g, 6 mmol)의 용액에 TATU(1.94 g, 6 mmol)에 이어 DIEA(1.83 mL, 10.5 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 용액을 상기 탈보호된 수지에 첨가하고, 현탁액을 밤새 진탕기에 두었다. 용매를 따라내고, 수지를 DMF(30 mL x3) 및 DCM(30 mL x3)으로 세척하였다.
수지를 DMF(15 mL) 중 20%의 4-메틸피페리딘으로 처리하고, 10분 후 용매를 따라냈다. 이 과정을 한 번 더 반복하고 수지를 DMF(15 mL x 4) 및 DCM(15 mL x 4)으로 세척하였다.
DMF(20 mL) 중 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(3.54 g, 6 mmol)의 용액에 TATU(1.94 g, 6 mmol)에 이어 DIEA(1.83 mL, 10.5 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 용액을 상기 탈보호된 수지에 첨가하고, 현탁액을 밤새 진탕기에 두었다. 용매를 따라내고, 수지를 DMF(30 mL x3) 및 DCM(30 mL x3)으로 세척하였다.
수지를 DMF(20 mL) 중 5%의 히드라진으로 처리하고, 5분 후 용매를 따라냈다. 이 과정을 4회 더 반복하고, 수지를 DMF(30 mL x 4) 및 DCM(30 mL x 4)으로 세척하였다.
DMF(40 mL) 중 5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)펜탄산(4.47 g, 10 mmol)의 용액에 TATU(3.22 g, 10 mmol)를 첨가하고, 용액을 5분 동안 교반하였다. DIEA(2.96 mL, 17 mmol)를 용액에 첨가하고, 이어서 혼합물을 상기 수지에 첨가하였다. 현탁액을 밤새 실온으로 유지하고, 용매를 따라냈다. 수지를 DMF(3 x 30 mL) 및 DCM(3 x 30 mL)으로 세척하였다.
수지를 DCM(30 mL, 3%의 트리이소프로필실란 함유) 중 1%의 TFA로 처리하고, 5분 후 용매를 따라냈다. 이 과정을 3회 더 반복하고, 합한 여과액을 진공 농축시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르(50 mL)로 트리튜레이션(trituration)하고, 현탁액을 여과하고 건조시켜 미정제 생성물을 수득하였다. 미정제 생성물을 역상 크로마토그래피로 정제하고, 물 중 0~20%의 MeCN으로 용출시켰다. 분획을 합하고 동결건조시켜 생성물을 백색 고체로 수득하였다.
하기 표 1은 변형된 PNPLA3 RNAi 작제물의 각각에 대한 센스 및 안티센스 서열에서의 변형 위치를 도시한 것이다. 뉴클레오티드 서열은 하기 표기법에 따라 열거된다: dT, dA, dG, dC = 상응하는 데옥시리보뉴클레오티드; a, u, g, 및 c = 상응하는 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드; Af, Uf, Gf, 및 Cf = 상응하는 2'-데옥시-2'-플루오로("2'-플루오로") 리보뉴클레오티드; Phos = 말단 뉴클레오티드가 이의 5' 말단에 모노포스페이트기를 가짐; invAb = 반전된 무염기 뉴클레오티드(즉, 가닥의 3' 말단에 있을 경우 3' 위치의 치환기(3'-3' 연결)를 통해 인접한 뉴클레오티드에 연결되거나, 가닥의 5' 말단에 있을 경우 5' 위치의 치환기(5'-5' 연결)를 통해 인접한 뉴클레오티드에 연결된 무염기 뉴클레오티드); 및 invdX = 반전된 데옥시리보뉴클레오티드(즉, 가닥의 3' 말단에 있을 경우 3' 위치의 치환기(3'-3' 연결)를 통해 인접한 뉴클레오티드에 연결되거나, 가닥의 5' 말단에 있을 경우 5' 위치의 치환기(5'-5' 뉴클레오티드간 연결)을 통해 인접한 뉴클레오티드에 연결된 데옥시리보뉴클레오티드). 서열에서 "s"의 삽입은 2개의 인접한 뉴클레오티드가 포스포로티오디에스테르기에 의해 연결(예를 들어, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결)됨을 나타낸다. 달리 지시되지 않는 한, 다른 모든 뉴클레오티드는 3'-5' 포스포디에스테르기에 의해 연결된다. 모든 RNAi 작제물을 센스 가닥의 5' 말단을 통해 화학식 VII에 도시된 GalNAc 모이어티에 접합시켰다. 또한, 표 1은 각각의 RNAi 작제물에 대한 패턴 명칭 및 서열 패밀리 명칭을 열거한다. 패턴 명칭은 도 1에 개략적으로 표시되어 있다. RNAi 작제물이 또 다른 RNAi 작제물과 동일한 서열 패밀리 명칭을 갖는다면, 두 작제물은 동일한 코어 서열을 갖지만, 화학적 변형 패턴이 상이하다.
[표 1]
예시적인 변형된 PNPLA3 RNAi 작제물
Figure pct00012
Figure pct00013
초기 실험 세트에서, P1 화학적 변형 패턴 또는 CM1 대조 화학적 변형 패턴을 갖도록 서로 다른 서열의 13개의 서로 다른 PNPLA3 RNAi 작제물을 합성하였다. CM1 대조 화학적 변형 패턴을 갖는 siRNA 분자는 생체내에서 강력하고 장기적인 유전자 사일런싱 효과를 갖는 것으로 보고되었다. Nair et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 136:16958-16961, 2014 참고. PNPLA3 유전자 발현을 억제하는 데에 있어서 화학적으로 변형된 RNAi 작제물의 효능을 야생형 인간 PNPLA3 또는 인간 PNPLA3 유전자의 변이체 형태를 발현하는 인간화 마우스 모델에서 평가하였다. 마우스 모델을 생성하기 위하여, 인산염 완충 식염수(Thermo Fisher Scientific, 14190-136)에서 동물당 1Χ1012개의 바이러스 입자로 희석된 관련 아데노바이러스(AAV; 혈청형 AAV8 또는 AAV7; 내독소 없음)를 C57BL/6NCrl 수컷 마우스(Charles River Laboratories Inc.)의 꼬리 정맥에 정맥 내 주사하여, 인간 PNPLA3, PNPLA3 rs738409 , 또는 PNPLA3 rs738409-rs738408 유전자의 발현을 유도하였다. 마우스는 일반적으로 10~12주령이었으며, 처리군당 n이 4~6마리인 동물이 포함되었다.
모든 RNAi 작제물을 AAV-PNPLA3, PNPLA3 rs738409 , 및/또는 PNPLA3 rs738409-rs738408 을 주입한 마우스에서 테스트하였다. 적어도 2개의 비히클 처리된 대조군: AAV-빈 벡터 및 비히클 처리된 AAV-PNPLA3, PNPLA3 rs738409 , 또는 PNPLA3 rs738409-rs738408 을 또한 포함시켰다. AAV 주사 2주 후, 인산염 완충 식염수(Thermo Fisher Scientific, 14190-136)로 희석된, 동물 킬로그램당 0.5, 1.0, 3.0 또는 5.0 밀리그램의, 피하 주사를 통한, 단일 용량의 RNAi 작제물(0.5 mM)로 마우스를 처리하였다. RNAi 작제물 주사 후 8, 15, 22, 28 또는 42일에, 간을 동물로부터 수집하고, 액체 질소에서 스냅 냉동하고, 제조업체의 지침에 따라 Qiagen QIACube HT 기기(9001793) 및 Qiagen RNeasy 96 QIACube HT 키트(74171)를 사용하여 정제된 RNA에 대해 처리하였다. QIAxpert 시스템 (9002340)을 사용하여 샘플을 분석하였다. RNA를 Promega RQ1 RNase-Free DNase(M6101)로 처리하고, Applied Biosystem TaqManTM RNA-to-CTTM 1-단계 키트(4392653)를 사용하여 실시간 qPCR을 위해 제조하였다. 실시간 qPCR은 QuantStudio 실시간 PCR 기계에서 실행되었다. 결과는 마우스 Gapdh (각각 Invitrogen으로부터의 TaqManTM 분석, hs00228747_m1 및 4352932E)에 정규화된 인간 PNPLA3의 유전자 발현을 기초로 하며, 비히클-처리된 대조군 동물과 비교하여 인간 PNPLA3 mRNA 발현의 상대적인 녹다운으로 제시된다.
P1 화학적 변형 패턴을 갖는 RNAi 작제물(이중체 번호 4544, 3552, 2393, 3464, 3918, 2390, 2391, 2392, 3465, 3467, 2394, 3539, 및 3916)을 CM1 대조 변형 패턴을 갖는 것들(이중체 번호 2118, 2119, 2125, 2120, 2121, 2124, 2370, 2371, 2122, 2368, 2369, 2123, 및 3558)과 비교하는 실험의 이 초기 세트로부터의 결과를 도 2에 제시하였다. RNAi 작제물을 인간 PNPLA3 rs738409 변이체 유전자를 발현하는 마우스에게 5 mg/kg으로 피하 투여하였을 때, P1 패턴을 갖는 작제물은 서열과 관계 없이 CM1 패턴을 갖는 작제물보다 주사 후 8일 후에 측정하였을 때 일반적으로 PNPLA3 발현을 더 큰 정도로 감소시켰다.
가닥의 길이, RNAi 작제물의 말단의 속성(즉, 오버행 대 평활 말단)을 변형하고/하거나 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에 반전된 무염기 뉴클레오티드를 포함하기 위한 P1 변형 패턴의 변형을 제조하고, 동일한 코어 서열을 갖는 RNAi 작제물에 적용하였다. 인간화 마우스 모델에서 새로운 패턴을 갖는 RNAi 작제물의 생체내 효능의 개선을 평가하였다. 구체적으로, P1, P2, P3, 또는 P4 화학적 변형 패턴을 갖는 RNAi 작제물(이중체 번호 3540, 5241, 5614, 및 5615)을 5 mg/kg의 용량으로 인간 PNPLA3 rs738409 변이체 유전자를 발현하는 마우스에 피하 투여하였다. 간에서 인간 PNPLA3의 발현 수준을 RNAi 작제물의 투여 후 15일에 평가하였다. 결과는 도 3에 도시되어 있다. P2, P3, 또는 P4 패턴을 갖는 RNAi 작제물은 P1 패턴을 갖는 RNAi 작제물보다 PNPLA3 발현의 더 큰 평균 감소를 가져왔다.
생체내에서 mRNA 녹다운의 효능 및 지속시간을 증가시키기 위한 P3 패턴의 추가 변형을 제조하였다. P3 패턴(이중체 번호 6191)의 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4 및 6번의 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드를 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드로 바꾸어 P9 패턴을 생성하였다. (이중체 번호 6267). 또한, 센스 가닥의 3' 말단에서 반전된 무염기 뉴클레오티드 대신 반전된 아데노신 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 P9 패턴을 갖는 RNAi 작제물(이중체 번호 7320)을 합성하였다. 전술한 인간화 마우스 모델에서 세 개의 작제물 모두를 평가하였다. 5 mg/kg의 이중체 번호 6267로 처리한 동물에서, 인간 PNPLA3 간 발현은 투여 후 22일에 97% 감소되었고, 5 mg/kg의 이중체 번호 6191로 처리한 동물은 동일한 시점에서 인간 PNPLA3 간 발현의 92% 감소를 나타내었다. 3 mg/kg의 이중체 번호 7320으로 처리한 동물은 투여 후 28일에 인간 PNPLA3 간 발현 수준의 95%의 감소를 나타내었으므로, 이중체 번호 7320이 이중체 번호 6191 및 6267보다 더욱 강력하였고, 더 오랜 지속시간의 유전자 녹다운을 가져왔다.
P9 패턴을 두 개의 상이한 코어 서열을 갖는 PNPLA3 RNAi 작제물(이중체 번호 7318, 7320, 7062, 8513, 및 8709)에 적용하고, 1 mg/kg 및 3 mg/kg의 용량에서 생체내 생물발광 이미징 분석에서 생체내 효능을 평가하였다. 생물발광 이미징 분석을 위하여, 관련 아데노바이러스(AAV) 벡터를 뮤린 사이토메갈로바이러스 프로모터, 반딧불이 루시퍼라제에 대한 전체 서열, 그리고 그 다음으로, 반딧불이 루시퍼라제 중지 코돈으로부터 바로 하류에, 테스트하려는 RNAi 작제물에 특이적인 mRNA 서열의 합성된 스트링을 함유하도록 설계하였다. mRNA 서열의 측면에는 각 말단에 10개의 추가적인 뉴클레오티드가 위치하였다. 벡터 "PP3A(DM)"는 AAV 혈청형인 AAVDJ8(내독소 없음)로 패키징되었다. 주입 전에, PP3A(DM)를 인산염 완충 식염수(Thermo Fisher Scientific, 14190-136)에서 동물당 5x1011개의 바이러스 입자로 희석하고, BALB/c 수컷 마우스(Charles River Laboratories Inc.)의 꼬리 정맥에 정맥 내 주사하였다. 마우스는 일반적으로 10~12주령이었으며, 그룹 당 n=5마리의 동물이 포함되었다.
AAV 주사 2주 후, 제조업체의 지침에 따라 RediJect D-루시페린 생물발광 기질(PerkinElmer, 770504)을 마우스에 주입하였다. 10분의 펄스 후, 마우스를 IVIS 스펙트럼 생체내 이미징 시스템(PerkinElmer)에서 이미지화하였다. 간을 포함하는 정의된 관심 영역으로부터의 기준선 총 플럭스 점수에 따라 마우스를 그룹으로 무작위화하였다. 마우스를 무작위화한 후, 인산염 완충 식염수(Thermo Fisher Scientific, 14190-136)로 희석한, 체중 킬로그램당 1.0 또는 3.0 밀리그램으로, 피하 주사를 통해, 단일 용량의 RNAi 작제물(0.5 mM)을 처리하거나, 또는 인산염 완충 식염수만을 처리하였다("비히클"로 표시함). 마우스는 총 플럭스 점수에 대해 동일한 게이팅 제약을 적용하여 동일한 프로토콜에 따라 매주 이미지화되었다. 데이터는 총 플럭스(초당 광자, y축) 대 RNAi 작제물 주사 후의 주(week, x축)로 표시된다. 총 플럭스의 감소는 루시퍼라제 리포터의 감소된 발현을 나타낸다.
이 실험의 결과를 도 4a 및 4b에 제시하였다. P9 패턴을 갖는 상이한 RNAi 작제물로 처리된 동물로부터의 루시퍼라제 리포터로부터의 신호는, 1 mg/kg의 단일 용량 후 적어도 3주 동안(도 4a) 및 3 mg/kg의 단일 용량(도 4b)의 RNAi 작제물의 경우, 적어도 5주 동안 비히클 처리된 동물로부터의 신호와 비교하여 현저하게 감소되었다. 많은 RNAi 작제물의 경우, 단일 3 mg/kg의 용량은 최대 6주 동안 루시퍼라제 리포터 발현을 억제하기에 충분하였다.
이러한 RNAi 작제물(이중체 번호 7318, 7320, 7062, 8513 및 8709)을 또한 전술한 인간화 마우스 모델에서 평가하였다. 구체적으로, RNAi 작제물을 0.5, 1, 또는 3 mg/kg으로 인간화 PNPLA3 rs738409-rs738408 변이체 유전자를 발현하는 마우스에게 피하 투여하였다. 간에서 인간 PNPLA3의 발현 수준을 RNAi 작제물의 투여 후 28 또는 42일에 qPCR에 의해 평가하였다. 결과는 비히클 처리된 대조군 동물과 비교한 인간 PNPLA3 mRNA 발현의 상대적 녹다운으로 제시되며, 아래 표 2에 제시하였다.
[표 2]
PNPLA3 RNAi 작제물의 생체내 효능
Figure pct00014
P9 변형 패턴을 갖는 RNAi 작제물은 이전에 테스트한 패턴보다 더 강력하고, 더 오랜 지속기간의 유전자 녹다운을 초래한다. 0.5 mg/kg의 단일 용량으로 RNAi 작제물을 투여하자 단일 용량의 투여 4주 후에 인간 PNPLA3 간 발현이 약 50% 감소한 반면, 1 mg/kg 용량으로 작제물을 투여하자 단일 용량 투여 4주 후 인간 PNPLA3 간 발현이 약 70% 감소하였다. 1 mg/kg의 용량은 단일 용량 후 6주까지 PNPLA3 발현의 55% 초과의 감소를 유지하기에 충분하였다. 3 mg/kg의 RNAi 작제물의 단일 용량의 투여는 단일 용량의 투여 4주 후에 인간 PNPLA3의 간 발현을 90% 이상 감소시켰다. 인간 PNPLA3의 간 발현은 3 mg/kg 용량의 투여 6주 후에 여전히 약 75% 이상으로 감소되었다. 유전자 녹다운의 개선된 효능 및 지속기간은 P9 화학적 변형 패턴이 핵염기 서열과 적어도 부분적으로 독립적인 RNAi 작제물을 안정화시키는 데 효과적임을 보여주는 2개의 별개의 서열을 갖는 RNAi 작제물로 관찰되었다.
다음으로, P9 화학적 변형 패턴을 갖는 PNPLA3 RNAi 작제물의 생체내 효능을 3개의 상이한 대조 변형 패턴 중 하나를 갖는 PNPLA3 RNAi 작제물과 비교하였다. CM2, CM3, 및 CM4 변형 패턴은 이전에 siRNA 분자의 대사 안정성을 증가시켜 유전자 사일런싱의 효능과 지속기간을 개선하는 것으로 보고되었다. Foster et al., Molecular Therapy, Vol. 26: 708-717, 2018 참고. 모든 RNAi 작제물은 센스 및 안티센스 가닥에서 동일한 코어 뉴클레오티드 서열을 가졌으며, 화학적 변형 패턴만 상이하였다. P9 변형 패턴을 갖는 두 개의 상이한 작제물을 합성하였다. 하나는 센스 가닥의 3' 말단에 반전된 무염기를 갖고(이중체 번호 7318), 다른 하나는 센스 가닥의 3' 말단에 반전된 데옥시티미딘을 갖는다(이중체 번호 8709). CM2, CM3, 또는 CM4 변형 패턴 중 하나를 갖는 RNAi 작제물도 합성하였다(각각 이중체 번호 8103, 8104 및 8105). 이어서, 각각의 RNAi 작제물을 3 mg/kg의 용량으로 인간화 PNPLA3 rs738409-rs738408 변이체 유전자를 발현하는 마우스에게 피하 투여하였다. 간에서 인간 PNPLA3의 발현 수준을 RNAi 작제물의 투여 후 28일에 qPCR에 의해 평가하였다. 결과는 도 5에 도시되어 있다. 센스 가닥의 3' 말단에 반전된 무염기가 있는 P9 변형 패턴을 갖는 RNAi 작제물(이중체 번호 7318)은 테스트한 모든 작제물 중에서 간 PNPLA3 발현에서 가장 큰 감소를 초래하였다. 센스 가닥의 3' 말단에 반전된 데옥시티미딘이 있는 P9 변형 패턴을 갖는 RNAi 작제물(이중체 번호 8709)은 CM4 패턴을 갖는 작제물(이중체 번호 8105)보다 간 PNPLA3 발현을 더 크게 감소시켰으며, CM2 및 CM3 패턴을 갖는 작제물(각각 이중체 번호 8103 및 8104)과 비슷한 간 PNPLA3 발현의 감소를 나타내었다.
별도의 실험 세트에서, P3 변형 패턴의 대안적인 변형을 설계하고, 인간화 PNPLA3 마우스 모델에서 생체내 효능을 평가하였다. P3 패턴의 변형을 두 개의 상이한 서열을 갖는 RNAi 작제물에 적용하였다. 각 RNAi 작제물에 대한 센스 및 안티센스 가닥의 서열은 표 1에 제시되어 있고, 변형 패턴은 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. RNAi 작제물을 3 mg/kg의 용량으로 인간화 PNPLA3 rs738409-rs738408 변이체 유전자를 발현하는 마우스에게 피하 투여하였다. 간에서 인간 PNPLA3의 발현 수준을 RNAi 작제물의 투여 후 28일에 qPCR에 의해 평가하였다. 결과를 아래의 표 3에 나타내었다. 모든 RNAi 작제물은 3 mg/kg의 단일 피하 주사 후 4주 후에 인간 PNPLA3의 간 발현을 약 90% 이상 감소시켰다.
[표 3]
대안적인 화학적 변형 패턴이 있는 PNPLA3 RNAi 작제물의 생체내 효능
Figure pct00015
실시예 2. 상이한 화학적 변형 패턴이 있는 ASGR1 RNAi 작제물의 생체내 활성
실시예 1에 나타난 바와 같이, 인간 PNPLA3 mRNA를 표적화하는 상이한 서열을 갖는 13개의 상이한 RNAi 작제물에 적용된 P1 화학적 변형 패턴은 작제물의 유전자 사일런싱 효능을 개선하였다. P1 화학적 변형 패턴이 또 다른 간 유전자를 표적화하는 RNAi 작제물의 효능을 증진시키는지를 조사하기 위하여, 아시알로당단백질 수용체 1(ASGR1) mRNA를 표적화하는, P1 화학적 변형 패턴이 있는 RNAi 작제물을 실시예 1에 기술된 방법에 따라 합성하였다. CM1 대조 화학적 변형 패턴을 사용하여 동일한 서열을 갖는 RNAi 작제물을 합성하였다. RNAi 작제물의 서열을 표 1에 대해 전술한 동일한 표기법을 사용하여 아래 표 4에 제공하였다. 화학식 VII에 제시된 구조를 갖는 GalNAc 모이어티를 이중체 번호 1520으로 지정된 RNAi 작제물의 센스 가닥의 5' 말단에 접합시키고, 화학식 IX에 제시된 구조를 갖는 GalNAc 모이어티를 이중체 번호 1421로 지정된 RNAi 작제물의 센스 가닥의 5' 말단에 접합시켰다. RNAi 작제물의 센스 가닥에 대한 GalNAc 모이어티의 접합을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였는데, 다만, 화학식 IX에 제시된 구조를 갖는 GalNAc 모이어티의 경우, GalNAc 모이어티를 다음과 같이 제조하였다. DMF(40 mL) 중 2-(2-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)에톡시)아세트산(5.37 g, 10 mmol)의 용액에 TATU(3.22 g, 10 mmol)를 첨가하고, 용액을 5분 동안 교반하였다. DIEA(2.96 mL, 17 mmol)를 용액에 첨가하고, 이어서 혼합물을 위의 실시예 1에 기술한 수지에 첨가하였다. 현탁액을 밤새 실온으로 유지하고, 용매를 따라냈다. 수지를 DMF(3 x 30 mL) 및 DCM(3 x 30 mL)으로 세척하였다.
[표 4]
예시적인 변형된 ASGR1 RNAi 작제물
Figure pct00016
간 마우스 ASGR1 발현을 억제하는 데 있어서 RNAi 작제물의 생체내 효능을 RNAi 작제물을 C57BL/6J 마우스에게 투여함으로써 평가하였다. 10 내지 12주령의 야생형 C57BL/6 동물(Charles River)에게 표준 사료(2020Χ Teklad global 콩단백질 불포함 압출 설치류 먹이; Harlan)를 공급하였다. 마우스는 제0일에 0.25 ml의 완충액 중 5 mg/kg 체중으로 완충액 또는 표시된 RNAi 작제물의 피하 주사를 받았다(군당 n = 9). 추가 분석을 위하여 제4일에 3마리의 동물, 제8일에 3마리의 동물, 그리고 제15일에 3마리의 동물을 수확하였다. 수확한 동물의 간의 총 RNA를 qPCR 분석을 위하여 처리하였다. RNAi 작제물 처리된 동물의 간 조직의 Asgr1 mRNA의 양을, 완충액을 주사한 동물의 간 조직의 Asgr1 mRNA의 양과 비교하여 RNAi 작제물의 효능을 평가하였다. 결과는 P1 변형 패턴을 갖는 RNAi 작제물(이중체 번호 1520)을 투여 받은 동물이 측정한 모든 시점에서 CM1 대조 변형 패턴을 갖는 RNAi 작제물을 투여 받은 동물보다 간 ASGR1 발현에서 더 큰 감소를 나타냈음을 보여준다(도 6). 인간 PNPLA3 mRNA를 표적화하는 RNAi 작제물을 사용한 실시예 1에 기술된 결과와 유사하게, P1 화학적 변형 패턴은 RNAi 작제물의 효능을 개선한다.
실시예 3. 상이한 화학적 변형 패턴이 있는 LPA RNAi 작제물의 생체내 활성
본원에 기술된 화학적 변형 패턴의 RNAi 작제물의 생체내 효능을 개선하는 능력을 추가로 평가하기 위하여, 제3의 간 유전자인 LPA 유전자를 표적화하는 RNAi 작제물을 합성하고, 실시예 1에 기술한 방법에 따라 화학식 VII에 제시된 구조를 갖는 GalNAc 모이어티에 접합시켰다. RNAi 작제물의 서열을 표 1에 대해 전술한 동일한 표기법을 사용하여 아래 표 5에 제공하였다. 또한, 표 5는 각각의 RNAi 작제물에 대한 패턴 명칭 및 서열 패밀리 명칭을 열거한다. 패턴 명칭은 도 1에 개략적으로 표시되어 있다. RNAi 작제물이 또 다른 RNAi 작제물과 동일한 서열 패밀리 명칭을 갖는다면, 두 작제물은 동일한 코어 서열을 갖지만, 화학적 변형 패턴이 상이하다.
[표 5]
예시적인 변형된 LPA RNAi 작제물
Figure pct00017
초기 실험에서, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 작제물을 CM1 대조 화학적 변형 패턴(이중체 번호 3632) 또는 P1 화학적 변형 패턴(이중체 번호 3635)을 갖도록 합성하였다. 두 작제물의 생체내 효능을 평균 약 50~60 mg/dL의 혈청 기준선 Lp(a) 수준으로 완전히 기능하는 인간 Lp(a) 입자를 발현하는 이중 형질전환 마우스 모델에서 평가하였다. Lp(a)는 이황화 결합에 의해 LDL 입자의 아포지질단백질 B에 연결된 당단백질 아포지질단백질 (a)(apo(a))와 LDL 입자로 구성된 저밀도 지질단백질이다. Apo(a)는 LPA 유전자에 의해 암호화되며, 혈청 Lp(a) 수준의 변화는 LPA 유전자의 발현의 변화를 반영한다. 전체 인간 LPA 유전자를 함유하는 효모 인공 염색체(YAC)로부터 인간 apo(a)를 발현하는 형질전환 마우스(Frazer et al., Nature Genetics, Vol. 9: 424-431, 1995)를 인간 apoB-100을 발현하는 형질전환 마우스(Linton et al., J. Clin. Invest., Vol. 92: 3029-3037, 1993)와 교배시켜 이중 형질전환 마우스를 생성하였다. LPA RNAi 작제물을 0.5 mg/kg의 용량으로 단일 피하 주사로서 투여하였다. 주사 전 혈청 샘플을 취한 다음, 제14일 및 제28일에 주사 후 취하였다. Lp(a) 농도는 Lp(a) ELISA 분석(Cat.# 10-1106-01, Mercodia AB, 스웨덴 웁살라 소재)을 이용하여 혈청에서 측정하였다. 특정 시점에서 각 동물에 대한 Lp(a) 수준의 변화 백분율을 해당 동물의 기준선 Lp(a) 수준을 기반으로 계산하였다. 결과는 도 7에 도시되어 있다. 주사 2주 후, 통계적으로 유의미하지는 않지만, P1 변형 패턴을 가진 이중체 번호 3635의 투여는 대조 CM1 변형 패턴을 갖는 이중체 번호 3632(-32%)와 비교하여 혈청 Lp(a) 수준의 더 큰 평균 감소(-49%)를 가져왔다.
제2의 일련의 실험에서, 첫 번째 실험 세트의 것들과는 구별되는 LPA mRNA의 영역을 표적화하는, P1 화학적 변형 패턴 또는 해당 패턴의 변형을 갖는 LPA RNAi 작제물을 합성하였다. 새로운 패턴을 갖는 RNAi 작제물을 생체내에서 LPA 유전자 발현의 억제의 규모와 지속기간 둘 다의 개선에 대해 이중 형질전환 마우스 모델에서 평가하였다. 구체적으로, P1 변형 패턴 또는 패턴 변이체(예를 들어, P2, P4, P6 또는 P7 화학적 변형 패턴) 중 하나를 갖는 3개의 상이한 서열 패밀리로부터의 LPA RNAi 작제물을 2 mg/kg의 용량으로 전술한 이중 형질전환 마우스에게 피하 투여하였다. 기준선 수준을 얻기 위하여 주사 전에, 그리고 LPA RNAi 작제물을 투여한 후 제1주, 제2주 및 제4주에 동물에서 혈청 Lp(a) 수준을 측정하였다. 이 실험 세트의 결과는 아래 표 6에 제시되어 있다. 3개의 서열 패밀리에 걸쳐, P2, P4, P6, 또는 P7 변형 패턴을 갖는 RNAi 작제물은 P1 변형 패턴을 갖는 RNAi 작제물에 비해 Lp(a) 혈청 수준의 억제의 더 큰 감소 및 지속기간을 초래하였다. P6 또는 P7 화학적 변형 패턴을 갖는 RNAi 작제물은 2 mg/kg의 단일 피하 주사 후 최대 4주까지 혈청 Lp(a) 수준을 80% 넘게 감소시켰다.
[표 6]
LPA RNAi 작제물의 생체내 효능
Figure pct00018
다음으로, 화학적 변형 패턴의 대안적인 변형을 설계하고 이중 형질전환 마우스 모델에서 생체내 효능을 평가하였다. 화학적 변형 패턴의 변형을 5개의 상이한 서열 패밀리로부터의 서열을 갖는 RNAi 작제물에 적용하였다. 각 RNAi 작제물에 대한 센스 및 안티센스 가닥의 서열은 표 5에 제공되어 있고, 변형 패턴은 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. RNAi 작제물을 1 mg/kg의 용량으로 인간 Lp(a) 입자를 발현하는 이중 형질전환 마우스에게 피하 투여하였다. 기준선 수준을 얻기 위하여 주사 전에, 그리고 LPA RNAi 작제물을 투여한 후 제2주, 제3주 및 제4주에 동물에서 혈청 Lp(a) 수준을 측정하였다. 결과를 아래의 표 7에 나타내었다. 몇몇 패턴 변형, 예컨대 P9, P19, P22, P24, P27, P28, 및 P29는 1 mg/kg의 단일 피하 주사 4주 후에 50%를 초과하여 Lp(a) 혈청 수준을 감소시켰다. P27 화학적 변형 패턴을 갖는 RNAi 작제물은 단일 주사 후 4주 후에 약 75%의 Lp(a) 수준의 지속적인 감소를 초래하였으므로, Lp(a) 혈청 수준을 억제하는 데 특히 효과적이었다.
[표 7]
대안적인 화학적 변형 패턴이 있는 LPA RNAi 작제물의 생체내 효능
Figure pct00019
본원에 논의되고 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 개시된 발명은 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 물질이 변할 수 있으므로 이들에 제한되지 않음이 이해된다. 또한, 본원에 사용된 용어가 단지 특정 구현예를 설명하는 목적을 위한 것이며 첨부된 청구범위의 범위를 제한하려는 것이 아님이 이해된다.
당업자는 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나, 통상적 실험만으로도 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> CHEMICALLY-MODIFIED RNAi CONSTRUCTS AND USES THEREOF <130> A-2327-WO-PCT <150> 62/777,677 <151> 2018-12-10 <160> 127 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 1 cggccaaugu ccaccagcuu u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 2 cggccaaugu ccaccagcuu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 3 gguccagccu gaacuucuuu u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 4 gguccagccu gaacuucuuu u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 5 gcuucaugcc cuucuacagu u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 6 gcuucaugcc cuucuacagu u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 7 gcggcuuccu gggcuucuau u 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 8 gcggcuuccu gggcuucuau u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 9 gugacaacgu acccuucauu u 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 10 gugacaacgu acccuucauu u 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 11 gguauguucc ugcuucaugu u 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 12 gguauguucc ugcuucaugu u 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 13 guauguuccu gcuucaugcu u 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 14 guauguuccu gcuucaugcu u 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 15 uguuccugcu ucaugcccuu u 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 16 uguuccugcu ucaugcccuu u 21 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 17 guuccugcuu caugcccuuu u 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 18 guuccugcuu caugcccuuu u 21 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 19 ccugcuucau gcccuucuau u 21 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 20 ccugcuucau gcccuucuau u 21 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 21 cuucaugccc uucuacaguu u 21 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 22 cuucaugccc uucuacaguu u 21 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 23 uucaugcccu ucuacagugu u 21 <210> 24 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 24 uucaugcccu ucuacagugu u 21 <210> 25 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 25 augcccuucu acaguggccu u 21 <210> 26 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 26 augcccuucu acaguggccu u 21 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 27 gcuucaugcc cuucuacauu u 21 <210> 28 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 28 gcuucaugcc cuucuacauu u 21 <210> 29 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 29 cugcuucaug cccuucuaca 20 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 30 cugcuucaug cccuucuaca u 21 <210> 31 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 31 cugcuucaug ccuuucuaca 20 <210> 32 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 32 cugcuucaug ccuuucuaca 20 <210> 33 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 33 ugcuucaugc cuuucuacag 20 <210> 34 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 34 ugcuucaugc cuuucuacag 20 <210> 35 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 35 cugcuucaug ccuuucuaca 20 <210> 36 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 36 cugcuucaug ccuuucuaca u 21 <210> 37 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 37 cugcuucaug ccuuucuaca u 21 <210> 38 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 38 cugcuucaug ccuuucuaca 20 <210> 39 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 39 ugcuucaugc cuuucuacag 20 <210> 40 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 40 agcuggugga cauuggccgu u 21 <210> 41 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 41 agcuggugga cauuggccgu u 21 <210> 42 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 42 aagaaguuca ggcuggaccu u 21 <210> 43 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 43 aagaaguuca ggcuggaccu u 21 <210> 44 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 44 cuguagaagg gcaugaagcu u 21 <210> 45 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 45 cuguagaagg gcaugaagcu u 21 <210> 46 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 46 uagaagccca ggaagccgcu u 21 <210> 47 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 47 uagaagccca ggaagccgcu u 21 <210> 48 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 48 augaagggua cguugucacu u 21 <210> 49 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 49 augaagggua cguugucacu u 21 <210> 50 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 50 caugaagcag gaacauaccu u 21 <210> 51 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 51 caugaagcag gaacauaccu u 21 <210> 52 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 52 gcaugaagca ggaacauacu u 21 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 53 gcaugaagca ggaacauacu u 21 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 54 agggcaugaa gcaggaacau u 21 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 55 agggcaugaa gcaggaacau u 21 <210> 56 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 56 aagggcauga agcaggaacu u 21 <210> 57 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 57 aagggcauga agcaggaacu u 21 <210> 58 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 58 uagaagggca ugaagcaggu u 21 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 59 uagaagggca ugaagcaggu u 21 <210> 60 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 60 acuguagaag ggcaugaagu u 21 <210> 61 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 61 acuguagaag ggcaugaagu u 21 <210> 62 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 62 cacuguagaa gggcaugaau u 21 <210> 63 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 63 cacuguagaa gggcaugaau u 21 <210> 64 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 64 ggccacugua gaagggcauu u 21 <210> 65 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 65 ggccacugua gaagggcauu u 21 <210> 66 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 66 ggccacugua gaagggcauu u 21 <210> 67 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 67 auguagaagg gcaugaagca guu 23 <210> 68 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 68 auguagaaag gcaugaagca guu 23 <210> 69 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 69 auguagaaag gcaugaagca guu 23 <210> 70 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 70 auguagaaag gcaugaagca guu 23 <210> 71 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 71 auguagaaag gcaugaagca guu 23 <210> 72 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 72 acuguagaaa ggcaugaagc auu 23 <210> 73 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 73 ucuguagaaa ggcaugaagc auu 23 <210> 74 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 74 auguagaaag gcaugaagca guu 23 <210> 75 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 75 auguagaaag gcaugaagca guu 23 <210> 76 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 76 auguagaaag gcaugaagca guu 23 <210> 77 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 77 auguagaaag gcaugaagca guu 23 <210> 78 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 78 auguagaaag gcaugaagca guu 23 <210> 79 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 79 auguagaaag gcaugaagca guu 23 <210> 80 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 80 auguagaaag gcaugaagca guu 23 <210> 81 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 81 gugggaagaa agaugaaguu u 21 <210> 82 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 82 gugggaagaa agaugaaguu u 21 <210> 83 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 83 acuucaucuu ucuucccacu u 21 <210> 84 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 84 acuucaucuu ucuucccacu u 21 <210> 85 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 85 gccccuuauu guuauacgau u 21 <210> 86 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 86 gccccuuauu guuauacgau u 21 <210> 87 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 87 acacaaugcu cagacgcagu u 21 <210> 88 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 88 ugacacaaug cucagacgca g 21 <210> 89 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 89 ugacacaaug cucagacgca 20 <210> 90 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 90 acacaaugcu cagacgcaau 20 <210> 91 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 91 acacaaugcu cagacgca 18 <210> 92 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 92 ccuagaggcu ccuucugaau u 21 <210> 93 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 93 agccuagagg cuccuucuga a 21 <210> 94 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 94 uucgcccuug guguuacacc a 21 <210> 95 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 95 cgcccuuggu guuacaccau u 21 <210> 96 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 96 cgcccuuggu guuacacca 19 <210> 97 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 97 cagaaucaag uguccuugca 20 <210> 98 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 98 gaaucaagug uccuugcaau u 21 <210> 99 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 99 cagaaucaag uguccuugca 20 <210> 100 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 100 aaucaagugu ccuugcaauu 20 <210> 101 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 101 agaaucaagu guccuugcaa 20 <210> 102 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 102 agucuugguc cucuaugaca 20 <210> 103 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 103 agucuugguc cucuaugaca 20 <210> 104 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 104 uucugaagaa gcaccaacuu u 21 <210> 105 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 105 uucugaagaa gcaccaacuu u 21 <210> 106 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 106 ccuucugaag aagcaccaac 20 <210> 107 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 107 ucguauaaca auaaggggcu u 21 <210> 108 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 108 ucguauaaca auaaggggcu u 21 <210> 109 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 109 cugcgucuga gcauuguguu u 21 <210> 110 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 110 cugcgucuga gcauuguguc auu 23 <210> 111 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 111 uugcgucuga gcauuguguc auu 23 <210> 112 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 112 uugcgucuga gcauuguguu u 21 <210> 113 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 113 uucagaagga gccucuaggu u 21 <210> 114 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 114 uucagaagga gccucuaggc uuu 23 <210> 115 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 115 ugguguaaca ccaagggcga auu 23 <210> 116 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 116 ugguguaaca ccaagggcgu u 21 <210> 117 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 117 ugguguaaca ccaagggcgu u 21 <210> 118 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 118 uugcaaggac acuugauucu guu 23 <210> 119 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 119 uugcaaggac acuugauucu u 21 <210> 120 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 120 uugcaaggac acuugauucu g 21 <210> 121 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 121 auugcaagga cacuugauuu u 21 <210> 122 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 122 auugcaagga cacuugauuc u 21 <210> 123 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 123 augucauaga ggaccaagac uuu 23 <210> 124 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 124 augucauaga ggaccaagac uuu 23 <210> 125 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 125 augucauaga ggaccaagac uuu 23 <210> 126 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 126 aguuggugcu ucuucagaau u 21 <210> 127 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 127 aguuggugcu ucuucagaag guu 23

Claims (71)

  1. 표적 유전자 서열의 발현을 억제하는 RNAi 작제물로서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 표적 유전자 서열에 상보적인 서열을 포함하고 센스 가닥은 이중체 영역을 형성하도록 안티센스 가닥의 서열에 충분히 상보적인 서열을 포함하고, 이때, RNAi 작제물은 식 (A)로 표시되는 구조를 포함하고,
    5′-(NA)x NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NM NL NM NL NT(n)y-3′
    3′-(NB)z NL NL NL NL NL NF NL NM NL NM NL NL NF NM NL NM NL NF NL-5′
    (A)
    식에서,
    5'에서 3'의 방향으로 열거된 윗 가닥은 센스 가닥이고 3'에서 5'의 방향으로 열거된 아랫 가닥은 안티센스 가닥이고;
    각각의 NF는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고;
    각각의 NM은 독립적으로 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, 이환식 핵산(BNA), 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
    각각의 NL은 독립적으로 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
    NT는 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
    x는 0 내지 4의 정수이나, 단, x가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이고, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 안티센스 가닥의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있고;
    y는 0 내지 4의 정수이나, 단, y가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, 1개 이상의 n 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 변형된 또는 변형되지 않은 오버행 뉴클레오티드이고;
    z는 0 내지 4의 정수이나, 단, z가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이고, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 센스 가닥에 존재할 때 NA 뉴클레오티드에 상보적일 수 있거나, 또는 센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 오버행 뉴클레오티드일 수 있는 것인, RNAi 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 19 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인, RNAi 작제물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 19 내지 25개의 뉴클레오티드 길이인, RNAi 작제물.
  4. 제1항에 있어서, x는 0, y는 2, z는 2인, RNAi 작제물.
  5. 제1항에 있어서, x는 1이고, NA는 반전된 무염기 뉴클레오티드이고, y는 2, z는 2인, RNAi 작제물.
  6. 제1항에 있어서, x는 2, y는 0, z는 4인, RNAi 작제물.
  7. 제1항에 있어서, x는 2, y는 0, z는 2인, RNAi 작제물.
  8. 제1항에 있어서, x는 3이고, 5' 말단의 NA는 반전된 무염기 뉴클레오티드이고, y는 0, z는 4인, RNAi 작제물.
  9. 제1항에 있어서, x는 0, y는 0, z는 2인, RNAi 작제물.
  10. 제1항에 있어서, x는 1이고, NA는 반전된 무염기 뉴클레오티드이고, y는 0, z는 2인, RNAi 작제물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, NT는 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥의 각각의 NL은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4 및 12번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  14. 제13항에 있어서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 6번의 NM은 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  15. 제14항에 있어서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 10번의 NM은 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 10 및 12번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  17. 제16항에 있어서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4번의 NM은 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4, 6, 및 10번의 NM은 각각 2′ O-메틸 변형된 뉴클레오티드이고, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 12번의 NM은 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥의 각각의 NM은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥의 각각의 NM은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥의 각각의 NM은 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  22. 표적 유전자 서열의 발현을 억제하는 RNAi 작제물로서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 표적 유전자 서열에 상보적인 서열을 포함하고 센스 가닥은 이중체 영역을 형성하도록 안티센스 가닥의 서열에 충분히 상보적인 서열을 포함하고, 이때, RNAi 작제물은 식 (B)로 표시되는 구조를 포함하고,
    5′-(NA)x NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NL NL NL NL NT(n)y-3′
    3′-(NB)z NL NL NL NL NL NF NL NF NL NL NL NL NF NF NL NF NL NF NL-5′
    (B)
    식에서,
    5'에서 3'의 방향으로 열거된 윗 가닥은 센스 가닥이고 3'에서 5'의 방향으로 열거된 아랫 가닥은 안티센스 가닥이고;
    각각의 NF는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고;
    각각의 NL은 독립적으로 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
    NT는 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
    x는 0 내지 4의 정수이나, 단, x가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이고, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 안티센스 가닥의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있고;
    y는 0 내지 4의 정수이나, 단, y가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, 1개 이상의 n 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 변형된 또는 변형되지 않은 오버행 뉴클레오티드이고;
    z는 0 내지 4의 정수이나, 단, z가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이고, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 센스 가닥에 존재할 때 NA 뉴클레오티드에 상보적일 수 있거나, 또는 센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 오버행 뉴클레오티드일 수 있는 것인, RNAi 작제물.
  23. 제22항에 있어서, x는 0, y는 2, z는 2인, RNAi 작제물.
  24. 제22항에 있어서, x는 0, y는 0, z는 2인, RNAi 작제물.
  25. 제22항에 있어서, x는 1이고, NA는 반전된 무염기 뉴클레오티드이고, y는 2, z는 2인, RNAi 작제물.
  26. 제22항에 있어서, x는 2, y는 0, z는 4인, RNAi 작제물.
  27. 제22항에 있어서, x는 3이고, 5' 말단의 NA는 반전된 무염기 뉴클레오티드이고, y는 0, z는 4인, RNAi 작제물.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, NT는 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥의 각각의 NL은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  30. 표적 유전자 서열의 발현을 억제하는 RNAi 작제물로서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 표적 유전자 서열에 상보적인 서열을 포함하고 센스 가닥은 이중체 영역을 형성하도록 안티센스 가닥의 서열에 충분히 상보적인 서열을 포함하고, 이때, RNAi 작제물은 식 (C)로 표시되는 구조를 포함하고,
    5′-(Ab)x NL NL NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NM NL NM NL NT-3′
    3′-NL NL NL NL NL NL NL NL NL NF NL NF NL NL NL NL NF NL NL NM NL NF NL-5′
    (C)
    식에서,
    5'에서 3'의 방향으로 열거된 윗 가닥은 센스 가닥이고 3'에서 5'의 방향으로 열거된 아랫 가닥은 안티센스 가닥이고;
    각각의 NF는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고;
    각각의 NL은 독립적으로 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
    각각의 NM은 독립적으로 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
    NT는 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
    x는 0 또는 1이고, Ab는 반전된 무염기 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  31. 제30항에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥의 각각의 NM은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  32. 제31항에 있어서, NT는 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드이고, x는 0인, RNAi 작제물.
  33. 제31항에 있어서, NT는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이고, x는 1인, RNAi 작제물.
  34. 제30항에 있어서, 안티센스 가닥의 NM은 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  35. 제34항에 있어서, 센스 가닥의 각각의 NM은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  36. 제34항에 있어서, 센스 가닥의 각각의 NM은 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, NT는 반전된 무염기 뉴클레오티드 또는 반전된 데옥시리보뉴클레오티드이고, x는 0인, RNAi 작제물.
  38. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥의 각각의 NL은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  39. 표적 유전자 서열의 발현을 억제하는 RNAi 작제물로서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 표적 유전자 서열에 상보적인 서열을 포함하고 센스 가닥은 이중체 영역을 형성하도록 안티센스 가닥의 서열에 충분히 상보적인 서열을 포함하고, 이때, RNAi 작제물은 식 (D)로 표시되는 구조를 포함하고,
    5′-(NA)x NL NL NL NL NM NL NF NF NF NF NL NL NL NL NL NL NL NL NT(n)y-3′
    3′-(NB)z NL NL NL NM NL NF NL NM NL NL NM NM NM NM NL NM NL NF NL-5′
    (D)
    식에서,
    5'에서 3'의 방향으로 열거된 윗 가닥은 센스 가닥이고 3'에서 5'의 방향으로 열거된 아랫 가닥은 안티센스 가닥이고;
    각각의 NF는 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고;
    각각의 NM은 독립적으로 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, 이환식 핵산(BNA), 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
    각각의 NL은 독립적으로 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
    NT는 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 나타내고;
    x는 0 내지 4의 정수이나, 단, x가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 무염기 뉴클레오티드, 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이고, NA 뉴클레오티드 중 1개 이상은 안티센스 가닥의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있고;
    y는 0 내지 4의 정수이나, 단, y가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, 1개 이상의 n 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 변형된 또는 변형되지 않은 오버행 뉴클레오티드이고;
    z는 0 내지 4의 정수이나, 단, z가 1, 2, 3, 또는 4인 경우, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오티드, BNA, 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 변형된 뉴클레오티드이고, NB 뉴클레오티드 중 1개 이상은 센스 가닥에 존재할 때 NA 뉴클레오티드에 상보적일 수 있거나, 또는 센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는 오버행 뉴클레오티드일 수 있는 것인, RNAi 작제물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 19 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인, RNAi 작제물.
  41. 제39항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 19 내지 25개의 뉴클레오티드 길이인, RNAi 작제물.
  42. 제39항에 있어서, x는 2, y는 0, z는 4인, RNAi 작제물.
  43. 제39항에 있어서, x는 1이고, NA는 반전된 무염기 뉴클레오티드이고, y는 2, z는 2인, RNAi 작제물.
  44. 제39항에 있어서, x는 1이고, NA는 반전된 무염기 뉴클레오티드이고, y는 0, z는 2인, RNAi 작제물.
  45. 제39항에 있어서, x는 0, y는 0, z는 2인, RNAi 작제물.
  46. 제39항에 있어서, x는 2, y는 0, z는 2인, RNAi 작제물.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, NT는 반전된 무염기 뉴클레오티드, 반전된 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  48. 제39항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥의 각각의 NL은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  49. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4, 6, 8, 9, 및 16번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 7 및 12번의 NM은 각각 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  50. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4, 6, 8, 9, 및 16번의 NM은 각각 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이고, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 7 및 12번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  51. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4, 6, 8, 9, 및 12번의 NM은 각각 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이고, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 7 및 16번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  52. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 7, 8, 9, 및 12번의 NM은 각각 2′-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이고, 5' 말단으로부터 계산하는 안티센스 가닥의 위치 4, 6, 및 16번의 NM은 각각 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  53. 제39항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥의 NM은 2′-플루오로 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  54. 제39항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥의 NM은 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드인, RNAi 작제물.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 및 안티센스 가닥 둘 다는 1개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 것인, RNAi 작제물.
  56. 제55항에 있어서, 안티센스 가닥은 3' 및 5' 말단 둘 다의 말단 뉴클레오티드들 사이에 2개의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 것인, RNAi 작제물.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 센스 가닥은 3' 말단의 말단 뉴클레오티드들 사이에 단일 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 것인, RNAi 작제물.
  58. 제55항 또는 제56항에 있어서, 센스 가닥은 3' 말단의 말단 뉴클레오티드들 사이에 2개의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 것인, RNAi 작제물.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드를 추가로 포함하는, RNAi 작제물.
  60. 제59항에 있어서, 리간드는 콜레스테롤 모이어티, 비타민, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트 모이어티, 지방산, 탄수화물, 글리코시드, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인, RNAi 작제물.
  61. 제59항에 있어서, 리간드는 간세포로 RNAi 작제물을 전달하는 것을 표적화하는 것인, RNAi 작제물.
  62. 제59항에 있어서, 리간드는 갈락토스, 갈락토사민, 또는 N-아세틸-갈락토사민을 포함하는 것인, RNAi 작제물.
  63. 제62항에 있어서, 리간드는 다가 갈락토스 모이어티 또는 다가 N-아세틸-갈락토사민 모이어티를 포함하는 것인, RNAi 작제물.
  64. 제63항에 있어서, 다가 갈락토스 모이어티 또는 다가 N-아세틸-갈락토사민 모이어티는 3가 또는 4가인 것인, RNAi 작제물.
  65. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드는 선택적으로 링커를 통해 센스 가닥에 공유적으로 부착되는 것인, RNAi 작제물.
  66. 제65항에 있어서, 리간드는 센스 가닥의 5' 말단에 공유적으로 부착되는 것인, RNAi 작제물.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 RNAi 작제물 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  68. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 RNAi 작제물과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 세포는 생체내에 있는 것인, 방법.
  70. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항의 RNAi 작제물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, RNAi 작제물은 비경구 투여 경로를 통해 대상체에게 투여되는 것인, 방법.
KR1020217020966A 2018-12-10 2019-12-09 화학적으로 변형된 RNAi 작제물 및 이의 용도 KR20210102313A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862777677P 2018-12-10 2018-12-10
US62/777,677 2018-12-10
PCT/US2019/065294 WO2020123410A1 (en) 2018-12-10 2019-12-09 CHEMICALLY-MODIFIED RNAi CONSTRUCTS AND USES THEREOF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210102313A true KR20210102313A (ko) 2021-08-19

Family

ID=69024730

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217020966A KR20210102313A (ko) 2018-12-10 2019-12-09 화학적으로 변형된 RNAi 작제물 및 이의 용도

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20220049252A1 (ko)
EP (1) EP3894554A1 (ko)
JP (1) JP2022511866A (ko)
KR (1) KR20210102313A (ko)
CN (1) CN113166759A (ko)
AU (1) AU2019395341A1 (ko)
BR (1) BR112021011043A2 (ko)
CA (1) CA3122393A1 (ko)
CL (1) CL2021001490A1 (ko)
EA (1) EA202191630A1 (ko)
IL (1) IL283550A (ko)
MX (1) MX2021006745A (ko)
SG (1) SG11202105900UA (ko)
WO (1) WO2020123410A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230046319A (ko) 2020-08-13 2023-04-05 암젠 인크 MARC1 발현을 억제하기 위한 RNAi 작제물 및 방법
AU2021373780A1 (en) * 2020-11-05 2023-06-08 Amgen Inc. METHODS FOR TREATING ATHEROSCLEROTIC CARDIOVASCULAR DISEASE WITH LPA-TARGETED RNAi CONSTRUCTS
AU2022308807A1 (en) * 2021-07-08 2024-02-01 Olix Pharmaceuticals, Inc. Rnai agent targeting marc1 gene, and use thereof
CN114703184B (zh) * 2022-03-11 2024-06-18 厦门甘宝利生物医药有限公司 Lpa抑制剂及其用途
WO2023207615A1 (zh) * 2022-04-26 2023-11-02 南京明德新药研发有限公司 一类含由天然核苷酸组成突出端的双链RNAi化合物
US20240084301A1 (en) 2022-07-25 2024-03-14 Amgen Inc. Rnai constructs and methods for inhibiting fam13a expression
WO2024023254A1 (en) * 2022-07-27 2024-02-01 E-Therapeutics Plc Nucleic acid compounds
WO2024023256A1 (en) * 2022-07-27 2024-02-01 E-Therapeutics Plc Nucleic acid compounds
WO2024061185A1 (zh) * 2022-09-20 2024-03-28 上海舶望制药有限公司 特定修饰的RNAi试剂和组合物

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5981505A (en) 1993-01-26 1999-11-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for delivery of genetic material
US5837533A (en) 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
US5840710A (en) 1994-12-09 1998-11-24 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing ester or ether-linked lipophilic groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
EP0832271B8 (en) 1995-06-07 2005-03-02 INEX Pharmaceuticals Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US6217900B1 (en) 1997-04-30 2001-04-17 American Home Products Corporation Vesicular complexes and methods of making and using the same
US6887906B1 (en) 1997-07-01 2005-05-03 Isispharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US6693187B1 (en) 2000-10-17 2004-02-17 Lievre Cornu Llc Phosphinoamidite carboxlates and analogs thereof in the synthesis of oligonucleotides having reduced internucleotide charge
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US20030130186A1 (en) 2001-07-20 2003-07-10 Chandra Vargeese Conjugates and compositions for cellular delivery
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
EP2298358A1 (en) 2002-05-06 2011-03-23 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Methods for delivery of nucleic acids
US8017762B2 (en) 2003-04-17 2011-09-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
US7723509B2 (en) 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
US7851615B2 (en) 2003-04-17 2010-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipophilic conjugated iRNA agents
EP2669377A3 (en) 2003-04-17 2015-10-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
US8877917B2 (en) 2007-04-23 2014-11-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycoconjugates of RNA interference agents
AU2008340355B2 (en) 2007-12-04 2015-01-22 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Targeting lipids
MX2018012038A (es) * 2011-11-18 2021-09-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de iarn modificados.
AR090905A1 (es) 2012-05-02 2014-12-17 Merck Sharp & Dohme Conjugados que contienen tetragalnac y peptidos y procedimientos para la administracion de oligonucleotidos, composicion farmaceutica
AU2014284152B2 (en) 2013-06-21 2020-01-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of target nucleic acids
NZ730296A (en) * 2014-08-20 2023-09-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded rna agents
AU2016332900C1 (en) 2015-09-29 2024-07-04 Amgen Inc. ASGR inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
CA3122393A1 (en) 2020-06-18
EA202191630A1 (ru) 2021-11-29
SG11202105900UA (en) 2021-07-29
JP2022511866A (ja) 2022-02-01
BR112021011043A2 (pt) 2021-08-31
CN113166759A (zh) 2021-07-23
WO2020123410A1 (en) 2020-06-18
AU2019395341A1 (en) 2021-06-17
US20220049252A1 (en) 2022-02-17
CL2021001490A1 (es) 2022-01-14
MX2021006745A (es) 2021-07-15
EP3894554A1 (en) 2021-10-20
IL283550A (en) 2021-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210102313A (ko) 화학적으로 변형된 RNAi 작제물 및 이의 용도
JP7245254B2 (ja) 細胞におけるｌｐａの発現を抑制するための核酸
JP7472180B2 (ja) ＡＳＧＲ１発現を阻害するためのＲＮＡｉコンストラクトおよびその使用方法
JP7245328B2 (ja) 細胞におけるｌｐａの発現を抑制するための核酸
JP2020516312A (ja) 産物及び組成物
US20230078200A1 (en) RNAi CONSTRUCTS AND METHODS FOR INHIBITING LPA EXPRESSION
JP2021520207A (ja) アンチセンス鎖の５’末端でビニルホスホネートを有するｓｉＲＮＡ
CA3184345A1 (en) Rnai constructs for inhibiting hsd17b13 expression and methods of use thereof
KR20220016138A (ko) Scap 발현을 저해하기 위한 rnai 구성체 및 이의 사용 방법
KR20230046319A (ko) MARC1 발현을 억제하기 위한 RNAi 작제물 및 방법
US20240084301A1 (en) Rnai constructs and methods for inhibiting fam13a expression
AU2022359289A1 (en) Compositions and methods for enhancing gene silencing activity of oligonucleotide compounds
RU2812806C2 (ru) Нуклеиновые кислоты для ингибирования экспрессии гена-мишени, содержащие фосфодитиоатные связи
WO2024130142A2 (en) Rnai constructs for inhibiting ttr expression and methods of use thereof
WO2021030613A1 (en) Rnai constructs for inhibiting slc30a8 expression and methods of use thereof
EA045986B1 (ru) Нуклеиновые кислоты для ингибирования экспрессии lpa в клетке