KR20210099858A - 폐부종 진단용 바이오마커 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

CPT2 및 ADRA1A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐부종 진단용 조성물, 키트 및 진단 정보 제공방법을 제공하며, 이에 따르면 리토드린 투여 후 폐부종 위험군을 객관적이고, 간편하고 높은 정확도 및 특이도로 진단 가능하다.

Description

폐부종 진단용 바이오마커 및 그의 용도{Biomarker for diagnosing pulmonary edema and use thereof}

폐부종 진단용 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.

주산기 이환율과 사망률에 미치는 영향을 고려할 때 조산은 산과 영역에서 가장 주요한 질환이다. 조기진통은 전체 조산의 1/3 이상을 차지하는 원인 질환으로서 아직까지 이에 대한 확실한 예방 및 치료가 어려운 상태이다. 조기진통의 치료를 위해 사용하는 자궁수축 억제제 중 리토드린(ritodrine)은 FDA 승인을 받은 자궁수축 억제제로서 정맥주사의 형태로 조기진통 환자에서 국내에서 가장 많이 쓰이는 약이다. 분만까지의 기간을 어느 정도 (약 48 시간) 지연시켜 주나, 궁극적으로 조산을 예방하지는 못하는 것으로 되어 있으며 심계항진, 빈맥, 폐부종, 저칼륨혈증, 고혈당 등의 부작용이 나타날 수 있고 이 때문에 투여를 중단해야 하는 경우가 종종 있다. 하지만 어떠한 환자군에서 리토드린으로 인한 부작용이 더 많이 생기는지에 관한 선행 연구는 부족한 실정으로 이에 대한 예측이 어렵다. 이러한 기술적 배경 하에서, 리토드린의 부작용에 대한 연구가 활발이 진행되고 있으나(한국특허출원 10-2007-7009109), 아직은 미비한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 약제 사용 중 부작용으로 폐부종 (pulmonary edema)이 발생한 산모와 발생하지 않은 산모 간의 유전체를 비교 분석하여 자궁수축억제제의 가장 치명적인 부작용 중 하나인 폐부종이 발생할 가능성이 있는 환자를 선별할 수 있는 유전체 변이를 밝히고자 하였다. 자궁수축억제제 사용 전에 폐부종 발생의 고위험군을 미리 선별해낼 수 있다면, 향후 임상에서 자궁수축억제제 사용 진료 지침에 획기적인 도움을 줄 수 있는 유용한 검색 도구로 사용될 수 있을 것이다.

일 양상은 CPT2 및 ADRA1A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐부종 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 폐부종은 리토드린 투여로 유발된 것인 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 제제는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머; 또는 상기 유전자의 핵산 서열과 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산인 것인 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 핵산은 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인 조성물을 제공하는 것이다.

일 양상은 CPT2 및 ADRA1A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐부종 진단용 키트를 제공하는 것이다.

일 양상은 CPT2 및 ADRA1A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 이의 단백질의 발현 수준을 생물학적 시료로부터 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 폐부종을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합인 것인 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, CPT2 또는 ADRA1A 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, CPT2 또는 ADRA1A 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 전자현미경법(electron microscopy), 또는 이들의 조합으로 수행되는 것인 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 방법은 상기 CPT2 또는 ADRA1A 발현 수준이 정상 대조군의 CPT2 또는 ADRA1A 발현 수준과 비교하여 증가되었는지 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 CPT2 및 ADRA1A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐부종 진단용 조성물이다.

용어 "진단(diagnosis)"은 병명을 판정하는 일을 말하고, 폐부종의 병명, 병의 상태, 병기, 병인, 합병증의 유무, 예후, 및 재발 등을 포함할 수 있다.

상기 폐부종은 여러 가지 원인에 의해 폐정맥 및 모세혈관 내에서 폐의 간질조직과 폐포로 체액이 빠져나가면서 폐포와 기도에 울혈되어 가스교환을 악화시켜 저산소증을 일으키는 것을 의미하며, 심장의 질병이나 장애가 원인이 되어 발생하는 심인성과 그 밖의 원인으로 발생하는 비심인성이 원인일 수 있고 리토드린 투여의 부작용에서 유래한 것일 수 있다.

상기 CPT2(carnitine palmitoyltransferase 2)는 미토콘드리아의 장쇄 지방산의 산화에 필요한 효소를 암호화한다. 심장은 미토콘드리아 산화 대사에 크게 의존하는 고 에너지 소모 기관이며, 미토콘드리아의 대사 장애는 심장 비대 리모델링 및 심장 기능 부진을 유발할 수 있다. CPT2-결핍 마우스 모델은 혈액 배출 분율의 현저한 감소, 심장 비대 및 수축기 기능 장애를 나타냈다. 또한, CPT-2 결핍 생쥐는 내피 세포의 접합 특성 손상 및 장벽 기능 감소로 인해 신장, 비장 및 폐에서 혈관 투과성을 증가시켰다. 종합하면 CPT2의 결핍은 우심실의 기능 감소 및 폐 조직의 혈관 투과성 증가를 통하여 폐부종의 발병에 기여할 수 있다.

상기 ADRA1A는 칼슘 채널과 관련된 β- 아드레날린 수용체를 암호화하는 유전자이다. 수용체-채널 복합체는 리토드린으로 유도된 tocolysis의 메커니즘과 관련된 G-단백질, 아데닐릴 싸이클라제 및 cAMP-의존성 키나아제를 포함한다. β- 아드레날린 수용체는 자궁 평활근뿐만 아니라 폐 조직에도 존재한다. β- 녹아웃 생쥐는 여분의 물을 폐로부터 제거하는 능력이 감소했으며, 급성 폐 손상 후에는 폐부종이 발생했다. β- 아드레날린 수용체는 내피 수축 및 세포 내 갭 형성의 억제를 통해 내피 장벽 기능을 향사시킬 수 있고, 폐포 세포의 계면 활성제 분비를 조절할 수 있다. 따라서 β- 아드레날린 수용체에서의 기능 감소는 폐포의 유지, 내피 장벽 기능 및 계면 활성제 분비의 이상을 초래할 수 있으며 이는 모두 폐부종의 발병에 기여할 수 있다.

상기 제제는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머; 또는 상기 유전자의 핵산 서열과 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산인 것인 조성물을 제공하는 것이다.

용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 다중클론 항체(polyclonal antibody) 또는 단클론 항체(monoclonal antibody)일 수 있다. 상기 항체는 전장 항체일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab', 또는 scFv일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어, 금속 칩, 플레이트, 또는 웰(well)의 표면이다.

상기 핵산은 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고 뉴클레오티드인 것인 조성물을 제공하는 것이다. 상기 프라이머 또는 프로브는 그의 말단 또는 내부에 형광 물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 것일 수 있다.

일 양상은 CPT2 및 ADRA1A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐부종 진단용 키트이다.

상기 키트는 폐부종 진단에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 고체 지지체, 항체 또는 항원 결합 단편의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소, 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 키트는 핵산 검출을 위하여, 중합효소, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 중합 효소는 예를 들어 Taq 중합효소이다.

일 양상은 CPT2 및 ADRA1A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 이의 단백질의 발현 수준을 생물학적 시료로부터 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 폐부종을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법이다.

용어 "정상 대조군(normal control)"은 용어 "음성 대조군(negative control)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 정상 대조군은 리토드린 투여 후 폐부종에 걸린 적이 없는 개체 또는 건강한 개체일 수 있다.

상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합인 것인 방법이다. 생물학적 시료가 채집되는 개체는 포유동물, 예를 들어, 사람, 개, 고양이, 마우스, 토끼, 말, 양, 햄스터, 고슴도치, 페럿(ferret), 또는 기니 피그(guinea pig)일 수 있다. 상기 개체는 폐부종을 앓거나 앓는 것으로 의심되는 개체일 수 있다.

상기 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, CPT2 또는 ADRA1A 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법이다.

상기 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, CPT2 또는 ADRA1A 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법이다.

상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 전자현미경법(electron microscopy), 또는 이들의 조합으로 수행되는 것인 방법이다.

상기 방법은 상기 CPT2 또는 ADRA1A 발현 수준이 정상 대조군의 CPT2 또는 ADRA1A 발현 수준과 비교하여 증가되었는지 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법이다.

CPT2 및 ADRA1A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐부종 진단용 조성물, 키트 및 진단 정보 제공방법을 이용하여, 폐부종 위험군을 객관적이고, 간편하고 높은 정확도 및 특이도로 진단 가능하다.

도 1은 폐부종 위험군 유전자를 선별하기 위한 알고리즘을 나타낸 결과이다.
도 2는 전장 엑솜 분석이 수행된 개체에 대한 생어 시퀀싱을 나타낸 결과이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 폐부종 위험군 유전자의 선별을 위한 전장엑솜분석

조산을 방지하기 위해 리토드린을 투여한 환자에게서 혈액을 채취하고, 분석 할 때까지 혈액 샘플을 -70 ℃에 보관 하였다. 저장되어 있던 혈액 샘플의 전체 게놈의 코딩 서열 영역을 스크리닝하기 위해 Ion AmpliSeq ™ Exome 패널을 사용하여 엑솜 시퀀싱을 수행 하였다. 이 패널은 19,072 개 유전자의 엑솜을 포함하였고 총 표적 영역의 크기는 57.7 Mb였다. 패널은 PCR 동안 프라이머-이합체 형성 및 간섭을 피하기 위해 12 개의 풀로 다중화 된 293,903 프라이머 쌍을 함유 하였다. 이러한 올리고 프라이머 쌍에 의해 증폭 된 앰플리콘의 범위는 125 내지 275 bp의 범위였으며, 이 패널에 대한 "표적 상(on target)" 적용률은 95.69 %였다. PCR 분석을 직접 수행하여 골수 흡인물 또는 말초 혈액의 정상 혈액 세포로부터 추출 된 100ng의 게놈 DNA 샘플을 증폭시켜 패널의 올리고 프라이머 쌍을 사용하여 표적 영역을 수집 하였다. 반응 파라미터는 다음과 같았다: 99 ℃에서 2 분; 이어서 99 ℃에서 15 초 동안, 60 ℃에서 16 분 동안 및 10 ℃에서 1 분 동안 10 회 사이클을 수행 하였다. 증폭 후, 제조업체의 지침서 (Thermo science, Waltham, MA)에 기술 된 바와 같이 Ion Ampliseq 라이브러리 키트 플러스를 사용하여 라이브러리 구축을 수행 하였다. 라이브러리는 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, California, Santa Clara, CA)를 사용하여 정량화 한 다음 ~ 10 pM으로 희석되었다. 이어서, 33.3 μL의 바 코딩 된 라이브러리를 3 개의 바코드 세트로 조합 하였다. 결합 된 라이브러리는 제조사의 지시 사항 (Thermo Scientific, MA Waltham, MA)에 따라 PI 칩 V3과 함께 이온 양성자 플랫폼을 사용하여 시퀀싱되었다.

실시예 2: 전장 엑솜 분석으로 얻어진 데이터의 분석

판독값은 Torrent Suite (v4.4)를 사용하여 인간 게놈 참조 서열 (hg19 / GRCh37)에 매핑되었다. 정렬 된 판독 값은 SAMTools (v0.1.19)를 통해 정렬 및 색인화되었다. 국소적 재조정 및 기본 재보정 (dbSNP137 및 hg19 사이트의 Mills and 1000 Genome Project gold-standard indels)을 위해 게놈 분석 툴킷 (GATK, v2.8.1)을 사용했다. 변이 검출(Variant calling)은 GATK에서 HaplotypeCaller를 사용하여 수행되었다. ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org)을 사용하여 변이에 주석을 달았다(annotate). 오탐지 가능성을 제거하기 위해 1KGP (1000 Genomes Project, Phase 3)에서 이전에 확인 된 변이만 추가 분석에 포함되었다. SnpEff 4.1 (빌드 2015-01-07)을 사용하여 기능 변형(missense, stop gained, stop lost, start lost)이 선택되었다. 유전자의 변이체 부담(Gene-wise variant burden, GVB) 점수를 계산하여 유전자의 모든 코딩 변이체에 대한 누적 유전자 효과를 예측 하였다. 19,729 개의 단백질 코딩 유전자에 대해, 환자와 매칭 된 대조군 사이의 평균 GVB를 비교 하였다. 감수성 유전자좌를 찾아 내기 위해, 유전자의 변이체에 대해 Fisher의 정확검정을 수행하여 통계적으로 유의미한 연관성을 나타냈다. 유해한 변이를 선택하기 위해 SIICO ≤ 0.05 (Ng 2003), CADD SIFT ≥ 15로 silico bioinformatics의 두 가지의 기준 중 하나 이상의 기준을 충족시키는 유전자 변이를 선별했다. 후보 변이체를 포함하는 생물학적 기능, 약물 및 유전자 경로의 연관성을 KEGG Drug, KEGGPathway 및 Drug2 Gene 데이터베이스를 통해 검토했다.

실시예 3: 생어(Sanger) 염기서열 분석

최종적으로 선별된 실시예 2의 폐부종 위험군 유전자의 독립검증을 위해 생어 염기서열 분석을 실시했다. 생어 염기서열 분석은 하기와 같이 이루어졌다.

rs2229291 위치를 포함하는 CPT2의 엑손 4 및 rs2229126 위치를 포함하는 ADRA1A의 엑손 2가 생어 시퀀싱을 위해 증폭되었다. 올리고-프라이머 쌍을 사용하여 표적 영역을 수집하기 위해 20ng의 게놈 DNA 샘플을 직접 증폭시키기 위해 PCR 분석을 수행 하였다. 반응 파라미터는 다음과 같았다: 5 분 동안 95 ℃, 이어서 30 초 동안 95 ℃, 30 초 동안 58 ℃, 1 분 동안 72 ℃ 및 10 분 동안 72 ℃의 35 사이클. RBC HiYield Gel / PCR DNA Mini Kit를 사용하여 PCR 산물 (타이페이 카운티 220, 대만)의 DNA를 정제했다. 정제 후, PCR 샘플은 ABI 3100 반자동 시퀀싱 분석기 (Applied Biosystems, Lincoln Center Drive Foster City, CA, USA)를 사용하여 직접 시퀀싱되었다. DNA 서열은 FinchTV 버전 1.4.0 (Geospiza, Inc., Seattle, WA, USA)을 사용하여 분석되었다.

32 명의 개체에서 2 개의 유전자좌 각각에 대한 생어 서열은 NGS 서열과 완벽하게 일치 하였다. 결과는 리토드린-유도 폐부종을 갖는 개체가 폐부종이 없는 개체보다 동형 접합체 (CPT2 rs2229291, GG) 또는 이종 접합체 (CPT2 rs2229291, TG) 변이체의 수가 상당히 많음을 보여 주었다. 도 2에 나타난 바와 같이 ADRA1A (rs2229126, TA)에 대한 변형은 이형 접합 상태의 폐부종을 가진 개체에서만 확인되었다. 이는 동형 접합 ADRA1A 변이체 보인자(carrier)에서 리토드린을 사용한 후에 중대한 부작용이 발생할 수 있음을 의미한다.

하기 표 1은 리토드린에 의한 폐부종의 두가지 주요 유전자를 나타낸다. KEGG Drug의 Perhexiline(calcium channel blocker) 표적 유전자로 알려진 CPT2 rs2229291은 G 대립 유전자가 실질적인 효과 크기를 가진 공통 (17 %) 인 동아시아 개체에게 특이적이다(OR = 4.6 (1.3-19.5), 피셔의 정확 검정 p- 값 = 0.014). Drug2Gene 데이터베이스를 통해 리토드린과 관련이 있는 ADRA1A rs2229126은 한계 연관 신호 (OR = Inf (1.0-Inf), Fisher의 정확 검정 p- 값 = 0.053)를 가졌다.

하기 표 2는 두 개의 독립된 위치에서 0 내지 4개의 위험군 유전자의 출현 빈도에 대해 기재하였다. 위험 대립 유전자의 수가 두 개 이상인 개체는 위험 대립 유전자가 없거나 하나인 대조군에 비해 리토드린으로 인한 폐부종이 발생할 위험이 증가했다.

표 1 및 2에 나타난 바와 같이 CPT2와 ADRA1A는 리토드린의 부작용에 의한 폐부종과 가장 유의미한 관련성을 나타내는 우수한 바이오마커임을 알 수 있었다.

Claims (11)

1. CPT2 및 ADRA1A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐부종 진단용 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 폐부종은 리토드린 투여로 유발된 것인 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머; 또는
   상기 유전자의 핵산 서열과 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산인 것인 조성물.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 핵산은 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인 조성물.
5. CPT2 및 ADRA1A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐부종 진단용 키트.
6. CPT2 및 ADRA1A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질 또는 이의 단백질의 발현 수준을 생물학적 시료로부터 측정하는 단계; 및
   상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 폐부종을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
8. 청구항 6에 있어서, 상기 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, CPT2 또는 ADRA1A 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
9. 청구항 6에 있어서, 상기 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, CPT2 또는 ADRA1A 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
10. 청구항 6에 있어서, 상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 전자현미경법(electron microscopy), 또는 이들의 조합으로 수행되는 것인 방법.
11. 청구항 6에 있어서, 상기 방법은 상기 CPT2 또는 ADRA1A 발현 수준이 정상 대조군의 CPT2 또는 ADRA1A 발현 수준과 비교하여 증가되었는지 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법.

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