KR20210095495A - 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 출원은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 신규한 퀴나졸리논 화합물, 이에 대한 제조 방법, 이를 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 출원에 따른 신규한 퀴나졸리논 화합물은 간 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00012

상기 화학식 1에서,
X는 -H, -halo, -CH3, 또는 -NH2이다.

Description

신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물{novel quinazolinone COMPOUNDs and pharmaceutical composition containing same}
아래의 실시 예들은 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이의 신규 용도에 대한 것이다.
아래의 실시 예들은 신규한 퀴나졸리논 화합물을 포함하는 간질환의 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
비만은 고혈압, 지질대사이상, 인슐린저항성 등을 수반하는 대사증후군의 발생 위험을 증가시킨다. 또한, 비만은 당뇨병, 지방간, 심혈관계 질환 등의 만성질환을 유발한다. 비만치료제로 개발 및 승인된 약물들이 존재하나, 이들이 부작용을 수반하는 경우가 많다.
비알코올성 지방간 질환은 비만, 제2 형 당뇨병, 이상지질혈증, 대사증후군 등과 밀접한 연관성을 보인다. 실제로 대사증후군이나 제2 형 당뇨병 환자에게 비알코올성 지방간의 유병률이 상대적으로 높게 관찰된다. 비알코올성 지방간 질환의 환자의 90%는 대사증후군의 요소 중 한가지 이상을 가지며, 1/3은 대사증후군을 동반하고 있다. 전 세계적으로 비알코올성 간질환의 유병률은 10-24%로 추정되며, 비만인구에서는 유병률이 57-74%까지 증가한다. 아시아에서 비알코올성 간질환은 12-24%로 추정되며, 중국와 일본, 한국에서 비만 인구 및 비알코올성 간질환의 유병률은 빠르게 증가하고 있다.
비알코올성 지방간의 치료방법으로는 생활 습관 개선과 약물치료가 있다. 생활 습관을 개선하는 방법은 체중감량, 식사요법, 운동요법 병행이 있다. 약물치료로는 당뇨병 치료제로 사용되는 티아졸리딘디온(Thiazolidinedione), 메트포르민(Metformin)과 고지혈증 치료제가 사용되고 있으나, 효과적이면서 안전하게 장기간 사용 가능한 약물의 개발이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명은 지방간을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료 목적에 부합하고, 우수한 안전성을 나타내는 신규한 퀴나졸리논 화합물들을 제공하는데 그 목적이 있다.
일 과제는, 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
일 과제는, 신규한 퀴나졸리논 화합물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
해결하고자 하는 과제가 상술한 과제로 제한되는 것은 아니며, 언급되지 아니한 과제들은 본 명세서 및 첨부된 도면으로부터 일 실시 예의 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
일 실시 예에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 제공될 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서,
X는 -H, -halo, -CH3, 또는 -NH2이다.
또한, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공될 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 화학식 1에서,
X는 -H, -halo, -CH3, 또는 -NH2이다.
일 실시 예에 의하면, 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 통해, 종래에는 구체화되지 않은 새로운 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
일 실시 예에 의하면, 신규한 퀴나졸리논 화합물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 통해, 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성을 제공할 수 있다.
일 실시 예의 효과가 상술한 효과들로 제한되는 것은 아니며, 언급되지 아니한 효과들은 본 명세서 및 첨부된 도면으로부터 일 실시 예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1 및 도 2는 지방세포에서의 지방 축적 감소 효과를 확인하기 위한 <실험 예 1>에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 정상 세포에서의 세포 독성을 확인하기 위한 <실험 예 2>에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 지방증을 유도한 간 세포에서 세포 독성을 확인하기 위한 <실험 예 3>에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 지방증이 유도된 간 세포에서 지방구 감소 효과를 확인하기 위한 <실험 예4>에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 내지 도 13은 지방증이 유도된 간 세포에서의 단백질 발현 수준을 확인하기 위한 <실험 예 5>에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 14 내지 도18은 지방증이 유도된 간 세포에서 관련 유전자를 확인하기 위한 <실험 예6>에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 19 는 약물 스크리닝하기 위한 <실험 예 7>에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 20 및 도 21은 기존 제품 약물과의 지방 합성 저해 및 단백질 수준을 비교하기 위한 <실험 예 8>에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 22는 중성 지방 축적 억제를 확인하기 위한 <실험 예 9>에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 23은 SIRT1 활성도를 확인하기 위한 <실험 예 10>에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
이하에서는 도면을 참조하여 일 실시 예의 구체적인 실시 예를 상세하게 설명한다. 다만, 일 실시 예의 사상은 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하고, 일 실시 예의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 일 실시 예 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본원 발명 사상 범위 내에 포함된다고 할 것이다.
또한, 각 실시 예의 도면에 나타나는 동일한 사상의 범위 내의 기능이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 사용하여 설명한다.
본 출원의 용어 "알킬"은 일반식 CnH2n+1 (n은 양의 정수)로 나타나는 직쇄형 또는 분지형 하이드로카빌을 (hydrocarbyl)을 포함한다. 예를 들어, C1 - C6 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, 및 n-헥실과 같은 직쇄형 알킬을 포함할 수 있다. 또한, "분지형 알킬"은 아이소프로필, sec-부틸, 아이소부틸, tert-부틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 1-에틸프로필, 3-메틸부틸, 1,1-다이메틸프로필, 1,2-다이메틸프로필, 2,2-다이메틸프로필, 2-메틸펜틸 등과 같은 알킬을 포함할 수 있다.
본 출원의 용어 "할로젠"또는 "할로"는 플루오린 (F), 클로린 (Cl), 브로민 (Br), 및 아이오딘 (I)을 포함할 수 있다.
일 실시 예에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 제공될 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00003
상기 화학식 1에서,
X는 -H, -halo, -CH3, 또는 -NH2이다.
또한, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공될 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00004
상기 화학식 1에서,
X는 -H, -halo, -CH3, 또는 -NH2이다.
또한, 상기 간질환은 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 비알콜성 지방간염(NASH), 간 지방증, 간경변, 간염, 간 선종, 인슐린 과민증 및 간암로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
이하에서는 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 대해 보다 상세히 설명하고자 한다.
1. 일반
1.1 퀴나졸리논 화합물(Quinazolinone compound)
퀴나졸리논 화합물은 일반적으로 최면, 진통, 경련 억제, 진해, 및 항염증 활성과 같은 매우 광범위한 생물학적 특성을 가지되, 특히 퀴나졸리논 화합물은 암을 포함하는 세포 증식성 질환의 치료에 사용되고 있다. 일 예로, 미국 등록 특허(US5747498) 및 미국 등록 특허(US5773476)은 티로신 수용체 키나아제의 과활성 또는 부적합한 활성에 의해 특징되는 암을 치료하기 위해 사용되는 퀴나졸리논 화합물을 기술하고 있다. 또한, 길리어드 칼리스토가(Gilead Calistoga)가 개발한 이델라리십(Idealisib)은 여러 종류의 혈액암에 뛰어난 효능을 보이는 퀴나졸리논 화합물을 개발하였다. 위와 같이, 퀴나졸리논 화합물 또는 유도체와 관련하여서는 항암제의 주요 용도에 대해서만 언급되고 있었고, NASH 등과 같은 대사 질환에 대한 치료 용도에 대해서는 보고된 바가 없었다.
본 출원의 일 실시 예는 이러한 특정 구조를 가지는 퀴나졸리논 화합물 및 이의 새로운 용도를 제공한다. 이러한 특정 구조를 가지는 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 간질환 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1.2 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물
1.2.1 신규한 퀴나졸리논 화합물
본 출원의 일 실시 예에 따른 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00005
본 출원의 화학식 1에서,
X는 -H, -halo, -CH3, 또는 -NH2이다.
본 출원에서 "halo"는 불소(F), 브롬(Br), 염소(Cl), 또는 요오드(I)를 의미할 수 있다.
상기 화학식 1의 구체적인 화합물로 하기 화학식 2 의 화합물을 포함하지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
본 출원의 일 실시 예에 따른 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00006
상기 화학식 2의 화합물은 상기 화학식 1의 화합물에 있어서, X는 -Cl인 것이다.
1.2.2 제조 방법
본 출원의 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하기 위한 제조 방법을 이하에서 설명하고자 한다.
[화학식 2]
Figure pat00007
상기 화학식 2의 화합물은 상기 화학식 1의 화합물에 있어서, X는 -Cl인 것이다.
이하에서는 본 발명의 제조 예와 관련하여 상세히 설명하고자 한다. 단 하기 제조 예는 본 발명의 예시일 뿐이며, 본 발명이 하기 제조 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[제조 예 1] (R)-2-(1-((7H-퓨린-6-일)아미노)-2-메틸프로필)-5-클로로-3-페닐퀴나졸린-4(3H)-온 의 제조(화학식 2)
[반응식 1]
Figure pat00008
1) 단계 1: (R)-tert-부틸(1-(5-클로로-4-옥소-3-페닐-3,4-디하이드로퀴나졸린-2-일)-2-메틸프로필)카바메이트의 제조
2-아미노-6-클로로벤조산(1.0eq)과 (R)-2-((tert-부톡시카보닐아미노)-3-메틸부타논산(1.4eq)이 피리딘 용매에 함께 섞여있는 용액을 상온에서 교반하는 가운데 디페닐 포스파이트(6eq)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 45-50℃에서 5시간 교반하고, 아닐린 (1.2eq) 첨가하여 45-50℃에서 2시간 반응시켰다. 그런 다음, 반응 혼합액 상온으로 냉각하고 에틸 아세테이트와 물로 추출하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘 (MgSO4)로 탈수시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제한 후, 얻은 고체를 건조하여 (R)-tert-부틸(1-(5-클로로-4-옥소-3-페닐-3,4-디하이드로퀴나졸린-2-일)-2-메틸프로필)카바메이트를 60% 수율로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.61-7.49 (m, 5 H), 7.47-7.45 (m, 1 H), 7.32-7.28 (m, 2 H), 5.38-5.36 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 4.39-4.36 (m, 1 H), 2.04-1.96 (m, 1 H), 1.42 (s, 9 H), 0.84-0.83 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 0.72-0.71 (d, J = 6.8 Hz, 3 H)
2) 단계 2: (R)-2-(1-아미노-2-메틸프로필-5-클로로-3-페닐퀴나졸린-4(3H)-온의 제조
트리플루오로 아세트산(0.34M)을 (S)-tert-부틸(1-(5-클로로-4-옥소-3-페닐-3,4-디하이드로퀴나졸린-2-일)-2-메틸프로필)카바메이트(1eq)가 용해되어 있는 디클로로메탄(0.085M) 용액에 첨가하였다. 이 반응 용액을 상온에서 0.5-1시간 정도 교반한 다음, 암모니아수를 사용하여 반응 용액의 pH를 10 정도로 맞추어 주었다. 반응 혼합액을 디클로로메탄과 물로 추출한 후, 유기층을 무수 황산마그네슘 (MgSO4)을 사용하여 탈수 및 여과하였다. 무수 황산마그네슘 (MgSO4)을 제거한 다음 여액을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제한 후, 얻은 고체를 건조하여 (R)-2-(1-아미노-2-메틸프로필-5-클로로-3-페닐퀴나졸린-4(3H)-온을 93% 수율로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.63-7.48 (m, 5 H), 7.47-7.45 (dd, J = 6.4 Hz, 2.4 Hz, 1 H), 7.28-7.26 (m, 2 H), 3.25-3.23 (d, J = 6 Hz, 1 H), 2.06-1.98 (m, 1 H), 1.66 (brs, 2 H), 0.88-0.87 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 0.75-0.73 (d, J = 6.8 Hz, 3 H)
3) 단계 3: (R)-2-(1-((7H-퓨린-6-일)아미노)-2-메틸프로필)-5-클로로-3-페닐퀴나졸린-4(3H)-온의 제조
단계 2에서 얻어진 (S)-2-(1-아미노-2-메틸프로필-5-클로로-3-페닐퀴나졸린-4(3H)-온(1eq)을 tert-부탄올(0.15M)에 투입하고, 트리에틸아민(2eq) 및 6-클로로-9H-퓨린(2eq)을 첨가한 다음, 반응용액을 환류하면서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각하고 디클로로메탄과 물로 추출하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘 (MgSO4)로 탈수시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제한 다음, 얻은 고체를 건조하여 (S)-2-(1-((7H-퓨린-6-일)아미노)-2-메틸프로필)-5-클로로-3-페닐퀴나졸린-4(3H)-온을 53% 수율로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:13.80 (brs, 1 H), 8.30 (s, 1 H), 7.99 (s, 1 H), 7.64-7.54 (m, 5 H), 7.46-7.44 (dd, J = 1.2 Hz, 7.6 Hz, 1 H), 7.38-7.36 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.32-7.32 (m, 1 H), 6.63-6.60 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 5.29 (m, 1 H), 2.32-2.24 (m, 1 H), 0.98-0.97 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 0.86-0.85 (d, J = 6.8 Hz, 3 H)
ESI-MS m/z 446.24 [M+H]+
1.2.3 신규한 퀴나졸리논 화합물을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 염
본 출원의 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(Free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용할 수 있다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글르콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻을 수 있다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 다이하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플르오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2―설포네이터, 만델레이트 등을 포함할 수 있다.
본 출원에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조 가능하며, 예를 들어 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디클로로메탄, 아세토니트릴 등과 같은 유기 용매에 녹이고, 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.
또한, 본 출원의 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염으로 얻어질 수 있다. 일 예로, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발 및 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨, 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합할 수 있다. 또한, 이에 대응되는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(일 예로, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
또한, 본 출원은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 한정되지 아니하고, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 입체 이성질체, 수화물 등을 모두 포함할 수 있다.
1.2.4 신규한 퀴나졸리논 화합물을 포함하는 약학적 조성물
본 출원에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 임상 투여 시 경구 및/또는 비경구 방식에 따른 여러가지 제형으로 투여될 수 있다. 이 때 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제제화할 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 충전제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 중 적어도 어느 하나가 사용되어 제제화될 수 있다.
일 예로, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 하는 경구 투여용 제형은 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시립제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있을 수 있다. 상기 경구 투여용 제형은 상기 유효 성분 이외에도 희석제(일 예로, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리식), 및 활택제(일 예로, 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여 방법으로 사용될 수 있다. 상기 비경구 투여 방법은 피하 주사, 정맥 주사, 근육 내 주사, 또는 흉부 내 주사에 의해 주입되는 방법 중 어느 하나일 수 있다.
일 예로, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 하는 비경구 투여용 제형은 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있고, 이는 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조될 수 있다. 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 하는 비경구 투여용 제형은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 포함할 수 있고, 통상적인 방법으로 혼합, 과립화 또는 코팅에 따라 제제화될 수 있다.
또한, 본 출원의 약학적 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타낼 수 있는 유효 성분을 1종 이상 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 증상의 정도, 약물 형태, 투여 경로, 및 기간에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 본 출원의 약학적 조성물은 유효 성분이 1일 0.2mg/kg 내지 200mg/kg으로 투여되도록 하는 것이 최적의 효능을 위해 바람직할 수 있다. 또한, 본 출원의 약학적 조성물은 하루에 한번 투여될 수도 있고, 수회 나누어 투여될 수는 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
1.3 신규한 퀴나졸리논을 포함하는 약학적 조성물의 대상 질병 또는 질환
본 출원의 일 실시 예에 따른 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 간 질환의 예방 또는 치료를 위해 이용될 수 있다.
본 출원의 간질환은 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 비알콜성 지방간염(NASH), 간 지방증, 간경변, 간염, 간선종, 인슐린 과민증 및 간암 중 어느 하나일 수 있다. 일 예로, 상기 간암은 간종양, 간세포 선종, 또는 간세포 암종 등일 수 있다.
또한, 본 출원의 일 실시 예에 따른 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 대사 질환 또는 대사 증후군의 예방 또는 치료를 위해 이용될 수 있다.
본 출원의 대사증후군 또는 대사질환은 각종 심혈관 질환과 제2형 당뇨병의 위험 요인을 이루는 현상을 한 가지 질환군을 말한다. 인슐린 저항성 및 이와 관련된 대사 이상과 임상 양상이 모두 포함된다. 예컨대 인슐린-저항성, 당뇨병전기 상태, 제2 당뇨병, 및/또는 그의 합병증일 수 있다.
1.4 신규한 퀴나졸리논 화합물을 포함하는 약학적 조성물과 관련된 유전자 발현 특성
본 출원의 일 실시 예에 따른 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 특정 유전자들의 발현을 조절할 수 있다.
본 출원의 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 지방신합성(Lipogenesis)에 관여하는 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 일 예로, 상기 지방신합성에 관여하는 유전자는 SREBP-1c 및 FAS 중 적어도 어느 하나일 수 있다.
본 출원의 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 지방산 산화(β-oxidation)에 관여하는 유전자 발현을 증가시킬 수 있다. 일 예로, 상기 지방산 산화에 관여하는 유전자는PPAR α일 수 있다.
본 출원의 신규한 퀴나졸리논 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 inflammation 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 일 예로, 상기 inflammation에 관여하는 유전자는 TNF α 및IL-8일 수 있다.
2. 약리적 효과
2.1 <실험 예 1> 지방세포에서의 지방 축적 감소 효과 확인 실험
2.1.1 실험 목적
본 출원의 일 실시 예에 따른 화학식 2의 화합물의 지방 세포에 대한 지방 축적 감소 효과를 확인하기 위한 실험을 다음과 같이 실시하였다.
2.1.2 실험 방법
2.1.2.1 3TL-L1 지방 전구 세포 준비 및 분화 유도
본 출원의 일 실시 예에 따른 화학식 2의 화합물의 지방 세포에 대한 지방 축적 감소 효과를 확인하기 위해 3TL-L1 마우스 지방 전구 세포(American Type Culture Collection)를 37℃, 습도 95%, CO2 5%로 설정된 인큐베이터에서 배양하였다.
또한, 증식배지(Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% bovine serum (BS), 100 U/ml of penicillin, and 100 μg/ml of streptomycin)를 사용하여 3T3-L1 마우스 지방 전구세포를 충분히 증식 시킨 뒤, 분화배지(DMEM containing 10% FBS, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1 mM dexamethasone, and 5 μg/ml insulin)를 2일간 처리하였다.
이후, 2일간 유도배지(DMEM containing 10% FBS and 5 μg/ml insulin)를 2일간 처리해주고, 실험이 종료될 때까지 분화된 지방세포를 유지하기 위해 유지 배지 (DMEM containing 10% FBS)를 매일 교체하였다.
2.1.2.2 Oil-Red-O 염색을 통한 지방구 확인
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 화학식 2의 화합물의 지방구 생성 억제 능력을 확인하기 위해, 지방 전구세포인 3T3-L1 세포를 지방세포로 분화 유도 시킨 후 Oil-Red-O 염색을 통하여 지방구를 염색하였다.
먼저, 6 cm2 직경의 6 well plate에 지방 전구세포인 3T3-L1 세포를 배양한 후 undifferentiation plate와 differentiation를 제외하고 배양배지로 시험물질을 희석하여 0.5 μM, 2.5 μM, 10 μM, 20 μM으로 처리하였다.
또한, Oil-Red-O 염색을 위해 well에 존재하는 세포 상층액을 제거한 후, PBS로 워싱 과정을 2번 진행하였다.
워싱 후, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 30분 고정하였다.
이후, 60% 1,2-프로페인다이올 디하이드레이션 솔루션(1,2-propanediol dehydration solution)액을 첨가한 뒤 5분 동안 배양하였다.
5분 뒤, 용액을 제거하고 Oil-Red-O 발색 시약(ORO 원액 6 ml과 증류수 4 ml의 비율로 혼합 한 다음 0.45 μm 필터로 여과하여 ORO 용액을 제조)을 추가하여 지방구 염색을 30분 동안 진행하였다.
염색 후, PBS로 워싱을 하여 남아있는 발색 시약을 제거하고 현미경으로 지방구 형성을 관찰하였다.
2.1.3 실험 결과
지방세포에서의 지방 축적 감소 효과를 확인한 실험 결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다. 특히, 도 1및 도 2는 Oil-Red-O 염색을 통한 화학식 2의 화합물의 지방구 형성 억제를 확인한 실험 결과를 나타내는 도면이다. 다만, 실험의 편의상 도 1 에 나타난 세포에 대해서만 실험 결과를 제시한 것이며, 지방세포에서의 지방 축적 감소 효과 확인 실험 결과는 도 1 에 나타난 세포에 한정되지 아니하고, 간 질환의 유래 세포에 해당되는 세포에 대해서도 지방세포에서의 지방 축적 감소 효과를 확인할 수 있다.
도 1 에 나타난 바와 같이, 본 출원의 화학식 2의 화합물이 모든 시험군에서 지방구 염색이 differentiation에 비해 적게 된 것을 확인할 수 있다. 특히, 화학식 2의 화합물의 농도를 0.5 μM, 2.5 μM, 10 μM, 20 μM 으로 증가시켜서 실험한 결과, 화학식 2의 화합물은 약물 농도 의존적으로 지방구 염색이 differentiation에 비해 적게 된 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 2 에 나타난 바와 같이, 본 출원의 화학식 2의 화합물은 농도를 0.5 μM, 2.5 μM, 10 μM, 20 μM으로 증가시킴에 따라, 약물 농도 의존적으로 염색된 지방구가 적게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
이러한 결과는 본 출원의 화합물이 지방세포에서 지방 축적을 감소시키는 효과를 가지고 있음을 보여준다.
2.2 <실험 예 2> 정상 세포에서의 세포 독성 확인 실험
2.2.1 실험 목적
화학식 2의 화합물들이 정상 세포에서의 세포 독성을 나타내는지 확인하기 위한 실험을 다음과 같이 실시하였다.
2.2.2 실험 방법
2.2.2.1 MRC5 세포 준비
정상 세포에서의 세포 독성 확인을 위해, 정상 폐 세포인 MRC를 37 ℃, 습도 95%, CO2 5%로 설정된 인큐베이터에서 배양하였다.
또한, 증식배지(Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with 10% bovine serum (FBS), 100 U/ml of penicillin, and 100 μg/ml of streptomycin)를 사용하여 MRC5를 70~80% 증식 시킨 뒤, 실험에 사용 하였다.
2.2.2.2 MRC5세포에서의 세포 독성 확인
본 출원의 일 실시 예에 따른 화학식 2의 화합물의 세포 독성을 확인하고자, 준비된MRC5 세포에 대한 CCK8 분석을 수행하였다.
먼저, 24 well plate에 MRC5 세포를 70~80%까지 배양한 후 대조군을 제외하고 배양배지에 시험물질을 희석하여 0.5 μM, 2.5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 100 μM로 처리하였다.
시험 물질 처리 24시간 후 well 당 CCK8 용액을 10 μl씩 분주하여 빛을 차단한 상태로 2시간 동안 배양하였다.
2시간 후, well 당 배양액 200 μl를 96 well plate에 옮겨 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
2.2.3 실험 결과
정상 세포에서의 세포 독성을 확인한 실험 결과는 도 3에 나타내었다. 상기 도 3은 MRC5 세포에서의 세포 독성을 CCK8 분석을 통해 확인한 실험 결과를 나타내는 도면이다. 다만, 실험의 편의상 도 3에 나타난 세포에 대해서만 실험 결과를 제시한 것이며, 정상 세포에서의 세포 독성을 확인한 실험 결과는 도 3 에 나타난 세포에 한정되지 아니하고, 다른 정상 세포에 해당되는 세포에 대해서도 정상 세포에서의 세포 독성을 확인할 수 있다. 실험 결과는 후술될 내용에서 보다 상세히 설명하고자 한다.
도 3 에 나타난 바와 같이, 본 출원의 화학식 2의 화합물이 MRC5 세포를 이용한 정상세포에서 세포 독성을 가지는지 확인해보았다. 그 결과, 대조군과 비교하였을 때, 정상세포에서 화학식 2의 화합물은 독성이 없었고, 화학식 2을 포함하는 약학적 조성물 자체가 가지고 있는 독성은 또한 없다고 판단되었다.
이러한 결과는 본 출원의 화합물이 정상 세포에서 독성이 없음을 보여준다.
2.3 <실험 예 3> 지방증을 유도한 간 세포에서 세포 독성 확인 실험
2.3.1 실험 목적
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 화학식 2의 화합물들이 지방증을 유도한 간 세포에서의 세포 독성을 확인하기 위한 실험을 다음과 같이 실시하였다.
2.3.2 실험 방법
2.3.2.1 Huh7 세포 준비
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 지방증을 유도한 간 세포에서의 세포 독성 확인을 위해, Huh7 세포를 37 ℃, 습도 95%, CO2 5%로 설정된 인큐베이터에서 배양하였다.
또한, 증식배지(Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml of penicillin, and 100 μg/ml of streptomycin)를 사용하여 Huh7세포를 plate에 80~90%까지 증식 시킨 뒤, 실험에 사용하였다.
2.3.2.2 지방증이 유도된 Huh7 세포에서의 세포 독성 확인
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 지방증을 유도한 간 세포에서 화학식 2의 화합물의 세포 독성을 확인하고자, 준비된 Huh7 세포에 대한 CCK8 분석을 수행하였다.
먼저, 24 well plate에 Huh7 세포를 70~80%까지 배양한 후 대조군을 제외하고 2% BSA에 결합시킨 palmitic acid(PA)를 500 μM 농도로 24시간 동안 처리하였다.
또한, 지방증을 유도하기 위한 배지에 1시간 동안 간 세포를 배양 후, 배양배지에 시험물질을 0.25 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2.5 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM 농도로 처리하였다.
또한, 시험 물질 처리 24시간 후 well 당 CCK8 용액을 10 μl씩 분주하여 빛을 차단한 상태로 2시간 동안 배양 하였다.
또한, 2시간 후, well 당 배양액 200 μl를 96 well plate에 옮겨 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
2.3.3 실험 결과
지방증을 유도한 간 세포에서의 세포 독성을 확인한 실험 결과는 도 4 에 나타내었다. 특히, 도 4는 지방증을 유도한 Huh7 세포에서의 세포 독성을 CCK8 분석을 통해 확인한 실험 결과를 나타내는 도면이다. 다만, 실험의 편의상 도 4에 나타난 세포에 대해서만 실험 결과를 제시한 것이며, 지방증을 유도한 간 세포에서의 세포 독성을 확인한 실험 결과는 도 4 에 나타난 세포에 한정되지 아니하고, 다른 지방증을 유도한 간 세포에 해당되는 세포에 대해서도 지방증을 유도한 간 세포의 세포 독성을 확인할 수 있다. 실험 결과는 후술될 내용에서 보다 상세히 설명하고자 한다.
도 4 에 나타난 바와 같이, 본 출원의 화학식 2의 화합물이 지방증을 유도한 Huh7 세포를 이용한 지방증을 유도한 간 세포에서 세포 독성을 가지는지 확인해보았다. 그 결과, 대조군과 비교하였을 때, 지방증을 유도한 간 세포에서 화학식 2의 화합물은 독성이 없었고, 화학식 2을 포함하는 약학적 조성물 자체가 가지고 있는 독성은 또한 없다고 판단되었다.
이러한 결과는 본 출원의 화합물이 지방증을 유도한 간 세포에서 독성이 없음을 보여준다.
2.4 <실험 예 4> 지방증이 유도된 간 세포에서 지방구 감소 효과 확인 실험
2.4.1 실험 목적
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 화학식 2의 화합물들이 지방증을 유도한 간 세포에서의 치료 효과를 확인하기 위한 실험을 다음과 같이 실시하였다.
2.4.2 실험 방법
2.4.2.1 Huh7 세포 준비
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 지방증을 유도한 간 세포에서의 세포 독성 확인을 위해, Huh7 세포를 37 ℃, 습도 95%, CO2 5%로 설정된 인큐베이터에서 배양하였다.
또한, 증식배지(Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml of penicillin, and 100 μg/ml of streptomycin)를 사용하여 Huh7세포를 plate에 80~90%까지 증식 시킨 뒤, 실험에 사용하였다.
2.4.2.2 Oil-Red-O 염색을 통한 지방증이 유도된 Huh7 세포에서의 지방구 감소 효과 확인
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 지방증을 유도한 간 세포에서 화학식 2의 화합물의 지방구 생성 억제 능력을 확인하기 위해, 간 세포에 대조군을 제외하고 2% BSA에 결합시킨 palmitic acid(PA)를 250 μM 농도로 처리하여 지방증을 유도 시킨 후 Oil-Red-O 염색을 통하여 지방구를 염색하였다.
먼저, 12 well plate에 간세포가 80~90% 자라게 배양한 후, 대조군을 제외하고 지방증을 유도한 배양배지에 시험물질을 희석하여 0.25 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2.5 μM, 5 μM, 10 μM 을 처리하였다.
또한, Oil-Red-O 염색을 위해 well에 존재하는 세포 상층액을 제거한 후, PBS로 워싱 과정을 2번 진행하였다.
또한, 워싱 후, 4 % 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 30분 고정하였다.
또한, 이후, 60% 1,2-프로페인다이올 디하이드레이션 솔루션(1,2-propanediol dehydration solution)액을 첨가한 뒤 5분 동안 배양하였다.
또한, 5분 뒤, 용액을 제거하고 Oil-Red-O 발색 시약(ORO 원액 6 ml과 증류수 4 ml의 비율로 혼합 한 다음 0.45 μm 필터로 여과하여 ORO 용액을 제조)을 추가하여 지방구 염색을 30분 동안 진행하였다.
또한, 염색 후, PBS로 워싱을 하여 남아있는 발색 시약을 제거하고 현미경으로 지방구 형성을 관찰하였다.
2.4.3 실험 결과
지방증이 유도된 Huh7세포에서의 지방 축적 감소 효과를 확인한 실험 결과는 도5 에 나타내었다. 특히, 도 5는 Oil-Red-O 염색을 통한 화학식 2의 화합물의 지방구 형성 억제를 확인한 실험 결과를 나타내는 도면이다. 다만, 실험의 편의상 도 5에 나타난 세포에 대해서만 실험 결과를 제시한 것이며, 지방세포에서의 지방 축적 감소 효과 확인 실험 결과는 도 5에 나타난 세포에 한정되지 아니하고, 간 질환의 유래 세포에 해당되는 세포에 대해서도 지방세포에서의 지방 축적 감소 효과를 확인할 수 있다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 출원의 화학식 2의 화합물이 모든 시험군에서 지방구 염색이 PA에 비해 적게 된 것을 확인할 수 있다. 특히, 화학식 2의 화합물의 농도를 0.25 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2.5 μM, 5 μM, 10 μM으로 증가시켜서 실험한 것을 고려할 때, 화학식 2의 화합물은 약물 농도 의존적으로 지방구 염색이 PA에 비해 적게 된 것을 확인할 수 있다.
이러한 결과는 본 출원의 화합물이 지방증이 유도된 간 세포에서 지방구 감소 효과가 있음을 보여준다.
2.5 <실험 예 5> 지방증이 유도된 간 세포에서 단백질 발현 수준 확인 실험
2.5.1 실험 목적
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 화학식 2의 화합물들이 지방증을 유도한 간 세포에서의 단백질 발현 수준을 확인하기 위한 실험을 다음과 같이 실시하였다.
2.5.2 실험 방법
대조군 세포를 제외한 각 well의 Huh-7 세포는 지방증을 유도하기 위해 대조군을 제외하고 2% BSA에 결합시킨 PA를 250 μM 농도로 처리하였고, 대조군 세포는 2%의 FA가 없는 BSA로 전처리 하였다.
각 well에 본 출원의 화학식 2의 화합물을 0.5 μM, 2.5 μM, 10 μM 처리한 다음 24 시간 동안 배양하였다. 대조군 세포 및 PA 처리된 세포를 DMSO로 처리하였다. 모든 배지를 흡인하고 차가운 PBS로 세포를 3번 부드럽게 세척하였다.
소듐 클로라이드 (NaCl) 150mM, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 5 mM, pH 8.0, HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 10 mM, NP-40 (nonylphenoxypolyethoxylethanol) 1%, 아프로티닌 (aprotinin) 2 μg/ml, 펩스타틴 A (pepstatin A) 1 μM, 류펩틴 (leupeptin) 10 μM, 소듐 플루오라이드 (NaF) 1 mM, 소듐 오르쏘바나데이트 (Na2VO4) 0.2 mM, 및 PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) 1 μM를 포함하는 차가운 용해 버퍼를 더하였다.
전체 세포 용해물을 수집하고 완전히 용해되도록 10번 이상 부드럽게 피펫팅하였다. 샘플을 얼음에서 20분 동안 배양하고 13,000 rpm, 4 oC에서 20분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 수집하고 샘플에 TrisCl (pH 6.8) 50 mM, SDS 2%, 브로모페올 블루 (bromopheol blue) 0.1%, 및 글리세롤 10%를 포함하는 5X SDS (sodium dodecyl sulfate) 샘플 버퍼를 넣고 95 oC에서 5분 동안 끓였다.
10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)의 Well에 같은 양의 단백질을 분자량 마커와 함께 로딩하였다. 상기 젤을 전기영동 챔버 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에서 30분 동안 100 V에서 전기영동을 실시하였다.
PVDF (polyvinylidene fluoride) 멤브레인 (MilliporeSigma, Burlington, MA USA)을 메탄올 (MeOH)로 1분 동안 활성화하고 트리스 25 mM, 글리신 190 mM, 및 MeOH 20%를 포함하는 트랜스퍼 버퍼로 씻었다. 트랜스퍼 버퍼에 젤을 10분 동안 넣었다.
트랜스퍼 샌드위치 (순서는 종이, 젤, 멤브레인, 및 종이)를 조립하고 트랜스퍼 샌드위치 내에 기포가 끼지 않았는지 확인하였다. 트랜스퍼 샌드위치를 *?*트랜스퍼 탱크 (Bio-Rad Laboratories)에 넣고 트랜스퍼 버퍼가 가열되는 것을 막기 위해 트랜스퍼 탱크에 얼음 덩어리를 넣었다. 30분 동안 100 V에서 단백질을 젤로부터 PVDF 멤브레인으로 옮겼다.
상기 PVDF 멤브레인을 증류수로 씻어내고 0.1% 트윈 20 (tween 20) (TBST, Sigma-Aldrich)이 포함된 TBST에 탈지유 (Difco Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA)를 5%로 제조한 블로킹 버퍼로 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 블로킹하였다.
1차 항체가 적절히 희석된 버퍼에서 멤브레인을 배양하였다. Sterol regulatory element-binding protein 1 (SREBP1) 및 Fatty Acid Synthase(FAS)의 멤브레인을 TBST로 5분씩 3번 세척하였다.
블로킹 버퍼에서 HRP (horseradish peroxidase)-접합 2차 마우스 항체의 권장 희석액과 함께 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 배양하였다.
멤브레인을 TBST로 5분씩 5번 세척하였다. 과량의 시약을 제거하고 투명한 플라스틱 랩으로 멤브레인을 덮었다.
제조사의 권고에 따라 ECL 프라임 웨스턴 블로팅 검출 시약 (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)을 적용하였다.
ImageQuant LAS 3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan)을 사용하여 이미지를 획득하였다. 데이터를 분석하였다.
2.5.3 실험 결과
지방증이 유도된 Huh7세포에서의 단백질 발현 수준을 확인한 실험 결과는 도 6 내지 도13 에 나타내었다.
도 6 내지 도 8은 Huh7 세포에 대한 지방신합성(Lipogenesis)에 관여하는 SREBP1 및 FAS에 대한 단백질 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 9 내지 도 13은 Huh7 세포에 대한 지방산 산화(β-oxidation)에 관여하는 SIRT3, PPARα, PGC1α 및 LCAD에 대한 단백질 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 6 내지 도 8에 따르면, 본 발명의 화학식 2의 화합물들은 농도가 0.5 μM, 2.5 μM, 10 μM 로 증가함에 따라, 농도의존적으로 지방 합성 단백질들인 SREBP1 및 FAS 이 감소하는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 9 내지 도 13에 따르면, 본 발명의 화학식 2의 화합물들은 농도가 0.5 μM, 2.5 μM, 10 μM로 증가함에 따라, 농도의존적으로 지방산 산화에 관여하는 단백질들인 SIRT3, PPARα, PGC1α, 및 LCAD 이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 화학식 2의 화합물들이 지방 합성 단백질의 발현을 감소시키면서도, 지방산 산화에 관여하는 단백질의 발현을 증가시키는 것을 보여준다.
2.6 <실험 예 6> 지방증이 유도된 간 세포에서 관련 유전자 확인 실험
2.6.1 실험 목적
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 화학식 2의 화합물들이 지방증을 유도한 간 세포에서의 관련 유전자를 확인하기 위한 실험을 다음과 같이 실시하였다.
2.6.2 실험 방법
2.6.2.1 Huh7 세포 준비
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 지방증을 유도한 간 세포에서의 세포 독성 확인을 위해, Huh7 세포를 37 ℃, 습도 95%, CO2 5%로 설정된 인큐베이터에서 배양하였다.
또한, 증식배지(Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium (DMEM) supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml of penicillin, and 100 μg/ml of streptomycin)를 사용하여 Huh7세포를 plate에 80~90%까지 증식 시킨 뒤, 실험에 사용하였다.
2.6.2.2 지방증이 유도된 Huh7 세포에서의 mRNA 정량 분석 결과 확인
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 지방증을 유도한 간 세포에서 화학식 2의 화합물의 지방구 생성 억제 능력을 확인하기 위해, Huh-7세포에 대조군을 제외하고 2% BSA에 결합시킨 palmitic acid를 500 μM 농도로 처리하여 지방증을 유도 시킨 후 Oil-Red-O 염색을 통하여 지방구를 염색하였다.
먼저, 6 well plate에 Huh-7세포가 80~90% 자라게 배양한 후, 대조군을 제외하고 지방증을 유도한 배양배지에 본 출원의 화학식 2의 화합물을 희석하여 0.5 μM을 처리하였다.
또한, RNeasy RNA isolation kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 전체 RNA를 추출하였다.
또한, 세포 용해 용액 1 ml 당 β-mercaptoethanol 10 μl를 추가하여 만들었다.
또한, 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척하고 RNA용해 버퍼 350 μl 를 첨가하였다.
또한, 용해물에 70% EtOH을 동일한 부피로 첨가하고, 피펫팅 (pipetting)하여 혼합 시켜 스핀 컬럼으로 옮기고 8,000 x g에서 15초 동안 원심 분리하였다.
또한, 통과액을 제거하고 스핀 컬럼에 세척 용액 700 μl를 첨가하여 8,000x g에서 원심 분리하고 통과액을 제거하였다.
또한, 스핀 컬럼에 EtOH를 포함하는 500 μl의 세척 완액을 첨가하고 8,000 x g에서 2분 동안 원심 분리하였다. (2회 반복)
또한, 통과액을 버리고 1번 더 원심 분리하여 스핀 컬럼 막을 완전히 건조 시켰다.
또한, 스핀 컬럼을 새로운 에펜도르프 튜브에 넣고 RNase가 없는 물 50 μl를 스핀 컬럼 막에 직접 넣고 RNA를 녹여서 분리하기 위해 8,000 x g에서 1분 동안 원심 분리하였다.
또한, Nanophotometer N60 (Implen, Munich, Germany)를 이하여 O.D. 260 nm에서 RNA 농도를 측정하였다.
또한, 올리고 (dT) 프라이머 6 μg/mL, 랜덤 프라이머 3 μg/mL, 역전사 효소 50 U, dNTP 4 mM, dNTP 5 mM, 마그네슘 클로라이드 (MgCl2) 5 mM, 및 RNase 억제제 40 U를 포함하는 제1 가닥 합성 버퍼에서 전체 RNA 중 1 μg을 역전사하였다.
또한, cDNA는 5분 동안 95 ℃ 에서 변성, 50분 동안 42 ℃ 에서 cDNA 합성, 및 5 분 동안 95 ℃ 에서 변성을 거치도록 설정된 PCR (polymerase chain reaction) 기기로 합성하였다.
또한, 합성된 cDNA는 1/10로 희석하여 StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 유전자에 대해 qRT-PCR을 수행하였다. (qRT-PCR의 모든 프라이머는 GenoTech (대전)에서 합성하였다.)
또한, cDNA 3 μl, 사이버 그린 (SYBR) 마스터 믹스 (Applied Biosystems) 10 μl, 프라이머 믹스 (센스 프라이머 및 안티센스 프라이머) 3 μl, 증류수 (distilled water, DW) 4 μl 를 섞어 반응 혼합물을 만들어 15초 동안 95 ℃ 에서 변성, 1분 동안 60 ℃ 에서 어닐링 및 합성을 40 사이클 동안 거치도록 하였다.
2.6.3 실험 결과
지방증이 유도된 Huh7세포에서의 mRNA 정량 분석 결과를 확인한 실험 결과는 도 14 내지 도18에 나타내었다.
도 14는 지방산 산화를 관장하는 PPARα의 유전자 발현과 관련된 mRNA 정량 분석 결과를 나타내는 도면이다. 도 15 및 도 16은 지방신합성에 관여하는 SREBP-1c, FAS의 유전자 발현과 관련된 mRNA 정량 분석 결과를 나타내는 도면이다. 도 17및 도 18는 NASH와 연관된 inflammation 유전자 발현과 관련된 mRNA 정량 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 14를 참조하면, 본 발명의 화학식 2의 화합물은 대조군과 비교 하였을 때, 지방산 산화(β-oxidation)를 관장하는 PPARα의 유전자 발현이 대조군에 비해 증가한 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 15및 도 16을 참조하면, 본 발명의 화학식 2의 화합물은 대조군과 비교하였을 때, 지방신합성(Lipogenesis)에 관여하는 SREBP-1c 및 FAS의 유전자 발현이 감소된 것을 확인할 수 있다.
이를 통해, 본 발명의 화합물은 지방증 유도 세포 모델에서 지방간 산화가 증가되고, 새로운 지방의 합성을 억제하는 것을 통해 지방 합성 억제 효과가 있음을 보여준다.
더불어, 도 17 및 도18을 참조하면, 본 발명의 화학식 2의 화합물은 NASH의 발병 원인으로 알려진 inflammation 유전자인 TNFα 및IL-8의 유전자를 각각 확인하였을 때, 대조군과 달리 TNFα 및IL-8의 유전자를 각각의 발현이 감소된 것을 확인할 수 있다.
이를 통해, 본 발명의 화합물은 NASH와 같은 지방간 관련 질환에 있어서도 치료 효과가 있음을 보여준다.
2.7 <실험 예 7> 약물 스크리닝 실험
2.7.1 실험 목적
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 화학식 2의 화합물의 약물 스크리닝 결과를 확인하기 위한 실험을 다음과 같이 실시하였다.
2.7.2 실험 방법
대조군 세포를 제외한 각 well의 Huh-7 세포는 지방증을 유도하기 위해 대조군을 제외하고 2% BSA에 결합시킨 PA를 250 μM 농도로 처리하였고, 대조군 세포는 2%의 FA가 없는 BSA로 전처리 하였다.
각 well에 본 출원의 화학식 2의 화합물을 0.25 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM 처리한 다음 24 시간 동안 배양하였다. 대조군 세포 및 PA 처리된 세포를 DMSO로 부드럽게 세척하였다.
소듐 클로라이드 (NaCl) 150mM, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 5 mM, pH 8.0, HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 10 mM, NP-40 (nonylphenoxypolyethoxylethanol) 1%, 아프로티닌 (aprotinin) 2 μg/ml, 펩스타틴 A (pepstatin A) 1 μM, 류펩틴 (leupeptin) 10 μM, 소듐 플루오라이드 (NaF) 1 mM, 소듐 오르쏘바나데이트 (Na2VO4) 0.2 mM, 및 PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) 1 μM를 포함하는 차가운 용해 버퍼를 더하였다.
전체 세포 용해물을 수집하고 완전히 용해되도록 10번 이상 부드럽게 피펫팅하였다. 샘플을 얼음에서 20분 동안 배양하고 13,000 rpm, 4 oC에서 20분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 수집하고 샘플에 TrisCl (pH 6.8) 50 mM, SDS 2%, 브로모페올 블루 (bromopheol blue) 0.1%, 및 글리세롤 10%를 포함하는 5X SDS (sodium dodecyl sulfate) 샘플 버퍼를 넣고 95 oC에서 5분 동안 끓였다.
10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)의 Well에 같은 양의 단백질을 분자량 마커와 함께 로딩하였다. 상기 젤을 전기영동 챔버 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에서 30분 동안 100 V에서 전기영동을 실시하였다.
PVDF (polyvinylidene fluoride) 멤브레인 (MilliporeSigma, Burlington, MA USA)을 메탄올 (MeOH)로 1분 동안 활성화하고 트리스 25 mM, 글리신 190 mM, 및 MeOH 20%를 포함하는 트랜스퍼 버퍼로 씻었다. 트랜스퍼 버퍼에 젤을 10분 동안 넣었다.
트랜스퍼 샌드위치 (순서는 종이, 젤, 멤브레인, 및 종이)를 조립하고 트랜스퍼 샌드위치 내에 기포가 끼지 않았는지 확인하였다. 트랜스퍼 샌드위치를 *?*트랜스퍼 탱크 (Bio-Rad Laboratories)에 넣고 트랜스퍼 버퍼가 가열되는 것을 막기 위해 트랜스퍼 탱크에 얼음 덩어리를 넣었다. 30분 동안 100 V에서 단백질을 젤로부터 PVDF 멤브레인으로 옮겼다.
상기 PVDF 멤브레인을 증류수로 씻어내고 0.1% 트윈 20 (tween 20) (TBST, Sigma-Aldrich)이 포함된 TBST에 탈지유 (Difco Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA)를 5%로 제조한 블로킹 버퍼로 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 블로킹하였다.
1차 항체가 적절히 희석된 버퍼에서 멤브레인을 배양하였다. Fatty Acid Synthase(FAS)의 멤브레인을 TBST로 5분씩 3번 세척하였다.
블로킹 버퍼에서 HRP (horseradish peroxidase)-접합 2차 마우스 항체의 권장 희석액과 함께 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 배양하였다.
멤브레인을 TBST로 5분씩 5번 세척하였다. 과량의 시약을 제거하고 투명한 플라스틱 랩으로 멤브레인을 덮었다.
제조사의 권고에 따라 ECL 프라임 웨스턴 블로팅 검출 시약 (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)을 적용하였다.
ImageQuant LAS 3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan)을 사용하여 이미지를 획득하였다. 데이터를 분석하였다.
2.7.3 실험 결과
화학식 2의 화합물의 약물 스크리닝 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19는 지방 합성 인자인 FAS에 대하여 약물 스크리닝 결과를 나타내는 도면이다. 도 19를 참조하면, 본 발명의 화학식 2의 화합물은 대조군과 비교하였을 때, 지방 합성 인자인 FAS에 대하여 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다.
이를 통해, 본 발명의 화합물은 지방 합성 단백질 발현을 감소시키는 효과가 있음을 보여준다.
2.8 <실험 예 8> 기존 제품 약물과의 비교 실험
2.8.1 실험 목적
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 화학식 2의 화합물의 기존 제품 약물과의 비교 실험 결과를 확인하기 위한 실험을 다음과 같이 실시하였다.
2.8.2 실험 방법
2.8.2.1 지방구 억제 효과 비교 실험
2.8.2.1.1. Huh7 세포 준비
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 지방증을 유도한 간 세포에서의 세포 독성 확인을 위해, Huh7 세포를 37 ℃, 습도 95%, CO2 5%로 설정된 인큐베이터에서 배양하였다.
또한, 증식배지(Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium (DMEM) supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml of penicillin, and 100 μg/ml of streptomycin)를 사용하여 Huh7세포를 plate에 80~90%까지 증식 시킨 뒤, 실험에 사용하였다.
2.8.2.1.2. Oil-Red-O 염색을 통한 지방증이 유도된 Huh7 세포에서의 지방구 감소 효과 확인
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 지방증을 유도한 간 세포에서 화학식 2의 화합물의 지방구 생성 억제 능력을 확인하기 위해, 간 세포에 대조군을 제외하고 2% BSA에 결합시킨 palmitic acid를 500 μM 농도로 처리하여 지방증을 유도 시킨 후 Oil-Red-O 염색을 통하여 지방구를 염색하였다.
먼저, 12 well plate에 간세포가 80~90% 자라게 배양한 후, 대조군을 제외하고, 지방증을 유도한 배양배지에 양성 대조군으로 PF-06409577을 희석하여 1 μM, 10 μM를 처리하고, 지방증을 유도한 배양배지에 양성 대조군으로 Elafibranor을 희석하여 10 μM, 30 μM 처리하고, 지방증을 유도한 배양배지에 시험물질을 희석하여 0.5 μM, 2.5 μM, 5 μM, 10 μM 을 처리하였다.
또한, Oil-Red-O 염색을 위해 well에 존재하는 세포 상층액을 제거한 후, PBS로 워싱 과정을 2번 진행하였다.
또한, 워싱 후, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 30분 고정하였다.
또한, 이후, 60% 1,2-프로페인다이올 디하이드레이션 솔루션(1,2-propanediol dehydration solution)액을 첨가한 뒤 5분 동안 배양하였다.
또한, 5분 뒤, 용액을 제거하고 Oil-Red-O 발색 시약(ORO 원액 6 ml과 증류수 4 ml의 비율로 혼합 한 다음 0.45 μm 필터로 여과하여 ORO 용액을 제조)을 추가하여 지방구 염색을 30분 동안 진행하였다.
또한, 염색 후, PBS로 워싱을 하여 남아있는 발색 시약을 제거하고 현미경으로 지방구 형성을 관찰하였다.
2.8.2.2 단백질 발현 수준 비교 실험
대조군 세포를 제외한 각 well의 Huh-7 세포는 지방증을 유도하기 위해 대조군을 제외하고 2% BSA에 결합시킨 PA를 250 μM 농도로 처리하였고, 대조군 세포는 2%의 FA가 없는 BSA로 전처리 하였다.
각 well에 대조군을 제외하고, 양성 대조군으로 PF-06409577을 1 μM 및 10 μM으로 각각 처리하고, 양성 대조군으로 Elafibranor을 10 μM 및 30 μM으로 각각 처리하고, 본 출원의 화학식 2의 화합물을 0.5 μM, 2.5 μM, 10 μM으로 각각 처리한 다음 24 시간 동안 배양하였다. 대조군 세포 및 처리된 세포를 DMSO로 처리하였다. 모든 배지를 흡인하고 차가운 PBS로 세포를 3번 처리하였다. 모든 배지를 부드럽게 세척하였다.
소듐 클로라이드 (NaCl) 150mM, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 5 mM, pH 8.0, HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 10 mM, NP-40 (nonylphenoxypolyethoxylethanol) 1%, 아프로티닌 (aprotinin) 2 μg/ml, 펩스타틴 A (pepstatin A) 1 μM, 류펩틴 (leupeptin) 10 μM, 소듐 플루오라이드 (NaF) 1 mM, 소듐 오르쏘바나데이트 (Na2VO4) 0.2 mM, 및 PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) 1 μM를 포함하는 차가운 용해 버퍼를 더하였다.
전체 세포 용해물을 수집하고 완전히 용해되도록 10번 이상 부드럽게 피펫팅하였다. 샘플을 얼음에서 20분 동안 배양하고 13,000 rpm, 4 oC에서 20분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 수집하고 샘플에 TrisCl (pH 6.8) 50mM, SDS 2%, 브로모페올 블루 (bromopheol blue) 0.1%, 및 글리세롤 10%를 포함하는 5X SDS (sodium dodecyl sulfate) 샘플 버퍼를 넣고 95 oC에서 5분 동안 끓였다.
10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)의 well에 같은 양의 단백질을 분자량 마커와 함께 로딩하였다. 상기 젤을 전기영동 챔버 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에서 30분 동안 100 V에서 전기영동을 실시하였다.
PVDF (polyvinylidene fluoride) 멤브레인 (MilliporeSigma, Burlington, MA USA)을 메탄올 (MeOH)로 1분 동안 활성화하고 트리스 25 mM, 글리신 190 mM, 및 MeOH 20%를 포함하는 트랜스퍼 버퍼로 씻었다. 트랜스퍼 버퍼에 젤을 10분 동안 넣었다.
트랜스퍼 샌드위치 (순서는 종이, 젤, 멤브레인, 및 종이)를 조립하고 트랜스퍼 샌드위치 내에 기포가 끼지 않았는지 확인하였다. 트랜스퍼 샌드위치를 *?*트랜스퍼 탱크 (Bio-Rad Laboratories)에 넣고 트랜스퍼 버퍼가 가열되는 것을 막기 위해 트랜스퍼 탱크에 얼음 덩어리를 넣었다. 30분 동안 100 V에서 단백질을 젤로부터 PVDF 멤브레인으로 옮겼다.
상기 PVDF 멤브레인을 증류수로 씻어내고 0.1% 트윈 20 (tween 20) (TBST, Sigma-Aldrich)이 포함된 TBST에 탈지유 (Difco Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA)를 5%로 제조한 블로킹 버퍼로 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 블로킹하였다.
1차 항체가 적절히 희석된 버퍼에서 멤브레인을 배양하였다. 1차 항체는 인산화 형태의 Acetyl-CoA carboxylase(p-ACC), LCAD를 사용하였고, 멤브레인을 TBST로 5분씩 3번 세척하였다.
블로킹 버퍼에서 HRP (horseradish peroxidase)-접합 2차 마우스 항체의 권장 희석액과 함께 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 배양하였다.
멤브레인을 TBST로 5분씩 5번 세척하였다. 과량의 시약을 제거하고 투명한 플라스틱 랩으로 멤브레인을 덮었다.
제조사의 권고에 따라 ECL 프라임 웨스턴 블로팅 검출 시약 (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)을 적용하였다.
ImageQuant LAS 3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan)을 사용하여 이미지를 획득하였다. 데이터를 분석하였다.
2.8.3 실험 결과
화학식 2의 화합물의 기존 제품 약물과의 지방 합성 저해의 단백질 발현 수준을 비교하기 위한 결과를 도 20 및 도21에 나타내었다.
도 20은 지방증을 유도한 간 세포에서의 지방 축적에 대하여 약물 스크리닝 결과를 나타내는 도면이다. 도 20을 참조하면, 본 발명의 화학식 2의 화합물은 PF-064099577 및 Elafibranor에 비해 낮은 농도임에도 불구하고, 농도 의존적으로 동등 또는 그 이상의 지방 축적 저해 효과가 있는 것을 확인할 수 있다.
도 21은 지방 합성 억제 및 지방산 산화와 관련된 단백질의 발현 수준을 나타내는 도면이다. 도 21을 참조하면, ACC는 인산화됨으로써 p-ACC 단백질 활성이 없어지기 때문에, p-ACC가 증가하였다는 것은 지방 합성이 감소하였음을 의미한다. 또한, 도 21을 참조하면, 본 발명의 화학식 2의 화합물은 PF-064099577 및 Elafibranor에 비해 낮은 농도임에도 불구하고, 농도 의존적으로 동등 또는 그 이상의 지방 축적 저해 효과가 있는 것을 확인할 수 있다. 그리고, 지방산 산화 관련 단백질인 LCAD의 발현이 본 발명의 화학식 2가 PF-064099577 및 Elafibranor에 비해에 비해 농도 의존 적으로 동등 또는 그 이상의 지방산 분해 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 본 발명의 화합물은 PF-064099577 및 Elafibranor에 비해 지방 축적 저해 효과가 있음을 보여준다.
2.9 <실험 예 9> 중성 지방 축적 억제 확인 실험
2.9.1 실험 목적
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 화학식 2의 화합물의 중성 지방 축적 억제를 확인하기 위한 실험을 다음과 같이 실시하였다.
2.9.2 실험 방법
실험 예 4와 동일한 방법으로써, 12 well에 Huh―7 세포를 PA에 의해 지방증을 유도하여 배양한 후 배양 배지로 시험물질을 희석하여 지정된 농도로 처리하였다. 처리 후, 트라이글리세라이드(Triglyceride)의 함량을 assay kit를 이용하여 확인하였다.
2.9.3 실험 결과
화학식 2의 화합물의 중성 지방 축적 억제 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22를 참조하면, 본 발명의 화학식 2의 화합물은 대조군과 비교하였을 때, 트라이글리세라이드 함량이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다.
이를 통해, 본 발명의 화합물은 중성 지방 축적을 억제시키는 효과가 있음을 보여준다.
2.10 <실험 예 10> SIRT1 활성도 확인 실험
2.10.1 실험 목적
본 출원의 일 실시 예에 따르면, 화학식 2의 화합물의 SIRT1 활성도를 확인하기 위한 실험을 다음과 같이 실시하였다.
2.10.2 실험 방법
모든 재료는 Sirt1 direct fluorescent screening assay kit (Cayman, Ann Arbor, MI, USA)로부터 제공되었다.
SIRT1, p53 conjugated AMC (aminomethylcoumarin) 단백질, 및 NAD+ 3 mM를 희석된 분석 버퍼 (Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, 및 MgCl2 1 mM)에 첨가하였다.
96-well 중 100% 초기 활성 Well (100% initial activity wells) 3개에는 분석 버퍼 25 μl, 희석된 SIRT1 5 μl, 및 용매 5 μl를 첨가하였다.
96-well 중 배경 well(background wells) 3개에는 분석 버퍼 30 μl 및 용매 5 μl를 첨가하였다.
96-well 중 샘플 well(sample wells) 3개에는 분석 버퍼 25 μl, 희석된 SIRT1 5 μl, 및 희석된 시험 화합물 5 μl를 첨가하였다. 최종 DMSO 농도는 2% 미만이었다.
사용되는 모든 well에 3 mM의 NAD+가 포함된 기질 용액 15 μl를 첨가하여 반응을 시작하였다. 플레이트 커버로 96 well을 덮고 45분 동안 실온 (25 oC 내지 30 oC)에서 쉐이커에서 배양하였다.
반응정지/발생 용액 (stop/developing solution)을 준비하였다. 최종 5ml 용액을 제조하기 위해 30 mg으로 무게를 젠 발색가루에 니코틴아마이드 (nicotinamide, NAM, Sigma-Aldrich)를 200 μl를 첨가하고 희석된 분석 버퍼 4.8 ml를 첨가하고 발색가루가 용액이 될 때까지 교반하였다.
플레이트 커버를 제거하고 반응정지/발색 용액 50 μl를 각 well에 첨가하였다.
플레이트 커버로 96 well을 덮고 30분 동안 실온 (25 oC 내지 30 oC)에서 배양하였다.
플레이트 커버를 제거하고 흡수 파장 (excitation wavelength) 360 nm 및 방출 파장 (emission wavelength) 450 nm를 사용하여 Cytation 5로 플레이트를 읽었다.
각 샘플의 평균 형광도를 측정하였다.
100% 시작 활성 well 및 샘플 well의 형광도로부터 백그라운드 well의 형광도를 뺐다.
각 샘플의 퍼센트를 결정하기 위해 100% 초기 활성값에서 각 샘플값을 뺀 후 100% 초기 활성값으로 나눈 다음 100을 곱한 값을 100과 더하여 백분율로 나타내었다.
Figure pat00009
2.10.3 실험 결과
화학식 2의 화합물의 SIRT1 활성도 확인 결과를 도 23에 나타내었다.
도 23을 참조하면, 본 발명의 화학식 2의 화합물은 SIRT 1 활성제로 잘 알려진 대조군(RSV, resveratrol) 과 비교하였을 때, SIRT1의 활성도를 보다 증가시키는 것을 확인할 수 있다.
이를 통해, 본 발명의 화합물은 SIRT1에 직접적으로 결합하여 활성을 증가시키는 것을 보여준다.

Claims (3)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure pat00010

    상기 화학식 1에서,
    X는 -H, -halo, -CH3, 또는 -NH2이다
  2. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00011

    상기 화학식 1에서,
    X는 -H, -halo, -CH3, 또는 -NH2이다.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 간질환은 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 비알콜성 지방간염(NASH), 간 지방증, 간경변, 간염, 간 선종, 인슐린 과민증 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,
    약학적 조성물.
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