KR20210095128A - 올리고당류의 외수송을 위한 기질 내수송체의 용도 - Google Patents
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Abstract
본원에서는 올리고당류의 외수송을 증진하기 위한 유전적으로 변형된 미생물 및 관련 방법이 개시된다. 본원에 기술된 미생물은 올리고당류의 외수송을 허용하는 CDT-1과 같은 주요 촉진인자 슈퍼패밀리 단백질을 발현한다. CDT-1의 변이체는 올리고당의 외수송과 관련하여 더 높은 활성을 나타낸다. 본원에서는 올리고당류를 성장 배지 내로 외수송하는 수단이 제공된다.
Description
관련 출원
본 출원은 2018년 10월 2일자로 제출된 미국 가출원 US 62/740,049 및 2019년 2월 6일자로 제출된 미국 가출원 US 62/801,755의 우선권을 주장하고 있다. 이들 출원 각각의 내용은 본원에 이들의 전문이 참고문헌으로 통합된다.
본원에서는 올리고당류의 외수송을 증진하기 위한 유전적으로 변형된 미생물 및 관련 방법이 개시된다. 본원에 기술된 미생물은 올리고당류의 외수송을 허용하는 CDT-1과 같은 주요 촉진인자 슈퍼패밀리 단백질을 발현한다. CDT-1의 변이체는 올리고당의 외수송과 관련하여 더 높은 활성을 나타낸다. 본원에서는 올리고당류를 성장 배지 내로 외수송하는 수단이 제공된다.
기능성 올리고당류는 식품 및 식이 보충제의 가치있는 성분으로서 출현하였다. 대장 미생물에 의한 소화 및 발효에 대한 이들의 저항성은 올리고당류의 영양적 장점을 제공한다. 식이 섬유, 감미제 및 보습제로서의 의미와는 별도로, 이들은 프리바이오틱스로서 환영을 받는다. 이들의 유익한 효과는 항산화, 항염증, 면역조절, 항-고혈압 및 항-알레르기 작용부터 항암, 신경보호 작용 및 피부 장벽 기능과 수분 공급의 개선까지 확장된다. 생체활성 올리고당류의 인기 상승은 새로운 지속가능한 공급원으로부터 이들을 생산하는 연구를 가속시켜 왔다.
올리고당류는 천연 공급원으로부터 획득될 수 있으며, 합성될 수도 있다. 올리고당류의 다양한 천연 공급원은 우유, 꿀, 사탕수수 쥬스, 호밀, 보리, 밀, 대두, 렌틸콩, 겨자, 과일 그리고 양파, 아스파라거스, 설탕무, 아티초크, 치커리, 부추, 마늘, 바나나, 야콘, 토마토 및 죽순과 같은 채소류를 포함한다. 공통적인 올리고당의 제조 방법은 다당류의 가수분해, 이당류 또는 단당류 기질로부터의 화학적 및 효소적 중합화를 포함한다. 다당류의 산, 알칼리 및 효소적 가수분해는 원하는 구조적 및 기능적 성질의 올리고당류를 생성할 수 있다. 특정 경우에, 효소적 방법이 이들의 높은 선택성 및 수율 그리고 환경-친화적인 특성으로 인해 올리고당 합성을 위해 선호된다. 다른 경우에는, 올리고당 생산하는 미생물 균주가 올리고당 생산을 가능하게 하는 외인성 유전자를 도입함으로써 조작될 수 있다.
미생물에서 생산된 올리고당류는 세포로부터 추가로 단리될 수 있는 배지 로 능동적으로 운반되지 않는 경우라면 세포내에 축적될 것이다. 외수송 과정이 없는 세포 내 축적은 바이오매스로부터 올리고당의 단리 과정을 요구하고, 발효 산물 또는 올리고당으로 기질의 전환을 제한시킨다. 일단 세포가 상당한 양의 올리고당을 축적하면 이를 회수하기 위하여 발효 진행이 효과적으로 중단되어야 하기 때문에, 세포 밖으로 발효 산물의 외수송이 결여되면 발효 공정의 비용도 역시 증가시킨다. 또한, 세포로부터 올리고당의 회수는 추출 또는 세포의 파쇄 또는 둘 다와 같은 추가적인 공정을 요구하고, 이는 비용을 추가적으로 증가시키거나, 오염시키는 세포 잔재물을 제거하도록 상당한 정제 단계를 요구하거나, 둘 다일 수 있다.
유기체가 전형적으로 소비, 감지 또는 둘 다에 대해 기질을 내수송하고, 외수송하지 않도록 메커니즘을 진화하였기 때문에, 올리고당류의 외수송체 단백질은 쉽게 입수가능하지 않다. 따라서, 진핵 세포에서 작용하는 올리고당 외수송을 허용하는 기능성 운반체의 확인은 효모 및 기타 진핵생물 생산 숙주에서 올리고당류의 생산을 위해 가장 중요하다.
기질 내수송체 (importer)는 외수송체 (exporter)로서 작용할 수 있는 점이 밝혀져 왔다. 예를 들면, 올리고당류가 세포 내에 높은 농도로 축적되는 경우, 이것은 적절한 운반체와 함께 기질을 농도가 더 낮은 세포 밖으로 밀어낼 수 있다. 추가적으로, 운반체의 돌연변이화된 버전은 농도 구배에 따른 기질 외수송이 용이하게 되는 방식으로 운반 공정의 조절이 손상될 수 있다. 또한, 동일한 기질 운반체의 변형은 세포 내에 적합한 기질을 축적하는 유기체에서 발현되는 경우에 더 높은 발효 산물 또는 올리고당 외수송율을 유도할 수 있다.
따라서, 본원에서는 구체적으로 올리고당류을 위한 기질 외수송체로서 기능할 수 있는 운반체가 제공된다. 이러한 운반체는 내수송체로서 또한 기능하고, 외수송된 것과는 상이한 올리고당과 같은 올리고당류를 내수송할 수 있다.
진균 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)로부터 나온 CDT-1 (XP_963801.1)은 셀로바이오스를 세포 내로 내수송하는 주요한 촉진인자 슈퍼패밀리 (MFS)로부터 나온 기질 운반체이다. 예기치 못하게도, 2'-퓨코실락토스 (2'-FL)와 같은 락토스 기반의 올리고당을 생산할 수 있는 조작된 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주에서 셀로덱스트린 운반체의 발현은 배양 배지로 방출되는 2'-FL의 증가를 유도한다. 이러한 상황에서, CDT-1은 세포 밖으로 2'-FL과 같은 올리고당의 운반을 용이하게 하는 외수송체로서 작용한다. 더우기, CDT-1의 변이된 버전은 2'-FL 외수송체로서 작용할 수 있고, 일정 경우에 이러한 돌연변이는 이 운반체의 변이되지 않은 버전과 비교하여 세포 밖으로 2'-FL 외수송을 추가로 증가시킨다. CDT-2은 본원에서 2'-FL와 같은 올리고당류을 외수송하는데 사용될 수 있는 진균 뉴로스포라 크라사로부터 나온 또 다른 기질 운반체이다.
특정 양태에서, 본 발명은 CDT-1, CDT-2 또는 CDT 돌연변이체와 같은 CDT를 발현하는 (즉, CDT 아미노산 서열에서 하나 이상의 변경을 갖음) 2'-FL 생산 균주를 제공한다.
일 양태에서, 이종유래 셀로덱스트린 운반체 유전자 또는 셀로덱스트린 운반체의 발현을 증진시키는 구조물을 포함하는 미생물이 제공된다.
부모 미생물과 비교하여, 본원에 기술된 미생물은 관심있는 올리고당 산물을 생산하는 능력을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 미생물을 올리고당을 포함하는 배지에서 배양하고, 배지로부터 관심있는 산물을 획득함으로써 관심있는 산물을 생산하는 방법이 제공된다.
일정 구현예에서, CDT 돌연변이체는 CDT-1SY이다. 이들 균주는 CDT-1 또는 CDT-1 유사체를 발현하지 않는 이들의 부모 균주와 비교하여 올리고당의 외수송 증가를 나타낸다.
특정 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 미생물을 배양함으로써 올리고당을 생산하는 방법을 제공한다. 일정 구현예에서, 미생물은 세균 또는 진균, 예를 들면 사상성 (filamentous) 진균 또는 효모이다. 일정 구현예에서, 미생물은 효모, 예를 들면 사카로마이세스 세레비시애이다.
일 양태에서, 본원에서는 올리고당을 생산하는 방법으로서, 본원에 기술된 미생물을 배양 배지에 배양하는 단계 및 올리고당을 회수하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, HMO를 단리하는 방법으로서, 배양 배지에 적어도 하나의 탄소 공급원을 제공하는 단계; 본원에 기술된 미생물을 제공하는 단계; 및 미생물을 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하고, HMO의 실질적인 분량은 배양 배지 내로 외수송되는, 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, HMO를 단리하는 방법으로서, 배양 배지에 적어도 하나의 탄소 공급원을 제공하는 단계; HMO를 생산하고 외수송할 수 있는 미생물을 제공하고, 상기 미생물은 이종유래 운반체 및 하나 이상의 이종유래 HMO 생산 유전자(들)을 포함하는, 단계; 미생물을 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하고, HMO의 실질적인 분량은 배양 배지 내로 외수송되는, 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, 동물 소비에 적합한 산물은 본원에 기술된 미생물에 의해 또는 본원에 기술된 방법에 따라 생산되는 HMO 및 동물 소비에 적합한 적어도 하나의 추가적인 성분을 포함한다.
또 다른 양태에서, 동물 소비에 적합한 산물은 본원에 기술된 미생물 및 선택적으로 동물 소비에 허용가능한 적어도 하나의 추가적인 성분을 포함한다.
도 1은 CDT-1 돌연변이체 및 락토스 운반체를 발현하는 세포의 모식도를 나타낸다. 이러한 예에서, 세포는 올리고당 2'-FL를 생산한다. 세포는 GDP-퓨코스를 생산하도록 조작된다. GDP-퓨코스에서 퓨코실 잔기는 후속으로 락토스로 전환되고, 이로써 2'-FL를 생산한다. 락토스는 락토스에 특이적인 운반체에 의해 내수송된다. CDT-1SY는 세포 밖으로 2'-FL와 같은 올리고당의 외수송을 용이하게 한다. 다음으로 올리고당은 성장 배지로부터 획득될 수 있다.
도 2는 운반체 CDT-1 돌연변이체 (예컨대 서열번호 1로 특정된 바 CDT-1SY)가 있거나 없는 2'-FL 생산하는 배경 균주의 상청액에서 2'-FL의 수준을 나타낸다. CDT-1SY를 발현하는 균주는 성장 배지에서 산물 축적의 ~ 30% 증가를 나타낸다.
도 3은 플라스미드 기반의 GMD, WcaG 및 WbgL로 구성되는 2'-FL 경로 발현과 함께 락토스 운반체로서 CDT-1 M7 (CDT-1 209S 262Y) 또는 Lacl2를 발현하는 효모 균주에 의한 락토스 흡수 활성 및 2'-FL 생산을 나타낸다.
도 4는 상이한 CDT-1 돌연변이체, CDT-1 (CDT-1 야생형), M1 (CDT-1 91A), M2 (CDT-1 213A), M3 (CDT-1 256V), M4 (CDT-1 335A), M5 (CDT-1 411A), M6 (CDT-1 209S 262W), M7 (CDT-1 209S 262Y), M8 (CDT-1 209S 262Y, 최적화된 초기 30개 아미노산 코돈)를 발현하는 효모 균주에 의한 상대적인 락토스 흡수 활성을 나타낸다. Ctrl은 운반체 발현이 전혀 없는 대조군 균주이다.
도 5는 플라스미드 기반의 GMD, WcaG 및 WbgL로 구성된 2'-FL 경로 발현과 함께 상이한 CDT-1 돌연변이체를 발현하는 효모 균주에 의한 상대적인 세포외 2'-FL 생산을 나타낸다. Ctrl은 락토스 운반체 발현이 없는 대조군 균주이다.
도 6은 플라스미드 기반의 GMD, WcaG 및 WbgL로 구성된 2'-FL 경로 발현과 함께 상이한 CDT-1 돌연변이체를 발현하는 효모 균주에 의한 총 2'-FL 생산을 나타낸다. Ctrl은 락토스 운반체 발현이 없는 대조군 균주이다.
도 7은 플라스미드 기반의 GMD, WcaG 및 WbgL로 구성된 2'-FL 경로 발현과 함께 상이한 CDT-1 돌연변이체를 발현하는 효모 균주에 의한 세포외 2'-FL 비율을 나타낸다.
도 8은 미생물 내에서 퓨코실화된 올리고당 생산의 모식도를 나타낸다. 2'-퓨코실락토스 (2'-FL)과 같은 퓨코실화된 올리고당이 형성되는 방식의 예를 나타낸다. GDP-만노스는 GDP-만노스 탈수화효소 (GMD)에 의해 GDP-4-데하이드로-6-데옥시-D-만노스로 탈수화된다. 다음으로 GDP-4-데하이드로-6-데옥시-D-만노스는 GDP 퓨코스 합성효소 (GFS)에 의해 GDP-퓨코스로 환원된다. 이러한 예에서, 락토스는 특이적 락토스 운반체에 의해 세포 내로 내수송되었으며, 다음으로 퓨코실 전이효소 (FT), 예로 알파-1,2-퓨코실 전이효소와 같은 글리코실 전이효소에 의해 추가로 퓨코실화되어 2'-FL를 형성한다. 다음으로 2'-FL은 올리고당 운반체에 의해 배지 내로 외수송된다.
도 9는 플라스미드 상의 CDT-1 M7, GMD 및 WcaG 발현을 갖는 효모 균주에게로 상이한 유기체로부터 나온 퓨코실 전이효소 (FT)의 도입에 의한 2'-FL 생산을 나타낸다. Ctrl은 FT 발현이 없는 대조군 균주이다.
도 10은 한 세트의 게놈 GMD, GFS 및 FT 유전자를 포함하는 기본 균주와 비교하여, GMD, GFS 및 FT 유전자를 갖는 플라스미드를 발현하는 효모 세포에서 2'-FL의 상대적인 생산을 나타낸다. 본원에서 발현 플라미드 상에 보유하는 GFS 유전자는 서열번호 20, 21, 22 및 23으로부터 선택되었다.
도 11은 한 세트의 게놈 GMD, GFS 및 FT 유전자를 포함하는 기본 균주와 비교하여, GMD, GFS 및 FT 유전자를 갖는 플라스미드를 발현하는 효모 세포에서 2'-FL의 상대적인 생산을 나타낸다. 발현 플라미드 상에 보유하는 FT 유전자는 서열번호 38, 29, 30, 31, 32 및 40으로부터 선택되었다.
도 12는 한 세트의 게놈 GMD, GFS 및 FT 유전자를 포함하는 기본 균주와 비교하여, (제 1 컬럼) GMD, FT 및 서열번호 24를 갖는 플라스미드 및 (제 2 컬럼) FT 및 서열번호 24만을 갖는 플라스미드를 발현하는 효모 세포에서 2'-FL의 상대적인 생산을 나타낸다.
도 13은 달리 2'-FL 생산을 할 수 없는 대조군 균주 (Ctrl)에서 플라스미드 발현에 의한 2'-FL의 생산을 나타낸다. 균주는 각각 서열번호 17, 18 또는 19를 보유하는 플라스미드와 함께 GFS 및 FT를 발현하는 플라스미드로 형질전환되었다. 플라스미드를 보유하지 않는 대조군은 2'-FL를 생산하지 않는다.
도 2는 운반체 CDT-1 돌연변이체 (예컨대 서열번호 1로 특정된 바 CDT-1SY)가 있거나 없는 2'-FL 생산하는 배경 균주의 상청액에서 2'-FL의 수준을 나타낸다. CDT-1SY를 발현하는 균주는 성장 배지에서 산물 축적의 ~ 30% 증가를 나타낸다.
도 3은 플라스미드 기반의 GMD, WcaG 및 WbgL로 구성되는 2'-FL 경로 발현과 함께 락토스 운반체로서 CDT-1 M7 (CDT-1 209S 262Y) 또는 Lacl2를 발현하는 효모 균주에 의한 락토스 흡수 활성 및 2'-FL 생산을 나타낸다.
도 4는 상이한 CDT-1 돌연변이체, CDT-1 (CDT-1 야생형), M1 (CDT-1 91A), M2 (CDT-1 213A), M3 (CDT-1 256V), M4 (CDT-1 335A), M5 (CDT-1 411A), M6 (CDT-1 209S 262W), M7 (CDT-1 209S 262Y), M8 (CDT-1 209S 262Y, 최적화된 초기 30개 아미노산 코돈)를 발현하는 효모 균주에 의한 상대적인 락토스 흡수 활성을 나타낸다. Ctrl은 운반체 발현이 전혀 없는 대조군 균주이다.
도 5는 플라스미드 기반의 GMD, WcaG 및 WbgL로 구성된 2'-FL 경로 발현과 함께 상이한 CDT-1 돌연변이체를 발현하는 효모 균주에 의한 상대적인 세포외 2'-FL 생산을 나타낸다. Ctrl은 락토스 운반체 발현이 없는 대조군 균주이다.
도 6은 플라스미드 기반의 GMD, WcaG 및 WbgL로 구성된 2'-FL 경로 발현과 함께 상이한 CDT-1 돌연변이체를 발현하는 효모 균주에 의한 총 2'-FL 생산을 나타낸다. Ctrl은 락토스 운반체 발현이 없는 대조군 균주이다.
도 7은 플라스미드 기반의 GMD, WcaG 및 WbgL로 구성된 2'-FL 경로 발현과 함께 상이한 CDT-1 돌연변이체를 발현하는 효모 균주에 의한 세포외 2'-FL 비율을 나타낸다.
도 8은 미생물 내에서 퓨코실화된 올리고당 생산의 모식도를 나타낸다. 2'-퓨코실락토스 (2'-FL)과 같은 퓨코실화된 올리고당이 형성되는 방식의 예를 나타낸다. GDP-만노스는 GDP-만노스 탈수화효소 (GMD)에 의해 GDP-4-데하이드로-6-데옥시-D-만노스로 탈수화된다. 다음으로 GDP-4-데하이드로-6-데옥시-D-만노스는 GDP 퓨코스 합성효소 (GFS)에 의해 GDP-퓨코스로 환원된다. 이러한 예에서, 락토스는 특이적 락토스 운반체에 의해 세포 내로 내수송되었으며, 다음으로 퓨코실 전이효소 (FT), 예로 알파-1,2-퓨코실 전이효소와 같은 글리코실 전이효소에 의해 추가로 퓨코실화되어 2'-FL를 형성한다. 다음으로 2'-FL은 올리고당 운반체에 의해 배지 내로 외수송된다.
도 9는 플라스미드 상의 CDT-1 M7, GMD 및 WcaG 발현을 갖는 효모 균주에게로 상이한 유기체로부터 나온 퓨코실 전이효소 (FT)의 도입에 의한 2'-FL 생산을 나타낸다. Ctrl은 FT 발현이 없는 대조군 균주이다.
도 10은 한 세트의 게놈 GMD, GFS 및 FT 유전자를 포함하는 기본 균주와 비교하여, GMD, GFS 및 FT 유전자를 갖는 플라스미드를 발현하는 효모 세포에서 2'-FL의 상대적인 생산을 나타낸다. 본원에서 발현 플라미드 상에 보유하는 GFS 유전자는 서열번호 20, 21, 22 및 23으로부터 선택되었다.
도 11은 한 세트의 게놈 GMD, GFS 및 FT 유전자를 포함하는 기본 균주와 비교하여, GMD, GFS 및 FT 유전자를 갖는 플라스미드를 발현하는 효모 세포에서 2'-FL의 상대적인 생산을 나타낸다. 발현 플라미드 상에 보유하는 FT 유전자는 서열번호 38, 29, 30, 31, 32 및 40으로부터 선택되었다.
도 12는 한 세트의 게놈 GMD, GFS 및 FT 유전자를 포함하는 기본 균주와 비교하여, (제 1 컬럼) GMD, FT 및 서열번호 24를 갖는 플라스미드 및 (제 2 컬럼) FT 및 서열번호 24만을 갖는 플라스미드를 발현하는 효모 세포에서 2'-FL의 상대적인 생산을 나타낸다.
도 13은 달리 2'-FL 생산을 할 수 없는 대조군 균주 (Ctrl)에서 플라스미드 발현에 의한 2'-FL의 생산을 나타낸다. 균주는 각각 서열번호 17, 18 또는 19를 보유하는 플라스미드와 함께 GFS 및 FT를 발현하는 플라스미드로 형질전환되었다. 플라스미드를 보유하지 않는 대조군은 2'-FL를 생산하지 않는다.
일 양태에서, 이종유래 셀로덱스트린 운반체 유전자 또는 셀로덱스트린 운반체의 발현을 증진시키는 구조물을 포함하는 미생물이 제공된다.
본원에 기술된 임의의 양태에 적용될 수 있는 수많은 구현예가 추가로 제공된다. 예를 들면, 일정 구현예에서, 이종유래 셀로덱스트린 운반체는 CDT-1이다. 일정 구현예에서, CDT-1을 발현하는 유전자 또는 구조물은 CDT-1의 올리고당 외수송 활성을 상응하는 CDT-1을 발현하는 야생형 유전자 또는 구조물 과 비교하여 증가시키는 유전적 변형을 포함한다. 일정 구현예에서, CDT-1을 발현하는 유전자 또는 구조물은 MFS 운반체 유전자 (CDT-1) 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, 운반체는 PESPR 모티브를 포함한다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 4와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산은 서열번호 4의 아미노산 위치 91번, 209번, 213번, 256번, 262번, 335번 및 411번에 상응하는 위치에서 치환된다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 4의 91A, 209S, 213A, 256V, 262Y, 335A 및 411A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 4와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖으며, 여기서 CDT-1 아미노산 서열은 서열번호 4의 잔기 209번에 상응하는 위치에서 세린 및 잔기 262번에 상응하는 위치에서 타이로신을 포함한다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 1과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 4와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖으며, 여기서 CDT-1 아미노산 서열은 서열번호 4의 잔기 209번에 상응하는 위치에서 세린을 포함한다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 2와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 4와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖으며, 여기서 아미노산 서열은 서열번호 4의 잔기 262번에 상응하는 위치에서 타이로신을 포함한다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 3과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 4와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖으며, 여기서 아미노산 서열은 서열번호 4의 잔기 91번에 상응하는 위치에서 알라닌을 포함한다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 10과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 4와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖으며, 여기서 아미노산 서열은 서열번호 4의 잔기 213번에 상응하는 위치에서 알라닌을 포함한다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 11과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 4와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖으며, 여기서 아미노산 서열은 서열번호 4의 잔기 256번에 상응하는 위치에서 발린을 포함한다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 12와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 4와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖으며, 여기서 아미노산 서열은 서열번호 4의 잔기 335번에 상응하는 위치에서 알라닌을 포함한다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 13과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 4와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖으며, 여기서 아미노산 서열은 서열번호 4의 잔기 411번에 상응하는 위치에서 알라닌을 포함한다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 14와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 4와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖으며, 여기서 CDT-1 아미노산 서열은 서열번호 4의 잔기 209번에 상응하는 위치에서 세린을 포함한다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 15와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, CDT-1은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩된다. 일정 구현예에서, 핵산은 효모에 대해 최적화된다. 일정 구현예에서, 핵산의 적어도 5%는 코돈 최적화된다. 일정 구현예에서, 핵산의 적어도 90개 뉴클레오티드는 코돈 최적화된다. 일정 구현예에서, CDT-1은 서열번호 16의 핵산에 의해 인코딩된다. 일정 구현예에서, 미생물은 다음으로부터 선택되는 CDT-1의 올리고당 외수송 활성을 증가시키는 유전적 변형을 추가로 포함한다: (a) cdt-1 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터; (b) cdt-1을 포함하는 염색체외 유전물질; (c) 하나 이상의 cdt-1 유전자 사본, 여기서 상기 사본은 미생물의 게놈 내로 혼입되고; (d) 변형되지 않은 CDT-1과 비교하여 구성적으로 활성을 갖는 CDT-1를 인코딩하는 변형된 cdt-1; (e) 변형되지 않은 CDT-1과 비교하여 올리고당 외수송 활성을 증가시킨 CDT-1를 인코딩하는 변형된 cdt-1; (f) 상응하는 야생형 CDT-1과 비교하여 구성적으로 활성을 갖는 CDT-1 또는 올리고당 외수송 활성을 증가시킨 CDT-1를 인코딩하는 변형된 cdt-1를 포함하는 염색체외 유전물질; 또는 (g) 하나 이상의 cdt-1 사본 또는 상응하는 야생형 CDT-1과 비교하여 구성적으로 활성을 갖는 CDT-1 또는 올리고당 외수송 활성을 증가시키는 CDT-1를 인코딩하는 변형된 cdt-1, 여기서 상기 사본은 미생물의 게놈 내로 혼입된다. 일정 구현예에서, cdt-1 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터는 내인성 프로모터보다 더 높은 수준으로 cdt-1의 발현을 유도한다. 일정 구현예에서, 프로모터는 이것이 cdt-1 발현을 유도시키는 미생물에 특이적이다. 일정 구현예에서, 이종유래 셀로덱스트린 운반체는 CDT-2이다. 일정 구현예에서, CDT-2는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 9와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 미생물은 락토스 퍼미아제를 발현하는 유전자 또는 구조물을 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 락토스 퍼미아제는 Lac12이다. 일정 구현예에서, Lac12는 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 41과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 미생물은 하나 이상의 HMO 생산 단백질의 발현을 증진시키는 하나 이상의 이종유래 HMO 생산 유전자 또는 구조물을 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 미생물은 이종유래 셀로덱스트린 운반체 CDT-1 또는 변이체 또는 본원에 기술된 바와 같은 CDT-1의 돌연변이를 포함하고, 하나 이상의 HMO 생산 단백질의 발현을 증진시키는 하나 이상의 이종유래 HMO 생산 유전자 또는 구조물을 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 HMO 생산 단백질은 퓨코스 및 ATP를 퓨코스-1-포스페이트로 전환할 수 있는 효소, 퓨코스-1-포스페이트 및 GTP를 GDP-퓨코스로 전환할 수 있는 효소 및/또는 글루코실 전이효소이다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 HMO 생산 유전자는 GDP-만노스 탈수화효소 유전자이거나, 하나 이상의 HMO 생산 단백질은 GDP-만노스 탈수화효소 단백질이다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 HMO 생산 유전자는 GDP-L-퓨코스 합성효소 유전자이거나, 하나 이상의 HMO 생산 단백질은 GDP-L-퓨코스 합성효소 단백질이다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 HMO 생산 유전자는 퓨코실 전이효소 유전자이거나, 하나 이상의 HMO 생산 단백질은 퓨코실 전이효소 단백질이다. 일정 구현예에서, GDP-만노스 탈수화효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은, GDP-만노스 탈수화효소를 발현하는 상응하는 야생형 유전자 또는 구조물과 비교하여 GDP-만노스 탈수화효소의 올리고당 생산 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함한다. 일정 구현예에서, GDP-만노스 탈수화효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 GDP-만노스 탈수화효소 유전자 (gmd) 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, GDP-만노스 탈수화효소는 서열번호 17 내지 19, 42 및 61 내지 63 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 17 내지 19, 42 및 61 내지 63 중 어느 하나와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, GDP-L-퓨코스 합성효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은, GDP-L-퓨코스 합성효소를 발현하는 상응하는 야생형 유전자 또는 구조물과 비교하여 GDP-L-퓨코스 합성효소의 올리고당 생산 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함한다. 일정 구현예에서, GDP-L-퓨코스 합성효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 GDP-L-퓨코스 합성효소 유전자 (gfs) 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, GDP-L-퓨코스 합성효소는 서열번호 20 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 20 내지 23 중 어느 하나와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, GDP-L-퓨코스 합성효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 WcaG 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, WcaG는 서열번호 43 내지 45 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 43 내지 45 중 어느 하나와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, GDP-L-퓨코스 합성효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 GMER 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, GMER는 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 46과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은, 퓨코실 전이효소를 발현하는 상응하는 야생형 유전자 또는 구조물과 비교하여 퓨코실 전이효소의 올리고당 생산 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함한다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 퓨코실 전이효소 유전자 (ft) 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소는 서열번호 26 내지 40 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 26 내지 40 중 어느 하나와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 wbgL 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, wbgL은 서열번호 47의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 47과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 futC 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, futC는 서열번호 48의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 48과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 wcfB 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, wcfB는 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 49와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 wbgN 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, wbgN은 서열번호 50의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 50과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 wbwk 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, wbwk는 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 51과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 wbsJ 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, wbsJ는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 52와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 wbiQ 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, wbiQ는 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 53과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 futB 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, futB는 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 54와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 futL 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, futL은 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 55와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 futF 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, futF는 서열번호 56의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 56과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 futG 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, futG는 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 57과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 futN 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, futN는 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 58과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 wcfw 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, wcfw는 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 59와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 futA 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, futA는 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 63과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 futD 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, futD는 서열번호 64의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 64와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 futE 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, futE는 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 65와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 futH 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, futH는 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 66과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 futJ 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, futJ는 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 67과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 futK 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, futK는 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 68과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 퓨코실 전이효소를 발현하는 유전자 또는 구조물은 futM 또는 이의 변이체이다. 일정 구현예에서, futM은 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 69와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 HMO 생산 유전자의 효소는 2가지 도메인을 포함하고, 여기서 하나의 도메인은 GDP-만노스 탈수화효소와 상동성을 갖고, 두 번째 도메인은 퓨코실 합성효소와 상동성을 갖는다. 일정 구현예에서, 효소는 서열번호 24 또는 25의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 24 또는 25와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 HMO 생산 유전자는 이중기능성 퓨코키나제/L-퓨코스-1-P-구아니릴 전이효소 유전자이고, 하나 이상의 HMO 생산 단백질은 이중기능성 퓨코키나제/L-퓨코스-1-P-구아니릴 전이효소 단백질이다. 일정 구현예에서, 이중기능성 퓨코키나제/L-퓨코스-1-P-구아니릴 전이효소는 서열번호 71 내지 73 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 71 내지 73 중 어느 하나와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 미생물은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다: (i) 미생물에서 PMA1의 양성자 외수송 활성을 부모 미생물에서 PMA1 활성과 비교하여 증가시키는 유전적 변형; (ii) 미생물에서 SNF3의 헥소스 감지 활성을 부모 미생물에서 SNF3 활성과 비교하여 감소시키는 유전적 변형; (iii) 미생물에서 RGT2의 헥소스 감지 활성을 부모 미생물에서 RGT2 활성과 비교하여 감소시키는 유전적 변형; 및 (iv) 미생물에서 GPR1의 헥소스 감지 활성을 부모 미생물에서 GPR1 활성과 비교하여 감소시키는 유전적 변형. 일정 구현예에서, 미생물은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다: (i) PMA1의 양성자 외수송 활성을 증가시키는 유전적 변형은 원형질막 ATP아제 유전자 (pma1)에 대한 유전적 변형이고, (ii) SNF3의 헥소스 감지 활성을 감소시키는 유전적 변형은 슈크로스 비-발효 유전자 (snf3)에 대한 유전적 변형이고, (iii) RGT2의 헥소스 감지 활성을 감소시키는 유전적 변형은 포도당 운반 유전자 (rgt2)에 대한 유전적 변형이고; (iv) GPR1의 헥소스 감지 활성을 감소시키는 유전적 변형은 G 단백질 결합된 수용체 1 유전자 (gpr1)에 대한 유전적 변형이다. 일정 구현예에서, (i) PMA1은 서열번호 5의 서열 또는 서열번호 5와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고, (ii) SNF3는 서열번호 6의 서열 또는 서열번호 6과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고, (iii) RGT2는 서열번호 7의 서열 또는 서열번호 7과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고, (iv) GPR1은 서열번호 8의 서열 또는 서열번호 8과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일정 구현예에서, 미생물은 샤퍼로닌을 인코딩하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 샤퍼로닌은 gGroESL이다. 일정 구현예에서, 미생물은 진핵 유기체이다. 일정 구현예에서, 진균 미생물은 사상성 진균 또는 효모이다. 일정 구현예에서, 미생물은 아스코마이세테스 진균이다. 일정 구현예에서, 아스코마이세테스 진균은 사카로마이세스 종, 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 종 및 피키아 (Pichia) 종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 미생물은 사카로마이세스 종, 사카로마이세스 세레비시애, 사카로마이세스 모나센시스, 사카로마이세스 바야누스, 사카로마이세스 파스토리아누스, 사카로마이세스 칼스버겐시스, 사카로마이세스 폼브, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 프라질리스, 피키아 스티피스, 스포로트리쿰 써모필레 (Sporotrichum thermophile), 칸디다 쉐하테 (Candida shehatae), 칸디다 트로피칼리스, 뉴로스포라 크라사, 뉴로스포라 종, 토룰라스포라 (Torulaspora) 종, 토룰라스포라 델브루엑키, 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces) 종, 자이고사카로마이세스 바일리, 브레타노마이세스 (Brettanomyces) 종, 브레타노마이세스 인터메디우스, 브레타노마이세스 브룩셀렌시스, 브레타노마이세스 아노말러스, 브레타노마이세스 쿠스테르시아누스, 브레타노마이세스 나르데넨시스, 브레타노마이세스 나누스, 덱케라 (Dekkera) 종, 덱케라브룩셀렌시스, 덱케라 아노말라, 메트쉼코위아 (Metschmkowia) 종, 이사첸키아 (Issatchenkia) 종, 이사첸키아 오리엔탈리스, 이사첸키아 테리콜라, 클로엑케라 (Kloeckera) 종, 클로엑케라 아피쿨라테, 아우레오바시디움 종, 아우레오바시디움 플루란스, 로도토룰라 (Rhodotorula) 종, 로도토룰라 글루티니스, 로도토룰라 클라디엔시스, 로도스포리디움 (Rhodosporidium) 종, 로도스포리디움 토룰로이데스, 크립토코커스 (Cryptococcus) 종, 크립토코커스 네오포르만스, 크립토코커스 알비두스, 야로위야 (Yarrowia) 종, 야로위야 리포티카, 쿠라이쉬아 (Kuraishia) 종, 쿠라이쉬아 캡슐라타, 쿠라이쉬아 몰리쉬아나, 코마가탤라 (Komagataella) 종, 코마가탤라 파피, 코마가탤라 파스토리스, 한세니아스포라 (Hanseniaspora) 종, 한세니아스포라 길리에르몬디, 한세니아스포라 우바룸, 하세가와애 (Hasegawaea) 종, 하세가와애 자포니카, 아스코이대 (Ascoidea) 종, 아스코이대 아시아티카, 세팔로아스쿠스 (Cephaloascus) 종, 세팔로아스쿠스 프라그란스, 리포마이세스 (Lipomyces) 종, 리포마이세스 스타르케이, 카와사키아 (Kawasakia) 종, 카와사키아 아르지, 자이고자이마 (Zygozyma) 종, 자이고자이마 올리고파가, 메츠쉬니코위야 (Metschnikowia) 종, 메츠쉬니코위야 풀쉐리마, 콕시디오데스 (Coccidiodes) 종, 콕시디오데스 이미티스, 뉴로스포라 디스크레타, 뉴로스포라 아프리카누스, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종, 아스퍼질러스 니게르, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 오리자이, 아스퍼질러스 푸미가투스, 뮤코르 (Mucor) 종, 뮤코르 서시넬로이데스, 뮤코르 라세모수스, 라이조푸스 (Rhizopus) 종, 라이조푸스 오리자이, 라이조푸스 스톨로니페라, 움벨롭시스 (Umbelopsis) 종, 움벨롭시스 이사벨린, 모르티에렐라 (Mortierella) 종, 모르티에렐라 알피네, 알테르나리라 (Alternaria) 종, 알테르나리라 알터나테, 보트리티스 (Botrytis) 종, 보트리티스 시내레알, 푸사리움 (Fusarium) 종, 푸사리움 그라미나리움, 제오트리쿰 (Geotrichum) 종, 제오트리쿰 칸디둠, 페니실리움 (Penicillium) 종, 페니실리움 크라이소게눔, 채토미움 (Chaetomium) 종, 채토미움 써모필리아, 마그나포르테 (Magnaporthe) 종, 마그나포르테 그리세아, 에머리셀라 (Emericella) 종, 에머리셀라 디스코포라, 트리코더마 (Trichoderma) 종, 트리코더마 리세이, 탈라로마이세스 (Talaromyces) 종, 탈라로마이세스 에메르소니, 소르다리아 (Sordaria) 종, 또는 소르다리아 마크로스포라이다. 일정 구현예에서, 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 2'-퓨코실락토스, 3'-퓨코실락토스, 6'-퓨코실락토스, 3'-시아릴락토스, 6'-시아릴락토스, 디-퓨코실락토스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-테트라오스, 락토-N-퓨코펜타오스 I, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅱ, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅲ, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅳ, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅴ, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅵ, 락토-N-헥사오스, 락토-N-네오헥사오스, 모노퓨코실락토-N-헥사오스 Ⅰ, 모노퓨코실락토-N-헥사오스 Ⅱ, 디퓨코실락토-N-헥사오스 Ⅰ, 디퓨코실락토-N-헥사오스 Ⅱ, 디퓨코실락토-N-네오헥사오스, 디퓨코실-파라-락토-N-네오헥사오스, 디퓨코실-파라-락토-N-헥사오스, 트리퓨코실락토-N-헥사오스, 시아릴락토-N-네오테트라오스 a, 시아릴락토-N-테트라오스 b, 시아릴락토-N-테트라오스 c, 디시아릴락토-N-테트라오스, 퓨코실시아릴락토-N-테트라오스 a, 퓨코실시아릴락토-N-테트라오스 b, 퓨코실시아릴락토-N-헥사오스, 퓨코실시아릴락토-N-네오헥사오스 I 또는 퓨코실디시아릴락토-N-헥사오스 Ⅱ로부터 선택된 올리고당을 세포 밖으로 운반하는 더 높은 성능을 갖는다. 일정 구현예에서, 미생물은 부모 미생물과 비교하여 중합화도 3을 갖는 인간 우유 올리고당을 세포 밖으로 운반하는 더 높은 성능을 갖는다. 일정 구현예에서, 인간 우유 올리고당은 2'-퓨코실락토스, 3'-퓨코실락토스, 6'-퓨코실락토스, 3'-시아릴락토스 또는 6'-시아릴락토스이다. 일정 구현예에서, 미생물은 부모 미생물과 비교하여 중합화도 4를 갖는 인간 우유 올리고당을 세포 밖으로 운반하는 더 높은 성능을 갖는다. 일정 구현예에서, 인간 우유 올리고당은 디퓨코실락토스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-테트라오스, 시아릴락토-N-네오테트라오스 a 또는 시아릴락토-N-테트라오스 b이다. 일정 구현예에서, 미생물은 부모 미생물과 비교하여 중합화도 5를 갖는 인간 우유 올리고당을 세포 밖으로 운반하는 더 높은 성능을 갖는다. 일정 구현예에서, 인간 우유 올리고당은 락토-N-퓨코펜타오스 I, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅱ, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅲ, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅳ, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅴ 또는 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅵ이다. 일정 구현예에서, 미생물은 부모 미생물과 비교하여 2'-퓨코실락토스를 세포 밖으로 운반하는 더 높은 성능을 갖는다. 일정 구현예에서, 미생물은 부모 미생물과 비교하여 락토-N-테트라오스를 세포 밖으로 운반하는 더 높은 성능을 갖는다. 일정 구현예에서, 미생물은 부모 미생물과 비교하여 락토-N-네오테트라오스를 세포 밖으로 운반하는 더 높은 성능을 갖는다. 일정 구현예에서, 미생물은 부모 미생물과 비교하여 3'-시아릴락토스를 세포 밖으로 운반하는 더 높은 성능을 갖는다. 일정 구현예에서, 미생물은 부모 미생물과 비교하여 6'-시아릴락토스를 세포 밖으로 운반하는 더 높은 성능을 갖는다. 일정 구현예에서, 미생물은 부모 미생물과 비교하여 디퓨코실락토스를 세포 밖으로 운반하는 더 높은 성능을 갖는다. 일정 구현예에서, 미생물은 부모 미생물과 비교하여 락토-N-퓨코펜타오스 I을 세포 밖으로 운반하는 더 높은 성능을 갖는다.
또 다른 양태에서, 이종유래 CDT-1 운반체 또는 이의 변이체 및 HMO 생산을 위한 적어도 하나의 이종유래 경로 유전자를 포함하는 인간 우유 올리고당 (HMO)의 생산을 증진시키는 미생물이 제공된다.
상기에 기술된 바와 같이, 특정 구현예는 본원에 기술된 임의의 미생물에 적용가능하다. 예를 들면, 일정 구현예에서, 미생물은 HMO를 생산하고 외수송할 수 있다. 일정 구현예에서, 운반체는 생산된 HMO의 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60%를 외수송할 수 있다. 일정 구현예에서, 미생물은 운반체가 결여된 부모 미생물과 비교하여 적어도 50% 더 많은 HMO를 외수송할 수 있다. 일정 구현예에서, 효모는 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖거나, 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 운반체를 포함한다. 일정 구현예에서, 운반체는 PESPR 모티브를 포함한다. 일정 구현예에서, 운반체는 서열번호 4의 아미노산 위치 91번, 209번, 213번, 256번, 262번, 335번 및 411번에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, CDT-1은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩된다. 일정 구현예에서, 핵산의 적어도 90개 뉴클레오티드는 효모에 대해 코돈 최적화되거나, 핵산의 적어도 5%는 효모에 대해 코돈 최적화된다. 일정 구현예에서, 운반체는 91A, 209S, 213A, 256V, 262Y, 335A, 411A 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함한다. 일정 구현예에서, 경로 유전자는 GDP-만노스 4,6-탈수화효소, GDP-L-퓨코스 합성효소 및 알파-1,2-퓨코실 전이효소로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 미생물은 제 2 이종유래 경로 유전자를 포함한다. 일정 구현예에서, HMO는 2'-퓨코실락토스 (2'-FL), 3'-퓨코실락토스 (3'-FL), 3'-시아릴락토스 (3'-SL), 6'-시아릴락토스 (6'-SL), 락토-N-네오테트라오스 (LNnT), 락토-N-테트라오스 (LNT), 시아릴락토-N-테트라오스 a (LST a), 시아릴락토-N-네오테트라오스 c (LST c), 락토-디퓨코테트라오스 (LDFT) 및 락토-N-퓨코펜타오스 I (LNFP I)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일정 구현예에서, HMO는 2'-퓨코실락토스이다. 일정 구현예에서, 미생물은 아스코마이세테스 (Ascomycetes) 진균이다. 일정 구현예에서, 아스코마이세테스 진균은 사카로마이세스 (Sacharomyces) 종, 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 종 및 피키아 (Pichia) 종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 아스코마이세테스 진균은 트리코더마 (Trichoderma), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 야로위야 (Yarrowia), 아스퍼질러스 (Aspergillus) 및 뉴로스포라 (Neurospora)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 이종유래 CDT-1 운반체 및 경로 유전자 중 하나 또는 둘 다는 효모 염색체 내로 혼입된다. 일정 구현예에서, 이종유래 CDT-1 운반체 및 경로 유전자 중 하나 또는 둘 다는 에피좀으로 존재한다. 일정 구현예에서, 미생물은 HMO 생산을 위한 한 세트의 경로 유전자를 포함한다. 일정 구현예에서, 세트는 GDP-만노스 4,6-탈수화효소 (GMD), GDP-L-퓨코스 합성효소 (GFS) 및 퓨코실 전이효소 (FT)를 포함한다. 일정 구현예에서, 세트는 GDP-만노스 4,6-탈수화효소, GDP-L-퓨코스 합성효소 및 알파-1,2-퓨코실 전이효소를 포함하고, 여기서 HMO는 2'-FL이다. 일정 구현예에서, 세트는 이중기능성 퓨코키나제/L-퓨코스-1-P-구아니릴 전이효소를 포함한다. 일정 구현예에서, 세트는 퓨코스 및 ATP를 퓨코스-1-포스페이트로 전환할 수 있는 효소, 퓨코스-1-포스페이트 및 GTP를 GDP-퓨코스로 전환할 수 있는 효소 및 글루코실 전이효소를 포함한다. 일정 구현예에서, 글리코실 전이효소는 알파-1,2-퓨코실 전이효소이고, 여기서 HMO는 2'-FL이다. 일정 구현예에서, 경로 유전자의 세트는 Gmd, WcaG 및 WbgL을 포함한다. 일정 구현예에서, GDP-만노스 4,6-탈수화효소는 서열번호 17 내지 19, 42 및 61 내지 63 또는 이와 적어도 85% 상동성을 갖는 변이체로부터 선택된다. 일정 구현예에서, GDP-L-퓨코스 합성효소는 서열번호 20 내지 23 또는 이와 적어도 85% 상동성을 갖는 변이체로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 알파-1,2-퓨코실 전이효소는 서열번호 26 내지 40 또는 이와 적어도 85% 상동성을 갖는 변이체로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 올리고당을 생산하는 방법으로서, 본원에 기술된 미생물을 배양 배지에서 배양하는 단계 및 본원에 제공된 올리고당을 회수하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, HMO를 단리하는 방법으로서, 적어도 하나의 탄소 공급원을 갖는 배양 배지를 제공하는 단계; HMO를 생산하여 외수송할 수 있는 미생물을 제공하고, 미생물은 HMO의 생산을 위한 이종유래 운반체 및 하나 이상의 이종유래 유전자를 포함하는, 단계; 및 미생물을 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 HMO의 실질적인 분량이 배지 내로 외수송되는, 방법이 제공된다.
상기에 기술된 바와 같이, 특정 구현예는 본원에 기술된 임의의 방법에 적용가능하다. 예를 들면, 일정 구현예에서, HMO는 2'-퓨코실락토스, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 3'-시아릴락토스, 6'-시아릴락토스 또는 디퓨코실락토스이다. 일정 구현예에서, 상기 방법은 미생물로부터 배양 배지를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 상기 방법은 배양 배지로부터 HMO를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 이종유래 운반체는 CDT-1, CDT-2 또는 이들의 변이체이다. 일정 구현예에서, HMP는 2'-FL이다. 일정 구현예에서, 이종유래 운반체는 서열번호 4의 아미노산 위치 91번, 209번, 213번, 256번, 262번, 335번 및 411번에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDT-1 변이체이다. 일정 구현예에서, CDT-1은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩된다. 일정 구현예에서, 핵산은 효모에 대해 최적화된다. 일정 구현예에서, 핵산의 적어도 5%는 코돈 최적화된다. 일정 구현예에서, 핵산의 적어도 90개 뉴클레오티드는 코돈 최적화된다. 일정 구현예에서, 운반체는 91A, 209S, 213A, 256V, 262Y, 262W, 335A, 411A 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함한다. 일정 구현예에서, 이종유래 유전자는 GDP-만노스 4,6-탈수화효소, GDP-L-퓨코스 합성효소 및 알파-1,2-퓨코실 전이효소로부터 선택된다. 일정 구현예에서, HMO의 외수송은 이종유래 운반체를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 증가된다. 일정 구현예에서, 이종유래 운반체는 락토스를 내수송하고, HMO를 외수송할 수 있다. 일정 구현예에서, 배양 배지는 락토스를 포함한다. 일정 구현예에서, 미생물에 의해 생산된 총 HMO 대비 배양 배지에서의 HMO의 비율은 적어도 약 1 : 1, 1.5 : 1, 2 : 1, 2.5 : 1, 3 : 1, 3.5 : 1, 4 : 1 또는 4 : 1 초과이다. 일정 구현예에서, HMO는 2'-퓨코실락토스 (2'-FL), 3'-퓨코실락토스 (3'-FL), 3'-시아릴락토스 (3'-SL), 6'-시아릴락토스 (6'-SL), 락토-N-네오테트라오스 (LNnT), 락토-N-테트라오스 (LNT), 시아릴락토-N-테트라오스 a (LST a), 시아릴락토-N-네오테트라오스 c (LST c), 락토-디퓨코테트라오스 (LDFT) 및 락토-N-퓨코펜타오스 I (LNFP I)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, HMO를 생산하는 방법으로서, 적어도 하나의 탄소 공급원을 갖는 배양 배지를 제공하는 단계; HMO를 생산하여 외수송할 수 있는 미생물을 제공하고, 미생물은 HMO의 생산을 위한 이종유래 운반체 및 하나 이상의 이종유래 유전자를 발현하는, 단계; 및 미생물을 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 HMO의 실질적인 분량이 배지 내로 외수송되는, 방법이 제공된다.
상기에 기술된 바와 같이, 특정 구현예는 본원에 기술된 임의의 방법에 적용가능하다. 예를 들면, 일정 구현예에서, 상기 방법은 미생물로부터 배양 배지를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 상기 방법은 배양 배지로부터 HMO를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 이종유래 운반체는 CDT-1, CDT-2 또는 이들의 변이체이다. 일정 구현예에서, HMP는 2'-FL이다. 일정 구현예에서, 운반체는 서열번호 4의 아미노산 위치 91번, 209번, 213번, 256번, 262번, 335번 및 411번에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDT-1 변이체이다. 일정 구현예에서, CDT-1은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩된다. 일정 구현예에서, 핵산의 적어도 초기 90개 뉴클레오티드는 효모에 대해 코돈 최적화되거나, 핵산의 적어도 5%는 효모에 대해 코돈 최적화된다. 일정 구현예에서, 운반체는 91A, 209S, 213A, 256V, 262Y, 262W, 335A, 411A 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함한다. 일정 구현예에서, 이종유래 유전자는 GDP-만노스 4,6-탈수화효소, GDP-L-퓨코스 합성효소 및 알파-1,2-퓨코실 전이효소로부터 선택된다. 일정 구현예에서, HMO의 외수송은 이종유래 운반체를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 증가된다. 일정 구현예에서, 이종유래 운반체는 락토스를 내수송하고, HMO를 외수송할 수 있다. 일정 구현예에서, 배양 배지는 락토스를 포함한다. 일정 구현예에서, 미생물에 의해 생산된 총 HMO 대비 배양 배지에서의 HMO의 비율은 적어도 약 1 : 1, 1.5 : 1, 2 : 1, 2.5 : 1, 3 : 1, 3.5 : 1, 4 : 1 또는 4 : 1 초과이다. 일정 구현예에서, HMO는 2'-퓨코실락토스 (2'-FL), 3'-퓨코실락토스 (3'-FL), 3'-시아릴락토스 (3'-SL), 6'-시아릴락토스 (6'-SL), 락토-N-네오테트라오스 (LNnT), 락토-N-테트라오스 (LNT), 시아릴락토-N-테트라오스 a (LST a), 시아릴락토-N-네오테트라오스 c (LST c), 락토-디퓨코테트라오스 (LDFT) 및 락토-N-퓨코펜타오스 I (LNFP I)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 미생물은 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 따른 미생물이다.
또 다른 양태에서, 동물 소비에 적합한 산물은 본원에 기술된 미생물에 의해 또는 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 HMO 및 동물 소비에 허용가능한 적어도 하나의 추가적인 성분을 포함한다.
또 다른 양태에서, 동물 소비에 적합한 산물은 본원에 기술된 미생물 및 선택적으로 동물 소비에 허용가능한 적어도 하나의 추가적인 성분을 포함한다.
상기에 기술된 바와 같이, 특정 구현예는 본원에 기술된 임의의 산물에 적용가능하다. 예를 들면, 일정 구현예에서, 상기 산물은 인간 소비에 적합하다. 일정 구현예에서, 상기 산물은 아동 처방, 아동 식품, 영양 보충제 또는 프리바이오틱 산물이다. 일정 구현예에서, 상기 산물은 포유동물 소비에 적합하다. 일정 구현예에서, 상기 산물은 적어도 하나의 추가적인 인간 우유 올리고당을 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 상기 추가적인 성분은 단백질, 지질, 비타민, 미네랄 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 상기 산물은 동물 사료로서의 용도에 적합하다.
또 다른 양태에서, 동물 소비에 적합한 산물은 본원에 기술된 미생물, 본원에 기술된 미생물에 의해 또는 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 HMO 및 적어도 하나의 추가적인 소비가능한 성분을 포함한다.
상기에 기술된 바와 같이, 특정 구현예는 본원에 기술된 임의의 산물에 적용가능하다. 예를 들면, 일정 구현예에서, 상기 산물은 인간 소비에 적합하다. 일정 구현예에서, 상기 산물은 아동 처방, 아동 식품, 영양 보충제 또는 프리바이오틱 산물이다. 일정 구현예에서, 상기 산물은 포유동물 소비에 적합하다. 일정 구현예에서, 상기 산물은 적어도 하나의 추가적인 인간 우유 올리고당을 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 상기 추가적인 소비가능한 성분은 단백질, 지질, 비타민, 미네랄 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 상기 산물은 동물 사료로서의 용도에 적합하다.
정의
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구항에 채용된 특정 용어는 여기에 수집된다.
본원에 사용된 바, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 달리 문맥상 명백하게 표시되지 않는 한, 복수 형태도 마찬가지로 포함하려고 의도된다.
용어 "약"은 당업자에 의해 결정된 바 구체적인 값에 허용가능한 오차 범위 이내를 의미하고, 이는 부분적으로 값이 측정되거나 결정되는 방식, 즉 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 용어 "약" 또는 "대략"이 성분의 양을 포함하는 조성물 및 온도와 같은 조건의 맥락에서 사용되는 곳에서, 이들 값은 해당 값 주변의 0% 내지 10%의 변화 (X ± 10%)를 갖는 진술된 값을 포함한다.
용어 "포함하는 (including)", "포함하다", "갖는", "갖는", "와 함께" 또는 이들의 변형은 용어 "포함하는 (comprising)"과 유사한 방식으로 함축적이다. 용어 "구성하는" 및 구성하다의 문법적 변화는 단지 열거된 요소만을 갖는 구현예를 포괄하고, 임의의 다른 요소를 배제한다. 어구 "필수적으로 구성하는" 또는 "필수적으로 구성하다"는 특정된 재료 또는 단계를 포함하는 구현예 및 구현예의 기본적 및 새로운 특징(들)에 물질적으로 영향을 주지 않는 재료 및 단계를 포함하는 것을 포괄한다.
범위는 길게 제시되고, 범위 내의 각각 및 모든 값을 기술해야 하는 것을 피하도록 간단하게 진술된다. 따라서, 범위가 값에 대해 진술될 때, 범위 내의 임의의 적절한 값이 선택될 수 있고, 이들 값은 범위의 상부 값 및 하부 값을 포함한다. 예를 들면, 2 내지 30의 범위는 2 및 30의 최종 값, 뿐만 아니라 2 내지 30의 중간 값 및 2 내지 30 이내에 포괄된 모든 중간 범위 예컨대 2 내지 5, 2 내지 8, 2 내지 10 등을 예시한다.
용어 "유전적 변형"은 본원에 사용된 바, 미생물에서 게놈 DNA를 변경하는 것을 말한다. 전형적으로, 유전적 변형은 변경된 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 및/또는 활성을 변경시킨다. 유전적 변형은 하기에 추가로 상술되는 바와 같이, 기준 유전자 또는 단백질로부터 파생되는 유전자 또는 단백질 서열인 "변이체"를 포괄한다.
용어 "올리고당"은 다양한 길이의 사카라이드 다량체를 말하고, 슈크로스 (1개 포도당 단량체 및 1개 과당 단량체), 락토스 (1개 포도당 단량체 및 1개 갈락토스 단량체), 말토스 (1개 포도당 단량체 및 1개 포도당 단량체), 이소말토스 (2개 포도당 단량체), 이소말툴로스 (1개 포도당 단량체 및 1개 과당 단량체), 트레할로스 (2개 포도당 단량체), 트레할룰로스 (1개 포도당 단량체 및 1개 과당 단량체), 셀로바이오스 (2개 포도당 단량체), 셀로트리오스 (3개 포도당 단량체), 셀로테트라오스 (4개 포도당 단량체), 셀로펜타오스 (5개 포도당 단량체), 셀로헥사오스 (6개 포도당 단량체), 2'-퓨코실락토스 (2'-FL, 1개 퓨코스 단량체, 1개 포도당 단량체 및 1개 갈락토스 단량체), 3'-퓨코실락토스 (3'-FL, 1개 퓨코스 단량체, 1개 포도당 단량체 및 1개 갈락토스 단량체), 6'-퓨코실락토스 (6'-FL, 1개 퓨코스 단량체, 1개 포도당 단량체 및 1개 갈락토스 단량체), 3'-시아릴락토스 (3'-SL, 1개 N-아세틸뉴라민산 단량체, 1개 포도당 단량체 및 1개 갈락토스 단량체), 6'-시아릴락토스 (6'-SL, 1개 N-아세틸뉴라민산 단량체, 1개 포도당 단량체 및 1개 갈락토스 단량체), 디퓨코실락토스 (DF-L, 2개 퓨코스 단량체, 1개 포도당 단량체 및 1개 갈락토스 단량체), 락토-N-트리오스 (LNT Ⅱ, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 1개 갈락토스 단량체), 락토-N-네오테트라오스 (LNnT, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 2개 갈락토스 단량체), 락토-N-테트라오스 (LNT, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 2개 갈락토스 단량체), 락토-N-퓨코펜타오스 I (LNFP I, 1개 퓨코스 단량체, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 2개 갈락토스 단량체), 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅱ (LNFP Ⅱ, 1개 퓨코스 단량체, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 2개 갈락토스 단량체), 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅲ (LNFP Ⅲ, 1개 퓨코스 단량체, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 2개 갈락토스 단량체), 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅳ (LNFP Ⅳ, 1개 퓨코스 단량체, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 2개 갈락토스 단량체), 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅴ (LNFP Ⅴ, 1개 퓨코스 단량체, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 2개 갈락토스 단량체), 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅵ (LNFP Ⅵ, 1개 퓨코스 단량체, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 2개 갈락토스 단량체), 락토-N-헥사오스 (LNH, 2개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 3개 갈락토스 단량체), 락토-N-네오헥사오스 (LNnH, 2개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 3개 갈락토스 단량체), 모노퓨코실락토-N-헥사오스 I (MFLNH I, 1개 퓨코스 단량체, 2개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 3개 갈락토스 단량체), 모노퓨코실락토-N-헥사오스 Ⅱ (MFLNH Ⅱ, 1개 퓨코스 단량체, 2개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 3개 갈락토스 단량체), 디퓨코실락토-N-헥사오스 I (LNDFH I, 2개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체, 2개 퓨코스 단량체 및 3개 갈락토스 단량체), 디퓨코실락토-N-헥사오스 Ⅱ (LNDFH Ⅱ, 2개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체, 2개 퓨코스 단량체 및 3개 갈락토스 단량체), 디퓨코실락토-N-네오헥사오스 (LNnDFH, 2개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체, 2개 퓨코스 단량체 및 3개 갈락토스 단량체), 디퓨코실-파라-락토-N-헥사오스 (DFpLNH, 2개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체, 2개 퓨코스 단량체 및 3개 갈락토스 단량체), 디퓨코실-파라-락토-N-네오헥사오스 (DFpLNnH, 2개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체, 2개 퓨코스 단량체 및 3개 갈락토스 단량체), 트리퓨코실락토-N-헥사오스 (TFLNH, 2개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체, 3개 퓨코스 단량체 및 3개 갈락토스 단량체), 시아릴락토-N-네오테트라오스 c (LSTc, 1개 아세틸뉴라민산 단량체, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 2개 갈락토스 단량체), 시아릴락토-N-테트라오스 a (LSTa, 1개 아세틸뉴라민산 단량체, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 2개 갈락토스 단량체), 시아릴락토-N-테트라오스 b (LSTb, 1개 아세틸뉴라민산 단량체, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 2개 갈락토스 단량체), 디시아릴락토-N-테트라오스 (DSLNT, 2개 아세틸뉴라민산 단량체, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 2개 갈락토스 단량체), 퓨코실시아릴락토-N-테트라오스 (FLSTb, 1개 퓨코스 단량체, 2개 아세틸뉴라민산 단량체, 1개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 2개 갈락토스 단량체), 퓨코실시아릴락토-N-헥사오스 (FSLNH, 1개 퓨코스 단량체, 1개 아세틸뉴라민산 단량체, 2개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 3개 갈락토스 단량체), 퓨코실시아릴락토-N-네오테트라오스 I (FSLNnH I, 1개 퓨코스 단량체, 1개 아세틸뉴라민산 단량체, 2개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 3개 갈락토스 단량체) 및 퓨코실디시아릴락토-N-테트라오스 Ⅱ (FDSLNH Ⅱ, 1개 퓨코스 단량체, 2개 아세틸뉴라민산 단량체, 2개 N-아세틸글루코사민 단량체, 1개 포도당 단량체 및 3개 갈락토스 단량체)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "인간 우유 올리고당", "HMO" 및 "인간 우유 글리칸"은 인간 유방 젖에서 높은 농도로 발견되는 올리고당류 군을 말한다. 모든 여성 중 80%에서 지배적인 올리고당은 2'-퓨코실락토스이다. 다른 HMO는 3'-퓨코실락토스, 6'-퓨코실락토스, 3'-시아릴락토스, 6'-시아릴락토스, 디퓨코실락토스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-테트라오스, 락토-N-퓨코펜타오스 I, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅱ, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅲ, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅳ, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅴ, 락토-N-퓨코펜타오스 Ⅵ, 락토-N-헥사오스, 락토-N-네오헥사오스, 모노퓨코실락토-N-헥사오스 Ⅰ, 모노퓨코실락토-N-헥사오스 Ⅱ, 디퓨코실락토-N-헥사오스 Ⅰ, 디퓨코실락토-N-헥사오스 Ⅱ, 디퓨코실락토-N-네오헥사오스, 디퓨코실-파라-락토-N-네오헥사오스, 디퓨코실-파라-락토-N-헥사오스, 트리퓨코실락토-N-헥사오스, 시아릴락토-N-네오테트라오스 a, 시아릴락토-N-테트라오스 b, 시아릴락토-N-테트라오스 c, 디시아릴락토-N-테트라오스, 퓨코실시아릴락토-N-테트라오스 a, 퓨코실시아릴락토-N-테트라오스 b, 퓨코실시아릴락토-N-헥사오스, 퓨코실시아릴락토-N-네오헥사오스 I 및 퓨코실디시아릴락토-N-헥사오스 Ⅱ를 포함한다.
용어 "중합화도" 또는 DP는 거대분자 또는 중합체 또는 올리고체 분자의 단량체성 단위의 수이다.
용어 "미생물"은 변형이 있거나 없이 올리고당류 생산 또는 이용을 할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물을 말한다.
용어 "이용 증진"은 부모 미생물과 비교하여 미생물에 의한 올리고당 생산의 개선, 구체적으로 올리고당류 생산율의 증가, 올리고당류 생산을 시작하기 이전의 초기 시간의 감소, 출발 물질이 소비되게 하는 산물의 비율로서 정의되는 수율의 증가, 및/또는 미생물이 주어진 양의 올리고당을 생산하는데 걸리는 전반적 시간을 말한다.
용어 "부모 미생물"은 유전적으로 변형된 미생물을 생산하도록 다루어진 미생물을 말한다. 예를 들면, 유전자가 하나 이상의 유전적 변형에 의해 미생물 내에서 돌연변이되는 경우, 변형되어 있는 미생물은 하나 이상의 유전적 변형을 보유하는 미생물의 부모 미생물이다.
용어 "소비율"은 주어진 기간에 주어진 배양 부피에서 주어진 세포 밀도를 갖는 미생물에 의해 소비되는 올리고당류의 양을 말한다.
용어 "생산율"은 주어진 기간에 주어진 배양 부피에서 주어진 세포 밀도를 갖는 미생물에 의해 생산되는 원하는 화합물의 양을 말한다.
용어 "유전자"는 유전자의 코딩 영역, 뿐만 아니라 상류 및 하류의 조절 영역을 포함한다. 상류 조절 영역은 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 서열을 포함한다. 하류 조절 영역은 종결인자 부위를 포함하는 서열을 포함한다. 다른 서열이 상류 및 하류 조절 영역에 존재할 수 있다. 본원에서 유전자는 유전자의 명칭의 소문자 및 이탤릭체 형식으로 예시되는 반면, 단백질은 단백질의 명칭의 대소문자 및 비-이탤릭체 형식으로 예시된다. 예를 들면, cdt-1 (이탤릭체)는 CDT-1 단백질을 인코딩하는 유전자를 예시하고, CDT-1 (비-이탤릭체 및 대소문자)는 CDT-1 단백질을 에시한다.
기준 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성은 바람직하게 BLAST 알고리즘을 사용하여 2가지 서열 간에 만들어진 비교를 말한다. 또한, 단백질 구조 정보, 예컨대 서열 트래딩 또는 3D-1D 프로파일을 사용하는 2가지 단백질 서열 간의 비교를 위한 알고리즘도 이 분야에서 공지되어 있다.
"변이체"는 기준 유전자 또는 단백질로부터 파생되는 유전자 또는 단백질 서열이다. 또한, 용어 "이소 형태", "이소형" 및 "유사체"는 유전자 또는 단백질의 "변이체" 형태를 말한다. 변이체는 "보존적인" 변화를 갖을 수 있고, 여기서 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 성질, 예로 류신의 이소류신으로 치환을 갖는다. 변이체는 "비-보존적인" 변화, 예로 글리신의 트립토판으로 치환을 갖는다. 또한, 유사한 소수의 변이는 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 치환되거나, 삽입되거나, 결실될 수 있으며, "보존적인" 또는 "비-보존적인" 적합한 아미노산 잔기는 당해 기술분야에 널리 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하는 것을 포함하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
"외인성 핵산"은 세포 내로 인위적으로 도입되었던 핵산, DNA 또는 RNA를 말한다. 이러한 외인성 핵산은 핵산이 도입된 세포에서 자연적으로 발견되는 서열 또는 이의 단편의 사본일 수 있거나, 아닐 수 있다.
"내인성 핵산"은 자연적으로 미생물에 존재하는 핵산, 유전자, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, mRNA 또는 cDNA 분자를 말한다. 내인성 서열은 미생물에게 "고유한", 즉 상재하는 것이다.
용어 "돌연변이"는 개방 해독틀, 상류 조절 영역 및/또는 하류 조절 영역에 대한 변형을 포함하여 유전자에 대한 유전적 변형을 말한다.
핵산 서열에 대한 이종유래 숙주 세포는 자연적으로 해당 핵산 서열을 포함하지 않는 세포를 말한다.
"키메라 핵산"은 제 2 뉴클레오티드 서열에 연결된 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 제 2 뉴클레오티드 서열은 제 1 뉴클레오티드 서열이 자연적으로 발생하는 세포에서 제 1 뉴클레오티드 서열과 관련되는 서열과 상이하다.
구성적 (constitutive) 프로모터는 RNA 중합효소의 완전효소가 이용가능할 때 작동가능하게 연결된 유전자를 발현한다. 구성적 프로모터의 조절 하에 유전자의 발현은 유도인자 (inducer)의 존재에 의존하지 않는다.
유도성 (inducible) 프로모터는 유도인자의 단지 존재 하에 작동가능하게 연결된 유전자를 발현한다. 유도인자는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도하는 전사 기구를 활성화한다.
인간 우유 올리고당류를 외수송하기 위한 미생물, 시스템 및 방법
1. 운반체
본원에서는 인간 우유 올리고당류 (HMO)과 같은 올리고당류를 외수송하기 위한 미생물, 시스템 및 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 본 발명은 올리고당류를 외수송할 수 있는 유전적으로 조작된 미생물을 제공한다. 예를 들면, 본원에 기술된 미생물은 2'-퓨코실락토스 (2'-FL)과 같은 HMO를 예로 미생물이 상재하는 성장 배지 내로 외수송할 수 있다.
일정 구현예에서, 미생물은 올리고당류를 미생물로부터 외수송할 수 있는 운반체를 발현하도록 유전적으로 조작된다. 예시적인 운반체는 CDT-1, CDT-2 또는 상동체 및 이들의 변이체인 셀로덱스트린 운반체를 포함한다.
셀룰로스 분해성 진균 뉴로스포라 크라사 (진뱅크 수탁번호: EAA34565.1)로부터 나온 운반체 CDT-1은 헥소스 및 관련 탄수화물을 포함하는 분자를 운반할 수 있는 운반체의 주요 촉진인자 슈퍼패밀리 (MFS) 부류에 속한다. 이러한 부류의 운반체는 패밀리 PF00083 하에 PFAM으로 정의된다 (월드와이드 웹 pfam.xfam.org/family/PF00083 참조).
CDT-1은 셀로바이오스, 셀로트리오스 및 셀로테트라오스를 포함하는 셀로덱스트린, 뿐만 아니라 락토스를 사카로마이세스 세레비시애로 내수송할 수 있다. 그러나, 본원에서의 발명의 이전에 이것은 미생물에서 조작된 산물의 외수송체로서 관찰되거나 사용되지 않았다. 놀랍게도, 클루이베로마이세스 락티스로부터 나온 또 다른 운반체 LAC12는 락토스를 내수송할 수 있지만 (CDT-1과 유사함), 본원에 설명되는 바와 같이 LAC12가 2'-FL의 외수송체로서 기능하지 않는다.
CDT-1의 예는 서열번호 4의 서열에 의해 제공되며, 이는 뉴로스포라 크라사로부터 나온 CDT-1이다 (유니프로트 엔트리 Q7SCU1). N. 크라사가 아닌 미생물, 구체적으로 진균으로부터 나온 CDT-1 상동체는 본원에 기술된 미생물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에서 CDT-1 상동체의 비-제한적인 예는 다음의 유니프로트 엔트리에 의해 예시된다: A0A0B0E0J3, F8MZD6, G4U961, F7VQY4, Q7SCU1, A0A0J0XVF7, A0A0G2FA71, Q0CVN2, G4T6X5, A0A1Q5T2Z1, A0A0F7VA10, A0A1S9RFP6, A0A0U1LZX5, A0A0C2J3L3, U7PNA2, A0A0F2M9E7, A0A2I1D8G2, A0A2J5HR99, A0A2I2EZ95, A0A0C2IUQ7, U7PNU1, A0A1L7XY52, A0A2J6PQH9, A0A165JU51, A0A167P382, A0A1W2TJP3, A0A175VST0, A1CN94, S3DBB4, L7IWM4, G4NAG6, L7HX81, G4NAG7, A0A1Y2BF25, G0SC27, A0A0F7SHM7, A0A2P5HRQ8, A0A194VWR4, A0A194UTG8, B8M4C1, A0A2J6RYZ2, S8AIR7, R9UR53, Q4WR71, B0XPA9, A0A0J5PH40, A0A0K8LME8, A0A1Y2V0X9, A0A0F8VMB5, A1D134, A0A0S7E4Y9, A0A2T3AJM0, Q5B9G6, A0A2I1C7L5, A0A167H9D2, A0A2J6SE99, J3PJL4, A0A0C4EGH0, A0A135LD10, A0A0A2I302, A0A0G4NZP3, K9G9B1, K9G7S2, A0A161ZL14, A0A0A2KJ45, A0A136JJM0 및 A0A090D3T9.
셀로덱스트린 운반체의 또 다른 예는 뉴로스포라 크라사로부터 나온 CDT-2이다 (유니프로트 엔트리: A0A2P5IEX1). CDT-2는 서열번호 9의 서열로 제공된다.
셀로덱스트린 운반체의 다른 예는 셀로덱스트린 운반체 cdt-g (유니프로트 엔트리 R9USL5), 셀로덱스트린 운반체 cdt-d (유니프로트 엔트리 R9UTV3), 셀로덱스트린 운반체 cdt-c (유니프로트 엔트리 R9UR53), 셀로덱스트린 운반체 CdtG (유니프로트 엔트리 S8A015), 추정된 셀로덱스트린 운반체 CdtG (유니프로트 엔트리 A0A0U5GS76), 셀로덱스트린 운반체 CdtC (유니프로트 엔트리 S8AIR7), 셀로덱스트린 운반체 CdtD (유니프로트 엔트리 S8AVE0) 및 추정된 셀로덱스트린 운반체 cdt-c (유니프로트 엔트리 A0A0F7VA10)이다.
본원에 열거된 유니프로트 엔트리는 이들 전체가 참고문헌으로 통합된다. CDT-1의 추가적인 상동체는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 이러한 구현예는 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들면, CDT-1의 상동체는 서열번호 1과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
CDT-1은 MFS 패밀리로부터 나온 기질-양성자 공동수송체 (symporter)이다. 이것은 성장 배지로부터 세포 내로 락토스 또는 셀로바이오스와 같은 베타-1,4 결합된 이당류의 내수송을 용이하게 한다. 본원에 설명된 발견 이전에, CDT-1은 세로바이오스 (예컨대 생체연료 산업에 사용됨)와 같은 기질의 내수송체로서 특성화되어 왔다. 예를 들면, 라이언 등 (Ryan et al, 2014)은 CDT-1 N209S 및 CDT-1 F262Y와 같은 CDT-1의 변이체가 올리고당 셀로바이오스를 내수송하는 능력을 개선하는 것을 확인하였다. 둘 다의 돌연변이 CDT-1-N209S/F262Y (간단하게 CDT-1SY)를 갖는 변이체는 셀로바이오스의 추가로 개선된 흡수를 나타내었다. 관련된 MFS 운반체 상에 돌연변이를 맵핑하여 야생형 CDT-1의 위치 N209이 통로 내부에서 올리고당 분자와 상호작용하는 것으로 예측됨을 보여주었다. 그러나, CDT-1 또는 임의의 변이체 모두가 외수송체인 것으로 관찰되지는 않았다. 대조적으로, 본원에서의 발견 이외에, CDT-1은 외수송체로서 유용성을 제공할 활성이 결여된 것으로서 특성화되었다 (예로, Hollands K. et al., Metab Eng. 2019년 3월; 52: 232-242 참조).
CDT-1 N209S/F262Y (또는 간단하게 CDT-1 SY): 서열번호 1
CDT-1 N209S (또는 간단하게 CDT-1s): 서열번호 2
CDT-1 F262Y (또는 간단하게 CDT-1y): 서열번호 3
막 단백질인 락토스 퍼미아제 (permease)는 주요 촉진인자 슈퍼패밀리의 구성원이다. 락토스 퍼미아제는 공동수송체로서 분류될 수 있고, 이는 세포로 향하는 양성자 구배를 사용하여 락토스와 같은 β-갈락토시드를 세포 내로 동일한 방향으로 운반한다. 일정 구현예에서, 락토스 내수송체는 LAC12이다. LAC12의 상동체는 본원에 기술된 미생물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에서 LAC12 상동체의 비-제한적인 예는 유니프로트 엔트리에 의해 예시된다: Q9FLB5, B9FJH4, P07921, A0A1J6J8V9, A0A251TUB0, A0A0A9W3I8, D0E8H2, W0THP1, A0A1S9RK01, A0A151V9Y9, A0A1C1CDD3, W0TAG2, A0A151W5N5, A0A151VVE7, A0A151WBL8, A0A151V6X4, A0A151W4U2, A0A1C7LPV6, W0T7D8, W0T8B1, A0A1C1CKJ6, A0A1C1CH50, A0A1C1D058, A0A1C1C6W6, A0A1C1CIT2, A0A1C1CFR6, A0A2N6NU09, A0A1C1C6I1, A0A1C7LTH2, A0A2N6N8U0, A0A2N6NP59, A0A0F8AZD4, Q8X109, A0A1J6IEJ6, A0A034W1B8, A0A1C7LRQ8, A0A1C1CWY2, A0A1C1CTI7, A0A1C1CQ74, A0A1C7M6U6, A0A1C7LT95, A0A2N6NIJ0, A0A2C5X4W3, A0A1C7M1E6, A0A2H8TQZ2, A0A2N6NWY5, A0A1T4IZL8, A0A1T4IZJ1, A0A1T4IZJ3, A0A1T4IZM1, A0A1T4IZL0, A0A1T4IZJ8, A0A0A9YFY8, W8BTJ3, A0A1C7LK22, A0A0C9QF59 및 A0A0A9WYQ6.
락토스 퍼미아제의 다른 예는 LacY 유전자 (유니프로트 엔트리 P02920, P22733, P47234, P18817, P59832), LacE (유니프로트 엔트리 P11162, P24400, P23531, Q4L869, Q5HE15, P50976, Q931G6, Q8CNF7, Q5HM40, Q99S77, Q7A092, Q6GEN9, Q6G7C4, A0A0H3BYW2), LacS 유전자 (유니프로트 엔트리 P23936, Q48624, Q7WTB2), LacP (유니프로트 엔트리 Q33814)에 의해 인코딩된다.
본원에 열거된 유니프로트 엔트리는 이들 전체가 참고문헌으로 통합된다.
락토스 퍼미아제는 미생물에서 발현되고, 락토스 흡수를 제공할 수 있다. 일정 양태에서, 락토스는 다음으로 미생물에 의해 HMO와 같은 기타 올리고당류의 생산을 위한 기질로서 사용될 수 있다. 그러나, CDT 운반체와는 달리, Lac12와 같은 락토스 퍼미아제는 미생물에서 발현될 때 HMO와 같은 올리고당류와 관련하여 외수송체로서 작용하지 않는다. 예를 들면, Lac12가 사카로마이세스 세레비시애와 같은 효모에서 발현될 때 Lac12는 2'-FL을 외수송하지 않는다.
본원에 설명된 바와 같이, 뉴로스포라 크라사 내에서 내수송체로서 작용하는 셀로바이오스 운반체는, 미생물에서 발현될 때 예컨대 HMO를 생산하는 사카로마이세스 세레비시애 균주에서 발현될 때 외수송체로서 작용할 수 있다. 일정 구현예에서, 이러한 운반체에 의해 외수송된 HMO는 갈락토스 고리에 대한 변형과 함께 락토스 코아를 포함하는 분지되지 않은 HMO이다. 일정 구현예에서, HMO는 2'-퓨코실락토스 (2'-FL), 3'-퓨코실락토스 (3'-FL), 3'-시아릴락토스 (3'-SL), 6'-시아릴락토스 (6'-SL), 락토-N-네오테트라오스 (LNnT), 락토-N-테트라오스 (LNT), 시아릴락토-N-테트라오스 a (LST a), 시아릴락토-N-네오테트라오스 c (LST c), 락토-디퓨코테트라오스 (LDFT) 또는 락토-N-퓨코펜타오스 I (LNFP I)이다. 일정 구현예에서, HMO는 2'-FL이다.
일정 구현예에서, HMO의 외수송을 위한 운반체는 CDT-1, CDT-2 또는 이들의 상동체이다. 일정 구현예에서, HMO의 외수송을 위한 운반체는 돌연변이체 CDT-1과 같은 변이체이고, 여기서 하나 이상의 아미노산은 CDT-1 아미노산 서열과 비교하여 변경된다. 일정 구현예에서, HMO를 외수송하는 돌연변이체 CDT-1은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99% 초과의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이체 CDT-1은 서열번호 1의 위치 91번, 209번, 213번, 256번, 262번, 335번 및 411번 중 하나 이상에 상응하는 아미노산 변화를 갖을 수 있다. 돌연변이체 CDT-1은 G91A, N209S, F213A, L256V, F262Y, F262W, F335A 및 S411A로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 1을 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 돌연변이체 CDT-1은 CDT-1 N209S F262Y (서열번호 1), CDT-1 G91A (서열번호 10), CDT-1 F213A (서열번호 11), CDT-1 L256V (서열번호 12), CDT-1 F335A (서열번호 13), CDT-1 S411A (서열번호 14), 또는 CDT-1 N209S F262W (서열번호 15)이다. CDT-1 또는 돌연변이체 CDT-1과 같은 CDT 운반체는 미생물에서 발현될 때, 2'-FL와 같은 HMO를 외수송한다. 예를 들면, cdt-1sy 유전자 (CDT-1 N209S/F262Y를 인코딩함)는 2'-FL을 생산하는 배경 균주 (미생물) 내에서 발현되었으며, 발효 실험 동안 성장 배지에서 2'-FL 축적이 cdt-1sy 유전자가 없는 동일한 균주와 비교되었다. 예기치 못하게도, CDT-1 N209S/F262Y의 발현은 성장 배지 내에서 2'-FL의 축적을 유의하게 증가시키고, CDT-1SY가 효율적인 기질 외수송체로서 작용할 수 있음을 나타낸다.
락토스 퍼미아제 돌연변이체 (CDT-1 G91A) [뉴로스포라 크라사] 서열번호 10
락토스 퍼미아제 돌연변이체 (CDT-1 F213A) [뉴로스포라 크라사] 서열번호 11
락토스 퍼미아제 돌연변이체 (CDT-1 L256V) [뉴로스포라 크라사] 서열번호 12
락토스 퍼미아제 돌연변이체 (CDT-1 F335A) [뉴로스포라 크라사] 서열번호 13
락토스 퍼미아제 돌연변이체 (CDT-1 S411A) [뉴로스포라 크라사] 서열번호 14
락토스 퍼미아제 돌연변이체 (CDT-1 N209S F262W) [뉴로스포라 크라사] 서열번호 15
락토스 퍼미아제 돌연변이체 (CDT-1 209S 262Y 초기 30개 아미노산이 효모에 대해 코돈 최적화됨) [뉴로스포라 크라사] 서열번호 16
일정 구현예에서, HMO 외수송체로서 사용되는 CDT-1의 변이체 및 관련 운반체는 당 기질 결합 포켓 근처에 (예로, CDT-1에서 N209S) 또는 당 포터 패밀리 PF00083에서 높게 보존된 PESPR 모티브 근처에 (예로, CDT-1에서 N209S) 존재하는 것으로 예측되는 아미노산의 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예시적인 돌연변이는 G336, Q337, N341 및 G471과 같은 기질 결합 포켓에 있는 것으로 예측되는 CDT-1에서의 아미노산을 포함한다.
일정 구현예에서, CDT-1 또는 CDT-1 돌연변이체와 같은 운반체를 발현하는 미생물의 변형은 운반체의 활성을 증가시키도록 조작될 수 있다. 부모 미생물에서 CDT-1 기질 내수송 활성과 비교하여 미생물에서 기질 외수송체로서 CDT-1의 활성을 증가시킬 수 있는 cdt-1에 대한 유전적 변형의 비-제한적인 예는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 내인성 cdt-1에 작동가능하게 연결된 외인성 프로모터로 내인성 프로모터의 교체; (b) 염색체외 유전물질을 통한 cdt-1의 발현; (c) 하나 이상의 cdt-1 사본의 미생물 게놈 내로의 혼입; (d) 기질 외수송체로서 활성을 증가시킨 운반체 단백질을 인코딩하는, 변형된 CDT-1을 생산하는 내인성 cdt-1에 대한 변형; (e) 미생물 내에 cdt-1 또는 cdt-1 변이체 (돌연변이체 cdt-1)을 포함하는, 예컨대 CDT-1 N209S F262Y 또는 본원에 기술된 하나 이상의 변이체 (예로, CDT-1 G91A, CDT-1 F213A, CDT-1 L256V, CDT-1 F335A, CDT-1 S411A 또는 CDT-1 N209S F262W)를 인코딩하는 염색체외 유전물질 상의 도입; f) 미생물 게놈 내에 CDT-1 N209S F262Y, CDT-1 G91A, CDT-1 F213A, CDT-1 L256V, CDT-1 F335A, CDT-1 S411A 또는 CDT-1 N209S F262W와 같은 운반체를 인코딩하는 cdt-1 또는 cdt-1 변이체의 하나 이상의 사본의 혼입; (g) 당 기질 결합 포켓 및/또는 PESPR 모티브 근처에 있는 것으로 예측되는, 위치 G336, Q337, N341 및 G471와 같은 아미노산의 하나 이상의 돌연변이를 갖는 CDT-1을 인코딩하는 염색체외 유전물질을 통해 또는 cdt-1 변이체의 혼입을 통한 도입; 및/또는 (h) cdt-1 또는 cdt-1 변이체의 일부 또는 전부의 코돈 최적화.
본 단락에서 설명된 변형 (a) 내지 (h)의 임의의 조합도 또한 고려된다. 일정 구현예에서, cdt-1 또는 이의 변이체의 발현은 상이한 프로모터 또는 도입된 cdt-1 유전자에 바로 인접한 변화를 이용함으로써 달라질 수 있다. 예를 들면, 특정 구현예에서 도입된 cdt-1sy 발현 카세트에 인접한 URA3 카세트의 결실은 2'-FL 외수송과 같은 HMO 외수송의 추가 개선을 유도한다.
일정 구현예에서, 내인성 프로모터는 cdt-1의 발현을 내인성 프로모터보다 더 높은 수준으로 유도하는 외인성 프로모터로 교체된다. 특정 구현예에서, 외인성 프로모터는 내인성 프로모터를 외인성 프로모터로 교체시킨 미생물에 특이적이다. 예를 들면, 효모 특이적 외인성 프로모터는 변형되고 있는 미생물이 효모인 경우 사용될 수 있다. 외인성 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다.
구성적 효모 특이적 프로모터의 비-제한적인 예는 pCYC1, pADH1, pSTE5, pADH1, pCYC1OO 최소, pCYC70 최소, pCYC43 최소, pCYC28 최소, pCYC16, pPGK1, pCYC, pGPD 또는 pTDH3를 포함한다. 효모로부터 나온 구성적 프로모터의 추가적인 예 및 효모가 아닌 미생물로부터 나온 구성적 프로모터의 예는 당업자에게 공지되어 있고, 이러한 구현예는 본 발명의 범위에 속한다.
유도성 효모 특이적 프로모터의 비-제한적인 예는 pGAL1, pMFA1, pMFA2, pSTE3, pURA3, pFIG1, pEN02, pDLD, pJEN1, pmCYC 및 pSTE2를 포함한다. 효모로부터 나온 유도성 프로모터의 추가적인 예 및 효모가 아닌 미생물로부터 나온 유도성 프로모터의 예는 당업자에게 공지되어 있고, 이러한 구현예는 본 발명의 범위에 속한다.
특정 구현예에서, 미생물은 세포로부터 2'-FL을 외수송하는 능력이 증가된 운반체를 인코딩하는 변형된 cdt-1을 생산하는 야생형 cdt-1에 대한 변형을 포함한다.
따라서, 특정 구현예에서, 야생형 cdt-1에 대한 변형은 미생물은 2'-FL의 외수송율이 증가된 CDT-1을 인코딩하는 변형된 cdt-1을 생산한다. 특정 구현예에서, 야생형 cdt-1은 헥소스 운반체에서 보존되는 보존된 PEPSR 모티브 주변에서 돌연변이된다. 특정 구현예에서, cdt-1는 변형되어 단백질 CDT-1 F262Y의 생산을 유도한다. 돌연변이체 CDT-1은 서열번호 1의 위치 91번, 209번, 213번, 256번, 262번, 335번 및 411번 중 하나 이상에 상응하는 하나 이상의 아미노산 변화를 갖을 수 있다. 돌연변이체 CDT-1은 CDT-1 N209S F262Y, CDT-1 G91A, CDT-1 F213A, CDT-1 L256V, CDT-1 F335A, CDT-1 S411A 또는 CDT-1 N209S F262W로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 1을 포함할 수 있다. 돌연변이체 CDT-1은 당 기질 결합 포켓 및/또는 PESPR 모티브 근처에 있는 것으로 예측되는, 위치 G336, Q337, N341 및 G471와 같은 하나 이상의 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 변화를 갖을 수 있다.
특정 구현예에서, 야생형 cdt-1은 올리고당 기질과 상호작용하고 있는 CDT-1내의 아미노산 잔기 주변에서 돌연변이된다. 특정 구현예에서, cdt-1는 변형되어 단백질 CDT-1 N209S의 생산을 유도한다. 또 다른 구현예에서, cdt-1는 변형되어 단백질 CDT-1 N209S F262Y의 생산을 유도한다. 일부 특정 구현예에서, cdt-1는 변형되어 단백질 CDT-1 G91A의 생산을 유도한다. 일부 특정 구현예에서, cdt-1는 변형되어 단백질 CDT-1 F213A의 생산을 유도한다. 일부 특정 구현예에서, cdt-1는 변형되어 단백질 CDT-1 L256V의 생산을 유도한다. 일부 특정 구현예에서, cdt-1는 변형되어 단백질 CDT-1 F335A의 생산을 유도한다. 일부 특정 구현예에서, cdt-1는 변형되어 단백질 CDT-1 S411A의 생산을 유도한다. 일부 특정 구현예에서, cdt-1는 변형되어 단백질 CDT-1 N209S F262W의 생산을 유도한다.
상세한 구현예에서, 미생물, 바람직하게 효모와 같은 진균, 더욱 바람직하게는 사카로마이세스 종, 훨씬 더 바람직하게는 S. 세레비시애가 제공되고, 미생물은 하기에 열거된 유전적 변형 또는 유전적 변형의 조합을 포함한다:
(1) 세포에게 올리고당-, 구체적으로 HMO-외수송 활성, 예컨대 2'-FL-외수송 활성을 부여하는 CDT-1을 생산하는 유전적 변형,
(2) 올리고당류에 대한 CDT-1의 외수송 활성, 예컨대 HMO 외수송 활성, 구체적으로 2'-FL 외수송 활성을 증가시키는 돌연변이된 아미노산 잔기를 갖는 CDT-1을 생산하는 유전적 변형.
Ⅱ. 미생물에서 HMO 생산
HMO는 일반적으로 다함께 연결된 단량체로 구성되고, 전형적으로 한 말단에 락토스 분자를 갖는다. 일반적으로, 미생물에서 HMO의 생산은 출발 단량체의 존재 및 미생물 내로 도입되는 하나 이상의 이종유래 효소를 요구한다. 단량체는 단당류일 수 있다. 단량체는 포도당, 갈락토스, N-아세틸글루코사민, 퓨코스 및/또는 N-아세틸뉴라민산일 수 있다. 예를 들면, 퓨코실화된 HMO의 생산의 경우, 생산은 (i) GDP-퓨코스의 생합성 및 (ii) 수여체 올리고당 상에 GDP-퓨코스의 퓨코실 도메인의 전이를 포함할 수 있다. 2'-퓨코실락토스 (2'-FL) 또는 3'-퓨코실락토스 (3'-FL)와 같은 퓨코실화된 올리고당의 생산의 경우, 수여체 올리고당은 이당류 락토스이다.
GDP-퓨코스는 GDP-만노스로부터 2개의 연속 반응에 의해 합성된다: 첫째, GDP-만노스는 GDP-만노스 탈수화효소 (GMD)에 의해 탈수화되어 GDP-4-데하이드로-6-데옥시-D-만노스를 생산한다. 둘째, GDP-4-데하이드로-6-데옥시-D-만노스는 GDP 퓨코스 합성효소 (GFS)에 의해 GDP-L-퓨코스로 추가로 환원된다. 일정 구현예에서, GDP-퓨코스는 다음으로 퓨코실 전이효소 (FT)에 의해 이당류 락토스로 전이되어, 퓨코실화된 올리고당을 형성할 수 있다. 일정 구현예에서, FT는 알파-1,2-퓨코실 전이효소이다. 일정 구현예에서, 퓨코실화된 올리고당은 2'-FL 또는 3'-FL이다.
올리고당류의 이용 증가를 나타내는 미생물이 제공된다. 일정 구현예에서, 미생물은 하나 이상의 이종유래 HMO 생산 유전자 또는 하나 이상의 HMO 생산 단백질의 발현을 증진시키는 구조물을 추가로 포함한다. 본원에 설명된 바와 같이, "HMO 생산 유전자"는 "HMO 생산 단백질"을 발현한다. 본원에 설명된 바와 같이, "HMO 생산 단백질"은 HMO 생산을 위한 경로에 참여하는 효소이다. HMO 생산을 위한 경로에 참여하는 예시적인 효소는, 예컨대 퓨코실화된 HMO의 경우 퓨코스 및 ATP를 퓨코스-1-포스페이트로 전환할 수 있는 효소, 퓨코스-1-포스페이트 및 GTP를 GDP-퓨코스로 전환할 수 있는 효소 및/또는 글루코실 전이효소이다. HMO 생산 단백질의 예는 GDP-만노스 탈수화효소 (GMD), GDP-L-퓨코스 합성효소 (GFS) 및 퓨코실 전이효소 (FT)이다.
특정 구현예에서, 미생물은 (i) GDP-만노스 탈수화효소 (GMD)의 활성을 증가시키고/거나, (ii) GDP-L-퓨코스 합성효소 (GFS)의 활성을 증가시키고/거나, (iii) 퓨코실 전이효소 (FT), 예로 알파-1,2-퓨코실 전이효소와 같은 글리코실 전이효소의 활성을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, (i), (ii) 및 (iii)을 생성하는 이들 유전적 변형은 GDP-만노스 탈수화효소 유전자 (GMD), GDP-L-퓨코스 합성효소 유전자 (GFS) 및 퓨코실 전이효소 (FT), 예로 알파-1,2-퓨코실 전이효소와 같은 글리코실 전이효소 유전자의 도입에 의해 생산된다. 일정 구현예에서, 미생물은 이종유래 GDP-만노스 탈수화효소 유전자 또는 GDP-만노스 탈수화효소의 발현을 증진시키는 구조물을 포함한다. 일정 구현예에서, 미생물은 이종유래 GDP-L-퓨코스 합성효소 유전자 또는 GDP-L-퓨코스 합성효소의 발현을 증진시키는 구조물을 포함한다. 일정 구현예에서, 미생물은 이종유래 퓨코실 전이효소 (FT), 예로 알파-1,2-퓨코실 전이효소와 같은 글리코실 전이효소 유전자 또는 퓨코실 전이효소 (FT), 예로 알파-1,2-퓨코실 전이효소와 같은 글리코실 전이효소의 발현을 증진시키는 구조물을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 유전적 변형을 포함하는 미생물을 제공한다:
(i) GDP-만노스 탈수화효소 유전자 (GMD) 또는 이의 유사체를 도입하는 유전적 변형,
(ii) GDP-L-퓨코스 합성효소 유전자 (GFS) 또는 이의 유사체를 도입하는 유전적 변형, 및
(iii) 퓨코실 전이효소 (FT), 예로 알파-1,2-퓨코실 전이효소와 같은 글리코실 전이효소 유전자 또는 이의 유사체를 도입하는 유전적 변형.
2'-FL과 같은 HMO는 미생물에서 생산될 수 있다. 일정 구현예에서, 미생물은 HMO 생산에서의 하나 이상의 단계를 위한 효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 혼입함으로써 유전적으로 조작될 수 있다. 일정 구현예에서, HMO 경로는 이러한 유전적 조작에 의해 전적으로 공급된다. 일정 구현예에서, HMO 경로는 숙주 미생물로부터 나온 하나 이상의 내인성 활성을 포함하고, 나머지는 유전적 조작을 통한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 미생물은 내인성 활성을 사용하여 HMO를 합성한다.
일정 구현예에서, HMO는 2'-퓨코실락토스 (2'-FL), 3'-퓨코실락토스 (3'-FL), 3'-시아릴락토스 (3'-SL), 6'-시아릴락토스 (6'-SL), 락토-N-네오테트라오스 (LNnT), 락토-N-테트라오스 (LNT), 시아릴락토-N-테트라오스 a (LST a), 시아릴락토-N-네오테트라오스 c (LST c), 락토-디퓨코테트라오스 (LDFT) 또는 락토-N-퓨코펜타오스 I (LNFP I)이다.
일정 경우에, HMO는 2'-FL와 같은 퓨코실락토스이다. 일정 구현예에서, 2'-FL와 같은 퓨코실락토스는 숙주 미생물에서 신생 (de novo) 경로를 통해 합성된다. 예를 들면, 경로는 GMD (GDP-만노스 탈수화효소), GFS (GDP-L-퓨코스 합성효소) 및 FS (퓨코실 전이효소)를 포함할 수 있고, 여기서 GMD는 GDP-만노스를 GDP-4-케토-6-데옥시만노스로 전환하는 효소적 활성을 공급한다. GFS, 예를 들면 WcaG는 GDP-4-케토-6-데옥시만노스를 GDP-퓨코스로 전환시키고, FT는 GDP-퓨코스를 2'-FL로 전환시킨다. 일정 구현예에서, FT는 알파-1,2-퓨코실 전이효소이다.
GDP-만노스 탈수화효소 (GMD)의 예는 서열번호 17 내지 19의 서열에 의해 제공되고, 이것은 각각 피스툴라리아 솔라리스 (Fistularia solaris) 및 클라도시폰 오카무라누스 (Cladosiphon okamuranus)로부터 나온 GDP-만노스 탈수화효소이다. 피스툴라리아 솔라리스 및 클라도시폰 오카무라누스가 아닌 미생물로부터, 구체적으로 다른 헤테로콘토파이트 (Heterokontophytes) 및 진균으로부터 나온 GMD의 상동체는 본원에 기술된 미생물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에서 GMD의 상동체의 비-제한적인 예는 다음의 유니프로트 엔트리에 의해 예시된다: P93031, 060547, Q18801, Q51366, Q93VR3, P0AC88, Q9VMW9, 045583, A3C4S4, Q9SNY3, Q8K0C9, Q8K3X3, Q9JRN5, Q56872, A0A1B4XBH2, P55354, 085713, Q06952, Q1ZXF7, Q56598, P0AC90, P0AC91, P0AC89, B9UJ29, A8Y0L5, 067175, P71790, A0A1H3VGZ0, A0A078KV89, Q7UVN9, Q7NMK1, Q89TZ1, A0A132P8J4, P72586, Q2R1V8, A0A0G1U600, A2Z7B3, D4ZMX8, K9QEY2, L0A7V1, C3SCZ0, B5W8Q3, K1XEL2, A0A0G1FQB5, H1WIZ0 및 Q63JM9.
본원에 열거된 유니프로트 엔트리는 이들 전체가 참고문헌으로 통합된다. GMD의 추가적인 상동체는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 이러한 구현예는 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들면, GMD의 상동체는 서열번호 17 내지 19 및 42와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
GDP-만노스 4,6-탈수화효소 (GMD; EC 4.2.1.47)는 NAD+를 보조인자로서 사용하여 GDP-만노스로부터 GDP-퓨코스의 합성에서 첫 번째 단계인 GDP-만노스를 GDP-4-케토-6-데옥시만노스로의 전환을 촉매한다. 이 효소는 라이아제, 상세하게 하이드로-라이아제의 패밀리에 속하고, 이는 탄소-산소 결합을 절단한다. 이 효소 부류의 체계적 명칭은 GDP-만노스 4,6-하이드로-라이아제 (GDP-4-데하이드로 6-데옥시-D-만노스를 형성함)이다. 보편적인 사용 시 다른 명칭은 구아노신 5'-디포스페이트-D-만노스 산화환원효소, 구아노신 디포스포만노스 산화환원효소, 구아노신 디포스포만노스 4,6-탈수화효소, GDP-D-만노스 탈수화효소, GDP-D-만노스 4,6-탈수화효소, Gmd 및 GDP-D-만노스 4,6-하이드로-라이아제를 포함한다. 이러한 효소는 과당 및 만노스 대사에 참여한다. 이것은 하나의 보조인자 NAD+를 채용한다.
일정 구현예에서, GMD 및/또는 GFS는 대장균, Helicobacter pylori, Arabidopsis thaliana, 및/또는 Mortierella alpina로부터 유래한다 (Ren et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010년 1월 22일; 39l(4): 1663-9; Hollands K. et al., Metab. Eng. 2019년 3월; 52: 232-242). 일정 구현예에서, GMD는 표 1에 열거된 서열 중 하나 또는 이의 변이체에 의해 인코딩된다.
본원에 제시된 GDP-퓨코스 합성에 관련하는 많은 단백질은 규조류와 다시마를 포함하고, 이들의 세포벽에 매우 많은 퓨코스를 포함하는 것으로 관찰되었던 일군의 해조류인 헤테로콘토파이트에서 동정되어 왔다. 또한, GMD 및 GFS 단백질 도메인을 구성하는 것으로 보이는 융합 단백질도 확인되었다. 하기 표 1은 GMD 활성을 나타낸다.
서열번호 | 유기체 | 유기체 설명 |
서열번호 17 | Fistularia solaris | 규조류 |
서열번호 18 | Cladosiphon okamuranus | 다시마 |
서열번호 19 | Cladosiphon okamuranus | 다시마 |
서열번호 42 | 대장균 | N/A |
서열번호 17
서열번호 18
서열번호 19
서열번호 42
헬리코박터 파일로리로부터의 GMD, 서열번호 60
아라비돕시스 탈리아나로부터의 GMD, 서열번호 61
모르티에렐라 알피네으로부터의 GMS, 서열번호 62
GFS (GDP-퓨코스 합성효소)의 예는 서열번호 20 내지 23의 서열에 의해 제공되고, 이는 각각 클라도시폰 오카무라누스 (Cladosiphon okamuranus), 패오닥틸럼 트리코누툼 (Phaeodactylum tricornutum), 사카리나 자포니카 (Saccharina japonica) 및 뮤코르 서시넬로이데스 (Mucor circinelloides) f. circinelloides 1006PhL로부터 나온 GDP-L-퓨코스 합성효소이다. 클라도시폰 오카무라누스, 패오닥틸럼 트리코누툼, 사카리나 자포니카 및 뮤코르 서시넬로이데스 f. circinelloides 1006PhL가 아닌 미생물로부터, 구체적으로 다른 헤테로콘토파이트 및 진균으로부터 나온 GFS의 상동체는 본원에 기술된 미생물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에서 GFS의 상동체의 비-제한적인 예는 다음의 유니프로트 엔트리에 의해 예시된다: Q13630, P32055, 049213, P23591, Q9W1X8, Q9LMU0, G5EER4, Q8K3X2, P33217, Q5RBE5, F0F7M8, Q67WR2, P55353, Q67WR5, D9RW33, F2KZP1, G1WDT9, D7NG24, C9MLN8, Q9S5F8, X6PWX2, H1HNE5, D1QPT8, G6AG96, I0TA81, G1VAH6, A0A0K1NMZ0, U2KFA0, F0H551, A0A2K9HDD8, A0A095YQN3, D3I452, A0A096ARU1, A0A095ZVW3, A0A096ACH9, A0A1B1IBP6, Q55C77, A0A1F0MVW9, A0A1F0P341, A0A1T4MGU5, W4UTD5, A0A0G0Z978, Q5V3C6, A0A2U0U1K6, A0A2T4T802 및 A0A2T4TH79.
본원에 열거된 유니프로트 엔트리는 이들 전체가 참고문헌으로 통합된다. GFS의 추가적인 상동체는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 이러한 구현예는 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들면, GFS의 상동체는 서열번호 20 내지 23과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
GDP-L-퓨코스 합성효소 (EC 1.1.1.271)는 화학 반응 GDP-4-데하이드로-6-데옥시-D-만노스 + NADPH + H+ ←→ GDP-L-퓨코스 + NADP+를 촉매하는 효소이다. 따라서, 이 효소의 3개의 기질은 GDP-4-데하이드로-6-데옥시-D-만노스, NADPH 및 H+인 반면, 이의 2개 산물은 GDP-L-퓨코스 및 NADP+이다. 이러한 효소는 산화환원효소, 상세하게는 수여체로서 NAD+ 또는 NADP+와 함께 공여체의 CH-OH 기 상에 작용하는 효소의 패밀리에 속한다. 이러한 효소 부류의 체계적 명칭은 GDP-L-퓨코스: NADP+ 4-산화환원효소 (3,5-에피머화)이다. 이 효소는 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D만노스-3,5-에피머라제-4-환원효소로 불린다. 이러한 효소는 과당 및 만노스 대사에 참여한다.
일정 구현예에서, GFS는 표 2에 열거된 서열 중 하나 또는 이의 변이체에 의해 인코딩된다. 하기 표 2는 GFS 활성을 나타낸다.
서열번호 | 유기체 | 유기체 설명 |
서열번호 20 | Cladosiphon okamuranus | 다시마 |
서열번호 21 | Phaeodactylum tricornutum | 규조류 |
서열번호 22 | Saccharina japonica | 다시마 |
서열번호 23 | Mucor circinelloides f. circinelloides 1006PhL | 토양 진균 |
서열번호 20
서열번호 21
서열번호 22
서열번호 23
GDP-L-퓨코스 합성효소 (WcaG) [대장균], 서열번호 43
아라비돕시스 탈리아나로부터의 GMER (WcaG), 서열번호 44
헬리코박터 파일로리로부터의 GMER (WcaG), 서열번호 45
모르티에렐라 알피네으로부터의 GMER (WcaG), 서열번호 46
일정 구현예에서, GMD 및 GFS 활성은 표 3에 열거된 효소 중 하나 또는 이의 변이체와 같은 단일한 효소에 의해 공급된다. 하기 표 3는 GMD 및 GFS 활성에 대한 유전자를 나타낸다.
서열번호 | 유기체 | 유기체 설명 |
서열번호 24 | Puniceicoccaceae bacterium TMED149 | 세균 |
서열번호 25 | Cladosiphon okamuranus | 다시마 |
서열번호 24
서열번호 25
퓨코실 전이효소 (FT), 예로 알파-1,2-퓨코실 전이효소는 서열번호 26 내지 40에 의해 제공되고, 이는 각각 딕티오스텔리움 디스코이듐 (Dictyostelium discoideum) AX4, 호모 사피엔스 (Homo sapiens), 피숨 사티바 (Pisum sativa), 라이조븀 마리눔 (Rhizobium marinum), 허바스피릴룸 루브리수발비칸스 (Herbaspirillum rubrisubalbicans), 시트로박터 프런디 (Citrobacter freundii), 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 네오칼리마스틱스 칼리포르니애 (Neocallimastix californiae), 글라실라리옵스 코르다 (Gracilariopsis chorda), 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri), 옥토푸스 비마쿨로이데스 (Octopus bimaculoides) 및 크리세오박테리움 스코프탈뭄 (Chryseobacterium scophthalmum)으로부터 나온 알파-1,2-퓨코실 전이효소이다. 딕티오스텔리움 디스코이듐 AX4, 호모 사피엔스, 피숨 사티바, 라이조븀 마리눔, 허바스피릴룸 루브리수발비칸스, 시트로박터 프런디, 락토바실러스 헬베티쿠스, 네오칼리마스틱스 칼리포르니애, 글라실라리옵스 코르다, 락토바실러스 가세리, 옥토푸스 비마쿨로이데스 및 크리세오박테리움 스코프탈뭄이 아닌 미생물로부터, 구체적으로 진균으로부터 나온 FT의 상동체는 본원에 기술된 미생물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에서 FT의 상동체의 비-제한적인 예는 다음의 유니프로트 엔트리에 의해 예시된다: O30511, P51993, Ql1128, G5EFP5, G5EE06, P56434, Q11130, Q11131, P56433, Q8HYJ7, Q8HYJ6, Q17WZ9, Q9ZFI3, D0ISI2, D0ITD1, Q9ZKD7, C7BXF2, E6NNI5, E6NPH4, B6JLN9, C7BZU7, E6NJ21, E6NI06, E6NRI2, E6NSJ6, E6NEQ5, E6NDP7, J0NAV4 및 Q9F8S4. FT의 유사체는 본원에 기술된 미생물 및 방법에 사용될 수 있다.
일정 구현예에서, FT는 헬리코박터 파일로리 26695 (FutC), 박테로이데스 프라질리스 (WcfB) 또는 대장균 (예컨대 WbgF, WbgN 및 WbwK, 예를 들면 대장균 O86으로부터 나온 wbwK, 대장균 0128로부터 나온 wbsJ, 대장균 0126로부터 나온 wbgL, 대장균 0127로부터 나온 wbiQ)로부터 나온 α-1,2-퓨코실 전이효소 (FT), H. 파일로리로부터 나온 futB, H. 무스탈래로부터 나온 futL, H. 빌리스로부터 나온 futF, C. 제주니로부터 나온 futG, B. 불가투스 ATCC 8482로부터 나온 futN 및 B. 프라질리스로부터 나온 wcfB 및 wcfW로부터 선택된다.
일정 구현예에서, FT는 표 4에 열거된 서열 중 하나 또는 이의 변이체에 의해 인코딩된다. 하기 표 4는 FT 활성에 대한 유전자를 나타낸다.
서열번호 | 유기체 | 유기체 설명 |
서열번호 26 | Dictyostelium discoideum AX4 | 점균류 |
서열번호 27 | Homo sapiens | 인간 효소 |
서열번호 28 | Pisum sativa | 식물 |
서열번호 29 | Rhizobium marinum | 세균 |
서열번호 30 | Herbaspirillum rubrisubalbicans | 세균 |
서열번호 31 | Citrobacter freundii | 세균 |
서열번호 32 | Lactobacillus helveticus | 세균 |
서열번호 33 | Neocallimastix californiae | 진균 |
서열번호 34 | 홍조류 | |
서열번호 35 | Lactobacillus gasseri | 세균 |
서열번호 36 | Octopus bimaculoides | 두족류 |
서열번호 37 | Chryseobacterium scophthalmum | 세균 |
서열번호 38 | Homo sapiens | 인간 효소 |
서열번호 39 | Pisum sativa | 식물 |
서열번호 40 | Neocallimastix californiae | 진균 |
서열번호 26
서열번호 27
서열번호 28
서열번호 29
서열번호 30
서열번호 31
서열번호 32
서열번호 33
서열번호 34
서열번호 35
서열번호 36
서열번호 37
서열번호 38
서열번호 39
서열번호 40
알파-1,2-퓨코실 전이효소 (WbgL) [대장균], 서열번호 47
H. 파일로리로부터의 futC_Hp26695, 서열번호 48
박테로이데스 프라질리스로부터의 추정된 퓨코실 전이효소, 서열번호 49
대장균으로부터의 wbgN, 서열번호 50
대장균으로부터의 wbwk, 서열번호 51
대장균으로부터의 wbsJ, 서열번호 52
대장균으로부터의 wbiQ, 서열번호 53
H. 파일로리로부터의 futB, 서열번호 54
H. 무스텔래로부터의 futL, 서열번호 55
H. 빌리스로부터의 futF, 서열번호 56
H. 제주니로부터의 futG, 서열번호 57
B. 불가투스로부터의 futN, 서열번호 58
B. 프라질리스로부터의 wcfW, 서열번호 59
futA, 서열번호 63
futD, 서열번호 64
futE, 서열번호 65
futH, 서열번호 66
futJ, 서열번호 67
futK, 서열번호 68
futM, 서열번호 69
일정 구현예에서, 효소 서열을 인코딩하는 핵산은 예컨대 특이적 세포성 소기관으로 국소화를 위한 표적화 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 이러한 서열은 미생물 내에 유전자 조작을 통해 이종유래 유전자로서 제공되기 이전에 핵산으로부터 제거된다. 예를 들면, 서열번호 27, 28, 33, 38, 39 또는 40의 표적화 서열은 인코딩된 FT가 미생물에서 발현을 위해 유전자 조작되기 이전에 제거될 수 있다.
미생물에서 HMO 생산에 사용될 수 있는 다른 FT는 다음의 유니프로트 엔트리를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다: 030511, P51993, Q11128, G5EFP5, G5EE06, P56434, Q11130, Q11131, P56433, Q8HYJ7, Q8HYJ6, Q17WZ9, Q9ZLI3, D0ISI2, D0ITD1, Q9ZKD7, C7BXF2, E6NNI5, E6NPH4, B6JLN9, C7BZU7, E6NJ21, E6NI06, E6NRI2, E6NSJ6, E6NEQ5, E6NDP7, J0NAV4 및 Q9L8S4. 또한, FT의 유사체 및 상동체도 본원에 기술된 미생물 및 방법에 사용될 수 있다.
본원에 열거된 유니프로트 엔트리는 이들 전체가 참고문헌으로 통합된다. FT의 추가적인 상동체는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 이러한 구현예는 본원에서 조작된 미생물 및 방법과 함께 사용되는 것으로 고려된다. 예를 들면, FT의 상동체는 서열번호 26 내지 40과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
일정 구현예에서, 2'-FL과 같은 HMO는 소위 재생 경로 효소를 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들면, 2'-FL의 경우 미생물은 락토스 및 퓨코스 기질을 이용하여, 퓨코스 및 ATP를 퓨코스-1-포스페이트로 전환할 수 있는 효소, 퓨코스-1-포스페이트 및 GTP를 GDP-퓨코스로 전환할 수 있는 효소를 사용하여 2'-FL을 합성할 수 있고, 이는 다음으로 퓨코실 전이효소 (FT)에 의해 2'-FL로 전환될 수 있다. 일정 구현예에서, 이중기능성 퓨코키나제/L-퓨코스-1-P-구아니릴 전이효소 (FKP) 효소, 예컨대 박테로이데스 프라질리스로부터 나온 fkp는 퓨코스부터 GDP-퓨코스까지 2개의 효소적 단계를 수행한 다음, FT가 GDP-퓨코스를 2'-FL로 전환시킨다. 일정 구현예에서, kfp는 B. 프라질리스 9343로부터 나온다. 예를 들면, FT는 헬리코박터 파일로리로부터 나온 fuc12 또는 본원에 기술된 임의의 FT일 수 있다. 일정 구현예에서, 락토스는 미생물에게 내인성으로 공급되고, Lac 12, CDT-1, CDT-2 또는 이들의 변이체 또는 유사체와 같은 운반체가 HMO로의 전환을 위해 락토스를 새포내로 내수송한다.
이중기능성 퓨코키나제/L-퓨코스-1-P-구아니릴 전이효소 (FKP) [박테로이데스 프라질리스], 서열번호 70
이중기능성 퓨코키나제/L-퓨코스-1-P-구아니릴 전이효소 (FKP) [박테로이데스 세타이오타오미크론], 서열번호 71
이중기능성 퓨코키나제/L-퓨코스-1-P-구아니릴 전이효소 (FKP) [박테로이데스 오바투스], 서열번호 72
일정 구현예에서, 하나 이상의 변형이 미생물 (예컨대 유전자 조작에 의함)에 대해 및/또는 HMO를 제조하는 단계의 효소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산에 대해 만들어진다. 이러한 변형은 (a) gmd, gfs, fkp 및/또는 ft와 같은 내인성 효소에 작동가능하게 연결된 외인성 프로모터로 내인성 프로모터의 교체; (b) 염색체외 유전물질을 통한 GMD, GFS, FKP 및/또는 FT의 발현; (c) 하나 이상의 gmd, gfs, fkp 및/또는 ft 사본의 미생물 게놈 내로의 혼입; (d) 활성을 증가시킨 단백질을 인코딩하는, 변형된 gmd, gfs, fkp 및/또는 ft를 생산하는 내인성 gmd, gfs, fkp 및/또는 ft에 대한 변형; 또는 본 단락에 설명된 (a) 내지 (d) 변형의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
일정 구현예에서, GMD, GFS, FKP 및/또는 FT의 발현은 상이한 프로모터 또는 도입된 gmd, gfs, fkp 및/또는 ft 유전자에 바로 인접한 변화를 이용함으로써 달라질 수 있다. 예를 들면, 특정 구현예에서 도입된 gmd, gfs, fkp 및/또는 ft 발현 카세트에 인접한 URA3 카세트의 결실은 2'-FL 생산의 추가 개선을 유도한다.
일정 구현예에서, 내인성 프로모터는 발현을 내인성 프로모터보다 더 높은 수준으로 유도하는 외인성 프로모터로 교체된다. 특정 구현예에서, 외인성 프로모터는 내인성 프로모터를 외인성 프로모터로 교체시킨 미생물에 특이적이다. 예를 들면, 효모 특이적 외인성 프로모터는 변형되고 있는 미생물이 효모인 경우 사용될 수 있다. 외인성 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다.
구성적 효모 특이적 프로모터의 비-제한적인 예는 pCYC1, pADH1, pSTE5, pADH1, pCYC1OO 최소, pCYC70 최소, pCYC43 최소, pCYC28 최소, pCYC16, pPGK1, pCYC, pGPD 또는 pTDH3를 포함한다. 효모로부터 나온 구성적 프로모터의 추가적인 예 및 효모가 아닌 미생물로부터 나온 구성적 프로모터의 예는 당업자에게 공지되어 있고, 이러한 구현예는 본 발명의 범위에 속한다.
유도성 효모 특이적 프로모터의 비-제한적인 예는 pGAL1, pMFA1, pMFA2, pSTE3, pURA3, pFIG1, pEN02, pDLD, pJEN1, pmCYC 및 pSTE2를 포함한다. 효모로부터 나온 유도성 프로모터의 추가적인 예 및 효모가 아닌 미생물로부터 나온 유도성 프로모터의 예는 당업자에게 공지되어 있고, 이러한 구현예는 본 발명의 범위에 속한다.
본원에 기술된 유전적으로 변형된 미생물을 생산하는데 사용된 미생물은 S. 세레비시애, S. 파스토리아누스, S. 베티쿠스, S. 퍼멘타티, S. 파라독서스, S. 우바룸 및 S. 바야누스와 같은 사카로마이세스 종, S. 폼브, S. 자포니쿠스, S. 옥토스포루스, S. 크립토필러스와 같은 스키조사카로마이세스 종, T. 델브루엑키와 같은 토룰라스포라 종, K. 마르시아누스와 같은 클루이베로마이세스 종, P. 스티피티스, P. 파스토리스 및 P. 안구스타와 같은 피키아 종, Z. 바일리와 같은 자이고사카로마이세스 종, B. 인터메디우스, B. 브룩셀렌시스, B. 아노말루스, B. 쿠스터시아누스, B 나르데넨시스 및 B. 나누스와 같은 브레타노마이세스 종, D. 브룩셀렌시스 및 D. 아노말라와 같은 덱케라 종, 메츠쉬니코위야 종, 이사첸키아 오리엔탈리스와 같은 이사첸키아 종, 클로엑케라 아피쿨라타와 같은 클로엑케라 종, 아우레오바시디움 플루란스와 같은 아우레오바시디움 종, 자이고사카로마이세스 종, 자이고사카로마이세스 바일리, 브레타노마이세스 종, 브레타노마이세스 인터메디우스, 브레타노마이세스 브룩셀렌시스, 브레타노마이세스 아노말루스, 브레타노마이세스 쿠스터시아누스, 브레타노마이세스 나르데넨시스, 브레타노마이세스 나누스, 덱케라 종, 덱케라 브룩셀렌시스, 덱케라 아노말라, 메츠쉬니코위야 종, 이사첸키아 종, 이사첸키아 오리엔탈리스, 이사첸키아 테리콜라, 클로엑케라 종, 클로엑케라 아피쿨라타, 아우레오바시디움 종, 아우레오바시디움 플루란스, 로도토룰라 종, 로도토룰라 글루티니스, 로도토룰라 클라디엔시스, 로도스포리디움 종, 로도스포리디움 토룰로이데스, 크립토코커스 종, 크립토코커스 네오포르만스, 크립토코커스 알비두스, 야로위야 종, 야로위야 리포티카, 쿠라이쉬아 종, 쿠라이쉬아 캡슐라타, 쿠라이쉬아 몰리쉬아나, 코마가탤라 종, 코마가탤라 파피, 코마가탤라 파스토리스, 한세니아스포라 종, 한세니아스포라 길리에르몬디, 한세니아스포라 우바룸, 하세가와애 종, 하세가와애 자포니카, 아스코이대 종, 아스코이대 아시아티카, 세팔로아스쿠스 종, 세팔로아스쿠스 프라그란스, 리포마이세스 종, 리포마이세스 스타르케이, 카와사키아 종, 카와사키아 아륵지, 자이고자이마 종, 자이고자이마 올리고파가, 메츠쉬니코위야 종, 메츠쉬니코위야 풀쉐리마, 콕시디오데스 종, 콕시디오데스 이미티스, 뉴로스포라 디스크레타, 뉴로스포라 아프리카누스, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 니게르, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 오리자이, 아스퍼질러스 푸미가투스, 뮤코르 종, 뮤코르 서시넬로이데스, 뮤코르 라세모수스, 라이조푸스 종, 라이조푸스 오리자이, 라이조푸스 스톨로니페라, 움벨롭시스 종, 움벨롭시스 이사벨린, 모르티에렐라 종, 모르티에렐라 알피네, 알테르나리라 종, 알테르나리라 알터나테, 보트리티스 종, 보트리티스 시내레알, 푸사리움 종, 푸사리움 그라미나리움, 제오트리쿰 종, 제오트리쿰 칸디둠, 페니실리움 종, 페니실리움 크라이소게눔, 채토미움 종, 채토미움 써모필리아, 마그나포르테 종, 마그나포르테 그리세아, 에머리셀라 종, 에머리셀라 디스코포라, 트리코더마 종, 트리코더마 리세이, 탈라로마이세스 종, 탈라로마이세스 에메르소니, 소르다리아 종, 또는 소르다리아 마크로스포라로부터 선택될 수 있다.
상세한 구현예에서, 미생물은 바람직하게 효모와 같은 진균, 더욱 바람직하게는 사카로마이세스 종, 훨씬 더 바람직하게는 S. 세레비시애가 미생물 숙주로서 제공된다. 사카로마이세스 종과 같은 효모는 본원에 기술된 바와 같이 또는 다수의 입수가능한 도구를 사용하여 유전적으로 조작될 수 있다.
또한, 다른 아스코마이세테스 진균도 적합한 숙주로서 제공될 수 있다. 많은 아스코마이세테스는 발효 생산에 유용한 산업적인 숙주이다. 예시적인 속은 트리코더마, 클루이베로마이세스, 야로위야, 아스퍼질러스, 스키조사카로마이세스, 뉴로스포라, 피키아 (한세눌라)) 및 사카로마이세스를 포함한다. 예시적인 종은 Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus , Neurospora crassa, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica 및 Saccharomyces boulardii를 포함한다.
클로닝 도구는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예로, Cellulases and beyond: the first 70 years of the enzyme producer Trichoderma reesei, Robert H. Bischof, Microbial Cell Factories Volume 15, 논문 번호: 106 (2016); Development of a comprehensive set of tools for genome engineering in a cold- and thermo-tolerant Kluyveromyces marxianus yeast strain, Yumiko Nambu-Nishida, Scientific Reports Vol. 7, 논문 번호: 8993 (2017); Engineering Kluyveromyces marxianus as a Robust Synthetic Biology Platform Host, Paul Cernak, mBio 2018년 9월, 9(5) e0l4l0-l 8; DOI: l0. H28/mBio.0l4l0-l 8; How a fungus shapes biotechnology: 100 years of Aspergillus niger research, Timothy C. Cairns, Fungal Biology and Biotechnology Vol. 5, 논문 번호: 13 (2018); GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris, Roland Prielhofer, BMC Systems Biology Vol. 11, 논문 번호: 123 (2017); Aiko Ozaki,"Metabolic engineering of Schizosaccharomyces pombe via CRISPR-Cas9 genome editing for lactic acid production from glucose and cellobiose," Metabolic Engineering Communications Vol. 5, 2017년 12월, p60-67; World J. Microbiol. Biotechnol. 2019; 35(1): 10, "Yarrowia lipolytica: a beneficious yeast in biotechnology as a rare opportunistic fungal pathogen; 미니리뷰, Bartlomiej Zieniuk (2014) "Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii PLOS ONE 9(11); "Metabolic Engineering of Probiotic Saccharomyces boulardii," Liu J. J., Kong Ⅱ, 2016; Metabolic engineering of probiotic Saccharomyces boulardii. Appl. Environ. Microbiol. 82: 2280 -2287; David Havlik, "Establishment of Neurospora crassa as a host for heterologous protein production using a human antibody fragment as a model product", Microb. Cell Fact. 2017; 16: 128; Ho, C.C. (1986년 4월). "Identity and characteristics of Neurospora intermedia responsible for oncom fermentation in Indonesia", Food Microbiology. 3(2): 115-132 참조.
Ⅲ. HMO 생산 및 외수송의 증진
일정 구현예에서, HMO의 생산 및/또는 외수송은 HMO 생산하는 미생물의 유전적 변형을 통하여 증진될 수 있다. 예를 들면, HMO 생산하는 미생물는 다음 중 하나 이상에 의해 변형될 수 있다:
(i) 부모 미생물의 PMA1 활성과 비교하여 미생물에서 PMA1 활성을 증가시키는 유전적 변형,
(ii) 부모 미생물의 SNF3 활성과 비교하여 미생물에서 SNF3 활성을 감소시키는 유전적 변형,
(iii) 부모 미생물의 RGT2 활성과 비교하여 미생물에서 RGT2 활성을 감소시키는 유전적 변형, 및
(iv) 부모 미생물의 GPR1 활성과 비교하여 미생물에서 GPR1 활성을 감소시키는 유전적 변형.
구체적인 구현예에서, (i) PMA1 활성을 증가시키는 유전적 변형은 원형질막 ATP아제 유전자 (pma1)에 대한 유전적 변형이고, (ii) SNF3 활성을 감소시키는 유전적 변형은 슈크로스 비-발효 유전자 (snf3)에 대한 유전적 변형이고, (iii) RGT2 활성을 감소시키는 유전적 변형은 포도당 운반 유전자 (rgt2)에 대한 유전적 변형이고; (iv) GPR1 활성을 감소시키는 유전적 변형은 G 단백질 결합된 수용체 1 유전자 (gpr1)에 대한 유전적 변형이다. PMA1, SNF3, RGT2 및 GPR1의 예는 국제특허출원 제 PCT/US2018/040351호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참고문헌으로 통합된다.
PMA1의 예는 서열번호 5의 서열에 의해 제공되고, 이는 사카로마이세스 세레비시애로부터 나온 PMA1이다. S. 세레비시애가 아닌 미생물, 구체적으로 효모로부터 나온 PMA1의 상동체는 본 발명의 미생물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 PMA1의 상동체의 비-제한적인 예는 다음의 유니프로트 엔트리에 의해 예시된다: A0A1U8I9G6, A0A1U8H4C1, A0A093V076, A0A1U8FCY1, Q08435, A0A1U7Y482, A0A1U8GLU7, P22180, A0A1U8G6C0, A0A1U8IAV5, A0A1U8FQ89, P09627, A0A199VNH3, P05030, P28877, A0A1U8I3U0, Q0EXL8, A0A1U8I3V7, P49380, Q07421, A0A1D8PJ01, P54211, P37367, P07038, Q0Q5F2, G8BGS3, A0A167F957, M5ENE2, A0A1B8GQT5, 074242, Q9GV97, Q6VAU4, A0A177AKN9, A0A1J6KB29, A0A2H9ZYJ6, A0A251UIM1, A0A251USM2, D2DVW3, M5BX73, Q6FXU5, A3LP36, G3ARI4, 9NSP9, A0A167C712, G2WE85, F2QNM0, A6ZUY5, C7GK65, A0A142GRJ4, W0T7K4, B3LDT4, A0A0H5BY16, A0A1B2J5T9, E7DB83, Q9UR20, F4NA03, Q96TH7, F4NA02, 12G7P2, C4PGL3, F4NA00, F4N9Z6, Q7Z8B7, F4N9Z9, A0A1L4AAP4, 094195, A0A1D1YKT6, A0A0U1YLR0, A0A0F8DBR8, A0A1C7N6N1, A0A2N6P2L5, A0A2C5WY03, 014437, T1VYW7, T1VY71, A1KAB0, C0QE12, K0NAG7, A0A0H3J1I1, A0A1Q9D817, A0A068MZP7, D1JED6, A0A2K8WRE9, A0A1A8YFD7, A0A1A8YG89, 12G7P8, D9PN36, D1JI19, B6IUJ9, B1XP54, H8W7G4, H6SL18, G8LCW3, L8AJP6, Q5ZFR6, A0A1D7QSR3, A0A1Q2TYG8, F4N054, A0A1Q9CTB2, A0A1Q9EJY5, A0A1D1XEE3, A0A0F7GAE0, D2DVW4, A0A0A9YX23, A0A1Q9ELW6. 본원에 열거된 유니프로트 엔트리는 이들 전체가 참고문헌으로 통합된다.
PMA1의 추가적인 상동체는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 이러한 구현예는 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들면, PMA1의 상동체는 서열번호 5와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
서열번호 5
SNF3의 예는 서열번호 6의 서열에 의해 제공되고, 이는 S. 세레비시애로부터 나온 SNF3이다. S. 세레비시애가 아닌 미생물, 구체적으로 효모로부터 나온 SNF3의 상동체는 본 발명의 미생물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 SNF3의 상동체의 비-제한적인 예는 다음의 유니프로트 엔트리에 의해 예시된다: W0TFH8, Q6FNU3, A0A0W0CEX1, G2WBX2, A6ZXD8, J6EGX9, P10870, C7GV56, B3LH76, A0A0L8RL87, A0A0K3C9L0, M7WSX8, A0A1U8HEQ5, G5EBN9, A8X3G5, A3LZS0, G3AQ67, A0A1E4RGT4, A0A1B2J9B3, F2QP27, E3MDL0, A0A2C5X045, G0NWE1, A0A0H5S3Z1, A0A2G5VCG9, A0A167ER19, A0A167DDU9, A0A167CY60, A0A167CEW8, A0A167ER43, A0A167F8X4, A0A1B8GC68, A0A177A9B0, E3EIS7, E3E8B6 및 A0A0A9Z0Q2. 본원에 열거된 유니프로트 엔트리는 이들 전체가 참고문헌으로 통합된다.
SNF3의 추가적인 상동체는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 이러한 구현예는 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들면, SNF3의 상동체는 서열번호 6과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
서열번호 6
RGT2의 예는 서열번호 7의 서열에 의해 제공되고, 이는 S. 세레비시애로부터 나온 RGT2이다. S. 세레비시애가 아닌 미생물, 구체적으로 효모로부터 나온 RGT2의 상동체는 본 발명의 미생물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 RGT2의 상동체의 비-제한적인 예는 다음의 유니프로트 엔트리에 의해 예시된다: A0A0U1MAJ7, N4TG48, A0A1Q8RPY1, N4U7I0, A0A1L7SSQ2, A0A1L7VB15, A0A0C4E497, A0A1L7UAN6, A0A0J0CU17, A0A1L7VMA9, S0ED22, A0A1L7SD48, N1R8L8, A0A1L7V0N4, S3BYD3, E4UUU6, N4UPT5, N4U030, A0A0I9YK83, S0DJS4, A0A0U1LWH9, A0A0K6FSJ2, N1S6K7, A0A0J6F3E5, A0A1E4RS51, N4UTN2, A0A0G2E6D5, A0A1J9R914, A0A0F4GQX7, A0A1S9RLB9, A3M0N3, J9PF54, A0A074WC52, A0A0K6GI66, N1QHS4, G2WXK0, B2VVL4, B2WDK7, A0A1J9S6A1, G4N0E9, L7JEU7, L7INA5, A0A0L1HE99, A0A0J8QL36, A0A0H5CKW2, A0A0J6Y4E2, W0VMG0, G2WQD8, A0A1C1WV61, A0A1S9RL33, C9SBA9, A0A0G2HY75, J3P244, N1QK04, A0A0N0NQR9, A0A1S7UJ19, G2XFE7, C9SWZ3, R8BUY9, M7SYH1, A0A1E1MIV2, A0A1E1LLK3, A0A1E1LJE1, L7J4Y3, L7I304, A0A1L7XU29, A0A136JCY3, A0A0J8RG81, A0A177DW33, A0A1L7X792, W9C8U1, B2VXL1, A0A0L1HMG8, A0A178DQW4, A0A167V6F7, A0A166WR60, A0A162KLT6, A0A1L7X3D1, G3JQX8, Q7S9U8, E9F7A6, A0A1S7HPX9, A0A0G2G564, A0A0W0D0B3, A6ZXI9, Q12300, C7GKZ0, G2WC23, A0A0H5CAT9, J4U3Y8 및 A0A0L8RL54. 본원에 열거된 유니프로트 엔트리는 이들 전체가 참고문헌으로 통합된다.
RGT2의 추가적인 상동체는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 이러한 구현예는 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들면, RGT2의 상동체는 서열번호 7과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
서열번호 7
GPR1의 예는 서열번호 8의 서열에 의해 제공되고, 이는 S. 세레비시애로부터 나온 GPR1이다. S. 세레비시애가 아닌 미생물, 구체적으로 효모로부터 나온 GPR1의 상동체는 본 발명의 미생물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 GPR1의 상동체의 비-제한적인 예는 다음의 유니프로트 엔트리에 의해 예시된다: A0A1S3ALF0, A0A0Q3MD25, A0A146RBQ8, A0A0P5SHA9, A2ARI4, Q9BXB1, Q9Z2H4, F1MLX5, U3DQD9, I2CVT9, 10FI44, K7D663, K7ASZ6, A0A1U7Q769, U3ESI5, T1E5B8, A0A0F7ZA01, J3RZW5, A0A094ZHC9, W6UF90, A0A0P6J7Q8, F5KYC3, B7P6N0, B0BLW3, A2AHQ2, A0A151N8W7, A0A146RCW3, A0A0X3NYB9, A0A0P5Y3G9, W5UAB2, A0A0P5IC44, A0A090XF51, A0A146NRV7, A0A0X3Q0R0, A0A0P6IRD7, F9JFB7, A0A146YGG2, A0A146WG88, Q12361, B3LGT6, A0A0N8A6F9, P0DM44, W6JM29, A0A1A8LC80, A0A0N8A4D4, Q7Z7M1, A0A1S3G1Q8, A0A1U7QGH1, A6ZXT8, A0A1U8C0F6, D3ZJU9, A0A1S3KGL3, G5B385, F9KNY9, A0A1S3AQM3, A0A087UXX9, A0A0F8VW24, A0A0P6AR08, Q9HBX8, Q3UVD5, A0A1U7UEF2, A0A146XMF9, A0A146QTV1, A0A1S3ID45, L5KTU9, A0A1A8ELT4, A0A0N7ZMX8, A0A0P5Q3T8, A0A1A8N9Z4, A0A1A8D807, A0A1A8CVG1, A0A1A8UMB1, A0A1A8JQ07, A0A1A8P7N2, A0A1A8HF38, E7FE13, A0A1S3FZF3, A0A0P7WFQ9, H2KQN3, A0A1S3WJA9, A0A146PKA1, F5FFQ3, F1Q989, A0A0F8AKY3, A0A0P7VR95, A0A1U8C8I3, A0A034VIM3, A0A0N8BFD4, A0A146XMJ1, A0A0N8BDM1, A0A1A8KTJ1, A0A1A7X706, A0A0R4ITE3, A0A1U7S4H0, A0A1S3AQ94, A0A1U7UCP2, F8HMA8, A0A0Q3P3V6, A0A1A8CDG3, D6W7N2, A0A1E1XMY8, A0A1A8ACF5, A0A1S3WNY2, T0MHY5, A0A1S3G113, V8P2X5, A0A1S3KV51, A0A1S3G018, A0A1S3PUP5, A0A1U8C7X5, S9WP18, A0A1S3AQL8, A0A0N8ENF1, K7CIG0, A0A147BFY7, A0A1S3FZK9, A0A1U7TUH0, A0A1U8BX93, A0A091DKN5, A0A146W919, A0A147B2K7, A0A146XNL4, A0A091DTX9, A0A0Q3UQB0, A0A146WH37, E9QDD1, Q58Y75, A0A096MKI0, A0A1S3S901, Q14BH6, A0A1S3AQ42, A0A0P5SV49, A0A0P5P299, A0A0P5WCR4, K7CHT8, A0A1U7U0Q5, A0A1S3EXD4, A0A146Y6G0, A0A061HXQ0, A0A1S3AQ84, A0A1S2ZNQ3, A0A1U7UEE6, A0A1S3G013, A0A1U7QJG4, S7N7M1, A0A1S3G108, A0A1U8C8H8 및 A0A1U8C7X0.
GPR1의 추가적인 상동체는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 이러한 구현예는 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들면, GPR1의 상동체는 서열번호 8과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
서열번호 8
HMO의 생산을 위한 기질
특정 구현예에서, 본 발명은 HMO를 제조하기 위하여 미생물에 의해 사용될 수 있는 하나 이상의 기질의 내수송 및/또는 흡수 증가를 제공하는 하나 이상의 유전적 변형을 포함하는 미생물을 제공한다. 예를 들면, 미생물은 다음을 포함할 수 있다:
(i) 미생물 내로 락토스 및/또는 다른 기질의 흡수를 증가시키는 기질 운반체 유전자 LAC12 또는 이의 유사체를 도입하는 유전적 변형; 및
(ii) 락토스와 같은 기질을 내수송하고, 생산된 HMO도 외수송할 수 있는 운반체, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 셀로덱스트인 운반체 유전자 cdt-1 또는 셀로덱스트인 운반체 유전자 cdt-1의 변이체 (예를 들면, CDT-1 N209S F262Y, CDT-1 G91A, CDT-1 F213A, CDT-1 L256V, CDT-1 F335A, CDT-1 S411A, CDT-1 N209S F262W)를 도입하는 유전적 변형.
락토스 운반체 (Lac12) [클루이베로마이세스 락티스], 서열번호 41
HMO의 생산, 분리 및 단리
일정 구현에에서, 본원에 기술된 미생물은 2'-FL과 같은 HMO를 생산할 수 있다. 일정 구현에에서, 미생물은 락토스를 2'-FL로 전환시킬 수 있다. 상세한 구현예에서, 본원에 기술된 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 락토스를 2'-FL로 전환시킬 수 있는 더 높은 성능을 갖는다. 상세한 구현예에서, 2'-FL로 락토스의 전환은 미생물의 세포질에서 일어난다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 미생물을 적절한 올리고당을 포함하는 적절한 배지에서 적절한 조건 하에 적절한 기간 동안 배양하고, 배양 배지로부터 올리고당을 회수하는 단계에 의해 관심있는 산물을 생산하는 방법이 제공된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 미생물을 락토스를 포함하는 배양 배지에서 적절한 조건 하에 적절한 기간 동안 배양하고, 배양 배지로부터 2'-FL을 회수하는 단계에 의해 2'-FL을 생산하는 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 미생물은 사카로마이세스 종에 속한다. 훨씬 더 바람직한 구현예에서, 미생물은 S. 세레비시애이다.
특정 구현예에서, 배지는 약 10 ㅎ/L 효모 추출물, 20 g/L 펩톤 및 약 40 g/L 올리고당, 구체적으로 락토스 또는 슈크로스를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 미생물, 구체적으로 효모는 30℃에서 성장시킨다.
추가적인 배양 배지, 미생물을 배양하기 위한 적절한 조건 및 배양 배지로부터 관심있는 산물을 회수하는 방법은 당해 기술분야에서 널리 공지되어 있으며, 이러한 구현예는 본 발명의 범위에 속한다.
특정 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 미생물을 적절한 올리고당의 존재 하에 배양하고, 관심있는 산물을 회수하는 단계에 의해 올리고당을 생산하는 방법을 제공한다. 일정 구현예에서, HMO는 HMO를 생산하는 세포 (미생물)로부터 분리된다. 일정 경우에, HMO는 HMO 생산하는 세포를 성장시킨 배양 배지 (발효 배양액)의 다른 성분으로부터 추가로 단리될 수 있다.
일정 구현예에서, HMO는 발효 배양액 (배양 배지로도 지칭됨)으로부터 회수된다. 많은 방법이 세포 및/또는 세포 잔재물 및 생산된 HMO로부터 나온 다른 배양액 성분의 분리에 사용가능하다.
예를 들면, 세포/잔재물 분리는 원심분리 및/또는 여과를 통해 달성될 수 있다. 여과는 미세여과 또는 한외여과 또는 이들의 조합일 수 있다. 하전된 화합물의 분리는 이온 교환 크로마토그래피, 나노여과, 전기투석 또는 이들의 조합을 통해 달성될 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있고, 정상 모드에서 또는 시뮬레이션된 이동 베드 (SMB) 크로마토그래피로서 수행될 수 있다. 다른 유형의 크로마토그래피가 크기 (크기 배제 크로마토그래피) 또는 특이적 표적 분자에게로 향하는 친화도 (친화 크로마토그래피)를 기반으로 하여 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국특허출원 US 2019/0119314 Al, GRAS 출원, GRN0005718 및 GRN 000749 참조.
건조화 또는 농축 단계는 증발, 동결건조, 역삼투 또는 분사 건조화로 달성될 수 있다. 결정화는 농축 및 분리 단계로서 작용할 수 있고, 예를 들면 증발성 또는 농도 기반의 결정화로 시행되거나, pH의 변경 또는 이온 강도의 증가에 의해 유도될 수 있다. 예를 들먼, 미국 측허출원 US20170369920A1 및 국제특허출원 WO2018164937A1 참조.
또한, 활성탄을 사용한 흡착과 같은 흡착 기법도 분리 단계로서 사용될 수 있고, 구체적으로 색상체의 제거 또는 단량체로부터 올리고당의 분리에 유용하다.
또한, HMO 산물은 식품 품질의 목적으로 파스퇴르화되거나, 여과되거나, 달리 멸균화될 수 있다.
산물 및 조성물
본원에 기술된 미생물 및 방법은 하나 이상의 HMO를 포함하는 다양한 산물 및 조성물을 생산하는데 사용될 수 있다. 일정 구현예에서, 동물 소비에 적합한 산물은 본원에서의 미생물 또는 방법에 의해 생산되는 하나 이상의 HMO를 포함한다. 산물은 단백질, 지질, 비타민, 미네랄 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 추가적인 소비가능한 성분을 포함할 수 있다. 산물은 포유동물 소비, 인간 소비 또는 동물 사료 또는 가축 및 반려 동물을 위한 보충제로서의 소비에 적합할 수 있다. 일정 구현예에서, 산물은 인간 소비와 같은 포유동물 소비에 적합하고, 아동 처방, 아동 식품, 영양 보충제 또는 프리바이오틱 산물이다. 산물은 1개, 2개, 3개 또는 3개 초과의 HMO를 갖을 수 있고, 하나 이상의 HMO는 본원에 기술된 미생물 또는 방법에 의해 생산될 수 있다. 일정 경우에, HMO는 2'-퓨코실락토스 (2'-FL), 3'-퓨코실락토스 (3'-FL), 3'-시아릴락토스 (3'-SL), 6'-시아릴락토스 (6'-SL), 락토-N-네오테트라오스 (LNnT), 락토-N-테트라오스 (LNT), 시아릴락토-N-테트라오스 a (LST a), 시아릴락토-N-네오테트라오스 c (LST c), 락토-디퓨코테트라오스 (LDFT) 또는 락토-N-퓨코펜타오스 I (LNFP I), 또는 이들의 임의의 조합이다.
예시적인 구현예
일정 구현예에서, HMO의 생산을 위해 조작된 미생물은 다음 중 하나 이상의 유전전 변형을 포함한다:
(a) GFS 효소를 생산하는 유전적 변형;
(b) GMD 효소를 생산하는 유전적 변형;
(c) FT 효소를 생산하는 유전적 변형;
(d) GFS, GMD 및 FT 효소의 임의의 조합을 생산하는 유전적 변형;
(e) HMO의 외수송을 위한 운반체, 예를 들면 CDT-1 또는 당 기질 결합 포켓 및/또는 PESPR 모티브 근처에 있는 것으로 예측되는, 위치 G336, Q337, N341 및 G471와 같은 하나 이상의 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 변화인, CDT-1 N209S F262Y, CDT-1 G91A, CDT-1 F213A, CDT-1 L256V, CDT-1 F335A, CDT-1 S411A, CDT-1 N209S F262W 중 하나와 같은 CDT-1 변이체를 생산하는 유전적 변형;
(f) GMD, GFS, FT 효소 및 HMO의 외수송을 위한 운반체, 예를 들면 CDT-1 또는 CDT-1 N209S F262Y, CDT-1 G91A, CDT-1 F213A, CDT-1 L256V, CDT-1 F335A, CDT-1 S411A, CDT-1 N209S F262W 중 하나와 같은 CDT-1 변이체의 임의의 조합을 생산하는 유전적 변형;
(g) 구현예 (a) 내지 (f)의 임의의 조합으로, CDT-1는 당 기질 결합 포켓 및/또는 PESPR 모티브 근처에 있는 것으로 예측되는, 위치 G336, Q337, N341 및 G471와 같은 하나 이상의 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 변화를 갖을 수 있는 유전적 변형;
(h) HMO의 생산을 위해 락토스와 같은 기질의 내수송을 위한 운반체, 예를 들면 Lac12, CDT-1 또는 이의 변이체 또는 유사체를 생산하는 유전적 변형;
(i) HMO의 생산을 위해 GMD, GFS, FT 효소 및 락토스와 같은 기질의 내수송을 위한 운반체, 예를 들면 Lac12, CDT-1 또는 이의 변이체 또는 유사체의 임의의 조합을 생산하는 유전적 변형;
(j) HMO의 생산을 위해 GMD, GFS, FT 효소, 락토스와 같은 기질의 내수송을 위한 운반체, 예를 들면 Lac12, CDT-1 또는 이의 변이체 또는 유사체 및 HMO의 외수송을 위한 운반체, 예를 들면 CDT-1 또는 CDT-1 N209S F262Y, CDT-1 G91A, CDT-1 F213A, CDT-1 L256V, CDT-1 F335A, CDT-1 S411A, CDT-1 N209S F262W 중 하나와 같은 CDT-1 변이체의 임의의 조합을 생산하는 유전적 변형;
(k) 락토스와 같은 HMO의 생산을 위해 유전적으로 변형된 미생물에게 기질을 공급하고, (a) 내지 (j) 중 하나 이상의 변형;
(l) 유전적으로 조작된 미생물에서 HMO의 생산, 여기서 HMO는 2'-퓨코실락토스 (2'-FL), 3'-퓨코실락토스 (3'-FL), 3'-시아릴락토스 (3'-SL), 6'-시아릴락토스 (6'-SL), 락토-N-네오테트라오스 (LNnT), 락토-N-테트라오스 (LNT), 시아릴락토-N-테트라오스 a (LST a), 시아릴락토-N-네오테트라오스 c (LST c), 락토-디퓨코테트라오스 (LDFT) 또는 락토-N-퓨코펜타오스 I (LNFP I)과 같은 락토스 코아를 포함하는 분지되지 않은 HMO이고;
(m) 임의의 (a) 내지 (l), 여기서 미생물은 사카로마이세스 종, 스키조사카로마이세스 종, 트리코더마, 클루이베로마이세스, 야로위야, 아스퍼질러스 및 뉴로스포라를 포함하나 이에 한정되지 않는 아스코마이세테스 진균이다.
실시예
실시예 1: GMD, GFS 및/또는 FT를 발현하는
사카로마이세스 세레비시애
에서 개선된 2'-FL 생산
효소 GMD, GFS 및 FT에 대한 잘 알려진 활성을 부여하는 발현 벡터 (GMD_t, GFS_t 및 FT_t로 명명됨)를 효모 사카로마이세스 세레비시애에서 발현을 위해 생성하였다. 선별 압력 하에, 이들 발현 벡터는 세포 당 수십개의 사본로 발생하는 것으로 여겨지고, 따라서 유전자를 보유하는 플라스미드의 발현이 비슷한 프로모터가 사용되는 경우에 단일한 게놈 유전자좌보다 더 높은 것 같다.
다음으로 이종유래 GMD, GFS 또는 FT 유전자를 발현하는 구조물은 효소적 활성이 테스트되었던 유전자로 모두 포함하는 플라스미드로 공동-형질전환되었다. 수여체 균주는 락토스 상에서 성장시킨 경우 2'-FL의 낮은 역가를 생산하는 유전적으로 변형된 사카로마이세스 세레비시애 균주이었다. 또한, 균주는 도 8에 나타낸 바와 같이 락토스의 내수송 개선을 위해 클루이베로마이세스 락티스로부터 나온 Lac12를 그리고 2'-FL의 외수송 개선을 위해 조작된 올리고당 운반체를 발현한다.
플라스미드 GMD_t, GFS_t 및 FT_t의 도입 이후에, 2'-FL의 더 높은 발현이 생성되었다. 기본 균주가 류신, 히스티딘 및 우라실의 합성에 대해 종속영양성이었던 반면, 플라스미드는 각 화합물에 대한 종속영양성을 각각 회복시키는 개별 유전자 카세트를 보유하였다.
하나의 플라스미드를 생략하면 수여체 균주와 유사한 2'-FL 생산율을 회복하였으며, 역으로 이러한 효소 활성의 부족을 기능적으로 보상할 수 있는 단백질을 인코딩하는 유전자의 추가적인 발현은 2'-FL 생산을 증가시킬 것이다.
추정된 GFS를 GMD_t 및 FT_t를 포함하는 발현 구조물과 함께 추정된 GFS 유전자를 포함하는 발현 구조물을 형질전환시킴으로써 테스트하였다. 형질전환 이후에, 세포를 형질전환된 플라스미드가 종속영양성을 부여하는 화합물을 생략한 각 배지 상에서 선별하였다.
형질전환 이후에 형성되는 콜로니를 결핍 배지 (형질전환된 플라스미드가 종속영양성을 부여하는 화합물을 생략함)에서 밤새 30℃에서 250 rpm 진탕하면서 성장시켰다. 다음으로 세포를 YPD 0.4 L 배지로 이동시켰으며, 이는 0.4 g/L 락토스 및 4 g/L 포도당을 갖는 YPD이고, 동일한 조건 하에 6일 동안 배양하였다. 상청액을 HPLC 분석법에 의해 분석하였다.
도 9는 플라스미드로부터 CDT-1 M7, GMD 및 WcaG도 발현하는 효모 균주에게상이한 유기체로부터 나온 이종유래 퓨코실 전이효소(FT)를 도입함으로써 2'-FL 생산을 나타낸다. Ctrl은 FT 발현이 없는 대조군 균주이다.
도 10은 더 적은 양의 2'-FL을 생산할 수 있는 기본 균주를 GMD, WcaG 및 WbgL로 구성된 혼입된 2'-FL 경로와 비교한 2'-FL 형성을 나타낸다. GMD, FT를 갖는 플라스미드 및 서열번호 20, 21, 22 및 23으로부터 각각 선택된 GFS를 발현하는 플라스미드를 발현하는 균주는 기본 균주보다 유의하게 더 많은 2'-FL을 생산하였다.
마찬가지로, 추정된 FT를 GMD_t 및 GFS_t를 포함하는 발현 구조물을 제조함으로써 테스트하였다. 서열번호 38, 29, 30, 31, 32 및 40으로부터 선택된 퓨코스 전이효소 중 하나를 각각 보유하는 추가적인 플라스미드가 이들 형질전환 각각에 포함되었다. 세포를 발현 플라스미드 GMD_t 및 GFS_t 그리고 서열번호 38, 29, 30, 31, 32 및 40으로부터 선택된 FT 중 하나를 각각 보유하는 발현 플라스미드로 형질전환하였다.
도 11은 다양한 FT를 발현하는 균주가 기본 균주와 비교하여 더 많은 2'-FL을 축적하는 것을 나타낸다.
서열번호 24에 의해 예시되는 효소의 활성을 테스트하였다. 이 효소는 2개의 모듈, GDP-만노스 탈수화효소와 상동성을 갖는 하나 및 GDP 퓨코스 합성효소와 상동성을 공유하는 하나로 구성된다. 따라서, GMD 및 GFS 둘 다를 포함하는 효소는 GDP 만노스, NADPH+ 및 GTP로부터 GDP 퓨코스를 생산할 수 있을 것이다.
상기에 기술된 바와 같은 낮은 수준의 2'-FL 생합성을 할 수 있는 기본 균주를 (i) GMD, FT 및 서열번호 24 및 (ii) 단지 FT 및 서열번호 24을 발현하는 플라스미드로 형질전환하였다. 세포를 상기와 같이 형질전환하고, 선별하고, 성장시켰다. 기본 균주와 비교하여, 둘 다의 조합은 추가적인 플라스미드의 발현이 없는 기본 균주와 비교할 때 더 높은 2'-FL 생산을 수득하였다. 퓨코스 합성효소를 발현하는 추가적인 플라스미드의 부재 하에 서열번호 24를 발현하는 플라스미드의 추가는 기본 균주와 비교하여 2'-FL 생산을 유의하게 증가시킨다. FT 및 서열번호 24를 보유하는 플라스미드에 추가하여 GMD 유전자를 보유하는 플라스미드의 발현은 2'-FT 생산을 추가로 증가시킨다.
도 12는 한 세트의 게놈 GMD, GFS 및 FT 유전자를 포함하는 기본 균주와 비교하여, (제 1 컬럼) GMD, FT 및 서열번호 24를 갖는 플라스미드 및 (제 2 컬럼) FT 및 서열번호 24만을 갖는 플라스미드를 발현하는 효모 세포에서 2'-FL의 상대적인 생산을 나타낸다.
발효 및 대사물 분석
단일 콜로니의 세 벌을 10 mL YPD에 접종하였고, 30℃에서 밤새 배양하였다. 최종 발효 배지는 YPDL 배지에서 10 mL이었다. 세포를 30℃ 및 250 rpm에서 120시간 동안 배양하였다. 락토스 농도를 Rezex ROA-유기산 H 10 × 7.8 mm 컬럼이 장착된 프로미넌스 HPLC (시마주사, 일본 교토) 상의 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 결정하였다. 컬럼을 0.005 N 황산으로 0.6 mL/분 유속, 50℃에서 용리하였다. 2'-FL 농도를 CarboPac PA20 컬럼이 장착된 ICS-3000 이온 크로마토그래피 시스템 (디오넥스사, 미국 CA 서니베일)을 사용하여 측정하였다. 컬럼을 KOH 구배로 0.4 mL/분의 유속, 30℃에서 용리하였다.
실시예 2: 2'-FL 생합성이 결여된
사카로마이세스 세레비시애
에서 GMD, GFS, 및/또는 FT를 발현시킴으로써 2'-FL의 생산
도 8에 나타낸 바와 같이 락토스 내수송 개선을 위한 Lacl2 및 개선된 2'-FL 외수송을 위한 조작된 막 운반체를 단지 보유하는 기본 균주를 제조하였다. 그러나, 이 균주는 2'-FL 생합성을 위한 유전자가 결여되면서, 2'-FL 생합성도 개선시키지 못하였다. 이러한 기본 균주를 (i) 서열번호 17, (ii) 서열번호 18 및 (iii) 서열번호 19에 의해 인코딩되는 GMD를 발현하는 플라스미드로 형질전환하였다. 2'-FL는 이들 균주 모두에서 생산되었고, 서열번호 17, 18 및 19에 의해 각각 인코딩된 GMD가 효모 세포에서 발현될 때 모두 GMD 활성을 제공하는 것을 나타낸다.
도 13은 달리 2'-FL 생산을 할 수 없는 대조군 균주 (Ctrl)에서 플라스미드 발현에 의한 2'-FL의 생산을 나타낸다. 균주를 각각 서열번호 17, 18 또는 19 중 어느 하나를 보유하는 플라스미드와 함께 GFS 및 FT를 발현하는 플라스미드로 형질전환하였다. 플라스미드를 보유하지 않는 대조군은 2'-FL를 생산하지 않는다.
실시예 3: CDT-1 N209S/F262Y를 발현하는
사카로마이세스 세레비시애
에서 2'-FL 생산의 증가
균주 및 배지
S. 세레비시애를 YPD 배지 (10 g/L 효모 추출물, 20 g/L 펩톤, 20 g/L 포도당) 상에서 30℃에 성장시키고, 유지하였다. 모든 유전자는 염색체상으로 발현되었다. cdt-1sy 유전자 (CDT-1 N209S/F262Y를 인코딩함)는 2'-FL를 생산하는 배경 균주 내에서 발현되었고, 발효 실험 동안 성장 배지에서 2'-FL 축적을 cdt-1sy 유전자가 없는 동일한 균주로부터 생산된 2'-FL 생산과 비교하였다.
균주를 이용한 2'-FL 생산은 GDP-만노스 4, 6-탈수화효소 (gmd1), GDP-L-퓨코스 합성효소 (wcaG), 락토스 퍼미아제 (LAC12) 및 2개의 퓨코실 전이효소 (FucT2, wbgL)를 포함한다.
실험을 YPD 배지 (10 g/L 효모 추출물, 20 g/L 펩톤, 30 g/L 포도당, 2 g/L 락토스)에서 30℃에 시행하였다.
발효 및 대사물 분석
단일 콜로니의 세 벌을 10 mL YPD에 접종하였고, 30℃에서 밤새 배양하였다. 최종 발효 배지는 YPDL 배지에서 10 mL이었다. 세포를 30℃ 및 250 rpm에서 120시간 동안 배양하였다. 락토스 농도를 Rezex ROA-유기산 H 10 × 7.8 mm 컬럼이 장착된 프로미넌스 HPLC (시마주사, 일본 교토) 상의 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 결정하였다. 컬럼을 0.005 N 황산으로 0.6 mL/분 유속, 50℃에서 용리하였다. 2'-FL 농도를 CarboPac PA20 컬럼이 장착된 ICS-3000 이온 크로마토그래피 시스템 (디오넥스사, 미국 CA 서니베일)을 사용하여 측정하였다. 컬럼을 KOH 구배로 0.4 mL/분의 유속, 30℃에서 용리하였다.
cdt-1sy 유전자 (CDT-1 N209S/F262Y를 인코딩함)는 2'-FL를 생산하는 배경 균주 내에서 발현되었고, 발효 실험 동안 성장 배지에서 2'-FL 축적을 cdt-1sy 유전자가 없는 동일한 균주로부터 생산된 2'-FL 생산과 비교하였다.
예기치 못하게도, CDT-1 N209S/F262Y의 발현은 성장 배지 내에서 2'-FL의 축적을 유의하게 증가시켰고, CDT-1SY가 효율적인 기질 외수송체로서 작용할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4: CDT-1 돌연변이체를 발현하는
사카로마이세스 세레비시애
에서 2'-FL 생산의 증가
균주 및 배지
2'-FL 생산하는 S. 세레비시애 균주는 게놈 혼입된 Lac12 또는 운반체로서 CDT-1 및 GDP-만노스 4, 6-탈수화효소 (gmd1), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스 3,5-에피머라제-4-환원효소 (wcaG) 및 퓨코실 전이효소 (wbgL)로 구성된 플라스미드 pRS424 및 pRS426 상의 2'-FL 생산 경로를 포함한다.
초기에 S. 세레비시애를 YPD 배지 (10 g/L 효모 추출물, 20 g/L 펩톤, 20 g/L 포도당)에서 30℃에 성장시키고, 유지하였다. 20 g/L 포도당을 갖는 최적화된 최소 배지 (oMM) (Lin Y. et al, Biotechnol. Biofuels. 2014년 8월 27일; 7(l): 126) 참조)를 효모 세포의 사전 배양에 사용하였다. 60 g/L 포도당 및 6 g/L 락토스 (V60D6L)를 갖는 베르듄 배지 (Verduyn et al, Yeast. 1992년 7월; 8(7): 50l-l7 참조, 월드와이드 웹 apz-rl.de/002_download/003_mitgeltende_dokumente/0l2_Verduyn-Medium_002.pdf 참조)를 2'-FL 생산에 사용하였다.
락토스 흡수 테스트
락토스 흡수를 측정하기 위하여, 상이한 운반체를 갖는 효모 균주를 4 mL YPD 배지에서 밤새 30℃ 및 250 rpm에서 성장시켰다. 운반체가 없는 야생형 효모 균주를 대조군으로 사용하였다. 세포 밀도를 플레이트 판독기에 의해 측정하였고, 건조 세포 중량 (DCW)으로 변환하였다. 세포 배양물을 물에 세척하고, 락토스 용액에 재현탁하였다. 상청액을 HPLC에 의해 분석하고, 락토스 흡수를 DCW로 정규화하였다. CDT-1 돌연변이체를 발현하는 균주로부터 나온 락토스 흡수를 야생형 CDT-1을 발현하는 균주로부터 나온 락토스 흡수로 정규화하였으며, 도 3 및 도 4에 상대값으로서 나타낸다.
발효 및 대사물 분석
단일 콜로니의 세 벌을 20 g/L 포도당을 갖는 10 mL oMM 배지에 접종하고, 30℃에서 밤새 배양하였다. 세포 배양물을 원심분리하고, 10 mL V60D6L 배지에 재현탁하고, 30℃ 및 250 rpm에서 48시간 동안 배양하였다. 세포외 락토스, 포도당 및 2'-FL 농도를 Rezex ROA-유기산 H 10 × 7.8 mm 컬럼 및 반사 인덱스 검출기 (RID)가 장착된 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 결정하였다. 컬럼을 0.005 N 황산으로 0.6 mL/분 유속, 50℃에서 용리하였다. 총 (세포내 및 세포외) 2'-FL를 측정하기 위하여, 효모 세포를 포함하는 발효 배양액을 가열하여 세포내 2'-FL를 모두 방출시켰다. 다음으로 상청액을 HPLC에 의해 분석하였다.
도 5 내지 도 7에서 백분율로 나타낸 세포외 및 총 2'-FL 역가를 야생형 CDT-1을 갖는 균주의 역가로 정규화하였다. 세포외 2'-FL 비율(%)은 다음과 같이 계산하였다: (세포외 2'-FL 역가) / (총 2'-FL 역가) × 100%.
참고문헌에 의한 통합
본원에 인용된 특허, 공개된 특허출원 및 비-특허 참고문헌 각각은 본원에 이들의 전문이 참고문헌으로 통합된다.
등가물
당업자라면 단지 일상적인 실험법을 사용하여 본원에 기술된 상세한 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 확증할 수 있다. 이러한 등가물은 다음의 청구항에 의해 포괄하려고 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> ZIMITECH, INC.
<120> USE OF SUBSTRATE IMPORTERS FOR THE EXPORT OF
OLIGOSACCHARIDES
<130> ZTW-00225
<140> PCT/US2019/054258
<141> 2019-10-02
<150> 62/801,755
<151> 2019-02-06
<150> 62/740,049
<151> 2018-10-02
<160> 73
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 579
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 1
Met Ser Ser His Gly Ser His Asp Gly Ala Ser Thr Glu Lys His Leu
1 5 10 15
Ala Thr His Asp Ile Ala Pro Thr His Asp Ala Ile Lys Ile Val Pro
20 25 30
Lys Gly His Gly Gln Thr Ala Thr Lys Pro Gly Ala Gln Glu Lys Glu
35 40 45
Val Arg Asn Ala Ala Leu Phe Ala Ala Ile Lys Glu Ser Asn Ile Lys
50 55 60
Pro Trp Ser Lys Glu Ser Ile His Leu Tyr Phe Ala Ile Phe Val Ala
65 70 75 80
Phe Cys Cys Ala Cys Ala Asn Gly Tyr Asp Gly Ser Leu Met Thr Gly
85 90 95
Ile Ile Ala Met Asp Lys Phe Gln Asn Gln Phe His Thr Gly Asp Thr
100 105 110
Gly Pro Lys Val Ser Val Ile Phe Ser Leu Tyr Thr Val Gly Ala Met
115 120 125
Val Gly Ala Pro Phe Ala Ala Ile Leu Ser Asp Arg Phe Gly Arg Lys
130 135 140
Lys Gly Met Phe Ile Gly Gly Ile Phe Ile Ile Val Gly Ser Ile Ile
145 150 155 160
Val Ala Ser Ser Ser Lys Leu Ala Gln Phe Val Val Gly Arg Phe Val
165 170 175
Leu Gly Leu Gly Ile Ala Ile Met Thr Val Ala Ala Pro Ala Tyr Ser
180 185 190
Ile Glu Ile Ala Pro Pro His Trp Arg Gly Arg Cys Thr Gly Phe Tyr
195 200 205
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210 215 220
Gly Cys Tyr Phe Ile Lys Ser Asn Trp Ser Trp Arg Ile Pro Leu Ile
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Leu Gln Ala Phe Thr Cys Leu Ile Val Met Ser Ser Val Phe Phe Leu
245 250 255
Pro Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Phe Ala Asn Gly Arg Asp Ala Glu Ala
260 265 270
Val Ala Phe Leu Val Lys Tyr His Gly Asn Gly Asp Pro Asn Ser Lys
275 280 285
Leu Val Leu Leu Glu Thr Glu Glu Met Arg Asp Gly Ile Arg Thr Asp
290 295 300
Gly Val Asp Lys Val Trp Trp Asp Tyr Arg Pro Leu Phe Met Thr His
305 310 315 320
Ser Gly Arg Trp Arg Met Ala Gln Val Leu Met Ile Ser Ile Phe Gly
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Gln Phe Ser Gly Asn Gly Leu Gly Tyr Phe Asn Thr Val Ile Phe Lys
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Asn Ile Gly Val Thr Ser Thr Ser Gln Gln Leu Ala Tyr Asn Ile Leu
355 360 365
Asn Ser Val Ile Ser Ala Ile Gly Ala Leu Thr Ala Val Ser Met Thr
370 375 380
Asp Arg Met Pro Arg Arg Ala Val Leu Ile Ile Gly Thr Phe Met Cys
385 390 395 400
Ala Ala Ala Leu Ala Thr Asn Ser Gly Leu Ser Ala Thr Leu Asp Lys
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Lys Gly Ala Leu Ala Ala Tyr Phe Leu Phe Asn Val Ile Phe Ser Phe
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Thr Tyr Thr Pro Leu Gln Gly Val Ile Pro Thr Glu Ala Leu Glu Thr
465 470 475 480
Thr Ile Arg Gly Lys Gly Leu Ala Leu Ser Gly Phe Ile Val Asn Ala
485 490 495
Met Gly Phe Ile Asn Gln Phe Ala Gly Pro Ile Ala Leu His Asn Ile
500 505 510
Gly Tyr Lys Tyr Ile Phe Val Phe Val Gly Trp Asp Leu Ile Glu Thr
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Val Ala Trp Tyr Phe Phe Gly Val Glu Ser Gln Gly Arg Thr Leu Glu
530 535 540
Gln Leu Glu Trp Val Tyr Asp Gln Pro Asn Pro Val Lys Ala Ser Leu
545 550 555 560
Lys Val Glu Lys Val Val Val Gln Ala Asp Gly His Val Ser Glu Ala
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<211> 579
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 2
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Thr Ile Arg Gly Lys Gly Leu Ala Leu Ser Gly Phe Ile Val Asn Ala
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Gly Tyr Lys Tyr Ile Phe Val Phe Val Gly Trp Asp Leu Ile Glu Thr
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Lys Val Glu Lys Val Val Val Gln Ala Asp Gly His Val Ser Glu Ala
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<212> PRT
<213> Neurospora crassa
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Val Ala Ser Ser Ser Lys Leu Ala Gln Phe Val Val Gly Arg Phe Val
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500 505 510
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515 520 525
Val Ala Trp Tyr Phe Phe Gly Val Glu Ser Gln Gly Arg Thr Leu Glu
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Ile Val Ala
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<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
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100 105 110
Gly Pro Lys Val Ser Val Ile Phe Ser Leu Tyr Thr Val Gly Ala Met
115 120 125
Val Gly Ala Pro Phe Ala Ala Ile Leu Ser Asp Arg Phe Gly Arg Lys
130 135 140
Lys Gly Met Phe Ile Gly Gly Ile Phe Ile Ile Val Gly Ser Ile Ile
145 150 155 160
Val Ala Ser Ser Ser Lys Leu Ala Gln Phe Val Val Gly Arg Phe Val
165 170 175
Leu Gly Leu Gly Ile Ala Ile Met Thr Val Ala Ala Pro Ala Tyr Ser
180 185 190
Ile Glu Ile Ala Pro Pro His Trp Arg Gly Arg Cys Thr Gly Phe Tyr
195 200 205
Ser Cys Gly Trp Phe Gly Gly Ser Ile Pro Ala Ala Cys Ile Thr Tyr
210 215 220
Gly Cys Tyr Phe Ile Lys Ser Asn Trp Ser Trp Arg Ile Pro Leu Ile
225 230 235 240
Leu Gln Ala Phe Thr Cys Leu Ile Val Met Ser Ser Val Phe Phe Leu
245 250 255
Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Phe Ala Asn Gly Arg Asp Ala Glu Ala
260 265 270
Val Ala Phe Leu Val Lys Tyr His Gly Asn Gly Asp Pro Asn Ser Lys
275 280 285
Leu Val Leu Leu Glu Thr Glu Glu Met Arg Asp Gly Ile Arg Thr Asp
290 295 300
Gly Val Asp Lys Val Trp Trp Asp Tyr Arg Pro Leu Phe Met Thr His
305 310 315 320
Ser Gly Arg Trp Arg Met Ala Gln Val Leu Met Ile Ser Ile Phe Gly
325 330 335
Gln Phe Ser Gly Asn Gly Leu Gly Tyr Phe Asn Thr Val Ile Phe Lys
340 345 350
Asn Ile Gly Val Thr Ser Thr Ser Gln Gln Leu Ala Tyr Asn Ile Leu
355 360 365
Asn Ser Val Ile Ser Ala Ile Gly Ala Leu Thr Ala Val Ser Met Thr
370 375 380
Asp Arg Met Pro Arg Arg Ala Val Leu Ile Ile Gly Thr Phe Met Cys
385 390 395 400
Ala Ala Ala Leu Ala Thr Asn Ser Gly Leu Ser Ala Thr Leu Asp Lys
405 410 415
Gln Thr Gln Arg Gly Thr Gln Ile Asn Leu Asn Gln Gly Met Asn Glu
420 425 430
Gln Asp Ala Lys Asp Asn Ala Tyr Leu His Val Asp Ser Asn Tyr Ala
435 440 445
Lys Gly Ala Leu Ala Ala Tyr Phe Leu Phe Asn Val Ile Phe Ser Phe
450 455 460
Thr Tyr Thr Pro Leu Gln Gly Val Ile Pro Thr Glu Ala Leu Glu Thr
465 470 475 480
Thr Ile Arg Gly Lys Gly Leu Ala Leu Ser Gly Phe Ile Val Asn Ala
485 490 495
Met Gly Phe Ile Asn Gln Phe Ala Gly Pro Ile Ala Leu His Asn Ile
500 505 510
Gly Tyr Lys Tyr Ile Phe Val Phe Val Gly Trp Asp Leu Ile Glu Thr
515 520 525
Val Ala Trp Tyr Phe Phe Gly Val Glu Ser Gln Gly Arg Thr Leu Glu
530 535 540
Gln Leu Glu Trp Val Tyr Asp Gln Pro Asn Pro Val Lys Ala Ser Leu
545 550 555 560
Lys Val Glu Lys Val Val Val Gln Ala Asp Gly His Val Ser Glu Ala
565 570 575
Ile Val Ala
<210> 16
<211> 1740
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 16
atgtcctctc atggttctca tgatggtgct tctactgaaa aacatttggc cactcatgat 60
attgctccaa ctcatgatgc tatcaagatc gtgcccaagg gccatggcca gacagccaca 120
aagcccggcg cccaagagaa ggaggtccgc aacgccgccc tatttgcggc catcaaggag 180
tccaatatca agccctggag caaggagtcc atccacctct atttcgccat cttcgtcgcc 240
ttttgttgtg catgcgccaa cggttacgat ggttcactca tgaccggaat catcgctatg 300
gacaagttcc agaaccaatt ccacactggt gacactggtc ctaaagtctc tgtcatcttt 360
tctctctata ccgtgggtgc catggttgga gctcccttcg ctgctatcct ctctgatcgt 420
tttggccgta agaagggcat gttcatcggt ggtatcttta tcattgtcgg ctccattatt 480
gttgctagct cctccaagct cgctcagttt gtcgttggcc gcttcgttct tggcctcggt 540
atcgccatca tgaccgttgc tgccccggcc tactccatcg aaatcgcccc tcctcactgg 600
cgcggccgct gcactggctt ctacagctgc ggttggttcg gaggttcgat tcctgccgcc 660
tgcatcacct atggctgcta cttcattaag agcaactggt catggcgtat ccccttgatc 720
cttcaggctt tcacgtgcct tatcgtcatg tcctccgtct tcttcctccc agaatcccct 780
cgctacctat ttgccaacgg ccgcgacgct gaggctgttg cctttcttgt caagtatcac 840
ggcaacggcg atcccaattc caagctggtg ttgctcgaga ctgaggagat gagggacggt 900
atcaggaccg acggtgtcga caaggtctgg tgggattacc gcccgctctt catgacccac 960
agcggccgct ggcgcatggc ccaggtgctc atgatctcca tctttggcca gttctccggc 1020
aacggtctcg gttacttcaa taccgtcatc ttcaagaaca ttggtgtcac cagcacctcc 1080
caacagctcg cctacaacat cctcaactcc gtcatctccg ctatcggtgc cttgaccgcc 1140
gtctccatga ctgatcgtat gccccgccgc gcggtgctca ttatcggtac cttcatgtgc 1200
gccgctgctc ttgccaccaa ctcgggtctt tcggctactc tcgacaagca gactcaaaga 1260
ggcacgcaaa tcaacctgaa ccagggtatg aacgagcagg atgccaagga caacgcctac 1320
ctccacgtcg acagcaacta cgccaagggt gccctggccg cttacttcct cttcaacgtc 1380
atcttctcct tcacctacac tcccctccag ggtgttattc ccaccgaggc tctcgagacc 1440
accatccgtg gcaagggtct tgccctttcc ggcttcattg tcaacgccat gggcttcatc 1500
aaccagttcg ctggccccat cgctctccac aacattggct acaagtacat ctttgtcttt 1560
gtcggctggg atcttatcga gaccgtcgct tggtacttct ttggtgtcga atcccaaggc 1620
cgtaccctcg agcagctcga atgggtctac gaccagccca accccgtcaa ggcctcccta 1680
aaagtcgaaa aggtcgtcgt ccaggccgac ggccatgtgt ccgaagctat cgttgcttaa 1740
<210> 17
<211> 362
<212> PRT
<213> Fistularia solaris
<400> 17
Met Ser Ser Glu Arg Lys Cys Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr Gly Gln
1 5 10 15
Asp Gly Ser Tyr Leu Thr Glu Leu Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Glu Val
20 25 30
His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Cys Phe Asn Thr Gly Arg Ile Asp
35 40 45
His Leu Tyr Lys Asp Arg His Glu Thr Gly Val Lys Leu Phe Leu His
50 55 60
Tyr Gly Asp Leu Cys Asp Ala Thr Asn Leu Ile Ser Ile Ile Ser Asn
65 70 75 80
Val Lys Pro Thr Glu Val Tyr Asn Leu Gly Ala Met Ser His Val Lys
85 90 95
Val Ser Phe Asp Met Pro Glu Tyr Thr Ala Asp Cys Asp Gly Val Gly
100 105 110
Val Leu Arg Met Leu Asp Ala Ile Arg Ala Ala Gly Met Glu Lys Thr
115 120 125
Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Lys Val Gln
130 135 140
Glu Val Pro Gln Ser Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg Ser Pro Tyr
145 150 155 160
Ala Val Ala Lys Gln Tyr Ala Phe Trp Ile Leu Val Asn Tyr Arg Glu
165 170 175
Ala Tyr Gly Met His Leu Thr Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser
180 185 190
Pro Arg Arg Gly Arg Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Cys Gly Val
195 200 205
Ala Ala Ile His His Gly Lys Gln Lys Thr Leu Phe Leu Gly Asn Leu
210 215 220
Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Arg Asp Tyr Val Glu Gly Met
225 230 235 240
Trp Arg Met Leu Gln Gln Glu Thr Ser Asp Asp Tyr Val Leu Ala Thr
245 250 255
Gly Glu Thr His Thr Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ala Phe Ala Val
260 265 270
Val Asn Thr Thr Val Gln Trp Gln Gly Glu Lys Gly Thr Val Asp Glu
275 280 285
Val Gly Val Asp Ala Ala Asp Pro Ser Arg Ile Leu Val Arg Ile Asp
290 295 300
Pro Arg Tyr Phe Arg Pro Thr Glu Val Asp Leu Leu Leu Gly Asn Pro
305 310 315 320
Ala Lys Ala Lys Glu Lys Leu Gly Trp Ser Ser Ser Thr Pro Phe Asp
325 330 335
Ala Leu Val Lys Glu Met Val Glu Ala Asp Leu Ala Ile Leu Arg Gly
340 345 350
Glu Met Ala Asp Ala Asp Asn Thr Phe Asp
355 360
<210> 18
<211> 366
<212> PRT
<213> Cladosiphon okamuranus
<400> 18
Met Ala Glu Pro Glu Thr Lys Lys Thr Lys Val Asp Glu Gly Thr Val
1 5 10 15
Lys Lys Ala Ile Ile Thr Gly Ile Thr Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu
20 25 30
Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Glu Val His Gly Ile Ile Arg
35 40 45
Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gln Arg Ile Asp His Ile Tyr Arg Asp
50 55 60
Arg His Glu Ser Ala Val Arg Leu Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr
65 70 75 80
Asp Ser Thr Asn Leu Met His Ile Ile Tyr Glu Val Gln Pro Asp Glu
85 90 95
Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Met Ser His Val Lys Val Ser Phe Glu Met
100 105 110
Ser Glu Tyr Thr Ala Glu Ala Asp Gly Val Gly Val Leu Arg Leu Leu
115 120 125
Asn Ala Ile Arg Ser Ala Gly Leu Glu Lys Lys Thr Arg Leu Tyr Gln
130 135 140
Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys
145 150 155 160
Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg Ser Pro Tyr Gly Val Ala Lys Gln
165 170 175
Phe Gly Tyr Trp Met Leu Ile Asn Tyr Arg Glu Ala Tyr Gly Met His
180 185 190
Leu Thr Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Pro
195 200 205
Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Arg Ala Val Ala Arg Ile His Arg
210 215 220
Gly Lys Gln Lys Cys Ile Tyr Leu Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp
225 230 235 240
Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Ile Lys Gly Met Trp Leu Met Val Gln
245 250 255
Arg Asp Glu Pro Ser Asp Tyr Val Leu Ser Thr Gly Glu Cys His Ser
260 265 270
Val Lys Glu Phe Val Gln Glu Ala Phe Ala Tyr Val Gly Ile Asp Ile
275 280 285
Thr Trp Val Gly Glu Gly Val Glu Glu Tyr Gly His Val Lys Gly Asp
290 295 300
Pro Glu Asn Val Leu Val Arg Val Asp Pro Arg Tyr Phe Arg Pro Thr
305 310 315 320
Glu Val Glu Leu Leu Leu Gly Asp Cys Thr Lys Ala Lys Lys Glu Leu
325 330 335
Gly Trp Val Pro Glu Ile Thr Phe Lys Glu Leu Val Lys Asp Met Met
340 345 350
Gln Ala Asp Ile Ala Asn Val Asp Ala Gly Asn Asp His Thr
355 360 365
<210> 19
<211> 360
<212> PRT
<213> Cladosiphon okamuranus
<400> 19
Met Gln Lys Thr Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr Gly Gln Asp Gly Ala
1 5 10 15
Tyr Leu Ala Glu Leu Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Thr Val His Gly Ile
20 25 30
Lys Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg Ile Asp His Leu Tyr
35 40 45
Gln Asp Pro His Asp Arg Asp Val Lys Leu His Leu His Tyr Gly Asp
50 55 60
Met Thr Asp Ser Thr Asn Leu Ile Arg Ile Met Gln Glu Thr Gln Pro
65 70 75 80
Asp Glu Val Tyr Asn Leu Ala Ala Gln Ser His Val Gln Val Ser Phe
85 90 95
Glu Thr Pro Glu Tyr Thr Gly Asn Ala Asp Ala Leu Gly Thr Leu Arg
100 105 110
Leu Leu Glu Ala Ile Arg Leu Leu Gly Leu Ser Glu Lys Thr Arg Phe
115 120 125
Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Lys Val Gln Glu Val Pro
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg Ser Pro Tyr Ala Ala Ala
145 150 155 160
Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn Tyr Arg Glu Ala Tyr Gly
165 170 175
Met His Ala Ser Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser Pro Ile Arg
180 185 190
Gly Glu Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Arg Ala Ala Ala Ala Ile
195 200 205
Lys Leu Gly Leu Gln Asp Lys Leu Tyr Leu Gly Asn Leu Asp Ala Glu
210 215 220
Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val Arg Gly Met Trp Leu Met
225 230 235 240
Leu Gln Gln Asp Lys Ala Asp Asp Tyr Val Leu Ala Thr Gly Glu Lys
245 250 255
His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Gln Ala Phe Ala Glu Leu Glu Ile
260 265 270
Asn Ile Arg Trp Glu Gly Arg Gly Leu Asp Glu Gln Gly Phe Asp Thr
275 280 285
Lys Thr Glu Lys Ala Val Val Ala Val Asp Pro Arg Tyr Phe Arg Pro
290 295 300
Thr Glu Val Asp Leu Leu Leu Gly Ser Pro Lys Lys Ala Arg Lys Ala
305 310 315 320
Leu Gly Trp Ala Pro Thr Thr Pro Phe Arg Asp Met Ile Lys Gln Met
325 330 335
Val Arg Ser Asp Leu Asn Ser Val Ser Glu Asp Ser Lys Lys Gly Ser
340 345 350
Gln Ala Ser Trp Ile Lys Thr Gly
355 360
<210> 20
<211> 271
<212> PRT
<213> Cladosiphon okamuranus
<400> 20
Met Glu Ala Thr Lys Ala Ile Phe Glu Lys Tyr Lys Pro Thr His Val
1 5 10 15
Ile His Leu Ala Ala Arg Val Gly Gly Leu Phe Ser Asn Leu Lys Tyr
20 25 30
Lys Val Glu Phe Phe Arg Glu Asn Ile Leu Ile Asn Asp Asn Val Met
35 40 45
Glu Cys Cys Arg Ile Tyr Lys Val Ala Lys Leu Val Ser Cys Leu Ser
50 55 60
Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu Thr Met
65 70 75 80
Val His Asn Gly Pro Pro His Thr Ser Asn Glu Gly Tyr Ala Tyr Ala
85 90 95
Lys Arg Met Ile Asp Val Leu Asn Arg Cys Tyr Lys Asp Glu Tyr Gly
100 105 110
Cys Asn Phe Thr Ser Val Ile Pro Thr Asn Ile Tyr Gly Lys Gly Asp
115 120 125
Asn Phe Ser Ile Asp Asn Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile His Lys
130 135 140
Cys Tyr Lys Ala Lys Gln Ala Gly Glu Asp Leu His Val Trp Gly Thr
145 150 155 160
Gly Ser Pro Leu Arg Gln Phe Ile Tyr Asn Val Asp Leu Gly Ala Leu
165 170 175
Met Val Trp Thr Met Arg Asn Tyr His Glu Val Asp Pro Ile Ile Leu
180 185 190
Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Ala Asp Ala Ala Lys Met
195 200 205
Ile Ala Ser Ala Met Asp Phe Glu Gly Asn Val Val Phe Asp Thr Asp
210 215 220
Lys Ser Asp Gly Gln Phe Lys Lys Thr Ala Cys Asn Asp Leu Leu Lys
225 230 235 240
Lys Lys Asn Pro Asp Phe Lys Phe Thr Ser Met Gln Asp Gly Leu Lys
245 250 255
Ala Ala Cys Asp Trp Phe Cys Glu Asn Phe Glu Thr Ala Arg Lys
260 265 270
<210> 21
<211> 311
<212> PRT
<213> Phaeodactylum tricornutum
<400> 21
Met Val Thr Gly Gly Ser Gly Leu Val Gly Ala Ala Ile Arg Glu Tyr
1 5 10 15
Val Glu Gly Thr Gly Ala Leu Glu Asn Glu Ser Trp Ile Tyr Leu Asn
20 25 30
Ser Lys Glu Gly Asp Leu Arg Asn Arg Ala Asp Thr Glu Lys Ile Phe
35 40 45
Ala Lys Tyr Gln Pro Thr His Val Ile His Leu Ala Ala Lys Val Gly
50 55 60
Gly Leu Phe Ala Asn Met Ala Gln Lys Val Glu Phe Phe Arg Glu Asn
65 70 75 80
Ile Leu Ile Asn Asp Asn Ile Met Glu Cys Ser Arg Ile Tyr Lys Val
85 90 95
Glu Lys Leu Val Ser Phe Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr
100 105 110
Thr Tyr Pro Ile Asp Glu Thr Met Leu His Asp Gly Pro Pro His Pro
115 120 125
Ser Asn Glu Gly Tyr Ala Tyr Ala Lys Arg Leu Ile Asp Thr Met Asn
130 135 140
Arg Ala Tyr Ala Glu Glu Tyr Gly Cys Asn Phe Thr Ser Ile Ile Pro
145 150 155 160
Thr Asn Ile Tyr Gly Pro His Asp Asn Phe Ser Ile Gln Asn Gly His
165 170 175
Val Ile Pro Gly Leu Ile His Lys Cys Tyr Leu Ala Lys Lys Asp Asn
180 185 190
Thr Pro Phe Thr Ile Trp Gly Ser Gly Thr Pro Leu Arg Gln Phe Val
195 200 205
Tyr Ser Arg Asp Leu Ala Glu Leu Thr Val Trp Val Met Arg Glu Tyr
210 215 220
His Asp Pro Thr Pro Ile Thr Leu Ser Val Asp Glu Glu Glu Glu Val
225 230 235 240
Ser Ile Lys Asp Val Ala Leu Ala Val Ala Lys Ala Met Gln Phe Asp
245 250 255
Gly Gln Ile Val Phe Asp Thr Ser Lys Ala Asp Gly Gln Phe Lys Lys
260 265 270
Thr Ala Cys Asn Lys Lys Leu Arg Ser Leu Lys Ala Asp Tyr Glu Phe
275 280 285
Thr Ser Met Pro Asp Gly Ile Gln Gln Ser Val Asp Trp Phe Val Ala
290 295 300
Asn Tyr Asp Ser Cys Arg Lys
305 310
<210> 22
<211> 327
<212> PRT
<213> Saccharina japonica
<400> 22
Met Ala Glu Thr Ser Gly Thr Asp Ala Ala Pro Lys Lys Val Val Met
1 5 10 15
Val Thr Gly Gly Thr Gly Leu Val Gly Cys Gly Ile Lys Glu Phe Val
20 25 30
Glu Ser Asp Ala Glu Ala Lys Glu Lys Glu Glu Tyr Ile Phe Leu Ser
35 40 45
Ser Lys Asp Gly Asp Ile Arg Asn Met Glu Glu Thr Lys Leu Ile Phe
50 55 60
Glu Lys Tyr Lys Pro Thr His Val Ile His Leu Ala Ala Arg Val Gly
65 70 75 80
Gly Leu Phe Ser Asn Leu Lys Tyr Lys Val Glu Phe Phe Arg Glu Asn
85 90 95
Ile Leu Ile Asn Asp Asn Val Met Glu Cys Cys Arg Ile Tyr Lys Val
100 105 110
Glu Lys Leu Val Ser Cys Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr
115 120 125
Thr Tyr Pro Ile Asp Glu Thr Met Val His Asn Gly Pro Pro His Val
130 135 140
Ser Asn Glu Gly Tyr Ala Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Leu Asn
145 150 155 160
Arg Cys Tyr Lys Glu Glu Tyr Gly Cys Asn Phe Thr Ser Val Ile Pro
165 170 175
Thr Asn Ile Tyr Gly Lys Gly Asp Asn Phe Ser Ile Asp Asn Gly His
180 185 190
Val Leu Pro Gly Leu Ile His Lys Cys Tyr Lys Ala Lys Gln Ala Gly
195 200 205
Glu Asp Leu His Val Trp Gly Thr Gly Ser Pro Leu Arg Gln Phe Ile
210 215 220
Tyr Asn Val Asp Leu Gly Ala Leu Met Ile Trp Thr Met Arg Asn Tyr
225 230 235 240
His Glu Val Asp Pro Ile Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val
245 250 255
Ser Ile Ala Asp Ala Ala Lys Met Ile Ala Ser Ala Met Asp Phe Glu
260 265 270
Gly Asn Val Val Phe Asp Thr Asp Lys Ser Asp Gly Gln Phe Lys Lys
275 280 285
Thr Ala Cys Asn Asp Leu Leu Lys Gln Lys Asn Pro Asp Phe Lys Phe
290 295 300
Thr Pro Met Lys Glu Gly Leu Lys Gln Ala Cys Glu Trp Phe Cys Glu
305 310 315 320
Asn Tyr Glu Thr Ala Arg Lys
325
<210> 23
<211> 323
<212> PRT
<213> Mucor circinelloides
<400> 23
Met Ala Thr Glu Ser Val Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Leu Val
1 5 10 15
Gly Glu Ala Val Lys Trp Val Ile Glu Asn Asp Lys Ser Glu Arg Tyr
20 25 30
Gly Lys Lys Glu Asn Glu Lys Trp Val Phe Leu Ser Ser Lys Asp Gly
35 40 45
Asp Leu Arg Lys Glu Gln Asp Val Lys Ala Ile Phe Glu Lys Tyr Lys
50 55 60
Pro Thr His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Lys
65 70 75 80
Asn Met Lys Tyr Lys Leu Asp Phe Leu Arg Glu Asn Met Leu Met Asn
85 90 95
Asp Asn Ile Leu Trp Gln Ser Lys Glu Tyr Asn Val Lys Lys Val Val
100 105 110
Ser Cys Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile
115 120 125
Asp Glu Thr Met Val His Asn Gly Pro Pro His Glu Ser Asn Phe Gly
130 135 140
Tyr Ala His Gly Lys Arg Met Ile Asp Val Tyr Asn His Ala Tyr His
145 150 155 160
Glu Gln Phe Gly Cys His Phe Thr Ser Val Ile Pro Thr Asn Ile Phe
165 170 175
Gly Pro His Asp Asn Tyr Asp Leu Glu Gly Ser His Val Leu Pro Gly
180 185 190
Leu Thr His Lys Cys Tyr Leu Ala Lys Lys Asn Asn Thr Pro Phe Val
195 200 205
Val Trp Gly Ser Gly Lys Pro Leu Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Arg Asp
210 215 220
Leu Ala Lys Leu Phe Ile Trp Thr Leu Arg Glu Tyr Glu Glu Ile Asp
225 230 235 240
Pro Ile Ile Leu Ser Val Gly Glu Lys Asp Glu Val Ser Ile Lys Asp
245 250 255
Val Ala Asp Ser Ile Val Lys Ala Met Asp Phe Gln Gly Glu Tyr Ser
260 265 270
Phe Asp Ser Thr Lys Ala Asp Gly Gln Tyr Lys Lys Thr Ala Ser Asn
275 280 285
Glu Lys Leu Met Lys Tyr Ile Pro Asp Phe Glu Phe Thr Pro Phe Asp
290 295 300
Val Ala Ile Lys Glu Ser Val Glu Trp Phe Val Glu Asn Tyr Asp Thr
305 310 315 320
Leu Arg Lys
<210> 24
<211> 645
<212> PRT
<213> Puniceicoccaceae bacterium
<400> 24
Met Lys Lys Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr Gly Gln Asp Gly Ser Tyr
1 5 10 15
Leu Ala Glu Leu Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Glu Val His Gly Ile Ile
20 25 30
Arg Arg Ala Ser Thr Phe Asn Thr Arg Asp His Tyr Glu Asp Pro His
35 40 45
Ile Asn Gly Lys Lys Phe Leu His Tyr Gly Asp Leu Ala Asp Gly Val
50 55 60
Gln Met Val Lys Leu Leu Tyr Asn Leu Gln Pro Asp Glu Ile Tyr His
65 70 75 80
Leu Gly Ala Gln Ser His Val Arg Val Ser Phe Asp Val Pro Glu Tyr
85 90 95
Thr Gly Asp Val Thr Gly Leu Gly Thr Leu Arg Leu Glu Ala Ile Arg
100 105 110
Glu Val Gly Leu Asn Asn Lys Cys Arg Phe Tyr Gln Ala Ser Ser Ser
115 120 125
Glu Met Phe Gly Met Val Gln Glu Val Pro Gln Thr Glu Lys Thr Pro
130 135 140
Tyr Pro Arg Ser Pro Gly Cys Ala Lys Val Tyr Ala Tyr Trp Leu Thr
145 150 155 160
Val Asn Tyr Arg Glu Ser Tyr Asn Leu His Ala Thr Asn Gly Ile Leu
165 170 175
Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Glu Thr Phe Val Thr Arg Lys
180 185 190
Ile Thr Arg Ala Ala Thr Arg Ile Lys Met Gly Leu Gln Asp Lys Leu
195 200 205
Tyr Leu Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly Tyr Ala Lys Glu
210 215 220
Tyr Val Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Gln Asp Ser Gly Asp Asp
225 230 235 240
Tyr Val Met Ala Thr Asn Glu Thr His Ser Val Lys Glu Val Gln Glu
245 250 255
Thr Phe Ala Gln Leu Asp Met Asp Trp Glu Ala Phe Val Glu Tyr Asp
260 265 270
Lys Arg Tyr Glu Arg Pro Thr Glu Val Asp Leu Ile Gly Asp Pro Ser
275 280 285
Lys Ala Lys Lys Gln Leu Asp Trp Glu Pro Lys Val Arg Phe Lys Asp
290 295 300
Leu Val Lys Ile Met Val Glu Ala Asp Leu Glu Ile Ala Arg Lys Glu
305 310 315 320
Ala Ala Phe Lys Ala Ala Thr Glu Gln Ser Phe Arg Leu Met Asn Lys
325 330 335
Asp Ala Lys Ile Tyr Val Ala Gly His Arg Gly Met Val Gly Ser Ala
340 345 350
Val Val Arg Ala Leu Glu Glu Asn Gly Phe Gln Ser Ile Ile Thr Arg
355 360 365
Thr His Ala Glu Leu Asp Leu Thr Asp Gln Ser Glu Val Arg Ala Phe
370 375 380
Phe Gln Ser Asn Asn Ile Gln Tyr Ala Val Ile Ala Ala Ala Lys Val
385 390 395 400
Gly Gly Ile His Ala Asn Asn Ser Tyr Pro Ala Glu Phe Ile Tyr Glu
405 410 415
Asn Leu Ala Ile Ala Gln Asn Thr Ile His Glu Ala Tyr Ala Ser Gly
420 425 430
Val Arg Leu Leu Phe Leu Gly Ser Thr Cys Tyr Pro Lys Phe Ala Lys
435 440 445
Gln Pro Ile Gln Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Ala Leu Glu Pro Thr
450 455 460
Asn Glu Ala Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala Gly Leu Lys Leu Cys Gln
465 470 475 480
Phe Tyr Arg Gln Tyr Gly Val Leu Tyr His Ser Ala Met Pro Thr Asn
485 490 495
Leu Tyr Gly Arg Gly Asp Asn Tyr His Pro Glu Asn Ser His Val Met
500 505 510
Pro Ala Leu Ile Arg Arg Ile His Glu Ala Lys Glu Val Gly Ala Pro
515 520 525
Glu Val Val Val Trp Gly Thr Gly Lys Pro Leu Arg Glu Phe Leu His
530 535 540
Ser Glu Asp Ala Ala Ser Gly Ile Val His Leu Leu Asn Ile Glu Asn
545 550 555 560
Pro Pro Asp Trp Val Asn Leu Gly Ser Gly Arg Glu Ile Ser Ile Gly
565 570 575
Asp Leu Ala Gln Met Ile Ser Ser Ile Ile Gly Tyr Asp Gly Val Leu
580 585 590
Lys Phe Asp Thr Ser Lys Pro Asp Gly Thr Pro Arg Lys Val Thr Asp
595 600 605
Ile Gln Leu Ile Ser Asp Thr Gly Trp Ser Pro Gln Ile Ser Leu Glu
610 615 620
Glu Gly Val Ala Ser Ala Tyr Gln Glu Phe Leu Phe Glu Leu Lys Gln
625 630 635 640
Gly Thr Val Arg Phe
645
<210> 25
<211> 1082
<212> PRT
<213> Cladosiphon okamuranus
<400> 25
Met Gln Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Glu Val His Gly Val
1 5 10 15
Lys Arg Arg Ala Ser Leu Phe Asn Thr Gln Arg Val Asp His Leu Tyr
20 25 30
Glu Asp Pro His Asp Ser Asp Thr Arg Leu Lys Leu His Tyr Gly Asp
35 40 45
Leu Thr Asp Thr Ser Asn Leu Thr Arg Leu Leu Arg Asp Ile Glu Pro
50 55 60
Asp Glu Val Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser His Val Ala Val Ser Phe
65 70 75 80
Glu Ala Pro Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp Ala Thr Gly Thr Leu Arg
85 90 95
Leu Leu Glu Ala Ile Arg Phe Leu Gly Leu Glu Glu Lys Thr Arg Phe
100 105 110
Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Lys Val Gln Glu Ile Pro
115 120 125
Gln Ser Glu Thr Thr Pro Phe His Pro Arg Ser Pro Tyr Ala Val Ala
130 135 140
Lys Met Tyr Ala Tyr Trp Ile Thr Val Asn Tyr Arg Glu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Met Tyr Ala Cys Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg
165 170 175
Gly Glu Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Arg Gly Leu Ser Asn Ile
180 185 190
Ala Met Gly Leu Glu Pro Cys Leu Tyr Met Gly Asn Ile Asp Ala Leu
195 200 205
Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val Arg Met Gln Trp Met Met
210 215 220
Leu Gln Gln Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val Ile Ala Thr Gly Val Gln
225 230 235 240
Tyr Ser Val Arg Glu Phe Ile Arg Trp Thr Ala Arg Glu Leu Gly Met
245 250 255
Glu Leu Glu Phe Ser Gly Thr Gly Thr Asp Glu Ile Ala Arg Val Ala
260 265 270
Ser Ile Thr Gly Asp Arg Val Lys Ala Leu Lys Val Gly Asp Val Val
275 280 285
Met Arg Ile Asp Pro Arg Tyr Phe Arg Pro Ala Glu Val Glu Thr Leu
290 295 300
Leu Gly Asn Pro Ala Lys Ala Lys Ala Lys Leu Gly Trp Val Pro Glu
305 310 315 320
Ile Thr Ala Gln Glu Met Cys Lys Arg Ile Trp Val Ala Gly His Arg
325 330 335
Gly Met Val Gly Gly Ala Val Val Arg Arg Leu Glu Arg Glu Asp Cys
340 345 350
Glu Val Ile Cys Ala Ala Arg Asp Val Val Asp Leu Thr Arg Gln Gln
355 360 365
Glu Val Gln Asp Trp Met Ala Glu Thr Arg Pro Asp Ala Ile Ile Met
370 375 380
Ala Ala Ala Lys Val Gly Gly Ile Leu Ala Asn Asp Thr Arg Pro Val
385 390 395 400
Asp Phe Leu Leu Gln Asn Leu Gln Ile Glu Thr Asn Ile Val Glu Ala
405 410 415
Ala His Gln Val Asp Val Glu Arg Phe Leu Phe Leu Gly Ser Ser Cys
420 425 430
Ile Tyr Pro Lys Met Ala Pro Gln Pro Ile Pro Glu Asp Ser Leu Leu
435 440 445
Thr Gly Pro Leu Glu Pro Thr Asn Glu Trp Tyr Ala Ile Ala Lys Ile
450 455 460
Ala Gly Ile Lys Leu Met Gln Ala Tyr Arg Lys Gln Tyr Gly Arg Asp
465 470 475 480
Trp Ile Ser Ala Met Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Pro Gly Asp Asn Tyr
485 490 495
Asp Leu Ala Ser Ser His Val Leu Pro Ala Leu Leu Arg Lys Phe His
500 505 510
Glu Ala Lys Val Ala Gly Ala Lys His Val Glu Leu Trp Gly Ser Gly
515 520 525
Thr Pro Leu Arg Glu Phe Met His Cys Asp Asp Leu Ala Asp Ala Leu
530 535 540
Val Phe Leu Leu Gln Arg Tyr Ser Gly His Asp His Val Asn Val Gly
545 550 555 560
Ser Gly Ser Glu Val Ser Ile Arg Glu Leu Ala Glu Thr Ile Ala Gln
565 570 575
Val Val Gly Tyr Glu Ala Glu Ile Val Phe Asp Ser Ser Lys Pro Asp
580 585 590
Gly Thr Pro Arg Lys Leu Met Asp Ser Ala Arg Leu His Asp Met Gly
595 600 605
Trp Asn Asn Ala Arg Ser Leu Leu Asp Gly Leu Arg Asp Thr Tyr Ala
610 615 620
Arg Gly Thr Val Val Phe Lys Ser Val Ala Asp Glu Ile Arg Thr Val
625 630 635 640
Asp Val Ala Asp Tyr Ser Ile Leu Pro Val Gly Val Val Gln Trp Leu
645 650 655
Glu Thr Asp Gly Ala Gly Asp Ser Tyr Asn Ile Ala Ser Arg Leu Asp
660 665 670
Phe Ala Pro Asn Pro Asp Ile Ala Val Ile Ser Ala Leu Arg Pro Leu
675 680 685
Ser Asn Leu Thr Pro Ile Gln Arg Val Phe His Leu Gly Gly Gly Asn
690 695 700
Gln His Ile Leu Leu Met Arg Met Ile Ser Ser Gln Pro Glu Asp Val
705 710 715 720
His Asn Ile Pro His Leu Gly Trp Tyr Met Arg Thr Gly Val Arg Val
725 730 735
Ile Val Ile Ser Ala Ala Leu Ser Ser Gly Gly Leu Phe Ala Ile Gly
740 745 750
Trp Ile Leu Gln Ser Ser Gly His Ala Tyr Gly Arg Val Leu Ile Gly
755 760 765
Gly Ala Val Phe Leu Phe Pro Met Ile Leu Ala Glu Ala Val Met Asn
770 775 780
Leu Ala Arg Ala Arg Gly Ser Phe Phe Met Ala Leu Leu Pro Arg Asp
785 790 795 800
Ile Ile Trp Arg Thr Leu Val Ile Ala Ile Ala Leu Gly Leu Leu Leu
805 810 815
Ala Leu Pro Thr Gly Trp Ser Gly Leu Gln Leu Met Leu Ile Cys Ala
820 825 830
Gly Ser Leu Met Ile Cys Leu Leu Val Gln Ile Arg Leu Ala Trp Gly
835 840 845
Leu Tyr Ala Gly His Ile Pro Pro Gln Thr Ala Pro Asp Trp Pro Asn
850 855 860
Trp Arg Ala Gln Ser Leu Trp Leu Trp Ile Ser Ser Leu Ala Gly Asn
865 870 875 880
Ile Ser Gly Asn Leu Ala Val Leu Ile Ile Ser Met Thr Leu Ser Leu
885 890 895
Glu Ala Ala Gly Val Phe Phe Ala Ala Leu Arg Leu Ser Met Val Leu
900 905 910
Ala Leu Pro Leu Asn Ala Leu Asn Ile Ala Val Ala Pro Arg Phe Ser
915 920 925
His Leu His Ala Arg Gln Asp Tyr Asn Ala Leu Gln Thr Tyr Gly Leu
930 935 940
Arg Met Thr Gln Val Ile Ala Leu Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu
945 950 955 960
Ile Val Ala Tyr Gly Asp Gln Ala Leu Ser Trp Phe Asp Ser Glu Ile
965 970 975
Thr Gly Gly Trp Gly Ala Leu Cys Leu Leu Ala Ile Gly Tyr Thr Leu
980 985 990
Arg Thr Cys Ala Gly Ala Ser Gly Val Met Met Leu Met Thr Gly His
995 1000 1005
Glu Arg Lys Ala Val Arg Ile Phe Phe Gln Thr Glu Gly Leu Ser
1010 1015 1020
Leu Leu Val Leu Pro Leu Ala Ala His Phe Tyr Gly Ile Glu Gly
1025 1030 1035
Ala Ala Ala Cys Leu Ala Leu Gly Val Ala Ala Ser Ser Val Leu
1040 1045 1050
Ser Asn Leu His Leu Arg Arg Ser Phe Arg Val Asp Pro Gly Leu
1055 1060 1065
His Ser Val Leu Leu Ala Pro Arg Ser Asp Gln Gly Ile Leu
1070 1075 1080
<210> 26
<211> 768
<212> PRT
<213> Dictyostelium discoideum
<400> 26
Met Asn Asp Ser Pro Ile Ile Ser Val Val Leu Pro Phe Leu Ile Lys
1 5 10 15
Asp Asn Asp Asp Lys Ser Leu Asn Tyr Gln Gly Ile Asn Asn Leu Ile
20 25 30
Ile Ser Ile Asp Ser Ile Ile Glu Gln Thr Phe Lys Glu Trp Glu Leu
35 40 45
Ile Leu Val Asp Asp Gly Ser Asn Asn Glu Ile Leu Glu Gln Leu Leu
50 55 60
Ser Lys Arg Tyr Ser Thr Asp Asn Arg Ile Lys Phe Ile Ile Asn Lys
65 70 75 80
Glu Asn Lys Gly Ile Val Lys Ser Leu Asn Asp Ala Ile Leu Asn His
85 90 95
Cys Ser Pro Thr Ser Lys Tyr Ile Ala Arg Met Asp Ser Asp Asp Ile
100 105 110
Ser His Pro Thr Arg Leu Gln Ser Gln Leu Lys Tyr Leu Gln Ser Asn
115 120 125
Glu Thr Ile Asp Ile Leu Gly Cys Pro Ile Lys Met Phe Asn Asn Asn
130 135 140
Lys Leu Ile Glu Ile Leu Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ile Asn
145 150 155 160
Asn Asn Val Lys Glu Leu Ile Asn Ile Ile Asn Asn Glu Glu Ser Phe
165 170 175
Lys Phe Ile Gln His Pro Asp Lys Asp Ile Leu Met Trp Ser Met Phe
180 185 190
Phe Asn Cys Cys Ile Val His Pro Ser Val Ile Phe Lys Arg Ser Ile
195 200 205
Phe Thr Ile Glu His Cys Tyr Glu Glu Asn Asn Gln Phe Pro Phe Ile
210 215 220
Glu Asp Tyr Leu Phe Trp Leu Lys Ser Leu Ile Met Lys Gly Leu Asn
225 230 235 240
Ile Ser Asn Ile Gln Ser Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Arg Lys His
245 250 255
Asn Asn Ser Ile Ser Phe Lys Asn Ile Glu Lys Gln Lys Asp Ser Thr
260 265 270
Ala Asn Ala Ser Cys Tyr Tyr Leu Asn Ile Leu Phe Lys Arg Phe Asn
275 280 285
Ile Asp Ser Glu Ile Ile Gln Asn Ser Ser Leu Ser Met Lys Glu Ile
290 295 300
Ile Gln Phe Phe Gln Leu Ser Pro Ser Ser Leu Ser Lys Ile Asn Asn
305 310 315 320
Ile Ser Ile Glu Leu Phe Glu Phe Ala Phe Lys Tyr Leu Glu Leu Ile
325 330 335
Glu Lys Ser Cys Thr Lys Gln Gln Pro Asn Tyr Ser Asn Ser Ile Lys
340 345 350
Asp Ala Ala Asn Glu Lys Met Gly Glu Leu Val Ser Leu Cys Leu Ser
355 360 365
Asn Tyr Pro Asn Asn Gln Lys Ser Ser Leu Leu Trp Glu Lys Trp Leu
370 375 380
Ser Arg Asn Pro Thr Ser Gln Leu Leu Ser Leu Leu Ser Asn Leu Asn
385 390 395 400
Val Lys Ser Ser Thr Thr Ile Ile Asn Asn Asn Ile Asn Asn Asn Asn
405 410 415
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn
420 425 430
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Ile Leu Asn Phe Ile Ser Gly
435 440 445
Ile Asn Ser Asn Lys Ile Asn Thr Pro Lys Ser Asn Asn Asn Lys Phe
450 455 460
Lys Glu Asn Gly Ile Arg Ile Ile Cys Phe Ser Lys Asp Arg Ala Phe
465 470 475 480
Gln Leu Lys Glu Tyr Leu Arg Thr Phe Phe Lys Tyr Leu Lys Asn Asp
485 490 495
Asp Asn Gly Asn Asp Lys Phe Glu Ile Ile Val Asp Val Leu Phe Thr
500 505 510
Tyr Ser Asn Glu Lys Phe Lys Asn Ser Tyr Gln Leu Val Ile Glu Ser
515 520 525
Phe Pro Gln Val Asn Phe Ile Lys Glu Glu Asn Phe Thr Asp Gln Leu
530 535 540
Ile Asn Leu Val Gln Lys Thr Asn Lys Leu Glu Tyr Val Met Phe Ser
545 550 555 560
Val Asp Asp Ile Leu Tyr Tyr Asn Glu Phe Asn Leu Lys Glu Tyr Cys
565 570 575
Leu Ser Leu Asn Ser Glu Pro Leu Ala Leu Gly Phe Tyr Met Lys Leu
580 585 590
Asn Lys Asn Ile Thr Tyr Cys His Thr Cys Asn Gln Asp Ile Thr Ile
595 600 605
Pro Leu Asn Ser Asn Thr Ile Ser Arg Thr Glu Asn Asn Phe Lys Tyr
610 615 620
Leu Lys Trp Asn Arg Asn Asp Asn Asp Cys Lys Lys Asp Trp Asn Tyr
625 630 635 640
Pro Trp Asp Leu Cys Ser Thr Ile Tyr Arg Cys Asn Asp Ile Asp Ser
645 650 655
Ile Ile Asn Gly Ile Val Lys Tyr Tyr Gly Ile Arg Asn Gly Ile Asn
660 665 670
His Pro Asn Arg Phe Glu Phe Asn Gly Asn Arg Pro Ile Ile Gln Lys
675 680 685
Gln Ile Tyr Gln Asn Lys Pro Tyr Cys Leu Cys Leu Ser Asp His Tyr
690 695 700
Ser Pro Met Ser Val Val Thr Ile Asn Arg Val Gln Asp Val Tyr Asp
705 710 715 720
Asn Pro Ile Tyr Asp Gln Thr Leu Ser Leu Asp Asp Leu Asp Gln Leu
725 730 735
Leu Tyr Ser Asn Lys Ser Leu Asn Asp Glu Lys Tyr Lys Glu Asn Ser
740 745 750
Leu Ser Leu Asn Phe Lys Ser Val His Ile Gly Glu Leu Phe Ile Ser
755 760 765
<210> 27
<211> 343
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Leu Val Val Gln Met Pro Phe Ser Phe Pro Met Ala His Phe Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Phe Thr Val Ser Thr Ile Phe His Val Gln Gln Arg Leu
20 25 30
Ala Lys Ile Gln Ala Met Trp Glu Leu Pro Val Gln Ile Pro Val Leu
35 40 45
Ala Ser Thr Ser Lys Ala Leu Gly Pro Ser Gln Leu Arg Gly Met Trp
50 55 60
Thr Ile Asn Ala Ile Gly Arg Leu Gly Asn Gln Met Gly Glu Tyr Ala
65 70 75 80
Thr Leu Tyr Ala Leu Ala Lys Met Asn Gly Arg Pro Ala Phe Ile Pro
85 90 95
Ala Gln Met His Ser Thr Leu Ala Pro Ile Phe Arg Ile Thr Leu Pro
100 105 110
Val Leu His Ser Ala Thr Ala Ser Arg Ile Pro Trp Gln Asn Tyr His
115 120 125
Leu Asn Asp Trp Met Glu Glu Glu Tyr Arg His Ile Pro Gly Glu Tyr
130 135 140
Val Arg Phe Thr Gly Tyr Pro Cys Ser Trp Thr Phe Tyr His His Leu
145 150 155 160
Arg Gln Glu Ile Leu Gln Glu Phe Thr Leu His Asp His Val Arg Glu
165 170 175
Glu Ala Gln Lys Phe Leu Arg Gly Leu Gln Val Asn Gly Ser Arg Pro
180 185 190
Gly Thr Phe Val Gly Val His Val Arg Arg Gly Asp Tyr Val His Val
195 200 205
Met Pro Lys Val Trp Lys Gly Val Val Ala Asp Arg Arg Tyr Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Leu Asp Trp Phe Arg Ala Arg Tyr Ser Ser Leu Ile Phe Val
225 230 235 240
Val Thr Ser Asn Gly Met Ala Trp Cys Arg Glu Asn Ile Asp Thr Ser
245 250 255
His Gly Asp Val Val Phe Ala Gly Asp Gly Ile Glu Gly Ser Pro Ala
260 265 270
Lys Asp Phe Ala Leu Leu Thr Gln Cys Asn His Thr Ile Met Thr Ile
275 280 285
Gly Thr Phe Gly Ile Trp Ala Ala Tyr Leu Thr Gly Gly Asp Thr Ile
290 295 300
Tyr Leu Ala Asn Tyr Thr Leu Pro Asp Ser Pro Phe Leu Lys Ile Phe
305 310 315 320
Lys Pro Glu Ala Ala Phe Leu Pro Glu Trp Thr Gly Ile Ala Ala Asp
325 330 335
Leu Ser Pro Leu Leu Lys His
340
<210> 28
<211> 565
<212> PRT
<213> Pisum sativa
<400> 28
Met Asn Met Leu Ile Lys Arg Val Ile Ala Ile Lys Asn Pro Arg Gly
1 5 10 15
Asp Asp Asn Asn Asn Asn Lys Leu Ser Asp Leu Glu Thr Leu Thr Asp
20 25 30
Lys Cys Thr Thr Cys Pro Leu Thr Leu Met Arg Val Met Ala Phe Phe
35 40 45
Val Val Ser Phe Met Leu Phe Ser Val Leu Phe Ser Leu Ser Val Val
50 55 60
Leu Arg Asp Pro Pro Ser Asp Ala Ala Ile Ser Ser Thr Thr Thr Leu
65 70 75 80
Phe Gln Leu Asn Gln Gly Leu Gly Ser Asp Asp Phe Asp Ser Val Glu
85 90 95
Leu Leu Asn Asp Lys Leu Leu Gly Gly Leu Leu Ala Asp Gly Phe Asp
100 105 110
Glu Lys Ser Cys Leu Ser Arg Tyr Gln Ser Ala Ile Phe Gly Lys Gly
115 120 125
Leu Ser Gly Lys Pro Ser Ser Tyr Leu Ile Ser Arg Leu Arg Lys Tyr
130 135 140
Glu Ala Arg His Lys Gln Cys Gly Pro Tyr Thr Glu Ser Tyr Asn Lys
145 150 155 160
Thr Val Lys Glu Leu Gly Ser Gly Gln Phe Ser Glu Ser Val Asp Cys
165 170 175
Lys Tyr Val Val Trp Ile Ser Phe Ser Gly Leu Gly Asn Arg Ile Leu
180 185 190
Thr Leu Val Ser Ala Phe Leu Tyr Ala Leu Leu Thr Asp Arg Val Leu
195 200 205
Leu Val Asp Pro Gly Val Asp Met Thr Asp Leu Phe Cys Glu Pro Phe
210 215 220
Pro Asp Ala Ser Trp Phe Val Pro Pro Asp Phe Pro Leu Asn Ser His
225 230 235 240
Leu Asn Asn Phe Asn Gln Glu Ser Asn Gln Cys His Gly Lys Ile Leu
245 250 255
Lys Thr Lys Ser Ile Thr Asn Ser Thr Val Pro Ser Phe Val Tyr Leu
260 265 270
His Leu Ala His Asp Tyr Asp Asp His Asp Lys Leu Phe Phe Cys Asp
275 280 285
Glu Glu Gln Leu Phe Leu Gln Asn Val Pro Leu Leu Ile Met Lys Thr
290 295 300
Asp Asn Tyr Phe Ile Pro Ser Leu Phe Leu Met Pro Ser Phe Glu Gln
305 310 315 320
Glu Leu Asn Asp Leu Phe Pro Lys Lys Glu Lys Val Phe His Phe Leu
325 330 335
Gly Arg Tyr Leu Leu His Pro Thr Asn Asn Val Trp Gly Leu Val Val
340 345 350
Arg Tyr Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Lys Val Asp Glu Arg Ile Gly Ile
355 360 365
Gln Ile Arg Val Phe Asp Thr Asp Pro Gly Pro Phe Gln His Val Leu
370 375 380
Asp Gln Val Leu Ala Cys Thr Leu Lys Glu Ser Ile Leu Pro Asp Val
385 390 395 400
Asn Arg Glu Gln Asn Ile Asn Ser Ser Ser Gly Thr Pro Lys Ser Lys
405 410 415
Ala Val Leu Ile Thr Ser Leu Ser Ser Gly Tyr Phe Glu Lys Val Arg
420 425 430
Asp Met Tyr Trp Glu Phe Pro Thr Glu Thr Gly Glu Val Val Gly Ile
435 440 445
Tyr Gln Pro Ser His Glu Gly Tyr Gln Gln Thr Gln Lys Gln Phe His
450 455 460
Asn Gln Lys Ala Trp Ala Glu Met Tyr Leu Leu Ser Leu Thr Asp Val
465 470 475 480
Leu Val Thr Ser Ser Trp Ser Thr Phe Gly Tyr Val Ala Gln Gly Leu
485 490 495
Gly Gly Leu Lys Pro Trp Ile Leu Tyr Lys Pro Glu Asn Arg Thr Ala
500 505 510
Pro Asn Pro Pro Cys Gln Arg Ala Met Ser Met Glu Pro Cys Phe His
515 520 525
Ala Pro Pro Phe Tyr Asp Cys Lys Ala Lys Arg Gly Thr Asp Thr Gly
530 535 540
Ala Leu Val Pro His Val Arg His Cys Glu Asp Met Ser Trp Gly Leu
545 550 555 560
Lys Leu Val Asp Asn
565
<210> 29
<211> 292
<212> PRT
<213> Rhizobium marinum
<400> 29
Met Ile Thr Val Lys Leu Leu Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln
1 5 10 15
Phe Ala Thr Gly Arg Ala Val Ala Arg Arg Leu Gly Ser Glu Leu Leu
20 25 30
Leu Asp Ile Ser Ser Phe Glu His Tyr Asp Leu Arg Arg Phe Glu Leu
35 40 45
Glu Asp Trp Ala Ile Asn Ala Arg Val Ala Thr Ala Ser Glu Leu Ala
50 55 60
Arg Ala Gly Val Val Pro Ser Pro Pro Arg Met Leu Thr Arg Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Leu Gly Leu Ala Phe Pro Ala Thr Thr Phe Arg Glu Ser Ser
85 90 95
Phe Ala Tyr Asp Pro Gly Ile Leu Gln Val Thr Asp Pro Val Tyr Leu
100 105 110
Asp Gly Tyr Phe Gln Ser Glu Arg Tyr Phe Ser Asp Val Ala Gly His
115 120 125
Leu Arg Glu Glu Phe Val Leu Arg Gln Pro Thr Asp Ala Lys Asn Lys
130 135 140
Ala Met Glu Ala Leu Ile Arg Asp Ala Gly Pro Leu Ala Val Ser Leu
145 150 155 160
His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Val Ala Asn Ala Gln Thr Ala Lys Tyr
165 170 175
His Gly Val Cys Ser Leu Asp Tyr Tyr Ser Ala Ala Val Asp His Ile
180 185 190
Ala Glu Gln Val Gly Gly Gly His Tyr Phe Val Phe Ser Asp Asp Leu
195 200 205
Ala Trp Val Arg Glu Asn Leu Lys Ile Thr Gln Pro Met Thr Leu Val
210 215 220
Asp Val Asn Gly Pro Asp Lys Gly Ala Trp Asp Met Ala Leu Met Thr
225 230 235 240
Ala Cys Arg His His Ile Ile Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly
245 250 255
Ala Trp Leu Asn Pro Arg Pro Asp Lys Ile Ile Val Ala Pro Lys Arg
260 265 270
Trp Phe Ala Gly Ala Ser His Asp Thr Thr Asp Leu Val Pro Ala Ser
275 280 285
Trp Ile Arg Leu
290
<210> 30
<211> 293
<212> PRT
<213> Herbaspirillum rubrisubalbicans
<400> 30
Met Ile Val Ser Arg Leu Ile Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln
1 5 10 15
Tyr Ala Val Gly Arg Ala Leu Ala Glu His Met His Thr Pro Leu Leu
20 25 30
Leu Asp Val Ser Gly Phe Val His Tyr Asp Leu Arg Arg Tyr Glu Leu
35 40 45
Asp Gly Phe Asn Ile Lys Ala Lys Pro Ala Ser Glu Glu Glu Leu Ala
50 55 60
Arg Leu Gly Val Lys Ala Gly Val Lys Pro Ser Met Tyr Glu Arg Ala
65 70 75 80
Met Arg Lys Leu Gly Ile Arg Arg Glu Pro Ser Ile Leu Arg Glu Ala
85 90 95
Ser Phe Thr Tyr Asp Ala Arg Ile Glu Thr Val Glu Ala Pro Leu Tyr
100 105 110
Leu Asp Gly Tyr Trp Gln Ser Gln Arg Tyr Phe Ala Ala Ile Arg Pro
115 120 125
Gln Leu Leu Gln Glu Phe Ser Leu Lys Asp Ser Trp Gly Ser Ala Asn
130 135 140
Asp Ala Leu Ala Glu Gln Ile Gly Leu Ala Gly Asp Gly Ala Val Ser
145 150 155 160
Leu His Val Arg Arg Gly Asp Tyr Val Asn Asn Ala Gln Thr Ala Gln
165 170 175
Tyr His Gly Val Cys Ser Leu Asp Tyr Tyr Arg Gln Ala Val Ala Tyr
180 185 190
Ile Val Ala Arg Val Ala Ala Pro His Phe Phe Val Phe Ser Asp Asp
195 200 205
His Ala Trp Val Ser Ala Asn Leu Asp Thr Gly Cys Pro Thr Thr Phe
210 215 220
Val Gln Thr Asn Ser Pro Asp Gln Gly Ile Phe Asp Met Ala Leu Met
225 230 235 240
Lys Thr Cys Arg His His Ile Ile Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp
245 250 255
Gly Ala Trp Leu Asn Ala Asn Asp Glu Lys Ile Val Val Ala Pro Gln
260 265 270
Arg Trp Phe Asn Glu Ala Ser Lys Asp Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala
275 280 285
Gly Trp Val Arg Leu
290
<210> 31
<211> 291
<212> PRT
<213> Citrobacter freundii
<400> 31
Met Gln Val Asn Arg Val Tyr Val Arg Pro Met Gly Gly Leu Gly Asn
1 5 10 15
Gln Leu Phe Gln Tyr Ala Val Ala Tyr Gly Val Ala Arg Lys His Ser
20 25 30
Ala Gln Leu Ile Ile Asp Thr Arg Phe Phe Asp Asn Tyr Glu Leu His
35 40 45
Gly Gly Phe Arg Leu Tyr Asn Leu Asn Ile Ser Val Ser Glu Met Thr
50 55 60
Asn Ala Asp Leu Lys Lys Phe Pro Glu Trp Lys Cys Lys Leu Leu Ser
65 70 75 80
Lys Phe Pro Gln Val Thr Arg Phe Phe Asn Glu Tyr Ile Tyr Asp Lys
85 90 95
Val Gly Asp Leu Asn Glu Ile Lys Ser Asn Asp Ala Met Leu Leu Gly
100 105 110
Tyr Trp Gln Asn Glu Thr Asn Phe His Gln Tyr Lys Asn Glu Leu Val
115 120 125
Thr Ile Phe Lys Pro Lys Ile Ile Ser Glu Asn Asp Asn Lys Lys Ala
130 135 140
Glu Ser Ile Leu Ala Thr Asn Ser Val Val Ile His Ile Arg Arg Gly
145 150 155 160
Asp Tyr Ile Asn Asn Pro Ile Ala Tyr Lys His His Gly Val Cys Ser
165 170 175
Leu Asn Tyr Tyr Lys Gln Ala Ile Asn Glu Met Lys Lys Asn Thr Lys
180 185 190
Asn Ile Phe Phe Tyr Ile Phe Ser Asp Asp Ile Glu Trp Cys Arg Glu
195 200 205
Asn Ile Thr Pro Leu Phe Ser Glu Tyr Asp Ser Phe Ser Phe Val Arg
210 215 220
Gly Glu Thr Gln Glu Val Asp Met Trp Leu Met Ser Cys Gly Lys Tyr
225 230 235 240
His Ile Ile Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly Ala Phe Leu Ser
245 250 255
Thr Asn Pro Asp Gln Ile Val Ile Ala Pro Thr Pro Trp Phe Asp Ile
260 265 270
Thr Gln Lys Tyr Thr Gly Asp Pro Ser Leu Pro Gln Trp Ile Lys Ile
275 280 285
Asp Lys Tyr
290
<210> 32
<211> 301
<212> PRT
<213> Lactobacillus helveticus
<400> 32
Met Leu Tyr Met Arg Leu Lys Gly Arg Leu Gly Asn Gln Leu Phe Ile
1 5 10 15
Tyr Ala Phe Ala Arg Glu Leu Val Tyr Lys Tyr Asn Gln Gln Val Leu
20 25 30
Leu Tyr Asp Arg Lys Asp Glu Lys Asp Ser Met Trp Tyr Ser His Leu
35 40 45
Asp Asn Tyr Pro Leu Asn Thr Asn Val His Phe Thr Ser Asn Arg Arg
50 55 60
Asp Met Lys Ile Gly Asn Phe Lys Ser Lys Leu Arg Phe Ile Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Val Ala Ile Arg His Leu Pro Pro Arg Glu Arg Tyr Asn Phe Gln
85 90 95
Ile Arg Asn Leu Lys Lys Asn Glu Lys Asn Ser Leu Phe Leu Leu Met
100 105 110
Asp Gly Tyr Ala Pro Leu Pro Lys Lys Ile Asn Asp Gly Thr Phe Phe
115 120 125
Asp Gly Tyr Phe Gln Ser Pro Lys Tyr Phe Asn Asn Ile Arg Glu Glu
130 135 140
Leu Ile Lys Glu Leu Asn Pro Val His Thr Tyr Ser Glu Glu Glu Lys
145 150 155 160
Lys Phe Ile Asn Lys Ile Lys Asn Thr Glu Ser Val Cys Val Thr Ile
165 170 175
Arg Leu Gly Asp Tyr Ile Asn Asn Ser Thr His Gln Val Cys Ser Lys
180 185 190
Glu Phe Tyr Leu Asn Ala Met Asp Lys Leu Lys Lys Ile Tyr Pro Asp
195 200 205
Cys Thr Phe Phe Ile Phe Ser Asp Glu Val Asp Lys Ala Gln Gln Ile
210 215 220
Phe Asp Phe Lys Tyr Pro Val Ile Tyr Asp Ser Gly Lys Met Gln Asp
225 230 235 240
Tyr Val Ser Leu His Val Met Ser Met Cys Lys His Phe Ile Ile Ser
245 250 255
Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Ala Gln Tyr Leu Ser Thr Asn Pro Gln
260 265 270
Lys Ile Val Ile Ala Pro Asp Lys Trp Tyr Ala Gln Asp Val Pro Cys
275 280 285
Asp Ile Tyr Glu Asp Asn Trp Val Leu Met Lys Gly Lys
290 295 300
<210> 33
<211> 313
<212> PRT
<213> Neocallimastix californiae
<400> 33
Met Lys Ile Leu Ile Phe Ser Val Ser Phe Ser Phe Phe Tyr Leu Leu
1 5 10 15
His Leu Phe Phe Ile Leu Tyr Tyr Ile Ile Ser Lys Ala Ser Lys Glu
20 25 30
Ile Arg Ile Val Lys Leu Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln
35 40 45
Tyr Ala Tyr Gly Lys Ser Leu Glu His Lys Leu Gln Glu Lys Val Leu
50 55 60
Phe Asp Val Ser Trp Tyr Lys Tyr Leu Asn Lys Lys Lys Asn Glu Lys
65 70 75 80
Leu Thr Lys Arg Glu Tyr Gly Leu Gly Ile Phe Asn Leu Lys Ile Ser
85 90 95
Phe Pro Thr Lys Lys Gln Leu Lys Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Glu
100 105 110
Lys Lys Ser Tyr Ile Tyr Asp Glu Glu Leu Leu Gln Asn Lys Gly Ser
115 120 125
Ser Tyr Tyr Val Gly Tyr Phe Gln Asn Glu Lys Tyr Phe Lys Asp Ile
130 135 140
Lys Asp Asn Ile Lys Lys Ile Tyr Thr Phe Pro Lys Ile His Asp Thr
145 150 155 160
Asp Lys Phe Asn Gln Gln Trp Ile Asn Lys Ile Lys Asn Val Lys Asn
165 170 175
Ser Val Phe Ile His Ile Arg Arg Ala Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Gly
180 185 190
Trp Val Leu Ser Met Asp Tyr Tyr Lys Lys Ala Ile Glu Tyr Ile Lys
195 200 205
Lys Asn Val Glu Asn Pro Thr Phe Phe Ile Phe Cys Tyr Gln Cys Lys
210 215 220
Asp Tyr Val Glu Glu Gln Phe Lys Leu Asp Asp Thr Ile Gln Phe Ile
225 230 235 240
Gly Glu Thr Asn Ser Ile Asn Asn Glu Asn Trp Lys Asp Met Val Leu
245 250 255
Met Lys Glu Cys Lys Tyr Ala Ile Ile Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp
260 265 270
Trp Ala Ala Trp Leu Gly Arg Ala Asn Glu Glu Gly Ile Val Ile Ala
275 280 285
Pro Ser Pro Phe Ile Lys Asn Asn Asp Glu Ile Ile Cys Asp Asn Trp
290 295 300
Ile Lys Ile Asn Ser Asn Asn Ser Ser
305 310
<210> 34
<211> 314
<212> PRT
<213> Gracilariopsis chorda
<400> 34
Met Gly Leu Arg Glu Arg Leu His Ser Val Trp Phe Leu Trp Phe Val
1 5 10 15
Ala Phe Ser Ile Ile Ala Val Gly Phe Leu Ser Arg Ser Val Arg Thr
20 25 30
Pro Ser Val Pro Gln Gln Leu Lys Ser Thr Val Leu Val Thr Leu Ser
35 40 45
Gly Arg Leu Gly Asn Gln Leu Phe Gln Val Ala Ala Ser Glu Phe Ile
50 55 60
Thr Ala Arg Ile Lys Pro Gln Lys Val Leu Phe Leu Arg Asn Asn Tyr
65 70 75 80
Ser Ala Glu Thr Asp Phe Ser Gln Gly Val Phe Arg Asp Leu Lys His
85 90 95
Val Asn Ser Val Ser Glu Ala Cys Arg Gly Leu Arg Arg Asn Tyr Tyr
100 105 110
Ser His Lys Arg Met Ser Cys Ser His Val Arg Arg Asn Gln Leu Lys
115 120 125
Gly Glu Cys Leu Ile Val Glu Gly Leu Phe Gln Cys Pro His Phe Ala
130 135 140
Asn Ala Gly Ser Ser Leu Val Arg Ser Leu Phe Glu Ser Ser Leu Ile
145 150 155 160
Ala Ser Lys Ala Glu Glu Thr Tyr Arg Ser Tyr Ala Ala Val Ser Pro
165 170 175
Ala Ser Pro Val Val Ala Ile His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Thr Lys
180 185 190
Arg Phe Asn Arg Asn Phe Leu Glu Pro Leu Pro Met Lys Tyr Tyr Ile
195 200 205
Arg Ala Thr Lys Phe Met Pro Lys Asn Ala Ile Tyr Leu Val Phe Ser
210 215 220
Asp Asp Thr Ala Trp Cys Lys Ser Asn Leu Pro Glu Leu Phe Arg Lys
225 230 235 240
Ile Pro His Ser Arg Leu Ile Phe Val Lys Glu Thr Asp Ala Ser Ile
245 250 255
Ser Leu Ala Leu Met Ser Leu Ala Asp His Phe Ile Ile Ala Asn Ser
260 265 270
Thr Phe Ser Trp Trp Ala Ala Phe Leu Arg Arg Phe Glu Lys Lys Ile
275 280 285
Val Val Ser Pro Lys Asn Trp Phe Gly Asp Arg Val Thr Glu Lys Asn
290 295 300
Lys Ile Tyr Pro Arg Lys Trp Ile Arg Val
305 310
<210> 35
<211> 314
<212> PRT
<213> Lactobacillus gasseri
<400> 35
Met Leu Tyr Val Glu Met Asp Gly Arg Cys Gly Asn Gln Leu Phe His
1 5 10 15
Tyr Ala Val Ala Arg Tyr Ile Gln Leu Ala Ile Gly Asn Lys Glu Lys
20 25 30
Leu Cys Leu Asn Phe Asn Lys Ile Phe Glu Lys Lys Asp Glu Asn Asn
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Tyr Leu Lys Asp Phe Lys Thr Val Pro Tyr Ser Tyr
50 55 60
Tyr Ser Lys Ser Gly Thr Ile Leu Lys Asn Glu Ser Asn Phe Ile Gln
65 70 75 80
Lys Ile Ala Ile Gly Leu Lys Ala Ile Gln Ile Lys Ser Leu Thr Lys
85 90 95
Lys Ser Arg Gln Glu Gln Ala Asp Lys Ala Glu Val Gly Gln Arg Thr
100 105 110
Leu Asn Lys Leu Gly Val Tyr Trp Val Arg Glu Gly Val Asn Gln Ile
115 120 125
Tyr Pro Tyr Lys Asn Asn Lys Ile Leu Val Ser Gly Ile Cys Glu Ser
130 135 140
Asn Phe Ile Tyr Glu Ile Gln Glu Gln Leu Gln Lys Glu Leu Ile Pro
145 150 155 160
Val Thr Pro Val Ser Ser Leu Asn Lys Ser Leu Leu Glu Lys Ile Asp
165 170 175
Asn Cys Asn Ser Val Cys Ile Ser Val Arg Arg Gly Asp Phe Phe Asn
180 185 190
Asn Lys Asn Ala Lys Lys Tyr Gly Val Cys Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile
195 200 205
Arg Ala Lys Lys Tyr Phe Asp Lys Lys Arg Leu Glu Asn Thr Val Tyr
210 215 220
Phe Cys Phe Ser Asp Asp Ile Glu Trp Cys Lys Glu Asn Leu Lys Phe
225 230 235 240
Thr Asp Lys Asn Val Ile Phe Val Ser Gln Glu Met Pro Val Tyr Glu
245 250 255
Thr Leu Arg Leu Met Ser Arg Cys Lys His Phe Ile Leu Ser Asn Ser
260 265 270
Thr Phe Ser Trp Trp Gly Gln Phe Leu Ser Glu Tyr Lys Asp Lys Ile
275 280 285
Val Val Ser Pro Ala Arg Trp Asn Asn Asp Gly Tyr Asp Thr Asn Leu
290 295 300
Ile Asp Lys Asn Trp Ile Leu Ile Asp Ala
305 310
<210> 36
<211> 342
<212> PRT
<213> Octopus bimaculoides
<400> 36
Met Leu Leu Pro Cys Trp Leu Tyr His Cys Tyr Cys Phe Tyr His Asp
1 5 10 15
Val Ala Ala Val Gly Val Phe His Ser Ala Phe Cys Val Lys Leu Leu
20 25 30
Ile Phe Phe Ile Val Phe Phe Leu Gly Val Ile Ile Phe His Tyr Leu
35 40 45
Asp Ile Leu Gly Val Ile Tyr Thr Ile Asn Tyr Leu Val His Arg Gln
50 55 60
Gln Asp Asp Thr Lys Val Leu Cys Pro Lys Phe Val Gly Gly Leu Gly
65 70 75 80
Asn Gln Met Phe Gln Tyr Ala Ser Leu Tyr Gly Ile Ala Lys Ser Lys
85 90 95
Asn Met Thr Leu Leu Ile Asp Ala Glu Cys Glu Leu Asn Gln Leu Phe
100 105 110
Ser Ile Ser Ala Val Thr Leu Pro His Val Ala Cys Trp Phe Leu Lys
115 120 125
Thr Arg Thr Asp Tyr Arg Pro Cys Ala Phe Asn Lys Asp Thr Met Asn
130 135 140
Phe Ser Ala Asp Gln Asn Tyr Gln Met Gln Gly Tyr Leu Gln Ser Trp
145 150 155 160
Gln Tyr Phe His Arg Ala Glu Pro Ala Leu Arg Gln Ile Phe Lys Phe
165 170 175
Lys Ala Ala Ile Arg Glu Lys Ala Glu Ser Ile Leu Lys Gln Ala Ile
180 185 190
Glu Val His Gln Lys Gln Val Arg Asn Gln Ala Leu Thr Phe Ile Ala
195 200 205
Ile His Ile Arg Arg Gly Asp Ile Thr Lys Asp Asn Phe Lys Thr Tyr
210 215 220
Gly Tyr Asn Thr Ala Ser Leu Asp Tyr Ile Arg Arg Ala Met Gln Tyr
225 230 235 240
Phe Ser Glu Arg Tyr His Arg Ile Leu Phe Leu Val Cys Thr Asn Asp
245 250 255
Met Glu Trp Ala Lys Arg Tyr Leu His Lys Lys Asn Val Tyr Phe Val
260 265 270
Glu Asn Gln Pro Arg Glu Val Asp Met Ala Leu Met Ala Ser Cys Asn
275 280 285
His Thr Ile Met Thr Val Gly Ser Phe Gly Trp Trp Ser Ala Trp Leu
290 295 300
Ala Asn Gly Glu Val Val Tyr Tyr Arg Tyr Pro Ala Ser Arg Gly Ser
305 310 315 320
Lys Leu Arg Lys Ala Phe Ser Lys Glu Met Thr Asp Tyr Tyr Tyr Pro
325 330 335
Lys Trp Lys Pro Met Leu
340
<210> 37
<211> 293
<212> PRT
<213> Chryseobacterium scophthalmum
<400> 37
Met Val Ala Val Glu Leu Ile Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln
1 5 10 15
Tyr Ala Thr Ala Arg Ala Leu Ser Leu His Arg Asp Asp Ser Leu Leu
20 25 30
Leu Asp Ser Arg Leu Phe Asp Asn Tyr Lys Leu His Ser Tyr Cys Leu
35 40 45
Asn His Phe Asn Ile Gly Ala Ala Val Val Lys Asn Asp Leu Ser Leu
50 55 60
Lys Thr Pro Gly Phe Ser Lys Arg Val Val Asp Lys Leu Leu Gln Lys
65 70 75 80
Ile Asp Ala Leu Thr Leu Gln Asn Lys Ile Phe Asn Thr Tyr Gln Glu
85 90 95
Lys Asn Leu Leu Phe Asp Asp Ser Leu Phe Arg Asn Ser Lys Lys Asn
100 105 110
Ile Tyr Leu Lys Gly Tyr Phe Gln Ser Glu Lys Tyr Phe Ala Lys Tyr
115 120 125
Glu Asp Gln Leu Arg Lys Asp Phe Glu Ile Val Thr Pro Leu Lys Lys
130 135 140
Glu Thr Thr Asp Leu Leu Lys Ile Ile Glu Ala Glu Asn Ser Val Ser
145 150 155 160
Leu His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Ile Ser Asn Pro Ala Ala Asn Ala
165 170 175
Val His Gly Thr Cys Asp Leu Asn Tyr Tyr His Arg Ala Ile Glu Ile
180 185 190
Ile Lys Glu Lys Ile Glu His Pro Ile Phe Phe Ile Phe Ser Asp Asp
195 200 205
Ile Asp Trp Ala Lys Glu Asn Leu Lys Leu Glu Asn Thr Thr Tyr Phe
210 215 220
Val Asp Phe Asn Asp Ala Ser Thr Asn Tyr Glu Asp Leu Lys Leu Met
225 230 235 240
Ser Ala Cys Lys Asn Asn Ile Thr Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp
245 250 255
Gly Ala Trp Leu Asn Ala Asn Lys Ser Lys Ile Val Ile Ala Pro Ser
260 265 270
Lys Trp Phe Asn Thr Asp Val Leu Asn Ser Gln Asp Ile Ile Pro Glu
275 280 285
Ser Trp Met Lys Ile
290
<210> 38
<211> 313
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Leu Ala Lys Ile Gln Ala Met Trp Glu Leu Pro Val Gln Ile Pro
1 5 10 15
Val Leu Ala Ser Thr Ser Lys Ala Leu Gly Pro Ser Gln Leu Arg Gly
20 25 30
Met Trp Thr Ile Asn Ala Ile Gly Arg Leu Gly Asn Gln Met Gly Glu
35 40 45
Tyr Ala Thr Leu Tyr Ala Leu Ala Lys Met Asn Gly Arg Pro Ala Phe
50 55 60
Ile Pro Ala Gln Met His Ser Thr Leu Ala Pro Ile Phe Arg Ile Thr
65 70 75 80
Leu Pro Val Leu His Ser Ala Thr Ala Ser Arg Ile Pro Trp Gln Asn
85 90 95
Tyr His Leu Asn Asp Trp Met Glu Glu Glu Tyr Arg His Ile Pro Gly
100 105 110
Glu Tyr Val Arg Phe Thr Gly Tyr Pro Cys Ser Trp Thr Phe Tyr His
115 120 125
His Leu Arg Gln Glu Ile Leu Gln Glu Phe Thr Leu His Asp His Val
130 135 140
Arg Glu Glu Ala Gln Lys Phe Leu Arg Gly Leu Gln Val Asn Gly Ser
145 150 155 160
Arg Pro Gly Thr Phe Val Gly Val His Val Arg Arg Gly Asp Tyr Val
165 170 175
His Val Met Pro Lys Val Trp Lys Gly Val Val Ala Asp Arg Arg Tyr
180 185 190
Leu Gln Gln Ala Leu Asp Trp Phe Arg Ala Arg Tyr Ser Ser Leu Ile
195 200 205
Phe Val Val Thr Ser Asn Gly Met Ala Trp Cys Arg Glu Asn Ile Asp
210 215 220
Thr Ser His Gly Asp Val Val Phe Ala Gly Asp Gly Ile Glu Gly Ser
225 230 235 240
Pro Ala Lys Asp Phe Ala Leu Leu Thr Gln Cys Asn His Thr Ile Met
245 250 255
Thr Ile Gly Thr Phe Gly Ile Trp Ala Ala Tyr Leu Thr Gly Gly Asp
260 265 270
Thr Ile Tyr Leu Ala Asn Tyr Thr Leu Pro Asp Ser Pro Phe Leu Lys
275 280 285
Ile Phe Lys Pro Glu Ala Ala Phe Leu Pro Glu Trp Thr Gly Ile Ala
290 295 300
Ala Asp Leu Ser Pro Leu Leu Lys His
305 310
<210> 39
<211> 481
<212> PRT
<213> Pisum sativa
<400> 39
Met Gly Leu Gly Ser Asp Asp Phe Asp Ser Val Glu Leu Leu Asn Asp
1 5 10 15
Lys Leu Leu Gly Gly Leu Leu Ala Asp Gly Phe Asp Glu Lys Ser Cys
20 25 30
Leu Ser Arg Tyr Gln Ser Ala Ile Phe Gly Lys Gly Leu Ser Gly Lys
35 40 45
Pro Ser Ser Tyr Leu Ile Ser Arg Leu Arg Lys Tyr Glu Ala Arg His
50 55 60
Lys Gln Cys Gly Pro Tyr Thr Glu Ser Tyr Asn Lys Thr Val Lys Glu
65 70 75 80
Leu Gly Ser Gly Gln Phe Ser Glu Ser Val Asp Cys Lys Tyr Val Val
85 90 95
Trp Ile Ser Phe Ser Gly Leu Gly Asn Arg Ile Leu Thr Leu Val Ser
100 105 110
Ala Phe Leu Tyr Ala Leu Leu Thr Asp Arg Val Leu Leu Val Asp Pro
115 120 125
Gly Val Asp Met Thr Asp Leu Phe Cys Glu Pro Phe Pro Asp Ala Ser
130 135 140
Trp Phe Val Pro Pro Asp Phe Pro Leu Asn Ser His Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Asn Gln Glu Ser Asn Gln Cys His Gly Lys Ile Leu Lys Thr Lys Ser
165 170 175
Ile Thr Asn Ser Thr Val Pro Ser Phe Val Tyr Leu His Leu Ala His
180 185 190
Asp Tyr Asp Asp His Asp Lys Leu Phe Phe Cys Asp Glu Glu Gln Leu
195 200 205
Phe Leu Gln Asn Val Pro Leu Leu Ile Met Lys Thr Asp Asn Tyr Phe
210 215 220
Ile Pro Ser Leu Phe Leu Met Pro Ser Phe Glu Gln Glu Leu Asn Asp
225 230 235 240
Leu Phe Pro Lys Lys Glu Lys Val Phe His Phe Leu Gly Arg Tyr Leu
245 250 255
Leu His Pro Thr Asn Asn Val Trp Gly Leu Val Val Arg Tyr Tyr Asp
260 265 270
Ala Tyr Leu Ala Lys Val Asp Glu Arg Ile Gly Ile Gln Ile Arg Val
275 280 285
Phe Asp Thr Asp Pro Gly Pro Phe Gln His Val Leu Asp Gln Val Leu
290 295 300
Ala Cys Thr Leu Lys Glu Ser Ile Leu Pro Asp Val Asn Arg Glu Gln
305 310 315 320
Asn Ile Asn Ser Ser Ser Gly Thr Pro Lys Ser Lys Ala Val Leu Ile
325 330 335
Thr Ser Leu Ser Ser Gly Tyr Phe Glu Lys Val Arg Asp Met Tyr Trp
340 345 350
Glu Phe Pro Thr Glu Thr Gly Glu Val Val Gly Ile Tyr Gln Pro Ser
355 360 365
His Glu Gly Tyr Gln Gln Thr Gln Lys Gln Phe His Asn Gln Lys Ala
370 375 380
Trp Ala Glu Met Tyr Leu Leu Ser Leu Thr Asp Val Leu Val Thr Ser
385 390 395 400
Ser Trp Ser Thr Phe Gly Tyr Val Ala Gln Gly Leu Gly Gly Leu Lys
405 410 415
Pro Trp Ile Leu Tyr Lys Pro Glu Asn Arg Thr Ala Pro Asn Pro Pro
420 425 430
Cys Gln Arg Ala Met Ser Met Glu Pro Cys Phe His Ala Pro Pro Phe
435 440 445
Tyr Asp Cys Lys Ala Lys Arg Gly Thr Asp Thr Gly Ala Leu Val Pro
450 455 460
His Val Arg His Cys Glu Asp Met Ser Trp Gly Leu Lys Leu Val Asp
465 470 475 480
Asn
<210> 40
<211> 278
<212> PRT
<213> Neocallimastix californiae
<400> 40
Met Lys Leu Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln Tyr Ala Tyr
1 5 10 15
Gly Lys Ser Leu Glu His Lys Leu Gln Glu Lys Val Leu Phe Asp Val
20 25 30
Ser Trp Tyr Lys Tyr Leu Asn Lys Lys Lys Asn Glu Lys Leu Thr Lys
35 40 45
Arg Glu Tyr Gly Leu Gly Ile Phe Asn Leu Lys Ile Ser Phe Pro Thr
50 55 60
Lys Lys Gln Leu Lys Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Glu Lys Lys Ser
65 70 75 80
Tyr Ile Tyr Asp Glu Glu Leu Leu Gln Asn Lys Gly Ser Ser Tyr Tyr
85 90 95
Val Gly Tyr Phe Gln Asn Glu Lys Tyr Phe Lys Asp Ile Lys Asp Asn
100 105 110
Ile Lys Lys Ile Tyr Thr Phe Pro Lys Ile His Asp Thr Asp Lys Phe
115 120 125
Asn Gln Gln Trp Ile Asn Lys Ile Lys Asn Val Lys Asn Ser Val Phe
130 135 140
Ile His Ile Arg Arg Ala Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Gly Trp Val Leu
145 150 155 160
Ser Met Asp Tyr Tyr Lys Lys Ala Ile Glu Tyr Ile Lys Lys Asn Val
165 170 175
Glu Asn Pro Thr Phe Phe Ile Phe Cys Tyr Gln Cys Lys Asp Tyr Val
180 185 190
Glu Glu Gln Phe Lys Leu Asp Asp Thr Ile Gln Phe Ile Gly Glu Thr
195 200 205
Asn Ser Ile Asn Asn Glu Asn Trp Lys Asp Met Val Leu Met Lys Glu
210 215 220
Cys Lys Tyr Ala Ile Ile Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Ala Ala
225 230 235 240
Trp Leu Gly Arg Ala Asn Glu Glu Gly Ile Val Ile Ala Pro Ser Pro
245 250 255
Phe Ile Lys Asn Asn Asp Glu Ile Ile Cys Asp Asn Trp Ile Lys Ile
260 265 270
Asn Ser Asn Asn Ser Ser
275
<210> 41
<211> 587
<212> PRT
<213> Kluyveromyces lactis
<400> 41
Met Ala Asp His Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Gln Lys Lys Pro Ile
1 5 10 15
Asn Thr Ile Glu His Lys Asp Thr Leu Gly Asn Asp Arg Asp His Lys
20 25 30
Glu Ala Leu Asn Ser Asp Asn Asp Asn Thr Ser Gly Leu Lys Ile Asn
35 40 45
Gly Val Pro Ile Glu Asp Ala Arg Glu Glu Val Leu Leu Pro Gly Tyr
50 55 60
Leu Ser Lys Gln Tyr Tyr Lys Leu Tyr Gly Leu Cys Phe Ile Thr Tyr
65 70 75 80
Leu Cys Ala Thr Met Gln Gly Tyr Asp Gly Ala Leu Met Gly Ser Ile
85 90 95
Tyr Thr Glu Asp Ala Tyr Leu Lys Tyr Tyr His Leu Asp Ile Asn Ser
100 105 110
Ser Ser Gly Thr Gly Leu Val Phe Ser Ile Phe Asn Val Gly Gln Ile
115 120 125
Cys Gly Ala Phe Phe Val Pro Leu Met Asp Trp Lys Gly Arg Lys Pro
130 135 140
Ala Ile Leu Ile Gly Cys Leu Gly Val Val Ile Gly Ala Ile Ile Ser
145 150 155 160
Ser Leu Thr Thr Thr Lys Ser Ala Leu Ile Gly Gly Arg Trp Phe Val
165 170 175
Ala Phe Phe Ala Thr Ile Ala Asn Ala Ala Ala Pro Thr Tyr Cys Ala
180 185 190
Glu Val Ala Pro Ala His Leu Arg Gly Lys Val Ala Gly Leu Tyr Asn
195 200 205
Thr Leu Trp Ser Val Gly Ser Ile Val Ala Ala Phe Ser Thr Tyr Gly
210 215 220
Thr Asn Lys Asn Phe Pro Asn Ser Ser Lys Ala Phe Lys Ile Pro Leu
225 230 235 240
Tyr Leu Gln Met Met Phe Pro Gly Leu Val Cys Ile Phe Gly Trp Leu
245 250 255
Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val Gly Val Gly Arg Glu Glu Glu
260 265 270
Ala Arg Glu Phe Ile Ile Lys Tyr His Leu Asn Gly Asp Arg Thr His
275 280 285
Pro Leu Leu Asp Met Glu Met Ala Glu Ile Ile Glu Ser Phe His Gly
290 295 300
Thr Asp Leu Ser Asn Pro Leu Glu Met Leu Asp Val Arg Ser Leu Phe
305 310 315 320
Arg Thr Arg Ser Asp Arg Tyr Arg Ala Met Leu Val Ile Leu Met Ala
325 330 335
Trp Phe Gly Gln Phe Ser Gly Asn Asn Val Cys Ser Tyr Tyr Leu Pro
340 345 350
Thr Met Leu Arg Asn Val Gly Met Lys Ser Val Ser Leu Asn Val Leu
355 360 365
Met Asn Gly Val Tyr Ser Ile Val Thr Trp Ile Ser Ser Ile Cys Gly
370 375 380
Ala Phe Phe Ile Asp Lys Ile Gly Arg Arg Glu Gly Phe Leu Gly Ser
385 390 395 400
Ile Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Thr Gly Leu Ser Ile Cys Thr Ala
405 410 415
Arg Tyr Glu Lys Thr Lys Lys Lys Ser Ala Ser Asn Gly Ala Leu Val
420 425 430
Phe Ile Tyr Leu Phe Gly Gly Ile Phe Ser Phe Ala Phe Thr Pro Met
435 440 445
Gln Ser Met Tyr Ser Thr Glu Val Ser Thr Asn Leu Thr Arg Ser Lys
450 455 460
Ala Gln Leu Leu Asn Phe Val Val Ser Gly Val Ala Gln Phe Val Asn
465 470 475 480
Gln Phe Ala Thr Pro Lys Ala Met Lys Asn Ile Lys Tyr Trp Phe Tyr
485 490 495
Val Phe Tyr Val Phe Phe Asp Ile Phe Glu Phe Ile Val Ile Tyr Phe
500 505 510
Phe Phe Val Glu Thr Lys Gly Arg Ser Leu Glu Glu Leu Glu Val Val
515 520 525
Phe Glu Ala Pro Asn Pro Arg Lys Ala Ser Val Asp Gln Ala Phe Leu
530 535 540
Ala Gln Val Arg Ala Thr Leu Val Gln Arg Asn Asp Val Arg Val Ala
545 550 555 560
Asn Ala Gln Asn Leu Lys Glu Gln Glu Pro Leu Lys Ser Asp Ala Asp
565 570 575
His Val Glu Lys Leu Ser Glu Ala Glu Ser Val
580 585
<210> 42
<211> 373
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 42
Met Ser Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Val Thr Gly Gln Asp Gly Ser
1 5 10 15
Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Glu Val His Gly Ile
20 25 30
Lys Arg Arg Ala Ser Ser Phe Asn Thr Glu Arg Val Asp His Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Pro His Thr Cys Asn Pro Lys Phe His Leu His Tyr Gly Asp
50 55 60
Leu Ser Asp Thr Ser Asn Leu Thr Arg Ile Leu Arg Glu Val Gln Pro
65 70 75 80
Asp Glu Val Tyr Asn Leu Gly Ala Met Ser His Val Ala Val Ser Phe
85 90 95
Glu Ser Pro Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp Ala Met Gly Thr Leu Arg
100 105 110
Leu Leu Glu Ala Ile Arg Phe Leu Gly Leu Glu Lys Lys Thr Arg Phe
115 120 125
Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Leu Val Gln Glu Ile Pro
130 135 140
Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg Ser Pro Tyr Ala Val Ala
145 150 155 160
Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Thr Val Asn Tyr Arg Glu Ser Tyr Gly
165 170 175
Met Tyr Ala Cys Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg
180 185 190
Gly Glu Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Arg Ala Ile Ala Asn Ile
195 200 205
Ala Gln Gly Leu Glu Ser Cys Leu Tyr Leu Gly Asn Met Asp Ser Leu
210 215 220
Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val Lys Met Gln Trp Met Met
225 230 235 240
Leu Gln Gln Glu Gln Pro Glu Asp Phe Val Ile Ala Thr Gly Val Gln
245 250 255
Tyr Ser Val Arg Gln Phe Val Glu Met Ala Ala Ala Gln Leu Gly Ile
260 265 270
Lys Leu Arg Phe Glu Gly Thr Gly Val Glu Glu Lys Gly Val Val Val
275 280 285
Ser Val Thr Gly His Asp Ala Pro Gly Val Lys Pro Gly Asp Val Ile
290 295 300
Ile Ala Val Asp Pro Arg Tyr Phe Arg Pro Ala Glu Val Glu Thr Leu
305 310 315 320
Leu Gly Asp Pro Thr Lys Ala His Glu Lys Leu Gly Trp Lys Pro Glu
325 330 335
Ile Thr Leu Arg Glu Met Val Ser Glu Met Val Ala Asn Asp Leu Glu
340 345 350
Ala Ala Lys Lys His Ser Leu Leu Lys Ser His Gly Tyr Asp Val Ala
355 360 365
Ile Ala Leu Glu Ser
370
<210> 43
<211> 321
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 43
Met Ser Lys Gln Arg Val Phe Ile Ala Gly His Arg Gly Met Val Gly
1 5 10 15
Ser Ala Ile Arg Arg Gln Leu Glu Gln Arg Gly Asp Val Glu Leu Val
20 25 30
Leu Arg Thr Arg Asp Glu Leu Asn Leu Leu Asp Ser Arg Ala Val His
35 40 45
Asp Phe Phe Ala Ser Glu Arg Ile Asp Gln Val Tyr Leu Ala Ala Ala
50 55 60
Lys Val Gly Gly Ile Val Ala Asn Asn Thr Tyr Pro Ala Asp Phe Ile
65 70 75 80
Tyr Gln Asn Met Met Ile Glu Ser Asn Ile Ile His Ala Ala His Gln
85 90 95
Asn Asp Val Asn Lys Leu Leu Phe Leu Gly Ser Ser Cys Ile Tyr Pro
100 105 110
Lys Leu Ala Lys Gln Pro Met Ala Glu Ser Glu Leu Leu Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Glu Pro Thr Asn Glu Pro Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala Gly Ile
130 135 140
Lys Leu Cys Glu Ser Tyr Asn Arg Gln Tyr Gly Arg Asp Tyr Arg Ser
145 150 155 160
Val Met Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Pro His Asp Asn Phe His Pro Ser
165 170 175
Asn Ser His Val Ile Pro Ala Leu Leu Arg Arg Phe His Glu Ala Thr
180 185 190
Ala Gln Asn Ala Pro Asp Val Val Val Trp Gly Ser Gly Thr Pro Met
195 200 205
Arg Glu Phe Leu His Val Asp Asp Met Ala Ala Ala Ser Ile His Val
210 215 220
Met Glu Leu Ala His Glu Val Trp Leu Glu Asn Thr Gln Pro Met Leu
225 230 235 240
Ser His Ile Asn Val Gly Thr Gly Val Asp Cys Thr Ile Arg Glu Leu
245 250 255
Ala Gln Thr Ile Ala Lys Val Val Gly Tyr Lys Gly Arg Val Val Phe
260 265 270
Asp Ala Ser Lys Pro Asp Gly Thr Pro Arg Lys Leu Leu Asp Val Thr
275 280 285
Arg Leu His Gln Leu Gly Trp Tyr His Glu Ile Ser Leu Glu Ala Gly
290 295 300
Leu Ala Ser Thr Tyr Gln Trp Phe Leu Glu Asn Gln Asp Arg Phe Arg
305 310 315 320
Gly
<210> 44
<211> 323
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 44
Met Ala Glu Thr Ile Gly Ser Glu Val Ser Ser Met Ser Asp Lys Ser
1 5 10 15
Ala Lys Ile Phe Val Ala Gly His Arg Gly Leu Val Gly Ser Ala Ile
20 25 30
Val Arg Lys Leu Gln Glu Gln Gly Phe Thr Asn Leu Val Leu Lys Thr
35 40 45
His Ala Glu Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala Asp Val Glu Ser Phe Phe
50 55 60
Ser Gln Glu Lys Pro Val Tyr Val Ile Leu Ala Ala Ala Lys Val Gly
65 70 75 80
Gly Ile His Ala Asn Asn Thr Tyr Pro Ala Asp Phe Ile Gly Val Asn
85 90 95
Leu Gln Ile Gln Thr Asn Val Ile His Ser Ala Tyr Glu His Gly Val
100 105 110
Lys Lys Leu Leu Phe Leu Gly Ser Ser Cys Ile Tyr Pro Lys Phe Ala
115 120 125
Pro Gln Pro Ile Pro Glu Ser Ala Leu Leu Thr Ala Ser Leu Glu Pro
130 135 140
Thr Asn Glu Trp Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala Gly Ile Lys Thr Cys
145 150 155 160
Gln Ala Tyr Arg Ile Gln His Gly Trp Asp Ala Ile Ser Gly Met Pro
165 170 175
Thr Asn Leu Tyr Gly Pro Asn Asp Asn Phe His Pro Glu Asn Ser His
180 185 190
Val Leu Pro Ala Leu Met Arg Arg Phe His Glu Ala Lys Val Asn Gly
195 200 205
Ala Glu Glu Val Val Val Trp Gly Thr Gly Ser Pro Leu Arg Glu Phe
210 215 220
Leu His Val Asp Asp Leu Ala Asp Ala Cys Val Phe Leu Leu Asp Arg
225 230 235 240
Tyr Ser Gly Leu Glu His Val Asn Ile Gly Ser Gly Gln Glu Val Thr
245 250 255
Ile Arg Glu Leu Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Val Gly Phe Glu Gly
260 265 270
Lys Leu Gly Trp Asp Cys Thr Lys Pro Asp Gly Thr Pro Arg Lys Leu
275 280 285
Met Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Leu Gly Trp Thr Pro Lys Val Ser
290 295 300
Leu Arg Asp Gly Leu Ser Gln Thr Tyr Asp Trp Tyr Leu Lys Asn Val
305 310 315 320
Cys Asn Arg
<210> 45
<211> 310
<212> PRT
<213> Helicobacter pylori
<400> 45
Met Asn Glu Ile Ile Leu Ile Thr Gly Ala Tyr Gly Met Val Gly Gln
1 5 10 15
Asn Thr Ala Leu Tyr Phe Lys Lys Asn Lys Pro Asp Val Thr Leu Leu
20 25 30
Thr Pro Lys Lys Ser Glu Leu Cys Leu Leu Asp Lys Asp Asn Val Gln
35 40 45
Ala Tyr Leu Lys Glu Tyr Lys Pro Thr Gly Ile Ile His Cys Ala Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Val Glu Asn Leu Leu Met Gly Leu Tyr Leu Phe Ser Ser Ala Leu Asp
85 90 95
Ser Gly Val Lys Lys Ala Ile Asn Leu Ala Ser Ser Cys Ala Tyr Pro
100 105 110
Lys Phe Ala Pro Asn Pro Leu Lys Glu Ser Asp Leu Leu Asn Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Pro Thr Asn Glu Gly Tyr Ala Leu Ala Lys Leu Ser Val Met
130 135 140
Lys Tyr Cys Glu Tyr Val Ser Ala Glu Lys Gly Val Phe Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Leu Val Pro Cys Asn Leu Tyr Gly Glu Phe Asp Lys Phe Glu Glu Lys
165 170 175
Ile Ala His Met Ile Pro Gly Leu Ile Ala Arg Met His Thr Ala Lys
180 185 190
Leu Lys Asn Glu Lys Glu Phe Ala Met Trp Gly Asp Gly Thr Ala Arg
195 200 205
Arg Glu Tyr Leu Asn Ala Lys Asp Leu Ala Arg Phe Ile Ser Leu Ala
210 215 220
Tyr Glu Asn Ile Ala Ser Ile Pro Ser Val Met Asn Val Gly Ser Gly
225 230 235 240
Val Asp Tyr Ser Ile Glu Glu Tyr Tyr Glu Lys Val Ala Gln Val Leu
245 250 255
Asp Tyr Lys Gly Val Phe Val Lys Asp Leu Ser Lys Pro Val Gly Met
260 265 270
Gln Gln Lys Leu Met Asp Ile Ser Lys Gln Arg Ala Leu Lys Trp Glu
275 280 285
Leu Glu Ile Pro Leu Glu Gln Gly Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Tyr Tyr
290 295 300
Leu Lys Leu Leu Glu Val
305 310
<210> 46
<211> 322
<212> PRT
<213> Mortierella alpine
<400> 46
Met Ser Pro Ser Lys Ser Val Ile Met Val Thr Gly Gly Ser Gly Leu
1 5 10 15
Val Gly Lys Ala Ile Asp Trp Val Val Glu Asn Asp Ser Lys Tyr Gly
20 25 30
Lys Arg Glu Gly Glu Glu Trp Val Phe Leu Thr Ser Lys Asp Gly Asn
35 40 45
Leu Ile Asp Pro Ala Gln Thr Lys Ala Ile Phe Glu Lys Tyr Arg Pro
50 55 60
Thr His Val Ile His Leu Ala Ala Lys Val Gly Gly Leu Phe Gly Asn
65 70 75 80
Met Ala Ala Asn Leu Asp Tyr Phe Arg Asp Asn Leu Leu Ile Asn Asp
85 90 95
Asn Val Leu His Asn Ala Lys Glu Phe Gly Val Lys Lys Val Val Ser
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Pro His Asp Asn Phe His Leu Val Asn Ser His Val Ile Pro Gly Leu
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195 200 205
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225 230 235 240
Leu Ile Leu Ser Val Pro Glu Glu Glu Glu Val Ser Ile Lys Gln Val
245 250 255
Gly Asp Ser Ile Val Lys Ala Met Gly Tyr Thr Gly Asp Tyr Arg Phe
260 265 270
Asp Thr Thr Lys Ala Asp Gly Gln Tyr Lys Lys Thr Ala Ser Asn Lys
275 280 285
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Ala Leu Ser Glu Thr Val Glu Trp Phe Lys Glu Asn Val Asp Thr Ile
305 310 315 320
Arg Lys
<210> 47
<211> 298
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 47
Met Arg Ser Ile Ile Arg Leu Gln Gly Gly Leu Gly Asn Gln Leu Phe
1 5 10 15
Gln Phe Ser Phe Gly Tyr Ala Leu Ser Lys Ile Asn Gly Thr Pro Leu
20 25 30
Tyr Phe Asp Ile Ser His Tyr Ala Glu Asn Asp Asp His Gly Gly Tyr
35 40 45
Arg Leu Asn Asn Leu Gln Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln Tyr Tyr Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Pro Glu Ile Phe Leu Phe Leu Gly Phe Cys Asn Glu Phe His Ala
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Tyr Gly Tyr Asp Phe Glu Tyr Ile Ala Gln Lys Trp Lys Ser Lys Lys
100 105 110
Tyr Ile Gly Tyr Trp Gln Ser Glu His Phe Phe His Lys His Ile Leu
115 120 125
Asp Leu Lys Glu Phe Phe Ile Pro Lys Asn Val Ser Glu Gln Ala Asn
130 135 140
Leu Leu Ala Ala Lys Ile Leu Glu Ser Gln Ser Ser Leu Ser Ile His
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Gly Val Cys Ser Leu Glu Tyr Tyr Lys Lys Ala Leu Asn Lys Ile Arg
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Leu Ala Asn His His Ile Ile Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly
245 250 255
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260 265 270
Trp Tyr Asp Ile Thr Pro Lys Asn Thr Tyr Ile Pro Ile Val Asn His
275 280 285
Trp Ile Asn Val Asp Lys His Ser Ser Cys
290 295
<210> 48
<211> 298
<212> PRT
<213> Helicobacter pylori
<400> 48
Met Ala Phe Lys Val Val Gln Ile Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met
1 5 10 15
Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Leu Asn Thr Pro
20 25 30
Val Leu Leu Asp Ile Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asn Arg Lys Met Gln
35 40 45
Leu Glu Leu Phe Pro Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Ala Lys Glu Ile
50 55 60
Ala Ile Ala Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Asp Thr Leu
65 70 75 80
Lys Cys Met Gly Phe Asp Arg Val Ser Gln Glu Ile Val Phe Glu Tyr
85 90 95
Glu Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Arg Leu Thr Tyr Phe Tyr Gly Tyr
100 105 110
Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Asp Ala Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln
115 120 125
Thr Phe Thr Leu Pro Pro Pro Glu Asn Gly Asn Asn Lys Lys Lys Glu
130 135 140
Glu Glu Tyr His Arg Lys Leu Ala Leu Ile Leu Ala Ala Lys Asn Ser
145 150 155 160
Val Phe Val His Val Arg Arg Gly Asp Tyr Val Gly Ile Gly Cys Gln
165 170 175
Leu Gly Ile Asp Tyr Gln Lys Lys Ala Leu Glu Tyr Ile Ala Lys Arg
180 185 190
Val Pro Asn Met Glu Leu Phe Val Phe Cys Glu Asp Leu Lys Phe Thr
195 200 205
Gln Asn Leu Asp Leu Gly Tyr Pro Phe Met Asp Met Thr Thr Arg Asp
210 215 220
Lys Glu Glu Glu Ala Tyr Trp Asp Met Leu Leu Met Gln Ser Cys Lys
225 230 235 240
His Gly Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu
245 250 255
Ile Asn Asn Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp Leu Phe
260 265 270
Gly His Glu Asn Ile Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile Glu Ser His
275 280 285
Phe Glu Val Lys Ser Lys Lys Tyr Asn Ala
290 295
<210> 49
<211> 287
<212> PRT
<213> Bacteroides fragilis
<400> 49
Met Leu Tyr Val Ile Leu Arg Gly Arg Leu Gly Asn Asn Leu Phe Gln
1 5 10 15
Ile Ala Thr Ala Ala Ser Leu Thr Gln Asn Phe Ile Phe Cys Thr Val
20 25 30
Asn Lys Asp Gln Glu Arg Gln Val Leu Leu Tyr Lys Asp Ser Phe Phe
35 40 45
Lys Asn Ile Lys Val Met Lys Gly Val Pro Asp Gly Ile Pro Tyr Tyr
50 55 60
Lys Glu Pro Phe His Glu Phe Ser Arg Ile Pro Tyr Glu Glu Gly Lys
65 70 75 80
Asp Leu Ile Ile Asp Gly Tyr Phe Gln Ser Glu Lys Tyr Phe Lys Arg
85 90 95
Ser Val Val Leu Asp Leu Tyr Arg Ile Thr Asp Glu Leu Arg Lys Lys
100 105 110
Ile Trp Asn Ile Cys Gly Asn Ile Leu Glu Lys Gly Glu Thr Val Ser
115 120 125
Ile His Val Arg Arg Gly Asp Tyr Leu Lys Leu Pro His Ala Leu Pro
130 135 140
Phe Cys Gly Lys Ser Tyr Tyr Lys Asn Ala Ile Gln Tyr Ile Gly Glu
145 150 155 160
Asp Lys Ile Phe Ile Ile Cys Ser Asp Asp Ile Asp Trp Cys Lys Lys
165 170 175
Asn Phe Ile Gly Lys Arg Tyr Tyr Phe Ile Glu Asn Thr Thr Pro Leu
180 185 190
Leu Asp Leu Tyr Ile Gln Ser Leu Cys Thr His Asn Ile Ile Ser Asn
195 200 205
Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly Ala Trp Leu Asn Glu Asn Ser Asn Lys
210 215 220
Ile Val Ile Ala Pro Gln Met Trp Phe Gly Ile Ser Val Lys Leu Gly
225 230 235 240
Val Ser Asp Leu Leu Pro Val Ser Trp Val Arg Leu Pro Asn Asn Tyr
245 250 255
Thr Leu Gly Arg Tyr Cys Phe Ala Leu Tyr Lys Val Val Glu Asp Tyr
260 265 270
Leu Leu Asn Ile Leu Arg Leu Ile Trp Lys Arg Lys Lys Asn Met
275 280 285
<210> 50
<211> 290
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 50
Met Ser Ile Val Val Ala Arg Leu Ala Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met
1 5 10 15
Phe Gln Tyr Ala Lys Gly Tyr Ala Glu Ser Val Glu Arg Asn Ser Ser
20 25 30
Leu Lys Leu Asp Leu Arg Gly Tyr Lys Asn Tyr Thr Leu His Gly Gly
35 40 45
Phe Arg Leu Asp Lys Leu Asn Ile Asp Asn Thr Phe Val Met Ser Lys
50 55 60
Lys Glu Met Cys Ile Phe Pro Asn Phe Ile Val Arg Ala Ile Asn Lys
65 70 75 80
Phe Pro Lys Leu Ser Leu Cys Ser Lys Arg Phe Glu Ser Glu Gln Tyr
85 90 95
Ser Lys Lys Ile Asn Gly Ser Met Lys Gly Ser Val Glu Phe Ile Gly
100 105 110
Phe Trp Gln Asn Glu Arg Tyr Phe Leu Glu His Lys Glu Lys Leu Arg
115 120 125
Glu Ile Phe Thr Pro Ile Asn Ile Asn Leu Asp Ala Lys Glu Leu Ser
130 135 140
Asp Val Ile Arg Cys Thr Asn Ser Val Ser Val His Ile Arg Arg Gly
145 150 155 160
Asp Tyr Val Ser Asn Val Glu Ala Leu Lys Ile His Gly Leu Cys Thr
165 170 175
Glu Arg Tyr Tyr Ile Asp Ser Ile Arg Tyr Leu Lys Glu Arg Phe Asn
180 185 190
Asn Leu Val Phe Phe Val Phe Ser Asp Asp Ile Glu Trp Cys Lys Lys
195 200 205
Tyr Lys Asn Glu Ile Phe Ser Arg Ser Asp Asp Val Lys Phe Ile Glu
210 215 220
Gly Asn Thr Gln Glu Val Asp Met Trp Leu Met Ser Asn Ala Lys Tyr
225 230 235 240
His Ile Ile Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly Ala Trp Leu Lys
245 250 255
Asn Tyr Asp Leu Gly Ile Thr Ile Ala Pro Thr Pro Trp Phe Glu Arg
260 265 270
Glu Glu Leu Asn Ser Phe Asp Pro Cys Pro Glu Lys Trp Val Arg Ile
275 280 285
Glu Lys
290
<210> 51
<211> 302
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 51
Met Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Ala Tyr Ile Leu Gln Arg Lys Leu Lys Gln Arg Ser Leu Val
20 25 30
Leu Asp Asp Ser Tyr Phe Leu Asp Cys Ser Asn Arg Asp Thr Arg Arg
35 40 45
Arg Phe Glu Leu Asn Gln Phe Asn Ile Cys Tyr Asp Arg Leu Thr Thr
50 55 60
Ser Lys Glu Lys Lys Glu Ile Ser Ile Ile Arg His Val Asn Arg Tyr
65 70 75 80
Arg Leu Pro Leu Phe Val Thr Asn Ser Ile Phe Gly Val Leu Leu Lys
85 90 95
Lys Asn Tyr Leu Pro Glu Ala Lys Phe Tyr Glu Phe Leu Asn Asn Cys
100 105 110
Lys Leu Gln Val Lys Asn Gly Tyr Cys Leu Phe Ser Tyr Phe Gln Asp
115 120 125
Ala Thr Leu Ile Asp Ser His Arg Asp Met Ile Leu Pro Leu Phe Gln
130 135 140
Ile Asn Glu Asp Leu Leu His Leu Cys Asn Asp Leu His Ile Tyr Lys
145 150 155 160
Lys Val Ile Cys Glu Asn Ala Asn Thr Thr Ser Leu His Ile Arg Arg
165 170 175
Gly Asp Tyr Ile Thr Asn Pro His Ala Ser Lys Phe His Gly Val Leu
180 185 190
Pro Met Asp Tyr Tyr Glu Lys Ala Ile Arg Tyr Ile Glu Asp Val Gln
195 200 205
Gly Glu Gln Val Ile Ile Val Phe Ser Asp Asp Val Lys Trp Ala Glu
210 215 220
Asn Thr Phe Ala Asn Gln Pro Asn Tyr Tyr Val Val Asn Asn Ser Glu
225 230 235 240
Cys Glu Tyr Ser Ala Ile Asp Met Phe Leu Met Ser Lys Cys Lys Asn
245 250 255
Asn Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Gly Ala Trp Leu Asn
260 265 270
Thr Phe Glu Asp Lys Ile Val Val Ser Pro Arg Lys Trp Phe Ala Gly
275 280 285
Asn Asn Lys Ser Lys Leu Thr Met Asp Ser Trp Ile Asn Leu
290 295 300
<210> 52
<211> 283
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 52
Met Glu Val Lys Ile Ile Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln Tyr
1 5 10 15
Ala Thr Ala Phe Ala Ile Ala Lys Arg Thr His Gln Asn Leu Thr Val
20 25 30
Asp Ile Ser Asp Ala Val Lys Tyr Lys Thr His Pro Leu Arg Leu Val
35 40 45
Glu Leu Ser Cys Ser Ser Glu Phe Val Lys Lys Ala Trp Pro Phe Glu
50 55 60
Lys Tyr Leu Phe Ser Glu Lys Ile Pro His Phe Met Lys Lys Gly Met
65 70 75 80
Phe Arg Lys His Tyr Val Glu Lys Ser Leu Glu Tyr Asp Pro Asp Ile
85 90 95
Asp Thr Lys Ser Ile Asn Lys Lys Ile Val Gly Tyr Phe Gln Thr Glu
100 105 110
Lys Tyr Phe Lys Glu Phe Arg His Glu Leu Ile Lys Glu Phe Gln Pro
115 120 125
Lys Thr Lys Phe Asn Ser Tyr Gln Asn Glu Leu Leu Asn Leu Ile Lys
130 135 140
Glu Asn Asp Thr Cys Ser Leu His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Val Ser
145 150 155 160
Ser Lys Ile Ala Asn Glu Thr His Gly Thr Cys Ser Glu Lys Tyr Phe
165 170 175
Glu Arg Ala Ile Asp Tyr Leu Met Asn Lys Gly Val Ile Asn Lys Lys
180 185 190
Thr Leu Leu Phe Ile Phe Ser Asp Asp Ile Lys Trp Cys Arg Glu Asn
195 200 205
Ile Phe Phe Asn Asn Gln Ile Cys Phe Val Gln Gly Asp Ala Tyr His
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Val Glu Leu Asp Met Leu Leu Met Ser Lys Cys Lys Asn Asn Ile Ile
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Ala Ala Trp Leu Asn Glu Asn Lys
245 250 255
Asn Lys Thr Val Ile Ala Pro Ser Lys Trp Phe Lys Lys Asp Ile Lys
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His Asp Ile Ile Pro Glu Ser Trp Val Lys Leu
275 280
<210> 53
<211> 301
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 53
Met Val Met Met Tyr Cys Cys Leu Ser Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met
1 5 10 15
Phe Gln Tyr Ala Ala Ala Tyr Ile Leu Lys Gln His Phe Pro Asp Thr
20 25 30
Ile Leu Val Leu Asp Asp Ser Tyr Tyr Phe Asn Gln Pro Gln Lys Asp
35 40 45
Thr Ile Arg His Leu Glu Leu Asp Gln Phe Lys Ile Ile Phe Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Ser Lys Asp Glu Lys Val Lys Ile Asn Arg Leu Arg Lys His
65 70 75 80
Lys Lys Ile Pro Leu Leu Asn Ser Phe Leu Gln Phe Thr Ala Ile Lys
85 90 95
Leu Cys Asn Lys Tyr Ser Leu Asn Asp Ala Ser Tyr Tyr Asn Pro Glu
100 105 110
Ser Ile Lys Asn Ile Asp Val Ala Cys Leu Phe Ser Phe Tyr Gln Asp
115 120 125
Ser Lys Leu Leu Asn Glu His Arg Asp Leu Ile Leu Pro Leu Phe Glu
130 135 140
Ile Arg Asp Asp Leu Arg Val Leu Cys His Asn Leu Gln Ile Tyr Ser
145 150 155 160
Leu Ile Thr Asp Ser Lys Asn Ile Thr Ser Ile His Val Arg Arg Gly
165 170 175
Asp Tyr Val Asn Asn Lys His Ala Ala Lys Phe His Gly Thr Leu Ser
180 185 190
Met Asp Tyr Tyr Ile Ser Ala Met Glu Tyr Ile Glu Ser Glu Cys Gly
195 200 205
Ser Gln Thr Phe Ile Ile Phe Thr Asp Asp Val Ile Trp Ala Lys Glu
210 215 220
Lys Phe Ser Lys Tyr Ser Asn Cys Leu Val Ala Asp Ala Asp Glu Asn
225 230 235 240
Lys Phe Ser Val Ile Asp Met Tyr Leu Met Ser Leu Cys Asn Asn Asn
245 250 255
Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Gly Ala Trp Leu Asn Arg
260 265 270
Ser Glu Asp Lys Leu Val Ile Ala Pro Lys Gln Trp Tyr Ile Ser Gly
275 280 285
Asn Glu Cys Ser Leu Lys Asn Glu Asn Trp Ile Ala Met
290 295 300
<210> 54
<211> 477
<212> PRT
<213> Helicobacter pylori
<400> 54
Met Val Phe Gln Pro Leu Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ser Ala Ser Ile
1 5 10 15
Glu Lys Met Val Ser Lys Ser Pro Pro Pro Pro Leu Lys Ile Ala Val
20 25 30
Ala Asn Trp Trp Gly Asp Glu Glu Ile Lys Glu Phe Lys Lys Ser Val
35 40 45
Leu Tyr Phe Ile Leu Ser Gln Arg Tyr Ala Ile Thr Leu His Gln Asn
50 55 60
Pro Asn Glu Ser Ser Asp Leu Val Phe Ser Asn Pro Leu Gly Ala Ala
65 70 75 80
Arg Lys Ile Leu Ser Tyr Gln Asn Thr Lys Arg Val Phe Tyr Thr Gly
85 90 95
Glu Asn Glu Ser Pro Asn Phe Asn Leu Phe Asp Tyr Ala Ile Gly Phe
100 105 110
Asp Glu Leu Asp Phe Asn Asp Arg Tyr Leu Arg Met Pro Leu Tyr Tyr
115 120 125
Ala His Leu His Tyr Glu Ala Glu Leu Val Asn Asp Thr Thr Ala Pro
130 135 140
Tyr Lys Leu Lys Asp Asn Ser Leu Tyr Ala Leu Lys Lys Pro Ser His
145 150 155 160
His Phe Lys Glu Asn His Pro Asn Leu Cys Ala Val Val Asn Asp Glu
165 170 175
Ser Asp Leu Leu Lys Arg Gly Phe Ala Ser Phe Val Ala Ser Asn Ala
180 185 190
Asn Ala Pro Met Arg Asn Ala Phe Tyr Asp Ala Leu Asn Ser Ile Glu
195 200 205
Pro Val Thr Gly Gly Gly Ser Val Arg Asn Thr Leu Gly Tyr Lys Val
210 215 220
Gly Asn Lys Ser Glu Phe Leu Ser Gln Tyr Lys Phe Asn Leu Cys Phe
225 230 235 240
Glu Asn Ser Gln Gly Tyr Gly Tyr Val Thr Glu Lys Ile Leu Asp Ala
245 250 255
Tyr Phe Ser His Thr Ile Pro Ile Tyr Trp Gly Ser Pro Ser Val Ala
260 265 270
Lys Asp Phe Asn Pro Lys Ser Phe Val Asn Val His Asp Phe Asn Asn
275 280 285
Phe Asp Glu Ala Ile Asp Tyr Ile Lys Tyr Leu His Thr His Pro Asn
290 295 300
Ala Tyr Leu Asp Met Leu Tyr Glu Asn Pro Leu Asn Thr Leu Asp Gly
305 310 315 320
Lys Ala Tyr Phe Tyr Gln Asp Leu Ser Phe Lys Lys Ile Leu Asp Phe
325 330 335
Phe Lys Thr Ile Leu Glu Asn Asp Thr Ile Tyr His Asn Asn Pro Phe
340 345 350
Ile Phe Tyr Arg Asp Leu His Glu Pro Leu Ile Ser Ile Asp Asp Leu
355 360 365
Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val
370 375 380
Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr
385 390 395 400
Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp
405 410 415
Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg
420 425 430
Val Asn Tyr Asp Arg Leu Leu Gln Asn Ala Ser Pro Leu Leu Glu Leu
435 440 445
Ser Gln Asn Thr Thr Phe Lys Ile Tyr Arg Lys Ala Tyr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Pro Leu Leu Arg Thr Ile Arg Arg Trp Val Lys Lys
465 470 475
<210> 55
<211> 286
<212> PRT
<213> Helicobacter mustelae
<400> 55
Met Asp Phe Lys Ile Val Gln Val His Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met
1 5 10 15
Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Thr His Leu Asn Ile Pro
20 25 30
Val Leu Leu Asp Thr Thr Trp Phe Asp Tyr Gly Asn Arg Glu Leu Gly
35 40 45
Leu His Leu Phe Pro Ile Asp Leu Gln Cys Ala Ser Ala Gln Gln Ile
50 55 60
Ala Ala Ala His Met Gln Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Gly Ala Leu
65 70 75 80
Arg Arg Met Gly Leu Gly Arg Val Ser Lys Glu Ile Val Phe Glu Tyr
85 90 95
Met Pro Glu Leu Phe Glu Pro Ser Arg Ile Ala Tyr Phe His Gly Tyr
100 105 110
Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Glu Asp Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln
115 120 125
Thr Phe Thr Leu Pro His Pro Thr Glu His Ala Glu Gln Tyr Ser Arg
130 135 140
Lys Leu Ser Gln Ile Leu Ala Ala Lys Asn Ser Val Phe Val His Ile
145 150 155 160
Arg Arg Gly Asp Tyr Met Arg Leu Gly Trp Gln Leu Asp Ile Ser Tyr
165 170 175
Gln Leu Arg Ala Ile Ala Tyr Met Ala Lys Arg Val Gln Asn Leu Glu
180 185 190
Leu Phe Leu Phe Cys Glu Asp Leu Glu Phe Val Gln Asn Leu Asp Leu
195 200 205
Gly Tyr Pro Phe Val Asp Met Thr Thr Arg Asp Gly Ala Ala His Trp
210 215 220
Asp Met Met Leu Met Gln Ser Cys Lys His Gly Ile Ile Thr Asn Ser
225 230 235 240
Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ile Lys Asn Pro Glu Lys Ile
245 250 255
Ile Ile Gly Pro Ser His Trp Ile Tyr Gly Asn Glu Asn Ile Leu Cys
260 265 270
Lys Asp Trp Val Lys Ile Glu Ser Gln Phe Glu Thr Lys Ser
275 280 285
<210> 56
<211> 327
<212> PRT
<213> Helicobacter bilis
<400> 56
Met Glu Asp Asn Leu Ile Ile Val Arg Val Asp Gly Gly Ile Ala Ser
1 5 10 15
Gln Ile Gly Phe Val Ala Leu Gly Lys Ala Phe Glu Glu Lys Gly Tyr
20 25 30
Gln Val Lys Tyr Asp Leu Ser Trp Phe Glu Thr Ser Gly Lys Gly Phe
35 40 45
Tyr Asn Thr Ile Asn Gly Tyr Asp Arg Ile Tyr Asp Leu Thr Phe Asp
50 55 60
Met Pro Lys Ala Phe Pro Gln Leu Glu Met Lys Ile Ala Ser Glu Asp
65 70 75 80
Glu Val Lys Arg Tyr Asn Lys Leu Tyr Phe Ile Asp Asp Glu Lys Val
85 90 95
Ile Thr His Lys Pro Pro Leu Tyr Val Gly Gly Tyr Leu Gly Arg His
100 105 110
Tyr Asp Ile Tyr Phe Ala Arg His Phe Ala Thr Tyr Phe Ser Pro Lys
115 120 125
Glu Ile Glu Gln Lys Asp Ala Pro Phe Tyr Ile Leu Leu Gln Glu Ile
130 135 140
Leu Asn Thr Gln Ser Cys Gly Ile His Ile Arg Arg Gly Asp Leu Ser
145 150 155 160
Gln Asn His Ile Val Tyr Gly Glu Pro Thr Ser Leu Thr Tyr Phe Glu
165 170 175
Arg Val Ile Gln Leu Val Ala Gln Met Asn Ser Lys Ser Val Phe Tyr
180 185 190
Leu Phe Ser Asp Asp Val Ala Trp Val Arg Glu His Ile Ala Pro Leu
195 200 205
Leu Lys Asp Lys Gln Phe Lys Ile Cys Asp Ile Asn Thr Pro Glu Gln
210 215 220
Gly Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Leu Ser Arg Cys Lys Val Ile Val Ala
225 230 235 240
Ser His Gly Ser Leu Gly Ala Tyr Ala Lys Ile Leu Ala Pro His Asn
245 250 255
Pro Leu Leu Ile Ala Pro Arg Val Arg Asn Val Phe Phe Glu Met Glu
260 265 270
Asn Val Met Leu Val Asn Trp Gly Ala Lys Leu Gln Ile Thr Gln Pro
275 280 285
Cys Asn Asn Val Ile Thr Pro Pro Pro His Cys Gln Asn Leu Thr Leu
290 295 300
Arg Tyr Arg Leu Phe Leu Tyr Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Ser Lys Leu
305 310 315 320
Leu Arg Lys Gly Val Ile Gln
325
<210> 57
<211> 319
<212> PRT
<213> Campylobacter jejuni
<400> 57
Met Leu Glu Ser Asn Phe Val Ile Ile Arg Val Asp Gly Gly Ile Val
1 5 10 15
Ser Gln Leu Tyr Phe Phe Ala Ile Gly Lys Leu Phe Glu Lys Lys Gly
20 25 30
Tyr Lys Val Lys Tyr Asp Ile Thr Trp Phe Glu Glu Glu Gly Leu Gly
35 40 45
Phe Tyr Asn Ile Asn Lys Gly Tyr Asp Lys Thr Tyr Asn Ile Asn Trp
50 55 60
Asp Ile Pro Lys Ile Phe Pro Asn Ile Ser Ile Glu Ile Ala Ser Lys
65 70 75 80
Ser Glu Ile Asp Gln Tyr Lys Lys Phe Arg Val Asp Ser Glu Leu Val
85 90 95
Leu Glu Tyr Gln Pro Pro Leu Tyr Val Val Gly Tyr Asn Ser Lys Cys
100 105 110
Asp Ile Val Glu Ile Cys Arg Glu Ile Arg Glu Phe Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Glu Leu Leu Ser Asp Asn Lys Ile Lys Phe Leu Ala Asn Glu Ile Lys
130 135 140
Arg Asn Arg Ser Cys Gly Val His Val Arg Arg Gly Asp Leu Ser Gln
145 150 155 160
Glu His Val Val Tyr Gly Lys Pro Thr Ser Val Asp Tyr Phe Phe Lys
165 170 175
Cys Ile Asn Ile Val Arg Ser Met Tyr Ser Asp Ala Lys Phe Tyr Phe
180 185 190
Phe Ser Asp Asp Asn Lys Trp Val Lys Asp Asn Ile Ala Pro His Ile
195 200 205
Glu Asn Leu Asp Tyr Phe Ile Cys Asp Ile Asn Thr Pro Glu Lys Gly
210 215 220
Tyr Leu Asp Leu Tyr Phe Leu Ser Leu Cys Lys Ile Ile Ile Gly Ser
225 230 235 240
His Gly Ser Met Gly Leu Gly Ala Lys Leu Leu Ser Gln Glu Glu Thr
245 250 255
Leu Phe Ile Thr Pro Lys Tyr Asn Tyr Met Leu Phe Ser Met Ser Asn
260 265 270
Ile Met Met Ile Asn Phe Glu Pro Lys Asn Met Glu Pro Phe Asn Pro
275 280 285
Lys Ile Lys Lys Ile Lys Tyr Lys Ile Leu Ile Lys Ile Tyr Tyr Tyr
290 295 300
Ile Arg Gln Ile Leu Leu Arg Lys Phe Leu Ile Lys Gly Ser Asp
305 310 315
<210> 58
<211> 281
<212> PRT
<213> Bacteroides vulgatus
<400> 58
Met Arg Leu Ile Lys Val Thr Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Ile
1 5 10 15
Tyr Ala Phe Tyr Leu Arg Met Lys Lys Tyr Tyr Pro Lys Val Arg Ile
20 25 30
Asp Leu Ser Asp Met Met His Tyr Lys Val His Tyr Gly Tyr Glu Met
35 40 45
His Arg Val Phe Asn Leu Pro His Thr Glu Phe Cys Ile Asn Gln Pro
50 55 60
Leu Lys Lys Val Ile Glu Phe Leu Phe Phe Lys Lys Ile Tyr Glu Arg
65 70 75 80
Lys Gln Ala Pro Asn Ser Leu Arg Ala Phe Glu Lys Lys Tyr Phe Trp
85 90 95
Pro Leu Leu Tyr Phe Lys Gly Phe Tyr Gln Ser Glu Arg Phe Phe Ala
100 105 110
Asp Ile Lys Asp Glu Val Arg Glu Ser Phe Thr Phe Asp Lys Asn Lys
115 120 125
Ala Asn Ser Arg Ser Leu Asn Met Leu Glu Ile Leu Asp Lys Asp Glu
130 135 140
Asn Ala Val Ser Leu His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Leu Gln Pro Lys
145 150 155 160
His Trp Ala Thr Thr Gly Ser Val Cys Gln Leu Pro Tyr Tyr Gln Asn
165 170 175
Ala Ile Ala Glu Met Ser Arg Arg Val Ala Ser Pro Ser Tyr Tyr Ile
180 185 190
Phe Ser Asp Asp Ile Ala Trp Val Lys Glu Asn Leu Pro Leu Gln Asn
195 200 205
Ala Val Tyr Ile Asp Trp Asn Thr Asp Glu Asp Ser Trp Gln Asp Met
210 215 220
Met Leu Met Ser His Cys Lys His His Ile Ile Cys Asn Ser Thr Phe
225 230 235 240
Ser Trp Trp Gly Ala Trp Leu Asn Pro Asn Met Asp Lys Thr Val Ile
245 250 255
Val Pro Ser Arg Trp Phe Gln His Ser Glu Ala Pro Asp Ile Tyr Pro
260 265 270
Thr Gly Trp Ile Lys Val Pro Val Ser
275 280
<210> 59
<211> 289
<212> PRT
<213> Bacteroides fragilis
<400> 59
Met Ile Val Ser Ser Leu Arg Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Ile
1 5 10 15
Tyr Ala Met Val Lys Ala Met Ala Leu Arg Asn Asn Val Pro Phe Ala
20 25 30
Phe Asn Leu Thr Thr Asp Phe Ala Asn Asp Glu Val Tyr Lys Arg Lys
35 40 45
Leu Leu Leu Ser Tyr Phe Ala Leu Asp Leu Pro Glu Asn Lys Lys Leu
50 55 60
Thr Phe Asp Phe Ser Tyr Gly Asn Tyr Tyr Arg Arg Leu Ser Arg Asn
65 70 75 80
Leu Gly Cys His Ile Leu His Pro Ser Tyr Arg Tyr Ile Cys Glu Glu
85 90 95
Arg Pro Pro His Phe Glu Ser Arg Leu Ile Ser Ser Lys Ile Thr Asn
100 105 110
Ala Phe Leu Glu Gly Tyr Trp Gln Ser Glu Lys Tyr Phe Leu Asp Tyr
115 120 125
Lys Gln Glu Ile Lys Glu Asp Phe Val Ile Gln Lys Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Thr Ser Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Ile Lys Leu Leu Asp Lys Asn Ala
145 150 155 160
Ile Met Ile Gly Val Arg Arg Tyr Gln Glu Ser Asp Val Ala Pro Gly
165 170 175
Gly Val Leu Glu Asp Asp Tyr Tyr Lys Cys Ala Met Asp Ile Met Ala
180 185 190
Ser Lys Val Thr Ser Pro Val Phe Phe Cys Phe Ser Gln Asp Leu Glu
195 200 205
Trp Val Glu Lys His Leu Ala Gly Lys Tyr Pro Val Arg Leu Ile Ser
210 215 220
Lys Lys Glu Asp Asp Ser Gly Thr Ile Asp Asp Met Phe Leu Met Met
225 230 235 240
His Phe Arg Asn Tyr Ile Ile Ser Asn Ser Ser Phe Tyr Trp Trp Gly
245 250 255
Ala Trp Leu Ser Lys Tyr Asp Asp Lys Leu Val Ile Ala Pro Gly Asn
260 265 270
Phe Ile Asn Lys Asp Ser Val Pro Glu Ser Trp Phe Lys Leu Asn Val
275 280 285
Arg
<210> 60
<211> 381
<212> PRT
<213> Helicobacter pylori
<400> 60
Met Lys Glu Lys Ile Ala Leu Ile Thr Gly Val Thr Gly Gln Asp Gly
1 5 10 15
Ser Tyr Leu Ala Glu Tyr Leu Leu Asn Leu Gly Tyr Glu Val His Gly
20 25 30
Leu Lys Arg Arg Ser Ser Ser Ile Asn Thr Ser Arg Ile Asp His Leu
35 40 45
Tyr Glu Asp Leu His Ser Asp His Lys Arg Arg Phe Phe Leu His Tyr
50 55 60
Gly Asp Met Thr Asp Ser Ser Asn Leu Ile His Leu Ile Ala Thr Thr
65 70 75 80
Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Ala Ala Gln Ser His Val Lys Val
85 90 95
Ser Phe Glu Thr Pro Glu Tyr Thr Ala Asn Ala Asp Gly Ile Gly Thr
100 105 110
Leu Arg Ile Leu Glu Ala Met Arg Ile Leu Gly Leu Glu Lys Lys Thr
115 120 125
Arg Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Glu Val Leu Glu
130 135 140
Thr Pro Gln Asn Glu Asn Thr Pro Phe Asn Pro Arg Ser Pro Tyr Ala
145 150 155 160
Val Ala Lys Met Tyr Ala Phe Tyr Ile Thr Lys Asn Tyr Arg Glu Ala
165 170 175
Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser Arg
180 185 190
Val Arg Gly Glu Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Arg Ala Ala Ser
195 200 205
Ala Ile Ala Tyr Asn Leu Thr Asp Cys Leu Tyr Leu Gly Asn Leu Asp
210 215 220
Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val Lys Met Met His
225 230 235 240
Leu Met Leu Gln Ala Pro Ile Pro Gln Asp Tyr Val Ile Ala Thr Gly
245 250 255
Lys Thr Thr Ser Val Arg Asp Phe Val Lys Met Ser Phe Glu Phe Ile
260 265 270
Gly Ile Asn Leu Glu Phe Gln Asn Thr Gly Ile Lys Glu Ile Gly Leu
275 280 285
Ile Lys Ser Val Asp Glu Lys Arg Ala Asn Ala Leu Lys Leu Asn Leu
290 295 300
Ser His Leu Lys Lys Gly Gln Ile Val Val Arg Ile Asp Glu Arg Tyr
305 310 315 320
Phe Arg Pro Thr Glu Val Asp Leu Leu Leu Gly Asp Pro Thr Lys Ala
325 330 335
Glu Lys Glu Leu Asp Trp Val Arg Glu Tyr Asp Leu Lys Glu Leu Val
340 345 350
Lys Asp Met Leu Glu Tyr Asp Leu Lys Glu Cys Gln Lys Asn Leu Tyr
355 360 365
Leu Gln Asp Gly Gly Tyr Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Glu
370 375 380
<210> 61
<211> 373
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 61
Met Ala Ser Glu Asn Asn Gly Ser Arg Ser Asp Ser Glu Ser Ile Thr
1 5 10 15
Ala Pro Lys Ala Asp Ser Thr Val Val Glu Pro Arg Lys Ile Ala Leu
20 25 30
Ile Thr Gly Ile Thr Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Thr Glu Phe Leu
35 40 45
Leu Gly Lys Gly Tyr Glu Val His Gly Leu Ile Arg Arg Ser Ser Asn
50 55 60
Phe Asn Thr Gln Arg Ile Asn His Ile Tyr Ile Asp Pro His Asn Val
65 70 75 80
Asn Lys Ala Leu Met Lys Leu His Tyr Ala Asp Leu Thr Asp Ala Ser
85 90 95
Ser Leu Arg Arg Trp Ile Asp Val Ile Lys Pro Asp Glu Val Tyr Asn
100 105 110
Leu Ala Ala Gln Ser His Val Ala Val Ser Phe Glu Ile Pro Asp Tyr
115 120 125
Thr Ala Asp Val Val Ala Thr Gly Ala Leu Arg Leu Leu Glu Ala Val
130 135 140
Arg Ser His Thr Ile Asp Ser Gly Arg Thr Val Lys Tyr Tyr Gln Ala
145 150 155 160
Gly Ser Ser Glu Met Phe Gly Ser Thr Pro Pro Pro Gln Ser Glu Thr
165 170 175
Thr Pro Phe His Pro Arg Ser Pro Tyr Ala Ala Ser Lys Cys Ala Ala
180 185 190
His Trp Tyr Thr Val Asn Tyr Arg Glu Ala Tyr Gly Leu Phe Ala Cys
195 200 205
Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Glu Asn Phe
210 215 220
Val Thr Arg Lys Ile Thr Arg Ala Leu Gly Arg Ile Lys Val Gly Leu
225 230 235 240
Gln Thr Lys Leu Phe Leu Gly Asn Leu Gln Ala Ser Arg Asp Trp Gly
245 250 255
Phe Ala Gly Asp Tyr Val Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Gln Glu
260 265 270
Lys Pro Asp Asp Tyr Val Val Ala Thr Glu Glu Gly His Thr Val Glu
275 280 285
Glu Phe Leu Asp Val Ser Phe Gly Tyr Leu Gly Leu Asn Trp Lys Asp
290 295 300
Tyr Val Glu Ile Asp Gln Arg Tyr Phe Arg Pro Ala Glu Val Asp Asn
305 310 315 320
Leu Gln Gly Asp Ala Ser Lys Ala Lys Glu Val Leu Gly Trp Lys Pro
325 330 335
Gln Val Gly Phe Glu Lys Leu Val Lys Met Met Val Asp Glu Asp Leu
340 345 350
Glu Leu Ala Lys Arg Glu Lys Val Leu Val Asp Ala Gly Tyr Met Asp
355 360 365
Ala Lys Gln Gln Pro
370
<210> 62
<211> 365
<212> PRT
<213> Mortierella alpine
<400> 62
Met Ser Ser Pro Ile Glu Val Val Asn Met Ser Pro Ala Asp Tyr Arg
1 5 10 15
Asn Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr Gly Gln Asp Gly Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Glu Leu Leu Ile Glu Lys Gly Tyr Gln Val His Gly Ile
35 40 45
Ile Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg Ile Glu His Leu Tyr
50 55 60
Lys Asp Ala His Glu Asn Pro Lys Met Arg Leu His His Gly Asp Leu
65 70 75 80
Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val His Ile Ile Ser Lys Val Leu Pro Thr
85 90 95
Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser His Val Lys Val Ser Phe Asp
100 105 110
Met Ser Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp Ala Val Gly Thr Leu Arg Leu
115 120 125
Leu Asp Ala Ile Arg Thr Cys Gly Leu Ser His Leu Val Arg Phe Tyr
130 135 140
Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Lys Val Ala Glu Ile Pro Gln
145 150 155 160
Ser Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg Ser Pro Tyr Gly Val Ala Lys
165 170 175
Met Tyr Ala Tyr Trp Ile Thr Ile Asn Tyr Arg Glu Ala Tyr Asp Met
180 185 190
Tyr Ala Cys Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg Gly
195 200 205
Arg Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Cys Ala Val Ala Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Lys Gln Glu Cys Leu Tyr Leu Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg
225 230 235 240
Asp Trp Gly His Ala Arg Asp Tyr Val Glu Gly Met Trp Arg Met Leu
245 250 255
Gln Gln Glu Thr Ala Glu Asp Phe Val Leu Ala Thr Gly Glu Met His
260 265 270
Thr Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser Phe Lys Ala Ile Gly Ser Thr
275 280 285
Ile Arg Trp Glu Gly Ser Ala Glu Glu Glu Val Gly Leu Asp Glu Lys
290 295 300
Gly Val Ile Arg Val Arg Val Asp Pro Ala Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu
305 310 315 320
Val Glu Leu Leu Leu Gly Asn Pro Ala Lys Ala Asn Glu Lys Leu Gly
325 330 335
Trp Lys Arg Gln Val Glu Phe Asp Ala Leu Val Glu Glu Met Val Lys
340 345 350
Ser Asp Leu Ile Gly Val Ala Ala Gly Asp Val Phe Asn
355 360 365
<210> 63
<211> 426
<212> PRT
<213> Helicobacter pylori
<400> 63
Met Gly Phe Gln Pro Leu Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ser Ala Ser Ile
1 5 10 15
Glu Lys Met Ala Ser Lys Ser Pro Pro Pro Pro Leu Lys Ile Ala Val
20 25 30
Ala Asn Trp Trp Gly Asp Glu Glu Ile Lys Glu Phe Lys Lys Ser Val
35 40 45
Leu Tyr Phe Ile Leu Ser Gln Arg Tyr Ala Ile Thr Leu His Gln Asn
50 55 60
Pro Asn Glu Phe Ser Asp Leu Val Phe Ser Asn Pro Leu Gly Ala Ala
65 70 75 80
Arg Lys Ile Leu Ser Tyr Gln Asn Thr Lys Arg Val Phe Tyr Thr Gly
85 90 95
Glu Asn Glu Ser Pro Asn Phe Asn Leu Phe Asp Tyr Ala Ile Gly Phe
100 105 110
Asp Glu Leu Asp Phe Asn Asp Arg Tyr Leu Arg Met Pro Leu Tyr Tyr
115 120 125
Ala His Leu His Tyr Lys Ala Glu Leu Val Asn Asp Thr Thr Ala Pro
130 135 140
Tyr Lys Leu Lys Asp Asn Ser Leu Tyr Ala Leu Lys Lys Pro Ser His
145 150 155 160
His Phe Lys Glu Asn His Pro Asn Leu Cys Ala Val Val Asn Asp Glu
165 170 175
Ser Asp Leu Leu Lys Arg Gly Phe Ala Ser Phe Val Ala Ser Asn Ala
180 185 190
Asn Ala Pro Met Arg Asn Ala Phe Tyr Asp Ala Leu Asn Ser Ile Glu
195 200 205
Pro Val Thr Gly Gly Gly Ser Val Arg Asn Thr Leu Gly Tyr Lys Val
210 215 220
Gly Asn Lys Ser Glu Phe Leu Ser Gln Tyr Lys Phe Asn Leu Cys Phe
225 230 235 240
Glu Asn Ser Gln Gly Tyr Gly Tyr Val Thr Glu Lys Ile Leu Asp Ala
245 250 255
Tyr Phe Ser His Thr Ile Pro Ile Tyr Trp Gly Ser Pro Ser Val Ala
260 265 270
Lys Asp Phe Asn Pro Lys Ser Phe Val Asn Val His Asp Phe Asn Asn
275 280 285
Phe Asp Glu Ala Ile Asp Tyr Ile Lys Tyr Leu His Thr His Pro Asn
290 295 300
Ala Tyr Leu Asp Met Leu Tyr Glu Asn Pro Leu Asn Thr Leu Asp Gly
305 310 315 320
Lys Ala Tyr Phe Tyr Gln Asp Leu Ser Phe Lys Lys Ile Leu Asp Phe
325 330 335
Phe Lys Thr Ile Leu Glu Asn Asp Thr Ile Tyr His Lys Phe Ser Thr
340 345 350
Ser Phe Met Trp Glu Tyr Asp Leu His Lys Pro Leu Val Ser Ile Asp
355 360 365
Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Arg Leu
370 375 380
Leu Gln Asn Ala Ser Pro Leu Leu Glu Leu Ser Gln Asn Thr Thr Phe
385 390 395 400
Lys Ile Tyr Arg Lys Ala Tyr Gln Lys Ser Leu Pro Leu Leu Arg Ala
405 410 415
Val Arg Lys Leu Val Lys Lys Leu Gly Leu
420 425
<210> 64
<211> 402
<212> PRT
<213> Helicobacter trogontum
<400> 64
Met Asp Lys Gln Ile Leu Asn Met Arg Val Leu Asp Trp Trp Thr Glu
1 5 10 15
Asp Asn Glu Gln Asn Phe Tyr Asp Asn Ile Phe Ile Arg Leu Leu Gln
20 25 30
Arg Lys Tyr Glu Val Val Tyr Ser Asp Thr Pro Asp Phe Val Leu Cys
35 40 45
Gly Pro Phe Gly Tyr Lys His Leu Glu Tyr Arg Gly Val Arg Ile Phe
50 55 60
Cys Thr Gly Glu Asn Val Arg Pro Asp Phe Asn Leu Val Asp Tyr Ala
65 70 75 80
Ile Ser Phe Asp Tyr Ala Val Phe Gly Asp Arg His Leu Arg Thr Pro
85 90 95
Leu Met Phe Leu Cys Asp Asp Tyr Val Glu Asp Met Gln Lys Val Leu
100 105 110
Asn Ser Arg Ala His Leu Ile Lys Ser Lys Ile Lys Phe Cys Ser Phe
115 120 125
Ile Ala Ser Asn Asn Tyr Met Thr Glu Met Arg Asp Ser Phe Phe Glu
130 135 140
Ala Leu Cys Thr Tyr Lys Lys Val Asp Ser Gly Gly Lys Trp Lys Asn
145 150 155 160
Asn Ile Gly Val Tyr Val Asp Asp Lys Ile Glu Trp Leu Lys Ser Tyr
165 170 175
Lys Phe Asn Ile Cys Phe Glu Asn Asp Ser Ser Pro Gly Tyr Leu Thr
180 185 190
Glu Lys Leu Phe Asp Ala Phe Met Gly Gly Cys Val Pro Ile Tyr Trp
195 200 205
Gly Asp Thr Ser Leu Arg Cys Lys Val Asp Asn Glu Cys Gly Asn Leu
210 215 220
Ile Glu Thr Gln Glu Ile Gly Tyr His Leu Asn Leu Glu Gln Thr Lys
225 230 235 240
Lys Glu Val Asp Phe Val Tyr Asn Gly Gly Gly Tyr Gly Met Phe Asp
245 250 255
Thr Arg Ile Pro Asn Ile Pro Ala Tyr Leu Phe Asp Tyr Lys Ile Asn
260 265 270
Pro Lys Ala Phe Ile Asn Ala His Asp Phe Pro Thr Phe Lys Glu Leu
275 280 285
Ile Asp Glu Ile Lys Arg Ile Asp Asn Asp Glu Gln Ala Phe Lys Asp
290 295 300
Met Leu Asn Glu Pro Val Phe Leu Asn Asn Phe Asn Pro Lys Glu Phe
305 310 315 320
Tyr Ser Gln Lys Thr Phe His Phe Leu Asp Tyr Ile Val Ser Gln Gly
325 330 335
Pro Val Cys Ala Lys Arg Ile Gly Arg Gly Ser Arg Leu Gln Arg Lys
340 345 350
Glu Asn Ile Met Arg Met Phe Pro Tyr Asp Thr Asp Ser Val Leu Ile
355 360 365
Pro Asn Phe Met Ser Tyr Cys Val Lys His Lys Lys Ile Ile Asp Arg
370 375 380
Val Arg Arg Val Cys Gly Phe Pro Arg Asp Ile Met Arg Thr Ile Arg
385 390 395 400
Gly Lys
<210> 65
<211> 384
<212> PRT
<213> Helicobacter bilis
<400> 65
Met Gln Lys Gln Gln Val Lys Met Arg Val Leu Asp Trp Trp Asn Lys
1 5 10 15
Asp Cys Glu Glu Asn Phe Tyr Asn Asn Phe Phe Ile Gln Ile Leu Gln
20 25 30
Lys Lys Tyr Asp Val Val Tyr Ser Asp Lys Pro Asp Phe Ile Leu Tyr
35 40 45
Gly Pro Cys Gly Tyr Glu His Leu Lys Tyr Asp Cys Val Arg Ile Phe
50 55 60
Tyr Thr Ala Glu Asn Ile Arg Pro Asp Tyr Asn Ile Ala Asp Tyr Ser
65 70 75 80
Ile Asp Tyr Asp Tyr Ile Lys Phe Gly Asp Arg His Leu Arg Leu Pro
85 90 95
Tyr Met Phe Trp Val Phe Cys Asp Glu Met Arg Gln Lys Glu Met Asp
100 105 110
Asn Arg Ile Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu Lys Phe Cys Gly Phe Met
115 120 125
Val Ser Asn Asn Ala Leu Thr Asp Lys Arg Asp Met Phe Phe Glu Ala
130 135 140
Leu Asn Lys Tyr Lys Arg Val Asp Ser Gly Gly Arg Trp Lys Asn Asn
145 150 155 160
Ile Gly Gly Asn Val Asp Asp Lys Ile Glu Trp Leu Lys Ser Tyr Lys
165 170 175
Phe Asn Leu Cys Phe Glu Asn Ser Ser Tyr Pro Gly Tyr Leu Thr Glu
180 185 190
Lys Leu Phe Asp Ala Phe Leu Ala Gly Cys Val Pro Ile Tyr Trp Gly
195 200 205
Asp Thr Ser Leu Arg Val His Lys Asn Thr Cys Ala Asp Ser Lys Asn
210 215 220
Ser Glu Asn Ile Asn Asn Arg Gly Gly Gly Gly Asn Asp Thr Phe Asp
225 230 235 240
Met Arg Ile Pro Asn Ile Ser His Ser Leu Ile Asp Tyr Glu Ile Asn
245 250 255
Pro Lys Ala Phe Ile Asn Ala His Asn Phe Pro Thr Phe Lys Asp Leu
260 265 270
Ile Asp Glu Ile Lys Arg Ile Asp Asn Asp Ser Tyr Ala Phe Glu Ser
275 280 285
Ile Leu Arg Glu Pro Ile Phe Leu Asn Asn Phe Ser Pro Tyr Glu Phe
290 295 300
Tyr Thr Glu Gln Ile Ser Ala Phe Leu Asp His Ile Ile Met Gln Gly
305 310 315 320
Ala Asn Asp Ala Arg Arg Cys Gly Asp Gly Tyr Trp Leu Arg Thr His
325 330 335
Leu Glu Phe Arg Arg Ile Ser Ala Lys Tyr Trp Asn Leu Pro Ser Asp
340 345 350
Phe Leu His Tyr Cys Phe Lys Tyr Arg Lys Ile Ile Gln Gly Val Arg
355 360 365
Asp Ile Ser Glu Tyr Pro Arg Asn Phe Met Arg Phe Leu Arg Arg Lys
370 375 380
<210> 66
<211> 340
<212> PRT
<213> Helicobacter sp.
<400> 66
Met Ala Gln Asn Leu Gln Thr Pro Gln Asp Ser Lys Thr Lys Lys Arg
1 5 10 15
Ile Tyr Phe Cys Asp Gly Ala Val Lys Gly Lys Ile Pro Ala Ile Leu
20 25 30
Ser Arg His Tyr Asp Ile Glu Ile Thr Pro His Asn Pro Asp Tyr Val
35 40 45
Phe Tyr Ser Val Met Gly Asn Glu His Ile Asn Tyr Asp Cys Ile Arg
50 55 60
Ile Phe Ser Thr Gly Glu Asn Val Arg Ala Asp Phe Asn Phe Cys Asp
65 70 75 80
Tyr Ala Ile Gly Phe Asp Tyr Met Gln Phe Glu Asp Arg Tyr Leu Arg
85 90 95
Tyr Pro Phe Tyr Leu His Tyr Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Arg Asn
100 105 110
Lys His Leu His Ile Thr Pro Gln Thr Leu Glu Asn Lys Lys Arg Phe
115 120 125
Cys Thr Phe Val Val Ser Asn Gly Lys Ala Asp Ser Ile Arg Ser Gln
130 135 140
Phe Phe Asp Lys Leu Met Gln Tyr Lys His Ile Asp Ser Gly Gly Lys
145 150 155 160
Tyr Lys Asn Asn Ile Gly Ala Pro Val Ala Asp Lys Leu Ala Phe Leu
165 170 175
Ser Glu Gly Lys Phe Asn Ile Ala Phe Glu Asn Ser Ser Ala Asn Gly
180 185 190
Tyr Thr Thr Glu Lys Leu Ile Glu Ala Phe Ala Ala Gly Thr Ile Pro
195 200 205
Leu Tyr Trp Gly Asp Glu Ser Val Ser Leu Pro Leu Asp Ser Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Val Asn Pro Lys Ser Phe Val Arg Leu Asn Asp Phe Ala Ser
225 230 235 240
Phe Glu Glu Ala Ile Ala Tyr Ile Glu Phe Leu Asp Thr His Asn Asp
245 250 255
Ala Tyr Leu Ala Ile Leu Arg Glu Glu Thr Phe Leu Asp Ser Asn His
260 265 270
Glu Ala Ile Phe Asp Lys Lys Leu Glu Ser Phe Leu Leu His Ile Phe
275 280 285
Asn Gln Pro Leu Glu Lys Ala Tyr Arg Arg Gly Phe Gly Gln Trp Arg
290 295 300
Cys Asn Ile Glu Lys Arg Tyr Lys Lys Tyr Gln Arg Ile Arg Ser Leu
305 310 315 320
Thr Asn Thr Cys Val Asn Ile Ile Lys Asn Pro Ile Arg Arg Ile Lys
325 330 335
Lys Leu Phe Lys
340
<210> 67
<211> 320
<212> PRT
<213> Helicobacter hepaticus
<400> 67
Met Lys Asp Asp Leu Val Ile Leu His Pro Asp Gly Gly Ile Ala Ser
1 5 10 15
Gln Ile Ala Phe Val Ala Leu Gly Leu Ala Phe Glu Gln Lys Gly Ala
20 25 30
Lys Val Lys Tyr Asp Leu Ser Trp Phe Ala Glu Gly Ala Lys Gly Phe
35 40 45
Trp Asn Pro Ser Asn Gly Tyr Asp Lys Val Tyr Asp Ile Thr Trp Asp
50 55 60
Ile Ser Lys Ala Phe Pro Ala Leu His Ile Glu Ile Ala Asn Glu Glu
65 70 75 80
Glu Ile Glu Arg Tyr Lys Ser Lys Tyr Leu Ile Asp Asn Asp Arg Val
85 90 95
Ile Asp Tyr Ala Pro Pro Leu Tyr Cys Tyr Gly Tyr Lys Gly Arg Ile
100 105 110
Phe His Tyr Leu Tyr Ala Pro Phe Phe Ala Gln Ser Phe Ala Pro Lys
115 120 125
Glu Ala Gln Asp Ser His Thr Pro Phe Ala Ala Leu Leu Gln Glu Ile
130 135 140
Glu Ser Ser Pro Ser Pro Cys Gly Val His Ile Arg Arg Gly Asp Leu
145 150 155 160
Ser Gln Pro His Ile Val Tyr Gly Asn Pro Thr Ser Asn Glu Tyr Phe
165 170 175
Ala Lys Ser Ile Glu Leu Met Cys Leu Leu His Pro Gln Ser Ser Phe
180 185 190
Tyr Leu Phe Ser Asp Asp Leu Ala Phe Val Lys Glu Gln Ile Val Pro
195 200 205
Leu Leu Lys Gly Lys Thr Tyr Arg Ile Cys Asp Val Asn Asn Pro Ser
210 215 220
Gln Gly Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Leu Ser Arg Cys Arg Asn Ile Ile
225 230 235 240
Gly Ser Gln Gly Ser Met Gly Glu Phe Ala Lys Val Leu Ser Pro His
245 250 255
Asn Pro Leu Leu Ile Thr Pro Arg Tyr Arg Asn Ile Phe Lys Glu Val
260 265 270
Glu Asn Val Met Cys Val Asn Trp Gly Glu Ser Val Gln His Pro Pro
275 280 285
Leu Val Cys Ser Ala Pro Pro Pro Leu Val Ser Gln Leu Lys Arg Asn
290 295 300
Ala Pro Leu Asn Ser Arg Leu Tyr Lys Glu Lys Asp Asn Ala Ser Ala
305 310 315 320
<210> 68
<211> 359
<212> PRT
<213> Helicobacter hepaticus
<400> 68
Met Asn Gln Gly Cys Thr Lys Thr His Lys Pro Thr Lys Lys Val Tyr
1 5 10 15
Phe Cys Asp Gly Ala Val Lys Gly Lys Ile Val Ala Leu Leu Glu Gln
20 25 30
His Tyr Glu Leu Ile Leu Thr Asn Lys Asp Pro Asp Tyr Ile Phe Tyr
35 40 45
Ser Cys Met Gly Phe Glu His Leu Asn Tyr Asn Lys Val Arg Ile Phe
50 55 60
Ala Thr Gly Glu Asn Leu Arg Ala Asp Phe Asn Phe Cys Asp Tyr Ala
65 70 75 80
Ile Gly Tyr Asp Tyr Ile His Phe Glu Asp Arg Tyr Leu Arg Tyr Pro
85 90 95
Leu Tyr Leu His Cys Glu Ser Asp Met Gln Lys Ala Met Asn Lys His
100 105 110
Leu His Ile Thr Pro Glu Thr Leu Gln Asn Lys Ser Arg Phe Cys Thr
115 120 125
Phe Val Val Ser Asn Gly Lys Ala Asp Glu Ile Arg Thr Gln Phe Phe
130 135 140
Asp Phe Leu Ser Gln Tyr Asn Arg Val Asp Ser Gly Gly Arg Tyr Lys
145 150 155 160
Asn Asn Ile Gly Asn Pro Val Val Asp Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Glu
165 170 175
Gly Lys Phe Asn Ile Ala Phe Glu Asn Ser Ser Thr Asn Gly Tyr Ile
180 185 190
Thr Glu Lys Leu Ile Gln Ala Phe Ala Ala His Thr Ile Pro Ile Tyr
195 200 205
Trp Gly Asp Glu Arg Ile Ser Leu Pro Leu Asp Lys Met Gly Gly Gly
210 215 220
Ile Asn Pro Lys Ser Phe Ile Asn Met His Lys Tyr Glu Ser Tyr Lys
225 230 235 240
Glu Val Leu Glu Thr Ile Tyr Phe Leu Asp Thr His Asp Glu Ala Tyr
245 250 255
Leu Ser Met Leu Ser Glu Pro Val Phe Leu Asp Lys Asn His Gln Lys
260 265 270
Ile Phe Asp Glu Lys Leu Glu Asn Phe Leu Leu His Ile Phe Asn Gln
275 280 285
Pro Leu Glu Lys Ala Tyr Arg Arg Gly Phe Gly Gln Trp Arg Cys Asn
290 295 300
Ile Glu Lys Arg Tyr Lys Lys Ala Gln Lys Ala Arg Gln Ile Val Asn
305 310 315 320
Asn Phe Ala Asn Ile Phe Gln Ile Pro Leu Arg Thr Leu Lys Lys Tyr
325 330 335
Leu Leu Ser Ile Tyr Leu Ser Ala Thr Ser Lys Ser Phe Val Phe Phe
340 345 350
Thr Lys Glu Arg Thr Ser Lys
355
<210> 69
<211> 331
<212> PRT
<213> Bacteroides fragilis
<400> 69
Met Cys Asp Cys Leu Ser Ile Ile Leu Leu Val Lys Met Lys Lys Ile
1 5 10 15
Tyr Leu Lys Phe Val Asp Phe Trp Asp Gly Phe Asp Thr Ile Ser Asn
20 25 30
Phe Ile Val Asp Ala Leu Ser Ile Gln Tyr Glu Val Val Leu Ser Asn
35 40 45
Glu Pro Asp Tyr Leu Phe Tyr Ser Cys Phe Gly Thr Ser His Leu Glu
50 55 60
Tyr Asp Cys Ile Lys Ile Met Phe Ile Gly Glu Asn Ile Val Pro Asp
65 70 75 80
Phe Asn Val Cys Asp Tyr Ala Ile Gly Phe Asn Tyr Ile Asp Phe Gly
85 90 95
Asp Arg Tyr Leu Arg Leu Pro Leu Tyr Ala Ile Tyr Asp Gly Phe Ser
100 105 110
Asn Leu Gln Asn Lys Lys Ile Asp Val Asn Lys Ala Leu Asp Arg Lys
115 120 125
Phe Cys Ser Ile Val Val Ser Asn Asn Lys Trp Ala Asp Pro Ile Arg
130 135 140
Glu Thr Phe Phe Lys Leu Leu Ser Ser Tyr Lys Lys Val Asp Ser Gly
145 150 155 160
Gly Arg Ala Trp Asn Asn Ile Gly Gly Pro Val Asp Asn Lys Leu Asp
165 170 175
Phe Ile Ser Gln Tyr Lys Phe Asn Ile Ala Phe Glu Asn Ser Arg Val
180 185 190
Leu Gly Tyr Thr Thr Glu Lys Ile Met Glu Pro Met Gln Val Asn Ser
195 200 205
Ile Pro Val Tyr Trp Gly Asn Pro Leu Val Gly Lys Asp Phe Asn Val
210 215 220
Asp Ser Phe Val Asn Ala His Asp Phe Asp Ser Leu Glu Arg Leu Val
225 230 235 240
Glu Tyr Ile Ile Glu Leu Asp Ser Ser Lys Asp Lys Tyr Leu Glu Met
245 250 255
Leu Glu Lys Pro Trp Leu Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Asp Trp Lys Gln
260 265 270
Leu Leu Leu Asn Phe Ile Asn Asn Ile Met Met Lys Ser Tyr Lys Asp
275 280 285
Ala Lys Tyr Leu Val Asn Tyr Gly His Ala Gly Lys Tyr Arg Asn Glu
290 295 300
Gln Arg Phe Trp Gly Arg Cys Glu Arg Lys Phe Lys Leu Gln Arg Ile
305 310 315 320
Ile Glu Tyr Tyr Ser Gln Leu Phe Asp Arg Lys
325 330
<210> 70
<211> 949
<212> PRT
<213> Bacteroides fragilis
<400> 70
Met Gln Lys Leu Leu Ser Leu Pro Pro Asn Leu Val Gln Ser Phe His
1 5 10 15
Glu Leu Glu Arg Val Asn Arg Thr Asp Trp Phe Cys Thr Ser Asp Pro
20 25 30
Val Gly Lys Lys Leu Gly Ser Gly Gly Gly Thr Ser Trp Leu Leu Glu
35 40 45
Glu Cys Tyr Asn Glu Tyr Ser Asp Gly Ala Thr Phe Gly Glu Trp Leu
50 55 60
Glu Lys Glu Lys Arg Ile Leu Leu His Ala Gly Gly Gln Ser Arg Arg
65 70 75 80
Leu Pro Gly Tyr Ala Pro Ser Gly Lys Ile Leu Thr Pro Val Pro Val
85 90 95
Phe Arg Trp Glu Arg Gly Gln His Leu Gly Gln Asn Leu Leu Ser Leu
100 105 110
Gln Leu Pro Leu Tyr Glu Lys Ile Met Ser Leu Ala Pro Asp Lys Leu
115 120 125
His Thr Leu Ile Ala Ser Gly Asp Val Tyr Ile Arg Ser Glu Lys Pro
130 135 140
Leu Gln Ser Ile Pro Glu Ala Asp Val Val Cys Tyr Gly Leu Trp Val
145 150 155 160
Asp Pro Ser Leu Ala Thr His His Gly Val Phe Ala Ser Asp Arg Lys
165 170 175
His Pro Glu Gln Leu Asp Phe Met Leu Gln Lys Pro Ser Leu Ala Glu
180 185 190
Leu Glu Ser Leu Ser Lys Thr His Leu Phe Leu Met Asp Ile Gly Ile
195 200 205
Trp Leu Leu Ser Asp Arg Ala Val Glu Ile Leu Ile Lys Arg Ser His
210 215 220
Lys Glu Ser Ser Glu Glu Leu Lys Tyr Tyr Asp Leu Tyr Ser Asp Phe
225 230 235 240
Gly Leu Ala Leu Gly Thr His Pro Arg Ile Glu Asp Glu Glu Val Asn
245 250 255
Thr Leu Ser Val Ala Ile Leu Pro Leu Pro Gly Gly Glu Phe Tyr His
260 265 270
Tyr Gly Thr Ser Lys Glu Leu Ile Ser Ser Thr Leu Ser Val Gln Asn
275 280 285
Lys Val Tyr Asp Gln Arg Arg Ile Met His Arg Lys Val Lys Pro Asn
290 295 300
Pro Ala Met Phe Val Gln Asn Ala Val Val Arg Ile Pro Leu Cys Ala
305 310 315 320
Glu Asn Ala Asp Leu Trp Ile Glu Asn Ser His Ile Gly Pro Lys Trp
325 330 335
Lys Ile Ala Ser Arg His Ile Ile Thr Gly Val Pro Glu Asn Asp Trp
340 345 350
Ser Leu Ala Val Pro Ala Gly Val Cys Val Asp Val Val Pro Met Gly
355 360 365
Asp Lys Gly Phe Val Ala Arg Pro Tyr Gly Leu Asp Asp Val Phe Lys
370 375 380
Gly Asp Leu Arg Asp Ser Lys Thr Thr Leu Thr Gly Ile Pro Phe Gly
385 390 395 400
Glu Trp Met Ser Lys Arg Gly Leu Ser Tyr Thr Asp Leu Lys Gly Arg
405 410 415
Thr Asp Asp Leu Gln Ala Ala Ser Val Phe Pro Met Val Asn Ser Val
420 425 430
Glu Glu Leu Gly Leu Val Leu Arg Trp Met Leu Ser Glu Pro Glu Leu
435 440 445
Glu Glu Gly Lys Asn Ile Trp Leu Arg Ser Glu Arg Phe Ser Ala Asp
450 455 460
Glu Ile Ser Ala Gly Ala Asn Leu Lys Arg Leu Tyr Ala Gln Arg Glu
465 470 475 480
Glu Phe Arg Lys Gly Asn Trp Lys Ala Leu Ala Val Asn His Glu Lys
485 490 495
Ser Val Phe Tyr Gln Leu Asp Leu Ala Asp Ala Ala Glu Asp Phe Val
500 505 510
Arg Leu Gly Leu Asp Met Pro Glu Leu Leu Pro Gly Asp Ala Leu Gln
515 520 525
Met Ser Arg Ile His Asn Arg Met Leu Arg Ala Arg Ile Leu Lys Leu
530 535 540
Asp Gly Lys Asp Tyr Arg Pro Glu Glu Gln Ala Ala Phe Asp Leu Leu
545 550 555 560
Arg Asp Gly Leu Leu Asp Gly Ile Ser Asn Arg Lys Ser Thr Pro Lys
565 570 575
Leu Asp Val Tyr Ser Asp Gln Ile Val Trp Gly Arg Ser Pro Val Arg
580 585 590
Ile Asp Met Ala Gly Gly Trp Thr Asp Thr Pro Pro Tyr Ser Leu Tyr
595 600 605
Ser Gly Gly Asn Val Val Asn Leu Ala Ile Glu Leu Asn Gly Gln Pro
610 615 620
Pro Leu Gln Val Tyr Val Lys Pro Cys Lys Asp Phe His Ile Val Leu
625 630 635 640
Arg Ser Ile Asp Met Gly Ala Met Glu Ile Val Ser Thr Phe Asp Glu
645 650 655
Leu Gln Asp Tyr Lys Lys Ile Gly Ser Pro Phe Ser Ile Pro Lys Ala
660 665 670
Ala Leu Ser Leu Ala Gly Phe Ala Pro Ala Phe Ser Ala Val Ser Tyr
675 680 685
Ala Ser Leu Glu Glu Gln Leu Lys Asp Phe Gly Ala Gly Ile Glu Val
690 695 700
Thr Leu Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Ser Gly Leu Gly Thr Ser Ser
705 710 715 720
Ile Leu Ala Ser Thr Val Leu Gly Ala Ile Asn Asp Phe Cys Gly Leu
725 730 735
Ala Trp Asp Lys Asn Glu Ile Cys Gln Arg Thr Leu Val Leu Glu Gln
740 745 750
Leu Leu Thr Thr Gly Gly Gly Trp Gln Asp Gln Tyr Gly Gly Val Leu
755 760 765
Gln Gly Val Lys Leu Leu Gln Thr Glu Ala Gly Phe Ala Gln Ser Pro
770 775 780
Leu Val Arg Trp Leu Pro Asp His Leu Phe Thr His Pro Glu Tyr Lys
785 790 795 800
Asp Cys His Leu Leu Tyr Tyr Thr Gly Ile Thr Arg Thr Ala Lys Gly
805 810 815
Ile Leu Ala Glu Ile Val Ser Ser Met Phe Leu Asn Ser Ser Leu His
820 825 830
Leu Asn Leu Leu Ser Glu Met Lys Ala His Ala Leu Asp Met Asn Glu
835 840 845
Ala Ile Gln Arg Gly Ser Phe Val Glu Phe Gly Arg Leu Val Gly Lys
850 855 860
Thr Trp Glu Gln Asn Lys Ala Leu Asp Ser Gly Thr Asn Pro Pro Ala
865 870 875 880
Val Glu Ala Ile Ile Asp Leu Ile Lys Asp Tyr Thr Leu Gly Tyr Lys
885 890 895
Leu Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Leu Tyr Met Val Ala Lys Asp
900 905 910
Pro Gln Ala Ala Val Arg Ile Arg Lys Ile Leu Thr Glu Asn Ala Pro
915 920 925
Asn Pro Arg Ala Arg Phe Val Glu Met Thr Leu Ser Asp Lys Gly Phe
930 935 940
Gln Val Ser Arg Ser
945
<210> 71
<211> 981
<212> PRT
<213> Bacteroides thetaiotaomicron
<400> 71
Met Pro Glu Pro Ile Cys Cys Phe Leu Leu Cys Arg His Ser Ala Ile
1 5 10 15
Ala Gly Ile Gln Ser Cys Tyr Lys Pro Ile Asn Thr Asp Ser Thr Met
20 25 30
Gln Lys Leu Leu Ser Leu Pro Pro Asn Leu Ile Asp Ser Phe His Gln
35 40 45
Leu Glu Glu Val Asn His Thr Asp Trp Phe Cys Thr Ser Asp Pro Val
50 55 60
Gly Ser Lys Leu Gly Ser Gly Gly Gly Thr Thr Trp Leu Leu Gln Ala
65 70 75 80
Cys His Gln Ala Phe Ala Pro Glu Glu Thr Phe Ser Lys Trp Ile Gly
85 90 95
Asn Glu Lys Lys Ile Leu Leu His Ala Gly Gly Gln Ser Arg Arg Leu
100 105 110
Pro Gly Tyr Ala Pro Ser Gly Lys Ile Leu Thr Pro Ile Pro Val Phe
115 120 125
Ser Trp Glu Arg Gly Gln Lys Leu Gly Gln Asn Leu Leu Ser Leu Gln
130 135 140
Leu Pro Leu Tyr Glu Arg Ile Met Lys Gln Ala Pro Lys Gly Leu Asn
145 150 155 160
Thr Leu Ile Ala Ser Gly Asp Val Tyr Ile Arg Ser Glu Lys Pro Leu
165 170 175
Gln Asp Ile Pro Glu Val Asp Val Val Cys Tyr Gly Leu Trp Val Asn
180 185 190
Pro Ser Leu Ala Thr His His Gly Val Phe Val Ser Asp Arg Lys Lys
195 200 205
Pro Glu Val Leu Asp Phe Met Leu Gln Lys Pro Ser Leu Glu Glu Leu
210 215 220
Glu Gly Leu Ser Lys Thr His Leu Phe Leu Met Asp Ile Gly Ile Trp
225 230 235 240
Ile Leu Ser Asp Arg Ala Val Glu Val Leu Met Lys Arg Ser Leu Lys
245 250 255
Glu Gly Thr Asn Asp Ile Ser Tyr Tyr Asp Leu Tyr Ser Asp Tyr Gly
260 265 270
Leu Ala Leu Gly Glu His Pro Gln Thr Thr Asp Asp Glu Val Asn Lys
275 280 285
Leu Ser Val Ala Ile Leu Pro Leu Pro Gly Gly Glu Phe Tyr His Phe
290 295 300
Gly Thr Ser Arg Glu Leu Ile Ser Ser Thr Leu Ala Ile Gln Asp Lys
305 310 315 320
Val Arg Asp Gln Arg Arg Ile Met His Arg Lys Val Lys Pro Asn Pro
325 330 335
Ala Ile Phe Ile Gln Asn Ser Phe Thr Gln Val Lys Leu Ser Ala Glu
340 345 350
Asn Ala Asn Leu Trp Ile Glu Asn Ser His Val Gly Glu Gly Trp Lys
355 360 365
Leu Gly Ser Arg Gln Ile Ile Thr Gly Val Pro Glu Asn His Trp Asn
370 375 380
Ile Asn Leu Pro Asp Gly Val Cys Ile Asp Ile Val Pro Met Gly Asp
385 390 395 400
Ala Ala Phe Val Ala Arg Pro Tyr Gly Leu Asp Asp Val Phe Lys Gly
405 410 415
Asp Leu Ser Asn Asp Ser Thr Thr Tyr Leu Gly Asn Ser Phe Thr Gln
420 425 430
Trp Met Lys Glu Arg Glu Ile Gly Leu Glu Asp Ile Lys Gly Arg Thr
435 440 445
Asp Asp Leu Gln Ala Ala Pro Val Phe Pro Val Thr Thr Ser Ile Glu
450 455 460
Glu Leu Gly Ile Leu Ile Arg Trp Met Thr Ala Glu Pro Gln Leu Lys
465 470 475 480
Glu Gly Lys Glu Leu Trp Leu Arg Ala Glu Lys Leu Ser Ala Asp Glu
485 490 495
Ile Ser Ala Gln Ala Asn Leu Glu Arg Leu Tyr Ala Gln Arg Ser Ala
500 505 510
Phe Arg Arg Asp Asn Trp Lys Gly Leu Ser Ala Asn Tyr Glu Lys Ser
515 520 525
Val Phe Tyr Gln Leu Asp Leu Gln Asp Ala Ala Asn Glu Phe Val Arg
530 535 540
Leu Asn Leu Asp Val Pro Ala Val Leu Lys Glu Asp Ala Ala Pro Met
545 550 555 560
Val Arg Ile His Asn Arg Met Leu Arg Ala Arg Ile Leu Lys Leu Gln
565 570 575
Gly Asn Glu Gly Cys Lys Gly Glu Glu Gln Ala Ala Phe Gln Leu Leu
580 585 590
Arg Asp Gly Leu Leu Glu Ala Val Ala Gly Lys Lys Asn Tyr Pro Lys
595 600 605
Leu Asn Val Tyr Ser Asp Gln Ile Val Trp Gly Arg Ser Pro Val Arg
610 615 620
Ile Asp Val Ala Gly Gly Trp Thr Asp Thr Pro Pro Tyr Ser Leu Tyr
625 630 635 640
Ser Gly Gly Ser Val Val Asn Leu Ala Ile Glu Leu Asn Gly Gln Pro
645 650 655
Pro Leu Gln Val Tyr Val Lys Pro Cys His Glu Phe His Ile Val Leu
660 665 670
Arg Ser Ile Asp Met Gly Ala Val Glu Val Ile Arg Ser Tyr Glu Glu
675 680 685
Leu Gln Asp Tyr Lys Lys Val Gly Ser Pro Phe Ser Ile Pro Lys Ala
690 695 700
Ala Leu Thr Leu Ala Gly Phe Ala Pro Leu Phe Ala Ala Glu Ser His
705 710 715 720
Ala Ser Leu Glu Glu His Leu Lys Ala Phe Gly Ser Gly Leu Glu Ile
725 730 735
Thr Leu Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Ser Gly Leu Gly Thr Ser Ser
740 745 750
Ile Leu Ala Ser Thr Val Leu Gly Ala Ile Asn Asp Phe Cys Gly Leu
755 760 765
Ala Trp Asp Arg Asn Asp Ile Cys Asn Tyr Thr Leu Val Leu Glu Gln
770 775 780
Leu Leu Thr Thr Gly Gly Gly Trp Gln Asp Gln Tyr Gly Gly Val Phe
785 790 795 800
Pro Gly Val Lys Leu Leu Gln Ser Glu Ser Gly Phe Glu Gln His Pro
805 810 815
Leu Val Arg Trp Leu Pro Asp Gln Leu Phe Val Gln Pro Glu Tyr Arg
820 825 830
Asp Cys His Leu Leu Tyr Tyr Thr Gly Ile Thr Arg Thr Ala Lys Gly
835 840 845
Ile Leu Ala Glu Ile Val Ser Ser Met Phe Leu Asn Ser Gly Lys His
850 855 860
Leu Ser Leu Leu Ala Glu Met Lys Ala His Ala Met Asp Met Ser Glu
865 870 875 880
Ala Ile Leu Arg Gly Asn Phe Glu Thr Phe Gly Asn Leu Val Gly Lys
885 890 895
Ser Trp Ile Gln Asn Gln Ala Leu Asp Ser Gly Thr Asn Pro Pro Ala
900 905 910
Val Ala Ala Ile Ile Glu Gln Ile Lys Asp Tyr Thr Leu Gly Tyr Lys
915 920 925
Leu Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Leu Tyr Met Val Ala Lys Asp
930 935 940
Pro Gln Ala Ala Gly Cys Ile Arg Arg Ile Leu Thr Glu Gln Ala Pro
945 950 955 960
Asn Pro Arg Ala Arg Phe Val Glu Met Thr Leu Ser Asp Lys Gly Leu
965 970 975
Gln Val Ser Arg Ser
980
<210> 72
<211> 950
<212> PRT
<213> Bacteroides ovatus
<400> 72
Met Gln Lys Leu Leu Ser Leu Pro Pro Asn Leu Ile His Cys Phe His
1 5 10 15
Glu Leu Glu Glu Val Asn His Thr Asp Trp Phe Cys Thr Ser Asp Pro
20 25 30
Ile Gly Ser Lys Leu Gly Ser Gly Gly Gly Thr Thr Trp Leu Leu Gln
35 40 45
Ala Cys His Gln Ala Phe Ala Pro Gln Glu Ser Phe Ser Asn Trp Ile
50 55 60
Gly His Glu Lys Arg Ile Leu Leu His Ala Gly Gly Gln Ser Arg Arg
65 70 75 80
Leu Pro Ser Tyr Gly Pro Ser Gly Lys Ile Leu Thr Pro Ile Pro Ile
85 90 95
Phe Ser Trp Glu Arg Gly Gln Lys Leu Gly Gln Asn Leu Leu Ser Leu
100 105 110
Gln Leu Pro Leu Tyr Glu Arg Ile Met Asn Gln Ala Pro Ala Gly Leu
115 120 125
Asn Thr Leu Ile Ala Ser Gly Asp Val Tyr Ile Arg Ser Glu Lys Pro
130 135 140
Leu Gln Asp Ile Pro Asn Ala Asp Val Val Cys Tyr Gly Leu Trp Val
145 150 155 160
Asn Pro Ser Leu Ala Thr His His Gly Val Phe Val Ser Asp Arg Lys
165 170 175
Lys Pro Glu Val Leu Asp Phe Met Leu Gln Lys Pro Ser Leu Glu Glu
180 185 190
Leu Glu Gly Leu Ser Lys Thr His Leu Phe Leu Met Asp Ile Gly Ile
195 200 205
Trp Ile Leu Ser Asp Arg Ala Ile Glu Val Leu Met Lys Arg Ser Leu
210 215 220
Lys Glu Gly Thr Lys Asp Ile Thr Tyr Tyr Asp Leu Tyr Ser Asp Tyr
225 230 235 240
Gly Leu Thr Leu Gly Glu His Pro Lys Thr Lys Asp Glu Glu Ile Asn
245 250 255
Gln Leu Ser Val Ala Ile Leu Pro Leu Pro Gly Gly Glu Phe Tyr His
260 265 270
Tyr Gly Thr Ser His Glu Leu Ile Ser Ser Thr Leu Ala Ile Gln Asp
275 280 285
Lys Val Arg Asp Gln Arg Arg Ile Met His Arg Lys Val Lys Pro Asn
290 295 300
Pro Ala Ile Phe Ile Gln Asn Ser Ile Thr Gln Val Ser Leu Ser Ala
305 310 315 320
Asp Asn Ala Asn Leu Trp Ile Glu Asn Ser Gln Val Gly Lys Glu Trp
325 330 335
Lys Leu Gly Ser Arg Gln Ile Ile Thr Gly Val Pro Glu Asn Gln Trp
340 345 350
Ser Ile Asn Leu Pro Asp Gly Val Cys Ile Asp Ile Ile Pro Ile Gly
355 360 365
Glu Asn Glu Phe Val Ala Arg Pro Tyr Gly Leu Asp Asp Val Phe Lys
370 375 380
Gly Ala Leu Asp Lys Ile Thr Thr Thr Tyr Leu Asn Val Pro Phe Thr
385 390 395 400
Arg Trp Met Glu Asp Arg Gly Ile Thr Trp Glu Asp Ile Lys Gly Arg
405 410 415
Thr Asp Asp Leu Gln Ser Ala Ser Ile Phe Pro Lys Val Ala Ser Val
420 425 430
Glu Asp Leu Gly Ile Leu Val Arg Trp Met Thr Ser Glu Pro Gln Leu
435 440 445
Glu Glu Gly Lys Lys Leu Trp Leu Lys Ala Glu Lys Val Ser Ala Asp
450 455 460
Glu Ile Ser Ala Ser Ala Asn Leu Lys Arg Leu Tyr Glu Gln Arg Asn
465 470 475 480
Ala Phe Arg Lys Glu Asn Trp Lys Gly Leu Ala Ala Asn Tyr Glu Lys
485 490 495
Ser Val Phe Tyr Gln Leu Asp Leu Leu Asp Ala Ala Asn Glu Phe Val
500 505 510
Arg Phe Asn Leu Asp Met Pro Asp Val Leu Lys Glu Asp Ala Ala Pro
515 520 525
Met Leu Arg Ile His Asn Arg Met Leu Arg Ala Arg Ile Met Lys Leu
530 535 540
Arg Glu Asp Lys Asp Cys Ala Lys Glu Glu Gln Ala Ala Phe Gln Leu
545 550 555 560
Leu Arg Asp Gly Leu Leu Gly Val Met Ser Glu Arg Lys Ser His Pro
565 570 575
Ile Leu Asn Val Tyr Ser Asp Gln Ile Val Trp Gly Arg Ser Pro Val
580 585 590
Arg Ile Asp Val Ala Gly Gly Trp Thr Asp Thr Pro Pro Tyr Ser Leu
595 600 605
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Pro Glu Ser Pro Arg
1 5
Claims (52)
- 인간 우유 올리고당 (HMO)의 생산을 증진하는 미생물로서, 이종유래 CDT-1 운반체 또는 이의 변이체 및 HMO 생산을 위한 적어도 하나의 이종유래 경로를 포함하는, 미생물.
- 제 1항에 있어서,
상기 미생물은 HMO를 생산하고 외수송할 수 있는, 미생물. - 제 2항에 있어서,
상기 운반체는 상기 생산된 HMO의 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60%를 외수송할 수 있는, 미생물. - 제 2항 또는 제 3항에 있어서,
상기 미생물은 상기 운반체가 결여된 부모 미생물보다 적어도 50% 더 많은 HMO를 외수송할 수 있는, 미생물. - 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미생물 효모는 서열번호 4 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 서열의 아미노산 서열을 갖는 상기 운반체를 포함하는, 미생물. - 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 운반체는 PESPR 모티브를 포함하는, 미생물. - 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 운반체는 서열번호 4의 아미노산 위치 91번, 209번, 213번, 256번, 262번, 335번 및 411번에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 서열을 포함하는, 미생물. - 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CDT-1은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩되는, 미생물. - 제 8항에 있어서,
상기 핵산의 적어도 초기 90개의 뉴클레오티드는 효모에 대해 코돈 최적화되거나, 상기 핵산의 적어도 5%는 효모에 대해 코돈 최적화되는, 미생물. - 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 운반체는 91A, 209S, 213A, 256V, 262Y, 262W, 335A, 411A 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하는, 미생물. - 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 경로 유전자는 GDP-만노스 4,6-탈수화효소, GDP-L-퓨코스 합성효소 및 알파-1,2-퓨코실 전이효소로부터 선택되는, 미생물. - 제 11항에 있어서,
제 2 이종유래 경로 유전자를 포함하는, 미생물. - 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HMO는 2'-퓨코실락토스 (2'-FL), 3'-퓨코실락토스 (3'-FL), 3'-시아릴락토스 (3'-SL), 6'-시아릴락토스 (6'-SL), 락토-N-네오테트라오스 (LNnT), 락토-N-테트라오스 (LNT), 시아릴락토-N-테트라오스 a (LST a), 시아릴락토-N-네오테트라오스 c (LST c), 락토-디퓨코테트라오스 (LDFT) 및 락토-N-퓨코펜타오스 I (LNFP I)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 미생물. - 제 13항에 있어서,
상기 HMO는 2'-퓨코실락토스인, 미생물. - 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미생물은 아스코마이세테스 (Ascomycetes) 진균인, 미생물 - 제 15항에 있어서,
상기 아스코마이세테스 진균은 사카로마이세스 (Sacharomyces) 종, 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 종 및 피키아 (Pichia) 종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 미생물. - 제 15항에 있어서,
상기 아스코마이세테스 진균은 트리코더마 (Trichoderma), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 야로위야 (Yarrowia), 아스퍼질러스 (Aspergillus) 및 뉴로스포라 (Neurospora)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 미생물. - 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이종유래 CDT-1 운반체 및 상기 경로 유전자 중 하나 또는 둘 다는 상기 효모 염색체 내로 혼입되는, 미생물. - 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이종유래 CDT-1 운반체 및 상기 경로 유전자 중 하나 또는 둘 다는 에피좀으로 존재하는, 미생물. - 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HMO 생산을 위한 한 세트의 경로 유전자를 포함하는, 미생물. - 제 20항에 있어서,
상기 세트는 GDP-만노스 4,6-탈수화효소 (GMD), GDP-L-퓨코스 합성효소 (GFS) 및 퓨코실 전이효소 (FT)를 포함하는, 미생물. - 제 20항에 있어서,
상기 세트는 GDP-만노스 4,6-탈수화효소, GDP-L-퓨코스 합성효소 및 알파-1,2-퓨코실 전이효소를 포함하고, 상기 HMO는 2'-FL인, 미생물. - 제 20항에 있어서,
상기 세트는 이중기능성 퓨코키나제/L-퓨코스-1-P-구아니릴 전이효소를 포함하는, 미생물. - 제 20항에 있어서,
상기 세트는 퓨코스 및 ATP를 퓨코스-1-포스페이트로 전환할 수 있는 효소, 상기 퓨코스-1-포스페이트 및 GTP를 GDP-퓨코스로 전환할 수 있는 효소 및 글루코실 전이효소를 포함하는, 미생물. - 제 24항에 있어서,
상기 글리코실 전이효소는 알파-1,2-퓨코실 전이효소이고, 상기 HMO는 2'-FL인, 미생물. - 제 21항 또는 제 22항에 있어서,
상기 경로 유전자의 세트는 Gmd, WcaG 및 WbgL을 포함하는, 미생물. - 제 21항에 있어서,
상기 GDP-만노스 4,6-탈수화효소는 서열번호 17 내지 19, 42 및 61 내지 63 또는 이들과적어도 85% 상동성을 갖는 변이체로부터 선택되는, 미생물. - 제 21항에 있어서,
상기 GDP-L-퓨코스 합성효소는 서열번호 20 내지 23 또는 이들과 적어도 85% 상동성을 갖는 변이체로부터 선택되는, 미생물. - 제 21항에 있어서,
상기 알파-1,2-퓨코실 전이효소는 서열번호 26 내지 40 또는 이들과 적어도 85% 상동성을 갖는 변이체로부터 선택되는, 미생물. - HMO를 생산하는 방법으로서,
적어도 하나의 탄소 공급원을 갖는 배양 배지를 제공하는 단계;
상기 HMO를 생산하여 외수송할 수 있는 미생물을 제공하고, 상기 미생물은 상기 HMO의 생산을 위한 이종유래 운반체 및 하나 이상의 이종유래 유전자를 발현하는, 단계; 및
상기 배양 배지에서 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하고,
상기 HMO의 실질적인 분량은 상기 배지 내로 외수송되는, 방법. - 제 30항에 있어서,
상기 배양 배지를 상기 미생물로부터 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제 31항에 있어서,
상기 HMO를 상기 배양 배지로부터 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제 30항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이종유래 운반체는 CDT-1, CDT-2 또는 이들의 변이체인, 방법. - 제 30항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HMO는 2'-FL인, 방법. - 제 33항에 있어서,
상기 운반체는 서열번호 4의 아미노산 위치 91번, 209번, 213번, 256번, 262번, 335번 및 411번에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDT-1 변이체인, 방법. - 제 30항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CDT-1은 코돈 최적화된 핵산에 의해 인코딩되는, 방법. - 제 36항에 있어서,
상기 핵산의 적어도 초기 90개의 뉴클레오티드는 효모에 대해 코돈 최적화되거나, 상기 핵산의 적어도 5%는 효모에 대해 코돈 최적화되는, 방법. - 제 35항에 있어서,
상기 운반체는 91A, 209S, 213A, 256V, 262Y, 262W, 335A, 411A 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하는, 방법. - 제 30항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이종유래 유전자는 GDP-만노스 4,6-탈수화효소, GDP-L-퓨코스 합성효소 및 알파-1,2-퓨코실 전이효소로부터 선택되는, 방법. - 제 30항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HMO의 외수송은 상기 이종유래 운반체를 포함하지 않는 부모 미생물과 비교하여 증가되는, 방법. - 제 30항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이종유래 운반체는 락토스를 내수송하고, 상기 HMO를 외수송할 수 있는, 방법. - 제 30항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양 배지는 락토스를 포함하는, 방법. - 제 30항에 있어서,
상기 미생물에 의해 생산된 총 HMO 대비 상기 배양 배지에서의 상기 HMO의 비율은 적어도 약 1 : 1, 1.5 : 1, 2 : 1, 2.5 : 1, 3 : 1, 3.5 : 1, 4 : 1 또는 4 : 1 초과인, 방법. - 제 30항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HMO는 2'-퓨코실락토스 (2'-FL), 3'-퓨코실락토스 (3'-FL), 3'-시아릴락토스 (3'-SL), 6'-시아릴락토스 (6'-SL), 락토-N-네오테트라오스 (LNnT), 락토-N-테트라오스 (LNT), 시아릴락토-N-테트라오스 a (LST a), 시아릴락토-N-네오테트라오스 c (LST c), 락토-디퓨코테트라오스 (LDFT) 및 락토-N-퓨코펜타오스 I (LNFP I)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법. - 제 30항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미생물은 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 따른 미생물인, 방법. - 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 따른 미생물, 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 따른 미생물에 의해 또는 제 30항 내지 제 45항의 방법에 따라 생산된 상기 HMO 및 적어도 하나의 추가적인 소비가능한 성분을 포함하는 동물 소비에 적합한 산물.
- 제 46항에 있어서,
상기 산물은 인간 소비에 적합한, 산물. - 제 47항에 있어서,
상기 산물은 아동 처방, 아동 식품, 영양 보충제 또는 프리바이오틱 산물인, 산물. - 제 46항에 있어서,
포유동물 소비에 적합한, 산물. - 제 46항에 있어서,
적어도 하나의 추가적인 인간 우유 올리고당을 추가로 포함하는, 산물. - 제 46항에 있어서,
상기 추가적인 소비가능한 성분은 단백질, 지질, 비타민, 미네랄 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는, 산물. - 제 49항에 있어서,
동물 사료로서의 용도에 적합한, 산물.
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