KR20210091861A - 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 유해 물질 검출 방법 - Google Patents

앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 유해 물질 검출 방법 Download PDF

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Abstract

유해 물질에 특이적으로 결합하는 앱타머; 및 형광체를 포함하고, 상기 형광체는 상기 앱타머에 가역적 또는 비가역적으로 결합되어 있는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 유해 물질 검출 방법이 제공된다.

Description

앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 유해 물질 검출 방법{BIOSENSOR FOR ANALYZING HARMFUL SUBSTANCE USING APTAMER AND METHOD FOR ANALYZING HARMFUL SUBSTANCE USING THE SAME}
본 발명은 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 유해 물질 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 앱타머와 형광체를 이용하여 복수 종류의 유해 물질을 검출할 수 있는 바이오센서 및 이를 이용한 유해 물질 검출 방법에 관한 것이다.
최근 산업 전반에 AI, 자동화 기술이 증가되면서 유해 물질에 대한 검출 기술이 요망되고 있다. 유해 물질 중에서도 프탈레이트계 물질은 그 규제가 심화되고 있다. 세계 각국은 디에틸헥실 프탈레이트(DEHP) 등 6종의 프탈레이트계 물질이 인체에 유해하다는 잠정 결정을 내리고 1999년부터 내분비계 장애를 일으키는 환경 호르몬 추정 물질로 관리하고 있다.
프탈레이트계 물질을 검출하는 기술을 살펴보면, 기체 크로마토그래피-질량 스페트로메터리(GC-MS), 열분해기(pyrolyzer)/열탈착 보조기(thermal desorption accessory)를 구비한 기체 크로마토그래피-질량 스펙트로메터리(Py/TD-GC-MS)를 사용해서 프탈레이트계 물질을 분석하고 있다. GC-MS 분석 방법은 정확도는 높지만 분석하는데 전처리 시간이 50분 이상으로 오래 걸리고 추가로 세척 및 전처리 설비 관리가 필요하다. Py/TD-GC-MS 분석 방법은 전처리 시간이 짧고 추가적인 설비 관리가 필요없지만 정확도가 떨어지는 한계가 있다.
한국등록특허 제10-1971449에 의하면 프탈레이트에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 앱타머를 기술하고 있다. 그러나, 이 방법의 경우 프탈레이트의 존부에 대한 판별 수단이 명확하지 않아서 압타머를 사용한다고 하더라도 프탈레이트의 존부를 간이한 방법으로 알기가 어려울 수 있다. 한편, 프탈레이트계 물질은 어디에서든 존재하는 만큼 검출 필요가 있는 현장 어디에서든 프탈레이트계 물질을 쉽게 검출할 수 있어야 한다. 이를 위해서는 고상에서도 고민감도로 판별할 수 있어야 한다.
본 발명의 과제는 복수의 유해 물질을 동시에 검출할 수 있는, 유해 물질 검출용 바이오센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 유해 물질을 고민감도로 검출할 수 있으며 현장에서도 간이한 방법으로 검출할 수 있게 하는, 유해 물질 검출용 바이오센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 과제는 이하의 유해 물질 검출용 바이오센서 및 유해 물질 검출 방법에 의해 해결된다.
본 발명의 유해 물질 검출용 바이오센서는 유해 물질에 특이적으로 결합하는 앱타머; 및 형광체를 포함하고, 상기 형광체는 상기 앱타머에 가역적 또는 비가역적으로 결합되어 있다.
일 구체예에서, 상기 유해 물질은 디에틸헥실 프탈레이트(DEHP), 벤질부틸 프탈레이트(BBP), 디부틸 프탈레이트(DBP), 디이소부틸 프탈레이트(DIBP) 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 DEHP, BBP, DBP, DIBP는 상기 바이오센서에 의해 동시에 검출될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 앱타머는 상기 형광체에 비가역적으로 결합될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 바이오센서는 상기 형광체에 비가역적으로 결합된 제1앱타머, 및 상기 바이오센서의 기재에 결합된 제2앱타머를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제1앱타머와 상기 제2앱타머는 상기 유해 물질의 서로 다른 부위에 결합할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제1앱타머와 상기 제2앱타머는 각각 링커에 의해 상기 형광체, 상기 바이오센서의 기재에 결합될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제1앱타머는 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나이고, 상기 제2 앱타머는 서열번호 21일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 앱타머는 상기 유해 물질의 서로 다른 부위에 결합하는 제1앱타머, 제2앱타머를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제1앱타머, 상기 제2앱타머는 링커에 의해 상기 형광체에 결합될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 바이오센서는 상기 제1앱타머 및 상기 제2앱타머가 동시에 결합된 상기 형광체를 복수 개 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 형광체는 상기 바이오센서의 기재에 결합될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 바이오센서는 상기 앱타머 및 상기 형광체에 결합된 ??처를 추가로 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 앱타머는 상기 형광체에 가역적으로 결합될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 앱타머는 핵산 서열을 매개로 상기 형광체에 가역적으로 결합될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 앱타머에 대해 상기 핵산 서열은 상기 유해 물질과 경쟁적으로 결합할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 형광체는 양자점 또는 양자점 비드를 포함하고, 상기 양자점은 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 쉘을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 양자점은 안정층, 리간드, 리간드층 중 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 코어, 상기 쉘, 상기 안정층은 각각 12족-16족계 화합물, 13족-15족계 화합물, 14족-16족계 화합물 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 양자점은 CdSe 및 ZnS로 이루어질 수 있다.
본 발명의 유해 물질 검출 방법은 본 발명의 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서를 사용하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면 복수의 유해 물질을 동시에 검출할 수 있는, 유해 물질 검출용 바이오센서를 제공하였다.
본 발명에 따르면 유해 물질을 고민감도로 검출할 수 있으며 현장에서도 간이한 방법으로 검출할 수 있게 하는, 유해 물질 검출용 바이오센서를 제공하였다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 바이오센서의 작용 개념도이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 바이오센서의 작용 개념도이다.
도 3은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 바이오센서의 작용 개념도이다.
도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 바이오센서의 작용 개념도이다.
도 5a는 실시예 3에서 양자점의 경우 프탈레이트에 대한 결합력 검정을 위한 모식도이고, 도 5b는 양자점 비드의 경우 프탈레이트에 대한 결합력 검정을 위한 모식도이다.
도 6은 실시예 3에 있어서, 대조군 1, 대조군 2, 샘플의 경우 각각 DEHP 농도 증가에 따른 DEHP에 대한 결합력 분석 결과이다.
도 7은 실시예 6에 있어서, 양자점과 양자점 비드의 검출 민감도 비교 결과이다.
본 명세서에서 "유해 물질"은 프탈레이트계 물질 등을 복수 개의 당업자에게 알려진 산업상 유해 물질을 포괄하는 개념이다. 예를 들면 "유해 물질"은 프탈레이트계 물질; 비스페놀 A 등을 포함하는 비스페놀계 물질; PBBs, PBDEs, HBCDD, TBBP-A 등을 포함하는 브롬계 물질; SCCP, PCP, PCBs, PCNs, PCTs, PVC, 염소계 난연제, 염화코발트 등을 포함하는 염소계 물질; 또는 Cd, Pb, Hg, Cr 등을 포함하는 중금속 물질 또는 그의 양이온을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "프탈레이트계 물질"은 치환 또는 비치환된 프탈릭산(phthalic acid)의 에스테르를 의미한다.
일 구체예에서, 프탈레이트계 물질은 디에틸헥실 프탈레이트(DEHP), 벤질부틸 프탈레이트(BBP), 디부틸 프탈레이트(DBP), 디이소부틸 프탈레이트(DIBP), 디에틸 프탈레이트(DEP), 디이소노닐 프탈레이트(DINP), 디이소데실 프탈레이트(DIDP), 디-n-옥틸 프탈레이트(DNOP), 디-N-펜틸 프탈레이트(DPENP), 디시클로헥실 프탈레이트(DCHP), 디-N-헥실 프탈레이트(DHEXP), 디이소펜틸 프탈레이트(DIPP), N-펜틸-이소펜틸 프탈레이트(nPIPP), 디(메톡시에틸) 프탈레이트(DMEP), 디이소옥틸 프탈레이트(DIOP), 디프로필 프탈레이트(DPrP), 디노닐 프탈레이트(DNP), 비스(2-에틸헥실)테트라브로모 프탈레이트(TBPH), 디이소헵틸 프탈레이트(DIHP), 디(헵틸, 노닐, 운데실) 프탈레이트(DHNUP), 디펜틸 프탈레이트(DPP), 디메틸 프탈레이트(DMP) 중 1종 이상을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 "형광체"는 양자점, 양자점 비드, 골드 나노파티클, 또는 표지 물질 예를 들면 형광 염료(HRP, 탈인산효소, 루시퍼레아제 등) 또는 형광 물질(FAM, HEX, CY3, CY5, TAMRA 등)을 갖는 입자 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 "양자점"은 반도체 나노 입자이며, 양자 고립 효과에 의해 입자의 크기에 따라 다른 빛을 발광하는 특성을 가지는 입자를 의미한다.
본 명세서에서 "양자점 비드"는 많은 수의 양자점을 포함하는 입자로서 양자점에 비하여 100배 이상의 밝은 특성을 나타낸다.
본 명세서에서 "양자점"이라고 할 때 양자점뿐만 아니라 양자점 비드를 포함하는 것으로 볼 수도 있다.
본 명세서에서 "시료"는 프탈레이트계 물질이 존재할 수 있는 시료들을 포괄하는 개념이다.
일 구체예에서, 시료는 각종 화학 제품을 전처리함으로써 얻은 액상의 시료, 환경으로부터 입수가능한 물, 토양, 공기를 포괄하는 의미일 수 있다. 상기 전처리는 추출, 용해, 농축 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 "핵산"은 DNA, DNA의 단일 가닥 스트랜드, 또는 RNA를 의미할 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 프탈레이트계 물질을 검출하는 바이오센서를 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 프탈레이트계 물질을 검출하는 바이오센서(이하, "바이오센서"라고 함)로서, 프탈레이트계 물질의 검출을 위하여 프탈레이트계 물질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 사용하고, 프탈레이트계 물질의 존부 즉 시료 중 프탈레이트계 물질이 존재하고 있음을 판단하는 수단으로 형광체를 사용한다. 본 발명에서 앱타머는 상기 형광체에 가역적 또는 비가역적으로 결합되어 있다. 이를 통해, 본 발명은 복수 종의 프탈레이트계 물질을 동시에 고 감도로 검출하도록 할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 바이오센서는 프탈레이트계 물질의 검출 한계가 100,000ppm 이하, 예를 들면 900ppm 내지 100,000ppm이 될 수 있다. 상기 "검출 한계"는 당업자에게 알려진 통상의 방법으로 측정될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 바이오센서는 프탈레이트계 물질 중 디에틸헥실 프탈레이트(DEHP), 벤질부틸 프탈레이트(BBP), 디부틸 프탈레이트(DBP), 디이소부틸 프탈레이트(DIBP) 중 1종 이상을 검출할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 바이오센서는 DEHP, BBP, DBP, DIBP 4종의 프탈레이트계 물질을 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 바이오센서에서, 앱타머는 프탈레이트계 물질에 특이적으로 결합하도록 선택된 DNA 서열 자체 또는 해당 DNA 서열을 포함하는 단일 가닥 스트랜드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 앱타머는 200개 이하(200mer 이하)의 핵산 서열로 구성될 수 있다. 상기 범위에서, 복수 개의 프탈레이트계 물질을 동시에 검출하는 것을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 바이오센서에서, 앱타머는 프탈레이트계 물질에 대한 결합 효율이 50% 이상, 바람직하게는 50% 내지 90%가 될 수 있다. 상기 범위에서, 프탈레이트계 물질에 대한 결합 효율이 높아 프탈레이트계 물질에 대한 검출 한계를 낮출 수 있다.
상기 "결합 효율"은 ICT(immunochemistry technologies), MST(microscale thermophoresis), Biacore 또는 ELISA 방법 등으로 측정할 수 있다.
본 발명의 바이오센서에서, 앱타머는 프탈레이트계 물질에 대한 결합력이 1nM 이상 1mM 이하가 될 수 있다. 상기 범위에서, 프탈레이트계 물질에 대한 결합 효율이 높아 프탈레이트계 물질에 대한 검출 한계를 낮출 수 있다.
상기 "결합력"은 ICT, MST, Biacore 또는 ELISA 방법 등으로 측정할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 바이오센서에서, 앱타머는 형광체에 비가역적으로 결합되어 있다. 그 결과, 앱타머가 형광체로부터 분리되지 않는다.
앱타머를 형광체에 비가역적으로 결합하는 방법은 화학 결합, 공유 결합을 포함하는 비가역적인 결합 방법(예를 들면 티올기와 말레이미드기간의 결합, 스트렙트아비딘과 비오틴간의 결합, EDC와 NHS 간의 결합 등) 등을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 바이오센서에서, 앱타머는 형광체에 가역적으로 결합되어 있다. 그 결과, 앱타머로부터 형광체가 주변 상황의 변경에 의해 결합되었다가 분리될 수도 있다. 예를 들어, 앱타머 주위에 프탈레이트계 물질이 존재하는 경우 앱타머는 형광체에 비해 프탈레이트계 물질에 대한 결합력이 높을 경우, 앱타머는 형광체로부터 분리되고, 대신에 프탈레이트계 물질에 결합될 수 있다.
일 실시예에서, 형광체는 그 자체로 앱타머에 가역적으로 결합될 수도 있지만, 형광체에 결합된 소정의 핵산을 매개로 앱타머에 결합될 수 있다. 상기 핵산은 앱타머의 적어도 일부와 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바이오센서에서, 앱타머는 프탈레이트계 물질의 일 부위에만 결합하는 앱타머 1종을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 형광체는 바이오센서를 구성하는 기재에 비가역적으로 결합되고, 앱타머가 상기 형광체에 결합될 수 있다.
바람직하게는, 앱타머는 형광체의 발광을 차단하는 ??처를 추가로 포함할 수 있다.
??처는 앱타머에 결합되어 형광체의 발광을 차단할 수 있다. 이후 프탈레이트게 물질이 존재하는 경우 ??처는 제거되고 형광체는 발광할 수 있다.
본 발명의 바이오센서에서, 앱타머는 프탈레이트계 물질의 서로 다른 부위에 결합하는 제1앱타머, 제2앱타머를 포함할 수 있다. 이를 통해, 프탈레이트계 물질을 보다 고 감도로 검출하도록 할 수 있다.
일 구체예에서, 제1앱타머는 형광체에 비가역적으로 결합되고, 제2앱타머는 바이오센서를 구성하는 기재에 비가역적으로 결합될 수 있다.
다른 구체예에서, 제1앱타머, 제2앱타머는 모두 형광체의 서로 다른 부위에 비가역적으로 결합될 수 있다.
일 구체예에서, 제1앱타머는 검출 앱타머(detection aptamer)로서, 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에서, 제2앱타머는 프탈레이트계 물질에 대한 캡쳐 앱타머(capture aptamer)로서, 제1앱타머 대비 서열이 다르며, 예를 들면 서열번호 21일 수 있다.
본 발명의 프탈레이트계 물질을 검출하는 바이오센서는 바이오센서에 광을 조사하는 광 조사 유닛을 더 포함할 수 있다.
광 조사 유닛은 자외선을 방출하는 것일 수 있다. 광 조사 유닛은 바이오센서에 광을 직접 조사한다. 광 조사 유닛은 바이오센서에서 유체의 흐름에 간섭하지 않는 위치에 존재할 수 있고, 광 조사는 바이오센서에서 앱타머와 프탈레이트계 물질의 반응에 간섭하지 않는 범위, 강도 및 시간으로 수행될 수 있다. 광 조사 유닛은 바이오센서에서 앱타머와 프탈레이트계 물질의 반응을 쉽게 확인할 수 있게 할 수 있으며, 형광체의 형광을 유발한다. 이에 따라 프탈레이트계 물질의 존재 여부를 측정 및/또는 검출할 수 있다.
본 발명의 바이오센서는 상술한 앱타머, 형광체가 구비된다면, 당업자에게 알려진 통상의 바이오센서에 따라 구성될 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 프탈레이트계 물질의 검출 바이오센서의 작용을 도 1을 참고하여 설명한다.
도 1을 참조하면, 바이오센서는 제1앱타머(100), 제2앱타머(200), 및 양자점 또는 양자점 비드(300)를 포함한다.
제1앱타머(100), 제2앱타머(200)는 프탈레이트계 물질(10)의 서로 다른 부위에 각각 특이적으로 결합한다. 이를 통해, 바이오센서는 프탈레이트계 물질을 소량으로라도 고 민감도로 검출하도록 할 수 있다.
제1앱타머(100)는 양자점 또는 양자점 비드(300)에 비가역적으로 결합되어 있다. 따라서, 제1앱타머(100)가 양자점 또는 양자점 비드(300)로부터 분리되지 않아서 분석 신뢰성을 높일 수 있다.
제1앱타머(100)는 양자점 또는 양자점 비드(300)에 직접적으로 결합될 수도 있다. 그러나, 제1앱타머(100)는 양자점 또는 양자점 비드(300)에 제1링커(410)를 통해 결합될 수도 있다.
제1앱타머(100)를 양자점 또는 양자점 비드에 제1링커(410)를 통해 결합시키는 방법은 당업자에게 알려진 통상의 방법을 채용할 수 있다. 예를 들면, 화학 결합, 공유 결합을 포함하는 비가역적인 결합 방법(예를 들면 티올기와 말레이미드기간의 결합, 스트렙트아비딘과 비오틴간의 결합, EDC와 NHS 간의 결합 등) 등에 의해 수행될 수 있다.
제1앱타머(100)는 검출 앱타머(detection aptamer)로서, 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나일 수 있다.
제2앱타머(200)는 바이오센서의 기재(500)에 비가역적으로 결합되어 있다. 따라서, 프탈레이트계 물질이 존재하는 경우 프탈레이트계 물질이 제1앱타머(100)와 제2앱타머(200)에 각각 결합되어 최종적으로는 바이오센서의 기재에 고정됨으로써 분석 신뢰성을 높일 수 있다.
일 구체예에서, 바이오센서의 기재(500)는 유리판, 플라스틱 필름 등이 될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
제2앱타머(200)를 바이오센서의 기재(500)에 비가역적으로 결합시키는 방법은 당업자에게 알려진 통상의 방법을 채용할 수 있다.
제2앱타머(200)는 바이오센서의 기재(500)에 제2링커(420)를 통해 결합됨으로써 친화도 및 민감도 상승 효과를 구현할 수도 있다. 제2앱타머(200)를 바이오센서의 기재(500)에 제2링커(420)를 통해 결합시키는 방법은 당업자에게 알려진 통상의 방법을 채용할 수 있다. 예를 들면 스트렙트아비딘과 비오틴간의 결합, EDC와 NHS 간의 결합 등에 의해 수행될 수 있다.
제2앱타머(200)는 프탈레이트계 물질에 대한 캡쳐 앱타머(capture aptamer)로서, 서열번호 21일 수 있다.
양자점은 코어 및 코어를 둘러싸는 쉘을 포함할 수 있다. 양자점은 코어와 쉘만으로 구성될 수도 있으나, 코어와 쉘 사이에 안정층을 더 구비할 수도 있고, 쉘의 외측 즉 코어와 대향하여 안정층을 더 구비할 수도 있고, 쉘의 외측 즉 코어와 대향하여 리간드(또는 리간드층)을 더 구비할 수도 있다. 리간드층은 리간드가 차지하는 공간이 형성되는 층을 의미한다.
코어, 쉘, 안정층은 각각 12족-16족계 화합물, 13족-15족계 화합물, 14족-16족계 화합물 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
12족-16족계 화합물은 카드뮴설파이드(CdS), 카드뮴셀레나이드(CdSe), 카드뮴텔레나이드(CdTe), 징크설파이드(ZnS), 징크셀레나이드(ZnSe), 징크텔레나이드(ZnTe), 머큐리설파이드(HgS), 머큐리셀레나이드(HgSe), 머큐리텔레나이드(HgTe), 징크옥사이드(ZnO), 카드뮴옥사이드(CdO), 머큐리옥사이드(HgO), 카드뮴셀레늄설파이드(CdSeS), 카드뮴셀레늄텔레나이드(CdSeTe), 카드뮴설파이드텔레나이드(CdSTe), 카드뮴징크설파이드(CdZnS), 카드뮴징크셀레나이드(CdZnSe), 카드뮴설파이드셀레나이드(CdSSe), 카드뮴징크텔레나이드(CdZnTe), 카드뮴머큐리설파이드(CdHgS), 카드뮴머큐리셀레나이드(CdHgSe), 카드뮴머큐리텔레나이드(CdHgTe), 징크셀레늄설파이드(ZnSeS), 징크셀레늄텔레나이드(ZnSeTe), 징크설파이드텔레나이드(ZnSTe), 머큐리셀레늄설파이드(HgSeS), 머큐리셀레늄텔레나이드(HgSeTe), 머큐리설파이드텔레나이드(HgSTe), 머큐리징크설파이드(HgZnS), 머큐리징크셀레나이드(HgZnSe), 카드뮴징크옥사이드(CdZnO), 카드뮴머큐리옥사이드(CdHgO), 징크머큐리옥사이드(ZnHgO), 징크셀레늄옥사이드(ZnSeO), 징크텔레늄옥사이드(ZnTeO), 징크설파이드옥사이드(ZnSO), 카드뮴셀레늄옥사이드(CdSeO), 카드뮴텔레늄옥사이드(CdTeO), 카드뮴설파이드옥사이드(CdSO), 머큐리셀레늄옥사이드(HgSeO), 머큐리텔레늄옥사이드(HgTeO), 머큐리설파이드옥사이드(HgSO), 카드뮴징크셀레늄설파이드(CdZnSeS), 카드뮴징크셀레늄텔레나이드(CdZnSeTe), 카드뮴징크설파이드텔레나이드(CdZnSTe), 카드뮴머큐리셀레늄설파이드(CdHgSeS), 카드뮴머큐리셀레늄텔레나이드(CdHgSeTe), 카드뮴머큐리설파이드텔레나이드(CdHgSTe), 머큐리징크셀레늄설파이드(HgZnSeS), 머큐리징크셀레늄텔레나이드(HgZnSeTe), 머큐리징크설파이드텔레나이드(HgZnSTe), 카드뮴징크셀레늄옥사이드(CdZnSeO), 카드뮴징크텔레늄옥사이드(CdZnTeO), 카드뮴징크설파이드옥사이드(CdZnSO), 카드뮴머큐리셀레늄옥사이드(CdHgSeO), 카드뮴머큐리텔레늄옥사이드(CdHgTeO), 카드뮴머큐리설파이드옥사이드(CdHgSO), 징크머큐리셀레늄옥사이드(ZnHgSeO), 징크머큐리텔레늄옥사이드(ZnHgTeO) 및 징크머큐리설파이드옥사이드(ZnHgSO) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
13족-15족계 화합물은 갈륨포스포러스(GaP), 갈륨아세나이드(GaAs), 갈륨안티모니(GaSb), 갈륨나이트라이드(GaN), 알루미늄포스포러스(AlP), 알루미늄아세나이드(AlAs), 알루미늄안티모니(AlSb), 알루미늄나이트라이드(AlN), 인듐포스포러스(InP), 인듐아세나이드(InAs), 인듐안티모니(InSb), 인듐나이트라이드(InN), 갈륨포스포러스아세나이드(GaPAs), 갈륨포스포러스안티모니(GaPSb), 갈륨포스포러스나이트라이드(GaPN), 갈륨아세나이드나이트라이드(GaAsN), 갈륨안티모니나이트라이드(GaSbN), 알루미늄포스포러스아세나이드(AlPAs), 알루미늄포스포러스안티모니(AlPSb), 알루미늄포스포러스나이트라이드(AlPN), 알루미늄아세나이드나이트라이드(AlAsN), 알루미늄안티모니나이트라이드(AlSbN), 인듐포스포러스아세나이드(InPAs), 인듐포스포러스안티모니(InPSb), 인듐포스포러스나이트라이드(InPN), 인듐아세나이드나이트라이드(InAsN), 인듐안티모니나이트라이드(InSbN), 알루미늄갈륨포스포러스(AlGaP), 알루미늄갈륨아세나이드(AlGaAs), 알루미늄갈륨안티모니(AlGaSb), 알루미늄갈륨나이트라이드(AlGaN), 알루미늄아세나이드나이트라이드(AlAsN), 알루미늄안티모니나이트라이드(AlSbN), 인듐갈륨포스포러스(InGaP), 인듐갈륨아세나이드(InGaAs), 인듐갈륨안티모니(InGaSb), 인듐갈륨나이트라이드(InGaN), 인듐아세나이드나이트라이드(InAsN), 인듐안티모니나이트라이드(InSbN), 알루미늄인듐포스포러스(AlInP), 알루미늄인듐아세나이드(AlInAs), 알루미늄인듐안티모니(AlInSb), 알루미늄인듐나이트라이드(AlInN), 알루미늄아세나이드나이트라이드(AlAsN), 알루미늄안티모니나이트라이드(AlSbN), 알루미늄포스포러스나이트라이드(AlPN), 갈륨알루미늄포스포러스아세나이드(GaAlPAs), 갈륨알루미늄포스포러스안티모니(GaAlPSb), 갈륨인듐포스포러스아세나이드(GaInPAs), 갈륨인듐알루미늄아세나이드(GaInAlAs), 갈륨알루미늄포스포러스나이트라이드(GaAlPN), 륨알루미늄아세나이드나이트라이드(GaAlAsN), 갈륨알루미늄안티모니나이트라이드(GaAlSbN), 갈륨인듐포스포러스나이트라이드(GaInPN), 갈륨인듐아세나이드나이트라이드(GaInAsN), 갈륨인듐알루미늄나이트라이드(GaInAlN), 갈륨안티모니포스포러스나이트라이드(GaSbPN), 갈륨아세나이드포스포러스나이트라이드(GaAsPN), 갈륨아세나이드안티모니나이트라이드(GaAsSbN), 갈륨인듐포스포러스안티모니(GaInPSb), 갈륨인듐포스포러스나이트라이드(GaInPN), 갈륨인듐안티모니나이트라이드(GaInSbN), 갈륨포스포러스안티모니나이트라이드(GaPSbN), 인듐알루미늄포스포러스아세나이드(InAlPAs), 인듐알루미늄포스포러스나이트라이드(InAlPN), 인듐포스포러스아세나이드나이트라이드(InPAsN), 인듐알루미늄안티모니나이트라이드(InAlSbN), 인듐포스포러스안티모니나이트라이드(InPSbN), 인듐아세나이드안티모니나이트라이드(InAsSbN) 및 인듐알루미늄포스포러스안티모니(InAlPSb) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
14족-16족계 화합물은 틴옥사이드(SnO), 틴설파이드(SnS), 틴셀레나이드(SnSe), 틴텔레나이드(SnTe), 리드설파이드(PbS), 리드셀레나이드(PbSe), 리드텔레나이드(PbTe), 저마늄옥사이드(GeO), 저마늄설파이드(GeS), 저마늄셀레나이드(GeSe), 저마늄텔레나이드(GeTe), 틴셀레늄설파이드(SnSeS), 틴셀레늄텔레나이드(SnSeTe), 틴설파이드텔레나이드(SnSTe), 리드셀레늄설파이드(PbSeS), 리드셀레늄텔레나이드(PbSeTe), 리드설파이드텔레나이드(PbSTe), 틴리드설파이드(SnPbS), 틴리드셀레나이드(SnPbSe), 틴리드텔레나이드(SnPbTe), 틴옥사이드설파이드(SnOS), 틴옥사이드셀레나이드(SnOSe), 틴옥사이드텔레나이드(SnOTe), 저마늄옥사이드설파이드(GeOS), 저마늄옥사이드셀레나이드(GeOSe), 저마늄옥사이드텔레나이드(GeOTe), 틴리드설파이드셀레나이드(SnPbSSe), 틴리드셀레늄텔레나이드(SnPbSeTe) 및 틴리드설파이드텔레나이드(SnPbSTe) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
코어의 직경은 1 nm 내지 6 nm, 구체적으로 1.2 nm 내지 5 nm, 더욱 구체적으로 2 nm 내지 5 nm일 수 있다. 상기의 범위에서 안정층을 2 이상 포함할 수 있고, 양자점의 광학적 효율이 우수한 장점이 있다.
쉘의 두께는 0.5 nm 내지 10 nm, 구체적으로 0.5 nm 내지 8 nm, 더욱 구체적으로 0.5 nm 내지 6 nm일 수 있다. 상기의 범위에서 양자점의 안정성이 높아지는 있다. 상기 쉘은 2 이상의 쉘을 포함할 수 있다.
안정층은 양자점에 1층으로 포함될 수도 있으나, 2개 이상의 층으로 포함될 수도 있다. 즉, 코어와 쉘 사이에 제1안정층을 포함하고, 쉘의 외측에 제2안정층을 포함할 수 있다. 또는 코어와 쉘, 및 쉘의 외층에 쉘로부터 제1안정층, 제2안정층을 포함할 수 있다.
리간드(또는 리간드층)은 수용성 리간드, 지용성 리간드 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 지용성 리간드는 트리-n-옥틸포스핀옥사이드(tri-n-octylphosphine oxide), 데실아민(decylamine), 디데실아민(didecylamine), 트리데실아민(tridecylamine), 테트라데실아민(tetradecylamine), 펜타데실아민(pentadecylamine), 헥사데실아민(hexadecylamine), 옥타데실아민(octadecylamine), 운데실아민(undecylamin), 디옥타데실아민(dioctadecylamine), N,N-디메틸데실아민(N,N-dimethyldecylamine), N,N-디메틸도데실아민(N,N-dimethyldodecylamine), N,N-디메틸헥사데실아민(N,N-dimethylhexadecylamine), N,N-디메틸테트라데실아민(N,N-dimethyltetradecylamine), N,N-디메틸트리데실아민(N,N-dimethyltridecylamine), N,N-디메틸운데실아민(N,N-dimethylundecylamine), N-데실아민(N-decylamine), N-메틸옥타데실아민(N-methyloctadecylamine), 디도데실아민(didodecylamine), 트리도데실아민(tridodecylamine), 사이클로도데실아민(cyclododecylamine), N-메틸도데실아민(N-methyldodecylamine), 트리옥틸아민(trioctylamine), 라우르산(lauric acid), 팔미트산(palmiticacid), 올레산(oleic acid), 스테아르산(stearic acid), 미리스트산(myristicacid), 엘라이드산(elaidic acid), 아라킨산(eicosanoic acid), 헨에이코산산(heneicosanoic acid), 트리코산산(tricosanoic acid), 도코사노산(docosanoic acid), 테트라코사논산(tetracosanoic acid), 헥사코사논산(hexacosanoic acid), 헵타코사논산(heptacosanoic acid), 옥타코사논산(octacosanoic acid) 및 시스-13-도코세논산(cis-13-docosenoic acid) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 수용성 리간드는 실리카, PEG(polyethylene glycol), 머캡토 프로피온산(MPA), 시스테아민(cysteamine), 메르캡토 아세트산(mercapto-acetic acid), 머캡토 운데카놀(mercapto-undecanol), 2-머캡토 에탄올(2-mercapto-ethanol), 1-티오-글리세롤(1-thio glycerol), 데옥시리보뉴클레익 에시드 (DNA), 머캡토 아세트산(mercapto acetic acid), 머캡토 운데카노산(mercapto-undecanoic acid), 1-머캡토-6-페닐 헥산 (1-mercapto-6-phenyl-hexane), 1,16-디머캡토-헥사데칸(1,16-dimecapto-hexadecane), 18-머캡토-옥타데실아민(18-mercapto-octadecyl amine), 트리옥틸포스핀(tri-octyl phosphine), 6-머캡토-헥산(6-mercapto-hexane), 6-머캡토-헥사노익 산(6-mercapto-hexanoic acid), 16-머캡토-헥사데카노익 산(16-mercapto-hexadecanoic acid), 18-머캡토-옥타데실아민(18-mercapto-octadecyl amine), 6-머캡토-헥실아민(6-mercapto-hexyl amine) 또는 8-히드록시-옥틸티올(8-hydroxy-octylthiol), 1-싸이오-글리세롤(1-thio-glycerol), 머캡토 아세트산(mercapto-acetic acid), 머캡토운데카노산(mercapto-undecanoic acid), 하이드록사메이트(hydroxamate), 하이드록사믹 산의 유도체 및 에틸렌디아민(ethylene diaminie) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
양자점은 평균 입경이 6 내지 30nm, 구체적으로 6 내지 20nm가 될 수 있다. 상기 범위에서, 광학 특성이 우수한 장점이 있을 수 있다.
양자점에서, 코어는 카드뮴, 셀레늄을 포함할 수 있다. 쉘 및 안정층은 각각 카드뮴, 셀레늄, 아연, 황 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 코어, 쉘 및 안정층은 각각 카드뮴을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 양자점은 코어로 갈수록 카드뮴 또는 셀레늄의 함량(몰%)이 증가할 수 있다.
양자점은 당업자에게 알려진 통상의 방법으로 제조될 수 있으며, 보다 상세한 내용은 양자점 관련하여 알려진 종래 기술에 따른다.
양자점 비드는 복수 개의 양자점이 결합된 비드로서, 양자점 대비 평균 입경이 크다.
양자점 비드는 평균 입경이 50nm 내지 2㎛ 바람직하게는 100nm 내지 1.5㎛가 될 수 있다. 상기 범위에서 바이오센서에 적용시 양자점 비드의 이동이 용이하고 프탈레이트계 물질의 이동에 방해가 되지 않을 수 있다.
일 구체예에서, 양자점 비드는 지지체 및 상기 지지체에 결합된 복수개의 양자점을 포함할 수 있다. 상기 지지체는 실리카 지지체를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 양자점은 CdSe 및 ZnS로 이루어진 것일 수 있다.
바이오센서 내에 시료가 주입되고, 시료 내에 프탈레이트계 물질(10)이 포함되어 있는 경우, 제1앱타머(100)와 제2앱타머(200)는 프탈레이트계 물질(10)의 서로 다른 부위에 각각 특이적으로 결합한다. 광 조사 유닛에 의해 광 조사시 양자점 또는 양자점 비드(300)에 의해 발광이 됨으로써 프탈레이트계 물질이 존재함을 확인할 수 있다.
일 구체예에서, 검출 앱타머로서 제1앱타머(100)는 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나이고, 캡처 앱타머로서 제2앱타머(200)는 서열번호 21의 서열일 수 있다.
다른 구체예에서, 검출 앱타머로서 제1앱타머(100)는 서열번호 21 이고, 캡처 앱타머로서 제2앱타머(200)는 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 서열일 수 있다.
이하, 본 발명의 다른 실시예에 따른 프탈레이트계 물질의 검출 바이오센서의 작용을 도 2를 참고하여 설명한다.
도 2를 참조하면, 바이오센서는 제1앱타머(100), 제2앱타머(200), 및 양자점 또는 양자점 비드(300)를 포함한다.
제1앱타머(100), 제2앱타머(200)는 프탈레이트계 물질(10)의 서로 다른 부위에 각각 특이적으로 결합한다. 이를 통해, 바이오센서는 프탈레이트계 물질을 소량으로라도 고 민감도로 검출하도록 할 수 있다.
제1앱타머(100), 제2앱타머(200)는 각각 양자점 또는 양자점 비드(300)에 비가역적으로 결합되어 있다. 따라서, 제1앱타머(100), 제2앱타머(200)가 양자점 또는 양자점 비드(300)으로부터 분리되지 않아서 분석 신뢰성을 높일 수 있다.
제1앱타머(100), 제2앱타머(200)는 각각 양자점 또는 양자점 비드(300)에 직접적으로 결합될 수도 있다. 그러나, 제1앱타머(100), 제2앱타머(200)는 각각 양자점 또는 양자점 비드(300)에 링커를 통해 결합됨으로써, 친화도 및 민감도 상승 효과를 구현할 수도 있다.
제1앱타머(100), 제2앱타머(200)를 양자점 또는 양자점 비드(300)에 제1링커(410), 제3링커(430)를 통해 결합시키는 방법은 당업자에게 알려진 통상의 방법을 채용할 수 있다.
일 구체예에서, 양자점 또는 양자점 비드(300)는 바이오센서의 기재에 고정되어 있지 않을 수 있다. 대신에, 복수 개의 양자점 또는 양자점 비드(300)이 존재함으로써 프탈레이트계 물질 존재시 서로 응집함으로써 발색을 하거나 발광을 할 수 있다.
양자점 또는 양자점 비드(300)에 대한 상세 내용은 상기 도 1에서 설명한 바와 같다.
바이오센서 내에 시료가 주입되고, 시료 내에 프탈레이트계 물질(10)이 포함되어 있는 경우, 제1앱타머(100)와 제2앱타머(200)는 프탈레이트계 물질(10)의 서로 다른 부위에 특이적으로 결합한다. 광 조사 유닛에 의해 광 조사시 양자점 또는 양자점 비드(300)에 의해 발광이 됨으로써 프탈레이트계 물질이 존재함을 확인할 수 있다. 또는 양자점 또는 양자점 비드(300)가 서로 응집됨으로써 발색이 됨으로써 프탈레이트계 물질이 존재함을 확인할 수 있다.
일 구체예에서, 검출 앱타머로서 제1앱타머(100)는 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나이고, 캡처 앱타머로서 제2앱타머(200)는 서열번호 21의 서열일 수 있다.
다른 구체예에서, 검출 앱타머로서 제1앱타머(100)는 서열번호 21 이고, 캡처 앱타머로서 제2앱타머(200)는 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 서열일 수 있다.
이하, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 프탈레이트계 물질의 검출 바이오센서의 작용을 도 3을 참고하여 설명한다.
도 3을 참조하면, 바이오센서는 앱타머(100), 양자점 또는 양자점 비드(300), ??처(600)를 포함할 수 있다.
앱타머(100)는 프탈레이트계 물질(10)의 임의의 부위에 특이적으로 결합한다. 이를 통해, 바이오센서는 프탈레이트계 물질을 소량으로라도 고 민감도로 검출하도록 할 수 있다.
일 구체예에서, 앱타머(100)는 서열번호 1 내지 서열번호 20의 서열 중 어느 하나일 수 있다.
다른 구체예에서, 앱타머(100)는 서열번호 21일 수 있다.
앱타머(100)는 양자점 또는 양자점 비드(300)에 비가역적으로 결합되어 있다. 따라서, 앱타머(100)가 양자점 또는 양자점 비드(300)으로부터 분리되지 않아서 분석 신뢰성을 높일 수 있다.
앱타머(100)는 양자점 또는 양자점 비드(300)에 직접적으로 결합될 수도 있다. 그러나, 앱타머(100)는 양자점 또는 양자점 비드(300)에 제1링커(410)를 통해 결합됨으로써, 친화도 및 민감도 상승 효과를 구현할 수도 있다.
앱타머(100)를 양자점 또는 양자점 비드(300)에 제1링커(410)를 통해 결합시키는 방법은 당업자에게 알려진 통상의 방법을 채용할 수 있다.
양자점 또는 양자점 비드(300)는 바이오센서의 기재(500)에 직접적으로 결합될 수도 있다. 그러나, 양자점 또는 양자점 비드(300)는 제4링커(440)를 통해 결합됨으로써, 친화도 및 민감도 상승 효과를 구현할 수도 있다.
양자점 또는 양자점 비드(300)를 바이오센서의 기재(500)에 제4링커(440)를 통해 결합시키는 방법은 당업자에게 알려진 통상의 방법을 채용할 수 있다.
??처(600)는 앱타머(100) 또는 양자점 또는 양자점 비드(300)에 결합되어 광을 조사하더라도 양자점 또는 양자점 비드(300)의 발광을 차단할 수 있다. 그러나, 프탈레이트계 물질(10)이 존재하는 경우 ??처(600)가 소거됨으로써, 프탈레이트계 물질이 앱타머(100)에 결합되고, 광을 조사하는 경우 양자점 또는 양자점 비드가 발광할 수 있다.
??처(600)는 염료(dye)로서 상품명 Black Hole, 골드(gold) 나노파티클 등을 포함하는 골드 파티클, FRET(fluorescence resonance energy transfer)용 형광체 중 1종 이상을 포함할 수 있다. ??처는 앱타머(100)에 결합하기 위하여 앱타머 서열 중 일부분의 상보염기를 갖는 서열을 포함할 수 있다
일 구체예에서, 앱타머(100)는 서열번호 1 내지 서열번호 21 중 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에서, 앱타머(100)가 하기 표 1에서 서열번호 8일 경우, ??처(600)는 서열번호 25의 서열을 포함할 수 있다: 서열번호 25: 5'-GTCGTGTGG-3'.
이하, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 프탈레이트계 물질의 검출 바이오센서의 작용을 도 4를 참고하여 설명한다.
도 4를 참조하면, 바이오센서는 앱타머(100), 양자점 또는 양자점 비드(300)를 포함할 수 있다.
앱타머(100)는 프탈레이트계 물질(10)의 임의의 부위에 특이적으로 결합한다. 이를 통해, 바이오센서는 프탈레이트계 물질(10)을 소량으로라도 고 민감도로 검출하도록 할 수 있다.
일 구체예에서, 앱타머(100)는 서열번호 1 내지 서열번호 20의 서열 중 어느 하나일 수 있다.
다른 구체예에서, 앱타머(100)는 서열번호 21일 수 있다.
앱타머(100)는 바이오센서의 기재(500)에 비가역적으로 결합되어 있다. 따라서, 프탈레이트계 물질이 존재하는 경우 프탈레이트계 물질이 앱타머(100)에 결합되어 최종적으로는 바이오센서의 기재에 고정됨으로써 분석 신뢰성을 높일 수 있다.
일 구체예에서, 바이오센서의 기재(500)는 유리판, 플라스틱 필름 등이 될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
앱타머(100)를 바이오센서의 기재(500)에 비가역적으로 결합시키는 방법은 당업자에게 알려진 통상의 방법을 채용할 수 있다.
앱타머(100)는 바이오센서의 기재(500)에 제2링커(420)를 통해 결합됨으로써 민감도, 친화도 개선 효과를 구현할 수도 있다. 앱타머(100)를 바이오센서의 기재(500)에 제2링커(420)를 통해 결합시키는 방법은 당업자에게 알려진 통상의 방법을 채용할 수 있다.
앱타머(100)는 핵산 서열(700)을 매개로 양자점 또는 양자점 비드에 가역적으로 결합되어 있다. 그 결과, 앱타머로부터 양자점 또는 양자점 비드가 주변 상황의 변경에 의해 결합되었다가 분리될 수도 있다. 예를 들어, 앱타머(100) 주위에 프탈레이트계 물질이 존재하는 경우 앱타머는 양자점 또는 양자점 비드에 비해 프탈레이트계 물질에 대한 결합력이 높을 경우, 앱타머로부터 양자점 또는 양자점 비드가 분리되고, 대신에 프탈레이트계 물질이 앱타머에 결합될 수 있다. 앱타머에 대해 핵산 서열은 유해 물질과 경쟁적으로 결합한다.
핵산 서열(700)은 앱타머(100)에 상보적인 염기 서열을 포함하거나 앱타머(100)에 상보적인 염기 서열일 수 있다. 일 구체예에서, 앱타머(100)가 하기 표 1에서 서열번호 8일 경우, 핵산 서열(700)은 서열번호 25의 서열일 수 있다: 서열번호 25: 5'-GTCGTGTGG-3'.
핵산 서열(700)은 양자점 또는 양자점 비드(300)에의 결합을 위하여 5' 말단이 티올기로 변성될 수도 있다.
도 4에서의 바이오센서는 바이오센서의 기재(500)에 핵산 서열(700)에 상보적인 서열을 갖는 핵산 서열(800)이 결합되어 있다. 프탈레이트계 물질(10) 투입시 앱타머(100)는 프탈레이트계 물질(10)과 결합하는 대신에 핵산 서열(700)이 떨어져 나가게 되며, 떨어져 나온 핵산 서열(700)은 바이오센서의 기재(500)에 결합된 상보적인 핵산 서열(800)에 결합됨으로써 발광을 할 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 프탈레이트계 물질의 검출 방법을 설명한다.
본 발명의 프탈레이트계 물질의 검출 방법은 본 발명의 프탈레이트계 물질 검출용 바이오센서를 사용하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 프탈레이트계 물질의 존부를 분석하고자 하는 시료를 프탈레이트계 물질 검출용 바이오센서에 주입하고, 상기 프탈레이트계 물질 검출용 바이오센서를 소정의 조건 하에 방치하고, 광 조사 유닛을 조사하여 양자점 또는 양자점 비드로부터 발광 유무를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
<실시예 1> 앱타머 발굴
도 1과 같이 프탈레이트계 물질의 양 방향에서 표적을 검출하는 시스템을 개발하기 위해 DEHP용 앱타머(서열번호 21)를 표적을 고정화하는데 이용하였다.
5'-AATTGAGCGGTTGAAAGGCGTGAGACCGATGTAATGCAGC-'3(서열번호 21)의 5' 말단에 비오틴이 치환되도록 변형시켜, 5'-biotin-AATTGAGCGGTTGAAAGGCGTGAGACCGATGTAATGCAGC-'3을 제조하였다. 준비된 앱타머 5'-biotin-AATTGAGCGGTTGAAAGGCGTGAGACCGATGTAATGCAGC-'3를 스트렙트아비딘 비드에 고정시켜 스트렙트아비딘 비드-비오틴-DEPH용 앱타머의 결합체를 제조하였다.
제조한 스트렙트아비딘 비드-비오틴-DEPH용 앱타머의 결합체에 표적 물질인 DEHP를 첨가하여 스트렙트아비딘 비드-비오틴-DEHP용 앱타머-DEHP의 중합체를 만들어준 뒤 결합하지 않는 DEHP 를 결합 완충 용액인 PBST로 1회 세척하여 제거하였다.
자체 제조한 합성 라이브러리 2nmol을 상기와 동일하게 제조한 스트렙트아비딘 비드-비오틴-DEPH용 앱타머와 결합시키고 분획을 분리하여 스트렙트아비딘 비드-비오틴-DEPH용 앱타머에 결합하는 라이브러리를 제거하는 count-selection 과정을 진행하였다.
이 과정을 거친 분획을 상기 표적이 결합된 중합체(스트렙트아비딘 비드-비오틴-DEHP용 앱타머-DEHP의 중합체)와 상온에서 2시간 동안 반응하여 결합하였다. 결합된 라이브러리를 2mM NaOH로 elution한뒤 다음과 같은 primer를 이용하여 (1) Forward 5'-GATGTGAGTGTGTGACGAG-3'(서열번호 22) (2) Reverse 5'-Biotin-GTGTCTCGGTTGTGGTG-3' (서열번호 23) QPCR로 증폭한 후에 QPCR product를 streptavidin에 고정하여 20mM NaOH로 single strand DNA를 추출하는 방식으로 SELEX를 진행하였다. 총 15회의 반복된 SELEX round가 진행되었고 염기 서열 분석을 통해 개별의 앱타머의 염기 서열을 해독하였다. 자세한 염기 서열은 하기 표 1에 정리하였다.
No 앱타머 서열 서열번호
DEHP-DE01 ATGATGCCCAGGTTAATCGATGCCAGAATAATAGAAGTCC 서열번호 1
DEHP-DE02 TGTGTTGTGTGGAGATATAGGGCGTGGTGAGTTGTTTCAG 서열번호 2
DEHP-DE03 CAGTGCATAAGGGAGTAGTGGAGGAGAGAGATCACCTGTT 서열번호 3
DEHP-DE04 TTGGAGGAGTGAGTGTTGTTAAAGAGGCTATCGATAGTGT 서열번호 4
DEHP-DE05 TGTGAGTGAGATGAGTTTTGACTGAGATTCCTACCCTACC 서열번호 5
DEHP-DE06 GCTCGGTTCAAATGGATGATGGTTGGGTGGATTGGGGAT 서열번호 6
DEHP-DE07 TGTGTGAGTGGGAGCTGGGGTTACCGGGAGTTAAAGGATT 서열번호 7
DEHP-DE08 AGTCAAGTACCCCACACGACGTGGATGAGAGATGGAACTA 서열번호 8
DEHP-DE09 AAGTAGTGAGAGTGAGTTGTGCGCGGCTCGTGTAGGTTTA 서열번호 9
DEHP-DE10 CGGAGTGGGAGTACCATATGTGGAGATGGAGATCAGTGTT 서열번호 10
DEHP-DE11 ACGACCATAGCCAAGCTGAGGAATAAGGAGTCAGGACAAC 서열번호 11
DEHP-DE12 TGTGTTAGAGTGAGGTAATGGAGTAGGAGGGCGACTGCTT 서열번호 12
DEHP-DE13 CCGAGATAAGGAGTGTAGAGAGCGATGGAGCATGCTGTTT 서열번호 13
DEHP-DE14 GATGATGAGGTGAGTAACTGACCCAGCCTCCTTCATTAT 서열번호 14
DEHP-DE15 GAGGTTTTGAGTCGTGTGAGTGTTTGGAGTTAGAAAGATT 서열번호 15
DEHP-DE16 ATTGGAGTGAGTAGCGTTCTCCTAGGGGCGATGTACTA 서열번호 16
DEHP-DE17 TATAGTTATGTTGAGCCTTATGAGTGAGATCAATTATTGT 서열번호 17
DEHP-DE18 GATGTGTGGAGTTCAGATGAGTATTCTGTCGAGGAAGACT 서열번호 18
DEHP-DE19 AGAGTGGGGTGCCAAGGTGGAGTGTGGGCTGTCGTGGTGT 서열번호 19
DEHP-DE20 TAATAGGATGAGTCGGATAGCGGTTGGGGATGAGATGTTA 서열번호 20
<실시예 2> 양자점과 검출 앱타머 결합
검출 앱타머(detection aptamer)와 양자점의 결합체를 제조하기 위해, 5' 말단에 티올기(-SH)를 갖는 올리고머를 주문하여 합성하였다. 본 실시예에서는 하기 표 2와 같이, 5'- AGTCAAGTACCCCACACGACGTGGATGA
GAGATGGAACTA-3' 앱타머(서열번호 8)의 5-말단에 티올기가 결합된 5'-Thiol-AGTCAAGTACCCCACACGACGTGGATGA
GAGATGGAACTA-3' 앱타머를 사용하였다. 상기 앱타머와 양자점(코어: CdSe, 쉘: ZnS)의 결합은 양자점이 앱타머의 티올기와 특이적인 결합을 이루는 성질을 이용하여 양자점의 표면에 티올기가 있는 앱타머가 결합하도록 48시간 동안 반응시켰다.
<실시예 3> 프탈레이트 앱타머 결합력 검증
앱타머의 성능 평가를 위해 도 5a에 나와 있는 그림과 같은 방법으로 샌드위치 어세이(sandwich assay) 방법을 이용한 결합력 측정을 진행하였다. 이를 위해 표 2에 표기된 염기 서열을 갖는 앱타머를 이용하였다.
5' 위치가 Biotin으로 변형된 캡쳐 앱타머와 양자점(코어: CdSe, 쉘: ZnS)이 결합된 검출 앱타머를 합성하였다. 캡쳐 앱타머와 검출 앱타머를 1:1비율로 혼합하여 준비하였다. 그리고 표적 물질인 DEHP를 농도별로 희석하여 혼합 용액과 반응하였다. 실온 상태에서 1시간 동안 1300rpm으로 결합 반응을 진행하였다. 그 후 스트렙트아비딘-비드를 첨가하여 비오틴과 스트렙트아비딘 간의 결합을 통해 결합체를 침전하여 분리하였다. 그리고 100ul의 binding buffer로 3회 세척하여 결합하지 않은 검출 앱타머를 제거하였다.
반응이 끝난 용액을 Black plate에 옮긴뒤 Fluorescence를 측정하여 결합 여부를 검증하였다.
대조군 1은 캡쳐 앱타머만 사용하고, 대조군 2는 검출 앱타머만 사용하여 위와 동일한 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 6에서와 같이 캡쳐 앱타머와 검출 앱타머가 동시에 사용된 경우에서만 형광값이 측정되는 것이 확인되었다. 그리고, DEHP 농도가 증가함에 따라 형광값도 증가함을 확인하였다.
No 앱타머 서열 설명
DEHP- 캡쳐 앱타머 5'-biotin-AATTGAGCGGTTGAAAGGCGTGAGACCGATGTAATGCAGC-3' 서열번호 21의 5'말단에 비오틴이 결합
DEHP-검출 앱타머 5'-Thiol-AGTCAAGTACCCCACACGACGTGGATGAGAGATGGAACTA-3' 서열번호 8의 5' 말단에 티올기가 결합
대조군-캡쳐 앱타머 5'-biotin-AGTTAAGAGCGATGTTGACGTATGGAGACAGCGTAGCAGC-3' 서열번호 24의 5'말단에 비오틴이 결합
*서열번호 21: 5'-AATTGAGCGGTTGAAAGGCGTGAGACCGATGTAATGCAGC-3'
*서열번호 24: 5'-AGTTAAGAGCGATGTTGACGTATGGAGACAGCGTAGCAGC-3'
<실시예 4> 양자점 비드 제조
(1) 실리카 입자 지지체의 합성
실리카 기반 나노입자는 스토버 방법에 따라 합성하였다. 삼각 플라스크에 먼저 NH4OH, EtOH, H2O를 3:60:1 ml의 비율로 교반한 후, 상기 반응물에TEOS(tetraethylorthosilicate)를 2 ml 첨가하고, 50 ℃에서 교반하면서 18시간 이상 반응시켰다. 이때 원하는 실리카 크기에 따라서 반응 시간과 혼합 비율을 조절할 수 있다. 그런 뒤 에탄올을 이용하여 원심 분리기를 통해 최종 시료를 얻었다. 여기서 대략 200 nm의 실리카 비드를 얻을 수 있었다. 그런 뒤 표면과 양자점의 반응을 위해 반응성 작용기인 3-머캅토프로필트리메톡시실란(3-mercaptopropyltrimethoxysilane, MPTS), NH4OH를 각각 180ul투입하고 12시간에서 24시간 동안 반응시켰다. 그런 뒤 에탄올을 이용하여 원심 분리기를 통해 정제하여 표면이 개질된 실리카 입자 지지체를 수득하였다.
(2) 지지체에 양자점 결합
양자점(코어: CdSe, 쉘: ZnS)과 표면 개질된 실리카 지지체 비율을 50:100mg비율로 하고, 클로로포름의 부피를 이 혼합물에 대해 2배 첨가한 다음, 교반후 30분 동안 반응시켰다. 반응 후 양자점 비드를 수득하였다.
<실시예 5> 양자점 비드-앱타머 결합
양자점 비드는 양자점이 비드의 표면에 결합되어 있고, 비드와 결합된 부위 이외의 양자점 표면은 양자점의 본 성질과 같이 티올기와 특이적인 결합을 이룰 수 있다. 따라서 양자점 비드와 앱타머의 결합은 양자점-앱타머의 결합과 동일한 방법으로써 티올기를 갖는 올리고머를 이용하여 양자점 비드 표면에 있는 양자점에 결합하도록 48시간 동안 반응하였다. 제조된 양자점 비드를 사용하여 도 5b에서와 같이 <실시예 3>의 방법을 수행할 수 있다.
<실시예 6> 양자점과 양자점 비드의 검출 민감도 비교
양자점 비드는 양자점에 비해 양자점 수가 최소 200배에서 많게는 500배 더 많은 양자점을 포함하므로 양자점과 양자점 비드에 결합한 앱타머의 검출 민감도를 비교하기 위해 실시예 3과 동일한 방법으로 검증하였다.
양자점으로는 코어가 CdSe, 쉘이 ZnS인 양자점을 사용하였다. 양자점 비드로는 <실시예 4>에서 제조한 양자점 비드를 사용하였다.
양자점 대조군과 양자점 비드 대조군의 캡쳐 앱타머로는 상기 표 2에서 명시된 대조군의 캡쳐 앱타머가 사용되었다.
양자점 샘플과 양자점 비드 샘플의 캡쳐 앱타머로는 서열번호 21의 5' 말단에 비오틴이 결합된 것이 사용되었다.
<실시예 3>과 동일한 방법으로 DEHP에 대한 결합력을 평가하였다. 도 7을 참조하면, 동일한 캡쳐 앱타머의 경우 양자점 대비 양자점 비드를 사용하였을 때 형광 강도가 매우 현저하게 증폭되는 것을 확인할 수 있다. 형광값으로 약 10배 가량 증하가는 것이 관찰되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> ZEUS <120> BIOSENSOR FOR ANALYZING HARMFUL SUBSTANCE USING APTAMER AND METHOD FOR ANALYZING HARMFUL SUBSTANCE USING THE SAME <130> AHP19035 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE01 <400> 1 atgatgccca ggttaatcga tgccagaata atagaagtcc 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE02 <400> 2 tgtgttgtgt ggagatatag ggcgtggtga gttgtttcag 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE03 <400> 3 cagtgcataa gggagtagtg gaggagagag atcacctgtt 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE04 <400> 4 ttggaggagt gagtgttgtt aaagaggcta tcgatagtgt 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE05 <400> 5 tgtgagtgag atgagttttg actgagattc ctaccctacc 40 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE06 <400> 6 gctcggttca aatggatgat ggttgggtgg attggggat 39 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE07 <400> 7 tgtgtgagtg ggagctgggg ttaccgggag ttaaaggatt 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE08 <400> 8 agtcaagtac cccacacgac gtggatgaga gatggaacta 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE09 <400> 9 aagtagtgag agtgagttgt gcgcggctcg tgtaggttta 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE10 <400> 10 cggagtggga gtaccatatg tggagatgga gatcagtgtt 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE11 <400> 11 acgaccatag ccaagctgag gaataaggag tcaggacaac 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE12 <400> 12 tgtgttagag tgaggtaatg gagtaggagg gcgactgctt 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE13 <400> 13 ccgagataag gagtgtagag agcgatggag catgctgttt 40 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE14 <400> 14 gatgatgagg tgagtaactg acccagcctc cttcattat 39 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE15 <400> 15 gaggttttga gtcgtgtgag tgtttggagt tagaaagatt 40 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE16 <400> 16 attggagtga gtagcgttct cctaggggcg atgtacta 38 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE17 <400> 17 tatagttatg ttgagcctta tgagtgagat caattattgt 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE18 <400> 18 gatgtgtgga gttcagatga gtattctgtc gaggaagact 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE19 <400> 19 agagtggggt gccaaggtgg agtgtgggct gtcgtggtgt 40 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-DE20 <400> 20 taataggatg agtcggatag cggttgggga tgagatgtta 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEHP-CAPTURE <400> 21 aattgagcgg ttgaaaggcg tgagaccgat gtaatgcagc 40 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD PRIMER <400> 22 gatgtgagtg tgtgacgag 19 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE PRIMER <400> 23 gtgtctcggt tgtggtg 17 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CONTROL CAPTURE APAMER <400> 24 agttaagagc gatgttgacg tatggagaca gcgtagcagc 40 <210> 25 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QUENCHER <400> 25 gtcgtgtgg 9

Claims (21)

  1. 유해 물질에 특이적으로 결합하는 앱타머; 및 형광체를 포함하고,
    상기 형광체는 상기 앱타머에 가역적 또는 비가역적으로 결합되어 있는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유해 물질은 디에틸헥실 프탈레이트(DEHP), 벤질부틸 프탈레이트(BBP), 디부틸 프탈레이트(DBP), 디이소부틸 프탈레이트(DIBP) 중 1종 이상을 포함하는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  3. 제2항에 있어서, 상기 DEHP, BBP, DBP, DIBP는 상기 바이오센서에 의해 동시에 검출되는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  4. 제1항에 있어서, 상기 앱타머는 상기 형광체에 비가역적으로 결합된 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  5. 제4항에 있어서, 상기 바이오센서는 상기 형광체에 비가역적으로 결합된 제1앱타머, 및 상기 바이오센서의 기재에 결합된 제2앱타머를 포함하는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제1앱타머와 상기 제2앱타머는 상기 유해 물질의 서로 다른 부위에 결합하는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  7. 제5항에 있어서, 상기 제1앱타머와 상기 제2앱타머는 각각 링커에 의해 상기 형광체, 상기 바이오센서의 기재에 결합되는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  8. 제5항에 있어서, 상기 제1앱타머는 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나이고, 상기 제2 앱타머는 서열번호 21인 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  9. 제4항에 있어서, 상기 앱타머는 상기 유해 물질의 서로 다른 부위에 결합하는 제1앱타머, 제2앱타머를 포함하는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1앱타머, 상기 제2앱타머는 링커에 의해 상기 형광체에 결합된 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  11. 제9항에 있어서, 상기 바이오센서는 상기 제1앱타머 및 상기 제2앱타머가 동시에 결합된 상기 형광체를 복수 개 포함하는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  12. 제4항에 있어서, 상기 형광체는 상기 바이오센서의 기재에 결합되는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  13. 제12항에 있어서, 상기 바이오센서는 상기 앱타머 및 상기 형광체에 결합된 ??처를 추가로 포함하는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  14. 제1항에 있어서, 상기 앱타머는 상기 형광체에 가역적으로 결합된 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  15. 제14항에 있어서, 상기 앱타머는 핵산 서열을 매개로 상기 형광체에 가역적으로 결합된 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  16. 제15항에 있어서, 상기 앱타머에 대해 상기 핵산 서열은 상기 유해 물질과 경쟁적으로 결합하는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  17. 제1항에 있어서, 상기 형광체는 양자점 또는 양자점 비드를 포함하고,
    상기 양자점은 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 쉘을 포함하는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  18. 제17항에 있어서, 상기 양자점은 안정층, 리간드, 리간드층 중 1종 이상을 추가로 포함하는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  19. 제18항에 있어서, 상기 코어, 상기 쉘, 상기 안정층은 각각 12족-16족계 화합물, 13족-15족계 화합물, 14족-16족계 화합물 중 1종 이상을 포함하는 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  20. 제17항에 있어서, 상기 양자점은 CdSe 및 ZnS로 이루어진 것인, 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 앱타머를 이용한 유해 물질 검출용 바이오센서를 사용하는 단계를 포함하는, 유해 물질 검출 방법.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20210124566A (ko) * 2020-04-03 2021-10-15 삼성전자주식회사 앱타머를 이용한 프탈레이트계 물질 검출용 키트 및 이를 이용한 프탈레이트계 물질 검출 방법

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KR20210124566A (ko) * 2020-04-03 2021-10-15 삼성전자주식회사 앱타머를 이용한 프탈레이트계 물질 검출용 키트 및 이를 이용한 프탈레이트계 물질 검출 방법

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