KR20210082469A - 정량적 유세포 분석법 - Google Patents
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Abstract
본 발명에 개시되어 있는 것은, 이하의 단계을 포함하는, 시료 중의 세포 농도를 측정하는 방법이다:
(1) 유세포 분석기를 이용하여, 복수의 기지 농도의 표준 시료 중의 세포 농도를 측정하는 단계, (2) 단계 (1)에서 측정한 측정값과 기지 농도에 기초하여 검량선을 작성하는 단계, (3) 유세포 분석기를 이용하여, 미지 농도의 시료 중의 세포 농도를 측정하는 단계, 및 (4) 단계 (2)에서 작성한 검량선을 이용하여, 단계 (3)에서 측정한 측정값으로부터 세포 농도를 결정하는 단계.
(1) 유세포 분석기를 이용하여, 복수의 기지 농도의 표준 시료 중의 세포 농도를 측정하는 단계, (2) 단계 (1)에서 측정한 측정값과 기지 농도에 기초하여 검량선을 작성하는 단계, (3) 유세포 분석기를 이용하여, 미지 농도의 시료 중의 세포 농도를 측정하는 단계, 및 (4) 단계 (2)에서 작성한 검량선을 이용하여, 단계 (3)에서 측정한 측정값으로부터 세포 농도를 결정하는 단계.
Description
본 발명은, 유세포 분석기를 사용한, 시료 중의 세포 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
유세포 분석법(flow cytometry)은 수류(水流) 중의 입자에 여기광을 조사하여, 각각의 입자에서 발하는 형광을 측정하는 원리에 의해, 세포 집단 중의 각각의 세포의 크기, DNA 함량, 막 항원의 발현량의 분포 등을 측정하는 방법이다. 당해 유세포 분석법을 실시하기 위한 측정 장치를 유세포 분석기(flow cytometer)라 한다.
이와 같은 유세포 분석법을 이용하여, 세포의 절대 개수를 측정하는 방법이 특허문헌 1에 의해 보고되었다. 특허문헌 1에 기재된 방법은, 이하의 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
(a) 샘플 중에 존재하는 각 모집단 중의 세포를 세포 마커와 기지 수의 형광 미소립자로 표지하기 위해, 1개 또는 그 이상의 세포 마커를 포함하는 희석제를 포함하는 튜프에, 샘플을 첨가하는 단계;
(b) 형광 트리거를 설정하여, 모집단 중에 존재하는 카운트해야 하는 실질적으로 모든 미소립자와 세포를 산입하는 단계;
(c) 각 세포 마커와 미소립자를 식별하기 위해, 1개 또는 그 이상의 형광 게이트를 설정하는 단계;
(d) 형광 트리거에 충돌하거나 또는 해당 트리거를 넘어서는 단계 (c)의 세포 수를 카운트하는 단계; 및
(e) 단계 (d)에서의 각 형광 게이트에 대한 미소립자 1개 당 세포수를 계산하고, 그 각각에 미소립자의 농도를 곱하여 단위 부피당 세포수의 절대 개수를 얻는 단계.
기지 수의 형광 미소립자는, 내부 표준이 되는 비즈에 해당한다. 특허문헌 1의 방법에서는, 샘플 튜브에 기지 수의 비즈를 넣고, 표적 세포와 함께 유세포 분석기에 넣어 동시 측정한 후, 표적 세포 실측치를 비즈 실측치로 표준화함으로서, 샘플 간의 측정 오차를 경감시킨다 (정밀도 (precision)의 향상).
한편, 표적 세포가 샘플 처리 과정에서 손실되지 않았는지, 유세포 분석기로 빠짐없이 측정할 수 있는지에 대해서는 고려되어 있지 않다. 따라서, 특허문헌 1의 방법에서는, 상기와 같이 "세포의 절대 개수를 측정하는 방법"이라고 되어 있지만, 정확도 (accuracy)가 담보되어 있다고는 말할 수 없다.
상기와 같이, 특허문헌 1의 방법에서는, 정밀도의 관리는 할 수 있지만, 표적 세포의 회수율을 고려하지 않기 때문에 정확도는 평가할 수 없다. 정확도 평가에는 표적 세포의 회수율을 구할 필요가 있고, 회수율을 구하려면 검량선의 작성이 필요하지만, 특허문헌 1에는 표준 물질의 회수율, 검량선 및 정확도의 평가에 대해서는 아무것도 개시되어 있지 않다.
본 발명은, 정확도가 높은 세포수의 정량을 가능하게 하는, 유세포 분석기를 사용한, 시료 중의 세포 농도를 측정하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 유세포 분석기를 이용하여 측정한 표준 시료 중의 세포 농도와 기지 농도에 기초하여 검량선을 작성하고, 상기 검량선을 사용하고, 유세포 분석기를 이용하여 측정한 시료 중의 세포 농도 측정값으로부터 세포 농도를 결정함으로써, 정확도가 높은 세포 수의 정량이 가능해진다는 지견(知見)을 얻었다.
본 발명은, 이러한 지견을 토대로, 더욱 검토를 거듭하여 완성된 것이며, 다음의 시료 중의 세포 농도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
제1항. 이하의 단계를 포함하는, 시료 중의 세포 농도를 측정하는 방법 :
(1) 유세포 분석기(flow cytometer)를 이용하여, 복수의 기지 농도의 표준 시료 중의 세포 농도를 측정하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 측정한 측정값과 기지 농도에 기초하여 검량선을 작성하는 단계,
(3) 유세포 분석기를 이용하여, 미지 농도의 시료 중의 세포 농도를 측정하는 단계, 및
(4) 단계 (2)에서 작성한 검량선을 이용하여, 단계 (3)에서 측정한 측정값으로부터 세포 농도를 결정하는 단계.
제2항. 제1항에 있어서, 2종 이상의 기지 농도의 표준 시료를 사용하는, 방법.
제3항. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각 기지 농도에 대해 1개 이상의 표준 시료를 사용하는, 방법.
제4항. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)에서, 기지 농도에 대해 오차 ± 30% 이내에 있는 측정값을 검량선의 작성에 사용하는, 방법.
제5항. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)에서 측정한 측정값의 기지 농도에 대한 정확도가, 모두 ± 30% 이내인, 방법.
제6항. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료가 혈액인, 방법.
제7항. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 T세포인, 방법.
본 발명의 세포 농도의 측정 방법에 의하면, 유세포 분석기를 사용한 정확도가 높은 정량이 가능해진다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대하여 상세하게 설명한다.
또한, 본 명세서에 있어서 "포함한다(comprise)"란, "본질적으로 이루어진 (essentially consist of)"이라는 의미와, "만으로 이루어진 (consist of)"이라는 의미도 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 "정확도 (accuracy)"란, 값이 참값에 가까운 값임을 나타내는 정확성의 척도이다. 즉, 평균치가 참값에 가까운 것이 "정확도"가 높아진다.
본 명세서에서 사용하는 "정밀도 (precision)"란, 여러번 측정한 값 사이에서의 서로의 편차의 작음의 척도이다.
본 발명의 시료 중의 세포 농도를 측정하는 방법은, 이하의 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
(1) 유세포 분석기를 이용하여, 복수의 기지 농도의 표준 시료 중의 세포 농도를 측정하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 측정한 측정값과 기지 농도에 기초하여 검량선을 작성하는 단계,
(3) 유세포 분석기를 이용하여, 미지 농도의 시료 중의 세포 농도를 측정하는 단계, 및
(4) 단계 (2)에서 작성한 검량선을 이용하여, 단계 (3)에서 측정한 측정값으로부터 세포 농도를 결정하는 단계.
본 발명에 있어서, 세포 농도를 측정하는 시료로는, 유세포 분석기로 측정 가능한 시료이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 혈액, 종양, 뇌척수액, 간장, 폐, 비장, 흉선, 골수 등을 들 수 있다.
유세포 분석기로의 측정 전에, 시료는 적절히 각종 전처리를 할 수 있다. 예를 들어, 시료로서 혈액을 사용하는 경우는, 측정 전에 용혈 등의 전처리를 할 수 있다. 이러한 용혈 처리는 공지의 방법으로 할 수 있으며, 예를 들어, 적혈구를 용혈시키는 방법으로는, 계면 활성제를 첨가하는 것 등을 들 수 있다. 그 외 다른 전처리로는, 세포의 고정화를 들 수 있다. 이러한 세포의 고정화에 사용되는 세포 고정제로는, 예를 들어, 파라포름알데히드, 글루타르알데히드, 메탄올 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 농도를 측정하는 세포로는, 유세포 분석기에 의해 세포 수의 측정이 가능한 세포이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 신경 줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 치수(齒髓) 줄기세포, ES 세포, iPS (induced pluripotent stem) 세포, 조직 전구 세포, 혈액 세포 (적혈구, 백혈구 및 혈소판), 상피 세포, 내피 세포, 근육 세포, 섬유아 세포, 평활근 세포, 모세포, 간세포, 위 점막 세포, 장세포, 비장 세포, 췌장 세포, 뇌 세포, 폐 세포, 신장 세포, 지방 세포, 심근 세포, 골아 세포, 신경 세포, 혈관 내피 세포, 골세포, 파골 세포, 연골 세포, 연골 전구 세포, 각막 세포, 망막 세포, 수지상 세포, 초대 배양 세포, 계대 세포, 주화(株化) 세포 등을 들 수 있다. 상기 백혈구로는, 단핵구, 림프구 (T 세포, B 세포 및 NK 세포), 수지상 세포, 마크로파지, 호산구, 호중구, 호염기구 등을 들 수 있다. T 세포에는, 헬퍼 T 세포, 세포 독성 T 세포, 제어성 T 세포, 억제 T 세포, CAR-T 세포 (키메라 항원 수용체 T 세포) 등이 포함된다.
본 발명에서 사용하는 유세포 분석기는, 특별히 제한되지 않고, 각종 시판품 등을 사용할 수 있다. 이러한 시판품으로는, 예를 들어, BECKMAN COULTER 사 (예를 들어, Gallios, Navios, Navios EX, CytoFLEX, CytoFLEX S, CytoFLEX LX, Cytomics FC 500), BD 바이오사이언스 사 (예를 들어, BD FACSCantoTM II 유세포 분석기, BD FACSVerseTM 유세포 분석기, BD FACSLyricTM 유세포 분석기, BD LSRFortessaTM 유세포 분석기, BD LSRFortessaTM X-20 유세포 분석기), Thermo Fisher Scientific 사 (예를 들어, Attune 유세포 분석기), 소니 사 (예를 들어, SA3800, SP6800Z) 등의 제품을 들 수 있다. 유세포 분석기로의 세포 농도 측정은, 공지된 방법에 따라 실시할 수 있으며, 예를 들어, 유세포 분석기의 제조사의 메뉴얼에 따라 실시할 수 있다.
유세포 분석법으로는, 세포의 크기 (전방산란광:FSC), 세포의 밀도 (측방 산란광: SSC), 세포 표면 항원 (형광 표지 항체에 의한 형광) 등을 기준으로 목적하는 세포를 검출할 수 있다.
유세포 분석기로 측정할 때에, 목적하는 세포를 검출할 수 있는 형광 표지 항체를 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 그러한 형광 표지 항체로는, 예를 들어, 각종 CD 항원에 특이적으로 결합하는 형광 표지 항체를 들 수 있다. 형광 표지 항체는, 여러가지 물건이 시판되고 있으므로 시판품을 사용할 수도 있고, 항체의 조제 및 형광표지화를 실시하여 얻을 수도 있다. 항체를 형광 표지하기 위한 화합물로는, 공지의 형광 표지 화합물을 널리 사용할 수 있다.
유세포 분석법으로 측정할 때에, 내부 표준이 되는 형광성 비즈를 사용 할 수도 있다 (특허문헌 1 참조). 이러한 기지 수의 비즈를 샘플 튜브에 넣어두고, 표적 세포와 함께 유세포 분석기에 넣어 동시 측정함으로써, 비즈의 측정값으로 표적 세포의 측정값을 표준화하여, 즉, 샘플 튜브 중 비즈의 기지 수로 보정함으로써, 샘플 튜브 중에 존재할 수 있는 표적 세포수를 산출할 수 있게 된다.
· 단계 (1)
단계 (1)에서는, 검량선을 작성하기 위해, 유세포 분석기를 이용하여 복수의 기지 농도의 표준 시료 중의 세포 농도 측정을 실시한다.
단계 (1)에서 사용하는 표준 시료의 농도의 수는, 검량선을 작성하는 것이 가능한한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 2종 이상, 바람직하게는 3종 이상, 보다 바람직하게는 4종 이상, 더욱 바람직하게는 5종 이상, 특히 바람직하게는 6종 이상이며, 상한은 예를 들어, 30종이다.
표준 시료의 조제 방법으로는, 세포의 농도를 조정하는 것이 가능한 방법을 널리 사용할 수 있다. 예를 들어, 혈구계산판 (hemocytometer)을 이용하여 현미경을 통해 육안으로 카운트하는 방법을 들 수 있다. 1종의 표준 시료를 조제할 수 있다면, 다른 표준 시료는 단계적으로 희석함으로써 조제할 수 있다.
또한, 단계 (1)에서 사용하는, 각 기지 농도에 대한 표준 시료의 수는, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 이상, 더욱 바람직하게는 4개 이상, 특히 바람직하게는 5개 이상, 가장 바람직하게는 6개 이상이며, 상한은 예를 들어, 90개이다.
단계 (1)에서 측정한 측정값의 기지 농도에 대한 정확도는, 바람직하게는 모두 ± 30% 이내이며, 더욱 바람직하게는 모두 ± 25% 이내이며, 더욱 바람직하게는 모두 ± 20% 이내이며, 특히 바람직하게는 모두 ± 15% 이내이다. 여기에서 "정확도"의 값은, 측정값의 평균과 기지 농도와의 차이를 기지 농도에 대한 백분율로 나타낸 것이다 (상대 오차). 이러한 정확도를 갖는 측정값을 검량선 작성에 사용함으로써, 세포 농도의 보다 정확한 정량이 가능해진다.
또한, 단계 (1)에서 측정한 측정값의 기지 농도에 대한 정밀도는, 바람직하게는 모두 ± 30% 이내이며, 더욱 바람직하게는 모두 ± 25% 이내이며, 더욱 바람직하게는 모두 ± 20% 이내이며, 특히 바람직하게는 모두 ± 15% 이내이다. 여기에서 "정밀도"의 값은, 변동 계수 (CV: coefficient of variation)를 의미한다. 이러한 정밀도를 갖는 측정값을 검량선 작성에 사용함으로써, 세포 농도의 보다 정확한 정량이 가능해진다.
· 단계 (2)
단계 (2)에서는, 단계 (1)에서 측정한 측정값과 기지 농도에 기초하여 검량선을 작성한다.
검량선은, 최소제곱법 등의 통상의 방법에 따라 소프트웨어 등을 사용하여 작성할 수 있다. 작성된 검량선의 상관 계수는 1에 가까울수록 바람직하다.
이와 같이 검량선을 작성함으로써, 시료의 조제 과정에서 표적 세포의 회수율을 구할 수 있기 때문에, 결과적으로 정확도의 평가를 할 수 있게 된다.
단계 (2)에서, (특히 검량선의 기울기가 거의 1이 되는 경우는) 기지 농도에 대해 오차 ± 30% 이내 (바람직하게는 ± 25% 이내, 보다 바람직하게는 ± 20% 이내, 더욱 바람직하게는 ± 15% 이내)의 측정값을 검량선 작성에 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 오차 범위의 측정값을 검량선 작성에 사용함으로써, 세포 농도의 보다 정확한 정량이 가능해진다.
또한, 검량선의 기울기가 1이 되지 않는 경우 (예를 들어, 세포의 회수율이 100%가 되지 않는 경우 등)는, 검량선의 수식을 이용하여 측정값으로부터 세포수를 계산하고, 그 계산값이 기지 농도에 대해 어느 정도의 정확도인지를 검증하는 것이 바람직하다.
· 단계 (3)
단계 (3)에서는, 유세포 분석기를 이용하여 미지 농도의 시료 중의 세포 농도를 측정한다.
· 단계 (4)
단계 (4)에서는, 단계 (2)에서 작성한 검량선을 이용하여, 단계 (3)에서 측정한 측정값으로부터 세포 농도를 결정한다.
이와 같이 검량선을 이용하여 세포 농도를 결정함으로써, 유세포 분석기를 사용하여 정확도 높은 정량화가 가능하게 된다.
[실시예]
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위한 실시예를 든다. 그러나, 본 발명은 이러한 실시예 등에 한정되는 것은 아니다.
<방법>
50 μL의 C.B-17 SCID 마우스의 혈액을 검체로 하고, 여기에 10, 100, 1,000 및 10,000 세포의 인간 T 세포 (말초 혈액 T 세포, Cryo-T8: Human CD8+ Negatively Selected (5-8M cells), Precision Bioservices 사)를 각각 첨가한 샘플, 및 인간 T 세포 용해액 비첨가의 샘플을 조제하였다. 이러한 샘플을, 시판 튜브 (TruCOUNT Tubes, BD Biosciences 사)내에서, BD TritestTM CD3/CD8/CD45 reagent (BD Biosciences 사)와 혼합시켰다. 본 시약에는, fluorescein isothiocyanate (FITC) -labeled anti-CD3 antibody (clone SK7), phycoerythrin (PE)-labeled anti-CD8 antibody (clone SK1) 및 peridinin chlorophyll protein (PerCP)-labeled anti-CD45 antibody (clone 2D1)가 포함되어 있다.
15분간 실온에 정치한 후, BD FACSTM lysing solution (BD Biosciences 사)을 이용하여 혈액을 용혈시키고, 세포를 고정화했다. 또한 15분간 정치한 후, 유세포 분석법 정량을 실시했다. 유세포 분석법 측정은, BD FACSLyricTM flow cytometer (BD Biosciences 사)를 이용하여 실시하였다. 분석에는 FlowJo software (version 10, BD Biosciences)를 이용하여, 인간 CD45/CD3/CD8 양성 세포를 표적 세포로서 감지했다. 각 농도에서, n=3으로 샘플을 조제하여 측정하였다.
<결과>
검량선 작성 결과를 표 1에 나타낸다. 검량선의 직선성은 양호하고, 회수율은 대체로 100% 였다. 일내 및 일간 정확도 (accuracy, Relative error) 및 정밀도 (precision, Coefficient of variation)도 양호했다. 정량 하한은 30 cells/50 μL였다.
Claims (7)
- 이하의 단계를 포함하는, 시료 중 세포 농도를 측정하는 방법 :
(1) 유세포 분석기(flow cytometer)를 이용하여, 복수의 기지 농도의 표준 시료 중의 세포 농도를 측정하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 측정한 측정값과 기지 농도에 기초하여 검량선을 작성하는 단계,
(3) 유세포 분석기를 이용하여, 미지 농도의 시료 중의 세포 농도를 측정하는 단계, 및
(4) 단계 (2)에서 작성한 검량선을 이용하여, 단계 (3)에서 측정한 측정값으로부터 세포 농도를 결정하는 단계. - 제1항에 있어서, 2종 이상의 기지 농도의 표준 시료를 사용하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 각 기지 농도에 대해 1개 이상의 표준 시료를 사용하는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)에서, 기지 농도에 대해 오차 ± 30% 이내에 있는 측정값을 검량선의 작성에 사용하는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)에서 측정한 측정값의 기지 농도에 대한 정확도가, 모두 ± 30% 이내인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료가 혈액인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 T세포인, 방법.
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