KR20210061354A - 생물활성 화합물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 화학식 X에 제시된 구조식을 갖는 신규 푸란-함유 세스퀴테르펜에 관한 것이다:
[화학식 X]
그것은 멜리코프 라티폴리아(Melicope latifolia) 나무의 껍질로부터 비교적 높은 농도로 얻어질 수 있고, 항생제 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
[화학식 X]
그것은 멜리코프 라티폴리아(Melicope latifolia) 나무의 껍질로부터 비교적 높은 농도로 얻어질 수 있고, 항생제 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
Description
1. 발명의 분야
본 발명은 멜리코프 라티폴리아(Melicope latifolia) 나무의 껍질로부터 단리된 신규 생물활성 화합물, 화합물을 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
2. 배경기술
엠. 라티폴리아(M. latifoliai)(유오디아 라티폴리아(Euodia latifolia)로 이전에 공지됨)는 시트러스 패밀리 루타세아에(Rutaceae)에 속한다. 그것은 동남아시아 및 태평양의 다수의 국가에서 서식하며, 전통 의약에 사용된다. 바누아투의 로(Loh)섬에서, 엠. 라티폴리아는 도입된 정원 식물로 설명되며, "네힌(nehine)"으로 불린다. 기침 치료를 위해 냉침된 잎을 내부로 섭취한다(Bradacs, Maes et al. 2010; Bradacs, Heilmann et al. 2011).
말레이시아 반도에서, 엠. 라티폴리아는 저지대 숲에서 서식하는 비-토착성 작은 나무(non-endemic small tree)이며, 말레이어로 "오랑 아슬리(Orang Asli)"로 공지되어 있다. 그것은 멸종위기종으로 간주되며, 의약뿐만 아니라 레진 및 비누를 제조하기 위해 사용된다. 가루화된(pounded) 잎은 열을 내리고, 경련을 치료하기 위해 외부에 도포된다(Chooi 1994).
엠. 라티폴리아 물질의 일부 추출물은 약간의 생물활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 인도네시아 동부 자바의 칸가숲(Cangar Forest)으로부터 수집된 엠. 라티폴리아의 건조 분말 잎의 에탄올 추출물은 유입 단계(entry step) 및 유입 후 단계(post-entry step) 둘 모두에서 3.5 ± 1.4 μg/mL의 IC50 값 및 100 μg/mL 초과의 CC50값으로, C형 간염 바이러스에 의한 인간 간세포(Huh7.5) 세포의 감염을 저해한다. 그러나, 엠. 라티폴리아 줄기의 추출물은 10배 넘게 덜 효과적이었다(Wahyuni, Tumewu et al. 2013).
바누아투의 로로부터의 이. 라티폴리아(E. latifolia)의 잎의 추출물은 하기 활성을 가졌다(Bradacs, Maes et al. 2010):
● 디클로로메탄 추출물은 배양물 중의 인간 폐 암종 세포주 A548에 대해 14.2 ± 0.89 μg/mL의 IC50 값을 가짐.
● 디클로로메탄 및 에틸 아세테이트 추출물은 적혈구 중의 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)에 대해 각각 8.30 ± 1.43 및 14.94 ± 2.72 μg/mL의 IC50 값을 가졌지만, 인간 폐 섬유아세포(MRC-5SV2)에 대해 유사한 활성을 갖고, 따라서 1의 선택성 지수를 가졌음.
● 디클로로메탄 및 에틸 아세테이트 추출물은 트리파노소마 크루질(Trypanosoma cruzii)에 대해 각각 6.55 ± 0.79 및 7.64 ± 0.26 μg/mL의 IC50 값을 가졌지만, 인간 폐 섬유아세포(MRC-5SV2)에 대해 유사한 활성을 갖고, 따라서 1의 선택성 지수를 가졌음.
● 디클로로메탄 추출물은 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)에 대해 8.28 ± 0.62 μg/mL의 IC50 값을 가졌지만, 인간 폐 섬유아세포(MRC-5SV2)에 대해 유사한 활성을 갖고, 따라서 1의 선택성 지수를 가졌음.
엠. 라티폴리아의 추출물에 대해서는 연구가 거의 수행되지 않았지만, 이의 천연물의 화학적 성질에 대해서는 공지된 것이 훨씬 더 적다. 엠. 라티폴리아로부터의 화학 성분에 관한 유일하게 실질적인 연구로 여겨지는 것에서, 겐팅 하이랜드(Genting Highlands)(서부 말레이시아 파항 소재(쿠알라 룸푸르에서 북쪽으로 50 km 떨어져 있음))로부터의 엠. 라티폴리아(당시에는 유오디아 라티폴리아로 알려짐)의 건조 잎의 에탄올 추출물의 크로마토그래피 분리는 2개의 새로운 이성질체 화합물인 멜리폴리온(melifolione) 1a 및 1b를 0.006% 수율로 제공하였으며, 이것은 분별 결정화에 의해 분리되었다(Goh, Chung et al. 1990).
단리된 다른 화합물은 쿠마린 유도체인 5,7,8- 및 6,7,8-트리메톡시쿠마린, 및 버갑텐(bergapten)(2)이었다. 버갑텐(2)은 광독성을 유발하는 베르가모트 오일 중의 화학물질이다. 이것은 이러한 푸라노쿠마린의 수준이 국소 제형으로 제한되어야 한다는 것을 제안한다. 또한, 스테롤인 시토스테롤, 스티그마스테롤 및 캄페스트롤이 67:17:21 비율로 존재한다는 것을 발견하였다.
석사 논문(Hashim 2010)의 초록에는, 말레이시아 사바에서 수집된 엠. 라티폴리아의 잎으로부터의 2종의 알칼로이드인 딕탐닌(dictamnine)(3) 및 콘푸사멜린(confusameline)(4)의 단리가 보고되어 있다.
딕탐닌(3)은 루타세아에에서 널리 발생하며, 광-유도 유전독성 및 피부 자극에 관여한다. 그것은 항-혈소판 응집 및 혈관-이완활성(Wu et al., 1994), 살곤충 활성, 박테리아 및 효모에 대한 광독성 및 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 대한 항박테리아 활성을 갖는 것으로 보고되어 있다. 딕탐닌(3)은 또한 특정 피부 질병을 치료하는데 널리 사용되어 왔다(Guo, Yu et al. 2008).
콘푸사멜린(4)은 기준 화합물인 미트라마이신(ED50 값 = 0.06 μg/mL)보다 P-388 세포주에 대해 더 강력한 세포 독성(ED50 값 = 0.03 μg/mL)을 갖는 다수의 푸라노쿠마린 중에서 가장 세포독성이 높은 단리물인 것으로 밝혀졌다(Chen, Duh et al. 2003).
2개의 벤조피란 화합물인 "O-메틸옥타드레놀론" 및 알로에보디오놀(alloevodionol)(6)은 인도네시아산 엠. 라티폴리아의 열매로부터 단리된 것으로 보고되었다(Primastuti 2017). 그러나 "O-메틸옥타드레놀론"과 같은 화합물은 존재하지 않는 것으로 보이며, 가장 가까운 화합물은 뉴질랜드 엠. 터나타(M. ternata)로부터 최초로 단리된 화합물인 옥타덴드롤론 메틸 에테르(5)이다(Cambie, Pan et al. 1996).
공중 보건 당국자들이 항생제 내성과 관련된 점점 심각해지는 문제를 인식함에 따라, 연구자들은 이전에 탐색되지 않은 동식물로 점점 관심을 돌려 새로운 항생제 화합물을 찾거나, 적어도 대중에게 유용한 선택을 제공한다.
상대적으로 엠. 라티폴리아의 2차 대사산물은 연구되지 않았다. 따라서 본 발명의 목적은 항생제 화합물을 포함하는 유용한 생물활성 화합물을 제공할 잠재력에 대해 이러한 식물을 평가하는 것이다.
특허 명세서, 기타 외부 문서 또는 기타 정보 공급원을 참고하는 본 명세서에서, 이는 일반적으로 본 발명의 특징을 논의하기 위한 내용을 제공하려는 목적을 위한 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 이러한 외부 문서에 대한 언급은 모든 관할권에서 그러한 문서 또는 그러한 정보 공급원이 선행 기술이거나 당업계의 통상적 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
3. 발명의 내용
본 발명은 본 발명자가 발라에논(Balaenone)으로 명명한, 엠. 라티폴리아 나무의 껍질로부터의 신규 생물활성 화합물의 단리 및 식별에 관한 것이다.
일 양태에서 본 발명은 하기 화학식 X의 단리된 생물활성 화합물에 관한 것이다:
[화학식 X]
이 화합물을 본 명세서에서 "발라에네온"으로 지칭한다.
일 양태에서 본 발명은 하기 화학식 Xa의 단리된 생물활성 화합물에 관한 것이다:
[화학식 Xa]
이 화합물을 본 명세서에서 "1,10-트랜스-발라에논" 또는 "트랜스-발라에논"으로 지칭한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 하기 화학식 Xb의 구조 및 상대 입체화학을 갖는 단리된 생물활성 화합물에 관한 것이다:
[화학식 Xb]
이 화합물을 본 명세서에서 "1,10-시스-발라에논" 또는 "시스-발라에논"으로 지칭한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 도 1 내지 도 6 중 어느 하나의 NMR 스펙트럼을 갖는 생물활성 화합물에 관한 것이다. 또 다른 양태에서 본 발명은 도 11 내지 도 16 중 어느 하나의 NMR 스펙트럼을 갖는 생물활성 화합물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서 본 발명은 발라에논의 정제된 조성물을 얻는 공정을 제공하며, 여기서 이 공정은 하기 단계를 포함한다:
(a) 엠. 라티폴리아의 껍질을 메탄올로 추출하는 단계;
(b) 여과된 추출물을 메탄올 중에서 사전-평형화된(pre-equilibrated) PSDVB 컬럼을 통해 통과시키는 단계;
(c) 용리액을 동일한 부피의 물과 합하고, 그것을 동일한 PSDVB 컬럼을 통해 통과시키는 단계;
(d) 컬럼을 물로 세척하는 단계;
(e) 흡착된 추출물의 화합물을 i) 물 중의 20% 아세톤(분획 A), ii) 물 중의 40% 아세톤(분획 B), iii) 물 중의 60% 아세톤(분획 C), iv) 물 중의 80% 아세톤(분획 D) 및 v) 아세톤(분획 E)으로 용리하는 단계;
(f) 분획 C 및/또는 D를 수집하여 발라에논의 정제된 조성물을 제공하는 단계; 및
(g) 선택적으로, 분획 C 및/또는 D를 실리카겔 플래시 크로마토그래피에 의해 더 정제하여 발라에논의 보다 정제된 조성물을 얻는 단계.
일 구현예에서, 단계 (a)를 반복하여 제2 메탄올성 추출물을 제공한다.
일 구현예에서, 단계 (c)를 반복한다.
일 구현예에서, 분획 C 및/또는 D를 석유 에테르 구배(0 내지 100%)의 에틸 아세테이트를 사용하여 단계 (g)에서 더 정제한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 공정에 의해 얻은 발라에논의 정제된 조성물을 제공한다:
(a) 엠. 라티폴리아의 껍질을 메탄올로 추출하는 단계;
(b) 여과된 추출물을 메탄올 중에서 사전-평형화된 PSDVB 컬럼을 통해 통과시키는 단계;
(c) 용리액을 동일한 부피의 물과 합하고, 그것을 동일한 PSDVB 컬럼을 통해 통과시키는 단계;
(d) 컬럼을 물로 세척하는 단계;
(e) 흡착된 추출물의 화합물을 i) 물 중의 20% 아세톤(분획 A), ii) 물 중의 40% 아세톤(분획 B), iii) 물 중의 60% 아세톤(분획 C), iv) 물 중의 80% 아세톤(분획 D) 및 v) 아세톤(분획 E)으로 용리하는 단계;
(f) 분획 C 및/또는 D를 수집하여 발라에논의 정제된 조성물을 제공하는 단계; 및
(g) 선택적으로, 분획 C 및/또는 D를 실리카겔 플래시 크로마토그래피에 의해 더 정제하여 발라에논의 보다 정제된 조성물을 얻는 단계.
일 구현예에서, 단계 (a)를 반복하여 제2 메탄올성 추출물을 제공한다.
일 구현예에서, 단계 (c)를 반복한다.
일 구현예에서, 분획 C 및/또는 D를 석유 에테르 구배(0 내지 100%)의 에틸 아세테이트를 사용하여 단계 (g)에서 더 정제한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 발라에논의 정제된 조성물을 제공한다. 또 다른 양태에서 본 발명은 트랜스-발라에논의 정제된 조성물을 제공한다. 또 다른 양태에서 본 발명은 시스-발라에논의 정제된 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 발라에논을 포함한다. 일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 트랜스-발라에논을 포함한다. 일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 시스-발라에논을 포함한다.
일 양태에서 본 발명은 발라에논 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서 본 발명은 트랜스-발라에논 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서 본 발명은 시스-발라에논 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 구현예에서 약제학적 조성물은 항-박테리아 조성물이다.
또 다른 양태에서 본 발명은 박테리아 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 박테리아 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체에게 치료 유효량의 발라에논 또는 발라에논의 정제된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 박테리아 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 박테리아 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체에게 치료 유효량의 트랜스-발라에논 또는 트랜스-발라에논의 정제된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 박테리아 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 박테리아 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체에게 치료 유효량의 시스-발라에논 또는 시스-발라에논의 정제된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서 감염은 그램-양성 박테리아 감염이다.
본 명세서에 제시된 구현예 및 선호도는 본 명세서에 제시된 본 발명의 임의의 양태와 단독으로 또는 임의의 둘 이상의 조합으로 관련될 수 있다.
본 발명은 상기에 광범위하게 정의된 바와 같지만, 당업자는 본 발명이 이에 제한되지 않으며, 또한 하기 설명이 예를 제공하는 구현예가 본 발명에 포함된다는 것을 이해할 것이다.
4. 도면의 간단한 설명
본 발명은 이제 첨부 도면을 참고로 설명될 것이다:
도 1은 CDCl3에서 트랜스-발라에논의 1H NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 2는 CDCl3에서 트랜스-발라에논의 13C NMR(125 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 3은 CDCl3에서 트랜스-발라에논의 COSY(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 4는 CDCl3에서 트랜스-발라에논의 HSQC(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 5는 CDCl3에서 트랜스-발라에논의 HMBC(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 6은 CDCl3에서 트랜스-발라에논의 NOESY(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 7은 샘플 1 = 메탄올 추출물, 2 = 60% 아세톤/물 분획, 3 = 80% 아세톤/물 분획, 4 = 100% 아세톤 분획의 성분의 분리 및 가시화를 나타내는 실리카겔 TLC 플레이트를 도시한다. 연분홍색/적색 스팟이 발라에논의 특징이다.
도 8은 기준 플레이트(우측 부분)와 비교한 에스. 아우레우스(S. aureus)(좌측 부분)에 대한 항박테리아 검정의 결과를 도시한다. 샘플 1 = 메탄올 추출물, 2 = 60% 아세톤/물 분획, 3 = 80% 아세톤/물 분획, 4 = 100% 아세톤 분획. 기준 플레이트의 연분홍색/적색 스팟이 발라에논의 특징이다.
도 9는 기준 플레이트(우측 부분)와 비교한 에스. 에피더미디스(S. epidermidis)(좌측 부분)에 대한 항박테리아 검정의 결과를 도시한다. 샘플 1 = 메탄올 추출물, 2 = 60% 아세톤/물 분획, 3 = 80% 아세톤/물 분획, 4 = 100% 아세톤 분획. 기준 플레이트의 연분홍색/적색 스팟이 발라에논의 특징이다.
도 10은 고리화첨가(cycloaddition) 생성물(9)의 ORTEP 다이어그램이다.
도 11은 CDCl3에서 시스-발라에논의 1H NMR(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 12는 CDCl3에서 시스-발라에논의 13C NMR(125 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 13은 CDCl3에서 시스-발라에논의 COSY(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 14는 CDCl3에서 시스-발라에논의 HSQC(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 15는 CDCl3에서 시스-발라에논의 HMBC(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 16은 CDCl3에서 시스-발라에논의 NOESY(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
본 발명은 이제 첨부 도면을 참고로 설명될 것이다:
도 1은 CDCl3에서 트랜스-발라에논의 1H NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 2는 CDCl3에서 트랜스-발라에논의 13C NMR(125 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 3은 CDCl3에서 트랜스-발라에논의 COSY(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 4는 CDCl3에서 트랜스-발라에논의 HSQC(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 5는 CDCl3에서 트랜스-발라에논의 HMBC(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 6은 CDCl3에서 트랜스-발라에논의 NOESY(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 7은 샘플 1 = 메탄올 추출물, 2 = 60% 아세톤/물 분획, 3 = 80% 아세톤/물 분획, 4 = 100% 아세톤 분획의 성분의 분리 및 가시화를 나타내는 실리카겔 TLC 플레이트를 도시한다. 연분홍색/적색 스팟이 발라에논의 특징이다.
도 8은 기준 플레이트(우측 부분)와 비교한 에스. 아우레우스(S. aureus)(좌측 부분)에 대한 항박테리아 검정의 결과를 도시한다. 샘플 1 = 메탄올 추출물, 2 = 60% 아세톤/물 분획, 3 = 80% 아세톤/물 분획, 4 = 100% 아세톤 분획. 기준 플레이트의 연분홍색/적색 스팟이 발라에논의 특징이다.
도 9는 기준 플레이트(우측 부분)와 비교한 에스. 에피더미디스(S. epidermidis)(좌측 부분)에 대한 항박테리아 검정의 결과를 도시한다. 샘플 1 = 메탄올 추출물, 2 = 60% 아세톤/물 분획, 3 = 80% 아세톤/물 분획, 4 = 100% 아세톤 분획. 기준 플레이트의 연분홍색/적색 스팟이 발라에논의 특징이다.
도 10은 고리화첨가(cycloaddition) 생성물(9)의 ORTEP 다이어그램이다.
도 11은 CDCl3에서 시스-발라에논의 1H NMR(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 12는 CDCl3에서 시스-발라에논의 13C NMR(125 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 13은 CDCl3에서 시스-발라에논의 COSY(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 14는 CDCl3에서 시스-발라에논의 HSQC(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 15는 CDCl3에서 시스-발라에논의 HMBC(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
도 16은 CDCl3에서 시스-발라에논의 NOESY(500 MHz) 스펙트럼을 도시한다.
5. 발명의 자세한 설명
5.1
정의
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는(comprising)"은 "적어도 일부로 이루어진(consisting at least in part of)"을 의미한다. 용어 "포함하는"을 포함하는 본 명세서 및 청구범위에서 각각의 진술을 해석하는 경우, 그 용어에 이어지는 것 또는 그 용어에 이어지는 것들 이외의 다른 특징부가 또한 존재할 수 있다. "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"와 같은 관련 용어는 동일한 방식으로 해석되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"은 명시된 물질 또는 단계, 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "이루어진(consisting of)"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외하고 청구된 발명의 명시된 재료 또는 단계를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "및" 또는 "또는" 또는 둘 모두를 의미한다.
참조된 수치 표시와 관련하여 사용되는 경우 용어 "약"은, 참조된 수치 표시에, 그러한 참조된 수치 표시의 최대 10%를 더하거나 빼는 것을 의미한다. 예를 들어, "약 100"은 90 내지 110를 의미하고 "약 6"은 5.4 내지 6.6을 의미한다.
본 명세서에 개시된 수치의 범위(예를 들어, 1 내지 10)에 대한 언급은 또한 그 범위 내의 모든 유리수(예를 들어, 1, 1.1, 2, 3, 3.9, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9 및 10), 및 그 범위 내의 임의의 범위의 유리수(예를 들어, 2 내지 8, 1.5 내지 5.5 및 3.1 내지 4.7)에 대한 언급도 포함하는 것으로 의도되며, 그에 따라 본 명세서에 명시적으로 개시된 모든 범위의 모든 하위 범위가 본 명세서에 명확하게 개시된다. 이들은 구체적으로 의도된 것의 예일 뿐이며, 열거된 최저 값과 최고 값 사이의 가능한 모든 수치 조합이 본 출원에서 유사한 방식으로 명시적으로 언급된 것으로 간주된다.
비대칭 중심이 본 명세서에 기재된 화합물에 존재할 수 있다. 비대칭 중심은 키랄 탄소 원자의 3차원 공간에서 치환체의 배열에 따라 (R) 또는 (S)로 지정될 수 있다. 특정 입체화학 또는 이성질체 형태가 제시되지 않는 한, 구조의 모든 키랄, 부분입체이성질체 및 라세미 형태의 구조가 의도된다. 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 에피머 형태뿐만 아니라 d-이성질체 및 l-이성질체를 포함하는, 화합물의 모든 입체화학 이성질체 형태, 및 입체화학 이성질체의 거울상이성질체 풍부 및 부분입체이성질체 풍부 혼합물을 포함하는 이들의 혼합물은 달리 제시되지 않는 한 본 발명의 범주 내에 있다.
본 명세서에 기재된 화합물은 또한 시스, 트랜스, 신(syn), 안티(anti), 엔트게겐(entgegen)(E) 및 추잠멘(zusammen)(Z) 이성질체를 포함하는 입체형태 또는 기하이성질체로서 존재할 수 있다. 이러한 모든 이성질체 및 이들의 임의의 혼합물은 달리 명시되지 않는 한 본 발명의 범주 내에 있다.
또한 본 발명의 범주 내에는 기재된 화합물의 임의의 호변이성질체 또는 이들의 혼합물이 존재한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 다양한 작용기 및 기타 구조는 호변이성(tautomerism)을 나타낼 수 있다. 예는 케토/엔올, 이민/엔아민 및 티오케톤/엔티올 호변이성을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
개시된 화합물의 입체화학이 명명되거나 도시된 경우, 명명되거나 도시된 입체이성질체는 다른 모든 입체이성질체에 비해 중량 기준으로 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.9%의 순도일 수 있다. 단일 거울상이성질체가 명명되거나 도시된 경우, 명명되거나 도시된 거울상이성질체는 다른 거울상 이성질체에 비해 중량 기준으로 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.9% 순수하다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 치료 효과를 유발하기에 적절한 방법에 의해 본 발명의 조성물 또는 화합물을 대상체 내로 또는 대상체 상으로 배치하는 것을 지칭한다. 투여형은 치료 목적 및 대상체에 따라 적절하게 선택되고 사용된다. 본 발명의 조성물의 용량은 치료 목적, 및 종, 연령, 성별, 일반적인 건강 및 질병 진행을 포함하는 대상체의 특징에 따라 선택될 수 있다. 일반적으로, 인간 대상체의 경우, 본 발명의 화합물은 체중 kg 당 1일 당 0.01 내지 100 mg, 바람직하게는 0.1 내지 50 mg의 용량으로 1회 또는 몇몇 투여에 걸쳐 나누어 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "치료 유효량"은 임상 결과를 포함하여 유익하거나 목적하는 결과를 가져오기에 충분한 양이다. 치료 유효량은 다양한 투여 경로에 의해 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 대상체에게 투여될 화합물의 치료 유효량은, 예를 들어, 화합물이 투여되는 목적, 투여 방식, 임의의 공동-투여된 화합물의 본성 및 투여량, 및 대상체의 특징, 예컨대, 일반적인 건강, 다른 질병, 연령, 성별, 유전자형, 체중 및 약물에 대한 내약성에 좌우된다. 당업자는 이러한 임의의 다른 관련 인자를 고려하여 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
"대상체"는 인간 또는 비-인간 동물, 바람직하게는 포유동물인 척추동물을 지칭한다. 비-인간 포유동물은 가축, 예컨대, 소, 양, 돼지, 사슴 및 염소; 스포츠 및 반려 동물, 예컨대, 개, 고양이 및 말; 및 연구 동물, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
5.2
발라에논
본 발명자들은 엠. 라티폴리아 나무의 껍질의 추출물로부터 신규 생물활성 화합물을 단리하였다. 나무의 종은 그를 Applelhans에 의해 수행된 멜리코프(Melicope) 종의 계통수 분석 시 엠. 라티폴리아의 시편 중 하나로 간주하는 DNA 지문 분석에 의해 식별되었다(Appelhans, Wen et al. 2014).
본 발명의 신규 화합물은 하기 화학식 X에 제시된 구조를 갖는 푸란-함유 세스퀴테르펜이다. 그것은 멜리코프 라티폴리아 나무의 껍질에 비교적 높은 농도로 존재한다. 그것은 당업계의 표준 기술을 사용하여 정제될 수 있는 미정제 추출물을 제공하기 위해 껍질의 메탄올 추출에 의해 얻어질 수 있다.
[화학식 X]
발라에논은 2개의 입체 중심(stereogenic centre)을 가지고 있어, 4개의 입체이성질체가 가능하다(RR, RS, SR 및 SS). 본 발명의 방법에 따른 발라에논의 추출은 대략 60:1 비율의 트랜스- 및 시스-발라에논을 제공한다. 각각의 부분입체이성질체는 거울상이성질체적으로 순수하다(99% 초과).
트랜스-발라에논의 절대 배열은 실시예 4에 기재된 바와 같이 설명되었다. 하기 넘버링 시스템에 기초하여, 1,10-트랜스-발라에논은 (+)-(1R,10S)-발라에논이다. 이의 IUPAC 명칭은 (6S,6aR)-1,6,9-트리메틸-5,6,6a,7-테트라히드로아줄레노[5,4-b]푸란-8(4H)-온이다.
1,10-시스-발라에논의 절대 배열은 결정되지 않았지만, 이의 상대 배열은 (+)-(1R*,10R*)-발라에논이다. 이의 IUPAC 명칭은 (6R*,6aR*)-1,6,9-트리메틸-5,6,6a,7-테트라히드로아줄레노[5,4-b]푸란-8(4H)-온이다.
부분입체이성질체는 실시예 3에 기재된 바와 같이, 플래시 크로마토그래피에 의해 서로 분리될 수 있다.
발라에논은 이전에 보고되지 않았고, 새로운 부류의 화합물을 나타내는 것으로 보인다. 구조에서, 발라에논은 하기에 제시된 바와 같은 멜리코필론(melicophyllone) A, B 및 C와 가장 많이 유사하다.
이들 화합물은 1988년 및 1989년에 멜리코프 트리필라(Melicope triphylla)의 뿌리 및 줄기 껍질 추출물의 성분으로 보고되었다(Wu, Jong et al. 1988, Jong and Wu 1989). 발라에논은 푸란을 (히드록시)부테놀리드로 산화시키는 방식에 의해 멜리코필론 A 내지 C (7a 내지 c)에 대한 전구체일 수 있으며, 멜리코필론 C(7c)는 특히 C-8의 추가 산화에 의해 달라진다. 멜리코필론의 상대 입체화학은 확립되었지만, 절대 입체화학은 확립되지 않았다. 본 명세서에 기재된 트랜스-발라에논의 절대 입체화학의 설명에 기초하면, 멜리코필론을 도시하기 위해 Wu 및 Jong(및 상기에 제시됨)이 선택한 입체화학은 잘못된 것으로 보인다.
발라에논은 항생제 특성을 갖고, 따라서 박테리아 감염, 특히 그램-양성 박테리아에 의한 감염의 치료에 유용할 수 있다.
따라서, 일 양태에서 본 발명은 생리활성 발라에논을 제공한다. 또 다른 양태에서 본 발명은 도 1 내지 도 6 중 어느 하나의 NMR 스펙트럼을 갖는 생물활성 화합물을 제공한다. 또 다른 양태에서 본 발명은 도 11 내지 도 16 중 어느 하나의 NMR 스펙트럼을 갖는 생물활성 화합물을 제공한다.
일 양태에서 본 발명은 (+)-(6S,6aR)-1,6,9-트리메틸-5,6,6a,7-테트라히드로아줄레노[5,4-b]푸란-8(4H)-온을 제공한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 강한 양성 회전을 갖는 ((6R*,6aS*)-1,6,9-트리메틸-5,6,6a,7-테트라히드로아줄레노[5,4-b]푸란-8(4H)-온)의 거울상이성질체 형태를 제공한다.
5.3
발라에논을 얻는 공정 및 발라에논의 정제된 조성물
용매 추출, 역상 크로마토그래피, 정상 실리카겔 크로마토그래피 등을 포함하는 천연물 화학의 표준 기술을 사용하여 발라에논을 그의 원료로부터 단리하고 정제하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있다.
바람직하게는, 발라에논 및 발라에논의 정제된 조성물은 엠. 라티폴리아 나무의 껍질의 메탄올 추출물로부터 얻어진다. 2가지 유용한 접근법은 (a) 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 공중합체(PSDVB) 및 (b) 액체-액체 분배를 사용하는 역상 크로마토그래피를 사용하고, 그 다음 선택적으로 하기에 기재된 바와 같이, 정상 크로마토그래피를 사용하는 것이다. 그러나, 당업자는 효과적인 기술의 임의의 조합을 사용할 수 있다.
PSDVB를 사용한 역상 크로마토그래피
이 추출 방법에서, 엠. 라티폴리아의 줄기의 껍질을 18 내지 24시간 동안 메탄올(2×)로 추출한다. 두 추출물 모두를 여과하고, 메탄올 중에서 사전-평형화된 PSDVB(제2 추출물, 그 다음 제1 추출물)의 층을 통해 통과시킨다. 이 공정으로부터의 용리액을 합하고, 동일한 부피의 물(물 중의 50% 메탄올)로 희석하고, 동일한 PSDVB 컬럼을 통해 통과시킨다. 이러한 공정을 또 다른 당량의 물(물 중의 25% 메탄올까지)로 반복하고, 동일한 PSDVB 컬럼을 통해 통과시킨다. 이제 흡착된 추출물을 포함하는 컬럼을 물(컬럼 부피의 3×)로 세척하고, 그 다음 수 분량의 i) 물 중의 20% 아세톤(분획 A), ii) 물 중의 40% 아세톤(분획 B), iii) 물 중의 60% 아세톤(분획 C), iv) 물 중의 80% 아세톤(분획 D) 및 v) 아세톤(분획 E)으로 세척한다.
분획 C 및 D는 다량의 발라에논을 함유해야 하며, 전자는 대부분의 물질을 함유한다.
순수한 발라에논은 실리카겔 플래시 크로마토그래피에 의해 분획 C(물 중의 60% 아세톤)로부터 얻을 수 있다. 바람직한 용매 시스템은 석유 에테르 구배(0 내지 100%)의 에틸 아세테이트이며, 여기서 발라에논은 석유 에테르 중의 20 내지 25% 에틸 아세테이트로부터 용리된다.
발라에논의 부분입체이성질체는 3:1 석유 에테르/디에틸 에테르 또는 동등한 용매 시스템을 사용하는 실리카겔 플래시 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 당업자는 다른 용매 시스템이 발라에논 및 이의 부분입체이성질체를 정제하는 데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
액체-액체 분배
엠. 라티폴리아의 줄기의 껍질을 18 내지 24시간 동안 메탄올(2×)로 추출한다. 두 추출물 모두를 합하고, 진공에서 농축 건조하고, 수-불혼화성 유기 용매(예를 들어, 디클로로메탄)에서 재구성하고, 물로 분배한다. 유기층을 무수 황산 마그네슘을 사용하여 건조하고, 진공에서 농축 건조한다. 농축된 유기층을 석유 에테르 구배(0 내지 100%)의 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카겔에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 여기서 발라에논은 석유 에테르 중의 20 내지 25% 에틸 아세테이트로부터 용리된다.
발라에논은 메탄올 중의 5%v/v 황산 + 에탄올 중의 0.1% w/v 바닐린과 접촉하고 가열되는 경우, 연분홍색/적색 스팟으로 시각화되기 때문에 박층 크로마토그래피(TLC)를 사용하여 정제 공정 중에 쉽게 추적된다. 실리카겔 TLC 플레이트의 샘플을 석유 에테르 중의 10% 에틸 아세테이트에서 전개시키는 경우 Rf는 0.25이다.
그러나 대안적인 시각화 시스템을 사용할 수 있다. 표 1은 다양한 TLC 용매 시스템에서 트랜스- 및 시스-발라에논의 Rf 값을 제시한다.
[표 1]
바람직한 추출 및 단리 방법을 하기 실시예 섹션에 기재한다.
일 양태에서 본 발명은 발라에논 또는 발라에논의 정제된 조성물을 얻는 공정을 제공하며, 여기서 이 공정은 하기 단계를 포함한다:
(a) 엠. 라티폴리아의 껍질을 메탄올로 추출하는 단계;
(b) 여과된 메탄올 추출물을 메탄올 중에서 사전-평형화된 PSDVB 컬럼을 통해 통과시키는 단계;
(c) 용리액을 동일한 부피의 물과 합하고, 그것을 동일한 PSDVB 컬럼을 통해 통과시키는 단계;
(d) 컬럼을 물로 세척하는 단계;
(e) 흡착된 추출물의 화합물을 i) 물 중의 20% 아세톤(분획 A), ii) 물 중의 40% 아세톤(분획 B), iii) 물 중의 60% 아세톤(분획 C), iv) 물 중의 80% 아세톤(분획 D) 및 v) 아세톤(분획 E)으로 용리하는 단계;
(f) 분획 C 및/또는 D를 수집하여 발라에논의 정제된 조성물을 제공하는 단계; 및
(g) 선택적으로, 분획 C 및/또는 D를 실리카겔 플래시 크로마토그래피에 의해 더 정제하여 발라에논의 보다 정제된 조성물을 얻는 단계.
일 구현예에서, 단계 (a)를 반복하여 제2 메탄올성 추출물을 제공한다.
일 구현예에서, 단계 (c)를 반복한다.
일 구현예에서, 분획 C 및/또는 D를 석유 에테르 구배(0 내지 100%)의 에틸 아세테이트를 사용하여 단계 (g)에서 더 정제한다.
일 양태에서 본 발명은 트랜스-발라에논 및/또는 시스-발라에논 또는 이의 정제된 조성물을 얻는 공정을 제공하며, 이 공정은 하기 단계를 포함한다:
(a) 엠. 라티폴리아의 껍질을 메탄올로 추출하는 단계;
(b) 여과된 메탄올 추출물을 메탄올 중에서 사전-평형화된 PSDVB 컬럼을 통해 통과시키는 단계;
(c) 용리액을 동일한 부피의 물과 합하고, 그것을 동일한 PSDVB 컬럼을 통해 통과시키는 단계;
(d) 컬럼을 물로 세척하는 단계;
(e) 흡착된 추출물의 화합물을 i) 물 중의 20% 아세톤(분획 A), ii) 물 중의 40% 아세톤(분획 B), iii) 물 중의 60% 아세톤(분획 C), iv) 물 중의 80% 아세톤(분획 D) 및 v) 아세톤(분획 E)으로 용리하는 단계;
(f) 분획 C 및/또는 D를 수집하여 발라에논의 정제된 조성물을 제공하는 단계;
(g) 선택적으로, 분획 C 및/또는 D를 석유 에테르 구배(0 내지 100%)의 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카겔 플래시 크로마토그래피에 의해 더 정제하여 발라에논을 얻는 단계, 및
(h) 트랜스-발라에논 및 시스-발라에논을 얻기 위해, 트랜스- 및 시스-발라에논을 3:1 석유 에테르/디에틸 에테르의 등용매 혼합물을 사용하여 실리카겔 플래시 크로마토그래피에서 분리하는 단계.
일 양태에서 본 발명은 상기 양태의 공정에 의해 얻은 생성물을 제공한다.
일 구현예에서 생성물은 발라에논 또는 발라에논의 정제된 조성물이다. 일 구현예에서 생성물은 트랜스-발라에논 또는 트랜스-발라에논의 정제된 조성물이다. 일 구현예에서 생성물은 시스-발라에논 또는 시스-발라에논의 정제된 조성물이다.
5.4
발라에논의 정제된 조성물
일 양태에서 본 발명은 발라에논의 정제된 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 상기에 정의된 공정에 의해 얻은 정제된 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 발라에논의 조성물에 대한 언급에서 용어 "정제된"은 그 조성물이 적어도 50% wt% 초과의 발라에논을 포함한다는 것을 의미한다. 95, 96, 97, 98, 99 및 심지어는 100%의 순도 수준이 본 명세서에 약술된 방법을 사용하여 달성 가능하다. 순도는 HPLC에 의해 측정할 수 있다.
일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 발라에논을 포함한다.
일 구현예에서 정제된 조성물은 적어도 60 wt%의 발라에논을 포함한다.
일 구현예에서 정제된 조성물은 적어도 70 wt%의 발라에논을 포함한다.
일 구현예에서 정제된 조성물은 적어도 80 wt%의 발라에논을 포함한다.
일 구현예에서 정제된 조성물은 적어도 80 wt%의 발라에논을 포함한다.
일 구현예에서 정제된 조성물은 적어도 90 wt%의 발라에논을 포함한다.
일 구현예에서 정제된 조성물은 적어도 95 wt%의 발라에논을 포함한다.
일 구현예에서 정제된 조성물은 적어도 98 wt%의 발라에논을 포함한다.
일 구현예에서 정제된 조성물은 적어도 99 wt%의 발라에논을 포함한다.
일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 트랜스-발라에논을 포함한다. 일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 시스-발라에논을 포함한다.
일 구현예에서 정제된 조성물은 약 2 wt% 미만의 할포르딘(halfordin)을 포함한다.
일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 발라에논 및 2% wt% 미만의 할포르딘을 포함한다.
일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 트랜스-발라에논 및 2% wt% 미만의 할포르딘을 포함한다.
일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 시스-발라에논 및 2% wt% 미만의 할포르딘을 포함한다.
일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 발라에논으로 본질적으로 이루어진다. 일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 트랜스-발라에논으로 본질적으로 이루어진다.
순수한 트랜스-발라에논은 광 및 산소를 피해 냉온에서 저장되는 경우 꽤 안정적인 것으로 관찰되었다. 그러나 덜 순수한 조성물은 실온에서 빠르게 분해되어(2일 이내), 멜리코필론 B(7b)를 제공한다는 것을 발견하였다. 실리카겔에서의 트랜스-발라에논의 최종 정제는 그것을 산화된 방향족 화합물로부터 분리하였고, 그 다음 할포르딘(8)으로 식별하였다. 이론에 얽매이지 않고, 분해는 엠. 라티폴리아의 메탄올 추출물에도 존재하는 할포르딘(8)의 존재로 인한 것으로 여겨진다.
트랜스-발라에논의 7b로의 전환은, 일중항 산소의 존재 하에서 발생하는 것으로 생각된다. 할포르딘(8)은 반응성 일중항 상태[1O2]에 대한 분자 산소의 광활성화제로 공지된 화합물(예를 들어, 소랄렌)과 구조적으로 관련되어 있다(Aboul-Enein et al. 2003).
일중항 산소는 푸란 모이어티(예를 들어, 발라에논에 존재함)와 반응하여 7b에서와 같이 부테놀리드 모이어티를 형성하는 것으로 공지되어 있다(반응식 1에서 트랜스-발라에논에 대해 도시됨)(Montagnon et al. 2014).
[반응식 1]
시스-발라에논에 대해서도 동일한 공정이 발생할 것으로 여겨진다.
8의 부재 하에서, 트랜스-발라에논은 광 및 산소를 피해 저장되는 경우 실온에서 본질적으로 안정적이었다. 별도의 실험에서, 정제된 트랜스-발라에논은 로즈 벵갈(Rose Bengal)(일중항 산소의 또 다른 공지된 광발생기)의 존재 하에서 대기 중 산소와 광화학 반응하고, 이것은 다른 산화 생성물 가운데 7b를 생성하였다.
추출물로부터 할포르딘(8)을 제거하여 트랜스-발라에논의 정제된 조성물을 제공하며, 여기서 트랜스-발라에논은 광 및 산소를 피해 저장되는 경우 실온에서 안정적이다. 시스-발라에논에 대해서도 동일한 공정이 발생할 것으로 여겨진다.
따라서, 정제 공정은 자연, 즉, 엠. 라티폴리아 나무의 껍질에서 발견되는 발라에논과 현저하게 상이한 특성을 갖는 발라에논 또는 발라에논의 정제된 조성물을 제공한다.
일 구현예에서 발라에논의 정제된 조성물은 약 2 wt% 미만의 할포르딘을 포함한다.
일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 발라에논 및 2% wt% 미만의 할포르딘을 포함한다.
일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 트랜스-발라에논 및 2% wt% 미만의 할포르딘을 포함한다. 일 구현예에서, 정제된 조성물은 적어도 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 시스-발라에논 및 2% wt% 미만의 할포르딘을 포함한다.
일 양태에서 본 발명은 발라에논으로 본질적으로 이루어진 정제된 조성물을 제공한다. 일 양태에서 본 발명은 트랜스-발라에논으로 본질적으로 이루어진 정제된 조성물을 제공한다. 일 양태에서 본 발명은 시스-발라에논으로 본질적으로 이루어진 정제된 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 발라에논, 트랜스-발라에논 또는 시스-발라에논의 정제된 조성물은 가용화제를 포함한다. 일 구현예에서 가용화제는 시클로덱스트린, 알코올, 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된다.
일 양태에서 본 발명은 발라에논 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 양태에서 본 발명은 트랜스-발라에논 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 양태에서 본 발명은 시스-발라에논 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적 조성물"은 동물 대상체에게 투여하기에 적합한 형태, 농도 및 순도의 고체 또는 액체 조성물을 의미한다.
발라에논은 약제학적으로 허용 가능한 부형제와의 혼합에 의해 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 생리학적으로 불활성이고, 약리학적으로 비활성이고, 활성제의 물리적 및 화학적 특징과 양립할 수 있는 물질을 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 담체, 충전제, 희석제, 결합제, 붕해제, 가소제, 증점제, 용매, 계면활성제, 보존제, 감미료 및 향미제, 제약 등급 염료 및 안료를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
발라에논의 약제학적 조성물은 특히 수성 생리학적 완충 용액 중의 액체 용액 또는 현탁액 형태의 비경구 투여용으로; 특히 정제 또는 캡슐 형태의 경구 투여용으로; 특히 분말, 점적 또는 에어로졸 형태의 비강내 투여용으로; 그리고 특히 에멀젼 또는 연고 형태의 국소 투여용으로 제조될 수 있다. 다른 투여 경로를 위한 조성물은 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 18th Ed., Gennaro, ed.(Mack Publishing Co. 1990)]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
일 구현예에서 약제학적 조성물은 고체, 액체, 페이스트, 겔, 에멀젼, 크림, 연고, 로션, 도포제(liniment), 용액, 현탁액, 스틱, 블록, 환제, 로젠지, 분말 또는 슬러리의 형태이거나 그로 제형화된다.
5.5
발라에논의 용도
실시예 4에서 인지되는 바와 같이, 순수한 발라에논 및 발라에논을 포함하는 정제된 조성물 둘 모두는 항박테리아 활성을 나타낸다.
따라서, 일 양태에서 본 발명은 박테리아 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 박테리아 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체에게 치료 유효량의 발라에논 또는 발라에논의 정제된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 박테리아 감염의 치료를 위한 의약의 제조에서의 발라에논의 용도 및 박테리아 감염의 치료에 사용하기 위한 발라에논의 조성물에 관한 것이다.
발라에논은 약 60:1의 트랜스-발라에논과 시스-발라에논의 혼합물을 포함하기 때문에, 발라에논으로 인한 생물학적 활성도는 트랜스-발라에논으로부터 유래될 가능성이 높지만, 시스-발라에논도 활성일 수 있다. 따라서, 일 구현예에서 발라에논은 트랜스-발라에논이다.
일 구현예에서 감염은 그램-양성 박테리아 감염이다.
특허 명세서, 기타 외부 문서 또는 기타 정보 공급원을 참고하는 본 명세서에서, 이는 일반적으로 본 발명의 특징을 논의하기 위한 내용을 제공하려는 목적을 위한 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 이러한 외부 문서에 대한 언급은 모든 관할권에서 그러한 문서 또는 그러한 정보 공급원이 선행 기술이거나 당업계의 통상적 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
6. 실시예
일반적인 실험 방법
광학 회전은 Rudolph Research Analytical Autopol IV 편광계에서 측정하였다. UV/vis 스펙트럼은 Molecular Devices SpectraMax M3 분광 광도계에서 기록하였다. NMR 실험은 각각 1H 및 13C 핵에 대해 500 MHz 및 125 MHz에서 작동하는 Bruker 500 MHz 분광계에서 획득하였다. 정확한 질량은 양이온 모드에서 전기 분무 이온화 소스를 사용하는 용매 전달을 위해 Agilent 1260 HPLC 시스템이 장착된 Agilent 6530 Q-TOF 질량 분석기를 사용하여 측정하였다. 플래시 크로마토그래피는 
Reveleris X2 조제용 크로마토그래피 시스템에서 수행하였다.
용매는 분석 등급 이상의 품질이었다. 물은 사용하기 전에 유리 증류하였다. 용매 혼합물은 달리 명시되지 않는 한 % vol/vol로 보고한다. Supelco Diaion HP-20 폴리(스티렌-디비닐벤젠)공중합체(PSDVB)를 사용하여 역상 크로마토그래피를 수행하였다. Silicycle SiliaFlash F60 실리카겔(40 내지 63 m)을 건식 로딩에 사용하였다. 플래시 크로마토그래피용의 사전-충전된 실리카 카트리지는 Silicycle에서 입수하였다. 스테인리스강 반조제용 컬럼(실리카, 250 × 10 mm, 10 μm)은 
에서 입수하였다. TLC는 0.2 μm 실리카겔(60 F254) 사전-코팅된 플레이트에서 수행하였으며, 메탄올 중의 5% v/v 황산 + 에탄올 중의 0.1% w/v 바닐린을 사용한 후, 가열하여 시각화하였다.
실시예 1: 발라에논의 단리(100 g 식물 물질 규모)
엠. 라티폴리아의 신선 동결된 줄기 껍질(100 g)을 작은 조각(약 2 cm3)으로 자르고, 200 mL의 메탄올에 18시간 동안 담갔다. 메탄올(제1 추출물)을 여과하고, 껍질 물질을 추가 200 mL의 메탄올에 18시간 동안 담갔다. 이 메탄올(제2 추출물)을 여과하고, 2 mL/분으로 제한된 유량 및 중력에 의해, 100 mL PSDVB(HP-20, Supelco) 컬럼을 통해 통과시켰다.
이어서, 제1 추출물을 유사한 방식으로 동일한 컬럼을 통해 통과시키고, 용리액을 합하였다. 400 mL의 H2O를 용리액에 첨가하고, 이것을 동일한 속도로 PSDVB 컬럼을 통해 다시 통과시켰다. 생성된 용리액(800 mL)을 추가로 800 mL의 물로 희석하고, 동일한 컬럼을 통해 통과시켰다. 이어서, 컬럼을 물(폐기함), i) 20% 아세톤/물, ii) 40% 아세톤/물, iii) 60% 아세톤/물, iv) 80% 아세톤/물 및 v) 아세톤의 300 mL 부분 표본을 사용하여, 대략 2 mL/분으로 제한된 유량으로 용리하였다.
60% 아세톤/물 분획을 물 300 mL로 희석하고, PSDVB(HP-20)의 50 mL 층을 통해 통과시켰다. 용리액을 600 ml의 물로 추가로 희석하고, 동일한 PSDVB 층을 통해 통과시키고, 용리액을 폐기하였다. 소량의 압축 공기를 사용하여 컬럼으로부터 액체를 배출시켰고, 컬럼을 150 mL의 아세톤으로 용리하였다. 생성된 용리액을 증발 건조시켰다.
분획 iii)(60% 아세톤/물)은 소량의 관련 세스퀴테르펜을 함유하였고, 대부분은 발라에논 및 할포르딘이었다. 발라에논을 실리카겔 상에서 정제하였다: 60% 아세톤 분획 2 g을 디클로로메탄 중의 1:1 메탄올 3 mL에 용해시키고, 실리카겔 4 g 상에서 증발시켰다. 로딩된 실리카겔을 건식-로딩 카트리지에 넣고, 40 g 실리카 컬럼의 상류에 배치하였다. 컬럼을 석유 에테르로 용리하고, 0 내지 50% 에틸 아세테이트/석유 에테르의 구배를 15 컬럼 부피에 걸쳐 적용하였다. 소량의 관련 세스퀴테르페노이드가 먼저 용리되었고(0 내지 5% 에틸 아세테이트/석유 에테르), 그 다음 순수한 발라에논(10 내지 30% 에틸 아세테이트/석유 에테르)이 용리되었고, 마지막으로 할포르딘(30% 초과의 에틸 아세테이트/석유 에테르)이 용리되었다.
실시예 2: 발라에논의 단리(600 g 식물 물질 규모)
엠. 라티폴리아의 줄기 껍질(600 g, 신선 동결됨)을 메탄올(2 × 1.2 L)로 밤새 추출하고 여과하였다. 제2 추출물 및 제1 추출물을 메탄올에서 사전-평형화된 500 mL PSDVB 층을 통해 통과시켰다. 이 단계로부터의 합한 용리액을 물(2× 부피)로 연속적으로 희석하고, 25% 메탄올/물의 최종 용액 농도가 달성될 때까지 동일한 컬럼을 통해 다시 통과시켰다. 컬럼을 물(1.5 L, 로딩 용리액으로 수집)로 세척하고, 이어서 1.5 L 분량의 i) 20% 아세톤/물, ii) 40% 아세톤/물, iii) 60% 아세톤/물, iv) 80% 아세톤/물 및 v) 아세톤으로 용리하였다.
농축된 60% 아세톤/물 분획(분획 iii)의 2 g 부분을 실리카겔(40 g) 플래시 크로마토그래피[석유 에테르/에틸 아세테이트, 0 내지 60% 16 컬럼 부피(CV), 60 내지 100% 3 CV, 100%, 2.9 CV, 메탄올 0.4 CV]를 사용하여 정제하였다. 발라에논은 할포르딘(35 내지 40% 석유 에테르/에틸 아세테이트)과 함께 20 내지 25% 석유 에테르/에틸 아세테이트에서 용리되었다.
실시예 3:
트랜스
- 및
시스
-발라에논의 단리
실시예 1에 기재된 공정에 따라 얻은 발라에논이 풍부한 분획을 풀링(pooling)하고, 3:1의 석유 에테르/디에틸 에테르의 등용매 혼합물을 사용하여 실리카겔(10 × 150 mm, 10 μ, 유량 5 mL/분)에서 크로마토그래피하였다. 트랜스-발라에논(화학식 Xa의 화합물)은 12.4분째에 용리된 반면, 시스-발라에논(화학식 Xb의 화합물)은 15.2분째에 용리되었다.
시스-발라에논은 무색의 광학 활성 고체로 단리되었다([a]20 D +575). NMR 실험 데이터(표 2)에 의해 설명된 정확한 질량 측정 및 구성 구조의 분자식은 트랜스-발라에논에 대해 결정된 것과 동일하다. 시스-발라에논의 절대 배열은 결정되지 않았지만, 트랜스-발라에논의 부분입체이성질체이기 때문에 이는 H-1과 H-10 사이에 신 관계를 가져야 한다.
실시예 4:
트랜스
-발라에논의 구조 설명
트랜스-발라에논은 광학 활성 무색 오일로 제공된다([α]20 D +171). C15H18O2의 분자식은 7의 불포화도를 필요로 하는 고분해능 질량 분석법(m/z 231.1383 [M + H]+, 계산치 231.1380)으로부터 얻었다. 트랜스-발라에논의 13C NMR 스펙트럼은 15개의 필수 공명을 모두 포함한다. 13C, DEPT 및 HSQC NMR 실험의 분석은 15개의 탄소가 3개의 메틸(δC 23.2, 10.7, 9.2), 3개의 메틸렌(δC 42.0, 26.6, 34.3), 3개의 메틴(δC 137.8, 48.4, 42.1) 및 6개의 비-양성자화된 탄소(δC 209.2, 164.8, 156.6, 135.9, 120.4, 118.7)로 추가로 분해되는 것으로 식별되었다. 제안된 분자식에 필요한 18개의 수소 모두는 탄소에 부착되는데, 이것은 교환 가능한 양성자가 없음을 나타낸다. NMR 데이터를 표 2에 요약한다.
COZY 및 HMBC 실험은 세 가지 주요 하위구조를 확립하였다. 트랜스-발라에논의 평면 구조를 설정하는 데 사용되는 상관관계는 하기에 제시되며, 구조식 I에 표시된 번호를 사용하여 자세히 설명된다.
제1 하위구조인 비닐 단편은 C-11(δC 120.4), CH-12(δH 7.06, 1 J CH 200 Hz; δC 137.8) 및 CH3-13(δH 1.89; δC 9.8)으로 이루어졌으며, H3-13 내지 C-11 및 C-12의 HMBC 상관관계에 의해 승인되었다. 제2 하위구조는 CH3-14(∂H 1.73; ∂C 10.7) 내지 C-3(∂C 209.2) C-4(δC 135.9) 및 C-5(δC 164.8)로부터의 HMBC 상관관계에 의해 입증된 바와 같이 2-메타크릴로일 단편으로 확립되었다. 제3 하위구조인 1,2,5-삼치환된 3-메틸펜틸 단위는 CH2-2(∂H 2.26, 2.67; ∂C 42.0), CH-1(δH 2.52; ∂C 48.4), CH-10(δH 1.58; δC 42.1), CH2-9(δH 1.60, 1.86; δC 34.3) 및 CH2-8(δH 2.73, 2.81; ∂C 26.6)로 이루어졌다. CH3-15(δH 1.08; δC 23.2)의 부착은 H-10과의 COSY 상관관계 및 C-1, C-9 및 C-10에 대한 HMBC 상관관계에 의해 확립되었다.
트랜스-발라에논의 상대 배열은 스칼라 결합 상수 및 NOE 상관관계 데이터의 분석을 통해 결정하였다. H-1과 H-9a, 및 H-10과 H-8a 사이의 NOE 상관관계는, 둘 모두 7원 고리에 대한 1,3-유사축 배향(pseudoaxial orientation)을 시사하였다. 이러한 상관관계는 CH3-15를 H-1 및 H-9b에 대해 유사 수평방향에 배치하고, 부분적으로 H-1과 H-10 사이에 9.7 Hz의 비시널(vicinal) 결합 상수에 의해 뒷받침되며, 이는 이들 두 양성자의 안티-관계를 나타낸다.
단리 공정 동안, 부분적으로 정제된 트랜스-발라에논 샘플이 또 다른 종으로 산화되었다. 이 화합물의 평면 구조는 1988년에 엠. 트리필라(M. triphylla)로부터 Wu 등에 의해 처음 기재된 세스퀴테르페노이드인 멜리코필론 B(7b)와 일치하였다. 스펙트럼 세부 사항은 동일하며, 이는 단결정 X-선 회절 분석에 의해 Wu 등에 의해 확립된 동일한 상대 배열을 나타낸다. 실험적으로 유래된 7b([α]20 D -199)의 특정 회전은 문헌에 기재된 것과 동일한 사인을 갖는다{[α]25 D -38 (c 0.854, CHCl3)}. 이로부터, 트랜스-발라에논 및 7b는 그들의 보존된 입체 중심에서 동일한 절대 배열을 공유한다는 결론을 내렸다.
트랜스-발라에논의 절대 입체화학은 트랜스-발라에논 유도체의 X-선 결정학에 의해 결정되었다. 트랜스-발라에논(화학식 Xa)을 Diels-Alder 고리화첨가 실험(실온에서 에탄올 중)에서 말레이미드와 반응시켰다. 4개의 반응 생성물이 검출되었으며, 이 중 하나(9)는 결정질 고체로 단리되었다(반응식 2). 이 부가물의 X-선 구조(도 10)는 천연물(트랜스-발라에논)에서 H-1과 H-10 사이의 안티-관계를 확인하고, 도시된 바와 같은 절대 배열(1R, 10S)을 결정한다.
[반응식 2]
시스-발라에논의 상대 입체화학을 트랜스-발라에논과 비교함으로써 설명하였다.
특징규명 데이터
트랜스-발라에논 (X a ): 무색 오일; [α]20 D +171 (c 0.5, CHCl3); UV (MeOH) λmax /nm(log 
) 244 (3.99), 280 (3.80); NMR(CDCl3, 500 MHz) 표 2 참고; HRESIMS m/z 231.1383 [M + H]+, C15H19O2에 대한 계산치, 231.1380.
멜리코필론 B (7b): 무색 반결정질 고체; [α]20 D -199(c 1, CHCl3); Wu 등에 의해 이미 기재된 바와 같은 NMR 데이터.
할포르딘 (3): 무색 결정질 고체; HRESIMS m/z 277.0715 [M + H]+(C14H13O6에 대한 계산치, 277.0707).
시스-발라에논 (X b ): 무색 오일; [α]20 D +575 (c 1, CHCl3); UV (MeOH) λmax /nm (log 
) 226 (3.76), 256 (3.76), 298 (3.71); NMR (CDCl3, 500 MHz) 표 3 참고; HRESIMS m/z 231.1379 [M + H]+(C15H19O2, 231.1385에 대한 계산치).
[표 2]
트랜스
-발라에논(X
a
)에 대한 NMR 데이터(CDCl
3
, 500 MHz)
[표 3]
시스
-발라에논(X
b
)에 대한 NMR 데이터(CDCl
3
, 500 MHz).
*HBMC 리크-쓰루(leak-through)로부터 얻음.
실시예 5: 발라에논 및
엠. 라티폴리아
껍질 추출물의 항박테리아 활성
엠. 라티폴리아 껍질의 미정제(제1 메탄올성) 추출물 및 실시예 1에 약술된 정제 공정을 사용하여 얻은 5개의 크로마토그래피 분획을 항박테리아 활성의 정량적 결정을 위한 TLC 바이오오토그래피 연구를 위해 제출하였다.
간략하면, 샘플을 실리카겔 TLC 플레이트에 로딩함으로써 기준 플레이트를 준비하였으며, 이것을 확립된 용매 시스템(석유 에테르 중의 10% 에틸 아세테이트)을 사용하여 현상하였고, 그에 따라 극성에 기초하여 이의 성분을 분리하였다. 이어서 현상된 플레이트를 메탄올 중의 5% v/v 황산 + 에탄올 중의 0.1% w/v 바닐린을 사용하여 가시화하고, 이어서 가열하였다. 이러한 방법을 사용하여, 발라에논은 연분홍색 내지 적색 스팟으로 구별되었다(도 7 참고).
이어서 이 플레이트의 다수의 카피를 준비하고, 동일한 용매 시스템을 사용하여 현상하였지만, 대신에 하기 미생물(하기 참고) 중 하나로 접종/스파이킹된 한천을 부어 가시화하고, 인큐베이션한 후 환원 염료로 시각화하였다. 저해 영역을 나타내는 이들 샘플에 존재하는 화합물은 항박테리아 활성을 갖는 것으로 간주된다.
시험된 그램-양성 유기체(3):
스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 바실루스 서브틸리스
시험된 그램-음성 유기체(2):
슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에쉬리키아 콜라이(Escherichia coli)
에스. 아우레우스 및 에스. 에피더미디스에 대한 결과를 도 8 및 도 9에 도시한다. 추출물 중 어느 것도 피. 애루기노사(P. aeruginosa)에 대해 활성이 있는 것으로 밝혀지지 않았다.
이들 결과는, 발라에논을 함유하는 것으로 알려진 샘플이 에스. 아우레우스 및 에스. 에피더미디스에 대해 항박테리아 활성을 나타내는 것을 보여주며, 저해 영역은 기준 플레이트의 발라에논의 연분홍색 스팟 특징과 대략 동일한 체류 인자에서 나타난다. 그램-음성 유기체에 대해 어떠한 활성도 관찰되지 않았다.
발라에논(20% 및 40% 아세톤/물 분획)을 함유하지 않는 샘플은 선택된 유기체 중 어느 것에 대해서도 활성을 나타내지 않았다(도시하지 않음).
7. 산업 응용
본 발명의 화합물 및 조성물은 항생제로서 응용된다. 당업자는 상기 설명이 단지 예시로서 제공되며, 본 발명이 이에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
8. 참고 문헌
Claims (15)
- 하기 화학식 X의 단리된 생물활성 화합물:
[화학식 X]
.
- 하기 화학식 Xa의 단리된 생물활성 화합물:
[화학식 Xa]
.
- 하기 화학식 Xb의 단리된 생물활성 화합물:
[화학식 Xb]
.
- 제1항의 화합물 또는 제1항의 화합물의 정제된 조성물을 얻는 공정으로서, 상기 공정은
(a) 엠. 라티폴리아(M. latifolia)의 껍질을 메탄올로 추출하는 단계;
(b) 여과된 추출물을 메탄올 중에서 사전-평형화된(pre-equilibrated) PSDVB 컬럼을 통해 통과시키는 단계;
(c) 용리액을 동일한 부피의 물과 합하고, 그것을 동일한 PSDVB 컬럼을 통해 통과시키는 단계;
(d) 컬럼을 물로 세척하는 단계;
(e) 흡착된 추출물의 화합물을 i) 물 중의 20% 아세톤(분획 A), ii) 물 중의 40% 아세톤(분획 B), iii) 물 중의 60% 아세톤(분획 C), iv) 물 중의 80% 아세톤(분획 D) 및 v) 아세톤(분획 E)으로 용리하는 단계;
(f) 분획 C 및/또는 D를 수집하여 제1항의 화합물의 정제된 조성물을 제공하는 단계; 및
(g) 선택적으로, 분획 C 및/또는 D를 실리카겔 플래시 크로마토그래피에 의해 더 정제하여 제1항의 화합물을 얻는 단계를 포함하는, 공정. - 제2항 또는 제3항의 화합물을 얻는 공정으로서, 상기 공정은
(a) 엠. 라티폴리아의 껍질을 메탄올로 추출하는 단계;
(b) 여과된 메탄올 추출물을 메탄올 중에서 사전-평형화된 PSDVB 컬럼을 통해 통과시키는 단계;
(c) 용리액을 동일한 부피의 물과 합하고, 그것을 동일한 PSDVB 컬럼을 통해 통과시키는 단계;
(d) 컬럼을 물로 세척하는 단계;
(e) 흡착된 추출물의 화합물을 i) 물 중의 20% 아세톤(분획 A), ii) 물 중의 40% 아세톤(분획 B), iii) 물 중의 60% 아세톤(분획 C), iv) 물 중의 80% 아세톤(분획 D) 및 v) 아세톤(분획 E)으로 용리하는 단계;
(f) 분획 C 및/또는 D를 수집하여 발라에논(Balaenone)의 정제된 조성물을 제공하는 단계;
(g) 선택적으로, 분획 C 및/또는 D를 석유 에테르 구배(0 내지 100%)의 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카겔 플래시 크로마토그래피에 의해 더 정제하여 발라에논을 얻는 단계, 및
(h) 발라에논의 부분입체이성질체를 실리카겔 플래시 크로마토그래피에서 분리하여 제2항 또는 제3항의 화합물을 얻는 단계를 포함하는, 공정. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물의 정제된 조성물.
- 제6항에 있어서, 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 wt%의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는, 정제된 조성물.
- 제7항에 있어서, 적어도 95 wt%의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는, 정제된 조성물.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 wt% 미만의 할포르딘(halfordin)을 포함하는, 정제된 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 정제된 조성물 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
- .
- 박테리아 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 박테리아 감염을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 박테리아 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 박테리아 감염을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 정제된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 박테리아 감염은 그램-양성 박테리아 감염인, 방법.
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