CN112930344B - 生物活性化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有式(X)所示结构的新型含呋喃的倍半萜。他可以以相对高的浓度从阔叶蜜茱萸的树皮中获得并且已发现具有抗生素特性。

Description

生物活性化合物
技术领域
本发明涉及一种从阔叶蜜茱萸(Melicope latifolia)树的树皮分离的新型生物活性化合物、包含该化合物的组合物及其使用方法。
背景技术
阔叶蜜茱萸(以前称为阔叶吴茱萸(Euodia latifolia))属于芸香科柑橘属。他生长在东南亚和太平洋地区的许多国家，在那些国家用于传统医学中。在瓦努阿图(Vanuatu)的洛岛(Loh)上，阔叶蜜茱萸被描述为一种引进的园林植物，称为“nehine”。叶的冷浸渍物内服用于治疗咳嗽(Bradacs,Maes等人，2010年)；(Bradacs,Heilmann等人，2011)。
在马来西亚半岛，阔叶蜜茱萸是一种生长在低地森林中的非特有的小树，在马来语中称为“Orang Asli”。他被认为是濒临灭绝的物种，可用于制造树脂和肥皂以及用于医药中。捣烂的叶子可以外用以退烧和治疗痉挛(Chooi1994)。
已经发现一些阔叶蜜茱萸材料的萃取物具有适度的生物活性。从印度尼西亚东爪哇省的坎加尔森林(Cangar Forest)采集的阔叶蜜茱萸粉末状干叶的乙醇萃取物显示出在进入和进入后步骤抑制丙型肝炎病毒感染人肝细胞(Huh7.5)，其中IC50值为3.5±1.4μg/mL，且CC50值>100μg/mL。然而，阔叶蜜茱萸茎的萃取物效力降低超过10倍(Wahyuni,Tumewu等人，2013)。
来自瓦努阿图的洛岛的阔叶吴茱萸叶的萃取物具有以下活性(Bradacs,Maes等人，2010)：
·二氯甲烷萃取物对培养的人肺癌细胞系A548的IC50值为14.2±0.89μg/mL。
·二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物对红细胞中恶性疟原虫的IC50值分别为8.30±1.43和14.94±2.72μg/mL，但对人肺成纤维细胞(MRC-5SV2)的活性相似，因此选择性指数为1。
·二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物对克鲁氏锥虫的IC50值分别为6.55±0.79和7.64±0.26μg/mL，但对人肺成纤维细胞(MRC-5SV2)的活性相似，因此选择性指数为1。
·二氯甲烷萃取物对布鲁氏锥虫的IC50值为8.28±0.62μg/mL，但对人肺成纤维细胞(MRC-5SV2)的活性相似，因此选择性指数为1。
尽管对阔叶蜜茱萸萃取物进行的研究很少，但对其天然产物的化学知之更少。据信这是唯一的对阔叶蜜茱萸化学组分的实质性研究，对来自西马来西亚彭亨州云顶高原(在吉隆坡以北50km处)的阔叶蜜茱萸(当时称为阔叶吴茱萸)的干叶的乙醇萃取物的色谱分离提供了两种新的异构体化合物，通过分步结晶分离的分别为0.006％产率的美利福酮(melifolione)1a和1b(Goh,Chung等人，1990)。
分离的其他化合物是香豆素衍生物，5,7,8-和6,7,8-三甲氧基香豆素和香柑内酯(bergapten)(2)。香柑内酯(2)是香柠檬油中引起光毒性的化学物质。建议在局部制剂中限制此类呋喃香豆素的水平。还发现固醇谷固醇、豆甾醇和菜油甾醇的比率为67:17:21。
硕士论文摘要(Hashim 2010)报道了从马来西亚沙巴州采集的阔叶蜜茱萸叶中分离出两种生物碱白鲜碱(3)和山刈碱(4)。
白鲜碱(3)广泛存在于芸苔科中，并且是光诱导的遗传毒性和皮肤刺激的原因。据报道他具有抗血小板聚集和血管松弛活性(Wu等人，1994)、杀虫活性、对细菌和酵母的光毒性以及对耻垢分枝杆菌和枯草芽孢杆菌的抗菌活性。白鲜碱(3)也已被广泛用于治疗某些皮肤疾病(Guo,Yu等人，2008)。
山刈碱(4)是在许多呋喃香豆素中细胞毒性最高的分离物，对P-388细胞系的细胞毒性比参考化合物光神霉素(ED50值＝0.06μg/mL)更强(ED50值＝0.03μg/mL)。(Chen,Duh等人，2003)。
据报道从印度尼西亚的阔叶蜜茱萸的果实中分离出两种苯并吡喃化合物“O-甲基八肾上腺素酮(O-methyloctadrenolone)”和别吴茱萸酮酚(alloevodionol)(6)(Primastuti 2017)。然而，似乎没有如“O-甲基八肾上腺素酮”这样的化合物，最接近的是八氮烯酮甲基醚(octadendrolone methyl ether)(5)，一种首先从新西兰三叶蜜茱萸(M.ternata)分离的化合物(Cambie,Pan等人，1996)。
随着公共卫生官员认识到抗生素耐药性日益严重的问题，研究人员正越来越多地转向以前未开发的动植物群以寻找新的抗生素化合物，或者至少为公众提供有用的选择。
阔叶蜜茱萸的次生代谢产物相对未经研究。因此，本发明的目的是评估这种植物提供有用的包括抗生素化合物在内的生物活性化合物的潜力。
在说明书中，已经参考专利说明书、其他外部文件或其他信息源，这通常是出于提供讨论本发明的特征的上下文的目的。除非另有具体说明，否则对此类外部文件的提及不应解释为承认此类文件或此类信息源在任何管辖范围内都是现有技术或构成本领域公知常识的一部分。
发明内容
本发明涉及本发明人命名为巴拉烯酮(Balaenone)的来自阔叶蜜茱萸树的树皮的新型生物活性化合物的分离和鉴定。
一方面，本发明涉及分离的式(X)的生物活性化合物
此化合物在本文中称为“巴拉烯酮(Balaeneone)”。
一方面，本发明涉及分离的式(Xa)的生物活性化合物
此化合物在本文中称为“1,10-反式-巴拉烯酮”或“反式-巴拉烯酮”。
另一方面，本发明涉及具有式(Xb)的结构和相对立体化学的分离的生物活性化合物。
此化合物在本文中称为“1,10-顺式-巴拉烯酮”或“顺式-巴拉烯酮”。
另一方面，本发明涉及具有图1-6中任一个的NMR谱的生物活性化合物。另一方面，本发明涉及具有图11-16中任一图的NMR谱的生物活性化合物。
另一方面，本发明提供了获得纯化的巴拉烯酮的组合物的方法，其中方法包括以下步骤：
(a)用甲醇萃取阔叶蜜茱萸的树皮；
(b)使过滤的萃取物通过已在甲醇中预平衡的PSDVB柱；
(c)将洗脱液与等体积的水合并，并使其通过同一PSDVB柱；
(d)用水洗涤柱；
(e)用i)20％丙酮的水溶液(级分A)、ii)40％丙酮的水溶液(级分B)、iii)60％丙酮的水溶液(级分C)、iv)80％丙酮的水溶液(级分D)和v)丙酮(级分E)洗脱吸附的萃取物的化合物；
(f)收集级分C和/或D以提供提纯化的巴拉烯酮的组合物；和
(g)任选地，通过硅胶快速色谱进一步纯化级分C和/或D以获得更纯化的巴拉烯酮的组合物。
在一个实施方案中，重复步骤(a)以提供第二甲醇萃取物。
在一个实施方案中，重复步骤(c)。
在一个实施方案中，在步骤(g)中使用乙酸乙酯的石油醚溶液梯度(0-100％)进一步纯化级分C和/或D。
另一方面，本发明提供了通过以下方法获得的纯化的巴拉烯酮的组合物，方法包括以下步骤：
(a)用甲醇萃取阔叶蜜茱萸的树皮；
(b)使过滤的萃取物通过已在甲醇中预平衡的PSDVB柱；
(c)将洗脱液与等体积的水合并，并使其通过同一PSDVB柱；
(d)用水洗涤柱；
(e)用i)20％丙酮的水溶液(级分A)、ii)40％丙酮的水溶液(级分B)、iii)60％丙酮的水溶液(级分C)、iv)80％丙酮的水溶液(级分D)和v)丙酮(级分E)洗脱吸附的萃取物的化合物；
(f)收集级分C和/或D以提供纯化的巴拉烯酮的组合物；和
(g)任选地，通过硅胶快速色谱进一步纯化级分C和/或D以获得更纯化的巴拉烯酮的组合物。
在一个实施方案中，重复步骤(a)以提供第二甲醇萃取物。
在一个实施方案中，重复步骤(c)。
在一个实施方案中，在步骤(g)中使用乙酸乙酯的石油醚溶液梯度(0-100％)进一步纯化级分C和/或D。
另一方面，本发明提供了纯化的巴拉烯酮的组合物。另一方面，本发明提供了纯化的反式-巴拉烯酮组合物。另一方面，本发明提供了纯化的顺式-巴拉烯酮组合物。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的巴拉烯酮。在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的反式-巴拉烯酮。在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的顺式-巴拉烯酮。
一方面，本发明提供了包含巴拉烯酮和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
一方面，本发明提供了包含反式-巴拉烯酮和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
一方面，本发明提供了包含顺式-巴拉烯酮和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在一个实施方案中，药物组合物是抗菌组合物。
另一方面，本发明提供了治疗有需要的个体中的细菌感染的方法，包括向该个体施用治疗有效量的巴拉烯酮或纯化的巴拉烯酮的组合物。
另一方面，本发明提供了治疗有需要的个体中的细菌感染的方法，包括向该个体施用治疗有效量的反式-巴拉烯酮或纯化的反式-巴拉烯酮组合物。
另一方面，本发明提供了一种治疗有需要的个体中的细菌感染的方法，包括向该个体施用治疗有效量的顺式-巴拉烯酮或纯化的顺式-巴拉烯酮组合物。
在一实施方案中，感染是革兰氏阳性细菌感染。
本文阐述的实施方案和优选方案可以单独或以任何两个或更多个的组合涉及本文阐述的本发明的任何方面。
尽管本发明大致上如上所定义，但是本领域技术人员将理解本发明不限于此，并且本发明还包括以下实施例给出实例的实施方案。
附图说明
现在将参考附图描述本发明，其中：
图1示出CDCl3中反式-巴拉烯酮的1H NMR谱。
图2示出CDCl3中反式-巴拉烯酮的13C NMR(125MHz)谱。
图3示出CDCl3中反式-巴拉烯酮的COZY(500MHz)谱。
图4示出CDCl3中反式-巴拉烯酮的HSQC(500MHz)谱。
图5示出CDCl3中反式-巴拉烯酮的HMBC(500MHz)谱。
图6示出CDCl3中反式-巴拉烯酮的NOESY(500MHz)谱。
图7示出硅胶TLC板，显示出样品1＝甲醇萃取物、2＝60％丙酮/水级分、3＝80％丙酮/水级分、4＝100％丙酮级分的组分的分离和可视化。亮粉红色/红色斑点是巴拉烯酮的特征。
图8示出与参考板(右手侧)相比金黄色葡萄球菌(左手侧)的抗菌测定结果。样品1＝甲醇萃取物，2＝60％丙酮/水级分，3＝80％丙酮/水级分，4＝100％丙酮级分。参考板中的亮粉红色/红色斑点是巴拉烯酮的特征。
图9示出与参考板(右手侧)相比对表皮葡萄球菌(左手侧)的抗菌测定的结果。样品1＝甲醇萃取物，2＝60％丙酮/水级分，3＝80％丙酮/水级分，4＝100％丙酮级分。参考板中的亮粉红色/红色斑点是巴拉烯酮的特征。
图10是环加成产物(9)的ORTEP图。
图11示出CDCl3中顺式-巴拉烯酮的1H NMR(500MHz)谱。
图12示出CDCl3中顺式-巴拉烯酮的13C NMR(125MHz)谱。
图13示出CDCl3中顺式-巴拉烯酮的COZY(500MHz)谱。
图14示出CDCl3中顺式-巴拉烯酮的HSQC(500MHz)谱。
图15示出CDCl3中顺式-巴拉烯酮的HMBC(500MHz)谱。
图16示出CDCl3中顺式-巴拉烯酮的NOESY(500MHz)谱。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“包含(comprising)”意指“至少部分地由……组成”。当解释本说明书和权利要求书中包括术语“包含”的每个陈述时，也可以存在不同于该术语或由该术语开头的那些特征。相关术语诸如“包含(comprise/comprises)将以相同的方式解释。
如本文所用，术语“基本上由……组成”意指指定的材料或步骤以及那些不实质性地影响所要求保护的发明的基本和新特征的材料或步骤。
如本文所用，术语“由……组成”意指所要求保护的发明的指定材料或步骤，不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或组分。
如本文所用，术语“和/或”意指“和”或“或”或两者。
当与参考数字指示结合使用时，术语“约”意指参考数字指示加或减参考数字指示的至多10％。例如，“约100”意指90至110，且“约6”意指5.4至6.6。
预期对本文公开的数字范围的引用(例如1至10)也包含对该范围内所有有理数(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及该范围内的任何有理数范围(例如2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)的引用，因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围都特此明确公开。这些仅是具体意图的实例，并且在所列举的最小值和最大值之间的数值的所有可能的组合应被认为在本申请中以类似的方式明确地陈述。
本文所述的化合物中可存在不对称中心。不对称中心可以指定为(R)或(S)，取决于手性碳原子处在三维空间中的取代基的构型。除非指明了特定的立体化学或异构形式，否则结构的所有手性、非对映异构和外消旋形式为预期的。除非另有说明，否则化合物的所有立体化学异构体形式(包括非对映异构体、对映异构体和差向异构体形式以及d-异构体和l-异构体，以及他们的混合物，包括立体化学异构体的对映异构体富集和非对映异构体富集的混合物)都在本发明的范围内。
本文所述的化合物也可以作为构象或几何异构体存在，包括顺式、反式、顺(syn)、反(anti)、entgegen(E)和zusammen(Z)异构体。除非另有说明，否则所有这些异构体及其任何混合物均在本发明的范围内，
所述化合物的任何互变异构体或其混合物也在本发明的范围内。如本领域技术人员将理解的，各种各样的官能团和其他结构可表现出互变异构。实例包括但不限于酮/烯醇、亚胺/烯胺和硫酮/烯硫醇互变异构。
在命名或描述所公开化合物的立体化学时，命名或描述的立体异构体相对于所有其他立体异构体可以按净重量计为至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.9％。当命名或描述单个对映异构体时，相对于其他对映异构体，命名或描述的对映异构体按净重量计为至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.9％。
如本文所用，术语“施用(administering/administration)”是指通过适于产生治疗效果的方法将本发明的组合物或化合物置于个体内或个体上。剂型根据治疗目的和个体选择和适当使用。本发明的组合物的剂量可以根据治疗目的和个体特征(包括他们的物种、年龄、性别、总体健康状况和疾病进展)来选择。通常，对于人个体，本发明的化合物可以每天每千克体重0.01mg至100mg、优选0.1mg至50mg的剂量施用，施用一次或分几次施用。
如本文所用，“治疗有效量”是足以产生有益或期望结果(包括临床结果)的量。治疗有效量可以通过各种施用途径以一种或多种施用方式施用。待施用至个体的化合物的治疗有效量取决于例如化合物的施用目的、施用方式、任何共同施用的化合物的性质和剂量以及个体的特征，诸如总体健康状况、其他疾病、年龄、性别、基因型、体重和药物耐受性。本领域技术人员将能够考虑到这些任何其他相关因素来确定合适的剂量。
“个体”是指人或非人动物，优选为哺乳动物的脊椎动物。非人哺乳动物包括但不限于；牲畜，诸如牛、绵羊、猪、鹿和山羊；运动和陪伴动物，诸如狗、猫和马；和研究动物，诸如小鼠、大鼠、兔子和豚鼠。优选地，个体是人。
巴拉烯酮
发明人已经从阔叶蜜茱萸树的树皮萃取物中分离出了新型生物活性化合物。通过DNA指纹分析鉴定了树的物种，Applelhans对蜜茱萸物种进行的系统发育分析中将他放置在了阔叶蜜茱萸的标本中(Appelhans,Wen等人，2014)。
本发明的新型化合物是具有式(X)所示结构的含呋喃的倍半萜。他以相对较高的浓度存在于阔叶蜜茱萸树的树皮中。他可以通过甲醇萃取树皮获得，以提供可以使用本领域标准技术纯化的粗提取物。
巴拉烯酮具有两个立体异构中心，使四个立体异构体成为可能(RR、RS、SR和SS)。根据本发明的方法萃取巴拉烯酮可以以大约60:1比率提供反式-巴拉烯酮和顺式-巴拉烯酮。每种非对映异构体都是对映异构体纯的(>99％)。
如实施例4中所述，已经阐明了反式-巴拉烯酮的绝对构型。基于下面的编号系统，1,10-反式-巴拉烯酮是(+)-(1R,10S)-巴拉烯酮。他的IUPAC名称为(6S,6aR)-1,6,9-三甲基-5,6,6a,7-四氢薁并[5,4-b]呋喃-8(4H)-酮。
1,10-顺式-巴拉烯酮的绝对构型尚未确定，但他的相对构型为(+)-(1R*,10R*)-巴拉烯酮。他的IUPAC名称为(6R*,6aR*)-1,6,9-三甲基-5,6,6a,7-四氢薁并[5,4-b]呋喃-8(4H)-酮。
如实施例3中所述，可以通过快速色谱将非对映异构体彼此分离。
巴拉烯酮以前尚未被报道过，似乎代表了一类新的化合物。在结构上，巴拉烯酮最类似于三叶蜜茱萸酮A、B和C，如下所示。
这些化合物在1988年和1989年被报道为三叶蜜茱萸的根和茎皮萃取物的组分(Wu,Jong等人，1988；Jong和Wu 1989)。巴拉烯酮可通过将呋喃氧化成(羟基)丁烯酸内酯的方式，成为三叶蜜茱萸酮(Melicophyllonelone)A–C(7a-c)的前体，尤其是三叶蜜茱萸酮C(7c)，区别在于C-8的额外氧化。尽管建立了三叶蜜茱萸酮的相对立体化学，但没有建立绝对立体化学。基于对本文所述反式-巴拉烯酮的绝对立体化学的阐明，由Wu和Jong选择的描述三叶蜜茱萸酮的立体化学(如上所示)似乎是不正确的。
巴拉烯酮具有抗生素特性，因此可用于治疗细菌感染，尤其是革兰氏阳性细菌感染。
因此，一方面，本发明提供了生物活性的巴拉烯酮。另一方面，本发明提供了具有图1-6中任一图的NMR谱的生物活性化合物。另一方面，本发明提供了具有图11-16中任一图的NMR谱的生物活性化合物。
一方面，本发明提供了(+)-(6S,6aR)-1,6,9-三甲基-5,6,6a,7-四氢薁并[5,4-b]呋喃-8(4H)-酮。
另一方面，本发明提供了具有强烈的正旋转的((6R*,6aS*)-1,6,9-三甲基-5,6,6a,7-四氢薁并[5,4-b]呋喃-8(4H)-酮的对映异构体形式。
获得巴拉烯酮和纯化的巴拉烯酮的组合物的方法
利用天然产物化学的标准技术(包括溶剂萃取、反相色谱、正相硅胶色谱等)可以使用多种方法将巴拉烯酮从其原料中分离和纯化。
优选地，巴拉烯酮和纯化的巴拉烯酮的组合物获自阔叶蜜茱萸树的树皮的甲醇萃取物。两种有用的方法是使用(a)利用聚(苯乙烯-二乙烯基苯)共聚物(PSDVB)的反相色谱和(b)液-液分配，任选地随后进行正相色谱，如下所述。然而，本领域技术人员可以使用有效技术的任何组合。
利用PSDVB的反相色谱
在这种萃取方法中，用甲醇(2倍)萃取阔叶蜜茱萸的茎皮18-24小时。过滤两种萃取物，并通过已在甲醇中预平衡的PSDVB床(第二次，然后是第一次萃取)。合并来自此过程的洗脱液，并用等体积的水(50％甲醇的水溶液)稀释，并通过同一PSDVB柱。用另一当量的水(至25％甲醇的水溶液)重复此过程，并通过同一PSDVB柱。现在含有吸附的萃取物的柱用水(3倍柱体积)洗涤，然后分批用i)20％丙酮的水溶液(级分A)、ii)40％丙酮的水溶液(级分B)、iii)60％丙酮的水溶液(级分C)、iv)80％丙酮的水溶液(级分D)和v)丙酮(级分E)洗涤。
级分C和D应含有一定量的巴拉烯酮，而前者含有大部分物质。
纯巴拉烯酮可以通过硅胶快速色谱从级分C(60％丙酮的水溶液)获得。优选的溶剂系统是乙酸乙酯的石油醚溶液梯度(0-100％)，其中巴拉烯酮用20-25％乙酸乙酯/石油醚溶液洗脱。
巴拉烯酮的非对映异构体可以通过使用3:1石油醚/乙醚或等效溶剂系统的硅胶快速色谱分离。本领域技术人员将理解可以使用其他溶剂体系来纯化巴拉烯酮及其非对映异构体。
液-液分配
用甲醇(2倍)萃取阔叶蜜茱萸的茎皮18-24小时。将两种萃取物合并，在真空中浓缩至干，在与水不混溶的有机溶剂(例如二氯甲烷)中重构并用水分配。有机层使用无水硫酸镁干燥并真空浓缩至干。浓缩的有机层通过硅胶快速色谱使用乙酸乙酯的石油醚溶液梯度(0-100％)纯化，其中巴拉烯酮用20-25％乙酸乙酯的石油醚溶液洗脱。
在使用薄层色谱(TLC)的纯化过程中，很容易追踪巴拉烯酮，因为当与5％v/v硫酸的甲醇溶液+0.1％w/v香兰素的乙醇溶液接触并加热时，他显示为亮粉红色/红色斑点。当硅胶TLC板上的样品在10％乙酸乙酯的石油醚溶液中运行时，Rf为0.25。
然而，可以使用可替代的可视化系统。表1示出一系列TLC溶剂系统中反式-巴拉烯酮和顺式-巴拉烯酮的Rf值。
表1
容积系统 反式-巴拉烯酮 顺式-巴拉烯酮
9:1石油醚/乙酸乙酯 0.33 0.28
二氯甲烷 0.13 0.13
乙醚 0.56 0.54
95:5二氯甲烷/丙酮 0.54 0.52
3:1石油醚/二乙醚 0.23 0.19
95:5二氯甲烷/甲醇 0.83 0.81
优选的萃取和分离方法在下面的实施例部分中描述。
一方面，本发明提供了获得巴拉烯酮或纯化的巴拉烯酮的组合物的方法，其中方法包括以下步骤：
(a)用甲醇萃取阔叶蜜茱萸的树皮；
(b)使过滤的甲醇萃取物通过已在甲醇中预平衡的PSDVB柱；
(c)将洗脱液与等体积的水合并，并使其通过同一PSDVB柱；
(d)用水洗涤柱；
(e)用i)20％丙酮的水溶液(级分A)、ii)40％丙酮的水溶液(级分B)、iii)60％丙酮的水溶液(级分C)、iv)80％丙酮的水溶液(级分D)和v)丙酮(级分E)洗脱吸附的萃取物的化合物；
(f)收集级分C和/或D以提供纯化的巴拉烯酮的组合物；和
(g)任选地，通过硅胶快速色谱进一步纯化级分C和/或D以获得更纯化的巴拉烯酮的组合物。
在一个实施方案中，重复步骤(a)以提供第二甲醇萃取物。
在一个实施方案中，重复步骤(c)。
在一个实施方案中，在步骤(g)中使用乙酸乙酯的石油醚溶液梯度(0-100％)进一步纯化级分C和/或D。
一方面，本发明提供了获得反式-巴拉烯酮和/或顺式-巴拉烯酮或其纯化的组合物的方法，方法包括以下步骤：
(a)用甲醇萃取阔叶蜜茱萸的树皮；
(b)使过滤的甲醇萃取物通过已在甲醇中预平衡的PSDVB柱；
(c)将洗脱液与等体积的水合并，并使其通过同一PSDVB柱；
(d)用水洗涤柱；
(e)用i)20％丙酮的水溶液(级分A)、ii)40％丙酮的水溶液(级分B)、iii)60％丙酮的水溶液(级分C)、iv)80％丙酮的水溶液(级分D)和v)丙酮(级分E)洗脱吸附的萃取物的化合物；
(f)收集级分C和/或D以提供纯化的巴拉烯酮的组合物；
(g)任选地，使用乙酸乙酯的石油醚溶液梯度(0-100％)通过硅胶快速色谱进一步纯化级分C和/或D以获得巴拉烯酮，以及
(h)使用3:1石油醚/乙醚的等度混合物，在硅胶快速色谱上分离反式-巴拉烯酮和顺式-巴拉烯酮，以获得反式-巴拉烯酮和顺式-巴拉烯酮。
一方面，本发明提供了通过上述方面的方法获得的产物。
在一个实施方案中，产物是巴拉烯酮或纯化的巴拉烯酮的组合物。在一个实施方案中，产物是反式-巴拉烯酮或纯化的反式-巴拉烯酮组合物。在一个实施方案中，产物是顺式-巴拉烯酮或纯化的顺式-巴拉烯酮组合物。
纯化的巴拉烯酮组分
一方面，本发明提供了纯化的巴拉烯酮的组合物。在一个实施方案中，本发明提供了通过上述方法获得的纯化的组合物。
如本文所用，术语“纯化的”是指巴拉烯酮的组合物，是指组合物包含至少大于50％wt％的巴拉烯酮。使用本文概述的方法可达到95％、96％、97％、98％、99％甚至100％的纯度水平。纯度可以通过HPLC测量。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的巴拉烯酮。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少60wt％的巴拉烯酮。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少70wt％的巴拉烯酮。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少80wt％的巴拉烯酮。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少80wt％的巴拉烯酮。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少90wt％的巴拉烯酮。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少95wt％的巴拉烯酮。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少98wt％的巴拉烯酮。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少99wt％的巴拉烯酮。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的反式-巴拉烯酮。在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的顺式-巴拉烯酮。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含小于约2wt％的哈福丁(halfordin)。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的巴拉烯酮和小于2wt％的哈福丁。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的反式-巴拉烯酮和小于2wt％的哈福丁。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的顺式-巴拉烯酮和小于2wt％的哈福丁。
在一个实施方案中，纯化的组合物基本上由至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的巴拉烯酮组成。在一个实施方案中，纯化的组合物基本上由至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的反式-巴拉烯酮组成。
观察到纯反式-巴拉烯酮在凉爽的温度下远离光线和氧气储存时非常稳定。然而，发现纯度较低的组合物在室温下迅速降解(2天内)，产生三叶蜜茱萸酮B(7b)。反式-巴拉烯酮在硅胶上的最终纯化将他与氧化的芳族化合物分离，随后鉴定为哈福丁(8)。不受理论的束缚，据信降解是由于哈福丁(8)的存在，所述哈福丁(8)也存在于阔叶蜜茱萸的甲醇萃取物中。
认为反式-巴拉烯酮向7b的转化在单线态氧存在下发生。哈福丁(8)与已知为分子氧的光活化剂、具有反应性单线态[1O2]的化合物(例如补骨脂素)在结构上相关(Aboul-Enein等人，2003)。
已知单线态氧与呋喃部分(如在巴拉烯酮中存在)发生反应(Montagnon等人，2014)，形成如7b中的丁烯酸内酯部分(在方案1中对于反式-巴拉烯酮所述)。
据信对于顺式-巴拉烯酮将发生相同的过程。
在不存在8的情况下，反式-巴拉烯酮在室温下远离光和氧气存储时基本稳定。在单独的实验中，在存在二碘曙红(Rose Bengal)(另一种已知的单线态氧光发生剂)的情况下，纯化的反式-巴拉烯酮与大气中的氧进行光化学反应，生成7b及其他氧化产物。
从萃取物中除去哈福丁(8)提供了纯化的反式-巴拉烯酮的组合物，其中反式-巴拉烯酮在室温下远离光和氧气存储时是稳定的。据信对于顺式-巴拉烯酮将发生相同的过程。
因此，纯化过程提供了与天然存在(即在阔叶蜜茱萸树的树皮中)的巴拉烯酮具有明显不同特性的巴拉烯酮或纯化的巴拉烯酮的组合物。
在一个实施方案中，纯化的巴拉烯酮的组合物包含小于约2wt％的哈福丁。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的巴拉烯酮和小于2wt％的哈福丁。
在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的反式-巴拉烯酮和小于2wt％的哈福丁。在一个实施方案中，纯化的组合物包含至少约60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％或99wt％的顺式-巴拉烯酮和小于2wt％的哈福丁。
一方面，本发明提供了基本上由巴拉烯酮组成的纯化的组合物。一方面，本发明提供了基本上由反式-巴拉烯酮组成的纯化的组合物。一方面，本发明提供了基本上由顺式-巴拉烯酮组成的纯化的组合物。
在一个实施方案中，纯化的巴拉烯酮、反式-巴拉烯酮或顺式-巴拉烯酮组合物包含增溶剂。在一个实施方案中，增溶剂选自环糊精、醇、甘油、丙二醇和聚乙二醇。
一方面，本发明提供了包含巴拉烯酮和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。一方面，本发明提供了包含反式-巴拉烯酮和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。一方面，本发明提供了包含顺式-巴拉烯酮和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
如本文所用，术语“药物组合物”意指适于施用至动物个体的形式、浓度和纯度的固体或液体组合物。
巴拉烯酮可以通过与药学上可接受的赋形剂混合而配制成药物组合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指在生理上惰性、在药理上无活性并且与活性剂的物理和化学特性相容的物质。药学上可接受的赋形剂包括但不限于载体、填充剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂、增塑剂、增粘剂、溶剂、表面活性剂、防腐剂、甜味剂和矫味剂以及医药级染料和颜料。
可以制备巴拉烯酮的药物组合物用于肠胃外施用，特别是以液体溶液或在生理缓冲水溶液中的悬浮液的形式；用于口服施用，特别是片剂或胶囊形式；用于鼻内施用，特别是粉末、滴剂或气雾剂形式；用于局部施用，特别是乳剂或软膏剂形式。可以使用本领域已知的标准方法来制备用于其他施用途径的组合物，例如如Remington’s PharmaceuticalSciences，第18版，Gennaro编辑(Mack Publishing Co.1990)中所述。
在一个实施方案中，药物组合物为固体、液体、糊剂、凝胶、乳剂、霜剂、软膏剂、洗剂、搽剂、溶液、悬浮液、棒、块、丸剂、锭剂、粉剂或浆剂形式或被配制为为固体、液体、糊剂、凝胶、乳剂、霜剂、软膏剂、洗剂、搽剂、溶液、悬浮液、棒、块、丸剂、锭剂、粉末或浆液。
巴拉烯酮的用途
如实施例4中所示，纯巴拉烯酮和纯化的包含巴拉烯酮的组合物均显示出抗菌活性。
因此，一方面，本发明提供了治疗有需要的个体中的细菌感染的方法，包括向该个体施用治疗有效量的巴拉烯酮或纯化的巴拉烯酮的组合物。
另一方面，本发明涉及巴拉烯酮在制造用于治疗细菌感染的药物中的用途，并涉及用于治疗细菌感染的巴拉烯酮的组合物。
由于巴拉烯酮包含约60:1反式-巴拉烯酮和顺式-巴拉烯酮的混合物，所以巴拉烯酮的生物活性可能源自反式-巴拉烯酮，尽管顺式-巴拉烯酮也可能具有活性。因此，在一个实施方案中，巴拉烯酮是反式-巴拉烯酮。
在一实施方案中，感染是革兰氏阳性细菌感染。
在说明书中，已经参考专利说明书、其他外部文件或其他信息源，这通常是出于提供讨论本发明的特征的上下文的目的。除非另有具体说明，否则对此类外部文件的引用不应解释为承认此类文件或此类信息源在任何管辖范围内都是现有技术或构成本领域公知常识的一部分。
实施例
一般实验方法
在Rudolph Research Analytical Autopol IV旋光仪上测量旋光度。UV/vis谱记录在Molecular Devices SpectraMax M3分光光度计上。NMR实验是在Bruker 500MHz光谱仪上得到的，对1H和13C核分别在500MHz和125MHz下操作。使用配备有用于溶剂递送的Agilent 1260HPLC系统的Agilent 6530Q-TOF质谱仪，利用正离子模式下的电喷雾电离源，测定准确质量。快速色谱在Reveleris X2制备型色谱系统上进行。
溶剂为分析级质量或更高。水在使用前经玻璃蒸馏。除非另有说明，否则溶剂混合物以％vol/vol报告。用Supelco Diaion HP-20聚(苯乙烯-二乙烯基苯)共聚物(PSDVB)进行反相色谱。使用Silicycle SiliaFlash F60硅胶(40-63m)进行干式加载。用于快速色谱的预装硅胶柱是从Silicycle获得的。从获得不锈钢半制备柱(二氧化硅，250×10mm，10μm)。TLC在0.2μm硅胶(60F254)预包被板上使用5％v/v硫酸的甲醇溶液+0.1％w/v香兰素的乙醇溶液进行，然后加热观察。/>
实施例1：分离巴拉烯酮(100g植物材料规模)
将新鲜冷冻的阔叶蜜茱萸茎皮(100g)切成小块(2cm3)，并在200mL甲醇中浸泡18h。过滤甲醇(第一萃取物)，并将树皮材料在200mL甲醇中再浸泡18h。过滤甲醇(第二萃取物)，并通过100mL PSDVB(HP-20，Supelco)柱，其中重力和流速限制为2mL/min。
然后将第一萃取物以类似方式通过同一柱，并合并洗脱液。将400mL H2O添加到洗脱液中，然后再次以相同速率通过PSDVB柱。所得的洗脱液(800mL)用另外的800mL水稀释，并通过同一柱。然后将柱洗脱，其中流速限制在约2mL/min，含300mL等份试样：水(已丢弃)，i)20％丙酮/水，ii)40％丙酮/水，iii)60％丙酮/水，iv)80％丙酮/水，v)丙酮。
60％丙酮/水级分用300mL水稀释，并通过50mL PSDVB(HP-20)床。洗脱液进一步用600ml水稀释，通过同一PSDVB床并弃掉洗脱液。用少量压缩空气排空柱中的液体，并用150mL丙酮洗脱。将所得洗脱液蒸发至干。
级分iii)(60％丙酮/水)主要为巴拉烯酮和哈福丁，以及少量相关倍半萜。在硅胶上纯化巴拉烯酮：将2g的60％丙酮级分溶于3mL的1:1甲醇的二氯甲烷溶液，并蒸发至4g的硅胶上。将加载的硅胶置于干式加载柱中，并置于40g硅胶柱的上游。用石油醚洗脱柱，并在15柱体积上使用0-50％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱。首先洗脱次要相关的倍半萜(0-5％乙酸乙酯/石油醚)，然后洗脱纯巴拉烯酮(10-30％乙酸乙酯/石油醚)，最后洗脱哈福丁(>30％乙酸乙酯/石油醚)。
实施例2：分离巴拉烯酮(600g植物材料规模)
用甲醇(2×1.2L)萃取阔叶蜜茱萸的茎皮(600g，新鲜冷冻)过夜并过滤。将第二和第一萃取物通过在甲醇中预平衡的500mL PSDVB床。来自此步骤的合并洗脱液连续用水(2倍体积)稀释，并通过同一柱，直到最终溶液浓度达到25％甲醇/水。用水(1.5L，用上样洗脱液收集)洗涤柱，然后用1.5L份的i)20％丙酮/水、ii)40％丙酮/水、iii)60％丙酮/水、iv)80％丙酮/水和v)丙酮洗脱。
使用硅胶(40g)快速色谱[石油醚/乙酸乙酯，0-60％16柱体积(CV)，60-100％3CV，100％，2.9CV，甲醇0.4CV]纯化2g份浓缩的60％丙酮/水级分(级分iii)。巴拉烯酮与哈福丁(35-40％石油醚/乙酸乙酯)一起以20-25％石油醚/乙酸乙酯洗脱。
实施例3：分离反式-巴拉烯酮和顺式-巴拉烯酮
汇集根据实施例1中所述的方法获得的富含巴拉烯酮的级分，并使用3:1石油醚/乙醚的等度混合物，在硅胶上进行色谱(10×150mm，10m，流速5mL/min)。反式-巴拉烯酮(式(Xa)的化合物)在12.4min洗脱，而顺式-巴拉烯酮(式(Xb)的化合物)在15.2min洗脱。
顺式-巴拉烯酮被分离为无色光学活性固体([a]20D+575)。由NMR实验数据(表2)阐明的精确质量测定和组成结构的分子式与反式-巴拉烯酮的分子式相同。尽管顺式-巴拉烯酮的绝对构型尚未确定，但作为反式-巴拉烯酮的非对映异构体，他必须在H-1和H-10之间具有顺式关系。
实施例4：反式-巴拉烯酮的结构阐明
反式-巴拉烯酮以旋光性无色油([α]20 D+171)的形式存在。C15H18O2的分子式由高分辨率质谱(m/z 231.1383[M+H]+，计算值231.1380)获得，其需要七个不饱和度。反式-巴拉烯酮的13C NMR谱含有所有15个必需的共振。13C的分析，DEPT和HSQC NMR实验鉴定出15个碳进一步分解为三个甲基(δC23.2,10.7,9.2)、三个亚甲基(δC 42.0,26.6,34.3)、三个次甲基(137.8,48.4,42.1)和六个非质子化碳(δC 209.2,164.8,156.6,135.9,120.4,118.7)。建议的分子式所需的所有18个氢均与碳相连，这表明不存在可交换的质子。NMR数据总结在表2中。
COZY和HMBC实验建立了三个主要的亚结构。下面示出用于建立反式-巴拉烯酮平面结构的相关性，并使用结构I中所示的编号进行详细说明。
第一个亚结构是由C-11(δC 120.4)、CH-12(δH 7.06,1JCH 200Hz；δC 137.8)和CH3-13(δH 1.89；δC 9.8)组成的乙烯基片段，并通过HMBC认可了从H3-13至C-11和C-12的相关性。第二个亚结构被确定为2-甲基丙烯酰基片段，如通过从CH3-14(1.73；/>10.7)至C-3(/>209.2)C-4(δC 135.9)和C-5(δC 164.8)的HMBC相关性所证实。第三个亚结构为1,2,5-三取代的3-甲基戊基单元，由CH2-2(/>2.26,2.67；/>42.0)、CH-1(δH 2.52；/>48.4)、CH-10(δH 1.58；δC42.1)、CH2-9(δH 1.60,1.86；δC 34.3)和CH2-8(δH 2.73,2.81；/>26.6)组成CH3-15(δH 1.08；δC 23.2)的连接通过与H-10的COZY相关性和HMBC与C-1、C-9和C-10的HMBC相关性确定。
反式-巴拉烯酮的相对构型通过分析标量耦合常数和NOE相关数据来确定。H-1与H-9a以及H-10与H-8a之间的NOE相关性均表明围绕七元环的1,3-伪轴取向。这些相关性将CH3-15置于H-1和H-9b伪赤道，并部分由H-1和H-10之间9.7Hz的邻偶耦合常数所支持，表明这两个质子具有反关系。
在分离过程中，部分纯化的反式-巴拉烯酮样品被氧化成另一物质。此化合物的平面结构与三叶蜜茱萸酮B(7b)一致，他是Wu等人1988年从三叶蜜茱萸(M.triphylla)首先描述的倍半萜。谱细节是相同的，表明由Wu等人通过单晶X射线衍射分析建立的相同的相对构型。我们实验得出的7b([α]20 D–199)的比旋度与文献{[α]25 D–38(c 0.854,CHCl3)}中描述的信号相同。由此得出结论，反式-巴拉烯酮和7b在其保守的立体定位中心具有相同的绝对构型。
反式-巴拉烯酮的绝对立体化学通过反式-巴拉烯酮衍生物的X射线晶体学确定。在狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)环加成实验(室温下于乙醇中)中，将反式-巴拉烯酮(式Xa)与马来酰亚胺反应。检测到四种反应产物-其中一种(9)被分离为结晶固体(方案2)。此加合物的X射线结构(图10)证实了天然产物(反式-巴拉烯酮)中H-1和H-10之间的反关系，并确定了所示的绝对构型(1R,10S)。
通过与反式-巴拉烯酮的比较阐明了顺式-巴拉烯酮的相对立体化学。
表征数据
反式-巴拉烯酮(Xa)：无色油；[α]20 D+171(c 0.5,CHCl3)；UV(MeOH)λmax/nm244(3.99),280(3.80)；NMR(CDCl3,500MHz)参见表2；HRESIMS m/z 231.1383[M+H]+,C15H19O2的计算值为231.1380。
三叶蜜茱萸酮B(7b)：无色半结晶固体；[α]20 D–199(c 1,CHCl3)；NMR数据如Wu等人先前所述。
哈福丁(3)：无色结晶固体；HRESIMS m/z 277.0715[M+H]+(C14H13O6的计算值为277.0707)。
顺式-巴拉烯酮(Xb)：无色固体；[α]20 D+575(c 1,CHCl3)；UV(MeOH)λmax/nm226(3.76),256(3.76),298(3.71)；NMR(CDCl3,500MHz)参见表3；HRESIMS m/z 231.1379[M+H]+(C15H19O2的计算值为231.1385)。
表2：反式-巴拉烯酮(Xa)的NMR数据(CDCl3，500MHz)
表3.顺式-巴拉烯酮(Xb)的NMR数据(CDCl3，500MHz)。
实施例5：巴拉烯酮和阔叶蜜茱萸树皮萃取物的抗菌活性
将使用实施例1中概述的纯化方法获得的阔叶真叶菌树皮的粗(第一甲醇)萃取物和五个色谱级分提交给TLC生物自显影研究，以定性地确定抗菌活性。
简言之，通过将样品加载到硅胶TLC板上来制备参考板，该硅胶TLC板使用建立的溶剂系统(10％乙酸乙酯的石油醚溶液)显影以基于极性分离他们的组分。然后使用5％v/v硫酸的甲醇溶液+0.1％w/v香兰素的乙醇溶液，接着加热对显影的板可视化。使用这种方法，将巴拉烯酮区分为亮的粉红色到红色的斑点(参见图7)。
然后使用相同的溶剂系统制备并显影此板的多个副本，但替代为通过倒入用以下一种微生物(见下文)接种/加标的琼脂进行可视化，然后在用还原染料可视化之前进行孵育。这些样品中展现出抑制区的化合物被认为具有抗菌活性。
测试的革兰氏阳性生物体(3)：
金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌
测试的革兰氏阴性生物体(2)：
铜绿假单胞菌、大肠杆菌
关于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的结果示于图8和图9。没有发现萃取物对铜绿假单胞菌具有活性。
这些结果表明，已知含有巴拉烯酮的样品显示出对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抗菌活性，抑制区的保留因子看起来与参比板中巴拉烯酮的亮粉红色斑点特征大致相同。没有观察到对任何革兰氏阴性生物体的活性。
不含巴拉烯酮(20％和40％丙酮/水级分)的样品显示对任何所选生物均无活性(未显示)。
工业应用
本发明的化合物和组合物可用作抗生素。本领域技术人员将理解，以上描述仅作为示例提供，并且本发明不限于此。
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Claims (15)

1.一种式(X)的分离的生物活性化合物
2.一种式(Xa)的分离的生物活性化合物
3.一种式(Xb)的分离的生物活性化合物
4.一种获得权利要求1所述的化合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a) 用甲醇萃取阔叶蜜茱萸的树皮；
(b) 使过滤的萃取物通过已在甲醇中预平衡的PSDVB柱；
(c) 将洗脱液与等体积的水合并，并使其通过同一PSDVB柱；
(d) 用水洗涤所述柱；
(e) 用i)级分A：20%丙酮的水溶液、ii)级分B：40%丙酮的水溶液、iii)级分C：60%丙酮的水溶液、iv)级分D：80%丙酮的水溶液和v)级分E：丙酮洗脱吸附的萃取物的化合物；
(f) 收集级分C和/或D以提供权利要求1所述的化合物的纯化的组合物；以及
(g) 通过硅胶快速色谱纯化级分C和/或D以获得权利要求1所述的化合物。
5.一种获得权利要求2或权利要求3所述的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a) 用甲醇萃取阔叶蜜茱萸的树皮；
(b) 使过滤的甲醇萃取物通过已在甲醇中预平衡的PSDVB柱；
(c) 将洗脱液与等体积的水合并，并使其通过同一PSDVB柱；
(d) 用水洗涤所述柱；
(e) 用i)级分A：20%丙酮的水溶液、ii)级分B：40%丙酮的水溶液、iii)级分C：60%丙酮的水溶液、iv)级分D：80%丙酮的水溶液和v)级分E：丙酮洗脱吸附的萃取物的化合物；
(f) 收集级分C和/或D以提供纯化的巴拉烯酮的组合物；
(g) 任选地，使用0-100%的乙酸乙酯的石油醚溶液梯度通过硅胶快速色谱进一步纯化级分C和/或D以获得巴拉烯酮，以及
(h) 在硅胶快速色谱上分离巴拉烯酮的非对映异构体以获得权利要求2或权利要求3所述的化合物。
6.一种权利要求1-3中任一项所述的化合物的纯化的组合物。
7.如权利要求6所述的纯化的组合物，其包含至少60 wt%的权利要求1-3中任一项所述的化合物。
8.如权利要求7所述的纯化的组合物，其包含至少95 wt%的权利要求1-3中任一项所述的化合物。
9.如权利要求6至8中任一项所述的纯化的组合物，其包含小于2 wt%的哈福丁。
10.一种获得权利要求6所述的纯化的组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a) 用甲醇萃取阔叶蜜茱萸的树皮；
(b) 使过滤的萃取物通过已在甲醇中预平衡的PSDVB柱；
(c) 将洗脱液与等体积的水合并，并使其通过同一PSDVB柱；
(d) 用水洗涤所述柱；
(e) 用i)级分A：20%丙酮的水溶液、ii)级分B：40%丙酮的水溶液、iii)级分C：60%丙酮的水溶液、iv)级分D：80%丙酮的水溶液和v)级分E：丙酮洗脱吸附的萃取物的化合物；
(f) 收集级分C和/或D以提供权利要求6所述的纯化的组合物。
11.一种药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
12.一种药物组合物，其包含权利要求6至9中任一项所述的纯化的组合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
13.权利要求1至3中任一项所述的化合物在制备用于治疗有需要的个体中的细菌感染的药物中的用途。
14.权利要求6至9中任一项所述的纯化的组合物在制备用于治疗有需要的个体中的细菌感染的药物中的用途。
15.如权利要求13或权利要求14所述的用途，其中所述细菌感染是革兰氏阳性细菌感染。
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