KR20210052731A - 블랙베리 추출물을 포함하는 지방간, 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 개선용 조성물 - Google Patents

블랙베리 추출물을 포함하는 지방간, 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 개선용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 지방간, 당뇨병, 비만 또는 대사증후군의 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 간세포 내 지방 축적을 억제하고, 혈당을 조절하며, 체중 증가를 억제함으로써 지방간, 당뇨병, 비만 및 대사증후군에 대하여 개선효과를 나타낸다.

Description

블랙베리 추출물을 포함하는 지방간, 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 개선용 조성물{Composition for preventing or improving fatty liver, diabetes or obesity comprising blackberry extract}
본 발명은 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 지방간, 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
경제발전에 따른 생활수준의 향상으로 위생환경이 개선되고 인스턴트 음식물의 잦은 섭취와 육식 위주의 식생활 변화는 체내에 과다한 열량 에너지의 축적을 유발한다. 이러한 식생활 변화에 운동부족으로 인한 열량 에너지 소모의 감소까지 더해져 비만 인구가 빠르게 증가하고 있다.
이처럼, 체내에 과다하게 축적된 열량 에너지는 비만 뿐 아니라 지방간, 고지혈증, 고혈압 등을 포함한 대사증후군을 유발한다.
비만은 21세기 들어 단일 질환으로서는 가장 위험하고 치사율이 높은 병에 해당한다. 그 이유는 비만이 비만 그 자체로도 위험하지만 지방조직에 의한 복부의 압박으로 인하여 변비와 소화불량, 위장 장애 등을 일으키는 경우가 많고 다른 여러 가지 다양한 질병의 위험도를 유의적으로 높이기 때문이다. 비만으로 위험도가 증가하는 질환으로는 대표적으로 제2형 당뇨, 고혈압, 관상 동맥 질환, 뇌졸중 및 각종 암이다.
지방간은 간 세포에 중성지방이 축적되는 질병으로, 비만, 대사증후군과 같은 에너지 과잉 상태나 과다한 알코올의 섭취에 의해 발생한다. 지방간이 지속되면 지방간염, 간경화 및 간암 까지도 이어지는 일련의 질환을 유발할 수 있다.
다양한 질환의 원인이 될 수 있는 대사증후군을 개선시키기 위한 필요성이 증대되고 있다. 대사증후군의 약물을 이용할 수 있으나, 시중에 유통되고 있는 약물은 그 부작용이 나타나는 문제점이 있다. 현재까지 비만, 지방간의 약물치료에 쓰이는 많은 제품들이 부작용을 나타내고 있으며 사회적으로도 많은 심각성을 나타내고 있음이 주지의 사실이다.
따라서, 이들 제제를 대신할 의약품 및 천연물이 함유된 기능성 식품 등의 개발에 대한 요구가 커지고 있다.
본 발명자들은 간 내 지방 축적을 억제하는 효과를 갖는 천연물 소재를 찾고자 위해 노력한 결과, 블랙베리 열매 추출물과 잎 추출물의 조합이 각각의 단일 추출물과 비교하여 보다 효과적으로 간에서 지방 축적을 억제하고, 지방 생성 관련 유전자의 발현을 억제하며, 체중 증가를 억제하고 혈당을 감소시킴으로써 지방간, 비만 및 당뇨병에 대하여 개선 효과를 나타냄을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 당뇨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항비만용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 대사증후군의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 간 내 지방 축적을 억제하는 효과를 갖는 천연물 소재를 찾고자 위해 노력한 결과, 블랙베리 열매 추출물과 잎 추출물의 조합이 각각의 단일 추출물과 비교하여 보다 효과적으로 간에서 지방 축적을 억제하고, 지방 생성 관련 유전자의 발현을 억제하며, 체중 증가를 억제하고 혈당을 감소시킴으로써 지방간, 비만 및 당뇨병에 대하여 개선 효과를 나타냄을 규명하였다.
블랙베리(Rubus fruticosus. L)는 라즈베리(raspberry)와 같이 나무딸기류(brambles)의 한 종류로 관목성 식물이다. 우리나라의 자생종 복분자(R. coreanus) 및 주요 재배 복분자(black raspberry; R. occidentalis)와는 다른 종으로 주로 북미및 유럽에서 야생종을 개량하여 품종화가 이루어졌으며, 식음료 및 잼 등 가공용과 생식용으로 이용되고 있다.
상기 블랙베리 열매 추출물은 블랙베리 열매를 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 추출물일 수 있다.
상기 블랙베리 잎 추출물은 블랙베리 잎을 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 추출물일 수 있다.
본 발명의 블랙베리 추출물 제조에 사용되는 용매로 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에 상기 용매는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 60%이상 내지 100%(v/v)미만, 70%이상 내지 100%(v/v)미만, 10%이상 내지 90%(v/v)미만, 20%이상 내지 90%(v/v)미만, 30%이상 내지 90%(v/v)미만, 40%이상 내지 90%(v/v)미만, 50%이상 내지 90%(v/v)미만, 60%이상 내지 90%(v/v)미만 또는 60%이상 내지 80%(v/v)미만의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액, 예를 들어, 50%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있다.
또한, 상기 알코올 수용액은 메탄올 수용액, 에탄올 수용액, 프로판올 수용액 및 부탄올 수용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어, 에탄올 수용액인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 블랙베리 추출물은 용매 조추출물을 추가의 용매로 분획한 용매 분획물일 수 있으며, 예를 들어, 상기 용매 조추출물에 에틸에테르, 아세트산에틸 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.
예를 들면, 상기 블랙베리 열매 및/블랙베리 잎을 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물을 에틸에테르, 아세트산에틸 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.
본 발명에 사용된 추출 방법은 통상적으로 사용되는 모든 방법일 수 있으며, 예컨대, 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 또는 환류 냉각 추출법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어, '추출물'은 용매 조추출물, 특정 용매 가용 추출물(용매 분획물) 및 용매 조추출물의 용매 분획물을 포함하며, 상기 블랙베리 추출물은 용액, 농축물 및/또는 분말 상태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 내의 유효성분으로서의 추출물 함량은 사용 형태 및 목적, 사용자의 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 또는 0.1 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%, 또는 0.1 내지 40 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 간세포 내 지방축적을 억제하고, 간 조직에서 지방 생성에 관여하는 유전자의 발현을 억제하여 지방간, 특히 비알콜성 지방간에 대하여 개선 효과를 나타낸다.
본 발명의 조성물은 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 1:2 내지 1:3의 중량비로 혼합한 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 1:2의 중량비로 혼합한 혼합물을 포함할 수 있다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물의 혼합물은 비알코올성 지방간에 대한 건강기능성 식품으로 알려진 밀크시슬과 비교하여 보다 우수한 지방간 치료 효과를 나타냈고, 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물 각각의 단일 추출물과 비교하여 지방간에 대해 증가된 치료 효과를 나타냈으며, 특히 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 1:2의 중량비로 혼합한 경우, 가장 우수한 효과를 나타냈다.
본 명세서에서 용어, "지방간(fatty liver)"은 정상 간에서 지방이 차지하는 비율(5%)보다 많은 양의 지방이 간에 축적된 증상을 의미한다. 상기 지방간은 크게 과음으로 인한 알코올성 지방간과 비만, 당뇨병, 고지혈증 또는 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간으로 분류될 수 있다. 알코올성 지방간은 알코올을 많이 섭취하게 되면 간에서 지방 합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않아 발생하고, 비알코올성 지방간은 알코올 이외의 원인으로 인하여 발생하며, 상기 비알코올성 지방간은 지방 대사의 이상을 초래하는 성인병에 동반되는 경우가 빈번한 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, "비알코올성 지방간"이란, 알코올 이외의 원인으로 인하여 발생하는 지방간을 의미한다. 이는 전체 지방간의 약 57%를 차지하고, 대체로 지방 대사의 이상을 초래하는 성인병에 동반되는 경우가 빈번한 것으로 알려져 있다. 이러한 성인병에 동반되는 원인 중 하나는 과도한 탄수화물의 섭취 및 이로 인하여 발생하는 비만인 것으로 알려져 있으며, 실제로 비알코올성 지방간이 발병된 환자의 약 75%가 비만환자라고 보고된 바 있다.
본 발명의 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물은 유효성분으로서 블랙베리 추출물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 블랙베리 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품 조성물로 제조될 수 있다.
상기 건강기능식품은 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 블랙베리 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마린, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파탐 등)을 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 당뇨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
당뇨병의 요인은 유전적 요인과 환경적 요인이 있으며 제1형 당뇨병(인슐린 의존형)은 주로 면역학적 기전에 의해 췌장베타세포가 파괴되어 인슐린 분비가 일어나지 않는 병이고, 제2형 당뇨병(인슐린비의존형)은 체내에서 인슐린이 생산되지만 인슐린 저항성이 증가하는 병으로 당뇨 환자의 90-95%를 차지한다.
본 발명의 조성물은 혈당 감소 효과를 나타내며, 인슐린 저항성을 감소시킴으로 당뇨병, 예를 들어, 제2형 당뇨병에 대하여 예방 또는 개선 효과를 나타낸다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 조성물을 고지방 고콜레스테롤 식이를 공급한 백서에게 투여한 경우, 공복 혈당에는 영향을 미치지 않았으나 혈청 인슐린 농도를 감소시켜 HOMA-IR을 감소시키므로, 체내 인슐린 저항성을 억제하는 것으로 나타났고, 경구내당을 감소시키는 것으로 나타났다. 본 발명의 조성물은 혈당 조절에 영향을 미치므로 당뇨병의 예방 또는 개선용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 항비만용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 "비만"이란 체내에 지방 또는 지방세포가 과다하게 축적된 상태를 의미하며, 상기 "항비만"이란 상기 "비만"상태를 개선하거나 예방하는 것을 의미한다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물의 혼합물은 고지방 고콜레스테롤 식이에 따른 체중 증가 및 내장 지방 증가를 효과적으로 억제하였으며, 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물 각각의 단일 추출물과 비교하여 우수한 체중 증가 및 내장 지방 증가 억제 효과를 나타냈다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 대사증후군의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 체중 증가를 억제시키고, 혈청 중성지방 및 총 콜레스테롤의 함량을 감소시키며, 간세포 내 지방축적을 억제시키고, 혈당을 감소시키므로 대사증후군에 대하여 개선 효과를 나타낸다.
본 명세서에서 용어, "대사증후군(또는 대사성 질환)"이란 비만, 지방간, 당뇨, 이상지질혈증과 같은 위험 인자가 함께 나타나는 질환을 의미한다. 일반적으로, 1) 허리둘레가 남자 90 cm 이상, 여자 85 cm 이상인 복부 비만, 2) 중성지방(triglycerides) 150 mg/dL 이상 또는 치료제복용, 3) HDL 콜레스테롤이 남자 40 mg/dL 미만 또는 치료제복용, 여자 50 mg/dL 미만 또는 치료제복용, 4) 혈압 130/85 mmHg 이상 또는 고혈압 치료제 복용, 5) 공복혈당(fasting glucose)이 100 mg/dL 이상 또는 제2형 당뇨병의 다섯 가지 위험인자 중 한 환자가 세 개 이상을 나타낼 경우 대사증후군으로 판정하게 된다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 항비만용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물의 약제학적 유효량 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "약제학적 유효량"은 상술한 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연고제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-1000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서는 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 지방간, 당뇨병, 비만 또는 대사증후군을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "치료"는 지방간, 당뇨병, 비만 또는 대사증후군의 경감 또는 제거를 의미한다.
본 발명의 상기 약제학적 조성물은 상기 식품 조성물과 동일한 유효성분을 포함하므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명은 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 지방간, 당뇨병, 비만 또는 대사증후군의 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 간세포 내 지방 축적을 억제하고, 혈당을 조절하며, 체중 증가를 억제함으로써 지방간, 당뇨병, 비만 및 대사증후군에 대하여 개선효과를 나타낸다.
도 1은 간세포에 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합 및 팔미트산을 처리하고 세포 독성을 측정한 결과이다.
도 2a는 간세포에 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합 및 팔미트산을 처리하고 중성지방량을 측정한 결과이다.
도 2b는 간세포에 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합 및 팔미트산을 처리하고 ACC, FAS, SREBP-1c 및 CPT-1 유전자의 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 3은 간세포에 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합 및 팔미트산을 처리하고 MDA 양, SOD 활성 및 GSH-Px 활성을 측정한 결과이다.
도 4는 간세포에 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합 및 팔미트산을 처리하고 TNF-α 및 IL-1β의 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 5는 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합의 비알코올성 지방간 유발 억제 효과를 평가하기 위한 동물실험 디자인을 나타낸다.
도 6a는 동물실험 기간 동안의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 지방간 실험 동물에 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합을 투여하고 지방량을 측정한 결과이다.
도 7은 지방간 실험 동물에 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합을 투여하고 지방산 합성에 관련된 mRNA 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 8은 지방간 실험 동물에 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합을 투여하고 AST 및 ALT 활성을 측정한 결과이다.
도 9a는 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합을 투여한 지방간 실험 동물의 간을 H&E 염색한 결과이다.
도 9b는 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합을 투여한 지방간 실험 동물의 간을 PAS 염색한 결과이다.
도 9c는 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합을 투여한 지방간 실험 동물의 간에 대한 H&E 및 PAS 염색 결과를 분석한 그래프이다.
도 10은 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합을 투여한 지방간 실험 동물에서 혈중 글루코오스, 인슐린 레벨 및 HOMA-IR을 측정한 결과이다.
도 11a는 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합을 투여한 지방간 실험 동물에서 OGTT 동안 혈중 클루코오스 레벨을 측정한 결과이다.
도 11b는 도 11a 결과에 대한 곡선하면적(Area under the curve, AUC) 값을 나타낸다.
도 12a는 블랙베리 열매 추출물, 블랙베리 잎 추출물 또는 이의 조합을 투여한 지방간 실험 동물에서 IPITT 동안 혈중 클루코오스 레벨을 측정한 결과이다.
도 12b는 도 12a 결과에 대한 곡선하면적 값을 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 블랙베리 추출물의 제조 및 지표성분 분석
1-1. 블랙베리 추출물의 제조
건조한 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 열매 및 잎을 각각 분말화하고, 분말에 50% 에탄올을 20배수 첨가하고 92℃에서 4시간 동안 추출하였다. 회전증발기를 이용하여 40℃에서 추출물을 농축한 다음, 동결건조하였다.
1-2. 블랙베리 추출물의 지표성분 분석
블랙베리 열매 추출물 및 잎 추출물의 지표 성분을 분석하기 위해 HPLC를 실시하였다. 블랙베리 열매에 대한 지표물질로 시아니딘-3-글루코사이드(cyanidin-3-glucoside), 블랙베리 잎에 대한 지표물질로 엘라그산(ellagic acid)을 사용하였다.
HPLC 결과, 블랙베리 열매 및 잎에 대한 50% 에탄올 추출물은 각각 12 ± 0.4 mg의 시아니딘-3-글루코사이드 및 28.3 ± 1.2 mg의 엘라그산을 포함하는 것으로 확인되었다.
실시예 1. 블랙베리 추출물의 간세포 보호 효과
간암 세포주 HepG2에 블랙베리 열매 추출물(BF), 블랙베리 잎 추출물(BL) 또는 이의 조합{블랙베리 열매 추출물 및 잎 추출물의 비율 = 1:2(BFL1:2), 1:3(BFL1:3), 및 1:5(BFL1:5)}을 30 또는 90 μg/mL 처리하였다. 양성대조군으로는 50% 에탄올 밀크씨슬추출물을 사용하였다. 블랙베리 추출물을 처리하고 1시간 후 0.5 mM의 팔미트산(palmitate)을 HepG2 세포에 첨가하고 추가로 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 세포 생존율을 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 어세이로 측정하였다.
팔미트산을 처리하지 않은 군(정상 대조군)에 비해 팔미트산을 처리한 군(대조군)에서 세포 생존이 감소하였다(도 1). BF 및 BL은 팔미트산에 의한 세포 사멸에 대해 용량 의존적으로 보호 효과를 나타냈으며 BL(30 및 90 μg/mL)은 BF보다 높은 세포 보호 활성을 나타냈다. BFL1:2, BFL1:3, BFL1:4 및 BFL1:5는 용량 의존적으로 세포 생존율을 개선시켰으며, BFL1:2 및 BFL1:3은 세포 손상으로부터 세포를 보호하는데 가장 효과적이었다.
실시예 2. 중성지방 축적 및 지방산 합성과 분해에 관여하는 유전자의 발현 분석
2-1. 중성지방 축적 억제
팔미트산 처리에 의해 HepG2 세포에서 TG(triglyceride) 축적이 증가하였다. BF, BL 또는 BFL은 팔미트산에 의한 TG 축적을 농도의존적으로 억제하였고, BL이 BF에 비해 팔미트산에 의한 TG 축적을 효과적으로 억제하였다. BFL1:2가 가장 효과적으로 팔미트산에 의한 TG 축적을 억제하였다(도 2a). 처리 농도가 높을 때 더 효과적으로 중성지방의 축적을 억제하였다.
2-2. 지방산 합성과 분해에 관여하는 유전자의 발현 분석
HepG2 세포에 블랙베리 추출물을 처리한 다음 총 RNA 분리하여 cDNA를 합성한 다음, 간에서 지방산 합성 및 산화에 관련된 유전자의 발현을 다음의 프라이머를 이용하여 측정하였다.
유전자 프라이머 서열(5'-3') 서열번호
SREBP-1c 정방향 GGAGCCATGGATTGCACATT 1
역방향 AGGAAGGCTTCCAGAGAGGA 2
ACC 정방향 GGAAGATGGTGTCCCGCTCTG 3
역방향 GGGGAGATGTGCTGGGTCAT 4
FAS 정방향 AGGTGCTAGAGGCCCTGCTA 5
역방향 GTGCACAGACACCTTCCCAT 6
CPT-1 정방향 CTCCTGAGCAGTTACCAATGC 7
역방향 GAACCTTGGCTGCGGTAAGAC 8
β-액틴 정방향 AAGTCCCTCACCCTCCCAAAAG 9
역방향 AAGCAATGCTGTCACCTTCCC 10
ACC(acetyl CoA carboxylase), FAS(fatty acid synthase), 및 SREBP-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c)의 발현은 지방산 합성과 관련되어 있고, CPT-1(carnitine palmitoyl transferase-1)의 발현은 지방산 산화와 관련되어 있다.
ACC의 mRNA 발현은 대조군과 비교하여 정상 대조군에서 감소되었고, BL, BF, BFL1:2 및 BFL1:3 처리군에서도 감소되었다. BF에 의한 ACC의 mRNA 발현 감소는 BL과 비교하여 낮은 수준이었다. FAS 및 SREBP-1c의 mRNA 발현도 ACC와 유사한 패턴을 나타냈다. FAS 및 SREBP-1c의 mRNA 발현은 대조군, BF, BL, BFL1:3, BFL1:2 및 정상 대조군의 내림차순으로 감소되었다. CPT-1의 mRNA 발현은 FAS의 mRNA 발현과 반대였으며, 대조군에서 정상 대조군보다 낮은 발현 수준을 나타냈다. CPT-1 mRNA 발현은 대조군, BF, BL, BFL1:2, BFL1:3 및 정상 대조군의 오름차순으로 증가하였다(도 2b).
실시예 3. 염증 및 산화스트레스 관련 단백질 및 유전자의 발현 분석
3-1. 산화스트레스 관련 단백질의 발현 분석
HepG2 세포에 팔미트산과 블랙베리 추출물을 처리한 다음, 지질과산화(Malondialdehyde, MDA)를 TBARS(thiobarbituric acid reactive substance) 어세이 키트(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 측정하였다. SOD(superoxide dismutase) 및 GSH(glutathione)-퍼옥시다아제(peroxidase)의 활성은 비색법 키트(각각 Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA 및 Biovision, Milpitas, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 각 효소의 활성 단위는 반응을 약 50% 억제하는데 필요한 SOD 양으로 정의하였다. 간에서 GHS 레벨은 GSH 어세이 키트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 결정하였다.
팔미트산 처리에 의한 세포 손상은 증가된 산화 스트레스 및 염증과 관련이 있다. 지질과산화물의 축적을 나타내는 MDA 수준은 정상 대조군과 비교하여 팔미트산(대조군)에 의해 손상된 HepG2 세포에서 대략 2.5 배 높았다(도 3). HepG2 세포의 MDA 함량은 정상 대조군과 비교하여 대조군에서 증가하였고, BL 및 BF 처리군은 대조군과 비교하여 MDA 증가를 억제하였다. BFL1:2는 MDA 증가를 가장 억제하였다. SOD 및 GSH-Px 수준은 정상대조군과 비교하여 대조군에서 감소되었다. BF 및 BL은 SOD 및 GSH-Px 활성을 증가시켰다. BFL1:2에서 SOD 및 GSH-Px 활성이 가장 높게 나타났다.
3-2. 염증 관련 유전자의 발현 분석
HepG2 세포에 블랙베리 추출물을 처리한 다음 총 RNA 분리하여 cDNA를 합성한 다음, 간세포에서 염증 및 산화스트레스에 관련된 유전자의 발현을 다음의 프라이머를 이용하여 측정하였다.
유전자 프라이머 서열(5'-3') 서열번호
TNF-α 정방향 ACCCCCAACCTATGAAGAAA 11
역방향 TCCACGCAAAACGGAATGAA 12
IL-1β 정방향 TTGTGGCTGTGGAGAAGCTG 13
역방향 GCCGTCTTTCATACACAGG 14
정상대조군과 비교하여 대조군에서 전염증 사이토카인의 mRNA 발현이 증가되었다(도 4). TNF-α 및 IL-1β의 mRNA 발현은 대조군과 BL, BF, BFL1:2 및 BFL1:3에서 감소하였고, BFL1:2 및 BFL1:3에서 가장 낮은 수준을 나타냈다.
실시예 4. 블랙베리 열매 추출물 및 잎 추출물 조합의 비알코올성 지방간, 비만, 당뇨병 억제 효과
수컷 백서에게 고지방 고설탕 고콜레스테롤 식이에 블랙베리 열매 추출물 및 잎 추출물을 1:2로 혼합한 혼합물(BFL1:2)을 12주 동안 공급할 때 비알코올성 지방간의 유발을 억제시키는지 여부와 그 기전을 연구하였다.
총 12 주 동안 고지방 고설탕 고콜레스테롤 식이로 비알코올성 지방간을 유발하였다. 실험군은 표 3과 같이 분류하고 블랙베리 열매 추출물(BF), 블랙베리 잎 추출물(BL)은 각각 100 mg/kg BW를 공급하였고, 블랙베리 열매 추출물과 잎 추출물의 1:2 혼합물은 10 mg/kg BW(BFL-L), 30 mg/kg BW(BFL-M), 100 mg/kg BW(BFL-H)으로 공급하였다. 양성대조군은 비알코올성 지방간의 건강기능성 식품으로 인정받은 밀크씨슬을 30 mg/kg bw으로 공급하였다. 실험은 도 5의 실험 디자인에 따라 진행하였다.
동물실험 투여군 세부 내용
군 구분 식이 구분 내용 군 이름 투여 농도 (mg/kg BW)
정상 대조군 저지방 저콜레스테롤1) - Normal-
control		 -
실험 대조군 고지방 고콜레스테롤2) - Control -
양성 대조군 밀크씨슬 추출물 Positive-
control		 30
실험군 고지방 고콜레스테롤 블랙베리 추출 복합물3) BFL-L 10
블랙베리 추출 복합물 BFL-M 30
블랙베리 추출 복합물 BFL-H 100
블랙베리 잎 추출물 BL 100
블랙베리 열매 추출물 BF 100
1) 저지방 저콜레스테롤 식이 : 23% 지방, 0.5% 콜레스테롤
2) 고지방 고콜레스테롤 식이 : 45% 지방, 2.5% 콜레스테롤
3) 블랙베리 추출 복합물 : 블랙베리 열매 추출물과 블랙베리 잎 추출물 1:2 혼합물
표 4에 기술한 것처럼 간 조직 손상 정도, 간의 지방 축적 및 인슐린 저항성 정도, 과산화와 염증 정도를 측정하였다.
동물실험 결과 분석 파라미터
구분 세부 내용
간 조직 손상정도 · 혈청 ALT, AST, ALP, LDH 측정
· 간의 조직병리학적 변화 (H&E, PAS, toluidine blue staining)
간의 지방 축적 및 인슐린 저항성 정도 · 경구 당부하검사
· Insulin tolerance test
· 간, 혈액 내 인슐린, 글루카곤 측정
· HOMA-IR 측정
· 체중 및 지방량 측정
· 혈청과 간에서 TG, glycogen, TC, LDL, HDL 측정
· 지방 합성에 관여하는 유전자인 ACC, SREBP-1c, SCD-1 발현 측정
과산화와 염증 정도 측정 · 간 조직내 MDA 함량 측정
· 간 조직내 SOD, catalase mRNA 발현 측정
· 간 조직내 TNF-alpha, IL-6 mRNA 발현 측정
4-1. 체중 및 체지방 변화
실험이 진행되는 10주간 주 1회 백서의 체중을 측정하였고, 10 주 후 실험이 끝나고 백서를 마취하여 백서의 부고환 지방(epididymal fat)과 내장 지방(visceral fat) 양을 측정하였다.
비알코올성 지방간은 고지방 식이나 비만 등으로 간에 지방이 축적되는 것으로 고지방식이로 인한 비알코올성 지방간은 비만을 동반한다. 정상대조군에 비해 대조군은 12주 동안 100 g 이상 체중이 증가하였다(도 6a). 실험군들은 대조군에 비해 체중 증가를 억제시키는 경향을 보였고 BL과 BFL-L, BFL-M 투여군에서는 6주 이후부터 체중 증가가 저하되었다.
복부 지방을 나타내는 부고환 지방과 후복막 지방(retroperitoneal fat) 양의 합은 대조군이 가장 높았고, BFL-H > BF > BFL-L > BL > BFL-M의 순으로 낮았다. BFL-L과 BFL-H는 대조군보다 낮았고 이들은 양성대조군과 비슷하였다(도 6b).
4-2. 체구성 성분
체구성 성분을 조사하기 위해서 실험식이를 공급하기 전후에 DEXA로 골밀도(bone mineral density), 제지방체중(lean body mass) 및 지방량(fat mass)을 측정한 결과, 골반과 다리의 골밀도는 모든 군에서 유사하였고, 체중에 관계없이 유사한 값을 나타냈다(표 5).
제지방체중은 골반과 다리에서 모두 BL, BF, BFL군에서 높았으며, BF가 BL에 비해 높았다. 그러나 양성대조군은 대조군과 제지방체중의 차이가 없었다. 반면에 복부와 다리의 지방량은 대조군에 비해 실험군에서 모두 낮았으며 특히 BL에서 지방량이 낮게 나타났다. 결론적으로 대조군에 비해 BL, BFL-M이 체지방은 낮추고, 근육량인 제지방체중은 높여서 체구성 성분을 유지하는데 좋은 영향을 나타냈다.
대조군 BL BF BFL-L BFL-M BFL-H 양성대조군 정상대조군
요추 BMD 0.072±0.003 0.074±0.003 0.074±0.002 0.073±0.003 0.075±0.004 0.074±0.003 0.074±0.003 0.072±0.003
다리 BMD 0.102±0.005 0.101±0.006 0.103±0.005 0.103±0.005 0.104±0.005 0.104±0.004 0.101±0.007 0.102±0.005
엉덩이LBM 0.198±0.039d 0.261±0.041c 0.356±0.046a 0.245±0.030c 0.308±0.043b 0.339±0.044ab 0.242±0.032c 0.357±0.049a
다리 LBM 0.083±0.029d 0.128±0.031bc 0.144±0.036b 0.155±0.024b 0.201±0.031a 0.194±0.028a 0.118±0.022c 0.183±0.039a
복부 FM 1.387±0.088a 1.070±0.059c 1.213±0.075b 1.196±0.055b 1.107±0.071c 1.135±0.067bc 1.139±0.086bc 0.806±0.056d
다리 FM 0.894±0.071a 0.722±0.03b 0.745±0.059b 0.810±0.065ab 0.718±0.08b 0.765±0.071b 0.749±0.067b 0.419±0.073c
4-3. 간에 축적된 지방함량 및 지방산 대사에 관여하는 유전자 발현 측정
정상대조군에 비해 대조군에서 중성지방 축적량이 많았다. BL, BF 모두 간에서의 중성지방 축적을 감소시켰으며, BFL-M과 BFL-H에서도 간에서의 중성지방 축적량이 감소하였다(표 6).
BFL-M군은 양성대조군보다 간에 중성 지방 축적량이 낮은 경향을 나타냈다. 간에 축적된 글리코겐의 함량은 정상 대조군에 비해 대조군이 낮았는데 이것은 실험군들에서 모두 증가하였다. 특히 BL, BFL는 모두 대조군에 비해 현저하여 증가하였고, 양성대조군과 유사하였다.
대조군 BL BF BFL-L BFL-M BFL-H 양성대조군 정상대조군
정상대조군간 TG 358±11a 301±8c 300±8c 316±8bc 308±9c 310±10c 321±10b 241±9d
간 콜레스테롤 180±7a 150±6d 172±5a 174±8a 159±4c 166±6b 158±5c 147±5d
간 글리코겐 37.1±1.3d 44.2±2.4b 41.0±2.7c 43.1±1.3bc 45.8±2.6b 46.6±2.7b 43.9±3.0bc 52.1±4.7a
간에서 중성지방의 합성 및 분해에 관여하는 유전자인 CPT-1(Carnitine Palmitoyltransferase I), ACC(Acetyl-CoA carboxylase), FAS(fatty acid synthase) 및 SREBP-1c(Sterol regulatory element-binding protein 1)에 대한 발현 변화를 측정하였다. 지방산 합성 유전자인 ACC, FAS는 정상대조군에 비해 대조군에서 발현이 증가하였으나, BL, BFL군에서는 대조군에 비해 현저하게 감소하였고, 양성대조군과 유사한 수준을 나타냈다(도 7).
4-4. 간에서 글리코겐 함량
백서의 간 조직에 과염소산(perchloric acid)을 넣어 균질화시키고, 전처리하여 글루코오스 키트를 이용하여 글리코겐을 측정하였다. 전처리 후 spectrophotometer wave 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
정상대조군에 비해 대조군의 간에서 글리코겐 함량이 감소하였고, 실험군들에서는 대조군에 비해 글리코겐 함량이 증가하였다. BL이 BF에 비해 간에 저장된 글리코겐 함량이 증가하였고, 농도 의존적으로 BL과 BF의 혼합물이 간에 저장된 글리코겐의 함량을 증가시켰다(표 6).
4-5. 간의 과산화물 및 손상 정도
4-5-1. ALT 및 AST 양 측정
백서의 혈액과 간 조직을 용해시킨 후 상층액에 함유된 간 기능 관련 효소인 ALT(Alanine transaminase), AST(Aspartate transaminase) 양을 비색정량 키트로 측정하였다.
간의 손상 정도를 나타내는 혈청내 AST와 ALT의 활성을 조사하였을 때 정상대조군에 비해 대조군에서 혈청 ALT 활성이 현저하게 높았다. 혈청 ALT 활성은 실험군에서 감소하였고, 특히, BL, BF군에서 가장 낮았고 이것은 양성대조군보다 더 낮았다. BFL-L과 BFL-M에서는 혈청 ATL 활성이 대조군보다 낮게 나타났다(도 8).
혈청 AST 활성은 정상대조군에 비해 대조군에서 높았다. BL과 BFL에서 혈청 AST 활성은 농도 의존적으로 낮아졌고 이것은 양성 대조군에 비해 낮은 값을 나타냈다(도 8). 결과적으로 BFL-M이 가장 간의 손상을 줄일 수 있는 것으로 판단된다.
4-5-2. MDA 양 측정
백서의 간 조직을 용해시킨 후에 상등액에 TBA 용액(TBA 0.375%, trichloroacetic acid 15%, HCl 0.25 N)을 1:1(v:v)로 처리하여 비색정량으로 과산화물을 측정하였다.
정상대조군에 비해 대조군에서 지질의 과산화물 양을 나타내는 MDA 값이 2배 이상 높았다. 이 값은 모든 실험군에서 모두 낮아졌는데 특히, BFL-L과 BFL-M에서 낮았으며 그 값은 양성대조군보다도 더 낮았다(표 7).
4-5-3. SOD, GSH-Px 활성 측정
간 조직에 trizol을 처리한 후 총 RNA를 추출하고 poly A 프라이머로 PCR을 하여 cDNA를 제작하고 이 cDNA를 이용하여 SOD(superoxide dismutase)와 GSH-Px(glutathione peroxidase)의 mRNA 발현을 측정하였다.
간에서 과산화물의 양과 관련이 있는 항산화 관련 효소인 SOD, GSH-Px 등의 활성은 정상 대조군에 비해 대조군에서 활성이 감소하였으며 이를 통해 과산화물의 증가가 항산화 효소의 활성 저하와 관련이 있다는 것을 알 수 있다. 항산화 효소인 SOD1과 GSH-Px 활성은 대조군에 비해 실험군에서 증가하였는데 특히 BFL-M, BFL-H에서 가장 증가하였다. GSH-Px의 기질로 작용하는 GSH의 양이 항산화 상태를 잘 반영하는데 GSH의 함량도 정상대조군에 비해 대조군이 감소하였고, 실험군에서 증가하였는데 그 중에서도 BFL-M과 BFL-JH에서 가장 증가하였다(표 7).
4-5-4. TNF-α 농도 측정
간 조직에 trizol을 처리한 후 총 RNA를 추출하고 poly A 프라이머로 PCR을 하여 cDNA를 제작하고 이 cDNA를 이용하여 TNF-α의 mRNA 발현을 측정하였다.
염증 정도를 나타내는 혈청 TNF-a 농도도 정상대조군에 비해 대조군에서 현저하게 증가하였으며 이것도 BFL-M과 BFL-H군에서 가장 감소하였다(표 7).
구분 대조군 BL BF BFL-L BFL-M BFL-H 양성대조군 정상대조군
간 MDA (nmol/mg protein) 26.8±1.6a 23.3±2.2b 24.1±1.9b 22.3±1.3b 20.7±1.3c 19.3±1.8c 24.0±2.0b 24.3±2.2b
간 SOD
(U/mg protein)		 31.7±2.7c 36.5±3.1a 33.4±3.1b 33.8±3.0b 37.5±3.7a 36.7±3.0a 35.7±2.9ab 35.9±3.1ab
간 GSH 퍼옥시다아제
(U/mg protein)		 54.1±4.9b 65.7±5.3ab 61.5±5.5b 63.7±6.2b 68.6±5.6a 62.2±5.7b 65.1±5.3ab 64.7±5.8ab
간 GSH (umol/g protein) 20.5±1.8c 26.2±1.6b 25.7±2.1b 24.2±1.9b 28.5±2.3a 27.6±2.4a 27.2±3.1ab 28.9±2.9a
간 TNF-α (pg/g tissue) 9.8±0.9a 8.0±0.7bc 8.8±0.8b 8.5±0.9b 7.4±0.8c 7.7±0.8c 7.8±0.7c 6.8±0.7d
4-6. 간의 morphology
간 조직을 파라핀으로 고정 후 섹션하여 조직병리학적 변화를 관찰하였다. 간 조직의 파라핀 섹션에서 헤마토실린, 에오신 순으로 염색을 진행하였다. 이 방법으로 지방간 정도, 간세포 염증과 배열, 핵 크기(X 400배율)를 관찰하고 평가하였다. 또한, 간조직의 파라핀 섹션에서 0.5% periodic acid, schiff solution, 헤마토실린 순으로 염색을 진행하고 간에 함유된 글리코겐 함량을 평가하였다(X 25배율).
H&E로 간세포의 변형을 조사하여 간세포의 핵의 크기와 모양, 세포의 크기, 세포의 배열 등을 조사하여 간세포의 손상을 조사하였다. 정상대조군에 비해 대조군에서는 핵의 크기가 커지고 세포의 크기도 커지고, 배열이 비정상적으로 바뀌었고 대식세포의 수도 증가되었다(도 9a, 9c). BL과 BFL에서는 대조군에서 나타나는 핵의 크기, 세포 크기, 배열들이 정상화 현상이 나타났고, 대식세포 수가 감소하였다(도 9a, 9c). PAS 염색을 하여 글리코겐의 양을 조사한 결과, 정상대조군이 대조군에 비해 높았고, BL과 BFL가 대조군에 비해 글리코겐의 함량이 증가하였다(도 9b, 9c).
4-7. 혈청 지질
백서의 간 조직에 간 용해 버퍼를 넣어 용해하고, 균질화한 샘플을 전처리한 후 원심 분리하여 클로로포름 층을 얻었다. 클로로포름 층을 희석하여 TG 키트를 사용하여 전처리 후 spectrophotometer wave 546 nm에서 흡광도를 측정하였다. 백서의 혈청을 이용하여 혈청 TG를 측정하였다.
혈청에 존재하는 총 콜레스테롤은 비색정량 키트인 콜레스테롤 키트로 측정하였다. HDL 콜레스테롤은 VLDL 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤을 침전시킨 후 상등액에 존재하는 콜레스테롤의 함량을 비색 정량 콜레스테롤 키트로 측정하면 이것이 HDL 콜레스테롤이다. LDL-콜레스테롤은 Friedman 방법으로 계산하였다.
혈청 총 콜레스테롤 농도는 대조군에 비해 정상대조군에서 감소하였고, BL, BF과 BFL 모두 대조군에 비해 감소하였으며 BL, BF 및 BFL-H는 양성대조군보다 감소하는 경향을 나타냈다(표 8). 혈청 중성 지방농도도 대조군이 실험군들에 비해 높았으며 BL에서 가장 낮은 값을 나타냈다. Friedewald formula로 혈청 LDL 농도를 계산하였을 때 정상대조군에 비해 대조군에서 높았다. BL, BF 및 BFL에서는 대조군 대비 감소하였고, 양성대조군에 비해 BL과 BFL에서 낮았다. 결과적으로 혈청 지질은 BL이 대조군에 비해 효과적으로 완화시키는 경향을 나타냈고, 양성대조군보다도 더 좋은 효과를 나타냈다.
구분 대조군 BL BF BFL-L BFL-M BFL-H 양성대조군 정상대조군
혈청 총 콜레스테롤 (mg/dL) 105.5±9.0a 78.0±3.2d 85.3±4.7c 93.1±5.5b 92.6±5.8b 85.6±7.5c 90.5±6.1bc 90.2±7.8bc
혈청 HDL 콜레스테롤 (mg/dL) 13.2±0.7 13.3±0.8 12.6±1.2 13.0±0.9 13.2±0.9 14.0±0.9 13.8±1.0 13.8±0.7
혈청 LDL 콜레스테롤 (mg/dL) 62.9±3.4a 50.6±2.6b 51.0±3.8b 47.2±3.3c 46.6±3.9c 48.3±3.2bc 51.2±3.1b 61.8±3.1a
혈청 TG (mg/dL) 79.7±4.8a 54.6±3.4c 62.6±4.7b 70.7±4.9a 70.1±5.1a 61.9±4.2b 66.4±4.6ab 64.1±3.2b
4-8. 공복 혈당, 혈청 인슐린 농도와 HOMA-IR
공복혈당은 정상대조군이 대조군에 비해 높았으며 BL, BFL-M과 BFL-H가 정상대조군과 유사하게 낮은 혈당을 나타냈다(도 10). 공복 혈청 인슐린은 정상대조군이 대조군에 비해 낮았으며 BL, BFL-M과 BFL-H가 혈청 인슐린농도를 대조군에 비해 낮추었으나 정상대조군보다는 높았다. 공복 혈당과 공복 혈청 인슐린 농도로 인슐린 저항성을 나타내는 HOMA-IR을 계산하였을 때 HOMA-IR은 정상대조군에 비해 대조군이 현저하게 높았으며 BL, BFL-M과 BFL-H에서 낮아졌다.
BFL-M(30 mg/kg BW)은 BL(100 mg/kg BW)과 비교하여 적용 투여 용량으로 보다 우수한 혈당 감소 및 인슐린 저항성 감소 효과를 나타냈다.
4-9. 경구내당능 검사
고지방식이는 간에 지방을 증가시키고 이것은 포도당 대사에도 영향을 미친다. 2 g 포도당/kg bw를 경구 투여하고 혈당 변화를 조사하였을 때 대조군은 정상 대조군에 비해 0-40분까지의 혈당이 현저하게 높았고 40분 이후에는 혈당 감소하였다(도 11a). 대조군에 비해 BL과 BFL에 농도 의존적으로 30-40분에 나타나는 최고혈당을 감소시켰으며 BL과 BFL-M은 양성대조군보다 최고혈당을 낮추고, 정상대조군과 유사한 값을 나타냈다. 40분 이후에 혈당 감소도 정상대조군에 비해 대조군이 현저하게 높았으며 양성대조군은 대조군보다는 혈당을 낮추었다. BL과 BFL-M은 40분 이후에도 우수한 혈당 감소 효과를 나타냈다.
경구내당능 검사 후에 혈당 곡선하면적을 계산하였을 때 정상대조군에 비해 대조군이 초기부분인 0-40분의 혈당 곡선하면적이 높았다. BL, BFL-M, BFL-H은 대조군보다 낮은 혈당 곡선하면적을 나타냈으며 이는 양성대조군보다도 더 낮은 값이었다(도 11b). 정상대조군에 비해 대조군에서 뒷부분인 40-120분의 혈당 곡선하면적이 높았으며 BL, BFL-M, BFL-H은 양성대조군보다도 더 낮은 값을 나타냈다. BFL-M은 정상대조군과 유사한 값을 나타냈다. 결론적으로 BL과 BFL-M이 우수한 경구내당능을 가진다는 것을 알 수 있었다.
4-10. IPITT(intraperitoneal insulin tolerance test)
10 주째에 ITT를 진행하였다. 6시간 공복시킨 후 1U/kg body weight 인슐린을 복강 투여 하고 0분, 15, 30, 45, 90분에 혈당을 측정하였다.
인슐린 저항성을 측정하는 방법으로 6시간을 금식시킨 백서에게 1 IU 인슐린 / kg bw을 복강 내 주사하였을 때 정상대조군이 가장 낮았으며 정상대조군에 비해 대조군이 현저하게 높았고, 양성대조군도 대조군에 비해 낮아졌다. 다만 대조군은 90분에 혈당이 리바운스 되었지만 양성대조군은 이런 현상은 나타내지 않았다(도 12a). BL, BFL-M에서 가장 혈당이 낮았으며 BL, BFL-M은 60분 이후에는 정상대조군과도 큰 차이가 없었다. BL, BFL-M에서 인슐린 저항성을 감소시키는 효과가 높았다.
IPITT의 초기(0-30분)에는 혈중 클루코오스 레벨 변화에 대한 곡선하면적은 정상대조군에 비해 대조군이 높았고, BL, BFL-M, BFL-H가 대조군에 비해 낮았으며 BFL-M과 BFL-H는 정상대조군만큼 낮아지는 것을 알 수 있었다(도 12b). IPITT의 후반기(30-90분)에는 혈중 클루코오스 레벨 변화에 대한 곡선하면적도 정상대조군에 비해 대조군이 높았으며 실험군들에서 대조군에 비해 감소하였고, 혈당 면적은 0-30 분 보다 30-90분에서 현저하게 감소하였다. BL, BFL-M, BFL-H가 대조군에 비해 낮았으며 BFL-M과 BFL-H는 정상대조군만큼 낮아지는 것을 알 수 있었다.
BFL-M(30 mg/kg BW)은 BL(100 mg/kg BW)과 비교하여 적용 투여 용량으로 보다 우수한 인슐린 저항성 감소 효과를 나타냈다.
<110> Korea Prime Pharm Co., Ltd. <120> Composition for preventing or improving fatty liver, diabetes or obesity comprising blackberry extract <130> PN190018 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP-1c forward primer <400> 1 ggagccatgg attgcacatt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP-1c reverse primer <400> 2 aggaaggctt ccagagagga 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC forward primer <400> 3 ggaagatggt gtcccgctct g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC reverse primer <400> 4 ggggagatgt gctgggtcat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS forward primer <400> 5 aggtgctaga ggccctgcta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS reverse primer <400> 6 gtgcacagac accttcccat 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT-1 forward primer <400> 7 ctcctgagca gttaccaatg c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT-1 reverse primer <400> 8 gaaccttggc tgcggtaaga c 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 9 aagtccctca ccctcccaaa ag 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 10 aagcaatgct gtcaccttcc c 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer <400> 11 acccccaacc tatgaagaaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse primer <400> 12 tccacgcaaa acggaatgaa 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta forward primer <400> 13 ttgtggctgt ggagaagctg 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta reverse primer <400> 14 gccgtctttc atacacagg 19

Claims (7)

  1. 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 추출물인 것인, 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 지방간은 비알코올성 지방간인 것인, 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 블랙베리 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 1:2 내지 1:3의 중량비로 혼합한 혼합물을 포함하는 것인, 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  5. 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 당뇨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  6. 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 항비만용 식품 조성물.
  7. 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 열매 추출물 및 블랙베리 잎 추출물을 포함하는 대사증후군의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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LU502713A1 (de) * 2021-08-26 2023-02-27 Pm Int Ag Normalisierung des Fettstoffwechsels

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