KR20210052477A - 단백질 검출을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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마짐 이사벨
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Abstract

본 발명은 일반적으로 액체 크로마토그래피 결합 탠덤 질량 분광법 다중 반응 모니터링(MRM)에 의해 트랜스제닉(transgenic) 식물 샘플을 포함하여 생물학적 샘플에서 하나 이상의 트랜스제닉 표적 단백질을 직접적으로 정량화하는 특이적인 이온화 특징을 갖는 펩티드 바이오마커에 관한 것이다. MRM-기반 방법과 조합된 펩티드 바이오마커는 선택된 펩티드 바이오마커를 단독으로 또는 조합하여 사용하여 메이즈와 같은 적층된 트랜스제닉 작물 내에서 단일 트랜스제닉 표적 단백질 또는 다중 트랜스제닉 표적 단백질을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시는 식물 매트릭스를 포함하여 여러 생물학적 매트릭스에서 광범위하고 신뢰 가능한 정량화를 가능하게 한다. 본 발명의 펩티드 바이오마커는 추가로 특이적 트랜스제닉 이벤트의 식별 및/또는 선택을 지원하는 형질 바이오마커로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 여러 펩티드 바이오마커 조합이 제공된다.

Description

단백질 검출을 위한 조성물 및 방법
전자 제출된 서열 목록에 대한 참조
서열 목록의 공식 사본은, 2018년 8월 7일에 생성되고 크기가 94 킬로바이트이며 파일명이 "81319-US-L-ORG-NAT-1_SeqList_ST25.txt"인 ASCII 형식의 서열 목록으로 EFS-Web을 통해 전자 제출되었고, 명세서와 함께 파일링되었다. 이러한 ASCII 형식 문서에 포함된 서열 목록은 명세서의 일부이고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 복합적인 생물학적 샘플에서 표적 트랜스제닉(transgenic) 단백질을 선택적으로 검출하고, 정량화하고, 특성규명하기 위한 질량 분광법의 용도에 관한 것이다.
트랜스제닉 작물은 "유전자 스택(gene stack)" 또는 "형질 스택(trait stack)"으로도 불리는 여러 형질을 부여하는 다중 전이유전자를 포함하는 점점 더 복합적인 유전자 변형으로 구성된다. 예를 들어, 현재 시중의 다수의 트랜스제닉 옥수수 산물은 동일한 식물 내에, 넓은 스펙트럼의 해충을 방제하기 위한 다중 살충성 단백질, 넓은 스펙트럼의 화학 제초제에 대한 식물 내성을 부여하는 다중 단백질 및 식물 형질전환 과정 동안 선택 가능 마커로서 사용되는 다중 단백질을 함유한다. 해충을 방제하는 데 사용되는 다수의 트랜스제닉 단백질, 예를 들어, 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터의 결정 내독소(Cry 단백질로 불림)는 구조적으로 밀접하게 관련되어 있을 수 있으며, 유사한 전체 아미노산 서열 동일성을 갖거나 서로에 대해 상당한 동일성을 갖는 모티프 또는 도메인을 함유할 수 있다. 다수의 Cry 단백질은 인시목(lepidopteran) 또는 딱정벌레목(coleopteran) 해충에 대항하여 활성이다. 인시목-활성 Cry 단백질의 예로는 Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F 및 Cry9가 포함된다. 딱정벌레목-활성 Cry 단백질의 예로는 Cry3A, Cry3B, Cry3C, Cry8, 이원계 Cry23-Cry37 및 이원계 Cry34-Cry35가 포함된다. 대부분의 개별 Cry 단백질은 주어진 곤충 목 내의 좁은 스펙트럼의 곤충 종에 대항하여 생물학적으로 활성이다.
증가된 스펙트럼의 활성을 갖는 혼성 Cry 단백질을 형성하기 위한 많은 성공적인 시도가 문헌에 개시되어 있다. 예를 들어, Cry1Aa 단백질로부터의 누에 나방(봄빅스 모리(Bombyx mori)) 특이성 도메인은 Cry1Ac 단백질로 이동하고, 이에 따라 생성된 Cry1Aa-Cry1Ac 키메라 단백질에 신규한 살충 활성을 부여한다(Ge et al. 1989, PNAS 86: 4037 4041). 1996년 및 1997년에 Thompson 등(미국 특허 제5,527,883호 및 제5,593,881호)은 Cry1Ab 단백질의 프로톡신 꼬리 영역으로 야생형 Cry1F 단백질 및 Cry1C 단백질의 프로톡신 꼬리 영역을 교체하여, Cry1F-Cry1Ab 혼성 Cry 단백질 및 Cry1C-Cry1Ab 혼성 Cry 단백질(둘 모두 특정 발현 숙주 세포에서 개선된 발현을 가짐)을 제조하였다. 1998년 Bosch 등(미국 특허 제5,736,131호)은 Cry1Ea 단백질 및 Cry1Ab 단백질의 도메인 III를 Cry1Ca 단백질의 도메인 III로 치환하여, G27로 불리는 Cry1E-Cry1C 혼성 Cry 단백질 및 H04로 불리는 Cry1Ab-Cry1C 혼성 Cry 단백질(이들 둘 모두 야생형 Cry 단백질 모 분자보다 넓은 스펙트럼의 인시목 활성을 가짐)을 생성함으로써 신규한 인시목-활성 단백질을 생산하였다. 2001년 Malvar 등(미국 특허 제6,242,241호)은 Cry1Ac 단백질의 도메인 I를 Cry1F 단백질의 도메인 II 및 도메인 III 및 프로톡신 꼬리와 조합하여 모 야생형 Cry 단백질보다 넓은 살충 활성을 갖는 Cry1Ac-Cry1F 혼성 Cry 단백질을 생산하였다. 2011년 Bogdanova 등(미국 특허 제8,034,997호)은 Cry1Ab 단백질의 도메인 I 및 도메인 II를 Cry1Fa 단백질의 도메인 III와 조합하고 Cry1Ac 단백질 프로톡신 꼬리를 첨가하여, Cry1A.105라 불리는 신규한 인시목-활성 혼성 Cry 단백질을 생산하였다. 그리고, 2012년에 Hart 등(미국 특허 제8,309,516호)은 Cry3A 단백질의 도메인 I 및 도메인 II 및 변형된 Cry3A 단백질을 Cry1Ab 단백질의 도메인 III와 조합하고, Cry1Ab 단백질 프로톡신 꼬리의 일부를 첨가하여 FR8a라 불리는(eCry3.1Ab로도 불림) 딱정벌레목-활성 혼성 Cry 단백질을 생산하였다. 지금까지 보고된 대부분의 혼성 Cry 단백질은 동일한 부류의 야생형 Cry 단백질의 일부 또는 전부, 예컨대, Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1C, Cry1F 및 Cry3A를 사용하였다.
여러 야생형 Cry 단백질, 예를 들어, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1C, Cry1F, Cry2A, Cry2Ba, Cry3A, Cry3B, Cry9C 및 Cry34-Cry35, 뿐만 아니라 식물성의 살충성 단백질, 예컨대, Vip3A(미국 특허 제5,877,012호 참조)는 옥수수, 목화, 벼 및 대두를 포함하여 트랜스제닉 작물 식물에서 발현되었는데, 이들 중 일부는 일찍이 1996년 이래로 특정 인시목 및 딱정벌레목 해충을 방제하기 위해 상업적으로 이용되었다. 보다 최근에, 치환된, 결실된 또는 삽입된 하나 이상의 아미노산을 갖는 조작된 Cry 단백질, 예를 들어, 변형된 Cry3A(mCry3A; 미국 특허 제7,230,167호), 및 혼성 Cry 단백질, 예를 들어, 상술된 eCry3.1Ab 및 Cry1A.105를 함유하는 트랜스제닉 작물 산물, 예를 들어, 옥수수가 상업적으로 도입되었다.
상업적 및 산업적 용도를 위한 트랜스제닉 식물을 생성하기 위한 재조합 DNA 기술의 이용이 증가함에 따라 트랜스제닉 식물 계통을 분석하는 진단 방법의 개발이 요구되고 있다. 이러한 방법들은 연이은 육종 세대를 통해 트랜스제닉 식물 품종을 유지하고, 환경 또는 트랜스제닉 식물로부터 유래된 생물학적 샘플에서 트랜스제닉 식물 또는 식물 부분의 존재를 모니터링하고, 요망되는 또는 최적의 표현형을 갖는 신규한 트랜스제닉 식물의 신속한 생산 및 개발을 지원하기 위해 필요하다. 더욱이, 많은 국가의 규제 기관의 트랜스제닉 식물의 안전성 평가에 대한 현재 지침은 규제 승인을 얻고 유지하기 위해 DNA 및 단백질 수준에서의 특성규명을 필요로 한다. 상술된 바와 같은 트랜스제닉 식물로 적층된 유전자 및 단백질의 복합성이 증가하면, 특히 적층된 트랜스제닉 단백질이 서로 유사하거나, 환경에서 야생형 비-트랜스제닉 단백질과 유사하거나, 트랜스제닉 식물에 내인성인 비-트랜스제닉 단백질과 유사한 경우, 복합적인 혼합물 내 어느 하나의 표적 단백질의 특이적 검출 및 정량화는 어려워진다.
면역검정, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA)은 식물의 유전자 변형을 통해 도입된 단백질의 검출 및 정량화를 위해 현재 농업에서 선호되는 방법이다. 면역검정의 중요한 구성요소는 표적 단백질(항원)에 대한 특이성을 갖는 항체이다. 면역검정은 고도로 특이적일 수 있으며, 흔히 샘플은 분석되기 전에 단지 간단한 준비만을 필요로 한다. 더욱이, 면역검정은 광범위한 농도에 걸쳐 정성적으로 또는 정량적으로 사용될 수 있다. 전형적으로, 면역검정에는 관심 대상의 각 단백질에 대한 개별 시험이 필요하다. 항체는 동물에서 상승된 다클론성이거나, 세포 배양에 의해 생성된 단클론성일 수 있다. 이들의 성질에 의해, 다클론성 항체의 혼합물은 다중 인식 에피토프를 가질 것이며, 이는 감도를 증가시킬 수 있지만, 또한 존재하는 여러 항체 파라토프의 수에 따라 기타 단백질과의 서열 및 구조적 상동성의 가능성이 증가하므로 특이성을 감소시킬 가능성이 있다. 단클론성 항체는 단일 에피토프 또는 항원 결정기에 대해 균일한 친화성 및 특이성을 나타내고 방대한 양으로 생성될 수 있기 때문에 다클론성 항체에 비해 일부 장점을 제공한다. 그러나, 유사한 트랜스제닉 또는 내인성 단백질의 복합적인 혼합물에서 단일 트랜스제닉 단백질의 선택적 검출 및 정량화와 같은 보다 까다로운 적용에 있어 이들의 사용을 제한하는 모든 항체의 내재적 특성이 있다. 또한, 다클론성 항체와 단클론성 항체 둘 모두에는 검정에서 감도를 향상시키고 배경을 감소시키는 추가 정제 단계가 필요할 수 있다. 또한, ELISA 시스템은 이의 물리적 및 생물학적 특성에 극적인 영향을 미칠 수 있는 표적 단백질에 대한 미묘한 변화를 검출하지 못할 가능성이 있다. 예를 들어, 항체는 포스포릴화 또는 글리코실화와 같은 번역 후 변형에 의해 변경되었거나, 형태적으로 가려지거나, 부분 열화에 의해 변형된 특정 형태의 단백질 또는 펩티드를 인식하지 못할 수 있다. 이러한 변형의 확인은 이러한 단백질들의 물리적 및 생물학적 특성의 변화가 이들의 효소적, 임상적 또는 다른 생물학적 활성에 있어서 중요한 역할을 할 수 있기 때문에 필수적이다. 이러한 변화는 ELISA-기반 정량화 방법의 신뢰성 및 유용성을 제한할 수 있다.
현재, 트랜스제닉 단백질을 함유하는 트랜스제닉 식물 산물의 타당성 확인을 하거나 상업적 작물 산물에서 트랜스제닉 단백질을 정량화하는 것은 면역검정의 정밀성에 좌우된다. 성공적인 면역검정의 개발은 항체 개발에 사용되는 항원의 특정 특징, 즉, 항원의 크기, 소수성 및 3차 구조 및 항체의 질 및 정밀성에 좌우된다. 항체의 특이성은 위양성 결과를 초래할 수 있는 유사한 물질과의 임의의 교차 반응을 설명하기 위해 신중히 확인되어야 한다. 업계의 현재 문제는 상업적으로 입수 가능한 시험 키트에서 다수의 항체들이 다양한 산물의 유사한 트랜스제닉 단백질 또는 야생형 단백질로부터의 트랜스제닉 단백질을 구별하지 않고, 상이한 생성물 식별 및 정량화가 어렵거나 불가능하다는 것이다. 예를 들어, 동일한 야생형 Cry 단백질, 예를 들어, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F 및 Cry3 중 하나 이상을 사용하는 다수의 현재 상업적 트랜스제닉 작물 산물의 경우, 그리고 트랜스제닉 작물 산물에 이미 존재하는 동일한 야생형 Cry 단백질의 일부 또는 전부로 제조된 혼성 Cry 단백질을 발현하는 작물을 도입하는 경우, 이들이 트랜스제닉 식물, 트랜스제닉 식물 부분 또는 트랜스제닉 미생물로부터의 샘플과 같은 복합적인 생물학적 샘플에 함께 존재할 때, 야생형 Cry 단백질을 서로 그리고 동일한 야생형 Cry 단백질의 일부 또는 전부를 함유하는 혼성 Cry 단백질과 구별할 수 있는 신규하고 개선된 진단 방법을 개발하려는 지속적인 요구가 있다.
질량 분광법(MS)은 단백질 분석을 위한 ELISA의 다수의 한계를 극복하는 대안적인 플랫폼을 제공한다. MS-기반 분석 분야는, 탠덤 질량 분광법과 결합된 전기분무 액체 크로마토그래피(LC-MS/MS)에 의한 다중 반응 모니터링(MRM)과 같은, 표적화된 단백질 분석의 중요한 진보를 이루어냈다. 기본 개념은 단백질이 단백질 분해 후 이들의 특정 구성성분 펩티드(대리 펩티드)를 측정함으로써 정량화될 수 있다는 것이다. 선택한 펩티드에 대한 데이터 획득만으로, 더 높은 정확도, 감도, 및 처리량을 갖는 측정이 가능해진다. 대리 펩티드의 MRM-기반 측정에 의한 단백질 정량화는 단백질 분석에서 가장 신속하게 성장하고 있는 MS 응용이다. MRM-기반 단백질 검정은 면역-기반 검정에 비해 두 가지 강력한 이점을 제공하는데, 첫 번째는 항체의 사용 없이 본질적으로 임의의 단백질에 대한 특이적 검정을 체계적으로 구성하는 능력이다. 두 번째는 단일 분석에서 다수의 펩티드의 다중화된 분석을 수행하는 표적화된 MS 분석의 능력이다. 또한, MRM은 직접적인 분석이고, 여기서 면역-기반 검정은 간접적이다. 면역-기반 검정은 특이적으로 결합하고 효소를 사용하여 적절하게 정량화될 수 있는 신호를 생성할 검출 시약과 함께 고체상에 고정될 수 있는 결찰 시약으로 구성된 결합 검정에 의존한다.
상업적 트랜스제닉 작물 산물은 살충성 단백질, 제초제 내성 단백질 및 선택 가능 마커 단백질의 스택을 포함한다. 동일한 야생형 살충성 Cry 단백질, 예를 들어, Cry1Ab, Cry1F 및 Cry3 중 하나 이상을 사용하는 다수의 그러한 상업적 트랜스제닉 작물 산물의 경우, 그리고 트랜스제닉 작물 산물에 이미 존재하는 동일한 야생형 Cry 단백질의 일부 또는 전부, 예를 들어, mCry3A, eCry3.1Ab 및 Cry1A.105로 제조된 혼성 Cry 살충성 단백질을 발현하는 작물을 도입하는 경우, MRM-기반 검정은 이러한 밀접하게 관련된 트랜스제닉 표적 살충성 단백질뿐만 아니라 제초제 내성 및 선택 가능 마커 단백질을 구별할 수 있어야 한다. 따라서, MRM-기반 검정에서 작용하는 데 필요한 모든 생화학적 특성을 갖고, 중복되는 아미노산 서열을 높은 비율로 가질 수 있는 표적 트랜스제닉 단백질에 절대적으로 특이적이라는 추가 특성을 갖는 대리 펩티드를 식별할 지속적 필요성(즉, 대리 펩티드의 전이 상태 중 하나 이상은 다중의 복합적인 매트릭스에 걸쳐 두 개의 밀접하게 관련된 표적 단백질을 간섭 없이 명확하게 구별할 수 있음)이 존재한다. 이러한 선택적인 대리 펩티드 및 이들의 전이 상태는, 서로 유사하거나 환경에서 야생형 비-트랜스제닉 단백질과 유사하거나, 트랜스제닉 식물에 내인성인 비-트랜스제닉 단백질과 유사한 표적 트랜스제닉 단백질을 구별할 수 있어야 한다.
본 발명은 질량 분광법을 사용하여 복합적인 생물학적 매트릭스에 존재하는 표적 트랜스제닉 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하는 데 유용한 표지 대리 펩티드(labeled surrogate peptide) 및 이들의 각 전이 이온을 제공한다. 본 발명은 표지 대리 펩티드 및 전이 이온을 사용하여 복합적인 생물학적 매트릭스에서 표적 트랜스제닉 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하기 위한 방법 및 시스템을 추가로 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 내부 표준 펩티드 마커는 경험적 분석 및 인 실리코 분해 분석을 통해 설계되고; 중질 아미노산 잔기로 화학적으로 합성되거나 안정 동위원소-표지 아미노산(들) 또는 대사 중간체의 존재 하에 합성 유전자를 발현함으로써 유전적으로 합성된다. 특정 구현예에서, 내부 표준은 탠덤 질량 분광법(MS/MS) 분석, 보다 구체적으로, 액체 크로마토그래피-결합 탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS) 분석을 포함하는 질량 분광법 분석(MS)에 의해 개별적으로 특성규명될 수 있다. 특성규명 후, 각 펩티드의 단일 동위원소 질량, 이의 대리 전하 상태, 대리 m/z 값, m/z 전이 이온, 및 각 전이 이온의 이온 유형과 같은, 펩티드의 사전 선택된 펩티드 매개변수가 수집될 수 있다. 다른 고려사항으로는 펩티드 크기 최적화, 번역 후 변형 방지, 공정 유도 변형 방지 및 높은 비율의 누락된 프로테아제 절단 방지가 포함된다.
고유의 안정 동위원소 표지(SIL) 대리 펩티드의 예시적인 목록이 본원에 제공되며, 이는 단일 트랜스제닉 이벤트, 다중 이벤트의 육종 스택 또는 다중 표적 트랜스제닉 단백질의 분자 스택을 갖는 식물에서 구성될 수 있는 살충성 단백질 Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A 및 Vip3, 제초제 내성 단백질 dmEPSPS 및 PAT, 및 식물 형질전환 선택 가능 마커 단백질 PMI로 이루어진 군으로부터 선택된 트랜스제닉 단백질의 선택적 검출 또는 정량화를 위한 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO: 98 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 포함하는 펩티드를 포함한다. 7개의 단백질로부터 유래된 각 펩티드에 대한 각 대리 펩티드 서열 및 전이 이온은 질량 분광법-기반 다중 반응 모니터링(MRM) 검정에 유용하다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 Cry1Ab 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 Cry1Ab 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:99 내지 SEQ ID NO:141 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 펩티드 PIR, TY, VW, HR, YR 또는 PPR을 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21)를 포함하고, 아미노산 서열 PLTK(SEQ ID NO:132) 또는 SAEFNNII(SEQ ID NO:133)로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 eCry3.1Ab 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:27 내지 SEQ ID NO:32 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 eCry3.1Ab 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:142 내지 SEQ ID NO:150 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 펩티드 DGR, IEF 또는 LER을 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27)를 포함하고, 아미노산 서열 TDYHIDQV(SEQ ID NO:142) 또는 DYHIDQV(SEQ ID NO:143)로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 mCry3A 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:33 내지 SEQ ID NO:35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 mCry3A 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:151 내지 SEQ ID NO:155 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 펩티드 IDK를 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 LQSGASVVAGPR(SEQ ID NO:252)을 포함하고, 아미노산 서열 SGASVVAGPR(SEQ ID NO:253) 또는 SVVAGPR(SEQ ID NO:254)로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 Vip3 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:36 내지 SEQ ID NO:73 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 Vip3 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:156 내지 SEQ ID NO:212 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 펩티드 TCK, FEK, DVS, FTK, HK, VNI, MIV, EAK, HLK, NK, DNF, LLC, NAY, YE, SDK, NEK, DK 또는 VDK를 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 DGGISQFIGDK(SEQ ID NO:36)를 포함하고, 아미노산 서열 SQFIGDK(SEQ ID NO:156) 또는 아미노산 서열 GDK로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 dmEPSPS 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:74 내지 SEQ ID NO:77 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 dmEPSPS 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:213 내지 SEQ ID NO:219 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 펩티드 PIK를 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 SLTAAVTAAGGNATYVLDGVPR(SEQ ID NO:257)을 포함하고, 아미노산 서열 GVPR(SEQ ID NO:258) 또는 아미노산 서열 PR로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 PAT 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:78 내지 SEQ ID NO:86 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 PAT 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:220 내지 SEQ ID NO:231 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 펩티드 DFE, DF, PER, SHR, GYK 또는 NFR을 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79)를 포함하고, 아미노산 서열 YTHLLK(SEQ ID NO:220) 또는 THLLK(SEQ ID NO:221)로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 PMI 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:87 내지 SEQ ID NO:98 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 PMI 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:232 내지 SEQ ID NO:251 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 펩티드 LK, PVK, HN 또는 PNK를 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89)을 포함하고, 아미노산 서열 PWQTIR(SEQ ID NO:235) 또는 GEPWQTIR(SEQ ID NO:236)로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 표지 대리 펩티드 및 이들의 생성된 전이 이온은 SEQ ID NO:259를 포함하는 Cry1Ab 단백질, 또는 SEQ ID NO:260을 포함하는 eCry3.1Ab 단백질, 또는 SEQ ID NO:261을 포함하는 mCry3A 단백질, 또는 SEQ ID NO:262를 포함하는 Vip3 단백질, 또는 SEQ ID NO:263을 포함하는 dmEPSPS 단백질, 또는 SEQ ID NO:264를 포함하는 PAT 단백질, 또는 PMI 단백질 SEQ ID NO:265 또는 SEQ ID NO:266을 선택적으로 검출하거나 정량화한다.
다른 양태에서, 본 발명의 표지 대리 펩티드는 표적 단백질이 트랜스제닉 식물로부터의 생물학적 샘플에 존재할 때 본 발명의 표적 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화한다. 이러한 양태의 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 트랜스제닉 식물의 잎 조직, 종자, 낟알, 화분 또는 뿌리 조직으로부터 유래된다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 표지 대리 펩티드 및 이들의 생성된 전이 이온은 트랜스제닉 이벤트 Bt11을 포함하는 옥수수 식물로부터의 Cry1Ab 단백질, 또는 트랜스제닉 이벤트 5307을 포함하는 옥수수 식물로부터의 eCry3.1Ab 단백질, 또는 트랜스제닉 이벤트 MIR604를 포함하는 옥수수 식물로부터의 mCry3A 단백질, 또는 트랜스제닉 이벤트 MIR162를 포함하는 옥수수 식물로부터의 또는 트랜스제닉 이벤트 COT102를 포함하는 목화 식물로부터의 Vip3 단백질, 또는 트랜스제닉 이벤트 GA21을 포함하는 옥수수 식물로부터의 dmEPSPS 단백질, 또는 트랜스제닉 이벤트 Bt11, DAS-59122, TC1507, DP4114 또는 T25를 포함하는 옥수수 식물로부터의 PAT 단백질, 또는 트랜스제닉 이벤트 MIR162, MIR604, 5307 또는 3272를 포함하는 옥수수 식물로부터의 PMI 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화한다.
대리 펩티드의 다수의 상이한 조합이 Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3, dmEPSPS, PAT 및/또는 PMI 단백질로부터의 특이적 대리 펩티드 중 하나 이상과 MRM 검정에 의해 동시에 모니터링 및 검출될 수 있고, 이에 따라 질량 분광법에 의해 생물학적 샘플로부터 얻어진 주어진 단백질 제제 중 그러한 단백질 각각의 총량을 측정하는 수단을 제공한다. MRM 기반 검정과 함께 이러한 펩티드는 상이한 성장 단계의 트랜스제닉 식물에서 발현 수준을 결정하기 위한, 잎 조직, 종자 및 낟알, 화분 및 뿌리 조직을 포함하지만 이로 제한되지 않는 상이한 트랜스제닉 식물 조직 및 기관에서 발현 수준을 결정하기 위한, 규제 위험 평가에 대한 잠재적 노출 수준을 결정하기 위한, 식품 가공, 비교, 및 세대 연구에서 단백질의 상이한 수준을 결정하기 위한 정량적 펩티드/단백질 분석을 포함하는 수많은 적용들을 갖는다. 가장 넓은 의미로, 7개의 단백질에 대한 이러한 고유의 대리 펩티드들은 모든 유형의 생물학적 및 비생물학적 매트릭스에서 농업적 적용, 생물학적등가 시험, 바이오마커, 진단, 발견, 식품, 환경, 치료 모니터링을 포함하는 수많은 적용을 위해 MRM 검정과 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 임의의 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:98을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 표지 대리 펩티드를 포함하는 검정 카세트(assay cassette)가 제공되며, 이는 본 발명의 임의의 하나 이상의 표적 단백질의 동시적이고 선택적인 검출 또는 정량화를 가능하게 한다.
본 발명은 또한 트랜스제닉 표적 단백질을 발현하는 트랜스제닉 식물로부터의 생물학적 샘플과 같은 복합적인 생물학적 매트릭스 내에서 트랜스제닉 표적 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 트랜스제닉 식물로부터의 샘플, 예를 들어, 잎, 종자 또는 낟알, 화분 또는 뿌리로부터의 샘플을 얻는 단계; 식물 샘플로부터 단백질을 추출하는 단계; 추출물에서 비-트랜스제닉 불용성 단백질의 양을 감소시킴으로써 표적 단백질 풀을 농축시키는 단계; 선택된 효소, 예를 들어, 트립신으로 추출물에서 가용성 단백질을 분해하여 펩티드 단편을 포함하는 추출물을 생성하는 단계로서, 펩티드 단편은 각 표적 트랜스제닉 단백질에 특이적인 적어도 하나의 대리 펩티드를 포함하는, 단계; 표적 단백질을 특이적으로 검출하는 SIL 펩티드의 검정 카세트를 첨가하는 단계로서, 각 표지 대리 펩티드는 표적 트랜스제닉 단백질의 각 대리 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖고, 첨가된 표지 대리 펩티드의 수는 혼합물 중 표적 트랜스제닉 단백질의 수와 동일한, 단계; 혼합물 중 비-대리 펩티드의 양을 감소시킴으로써 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드를 농축시키는 단계; 액체 크로마토그래피를 이용하여 펩티드 단편 혼합물을 용해시키는 단계; 질량 분광법을 이용하여 펩티드 단편 혼합물을 분석하는 단계로서, 표지 대리 펩티드의 전이 이온 단편의 검출은 대리 펩티드가 유래된 표적 트랜스제닉 단백질의 존재를 가리키는, 단계; 및, 선택적으로, 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 표지 대리 펩티드의 전이 이온에 의해 발생된 질량 분광법 신호와 비교함으로써 생물학적 샘플에서 표적 트랜스제닉 단백질의 양을 계산하는 단계를 포함한다. 본 발명의 트랜스제닉 단백질로부터 유래된 SIL 대리 펩티드 각각은 질량 분광법-기반 다중 반응 모니터링(MRM) 검정 동안 고유의 전이 이온을 갖는다. 이와 같이, 이러한 펩티드들은 충돌 에너지의 약간의 변화로 인해 상이한 정도의 이온화를 야기하는 선택적 MS 이온을 생성할 것이다. 예를 들어, 삼중 사극자 MS는 펩티드 특이적인 높은 m/z 이온을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 방법은 당업계에 알려져 있을 수 있는 더 낮은 m/z 강도 이온 마커의 사용에 비해 내인성 배경을 감소시키는 선택적 이점을 제공할 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 방법에서 선택적으로 검출되거나 정량화되는 표적 단백질은 Cry1Ab 단백질, eCry3.1Ab 단백질, mCry3A 단백질, Vip3 단백질, 이중 돌연변이체 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(dmEPSPS) 단백질, 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제(PAT) 단백질 또는 포스포만노스 이소머라제(PMI) 단백질이다.
본 발명의 다른 양태에서, Cry1Ab 단백질, eCry3.1Ab 단백질, mCry3A 단백질, Vip3 단백질, 이중 돌연변이체 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(dmEPSPS) 단백질, 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제(PAT) 단백질 또는 포스포만노스 이소머라제(PMI) 단백질을 검출하거나 정량화하는 본 발명의 방법에 유용한 표지 대리 펩티드는 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:98 중 어느 하나를 포함한다.
본 발명의 방법의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 Cry1Ab를 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 Cry1Ab를 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:99 내지 SEQ ID NO:141 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 펩티드 PIR, TY, VW, HR, YR 또는 PPR을 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21)를 포함하고, 아미노산 서열 PLTK(SEQ ID NO:132) 또는 SAEFNNII(SEQ ID NO:133)로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 또 다른 양태에서, Cry1Ab 표적 단백질은 아미노산 서열 PLTK(SEQ ID NO: 132)로 이루어진 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 생물학적 샘플에서 정량화된다.
본 발명의 방법의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 eCry3.1Ab 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:27 내지 SEQ ID NO:32 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 eCry3.1Ab 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:142 내지 SEQ ID NO:150 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 펩티드 DGR, IEF 또는 LER을 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27)를 포함하고, 아미노산 서열 TDYHIDQV(SEQ ID NO:142) 또는 DYHIDQV(SEQ ID NO:143)로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 또 다른 양태에서, eCry3.1Ab 표적 단백질은 아미노산 서열 TDYHIDQV(SEQ ID NO:142)로 이루어진 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 생물학적 샘플에서 정량화된다. 이러한 양태의 또 다른 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 AVFNELFTSSNQIGLK(SEQ ID NO:28)를 포함하고, 아미노산 서열 TSSNQIGLK(SEQ ID NO:144) 또는 SSNQIGLK(SEQ ID NO:145)로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 또 다른 양태에서, eCry3.1Ab 표적 단백질은 아미노산 서열 TSSNQIGLK(SEQ ID NO:144)로 이루어진 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 생물학적 샘플에서 정량화된다.
본 발명의 방법의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 mCry3A 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:33 내지 SEQ ID NO:35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 방법의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 mCry3A 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:151 내지 SEQ ID NO:155 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 펩티드 IDK를 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 LQSGASVVAGPR(SEQ ID NO:252)을 포함하고, 아미노산 서열 SGASVVAGPR(SEQ ID NO:253) 또는 SVVAGPR(SEQ ID NO:254)로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 또 다른 양태에서, mCry3A 표적 단백질은 아미노산 서열 SGASVVAGPR(SEQ ID NO:253)로 이루어진 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 생물학적 샘플에서 정량화된다.
본 발명의 방법의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 Vip3 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:36 내지 SEQ ID NO:73 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 방법의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 Vip3 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:156 내지 SEQ ID NO:212 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 펩티드 TCK, FEK, DVS, FTK, HK, VNI, MIV, EAK, HLK, NK, DNF, LLC, NAY, YE, SDK, NEK, DK 또는 VDK를 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 DGGISQFIGDK(SEQ ID NO:36)를 포함하고, 아미노산 서열 SQFIGDK(SEQ ID NO:156) 또는 아미노산 서열 GDK로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 또 다른 양태에서, Vip3 표적 단백질은 아미노산 서열 SQFIGDK(SEQ ID NO:156)로 이루어진 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 생물학적 샘플에서 정량화된다. 이러한 양태의 또 다른 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 FTTGTDLK(SEQ ID NO:255)를 포함하고, 아미노산 서열 TGTDLK(SEQ ID NO:256) 또는 아미노산 서열 LK로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 또 다른 양태에서, Vip3 표적 단백질은 아미노산 서열 TGTDLK(SEQ ID NO:256)로 이루어진 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 생물학적 샘플에서 정량화된다.
본 발명의 방법의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 dmEPSPS 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:74 내지 SEQ ID NO:77 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 방법의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 dmEPSPS 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:213 내지 SEQ ID NO:219 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 SLTAAVTAAGGNATYVLDGVPR(SEQ ID NO:257)을 포함하고, 아미노산 서열 GVPR(SEQ ID NO:258) 또는 아미노산 서열 PR로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 또 다른 양태에서, dmEPSPS 표적 단백질은 아미노산 서열 PR로 이루어진 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 생물학적 샘플에서 정량화된다.
본 발명의 방법의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 PAT 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:78 내지 SEQ ID NO:86 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 PAT 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:220 내지 SEQ ID NO:231 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 펩티드 DFE, DF, PER, SHR, GYK 또는 NFR을 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79)를 포함하고, 아미노산 서열 YTHLLK(SEQ ID NO:220) 또는 THLLK(SEQ ID NO:221)로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 또 다른 양태에서, dmEPSPS 표적 단백질은 아미노산 서열 YTHLLK(SEQ ID NO:220)로 이루어진 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 생물학적 샘플에서 정량화된다.
본 발명의 방법의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 PMI 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:87 내지 SEQ ID NO:98 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 PMI 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, SEQ ID NO:232 내지 SEQ ID NO:251 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 펩티드 LK, PVK, HN 또는 PNK를 갖는 전이 이온을 생성한다. 이러한 양태의 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89)을 포함하고, 아미노산 서열 PWQTIR(SEQ ID NO:235) 또는 GEPWQTIR(SEQ ID NO:236)로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
본 발명은 트랜스제닉 표적 단백질의 고처리량 검출 또는 정량화를 위한 시스템을 추가로 제공한다. 이러한 시스템은 트랜스제닉 표적 단백질에 특이적인 사전-설계된 표지 대리 펩티드의 카세트; 및 하나 이상의 질량 분광기를 포함한다.
본 발명의 다양한 목적, 특징, 양태, 및 이점은 첨부된 도면 및 서열 목록과 함께 본 발명의 바람직한 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 보다 명백해질 것이다.
서열의 간략한 설명
SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:26은 트랜스제닉 Cry1Ab 단백질의 선택적 검출 및 정량화를 위한 안정 동위원소-표지 대리 펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:27 내지 SEQ ID NO:32는 트랜스제닉 eCry3.1Ab 단백질의 선택적 검출 및 정량화를 위한 안정 동위원소-표지 대리 펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:33 내지 SEQ ID NO:35는 트랜스제닉 mCry3A 단백질의 선택적 검출 및 정량화를 위한 안정 동위원소-표지 대리 펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:36 내지 SEQ ID NO:73은 트랜스제닉 Vip3 단백질의 선택적 검출 및 정량화를 위한 안정 동위원소-표지 대리 펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:74 내지 SEQ ID NO:77은 트랜스제닉 dmEPSPS 단백질의 선택적 검출 및 정량화를 위한 안정 동위원소-표지 대리 펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:78 내지 SEQ ID NO:86은 트랜스제닉 PAT 단백질의 선택적 검출 및 정량화를 위한 안정 동위원소-표지 대리 펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:87 내지 SEQ ID NO:98은 트랜스제닉 PMI 단백질의 선택적 검출 및 정량화를 위한 안정 동위원소-표지 대리 펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:99 내지 SEQ ID NO:141은 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:26의 SIL 대리 펩티드의 전이 이온의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:142 내지 SEQ ID NO:150은 SEQ ID NO:27 내지 SEQ ID NO:32의 SIL 대리 펩티드의 전이 산물의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:151 내지 SEQ ID NO:155는 SEQ ID NO:33 내지 SEQ ID NO:35의 SIL 대리 펩티드의 전이 산물의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:156 내지 SEQ ID NO:212는 SEQ ID NO:36 내지 SEQ ID NO:72의 SIL 대리 펩티드의 전이 산물의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:213 내지 SEQ ID NO:219는 SEQ ID NO:74 내지 SEQ ID NO:77의 SIL 대리 펩티드의 전이 산물의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:220 내지 SEQ ID NO:231는 SEQ ID NO:79 내지 SEQ ID NO:86의 SIL 대리 펩티드의 전이 산물의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:232 내지 SEQ ID NO:251는 SEQ ID NO:87 내지 SEQ ID NO:98의 SIL 대리 펩티드의 전이 산물의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:252 내지 SEQ ID NO:254는 트랜스제닉 mCry3A 단백질의 선택적 검출 및 정량화를 위한 SIL 대리 펩티드 및 이의 전이 산물의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:255 내지 SEQ ID NO:256은 트랜스제닉 Vip3A 단백질의 선택적 검출 및 정량화를 위한 SIL 대리 펩티드 및 전이 산물의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:257 내지 SEQ ID NO:258은 트랜스제닉 dmEPSPS 단백질의 선택적 검출 및 정량화를 위한 SIL 대리 펩티드 및 전이 산물의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:259 내지 SEQ ID NO:270은 본 발명의 예시적인 표적 트랜스제닉 단백질의 아미노산 서열이다.
이러한 설명은 본 발명이 구현될 수 있는 모든 상이한 방식, 또는 본 발명에 추가될 수 있는 모든 특징의 상세한 카탈로그임을 뜻하지는 않는다. 예를 들어, 일 구현예와 관련하여 예시된 특징이 다른 구현예에 도입될 수 있거나, 특정 구현예와 관련하여 예시된 특징이 그러한 구현예로부터 삭제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 일부 구현예에서 본원에 기재된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 배제되거나 생략될 수 있다는 것을 고려한다. 또한, 본원에 제안된 다양한 구현예에 대한, 본 발명으로부터 벗어나지 않는 수많은 변화 및 부가는 본 개시의 비추어 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 하기 설명은 본 발명의 일부 특정 구현예를 예시하고자 하는 것이며, 이의 모든 치환, 조합 및 변화를 철저하게 명시하고자 하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 본 발명의 설명에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하려는 목적을 위한 것이며, 본 발명의 제한임을 뜻하지는 않는다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 기술하려는 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님이 이해되어야 한다. 본 발명에 관한 일반적인 참조는 다음 문헌들을 포함한다: Alwine et al. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. 74:5350-54; Baldwin (2004) Mol. Cell. Proteomics 3(1):1-9; Can and Annan (1997) Overview of peptide and protein analysis by mass spectrometry. In: Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel, et al. New York: Wiley, p. 10.21.1-10.21.27; Chang et al. (2000) Plant Physiol. 122(2):295-317; Domon and Aebersold (2006) Science 312(5771):212-17; Nain et al. (2005) Plant Mol. Biol. Rep. 23:59-65; Patterson (1998) Protein identification and characterization by mass spectrometry. In: Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel, et al. New York: Wiley, p. 10.22.1-10.22.24; Paterson and Aebersold (1995) Electrophoresis 16: 1791-1814; Rajagopal and Ahern (2001) Science 294(5551):2571-73; Sesikeran and Vasanthi (2008) Asia Pac. J. Clin. Nutr. 17 Suppl. 1:241-44; 및 Toplak et al. (2004) Plant Mol. Biol. Rep. 22:237-50.
정의
본원에서 그리고 첨부된 청구항에서 사용되는, 단수형태인 부정관사 및 정관사는 하나 또는 하나 보다 많은 것을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들어, "식물"에 대한 언급은 단일 식물 또는 다중 식물을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 "및/또는"은 관련이 있는 열거된 항목 중 하나 이상의 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안("또는")으로 해석되는 경우 조합의 결여를 지칭하고 이를 포괄한다.
용어 "약(about)"은 본원에서 대략, 거의, 쯤, 또는 영역 내를 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때, 이는 제시된 수치 값의 위와 아래로 경계를 확장함으로써 그 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"은 본원에서 20%, 바람직하게는 10% 초과 또는 미만의(더 높은 또는 더 낮은) 변동에 의해, 명시된 값보다 높게 그리고 낮게 수치를 수정하기 위해 사용된다. 온도와 관련하여 용어 "약"은 ± 1℃, 바람직하게는 ± 0.5℃를 의미한다. 용어 "약"은 본 발명의 문맥에서(예를 들어, 온도 또는 분자량 값과 조합하여) 사용되는 경우, 정확한 값(즉, "약"이 없음)이 바람직하다.
용어 "~을 포함하다(comprises)" 및/또는 "~을 포함하는(comprising)"은, 본 명세서에서 사용될 때, 명시된 특징, 정수, 단계, 작동, 요소 및/또는 구성요소의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 작동, 요소, 구성요소, 및/또는 이들의 군의 존재 또는 부가를 배제하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 전이 문구 "~로 필수적으로 이루어진(consisting essentially of)"(및 문법적 변형어)은 청구항의 범위가 청구항에 나열된 특정 물질 또는 단계, 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)을 실질적으로 변경시키지 않는 것들을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 용어 "~로 필수적으로 이루어진"은, 본 발명의 청구항에서 사용될 때, "~을 포함하는"과 등가인 것으로 해석됨을 뜻하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "Cry 단백질"은 천연 조건 하에서 바실러스(Bacillus) 종, 예를 들어, 바실러스 튜린지엔시스 성장 사이클의 포자형성 단계 동안 결정질 형태로 프로톡신으로서 축적되는 구상 단백질 분자인 살충성 단백질을 지칭한다. 용어 "Cry 독소" 및 "델타-내독소"는 용어 "Cry 단백질"과 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. Cry 단백질 및 Cry 단백질을 인코딩하는 유전자에 대한 현재 명명법은 아미노산 서열 상동성을 기초로 한다(Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). 이러한 분야에서 인정되는 분류에서, 각 Cry 단백질에는 1차 순열(rank)(아라비아 숫자), 2차 순열(대문자), 3차 순열(소문자) 및 4차 순열(또 다른 아라비아 숫자)을 포함하는 고유의 명칭이 부여된다. 예를 들어, Crickmoe 등에 따르면, 45% 미만의 상동성을 갖는 두 개의 Cry 단백질에는 고유의 1차 순열이 부여될 것이다(예를 들어, Cry1 및 Cry2). 45%를 초과하지만 70% 미만의 상동성을 갖는 두 개의 Cry 단백질은 동일한 1차 순열을 제공받지만, 상이한 2차 순열이 부여될 것이다(예를 들어, Cry1A 및 Cry1B). 70% 내지 95%의 상동성을 갖는 두 개의 Cry 단백질에는 동일한 1차 및 2차 순열이 부여될 것이지만, 상이한 3차 순열이 부여될 것이다(예를 들어, Cry1Aa 및 Cry1Ab). 그리고, 95%를 초과하지만 100% 미만의 상동성을 갖는 두 개의 Cry 단백질에는 동일한 1차, 2차 및 3차 순열이 부여될 것이지만, 상이한 4차 순열이 부여될 것이다(예를 들어, Cry1Ab1 및 Cry1Ab2).
본원에서 사용되는 "Cry1Ab 단백질"은, 자연 발생 또는 합성에 상관없이, Crickmore 등(상기)에 따른 홀로타입 Cry1Ab 아미노산과 적어도 96%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 바실러스 튜린지엔시스로부터 유래된 살충성 결정 단백질을 의미하고, 인터넷 웹사이트 "lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/"에 수탁번호 AAA22330으로서 개시되어 있다. Cry1Ab 단백질(수탁 번호)의 예는, 제한 없이, Cry1Ab1(AAA22330), Cry1Ab2(AAA22613), Cry1Ab3(AAA22561), Cry1Ab4(BAA00071), Cry1Ab5(CAA28405), Cry1Ab6(AAA22420), Cry1Ab7(CAA31620), Cry1Ab8(AAA22551), Cry1Ab9(CAA38701), Cry1Ab10(A29125), Cry1Ab11(I12419), Cry1Ab12(AAC64003), Cry1Ab13(AAN76494), Cry1Ab14(AAG16877), Cry1Ab15(AAO13302), Cry1Ab16(AAK55546), Cry1Ab17(AAT46415), Cry1Ab18(AAQ88259), Cry1Ab19(AAW31761), Cry1Ab20(ABB72460), Cry1Ab21(ABS18384), Cry1Ab22(ABW87320), Cry1Ab23(HQ439777), Cry1Ab24(HQ439778), Cry1Ab25(HQ685122), Cry1Ab26(HQ847729), Cry1Ab27(JN135249), Cry1Ab28(JN135250), Cry1Ab29(JN135251), Cry1Ab30(JN135252), Cry1Ab31(JN135253), Cry1Ab32(JN135254), Cry1Ab33(AAS93798), Cry1Ab34(KC156668), Cry1Ab35(KT692985), 및 Cry1Ab36(KY440260)을 포함한다. 본 발명의 Cry1Ab 단백질의 대표적인 예는 SEQ ID NO:259로 표현된다.
본원에서 사용되는 용어 "Cry3"은 Crickmore 등(상기)에 따라 Cry3으로 분류된 전술된 서열과 높은 정도의 서열 동일성 또는 유사성을 공유하는 살충성 단백질을 지칭하며, 이의 예는 인터넷 웹사이트 "lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/"에 개시되어 있으며, (수탁 번호와 함께) Cry3Aa1(AAA22336), Cry3Aa2(AAA22541), Cry3Aa3(Caa68482), Cry3Aa4(AAA22542), Cry3Aa5(AAA50255), Cry3Aa6(AAC43266), Cry3Aa7(CAB41411), Cry3Aa8(AAS79487), Cry3Aa9(AAW05659), Cry3Aa10(AAU29411), Cry3Aa11(AAW82872), Cry3Aa12(ABY49136), Cry3Ba1(CAA34983), Cry3Ba2(CAA00645), Cry3Ba3(JQ397327), Cry3Bb1(AAA22334), Cry3Bb2(AAA74198), Cry3Bb3(I15475), 및 Cry3Ca1(CAA42469)을 포함한다. 아미노산을 삽입하거나, 치환하거나, 결실시킴으로써 조작된 Cry3 단백질은 본원에서 "변형 Cry3 단백질" 또는 "mCry3 단백질"로 지칭된다. 이러한 "변형 Cry3 단백질"은 전형적으로 "변형 Cry3 단백질"이 유래된 야생형 Cry3 단백질에 비해 특정 해충, 예를 들어, 옥수수 근충(디아브로티카(Diabrotica) 종)에 대항하여 향상된 활성을 갖는다. "변형 Cry3 단백질"의 예는 SEQ ID NO:262의 아미노산 서열로 표현되는 "mCry3A"이다. "변형 Cry3" 단백질의 다른 예는, 제한 없이, 미국 특허 제8,247,369호에 개시된 "mCry3A 단백질", 미국 특허 제9,109,231호에 개시된 "mCry3A 단백질", 및 미국 특허 제6,060,594호에 개시된 "mCry3B 단백질"을 포함한다.
용어 "eCry3.1Ab"는 미국 특허 제8,309,516호에 기재된 바와 같이, N-말단 방향에서 C-말단 방향으로, Cry1Aa 또는 Cry1Ab 단백질의 C-말단 영역에 융합된 Cry3A 단백질의 N-말단 영역을 포함하는 조작된 혼성 살충성 단백질을 지칭한다. "eCry3.1Ab 단백질"의 예는 SEQ ID NO:260의 아미노산 서열로 표현된다.
본원에서 사용되는 용어 트랜스제닉 "이벤트"는 이종 DNA를 갖는 단일 식물 세포의 형질전환 및 재생성, 예를 들어, 관심 대상의 유전자를 포함하는 발현 카세트에 의해 생성된 재조합 식물을 지칭한다. 용어 "이벤트"는 본래의 형질전환체 및/또는 이종 DNA를 포함하는 형질전환체의 자손을 지칭한다. 용어 "이벤트"는 또한 형질전환체와 또 다른 옥수수 계통 사이의 성적 교배에 의해 생성된 자손을 지칭한다. 반복친에 대한 반복적인 여교배 후에도, 형질전환된 모체로부터 삽입된 DNA 및 측접한 DNA는 동일한 염색체 위치에서 교차의 자손에 존재한다. 정상적으로, 식물 조직의 형질전환은 여러 이벤트를 생성하며, 이들 각각은 식물 세포 게놈에서 상이한 위치에 DNA 작제물의 삽입을 나타낸다. 전이유전자의 발현 또는 기타 바람직한 특징에 기초하여, 특정 이벤트가 선택된다. 본 발명의 이러한 트랜스제닉 이벤트의 비제한적 예는, cry1Ab 및 pat 유전자를 포함하고 제US6114608호에 기재된 "이벤트 Bt11"(또한 "Bt11 이벤트" 또는 간단히 "Bt11"), eCry3.1Ab 및 PMI 유전자를 포함하고 제US8466346호에 기재된 "이벤트 5307"(또한 "5307 이벤트" 또는 간단히 "5307"), mCry3A 및 PMI 유전자를 포함하고 제US7361813호에 기재된 "이벤트 MIR604"(또한 "MIR604 이벤트" 또는 간단히 "MIR604"), Vip3A 및 PMI 유전자를 포함하고 제US8232456호에 기재된 "이벤트 MIR162"(또한 "이벤트 MIR162" 또는 간단히 "MIR162"), dmEPSPS 유전자를 포함하고 제US 6566587호에 기재된 "이벤트 GA21"(또한 "GA21 이벤트" 또는 간단히 "GA21"), 알파-아밀라제797E 및 PMI 유전자를 포함하고 제US7635799호에 기재된 "이벤트 3272"(또한 "3272 이벤트" 또는 간단히 "3272"), Cry1Ab를 포함하고 제US6713259호에 기재된 "이벤트 MON810"(또한 "MON810 이벤트" 또는 간단히 "MON810"), Cry1A.105 및 Cry2Ab 유전자를 포함하고 제US8062840호에 기재된 "이벤트 MON89034"(또한 "MON89034 이벤트" 또는 간단히 "MON89034"), Cry1F 및 PAT 유전자를 포함하고 제US7288643호에 기재된 "이벤트 TC1507"(또한 "TC1507 이벤트" 또는 간단히 "TC1507"), Cry34/Cry35 및 PAT 유전자를 포함하고 제US7323556호에 기재된 "이벤트 DAS59122"(또한 "DAS59122 이벤트" 또는 간단히 "DAS59122"), 및 Cry1F, Cry34/Cry35 및 PAT 유전자를 포함하고 제US9790561호에 기재된 "이벤트 DP4114"(또한 "DP4114 이벤트" 또는 간단히 "DP4114")를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "혼성 Cry 단백질"은 자연적으로 존재하지 않고 적어도 일부가 Cry1Ab 단백질의 적어도 27% 인접한 아미노산 서열을 포함하는 조작된 살충성 단백질이다. 27% 제한은 혼성 Cry 단백질 중 인접 Cry1Ab 아미노산의 개수를 혼성 Cry 단백질 중 아미노산의 총 개수로 나눔으로써 계산된다. 예를 들어, 혼성 Cry 단백질, eCry3.1Ab(SEQ ID NO:261)는 174개의 Cry1Ab 아미노산(480번 내지 653번 위치) 및 총 653개의 아미노산을 갖는다. 따라서, eCry3A.1Ab는 Cry1Ab 단백질의 적어도 27% 인접한 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명에 따른 혼성 Cry 단백질의 또 다른 예인 Cry1A.105는 SEQ ID NO:267로 표현된다.
"dmEPSPS" (5-에놀피루불시키메이트-3-포스페이트 신타제)는 PCT 공개 제WO97/04103호에 기재된 바와 같은 글리포세이트 제초제에 대한 식물 내성을 부여하는 조작된 단백질이다. 본 발명의 dmEPSPS의 대표적인 예는 SEQ ID NO:263으로 표현된다.
본원에서 사용되는 "고도로 관련된 살충성 단백질"은 적어도 95%의 전체 서열 동일성을 갖거나 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 공통적인 모티프를 갖는 단백질을 지칭한다. "고도로 관련된" 살충성 단백질의 예는 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 모티프를 공통적으로 갖는 Cry1Ab(SEQ ID NO:259) 및 eCry3.1Ab(SEQ ID NO:260), 및 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 공통적인 모티프를 갖는 eCry3.1Ab(SEQ ID NO:260) 및 mCry3A(SEQ ID NO:261)를 포함한다.
용어 "단리된" 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 독소는 이의 자연 환경에 더 이상 존재하지 않는 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 독성 단백질이다. 본 발명의 단리된 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 독소는 정제된 형태로 존재할 수 있거나 재조합 숙주에, 예컨대 트랜스제닉 세균 세포 또는 트랜스제닉 식물에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 일반적인 용어 "질량 분광법"은, 예를 들어, 전기분무 이온화(ESI), 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화(MALDI) MS, MALDI-비행 시간(TOF) MS, 대기압(AP) MALDI MS, 진공 MALDI MS, 탠덤 MS, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 임의의 적합한 질량 분광법의 방법, 장치 또는 구성을 지칭한다. 질량 분광법 장치는 일련의 자기장과 전기장을 통해 분자의 비행 경로를 측정함으로써 분자의 분자 질량(분자의 질량-대-전하 비율의 함수로서)을 측정한다. 질량-대-전하 비율은 하전된 입자의 전기역학에서 널리 사용되는 물리량이다. 특정 펩티드의 질량-대-전하 비율은 당업자에 의해 선험적으로 계산될 수 있다. 상이한 질량-대-전하 비율을 갖는 두 개의 입자는 동일한 전기장과 자기장에 적용될 때 진공에서 동일한 경로로 이동하지 않을 것이다. 본 발명은, 특히, 펩티드의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 이어서 탠덤 MS 분석의 사용을 포함한다. "탠덤 질량 분광법"에서, 대리 펩티드는 MS 기기에서 필터링될 수 있고, 대리 펩티드는 하나 이상의 "전이 이온"을 수득하기 위해 후속적으로 단편화되고, 이는 두 번째 MS 절차에서 분석된다(검출되고/되거나 정량화된다).
질량 분광법의 방법론 및 장치에 대한 상세한 개요는 본원에 참조로 포함되는 다음 참조문헌에서 찾아볼 수 있다: Can and Annan (1997) Overview of peptide and protein analysis by mass spectrometry. In: Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel, et al. New York: Wiley, p. 10.21.1-10.21.27; Paterson and Aebersold (1995) Electrophoresis 16: 1791-1814; Patterson (1998) Protein identification and characterization by mass spectrometry. In: Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel, et al. New York: Wiley, p. 10.22.1-10.22.24; 및 Domon and Aebersold (2006) Science 312(5771):212-17.
펩티드는 규정된 순서로 알파-아미노산의 링킹(linking)으로부터 형성된 짧은 폴리머이다. 펩티드는 또한 폴리펩티드, 예를 들어, 단백질의 프로테아제를 이용한 분해에 의해 생성될 수 있다.
"식물"은 임의의 발생 단계의 임의의 식물, 특히, 종자 식물이다.
"식물 세포"는 원형질체 및 세포벽을 포함하는 식물의 구조적 및 생리학적 단위이다. 식물 세포는 단리된 단일 세포 또는 배양된 세포의 형태, 또는, 예를 들어, 식물 조직, 식물 기관, 또는 전체 식물과 같은 고도로 조직화된 단위의 일부일 수 있다.
"식물 세포 배양물"은, 예를 들어, 원형질체, 세포 배양 세포, 식물 조직 중 세포, 화분, 화분관, 배주, 배낭, 접합체 및 배(embryo)와 같은 다양한 발생 단계의 식물 단위의 배양물을 의미한다.
"식물 물질"은 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃 부분, 과실, 화분, 난세포, 접합체, 종자, 절단물, 세포 또는 조직 배양물, 또는 식물의 임의의 다른 부분 또는 산물을 지칭한다.
"식물 기관"은 뿌리, 줄기, 잎, 꽃눈, 또는 배와 같은 식물의 독특하고 가시적으로 구조화되고 분화된 부분이다.
본원에서 사용되는 "식물 조직"은 구조적 및 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 그룹을 의미한다. 식물체내 또는 배양물내 식물의 임의의 조직이 포함된다. 이 용어는 전체 식물, 식물 기관, 식물 종자, 식물 배양물 및 구조적 및/또는 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 임의의 그룹을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 상기 열거된 바와 같거나 그 밖에 이러한 정의에 의해 포함되는 식물 조직의 임의의 특정 형태와 함께, 또는 이의 부재 하에서의 이 용어의 사용은 임의의 다른 유형의 식물 조직의 배제인 것을 뜻하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "대리 펩티드"는 단백질 분해, 예를 들어, 트립신 분해를 통해 표적 트랜스제닉 단백질로부터 유래된 펩티드로서, 표적 트랜스제닉 단백질이 복합적인 생물학적 매트릭스, 예컨대, 트랜스제닉 식물로부터의 샘플에서 하나 이상의 다른 트랜스제닉 단백질 및/또는 비-트랜스제닉 단백질의 존재 하에 있을 때, 대리 펩티드와 조합되어, 표적 트랜스제닉 단백질을 차등적으로 검출하고/하거나 정량화하고, 생물학적 매트릭스에서 하나 이상의 다른 트랜스제닉 단백질 또는 비-트랜스제닉 단백질을 검출하고/하거나 정량화하지 않는 하나 이상의 전이 이온을 생성하기 위해 질량 분광법 검정에서 작용하는 펩티드를 지칭한다. "대리 펩티드"는 또한 표적 트랜스제닉 단백질에 대한 "시그니처 펩티드(signature peptide)"로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Cry1Ab 대리 펩티드는 Cry1Ab 트랜스제닉 단백질이 하나 이상의 비-Cry1Ab 트랜스제닉 단백질, 예를 들어, 본 발명의 eCry3.1Ab 살충성 단백질 또는 mCry3A 살충성 단백질, 및/또는 비-트랜스제닉 단백질의 존재 하에 있을 때, Cry1Ab-대리 펩티드와 조합되어, 복합적인 생물학적 매트릭스에서 표적 Cry1Ab 트랜스제닉 살충성 단백질을 차등적으로 검출하고/하거나 정량화하는 하나 이상의 전이 이온을 생성한다. 또 다른 예에서, 본 발명의 eCry3.1Ab 대리 펩티드는 eCry3.1Ab 트랜스제닉 단백질이 하나 이상의 비-eCry3.1Ab 트랜스제닉 단백질, 예를 들어, 본 발명의 Cry1Ab 또는 mCry3A, 및/또는 비-트랜스제닉 단백질의 존재 하에 있을 때, eCry3.1Ab-대리 펩티드와 조합되어, 복합적인 생물학적 매트릭스에서 표적 eCry3.1Ab 트랜스제닉 단백질을 차등적으로 검출하고/하거나 정량화하는 하나 이상의 전이 이온을 생성한다. 본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 둘 이상의 표지 대리 펩티드는 복합적인 생물학적 매트릭스에서 둘 이상의 표적 트랜스제닉 단백질을 검출하고/하거나 정량화하기 위해 질량 분광법 검정에서 동시에 사용될 수 있다.
"표지 대리 펩티드"는 질량 분광법 검정에서 대리 펩티드의 용이한 검출을 위해 표지되는 비-자연 발생 대리 펩티드이다. 예를 들어, 표지는 리신, 이소류신, 발린 또는 아르기닌과 같은 안정 동위원소 표지 아미노산(stable isotope labeled: SIL)일 수 있다. 따라서, 대리 펩티드의 하나 이상의 아미노산이 중동위원소로 표지된다는 점을 제외하고, SIL-표지 대리 펩티드는 비-표지 대리 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 대리 펩티드 SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21)는 중질 리신(K)으로 표지되고, SAEFNNIIPSSQITQIPLTK [C13N15-K]로 표기될 수 있고; 대리 펩티드 TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27)는 중질 발린(V)으로 표지되고, TDVTDYHIDQV[C13N15-V]로 표기될 수 있고; 대리 펩티드 LQSGASVVAGPR(SEQ ID NO:252)은 아르기닌(R)으로 표지되고, LQSGASVVAGPR[C13N15-R]로 표기될 수 있고; 대리 펩티드 DGGISQFIGDK(SEQ ID NO:36)는 중질 리신(K)으로 표지되고, DGGISQFIGDK[C13N15-K]로 표기될 수 있고; 대리 펩티드 FTTGTDLK(SEQ ID NO:255)는 중질 리신(K)으로 표지되고, FTTGTDLK[C13N15-K]로 표기될 수 있고; 대리 펩티드 SLTAAVTAAGGNATYVLDDGVPR(SEQ ID NO:257)은 중질 아르기닌(R)으로 표지되고, SLTAAVTAAGGNATYVLDDGVPR[C13N15-R]로 표기될 수 있고; 대리 펩티드 LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79)는 중질 리신으로 표지되고, LGLGSTLYTHLLK[C13N15-K]로 표기될 수 있고; 대리 펩티드 SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89)은 중질 아르기닌(R)으로 표지되고, SALDSQQGEPWQTIR[C13N15-R]로 표기될 수 있고, 기타 등등이다.
"PAT" (포스피노트리신 N-아세틸트랜스페라제) 단백질은 PCT 공개 제WO87/05629호에 기재된 바와 같이 글루포시네이트 제초제에 대한 식물 내성을 부여한다. 본 발명의 PAT 단백질의 대표적인 예는 SEQ ID NO:264로 표현된다.
"PMI" (만노스6-포스페이트 이소머라제) 단백질은 제US5767378호에 기재된 바와 같이, 만노스를 사용하는 능력을 식물 세포에 부여한다. 본 발명의 PMI 단백질의 대표적인 예는 SEQ ID NO:265 및 SEQ ID NO:266으로 표현된다.
본원에서 사용되는 용어 "적층된" 또는 "적층하는"은 식물의 게놈에 혼입되는 다중의 이종 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스제닉 단백질 또는 트랜스제닉 이벤트의 존재를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "표적 단백질"은 표적 단백질이 복합적인 생물학적 매트릭스에 존재할 때 표지 대리 펩티드에 의해 선택적으로 검출되고/되거나 정량화되도록 의도된 단백질, 전형적으로 트랜스제닉 단백질을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "트랜스제닉 단백질"은 비-천연 형태, 위치, 및 유기체 등에서 생성되는 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 따라서, "트랜스제닉 단백질"은 자연-발생 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있거나, 이는 비-자연 발생 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 예를 들어, 천연 Cry1Ab-생성 유기체인 바실러스 튜린지엔시스로부터의 야생형 Cry1Ab 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 Cry1Ab 단백질은 트랜스제닉 식물 또는 세균 내에서 생성될 때 "트랜스제닉 단백질"이다.
뉴클레오티드는 본원에서 다음 표준 약어로 표시된다: 아데닌(A), 시토신(C), 티민(T), 및 구아닌(G). 아미노산도 마찬가지로 다음 표준 약어로 표시된다: 알라닌(Ala; A), 아르기닌(Arg; R), 아스파라긴(Asn; N), 아스파트산(Asp; D), 시스테인(Cys; C), 글루타민(Gln; Q), 글루탐산(Glu; E), 글리신(Gly; G), 히스티딘(His; H), 이소류신(Ile; 1), 류신(Leu; L), 리신(Lys; K), 메티오닌(Met; M), 페닐알라닌(Phe; F), 프롤린(Pro; P), 세린(Ser; S), 트레오닌(Thr; T), 트립토판(Trp; W), 티로신(Tyr; Y), 및 발린(Val; V).
본 발명은, 각각 질량 분광법 검정 결과에 상이하게 영향을 줄 수 있는, 트랜스제닉 및 비-트랜스제닉 단백질의 혼합물을 포함하는 트랜스제닉 식물로부터 유래된 복합적인 생물학적 샘플, 예를 들어, 하나 이상의 트랜스제닉 식물의 잎, 줄기, 뿌리, 화분 및 종자로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 트랜스제닉 단백질의 차등 검출 및/또는 정량화를 위해 질량 분광법을 수행하는 데 유용한 조성물, 방법 및 시스템을 포괄한다. 본 발명의 조성물, 방법 및 시스템은 또한, 예를 들어, 교차-수분에 의해 이웃하는 식물로부터의 전이유전자로 오염될 위험이 있는 비-트랜스제닉 식물을 시험하는 데 유용하다. 이러한 구현예들에 의해, 전이유전자의 외래성 존재가 모니터링 및 제한될 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 트랜스제닉 단백질의 요망되는 발현 특징을 나타내는 형질전환체를 식별하는 식물 형질전환 절차의 결과를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
분석될 특정 표적 단백질에 대한 선호는 당업자의 재량에 달려있다. 이러한 단백질은 식물, 동물, 세균, 및 효모 등으로부터의 단백질일 수 있지만 이로 제한되지 않으며, 비-형질전환된 세포에서 발견되지 않거나 형질전환된 세포에서 발견되는 단백질일 수 있다. 트랜스제닉 식물에서 발현되는 특히 적합한 단백질은 제초제, 해충, 또는 바이러스에 대한 내성을 부여하는 것들, 및 개선된 영양가, 증가된 수율, 가뭄 내성, 질소 이용(nitrogen utilization), 유용한 산업적 화합물의 생산, 식물의 가공 특징, 또는 생물정화 잠재력을 제공하는 유전자이다. 이러한 단백질의 예는 곤충 내성을 부여하기 위한 살충성 결정 단백질, 즉, 바실러스 튜린지엔시스로부터의, Cry 단백질 및 식물성의 살충성 단백질, 즉, Vip, 또는 이로부터 유래된 조작된 단백질, 제초제 내성 단백질, 예컨대, 5'-에놀피루빌-3'-포스포시키메이트 신타제(EPSPS) 또는 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제(PAT), 또는 선택 가능 마커 단백질, 예컨대, 포스포만노스 이소머라제(PMI)를 포함한다. 당업자에게 용이하게 이해되는 바와 같이, 요망되는 형질을 부여하는 임의의 단백질은 재조합 DNA 기술을 이용하여 식물 세포에서 발현될 수 있고, 그러므로 본 발명에 따른 표적 트랜스제닉 단백질일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 잎, 뿌리, 줄기, 화분, 종자 또는 낟알과 같은 트랜스제닉 식물 조직의 샘플로부터의 복합적인 생물학적 매트릭스에서 Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3, dmEPSPS, PAT 및 PMI 트랜스제닉 단백질의 특이적인 차등 검출 및/또는 정량화를 가능하게 하는 진단 방법을 수행하는 데 유용한 조성물, 진단 방법 및 시스템을 제공한다. 본 발명의 조성물, 진단 방법 및 시스템은 트랜스제닉 살충성 단백질을 포함하는 복합적인 생물학적 샘플에서 고도로 유사한 트랜스제닉 살충성 단백질, 예를 들어, Cry1Ab, mCry3A 및 eCry3.1Ab의 차등 검출 및/또는 정량화에 특히 유용하다. 현재의 기술은 항체에 기초한 상업적으로 입수 가능한 면역검정이며, 동일한 생물학적 샘플에 두 개의 단백질이 존재할 때 두 유형의 단백질 간에 항체의 높은 교차-반응성이 존재하므로 상당량의 Cry1Ab 단백질의 아미노산 서열을 사용하여 조작된 혼성 Cry 단백질로부터 Cry1Ab 단백질을 차등적으로 검출하는 데에는 유용하지 않다. 예를 들어, Cry1Ab-검출 면역검정에서 사용하기 위한 야생형 Cry1Ab에 대항하여 상승된 항체는, 동일한 생물학적 샘플에 두 개의 단백질이 존재할 때, 야생형 Cry1Ab 단백질로부터 유래된 이의 아미노산을 27%만큼 적게 갖는 혼성 Cry 단백질과 교차 반응한다. 따라서, 예를 들어, 이러한 복합적인 생물학적 샘플에서 야생형 Cry1Ab의 정량화는 하나 이상의 비-표적 야생형 Cry 단백질 또는 비-표적 혼성 Cry 단백질의 존재에 의해 혼동이 일어날 수 있다. 게다가, 야생형 Cry1Ab 및 본 발명의 하나 이상의 혼성 Cry 단백질을 포함하는 상업적 트랜스제닉 식물 산물의 보존을 확인하기 위해 발현된 단백질의 검출을 이용하는 것은 트랜스제닉 식물 산물에서 Cry1Ab 단백질과 혼성 Cry 단백질 둘 모두에 대한 항체의 교차-반응성 때문에 어렵다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 이러한 문제들에 대한 해결책을 제공하고, 표적 단백질이 다른 매우 밀접하게 관련된 트랜스제닉 단백질과 비-트랜스제닉 단백질의 혼합물에 존재할 때에도, 표적 단백질의 차등 검출 및/또는 정량화를 위해 표적 트랜스제닉 단백질로부터의 대리 펩티드 및 대리 펩티드로부터 유래된 전이 이온에 의존한다.
질량 분광법 다중 반응 모니터링 검정(MRM)에 의한 표적 단백질 정량화의 정밀도는 적절한 대리 펩티드의 선택 및 대리 펩티드/전이 이온 조합의 표적 단백질 구별 능력에 완전히 좌우된다. 본 발명의 대리 펩티드의 다수의 상이한 조합은 Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3, dmEPSPS, PAT 및/또는 PMI 단백질로부터의 특이적 펩티드 중 하나 이상과 MRM 검정에 의해 동시에 모니터링 및 검출될 수 있고, 따라서 질량 분광법에 의해 주어진 생물학적 샘플 내에서 표적 단백질 각각을 식별하고 정량화하는 수단을 제공한다. 7개의 표적 단백질의 대리 펩티드는 각각의 상응하는 표적 단백질, 즉, Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3, dmEPSPS, PAT 및/또는 PMI를 정량화하는 카세트로 구성될 수 있다. 카세트를 구성하는 이용 가능한 대리 펩티드는 단일 MRM 검정에서 단독으로 또는 임의의 조합으로 분석될 수 있거나, 다중 MRM 검정에서 분석될 수 있다.
MRM 기반 검정과 함께 본 발명의 대리 펩티드는 상이한 성장 단계에서 발현 수준을 결정하기 위한, 환경적 위험 평가에 대한 잠재적 노출 수준을 결정하기 위한, 식품 가공에서 표적 단백질의 상이한 수준을 결정하기 위한, 비교 연구에서 발현 수준을 결정하기 위한, 및 세대간 연구에서 발현 수준을 비교하기 위한 정량적 펩티드/단백질 분석을 포함하는 수많은 적용들을 갖는다. 가장 넓은 의미로, 7개의 단백질에 대한 이러한 고유의 대리 펩티드들은 특정 조직(즉, 잎, 뿌리, 알맹이, 화분) 내에서 단일 트랜스제닉 이벤트, 또는 다중 트랜스제닉 이벤트의 육종 스택일 수 있는 선택 가능 마커, 제초제 내성 또는 살충성 형질을 모니터링하거나 정량화하기 위해 MRM 검정과 조합되어 사용될 수 있다.
MRM 기반 검정은 Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3, dmEPSPS, PAT 및/또는 PMI를 포함하는 단백질로부터 특이적 대리 펩티드의 상대 또는 절대 수준을 정량화하거나 측정할 수 있다. 이러한 단백질들의 상대 정량적 수준은 시그니처 피크 면적을 서로 비교함으로써 MRM 검정에 의해 결정될 수 있다. 개별 Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3, dmEPSPS, PAT 및/또는 PMI 대리 펩티드의 상대 수준은 상이한 샘플 또는 조직 유형으로부터 정량화될 수 있다. 일반적으로, 상대 정량적 수준은 각 표적 대리 펩티드에 대한 내부 표준물로서 안정 동위원소-표지(SIL) 합성 펩티드 유사체와, MRM 측정에서의 펩티드 풍부도를 비교함으로써 결정된다. 당업계에서 전형적으로 교시된 것과는 달리, 전형적으로, SIL 펩티드는 [13C6 15N2] 리신 또는 [13C6 15N4] 아르기닌의 혼입에 의해 표지되지만, 또한 이소류신 및 발린과 같은 다른 아미노산을 포함할 수 있다. SIL 표준물은 고순도일 필요가 있고, 아미노산 분석에 의해 정량적으로 표준화되어야 한다. 당업계에서 전형적으로 교시된 것과는 달리, 본 발명의 SIL은 단백질 분해 직후 샘플에 스파이킹되고, 이에 따라 후속적인 분석 단계에 대해 보정하는 역할을 한다. SIL은 액체 크로마토그래피 분리에서 비표지 대리 펩티드와 공용출되고, 동일한 MS/MS 단편화 패턴을 나타내지만, 동위원소 표지로 인해 질량만이 상이하다. 이에 의해 생성된 표지 대리 펩티드와 생성 이온 둘 모두의 질량 변화 때문에, 질량 분광기가 비표지 펩티드와 표지 펩티드를 구별하는 것이 가능하다. 복합적인 펩티드 분해물은 흔히 표적 펩티드에 대해 오인될 수 있는 여러 세트의 공용출 전이를 함유하기 때문에, 동위원소로 표지된 표준물의 공용출은 올바른 신호를 식별하고 위양성 정량화에 대항하는 최상의 보호를 제공한다. 공지된 농도의 스파이킹된 SIL 표준물이 각 샘플에 스파이킹되기 때문에, Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3, dmEPSPS, PAT 및/또는 PMI에 대해 상이한 표적 단백질로부터의 각 상응하는 대리 펩티드의 상대 정량적 양이 결정될 수 있다. 개별 펩티드, 또는 펩티드들의 상대 정량화는 샘플내 또는 샘플간 또 다른 펩티드, 또는 펩티드들의 양에 비례하여 실시될 수 있기 때문에, 피크 면적이 생물학적 샘플내에서 서로 상대적인지를 결정함으로써 존재하는 펩티드의 상대량을 결정하는 것이 가능하다. 상이한 샘플간에 개별 시그니처 피크 면적으로부터 추론된 상대 정량적 데이터는 일반적으로 샘플당 분석된 단백질의 양에 대해 정규화된다. 상대 정량화는 단일 샘플에서 동시에 다중 단백질로부터의 다수의 펩티드에 걸쳐 및/또는 하나의 펩티드/단백질을 다른 펩티드/단백질에 대하여 상대 단백질 양에 관한 추가 통찰을 얻기 위해 다수의 샘플들에 걸쳐 수행될 수 있다.
절대 정량적 수준은 하나의 생물학적 샘플에서 상응하는 단백질로부터의 개별 대리 펩티드의 시그니처 피크 면적을 샘플에서 하나 이상의 내부 표준물의 공지된 양과 비교함으로써 MRM 기반 검정에 의해 Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3, mEPSPS, PAT 및/또는 PMI에 대하여 결정될 수 있다. 이는 표적 단백질을 함유하지 않는 음성 대조 매트릭스에 공지된 농도의 이들 단백질을 스파이킹함으로써 달성될 수 있다. 다중-반응 모니터링 (MRM) 검정은 정확한 스파이킹된 농도의 7개 단백질 각각을 갖는 비-트랜스제닉 샘플을 칭량하는 단계; 용해 완충액에서 샘플을 추출하고 균질화시키는 단계; 샘플을 별개의 가용성 및 풍부한 불용성 단백질로 원심분리하고 추출의 복잡성을 감소시키는 단계; 가용성 단백질 샘플을 트립신으로 분해하고(조직 또는 생물학적 샘플은 샘플이 적절히 분해되도록 소정 시간 동안 트립신, 키모트립신, 펩신, 엔도프로테이나제 Asp-N 및 Lys-C를 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 프로테아제로 처리될 수 있음), 샘플을 원심분리하고, 고정 농도의 SIL 펩티드를 첨가하는 단계(절대 정량화에서 SIL이 지표로서 사용됨); 양이온 교환을 이용하여 고체상 추출에 의해 탈염시켜 매트릭스 효과 또는 간섭을 최소화하고 이온 억제를 감소시키는 단계; 및 탠덤 질량 분광법에 결합된 액체 크로마토그래피에 의해 샘플을 분석하는 단계로 구성된다. 전형적으로, 단일 복합 단백질/펩티드 용해물로부터 가능한 한 많은 펩티드를 식별하기 위해 이온 트랩 질량 분광기, 또는 글로벌 프로파일링을 수행할 수 있는 또 다른 형태의 질량 분광기가 전형적으로 분석을 위해 작동된다. MRM-기반 검정이 개발되고 임의 유형의 질량 분광기에서 수행될 수 있지만, MRM 검정에 가장 유리한 기기 플랫폼은 흔히 삼중 사극자 기기 플랫폼인 것으로 여겨진다. 7개 단백질에 고유한 관심 대상의 대리 펩티드 및 SIL은 LC-MS/MS에 의해 측정된다. 피크 면적 비율(대리 펩티드의 피크 면적/상응하는 SIL 펩티드의 피크 면적)이 관심 대상의 각 펩티드에 대하여 결정된다. 관심 대상의 7개 단백질의 농도는 피크 면적 비율을 이용하여 보정 곡선으로부터 역산된다. 절대 정량화는 다수의 펩티드에 걸쳐(단일 샘플에서 동시에 다중 단백질의 정량적 측정을 가능하게 함) 및/또는 다중 샘플에 걸쳐(개별 생물학적 샘플 또는 큰 샘플 세트에서 절대 단백질 양에 관한 통찰을 얻기 위함) 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 트랜스제닉 식물로부터의 하나 이상의 생물학적 샘플 중 트랜스제닉 단백질과 비-트랜스제닉 단백질의 혼합물에서 Cry1Ab 단백질, eCry3.1Ab 단백질, mCry3A 단백질, Vip3 단백질, 이중 돌연변이체 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(dmEPSPS) 단백질, 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제(PAT) 단백질 및 포스포만노스 이소머라제(PMI) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 트랜스제닉 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하기 위해 질량 분광법 검정, 예를 들어, 다중 반응 모니터링 검정에서 작용하는 표지 대리 펩티드를 포괄하고, 대리 펩티드는 표지 및 GSAQGIEGSIR(SEQ ID NO:1), IVAQLGQGVYR(SEQ ID NO:2), TLSSTLYR(SEQ ID NO:3), DVSVFGQR(SEQ ID NO:4), TYPIR(SEQ ID NO:5), TVSQLTR(SEQ ID NO:6), WYNTGLER(SEQ ID NO:7), EWEADPTNPALR(SEQ ID NO:8), VWGPDSR(SEQ ID NO:9), APMFSWIHR(SEQ ID NO:10), WGFDAATINSR(SEQ ID NO:11), NQAISR(SEQ ID NO:12), IEEFAR(SEQ ID NO:13), SGFSNSSVSIIR(SEQ ID NO:14), LSHVSMFR(SEQ ID NO:15), EIYTNPVLENFDGSFR(SEQ ID NO:16), LEGLSNLYQIYAESFR(SEQ ID NO:17), YNQFR(SEQ ID NO:18), YNDLTR(SEQ ID NO:19), SPHLMDILNSITIYTDAHR(SEQ ID NO:20), SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21), QGFSHR(SEQ ID NO:22), MDNNPNINECIPYNCLSNPEVEVLGGER(SEQ ID NO:23), ELTLTVLDIVSLFPNYDSR(SEQ ID NO:24), RPFNIGINNQQLSVLDGTEFAYGTSSNLPSAVYR(SEQ ID NO:25), SGTVDSLDEIPPQNNNVPPR(SEQ ID NO:26), TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27), AVNELFTSSNQIGLK(SEQ ID NO:28), ITQLPLTK(SEQ ID NO:29), GLDSSTTK(SEQ ID NO:30), QCAGIRPYDGR(SEQ ID NO:31), IEFVPAEVTFEAEYDLER(SEQ ID NO:32), ITQLPLVK(SEQ ID NO:33), MTADNNTEALDSSTTK(SEQ ID NO:34), VYIDK(SEQ ID NO:35), DGGISQFIGDK(SEQ ID NO:36), LITLTCK(SEQ ID NO:37), ELLLATDLSNK(SEQ ID NO:38), FEELTFATETSSK(SEQ ID NO:39), EVLFEK(SEQ ID NO:40), TASELITK(SEQ ID NO:41), DVSEMFTTK(SEQ ID NO:42), LLGLADIDYTSIMNEHLNK(SEQ ID NO:43), IDFTK(SEQ ID NO:44), TDTGGDLTLDEILK(SEQ ID NO:45), DIMNMIFK(SEQ ID NO:46), ALYVHK(SEQ ID NO:47), VNILPTLSNTFSNPNYAK(SEQ ID NO:48), ITSMLSDVIK(SEQ ID NO:49), QNLQLDSFSTYR(SEQ ID NO:50), DSLSEVIYGDMDK(SEQ ID NO:51), MIVEAKPGHALIGFEISNDSITVLK(SEQ ID NO:52), VYFSVSGDANVR(SEQ ID NO:53), NQQLLNDISGK(SEQ ID NO:54), VESSEAEYR(SEQ ID NO:55), YMSGAK(SEQ ID NO:56), DGSPADILDELTELTELAK(SEQ ID NO:57), VYEAK(SEQ ID NO:58), LDAINTMLR(SEQ ID NO:59), GKPSIHLK(SEQ ID NO:60), DENTGYIHYEDTNNNLEDYQTINK(SEQ ID NO:61), DNFYIELSQGNNLYGGPIVHFYDVSIK(SEQ ID NO:62), LLCPDQSEQIYYTNNIVFPNEYVITK(SEQ ID NO:63), SQNGDEAWGDNFIILEISPSEK(SEQ ID NO:64), NAYVDHTGGVNGTK(SEQ ID NO:65), LDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSK(SEQ ID NO:66), IANEQNQVLNDVNNK(SEQ ID NO:67), YEVTANFYDSSTGEIDLNK(SEQ ID NO:68), QNYALSLQIEYLSK(SEQ ID NO:69), QLQEISDK(SEQ ID NO:70), LLSPELINTNNWTSTGSTNISGNTLTLYQGGR(SEQ ID NO:71), YVNEK(SEQ ID NO:72), QNYQVDK(SEQ ID NO:73), MAGAEEIVLQPIK(SEQ ID NO:74), FPVEDAK(SEQ ID NO:75), EISGTVK(SEQ ID NO:76), ILLLAALSEGTTVVDNLLNSEDVHYMLGALR(SEQ ID NO:77), DFELPAPPRPVRPVTQI(SEQ ID NO:78), LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79), MSPER(SEQ ID NO:80), HGGWHDVGFWQR(SEQ ID NO:81), NAYDWTVESTVYVSHR(SEQ ID NO:82), TEPQTPQEWIDDLER(SEQ ID NO:83), AAGYK(SEQ ID NO:84), YPWLVAEVEGVVAGIAYAGPWK(SEQ ID NO:85), RPVEIRPATAADMAAVCDIVNHYIETSTVNFR(SEQ ID NO:86), ENAAGIPMDAAER(SEQ ID NO:87), ALAILK(SEQ ID NO:88), SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89), GSQQLQLKPGESAFIAANESPVTVK(SEQ ID NO:90), FEAKPANQLLTQPVK(SEQ ID NO:91), STLLGEAVAK(SEQ ID NO:92), LINSVQNYAWGSK(SEQ ID NO:93), HNSEIGFAK(SEQ ID NO:94), VLCAAQPLSIQVHPNK(SEQ ID NO:95), TALTELYGMENPSSQPMAELWMGAHPK(SEQ ID NO:96), LSELFASLLNMQGEEK(SEQ ID NO:97) 및 QGAELDFPIPVDDFAFSLHDLSDK(SEQ ID NO:98)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 대리 펩티드는 안정 동위원소 표지(SIL) 아미노산의 혼입에 의해 표지된다. 다른 구현예에서, SIL 펩티드는 [13C6 15N2] 리신, [13C6 15N2] 이소류신, [13C6 15N2] 발린 또는 [13C6 15N2] 아르기닌의 혼입에 의해 표지된다.
일부 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 트랜스제닉 및 비-트랜스제닉 단백질의 혼합물에서 Cry1Ab 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, GSAQGIEGSIR(SEQ ID NO:1), IVAQLGQGVYR(SEQ ID NO:2), TLSSTLYR(SEQ ID NO:3), DVSVFGQR(SEQ ID NO:4), TYPIR(SEQ ID NO:5), TVSQLTR(SEQ ID NO:6), WYNTGLER(SEQ ID NO:7), EWEADPTNPALR(SEQ ID NO:8), VWGPDSR(SEQ ID NO:9), APMFSWIHR(SEQ ID NO:10), WGFDAATINSR(SEQ ID NO:11), NQAISR(SEQ ID NO:12), IEEFAR(SEQ ID NO:13), SGFSNSSVSIIR(SEQ ID NO:14), LSHVSMFR(SEQ ID NO:15), EIYTNPVLENFDGSFR(SEQ ID NO:16), LEGLSNLYQIYAESFR(SEQ ID NO:17), YNQFR(SEQ ID NO:18), YNDLTR(SEQ ID NO:19), SPHLMDILNSITIYTDAHR(SEQ ID NO:20), SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21), QGFSHR(SEQ ID NO:22), MDNNPNINECIPYNCLSNPEVEVLGGER(SEQ ID NO:23), ELTLTVLDIVSLFPNYDSR(SEQ ID NO:24), RPFNIGINNQQLSVLDGTEFAYGTSSNLPSAVYR(SEQ ID NO:25) 및 SGTVDSLDEIPPQNNNVPPR(SEQ ID NO:26)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 Cry1Ab-특이적 표지 대리 펩티드는 GIEGSIR(SEQ ID NO:99), EGSIR(SEQ ID NO:100), AQLGQGVYR(SEQ ID NO:101), GQGVYR(SEQ ID NO:102); SSTLYR(SEQ ID NO:103), STLYR(SEQ ID NO:104), SVFGQR(SEQ ID NO:105), FGQR(SEQ ID NO:106), PIR, TY, SQLTR(SEQ ID NO:107), QLTR(SEQ ID NO:108), NTGLER(SEQ ID NO:109), YNTGLER(SEQ ID NO:110), PTNPALR(SEQ ID NO:111), DPTNPALR(SEQ ID NO:112), GPDSR(SEQ ID NO:113), VW, HR, SWIHR(SEQ ID NO:114), ATINSR(SEQ ID NO:115), DAATINSR(SEQ ID NO:116), AISR(SEQ ID NO:117), ISR, EFAR(SEQ ID NO:118), EEFAR(SEQ ID NO:119), SNSSVSIIR(SEQ ID NO:120), SSVSIIR(SEQ ID NO:121), SMFR(SEQ ID NO:122), VSMFR(SEQ ID NO:123), ENFDGSFR(SEQ ID NO:124), GSFR(SEQ ID NO:125), YAESFR(SEQ ID NO:126), LEG, NQFR(SEQ ID NO:127), QFR, DLTR(SEQ ID NO:128), NDLTR(SEQ ID NO:129), TIYTDAHR(SEQ ID NO:130), YTDAHR(SEQ ID NO:131), PLTK(SEQ ID NO:132), SAEFNNII(SEQ ID NO:133), FSHR(SEQ ID NO:134), GFSHR(SEQ ID NO:135), EVLGGER(SEQ ID NO:136), GGER(SEQ ID NO:137), FPNYDSR(SEQ ID NO:138), PNYDSR(SEQ ID NO:139), PSAVYR(SEQ ID NO:140), YR, PPR, 및 SGTVDSLDE(SEQ ID NO:141)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성한다.
추가의 다른 구현예에서, 본 발명의 Cry1Ab-특이적 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21)를 포함하고, 아미노산 서열 PLTK(SEQ ID NO:132) 또는 SAEFNNII(SEQ ID NO:133)로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 표지 대리 펩티드는 eCry3.1Ab 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27), AVNELFTSSNQIGLK(SEQ ID NO:28), ITQLPLTK(SEQ ID NO:29), GLDSSTTK(SEQ ID NO:30), QCAGIRPYDGR(SEQ ID NO:31) 및 IEFVPAEVTFEAEYDLER(SEQ ID NO:32)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, eCry3.1Ab-특이적 표지 대리 펩티드는 TDYHIDQV(SEQ ID NO:142), DYHIDQV(SEQ ID NO:143), TSSNQIGLK(SEQ ID NO:144), SSNQIGLK(SEQ ID NO:145), QLPLTK(SEQ ID NO:146), TQLPLTK(SEQ ID NO:147), DSSTTK(SEQ ID NO:148), SSTTK(SEQ ID NO:149), PYDGR(SEQ ID NO:150), DGR, IEF, 및 LER로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성한다.
추가의 다른 구현예에서, 본 발명의 eCry3.1Ab-특이적 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27)를 포함하고, 아미노산 서열 TDYHIDQV(SEQ ID NO:142) 또는 DYHIDQV(SEQ ID NO:143)로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
일부 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 mCry3A 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, ITQLPLVK(SEQ ID NO:33), MTADNNTEALDSSTTK(SEQ ID NO:34), VYIDK(SEQ ID NO:35) 및 LQSGASVVAGPR(SEQ ID NO:252)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, mCry3A-특이적 대리 펩티드는 QLPLVK(SEQ ID NO:151), TQLPLVK(SEQ ID NO:152), ALDSSTTK(SEQ ID NO:153), EALDSSTTK(SEQ ID NO:154), YIDK(SEQ ID NO:155) 및 IDK로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성한다.
추가의 다른 구현예에서, 본 발명의 mCry3A-특이적 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 LQSGASVVAGPR(SEQ ID NO:252)을 포함하고, 아미노산 서열 SGASVVAGPR(SEQ ID NO:253) 및 SVVAGPR(SEQ ID NO:254)로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 표지 대리 펩티드는 Vip3A 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, DGGISQFIGDK(SEQ ID NO:36), LITLTCK(SEQ ID NO:37), ELLLATDLSNK(SEQ ID NO:38), FEELTFATETSSK(SEQ ID NO:39), EVLFEK(SEQ ID NO:40), TASELITK(SEQ ID NO:41), DVSEMFTTK(SEQ ID NO:42), LLGLADIDYTSIMNEHLNK(SEQ ID NO:43), IDFTK(SEQ ID NO:44), TDTGGDLTLDEILK(SEQ ID NO:45), DIMNMIFK(SEQ ID NO:46), ALYVHK(SEQ ID NO:47), VNILPTLSNTFSNPNYAK(SEQ ID NO:48), ITSMLSDVIK(SEQ ID NO:49), QNLQLDSFSTYR(SEQ ID NO:50), DSLSEVIYGDMDK(SEQ ID NO:51), MIVEAKPGHALIGFEISNDSITVLK(SEQ ID NO:52), VYFSVSGDANVR(SEQ ID NO:53), NQQLLNDISGK(SEQ ID NO:54), VESSEAEYR(SEQ ID NO:55), YMSGAK(SEQ ID NO:56), DGSPADILDELTELTELAK(SEQ ID NO:57), VYEAK(SEQ ID NO:58), LDAINTMLR(SEQ ID NO:59), GKPSIHLK(SEQ ID NO:60), DENTGYIHYEDTNNNLEDYQTINK(SEQ ID NO:61), DNFYIELSQGNNLYGGPIVHFYDVSIK(SEQ ID NO:62), LLCPDQSEQIYYTNNIVFPNEYVITK(SEQ ID NO:63), SQNGDEAWGDNFIILEISPSEK(SEQ ID NO:64), NAYVDHTGGVNGTK(SEQ ID NO:65), LDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSK(SEQ ID NO:66), IANEQNQVLNDVNNK(SEQ ID NO:67), YEVTANFYDSSTGEIDLNK(SEQ ID NO:68), QNYALSLQIEYLSK(SEQ ID NO:69), QLQEISDK(SEQ ID NO:70), LLSPELINTNNWTSTGSTNISGNTLTLYQGGR(SEQ ID NO:71), YVNEK(SEQ ID NO:72), QNYQVDK(SEQ ID NO:73) 및 FTTGTDLK(SEQ ID NO:255)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, Vip3A-특이적 표지 대리 펩티드는 SQFIGDK(SEQ ID NO:156), GDK, TLTCK(SEQ ID NO:157), TCK, ATDLSNK(SEQ ID NO:158), LATDLSNK(SEQ ID NO:159), TFATETSSK(SEQ ID NO:160), FATETSSK(SEQ ID NO:161), FEK, LFEK(SEQ ID NO:162), SELITK(SEQ ID NO:163), ASELITK(SEQ ID NO:164), SEMFTTK(SEQ ID NO:165), DVS, IMNEHLNK(SEQ ID NO:166), MNEHLNK(SEQ ID NO:167), DFTK(SEQ ID NO:168), FTK, TLDEILK(SEQ ID NO:169), LTLDEILK(SEQ ID NO:170), MNMIFK(SEQ ID NO:171), NMIFK(SEQ ID NO:172), YVHK(SEQ ID NO:173), HK, VNI, VNIL(SEQ ID NO:174), SMLSDVIK(SEQ ID NO:175), TSMLSDVIK(SEQ ID NO:176), DSFSTYR(SEQ ID NO:177), LDSFSTYR(SEQ ID NO:178), IYGDMDK(SEQ ID NO:179), VIYGDMDK(SEQ ID NO:180), SNDSITVLK(SEQ ID NO:181), MIV, SGDANVR(SEQ ID NO:182), SVSGDANVR(SEQ ID NO:183), LLNDISGK(SEQ ID NO:184), LNDISGK(SEQ ID NO:185), SSEAEYR(SEQ ID NO:186), ESSEAEYR(SEQ ID NO:187), SGAK(SEQ ID NO:188), MSGAK(SEQ ID NO:189), TELTELAK(SEQ ID NO:190), DGSPADI(SEQ ID NO:191), YEAK(SEQ ID NO:192), EAK, NTMLR(SEQ ID NO:193), AINTMLR(SEQ ID NO:194), PSIHLK(SEQ ID NO:195), HLK, DYQTINK(SEQ ID NO:196), NK, DNF, DNFY(SEQ ID NO:197), PNEYVITK(SEQ ID NO:198), LLC, SPSEK(SEQ ID NO:199), LEISPSEK(SEQ ID NO:200), NAY, DHTGGVNGTK(SEQ ID NO:201), GNLNTELSK(SEQ ID NO:202), NTELSK(SEQ ID NO:203), LNDVNNK(SEQ ID NO:204), NDVNNK(SEQ ID NO:205), YE, DLNK(SEQ ID NO:206), QIEYLSK(SEQ ID NO:207), LQIEYLSK(SEQ ID NO:208), SDK, QEISDK(SEQ ID NO:209), YQGGR(SEQ ID NO:210), TLYQGGR(SEQ ID NO:211), NEK, VNEK(SEQ ID NO:212), DK, 및 VDK로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성한다.
추가의 다른 구현예에서, 본 발명의 Vip3A-특이적 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 FTTGTDLK(SEQ ID NO:255)를 포함하고, 아미노산 서열 TGTDLK(SEQ ID NO:256) 및 LK로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 표지 대리 펩티드는 dmEPSPS 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, MAGAEEIVLQPIK(SEQ ID NO:74), FPVEDAK(SEQ ID NO:75), EISGTVK(SEQ ID NO:76), ILLLAALSEGTTVVDNLLNSEDVHYMLGALR(SEQ ID NO:77) 및 SLTAAVTAAGGNATYVLDGVPR(SEQ ID NO:257)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, EPSPS-특이적 표지 대리 펩티드는 PIK, EIVLQPIK(SEQ ID NO:213), PVEDAK(SEQ ID NO:214), VEDAK(SEQ ID NO:215), SGTVK(SEQ ID NO:216), GTVK(SEQ ID NO:217), ILLLAA(SEQ ID NO:218), 및 HYMLGALR(SEQ ID NO:219)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성한다.
추가의 다른 구현예에서, 본 발명의 dmEPSPS-특이적 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 SLTAAVTAAGGNATYVLDGVPR(SEQ ID NO:257)을 포함하고, 아미노산 서열 PR 및 GVPR(SEQ ID NO:258)로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 표지 대리 펩티드는 PAT 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, DFELPAPPRPVRPVTQI(SEQ ID NO:78), LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79), MSPER(SEQ ID NO:80), HGGWHDVGFWQR(SEQ ID NO:81), NAYDWTVESTVYVSHR(SEQ ID NO:82), TEPQTPQEWIDDLER(SEQ ID NO:83), AAGYK(SEQ ID NO:84), YPWLVAEVEGVVAGIAYAGPWK(SEQ ID NO:85) 및 RPVEIRPATAADMAAVCDIVNHYIETSTVNFR(SEQ ID NO:86)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, PAT-특이적 표지 대리 펩티드는 DFE, DF, YTHLLK(SEQ ID NO:220), THLLK(SEQ ID NO:221), PER, SPER(SEQ ID NO:222), GFWQR(SEQ ID NO:223), VGFWQR(SEQ ID NO:224), STVYVSHR(SEQ ID NO:225), SHR, TEPQT(SEQ ID NO:226), DLER(SEQ ID NO:227), GYK, AGYK(SEQ ID NO:228), GPWK(SEQ ID NO:229) GIAYAGPWK(SEQ ID NO:230), TSTVNFR(SEQ ID NO:231), 및 NFR로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성한다.
추가의 다른 구현예에서, PAT-특이적 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79)를 포함하고, 아미노산 서열 YTHLLK(SEQ ID NO:220) 또는 THLLK(SEQ ID NO:221)로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 표지 대리 펩티드는 PMI 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, ENAAGIPMDAAER(SEQ ID NO:87), ALAILK(SEQ ID NO:88), SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89), GSQQLQLKPGESAFIAANESPVTVK(SEQ ID NO:90), FEAKPANQLLTQPVK(SEQ ID NO:91), STLLGEAVAK(SEQ ID NO:92), LINSVQNYAWGSK(SEQ ID NO:93), HNSEIGFAK(SEQ ID NO:94), VLCAAQPLSIQVHPNK(SEQ ID NO:95), TALTELYGMENPSSQPMAELWMGAHPK(SEQ ID NO:96), LSELFASLLNMQGEEK(SEQ ID NO:97) 및 QGAELDFPIPVDDFAFSLHDLSDK(SEQ ID NO:98)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, PMI-특이적 표지 대리 펩티드는 PMDAAER(SEQ ID NO:232), GIPMDAAER(SEQ ID NO:233), AILK(SEQ ID NO:234), LK, PWQTIR(SEQ ID NO:235), GEPWQTIR(SEQ ID NO:236), ANESPVTVK(SEQ ID NO:237), PVTVK(SEQ ID NO:238), LTQPVK(SEQ ID NO:239), PVK, GEAVAK(SEQ ID NO:240), LGEAVAK(SEQ ID NO:241), QNYAWGSK(SEQ ID NO:242), NYAWGSK(SEQ ID NO:243), NSEIGFAK(SEQ ID NO:244), HN, VLCAAQ(SEQ ID NO:245), PNK, WMGAHPK(SEQ ID NO:246), TALTE(SEQ ID NO:247), NMQGEEK(SEQ ID NO:248) LNMQGEEK(SEQ ID NO:249), SLHDLSDK(SEQ ID NO:250), 및 HDLSDK(SEQ ID NO:251)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성한다.
추가의 다른 구현예에서, PMI-특이적 대리 펩티드는 아미노산 서열 SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89)을 포함하고, 아미노산 서열 PWQTIR(SEQ ID NO:235) 또는 GEPWQTIR(SEQ ID NO:236)로 이루어진 전이 이온을 생성한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 Cry1Ab-특이적 표지 대리 펩티드는 SEQ ID NO:259의 아미노산 서열을 포함하는 Cry1Ab 단백질을 검출하고/하거나 정량화한다. 다른 구현예에서, Cry1Ab 단백질은 트랜스제닉 옥수수 이벤트 Bt11로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 eCry3.1Ab-특이적 표지 대리 펩티드는 SEQ ID NO:260의 아미노산 서열을 포함하는 eCry3.1Ab 단백질을 검출하고/하거나 정량화한다. 다른 구현예에서, eCry3.1Ab 단백질은 트랜스제닉 옥수수 이벤트 5307로부터 유래된다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 mCry3A-특이적 표지 대리 펩티드는 SEQ ID NO:261의 아미노산 서열을 포함하는 mCry3A 단백질을 검출하고/하거나 정량화한다. 다른 구현예에서, mCry3A 단백질은 트랜스제닉 옥수수 이벤트 MIR604로부터 유래된다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 Vip3-특이적 표지 대리 펩티드는 SEQ ID NO:262의 아미노산 서열을 포함하는 Vip3Aa 단백질을 검출하고/하거나 정량화한다. 다른 구현예에서, Vip3Aa 단백질은 트랜스제닉 옥수수 이벤트 MIR162로부터 유래된다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 dmEPSPS-특이적 표지 대리 펩티드는 SEQ ID NO:263의 아미노산 서열을 포함하는 dmEPSPS 단백질을 검출하고/하거나 정량화한다. 다른 구현예에서, dmEPSPS 단백질은 트랜스제닉 옥수수 이벤트 GA21로부터 유래된다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 PAT-특이적 표지 대리 펩티드는 SEQ ID NO:264의 아미노산 서열을 포함하는 PAT 단백질을 검출하고/하거나 정량화한다. 다른 구현예에서, PAT 단백질은 트랜스제닉 옥수수 이벤트 Bt11, 59122, TC1507, DP4114 또는 T25로부터 유래된다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 PMI-특이적 표지 대리 펩티드는 SEQ ID NO:265 또는 SEQ ID NO:266의 아미노산 서열을 포함하는 PMI 단백질을 검출하고/하거나 정량화한다. 다른 구현예에서, PMI 단백질은 트랜스제닉 옥수수 이벤트 MIR162, MIR604, 5307 또는 3272로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 표지 대리 펩티드는 Cry1Ab 단백질, eCry3.1Ab 단백질, mCry3A 단백질, Vip3A 단백질, dmEPSPS 단백질, PAT 단백질 및 PMI 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 트랜스제닉 단백질을 포함하는 트랜스제닉 단백질의 혼합물에서 Cry1Ab 단백질, eCry3.1Ab 단백질, mCry3A 단백질, Vip3 단백질, dmEPSPS 단백질, PAT 단백질 또는 PMI 단백질을 특이적으로 검출하거나 정량화한다. 다른 구현예에서, 트랜스제닉 단백질의 혼합물은 Cry1Ab 단백질, eCry3.1Ab 단백질, mCry3A 단백질, Vip3A 단백질, dmEPSPS 단백질, PAT 단백질 및 PMI 단백질을 포함한다. 추가의 다른 구현예에서, 트랜스제닉 단백질의 혼합물은 Cry1A.105 단백질(SEQ ID NO:267), Cry1F 단백질(SEQ ID NO:268), Cry34 단백질(SEQ ID NO:269) 및 Cry35 단백질(SEQ ID NO:270)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 트랜스제닉 단백질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 표지 대리 펩티드는 트랜스제닉 식물로부터의 생물학적 샘플 중 트랜스제닉 단백질의 혼합물에서 Cry1Ab 단백질, eCry3.1Ab 단백질, mCry3A 단백질, Vip3 단백질, dmEPSPS 단백질, PAT 단백질 또는 PMI 단백질을 특이적으로 검출하거나 정량화하고, 여기서 트랜스제닉 식물은 옥수수 식물, 대두 식물, 목화 식물, 벼 식물, 밀 식물 또는 카놀라 식물이다. 다른 구현예에서, 트랜스제닉 식물은 이벤트 Bt11, 이벤트 5307, 이벤트 MIR604, 이벤트 MIR162, 이벤트 3272 및 이벤트 GA21로 이루어진 군으로부터 선택된 트랜스제닉 이벤트를 포함하는 옥수수 식물이다. 추가의 다른 구현예에서, 트랜스제닉 옥수수 식물은 이벤트 MON89034, 이벤트 DP4114, 이벤트 TC1507, 이벤트 59122 또는 이벤트 T25를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 표지 대리 펩티드는 트랜스제닉 식물로부터의 잎 조직, 종자, 낟알, 화분, 또는 뿌리 조직으로부터의 생물학적 샘플에서 Cry1Ab 단백질, eCry3.1Ab 단백질, mCry3A 단백질, Vip3 단백질, dmEPSPS 단백질, PAT 단백질 또는 PMI 단백질을 특이적으로 검출하거나 정량화한다. 다른 구현예에서, 잎 조직, 종자, 낟알, 화분 또는 뿌리 조직은 트랜스제닉 옥수수 이벤트 Bt11, 5307, MIR604, MIR162, GA21, 3272, 59122, DP4114, TC1507 및 T25 중 하나 이상을 포함하는 트랜스제닉 옥수수 식물로부터 유래된다.
당업계에는 어떤 대리 펩티드가 임의의 주어진 표적 단백질에 최상인지를 예측하는 다수의 상이한 방법이 제안된 다수의 문헌들이 있으며, 다수의 참조문헌, 예를 들어, 문헌[Mead et al. 2009. Mol. Cell. Proteomics 8:696-705] 및 미국 특허 제8,227,252호에는 질량 분광법을 이용하여 표적 단백질을 정량화하는 간단한 방법이 제안되어 있다. 그러나, 이러한 예측 방법 및 간단한 방법에 대한 의존은 예측 불가능한 요인들이 질량 분광법 기반 검정에 간섭하여 부정확한 정량화 및 감도의 손실을 초래할 수 있기 때문에, 혼란스러운 결과를 초래할 수 있다. 적어도 하나의 주요 요인은 생물학적 매트릭스 자체에 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 식물로부터의 잎, 뿌리, 화분 및 종자로부터의 생물학적 샘플과 동등하게 잘 작용할 대리 펩티드로부터 단일 전이 이온을 식별하는 것은 매우 예측 불가능하며 어렵다. 매트릭스의 화학적 조성, pH, 또는 이온 강도의 차이는 MS 기기에서 단백질분해, 펩티드 안정성, 응집, 또는 이온화에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 모든 관련 매트릭스, 특히 트랜스제닉 식물에 대한 것들에 걸쳐 대리 펩티드 및 특이적 대리 펩티드/전이 이온 조합을 식별하고 실증적으로 시험하는 것은 이러한 검정의 예측 불가능한 성질을 극복하는 데 필수적이다. 본 발명은, 표적 트랜스제닉 단백질을 특이적으로 검출하고/하거나 정량화하기 위해 질량 분광법 검정을 진행하는 데 있어서 1) 단백질가수분해적으로 절단된 표적 단백질로부터 유래된 펩티드의 풀로부터 대리 펩티드를 시험 및 선택하고, SIL 대리 펩티드 및 전이 이온 펩티드의 조합을 시험하고, 모든 생물학적 매트릭스, 예를 들어, 트랜스제닉 식물의 잎, 뿌리, 화분 또는 종자로부터의 생물학적 샘플 전체에 걸쳐 표적 단백질을 특이적으로 검출하고 정량화하는 조합을 선택하는 것; 및 2) 트랜스제닉 식물, 특히 트랜스제닉 옥수수 식물의 잎, 뿌리, 화분 및 종자를 포함하는 모든 생물학적 매트릭스에서 모든 대리 펩티드 및 대리 펩티드/전이 이온 조합에 대해 작용하는 적절한 샘플 제조 방법 및 질량 분광기 조건을 실증적으로 결정하는 것을 포함하는 2-단계 접근을 이용한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 표적 트랜스제닉 단백질과 비-트랜스제닉 단백질의 혼합물을 포함하는 트랜스제닉 식물로부터의 복합적인 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 트랜스제닉 단백질을 동시에 검출하고/하거나 정량화하는 방법을 포괄하고, 여기서 본 방법은 다음 단계들을 포함한다: a) 트랜스제닉 식물로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; b) 생물학적 샘플로부터 단백질을 추출하여 단백질의 혼합물을 포함하는 추출물을 생성하는 단계; c) 단계 b의 추출물에서 비-트랜스제닉 불용성 단백질의 양을 감소시켜, 농축된 가용성 단백질의 추출물을 생성하는 단계; d) 단계 c의 추출물에서 가용성 단백질을 분해하여 펩티드 단편을 포함하는 추출물을 생성하는 단계로서, 펩티드 단편은 각 표적 트랜스제닉 단백질에 특이적인 적어도 하나의 비-표지 대리 펩티드를 포함하는, 단계; e) 단계 d의 추출물에서 펩티드 단편을 농축시키는 단계; f) 본 발명의 하나 이상의 표지 대리 펩티드를 첨가하는 단계로서, 각 표지 대리 펩티드는 표적 트랜스제닉 단백질로부터 유래된 각 비-표지 대리 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖고, 첨가된 표지 대리 펩티드의 수는 혼합물 중 표적 트랜스제닉 단백질의 수와 동일한, 단계; g) 혼합물 중 비-대리 펩티드의 양을 감소시킴으로써 비-표지 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드를 농축시키는 단계; h) 액체 크로마토그래피를 통해 단계 g로부터의 펩티드 단편 혼합물을 용해시키는 단계; i) 질량 분광법을 통해 단계 h로부터 생성된 펩티드 단편 혼합물을 분석하는 단계로서, 비-표지 대리 펩티드의 전이 이온 단편의 검출은 대리 펩티드가 유래된 표적 트랜스제닉 단백질의 존재를 가리키는, 단계; 및, 선택적으로, j) 단계 i의 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 표지 대리 펩티드의 전이 이온에 의해 발생된 질량 분광법 신호와 비교함으로써 생물학적 샘플에서 표적 트랜스제닉 단백질의 양을 계산하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상술된 방법에 의해 검출되고/되거나 정량화되는 표적 트랜스제닉 단백질은 Cry1Ab 단백질, eCry3.1Ab 단백질, mCry3A 단백질, Vip3 단백질, 이중 돌연변이체 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(dmEPSPS) 단백질, 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제(PAT) 단백질 또는 포스포만노스 이소머라제(PMI) 단백질이다.
본 발명의 방법에 의해 포괄되는 다른 구현예에서, 표적 트랜스제닉 단백질은 Cry1Ab이고, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21)를 포함하고, 아미노산 서열 PLTK(SEQ ID NO:132) 또는 SAEFNNII(SEQ ID NO:133)로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 추가의 다른 구현예에서, Cry1Ab 표적 단백질은 아미노산 서열 PLTK(SEQ ID NO:132)로 이루어진 비-표지 및 표지 전이 이온으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 정량화된다.
본 발명의 방법에 의해 포괄되는 다른 구현예에서, 표적 트랜스제닉 단백질은 eCry3.1Ab이고, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27)를 포함하고, 아미노산 서열 TDYHIDQV(SEQ ID NO:142) 또는 DYHIDQV(SEQ ID NO:143)로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 추가의 다른 구현예에서, eCry3.1Ab 표적 단백질은 아미노산 서열 TDYHIDQV(SEQ ID NO:142)로 이루어진 비-표지 및 표지 전이 이온으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 정량화된다.
본 발명의 방법에 의해 포괄되는 다른 구현예에서, 표적 트랜스제닉 단백질은 mCry3A이고, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 LQSGASVVAGPR(SEQ ID NO:252)을 포함하고, 아미노산 서열 SGASVVAGPR(SEQ ID NO:253) 또는 SVVAGPR(SEQ ID NO:254)로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 추가의 다른 구현예에서, mCry3A 표적 단백질은 아미노산 서열 SGASVVAGPR(SEQ ID NO:253)로 이루어진 비-표지 및 표지 전이 이온으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 정량화된다.
본 발명의 방법에 의해 포괄되는 다른 구현예에서, 표적 트랜스제닉 단백질은 Vip3A이고, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 FTTGTDLK(SEQ ID NO:255)를 포함하고, 아미노산 서열 TGTDLK(SEQ ID NO:256) 또는 LK로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 추가의 다른 구현예에서, Vip3A 표적 단백질은 아미노산 서열 TGTDLK(SEQ ID NO:256)로 이루어진 비-표지 및 표지 전이 이온으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 정량화된다.
본 발명의 방법에 의해 포괄되는 다른 구현예에서, 표적 트랜스제닉 단백질은 dmEPSPS이고, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 SLTAAVTAAGGNATYVLDGVPR(SEQ ID NO:257)을 포함하고, 아미노산 서열 PR 또는 GVPR(SEQ ID NO:258)로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 추가의 다른 구현예에서, eCry3.1Ab 표적 단백질은 아미노산 서열 PR로 이루어진 비-표지 및 표지 전이 이온으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 정량화된다.
본 발명의 방법에 의해 포괄되는 다른 구현예에서, 표적 트랜스제닉 단백질은 PAT이고, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79)를 포함하고, 아미노산 서열 YTHLLK(SEQ ID NO:220) 또는 THLLK(SEQ ID NO:221)로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 추가의 다른 구현예에서, PAT 표적 단백질은 아미노산 서열 YTHLLK(SEQ ID NO:220)로 이루어진 비-표지 및 표지 전이 이온으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 정량화된다.
본 발명의 방법에 의해 포괄되는 다른 구현예에서, 표적 트랜스제닉 단백질은 PMI이고, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89)을 포함하고, 아미노산 서열 PWQTIR(SEQ ID NO:235) 또는 GEPWQTIR(SEQ ID NO:236)로 이루어진 전이 이온을 생성한다. 추가의 다른 구현예에서, PMI 표적 단백질은 아미노산 서열 PWQTIR(SEQ ID NO:235)로 이루어진 비-표지 및 표지 전이 이온으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 정량화된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 트랜스제닉 표적 단백질의 고처리량 검출 또는 정량화를 위한 시스템을 포괄한다. 이러한 시스템은 트랜스제닉 표적 단백질에 특이적인 사전-설계된 표지 대리 펩티드의 카세트; 및 하나 이상의 질량 분광기를 포함한다. 이러한 구현예의 일 양태에서, 카세트는 Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3, dmEPSPS, PAT 및 PMI로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 단백질에 특이적인 표지 대리 펩티드를 포함한다. 이러한 구현예의 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:98 중 어느 하나를 포함한다. 이러한 구현예의 다른 양태에서, 표지 대리 펩티드는 SEQ ID NO:99 내지 SEQ ID NO:251, SEQ ID NO:254, SEQ ID NO:255, SEQ ID NO:256 중 적어도 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드 서열, 펩티드 PIR, TY, VW, HR, ISR, LEG, QFR, YR, PPR, DGR, IEF, LER, IDK, GDK, TCK, FEK, DVS, FTK, HK, VNI, MIV,EAK, HLK, NK, DNF, LLC, NAY, YE, SDK, NEK, DK, VDK, PIK, DFE, DF, PER, SHR, GYK, NFR, LK,PVK, HN, PNK 및 PR을 포함하는 하나 이상의 전이 이온을 생성한다.
본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 하기 특정 실시예가 포함된다. 이어지는 실시예에 개시된 기법은 본 발명의 실시에서 잘 작용하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기법을 나타내며, 이에 따라 이의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인지되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시에 비추어, 개시된 특정 구현예에서 많은 변화가 이루어질 수 있으며 본 발명의 개념, 사상 및 범위로부터 벗어남 없이 비슷하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 인지해야 한다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 작용제는 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서, 본원에 기재된 작용제를 대체할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 그러한 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구항에 정의된 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 여겨진다.
실시예
실시예 1 - 대리 펩티드 선택
MRM-기반 검정은 소정 세트의 펩티드를 선택하는 것에 의존하며, 각각의 선택된 대리 펩티드에 대한 특정 단편화/전이 이온에 좌우된다. 적합한 대리 또는 시그니처 펩티드를 선택하기 위해 여러 기준이 필요하다. 첫째로, 표적 단백질 카세트를 구성하는 단백질이 선택되어야 한다. 둘째로, 각 표적 단백질에 대해, 우수한 질량 분광법 반응을 나타내고 표적 단백질을 고유하게 식별하는 그러한 펩티드, 또는 이의 특이적 변형(즉, 번역 후 변형)이 식별되어야 한다. 셋째로, 각 질량 분광법 적합 펩티드에 대해, 최적의 신호 세기를 제공하고 대리 펩티드를 샘플에 존재하는 다른 펩티드 종과 고유하게 구별하는 그러한 전이 이온이 식별되어야 한다. 이러한 기준은 MRM-기반 검정을 수행하는 데 있어서 필수적이다.
7개의 트랜스제닉 단백질, Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3A, dmEPSPS, PAT 및 PMI로부터의 대리 펩티드를 MRM-기반 검정을 위해 식별 및 선택하였다. 트립신으로 분해된 미생물-생성된 단백질을 사용하여 MRM 검정을 진행하였다. 미생물-생성된 단백질을 개별적으로 물로 재구성하였다. 트리플루오로에탄올(TFE)을 이후 분취량의 각 단백질에 첨가하고, 이어서 100 mM 암모늄 바이카보네이트 및 트립신(1:10(w:w) 효소:단백질 비율)을 첨가하였다. 샘플을 약 37℃에서 밤새 분해하고, 이어서 약 0.05 M 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)을 첨가하였다. 각 단백질을 분취하여 약 200 pmol/μL의 최종 농도를 갖는 풀을 생성하였다. 이러한 펩티드 혼합물을 사용하여 QTRAP 6500 질량 분광기(AB Sciex LLC, 프레이밍햄, MA USA)에서 MRM 검정을 진행하였다. 펩티드 당 최적의 두 전이(질량 분광기에 의해 모니터링되는 펩티드 대리체 및 단편 이온 질량-대-전하(m/z) 비율의 조합)를 선택된 반응 모니터링 MS/MS를 이용하여 결정하였다. MS/MS 방법은 각 펩티드에 대해 이중 및 삼중 하전 펩티드 이온과 [m/z(대리체) + 20 Da] 초과의 m/z를 갖는 1차 및 2차 y 단편 이온의 시그니처 질량을 계산함으로써 진행하였다. 이들 계산된 전이가 MRM 스캔 동안 관찰된 경우, 기기를 자동으로 MS/MS 모드로 바꾸고, 대리 펩티드 이온의 전체 MS/MS 스펙트럼을 획득하였다. MS/MS 스펙트럼에서 두 개의 가장 강렬한 단편 이온(b 또는 y 단편 이온만) 및 이의 용리 시간을 각각의 획득된 펩티드에 대하여 결정하였다. 그 후에, 선택된 전이 각각에 대해 충돌 에너지(CE)를 최적화하였다. 진행된 MRM 검정을 보정 곡선 샘플의 분석을 위해 사용하였다.
MRM 검정은 7개의 트랜스제닉 단백질로부터 193개의 단백질형 펩티드를 표적화하였다. 이들 중 111개의 펩티드는 7개의 단백질에 고유했으며, 공지된 메이즈 단백질과 중복되지 않았다. 표 1은 아미노산 서열(적어도 4개의 아미노산을 포함하는 펩티드에 대한 서열 목록 식별자 포함), 단일동위원소 질량, 시그니처 전하 상태, 시그니처 m/z, 및 생성물 전이 m/z를 포함하는 각 표적 단백질에 대한 대리 펩티드 및 전이 이온의 특징을 열거한 것이다. 7개의 단백질 모두에 대해 고유의 대리 펩티드가 식별되었다: Cry1Ab(26), eCry3.1Ab(6), mCry3A(4), Vip3Aa20(39), dmEPSPS(5), PAT(9) 및 PMI(12). Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3A, dmEPSPS, PAT 및 PMI로부터의 이러한 대리 펩티드들은 Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3A, dmEPSPS, PAT 및 PMI 트랜스제닉 단백질에 대한 절대량 또는 상대량의 결정에 유용한 것으로 확인되었다. 표 1에 열거된 이러한 펩티드 각각 또는 펩티드의 조합은 용해물에서 질량 분광법에 의해 검출된 것이고, Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3A, dmEPSPS, PAT 및 PMI의 정량화를 위해 MRM-기반 검정에서 사용하기 위한 잠재적인 후보이다.
[표 1]
대리 펩티드 및 전이 이온의 특징.
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Figure pct00006

Figure pct00007

표적 단백질 Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3A, dmEPSPS, PAT 및 PMI에 대한 여러 잠재적인 대리 펩티드의 식별 후, 최적의 신호 세기를 제공하고 생물학적 샘플 매트릭스(예를 들어, 메이즈 잎, 뿌리, 화분, 또는 알맹이(종자))에 존재하는 다른 종으로부터의 표적 대리 펩티드를 구별하는 능력을 갖는 전이 이온을 기초로 개별 대리 펩티드를 추가로 선택하였다. 이는 매트릭스 간섭(즉, 매트릭스 간섭은 관심 대상의 펩티드에서 또는 그 부근에서 검출되는 매트릭스 내 하나 이상의 특정 구성성분임)과 잠재적인 캐리-오버(carry-over)(즉, 캐리-오버는 샘플 분석 시스템의 화학적/물리적 특징 또는 이 둘 모두로 인해 후속 분석 시 용출되는 이전에 주입된 샘플의 결과임) 둘 모두를 포함한다. 개별 대리 펩티드를 함유하는 카세트의 이러한 최적의 전이들은 전체 MRM 검정을 구성한다. 본 개시에서, 최고-감도(가장 강렬한 단편)를 제공하고 요망되는 특이성을 가진 Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3A, dmEPSPS, PAT 및 PMI로부터의 그러한 대리 펩티드를 추가로 선택하여, 7개의 표적화된 단백질을 정량화하기 위한 대리 펩티드의 카세트를 구성하였다. 표 2는 각 표적 단백질 Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3Aa20 dmEPSPS, PAT 및 PMI에 대한 바람직한 대리 펩티드, 및 상응하는 안정 동위원소 표지(SIL) 펩티드를 열거한 것이다. 대리 펩티드의 카세트는 동시에 모니터링되고/되거나 정량화될 하나 이상의 펩티드로 구성된다. 각 펩티드에 대한 특이적 단편화/전이 이온을 갖는 대리 펩티드의 카세트는 상응하는 표적 단백질을 정량화하기 위해 MRM 검정에서 사용될 수 있다.
[표 2]
표적 단백질을 특이적으로 검출하는 대리 펩티드 및 SIL 펩티드.
Figure pct00008

실시예 2 - 트랜스제닉 식물 조직에서 트랜스제닉 단백질을 검출하기 위한 검정
표적 단백질을 직접적으로 모니터링하기 위한 민감한 방법의 개발은 생물학적 매트릭스, 예컨대, 트랜스제닉 식물의 조직, 예를 들어, 잎, 알맹이, 뿌리 및 화분 조직으로부터의 생물학적 매트릭스에서 정량적 평가를 위해 매우 바람직하다. 다중 반응 모니터링(MRM) 질량 분광법은 탠덤 질량 분광법(MS/MS/)과 결합된 액체 크로마토그래피(LC)에 의해, 주어진 샘플 내에서 다중 단백질을 정량화하기 위한 유망한 플랫폼인 것으로 나타났다. MRM 검정은 단백질분해 펩티드의 서열-특이적 탠덤 MS 단편화를 이용하여 별개의 표적 단백질에 대한 고도 선택적 및 특이적 측정을 제공한다. 이러한 진보에도 불구하고, 풍부도가 낮은 단백질 또는 분리에 영향을 미치는 특이적 물리화학적 특성을 갖는 것들에 대한 정밀한 정량적 측정치를 얻는 것은 여전히 난제로 남아 있다.
MRM 검정은 전형적으로 삼중 사극자 질량 분광기에서 수행되지만, 이러한 방법론은 또한, 시그니처 이온의 단편화 시에 MS/MS 데이터가 규정 질량 범위 또는 전체 질량 범위에서 단편 이온에 대하여 획득되는 이온 트랩 기기에서 적용될 수 있다. 표적화된 펩티드의 머무름 시간과 조합된 일련의 전이(시그니처/단편 이온 m/z 쌍)는 MRM 검정을 구성할 수 있다. 최적의 MRM 검정을 달성하기 위해, (1) 표적 단백질/펩티드가 선택되어야 하고; (2) 대리 펩티드는 우수한 MS 및 MS/MS 신호를 발생시켜야 하고; (3) 선택된 각 펩티드 단편 이온은 최적의 신호 세기를 제공하고 복합적인 생물학적 샘플에 존재하는 다른 펩티드 종과 표적 펩티드를 구별해야 한다. 총괄하여, 대리 펩티드 및 단편 이온은, 요망되는 전이만이 기록되고 샘플에 존재하는 다른 신호는 무시되기 때문에, 펩티드 선택에 높은 특이성을 제공한다.
당업계에서의 흔한 오해는 MRM 검정이 특이성 및 감도를 보장하고, 샘플 준비가 단순화되고 심지어 생략될 수 있으며, 크로마토그래피 분리가 필요하지 않거나 거의 필요하지 않다는 것이다. 그러나, 이러한 잘못된 개념과는 달리, MRM 검정은 샘플의 복잡성에 의해 고도로 영향을 받아 특이적 표적 펩티드의 감도를 감소시키는 경향이 있다. 특이성 및 감도는 매트릭스 효과, 예를 들어, 잎, 화분, 뿌리, 줄기 간의 차이에 의해 영향을 받을 수 있고, MS 분석 중에 발생하는 이온 억제를 초래할 수 있다. 일반적으로, 대부분의 하전되거나 이온화 가능한 분자, 예를 들어, 염, 카오트로프(chaotrope), 세제, 폴리머, 모든 비휘발성 이온성 화합물은 요망되는 피분석물, 즉, 펩티드/단백질의 이온화에 간섭하고, 그에 따라 신호 억제 및/또는 상승된 배경 잡음을 경쟁시키고 초래한다. 이온 억제는 검출 능력, 정확도 및 정밀도와 같은 여러 분석 매개변수에 부정적으로 영향을 미친다. 따라서, 당업계에서는 MRM 질량 분광법 방법에서 이러한 모든 결함을 극복하기 위해, 표적 단백질을 풍부하게 하고/하거나, 표적화된 단백질/펩티드의 이온 세기를 감소시키고 검정의 재현성 및 정밀도에 영향을 미칠 수 있는 간섭을 제거하도록, 복합적인 생물학적 샘플, 예를 들어, 트랜스제닉 식물 샘플로부터 표적 단백질을 효율적으로 추출하기 위한 방법을 개발하는 것이 요구된다.
일반적으로, 샘플 준비를 개선하는 것이 매트릭스 효과를 감소시키고 이온 억제를 막는 가장 효과적인 방식일 수 있다. 이러한 방법은 간섭을 집중시키지 않으면서 선택된 표적 단백질 및 펩티드를 풍부하게 하는 능력을 가능하게 하고, 이로써 낮은 표적 단백질 농도에서 정밀하고 정확한 정량화가 가능하다.
대리 펩티드(표 1 또는 표 2로부터의)의 카세트를 사용하는 MRM-기반 검정을 이용하여 7개의 단백질 중 적어도 하나를 함유하는 상이한 트랜스제닉 이벤트에서 Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3A, dmEPSPS, PAT 및 PMI를 측정하였다(표 4). 연구에서 평가된 트랜스제닉 이벤트는 다음과 같았다: Bt11(Cry1Ab 및 PAT); 5307(eCry3.1Ab 및 PMI); MIR604(mCry3A 및 PMI); MIR162(Vip3Aa20 및 PMI) 및 GA21(dmEPSPS).
조직 추출 - 12 mg 내지 15 mg의 동결건조된 조직(잎, 뿌리, 화분 알맹이 및 전체 식물)을 2 μL의 라이싱 매트릭스(Lysing Matrix) A FastPrep 튜브(MP Biomedicals, 산타 아나, CA)에 넣었다. 0.1% RapiGest를 갖는 1.0 μL 내지 1.5 μL(w/v)의 PBS를 이후 첨가하였다. 다음으로, 주위 온도에서 1회 사이클(40 s, 속도 설정 6) 동안 라이싱 매트릭스 A(가넷 매트릭스 및 ¼" 세라믹 구형 비드)가 있는 FastPrep-24 조직 균질기(MP Biomedicals, 산타 아나, CA)에서 샘플을 추출하였다. 동결건조된 조직 mg 당 50 μl 추출 완충액(6 M 우레아, 2 M 티오우레아, 5 mM EDTA, 0.1 M HEPES)에서, 선택된 조직으로부터 단백질을 추출하였다.
원심 분리 - 조직 추출 후, 샘플을 15,000 g으로 4℃에서 약 5분 동안 원심분리하였다. 이 단계는 불용성 단백질, 예를 들어, 히스톤 및 액틴을 뽑아내 분해 전 추출물의 복잡성을 감소시킨다. 따라서, 가용성 단백질만이 효소 분해 단계로 이동하게 된다.
트립신 분해 - 원심분리 단계로부터의 상청액의 총 단백질 농도를 균질화 완충액에서의 희석에 의해 약 0.2 μg/μl로 조절하였다. 등가의 30 μg의 단백질을 웰 플레이트로 옮겼다. 1 부피의 트리플루오로에탄올을 샘플에 첨가하고, 저속으로 진탕시키면서 실온에서 약 30분 동안 인큐베이션하였다. 4 부피의 100 mM 암모늄 바이카보네이트를 첨가하였다. 약 12 μl의 트립신(0.1 μg/μl)을 이후 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후에, 샘플을 20% 포름산으로 켄칭하였다(1% 최종). 20 μl의 안정 동위원소-표지 펩티드를 이후 첨가하였다.
원심분리 - 이전 단계로부터의 샘플을 이후 15,000 g으로 4℃에서 약 5분 동안 원심분리하였다.
MCX에 의한 탈염 - 원심분리 후, 샘플을 탈염시켰다. 이 단계를 이온 교환 컬럼에서 수행하였다. 이러한 탈염 단계는 세척 시 관심 대상이 아닌 펩티드를 폐기함으로써 관심 대상의 펩티드를 농축시키는 것이다. 관심 대상이 아닌 펩티드를 제거하는 것 외에도, 이러한 단계는 또한 관심 대상의 대리 펩티드의 이온화 및 검출에 간섭할 수 있는 염 및 소분자를 제거한다. 관심 대상의 펩티드를 농축시키고, 간섭하는 염 및 소분자를 제거하는 것은 당업계에 공지된 다른 방법에 비해 본 발명의 MRM 검정의 감도를 증가시킨다.
QTRAP-MRM - Halo Peptide ES-C18 컬럼을 구비한 NanoAcquity UPLC에 결합된 QTRAP 6500을 사용하여 MRM 분석을 수행하였다. 유량은 약 18 μl/min이었다. 용매 A는 약 97/3의 물/DMSO + 0.2% 포름산(FA)이고, 용매 B는 약 97/3의 아세토니트릴(CAN)/DMSO + 0.2% FA였다. 오토샘플러 온도를 분석 동안 약 4℃에서 유지하였다. 총 8 μl의 샘플을 주위 온도에서 유지되는 컬럼 상에 주입하였다.
데이터 분석 - Analyst 소프트웨어(AB SCIEX, 온타리오, 캐나다)를 사용하여 데이터 획득을 수행하고, Multiquant 소프트웨어 (AB SCIEX)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.
본 발명의 바람직한 표지 대리 펩티드를 사용하여 표적 트랜스제닉 단백질의 검출 수준(LOD)을 결정하기 위해, 모든 7개의 표적 단백질, Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3A, dmEPSPS, PAT 및 PMI를 함께 혼합하고, 비-트랜스제닉 옥수수 식물의 잎, 뿌리, 알맹이 및 화분 조직에 첨가하였다. 표 3 내지 표 6은 MRM에 의한 표적 단백질의 검출 수준(LOD)을 나타낸 것이고, 각 표지 대리 펩티드 및 이의 생성된 전이 이온이, 모든 식물 매트릭스 전체에 걸쳐 표적 단백질이 다른 트랜스제닉 및 비-트랜스제닉 단백질의 존재 하에 있을 때 표적 단백질을 선택적으로 검출하고 정량화할 수 있다는 것을 입증한다. 표 2의 바람직한 각 대리 펩티드에 대하여 우수한 선형성(r=0.988-0.998)이 달성되었다. 각 대리 펩티드에 대한 LOD는 ELISA에 의해 확립된 정량 범위보다 낮았으며, 이는 본 발명의 조성물 및 방법이 식물에서 트랜스제닉 단백질을 정량화하는 데 사용된 현재 표준과 동등하거나 이보다 우수하다는 것을 나타낸다.
[표 3]
옥수수 잎 매트릭스 중 표적 단백질의 LOD. (LOD = fmol/μg 총 단백질)
Figure pct00009

[표 4]
옥수수 알맹이 매트릭스 중 표적 단백질의 LOD. (LOD = fmol/μg 총 단백질)
Figure pct00010

[표 5]
옥수수 뿌리 매트릭스 중 표적 단백질의 LOD. (LOD = fmol/μg 총 단백질)
Figure pct00011

[표 6]
옥수수 화분 매트릭스 중 표적 단백질의 LOD. (LOD = fmol/μg 총 단백질)
Figure pct00012

바람직한 표지 대리 펩티드(표 2) 및 이들의 전이 이온을 이후 Bt11(Cry1Ab 및 PAT 포함), 5307(eCry3.1Ab 및 PMI 포함), MIR604(mCry3A 및 PMI 포함), MIR162(Vip3A 및 PMI 포함) 및 GA21(dmEPSPS 포함)로 이루어진 군으로부터 선택된 트랜스제닉 이벤트를 포함하는 트랜스제닉 옥수수 식물로부터의 잎, 알맹이, 뿌리 및 화분 조직에서 표적 단백질을 특이적으로 검출하는 이의 능력을 결정하기 위해 시험하였다. 바람직한 7개 대리 펩티드 각각을 트랜스제닉 이벤트 각각에 대하여 시험하였다. 표 7은 표적 단백질의 정량화 결과를 나타낸 것이다. 결과는 Cry1Ab 및 PAT 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드가 이벤트 Bt11을 포함하는 트랜스제닉 옥수수 식물로부터의 잎, 알맹이, 뿌리 및 화분에서 Cry1Ab 및 PAT를 검출하고/하거나 정량화할 수 있다는 것을 입증한다. 시험된 식물에 대하여, Cry1Ab 단백질은 화분(표 5 참조) 조직에서 LOD 미만이었고, PAT 단백질은 알맹이 및 화분에서 LOD 미만이었다(표 4 및 표 5 참조). eCry3.1Ab 및 PMI 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드는 이벤트 5307을 포함하는 트랜스제닉 옥수수 식물로부터의 잎, 알맹이, 뿌리 및 화분에서 eCry3.1Ab 및 PMI를 검출할 수 있다. 시험된 식물에 대하여 eCry3.1Ab 단백질은 화분에서 LOD 미만이었다(표 5 참조). mCry3A 및 PMI 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드는 이벤트 MIR604를 포함하는 트랜스제닉 옥수수 식물로부터의 잎, 알맹이, 뿌리 및 화분에서 mCry3A 및 PMI 단백질을 검출할 수 있다. 시험된 식물에 대하여 mCry3A 단백질은 화분에서 LOD 미만이었다(표 5 참조). Vip3Aa20 및 PMI 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드는 이벤트 MIR162를 포함하는 트랜스제닉 옥수수 식물로부터의 잎, 알맹이, 뿌리 및 화분에서 Vip3Aa20 및 PMI 단백질을 검출할 수 있다. dmEPSPS 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드는 이벤트 GA21을 포함하는 트랜스제닉 옥수수 식물로부터의 잎, 알맹이, 뿌리 및 화분에서 dmEPSPS 단백질을 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 표지 대리 펩티드의 능력을 추가로 특성규명하기 위해, 상술된 검정을 모든 7개의 단백질, Cry1Ab, eCry3.1Ab, mCry3A, Vip3A, dmEPSPS, PAT 및 PMI를 발현하는 육종 스택에서 수행하였다. 결과는 육종 스택에 함유된 모든 7개 단백질이 LC-SRM에 의해 동시에 검출 및 정량화될 수 있다는 것을 입증해 준다.
표 1 및/또는 표 2에 열거된 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드는 본 발명의 표적 단백질을 검출하고/하거나 정량화할 수 있다. 이러한 펩티드 각각 또는 이러한 펩티드들의 조합은 표적 단백질에 대한 정량적 MRM 검정에서 사용하기 위한 후보이다.
[표 7]
트랜스제닉 식물에서의 표적 단백질 검출 및 정량화.
Figure pct00013

본 발명은 이의 특정 구현예와 연관하여 기술되었지만, 본 발명의 장치는 추가 변형이 가능하다는 것이 이해될 것이다. 본 특허 출원은, 본 발명의 임의의 변화, 사용, 또는 개조(일반적으로 본 발명의 원리를 따르며, 발명이 속하는 기술 분야 내의 공지되어 있거나 관례적인 실시 내에 속하고 기재 전에 본원의 필수적인 특징에 적용될 수 있으며 첨부된 청구항의 범위에 따르는 본 개시로부터의 일탈을 포함함)를 포함하는 것으로 하고자 한다.
본 명세서에서 언급되는 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 본원에서 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별적 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로, 참조로서 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Syngenta Participations AG Young, Scott Sessler, Richard Graser, Gerson Guilbaud, Rudolf Schirm, Michael Isabelle, Maxim <120> Biomarkers For Transgenic Proteins <130> 81319-US-L-ORG-NAT-1 <160> 270 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 1 Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu Gly Ser Ile Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 2 Ile Val Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 3 Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 4 Asp Val Ser Val Phe Gly Gln Arg 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 5 Thr Tyr Pro Ile Arg 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 6 Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 7 Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg 1 5 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 8 Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 9 Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 10 Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg 1 5 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 11 Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 12 Asn Gln Ala Ile Ser Arg 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 13 Ile Glu Glu Phe Ala Arg 1 5 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 14 Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 15 Leu Ser His Val Ser Met Phe Arg 1 5 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 16 Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 17 Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu Ser Phe Arg 1 5 10 15 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 18 Tyr Asn Gln Phe Arg 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 19 Tyr Asn Asp Leu Thr Arg 1 5 <210> 20 <211> 19 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 20 Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr Asp 1 5 10 15 Ala His Arg <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 21 Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile 1 5 10 15 Pro Leu Thr Lys 20 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 22 Gln Gly Phe Ser His Arg 1 5 <210> 23 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 23 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg 20 25 <210> 24 <211> 19 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 24 Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr 1 5 10 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47 Ala Leu Tyr Val His Lys 1 5 <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 48 Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr 1 5 10 15 Ala Lys <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 49 Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Ile Lys 1 5 10 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 50 Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg 1 5 10 <210> 51 <211> 13 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 51 Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys 1 5 10 <210> 52 <211> 25 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 52 Met Ile Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile 1 5 10 15 Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys 20 25 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 53 Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 54 Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys 1 5 10 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 55 Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 56 Tyr Met Ser Gly Ala Lys 1 5 <210> 57 <211> 19 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 57 Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu 1 5 10 15 Leu Ala Lys <210> 58 <211> 5 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 58 Val Tyr Glu Ala Lys 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 59 Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu Arg 1 5 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 60 Gly Lys Pro Ser Ile His Leu Lys 1 5 <210> 61 <211> 24 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 61 Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asn Leu 1 5 10 15 Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys 20 <210> 62 <211> 27 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 62 Asp Asn Phe Tyr Ile Glu Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Pro Ile Val His Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys 20 25 <210> 63 <211> 26 <212> PRT 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Mutated EPSPS <400> 77 Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn 1 5 10 15 Leu Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg 20 25 30 <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Streptomyces viridochromogenes <400> 78 Asp Phe Glu Leu Pro Ala Pro Pro Arg Pro Val Arg Pro Val Thr Gln 1 5 10 15 Ile <210> 79 <211> 13 <212> PRT <213> Streptomyces viridochromogenes <400> 79 Leu Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys 1 5 10 <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Streptomyces viridochromogenes <400> 80 Met Ser Pro Glu Arg 1 5 <210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Streptomyces viridochromogenes <400> 81 His Gly Gly Trp His Asp Val Gly Phe Trp Gln Arg 1 5 10 <210> 82 <211> 16 <212> PRT <213> Streptomyces viridochromogenes <400> 82 Asn Ala Tyr Asp Trp Thr Val Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser His Arg 1 5 10 15 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Streptomyces viridochromogenes <400> 83 Thr Glu Pro Gln Thr Pro Gln Glu Trp Ile Asp Asp Leu Glu Arg 1 5 10 15 <210> 84 <211> 5 <212> PRT 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thuringiensis <400> 130 Thr Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg 1 5 <210> 131 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 131 Tyr Thr Asp Ala His Arg 1 5 <210> 132 <211> 4 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 132 Pro Leu Thr Lys 1 <210> 133 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 133 Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Ile 1 5 <210> 134 <211> 4 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 134 Phe Ser His Arg 1 <210> 135 <211> 5 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 135 Gly Phe Ser His Arg 1 5 <210> 136 <211> 7 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 136 Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg 1 5 <210> 137 <211> 4 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 137 Gly Gly Glu Arg 1 <210> 138 <211> 7 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 138 Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg 1 5 <210> 139 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 139 Pro Asn Tyr Asp Ser Arg 1 5 <210> 140 <211> 6 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 140 Pro Ser Ala Val Tyr Arg 1 5 <210> 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Streptomyces viridiochromes <400> 227 Asp Leu Glu Arg 1 <210> 228 <211> 4 <212> PRT <213> Streptomyces viridiochromes <400> 228 Ala Gly Tyr Lys 1 <210> 229 <211> 4 <212> PRT <213> Streptomyces viridiochromes <400> 229 Gly Pro Trp Lys 1 <210> 230 <211> 9 <212> PRT <213> Streptomyces viridiochromes <400> 230 Gly Ile Ala Tyr Ala Gly Pro Trp Lys 1 5 <210> 231 <211> 7 <212> PRT <213> Streptomyces viridiochromes <400> 231 Thr Ser Thr Val Asn Phe Arg 1 5 <210> 232 <211> 7 <212> PRT <213> Eschericia coli <400> 232 Pro Met Asp Ala Ala Glu Arg 1 5 <210> 233 <211> 9 <212> PRT <213> Eschericia coli <400> 233 Gly Ile Pro Met Asp Ala Ala Glu Arg 1 5 <210> 234 <211> 4 <212> PRT <213> Eschericia coli <400> 234 Ala Ile Leu Lys 1 <210> 235 <211> 6 <212> PRT <213> Eschericia coli <400> 235 Pro Trp Gln Thr Ile Arg 1 5 <210> 236 <211> 8 <212> PRT <213> Eschericia coli <400> 236 Gly Glu Pro Trp Gln Thr Ile Arg 1 5 <210> 237 <211> 9 <212> PRT <213> Eschericia coli <400> 237 Ala Asn Glu Ser Pro Val Thr Val 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55 60 Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln 65 70 75 80 Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr 85 90 95 Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu 100 105 110 Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val 115 120 125 Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn 130 135 140 Asn Phe Thr Leu Thr Ser Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val 145 150 155 160 Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe 165 170 175 Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn 180 185 190 Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr 195 200 205 Tyr Asn Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp 210 215 220 Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp 225 230 235 240 Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln 245 250 255 Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu 260 265 270 Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu 275 280 285 Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe 290 295 300 Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu 305 310 315 320 Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr 325 330 335 Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro 340 345 350 Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly 355 360 365 Phe Gly Asn Pro His Tyr Val Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln 370 375 380 Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile 385 390 395 400 Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp 405 410 415 Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro 420 425 430 Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp 435 440 445 Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile 450 455 460 Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr 465 470 475 480 Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr 485 490 495 Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu 500 505 510 Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu 515 520 525 Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe 530 535 540 Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser 545 550 555 560 Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser 565 570 575 Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile 580 585 590 Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu 595 600 605 <210> 269 <211> 123 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 269 Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His 1 5 10 15 Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg 20 25 30 Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala 35 40 45 Glu Ser Asn Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser 50 55 60 Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala 65 70 75 80 Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Ser Gln Tyr Glu Ile 85 90 95 Ile Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile 100 105 110 Gln Thr Thr Ser Ser Arg Tyr Gly His Lys Ser 115 120 <210> 270 <211> 354 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 270 Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly 1 5 10 15 Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu 20 25 30 Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe 35 40 45 Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala 50 55 60 Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn 85 90 95 Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala 100 105 110 Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser 115 120 125 Asn Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Val Gln Thr Ile Gln 130 135 140 Leu Pro Gln Lys Pro Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys 145 150 155 160 Tyr Ser Pro Thr Gly Asn Ile Asp Asn Gly Thr Ser Pro Gln Leu Met 165 170 175 Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp 180 185 190 Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr 195 200 205 Gln Tyr Trp Gln Arg Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His 210 215 220 Glu Lys Lys Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln Lys 225 230 235 240 Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly 245 250 255 Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys 260 265 270 Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser His Glu Thr Lys 275 280 285 Ile Met Glu Lys Tyr Gln Glu Gln Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp 290 295 300 Gln Ser Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu 305 310 315 320 Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Gln Ile Gln Thr Ser 325 330 335 Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asn His Gln Gln Ala 340 345 350 Leu Leu

Claims (55)

  1. 하나 이상의 트랜스제닉(transgenic) 식물로부터의 하나 이상의 생물학적 샘플 중 트랜스제닉 단백질과 비-트랜스제닉 단백질의 혼합물에서 Cry1Ab 단백질, eCry3.1Ab 단백질, mCry3A 단백질, Vip3 단백질, 이중 돌연변이체 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(dmEPSPS) 단백질, 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제(PAT) 단백질 및 포스포만노스 이소머라제(PMI) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 트랜스제닉 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하기 위해 질량 분광법 검정에서 작용하는 표지 대리 펩티드(labeled surrogate peptide)로서, 대리 펩티드는 표지 및 GSAQGIEGSIR(SEQ ID NO:1), IVAQLGQGVYR(SEQ ID NO:2), TLSSTLYR(SEQ ID NO:3), DVSVFGQR(SEQ ID NO:4), TYPIR(SEQ ID NO:5), TVSQLTR(SEQ ID NO:6), WYNTGLER(SEQ ID NO:7), EWEADPTNPALR(SEQ ID NO:8), VWGPDSR(SEQ ID NO:9), APMFSWIHR(SEQ ID NO:10), WGFDAATINSR(SEQ ID NO:11), NQAISR(SEQ ID NO:12), IEEFAR(SEQ ID NO:13), SGFSNSSVSIIR(SEQ ID NO:14), LSHVSMFR(SEQ ID NO:15), EIYTNPVLENFDGSFR(SEQ ID NO:16), LEGLSNLYQIYAESFR(SEQ ID NO:17), YNQFR(SEQ ID NO:18), YNDLTR(SEQ ID NO:19), SPHLMDILNSITIYTDAHR(SEQ ID NO:20), SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21), QGFSHR(SEQ ID NO:22), MDNNPNINECIPYNCLSNPEVEVLGGER(SEQ ID NO:23), ELTLTVLDIVSLFPNYDSR(SEQ ID NO:24), RPFNIGINNQQLSVLDGTEFAYGTSSNLPSAVYR(SEQ ID NO:25), SGTVDSLDEIPPQNNNVPPR(SEQ ID NO:26), TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27), AVNELFTSSNQIGLK(SEQ ID NO:28), ITQLPLTK(SEQ ID NO:29), GLDSSTTK(SEQ ID NO:30), QCAGIRPYDGR(SEQ ID NO:31), IEFVPAEVTFEAEYDLER(SEQ ID NO:32), ITQLPLVK(SEQ ID NO:33), MTADNNTEALDSSTTK(SEQ ID NO:34), VYIDK(SEQ ID NO:35), DGGISQFIGDK(SEQ ID NO:36), LITLTCK(SEQ ID NO:37), ELLLATDLSNK(SEQ ID NO:38), FEELTFATETSSK(SEQ ID NO:39), EVLFEK(SEQ ID NO:40), TASELITK(SEQ ID NO:41), DVSEMFTTK(SEQ ID NO:42), LLGLADIDYTSIMNEHLNK(SEQ ID NO:43), IDFTK(SEQ ID NO:44), TDTGGDLTLDEILK(SEQ ID NO:45), DIMNMIFK(SEQ ID NO:46), ALYVHK(SEQ ID NO:47), VNILPTLSNTFSNPNYAK(SEQ ID NO:48), ITSMLSDVIK(SEQ ID NO:49), QNLQLDSFSTYR(SEQ ID NO:50), DSLSEVIYGDMDK(SEQ ID NO:51), MIVEAKPGHALIGFEISNDSITVLK(SEQ ID NO:52), VYFSVSGDANVR(SEQ ID NO:53), NQQLLNDISGK(SEQ ID NO:54), VESSEAEYR(SEQ ID NO:55), YMSGAK(SEQ ID NO:56), DGSPADILDELTELTELAK(SEQ ID NO:57), VYEAK(SEQ ID NO:58), LDAINTMLR(SEQ ID NO:59), GKPSIHLK(SEQ ID NO:60), DENTGYIHYEDTNNNLEDYQTINK(SEQ ID NO:61), DNFYIELSQGNNLYGGPIVHFYDVSIK(SEQ ID NO:62), LLCPDQSEQIYYTNNIVFPNEYVITK(SEQ ID NO:63), SQNGDEAWGDNFIILEISPSEK(SEQ ID NO:64), NAYVDHTGGVNGTK(SEQ ID NO:65), LDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSK(SEQ ID NO:66), IANEQNQVLNDVNNK(SEQ ID NO:67), YEVTANFYDSSTGEIDLNK(SEQ ID NO:68), QNYALSLQIEYLSK(SEQ ID NO:69), QLQEISDK(SEQ ID NO:70), LLSPELINTNNWTSTGSTNISGNTLTLYQGGR(SEQ ID NO:71), YVNEK(SEQ ID NO:72), QNYQVDK(SEQ ID NO:73), MAGAEEIVLQPIK(SEQ ID NO:74), FPVEDAK(SEQ ID NO:75), EISGTVK(SEQ ID NO:76), ILLLAALSEGTTVVDNLLNSEDVHYMLGALR(SEQ ID NO:77), DFELPAPPRPVRPVTQI(SEQ ID NO:78), LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79), MSPER(SEQ ID NO:80), HGGWHDVGFWQR(SEQ ID NO:81), NAYDWTVESTVYVSHR(SEQ ID NO:82), TEPQTPQEWIDDLER(SEQ ID NO:83), AAGYK(SEQ ID NO:84), YPWLVAEVEGVVAGIAYAGPWK(SEQ ID NO:85), RPVEIRPATAADMAAVCDIVNHYIETSTVNFR(SEQ ID NO:86), ENAAGIPMDAAER(SEQ ID NO:87), ALAILK(SEQ ID NO:88), SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89), GSQQLQLKPGESAFIAANESPVTVK(SEQ ID NO:90), FEAKPANQLLTQPVK(SEQ ID NO:91), STLLGEAVAK(SEQ ID NO:92), LINSVQNYAWGSK(SEQ ID NO:93), HNSEIGFAK(SEQ ID NO:94), VLCAAQPLSIQVHPNK(SEQ ID NO:95), TALTELYGMENPSSQPMAELWMGAHPK(SEQ ID NO:96), LSELFASLLNMQGEEK(SEQ ID NO:97) 및 QGAELDFPIPVDDFAFSLHDLSDK(SEQ ID NO:98)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 표지 대리 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 펩티드는 안정 동위원소 표지(stable isotope labeled: SIL) 아미노산의 혼입에 의해 표지되는, 표지 대리 펩티드.
  3. 제2항에 있어서, SIL 아미노산은 리신, 이소류신, 발린 또는 아르기닌인, 표지 대리 펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 혼합물에서 Cry1Ab 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, GSAQGIEGSIR(SEQ ID NO:1), IVAQLGQGVYR(SEQ ID NO:2), TLSSTLYR(SEQ ID NO:3), DVSVFGQR(SEQ ID NO:4), TYPIR(SEQ ID NO:5), TVSQLTR(SEQ ID NO:6), WYNTGLER(SEQ ID NO:7), EWEADPTNPALR(SEQ ID NO:8), VWGPDSR(SEQ ID NO:9), APMFSWIHR(SEQ ID NO:10), WGFDAATINSR(SEQ ID NO:11), NQAISR(SEQ ID NO:12), IEEFAR(SEQ ID NO:13), SGFSNSSVSIIR(SEQ ID NO:14), LSHVSMFR(SEQ ID NO:15), EIYTNPVLENFDGSFR(SEQ ID NO:16), LEGLSNLYQIYAESFR(SEQ ID NO:17), YNQFR(SEQ ID NO:18), YNDLTR(SEQ ID NO:19), SPHLMDILNSITIYTDAHR(SEQ ID NO:20), SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21), QGFSHR(SEQ ID NO:22), MDNNPNINECIPYNCLSNPEVEVLGGER(SEQ ID NO:23), ELTLTVLDIVSLFPNYDSR(SEQ ID NO:24), RPFNIGINNQQLSVLDGTEFAYGTSSNLPSAVYR(SEQ ID NO:25) 및 SGTVDSLDEIPPQNNNVPPR(SEQ ID NO:26)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 표지 대리 펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 펩티드는 GIEGSIR(SEQ ID NO:99), EGSIR(SEQ ID NO:100), AQLGQGVYR(SEQ ID NO:101), GQGVYR(SEQ ID NO:102); SSTLYR(SEQ ID NO:103), STLYR(SEQ ID NO:104), SVFGQR(SEQ ID NO:105), FGQR(SEQ ID NO:106), PIR, TY, SQLTR(SEQ ID NO:107), QLTR(SEQ ID NO:108), NTGLER(SEQ ID NO:109), YNTGLER(SEQ ID NO:110), PTNPALR(SEQ ID NO:111), DPTNPALR(SEQ ID NO:112), GPDSR(SEQ ID NO:113), VW, HR, SWIHR(SEQ ID NO:114), ATINSR(SEQ ID NO:115), DAATINSR(SEQ ID NO:116), AISR(SEQ ID NO:117), ISR, EFAR(SEQ ID NO:118), EEFAR(SEQ ID NO:119), SNSSVSIIR(SEQ ID NO:120), SSVSIIR(SEQ ID NO:121), SMFR(SEQ ID NO:122), VSMFR(SEQ ID NO:123), ENFDGSFR(SEQ ID NO:124), GSFR(SEQ ID NO:125), YAESFR(SEQ ID NO:126), LEG, NQFR(SEQ ID NO:127), QFR, DLTR(SEQ ID NO:128), NDLTR(SEQ ID NO:129), TIYTDAHR(SEQ ID NO:130), YTDAHR(SEQ ID NO:131), PLTK(SEQ ID NO:132), SAEFNNII(SEQ ID NO:133), FSHR(SEQ ID NO:134), GFSHR(SEQ ID NO:135), EVLGGER(SEQ ID NO:136), GGER(SEQ ID NO:137), FPNYDSR(SEQ ID NO:138), PNYDSR(SEQ ID NO:139), PSAVYR(SEQ ID NO:140), YR, PPR, 및 SGTVDSLDE(SEQ ID NO:141)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성하는, 대리 펩티드.
  6. 제4항에 있어서, 펩티드는 아미노산 서열 SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21)를 포함하고, 아미노산 서열 PLTK(SEQ ID NO:132) 또는 SAEFNNII(SEQ ID NO:133)로 이루어진 전이 이온을 생성하는, 대리 펩티드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 eCry3.1Ab 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27), AVNELFTSSNQIGLK(SEQ ID NO:28), ITQLPLTK(SEQ ID NO:29), GLDSSTTK(SEQ ID NO:30), QCAGIRPYDGR(SEQ ID NO:31) 및 IEFVPAEVTFEAEYDLER(SEQ ID NO:32)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 펩티드는 TDYHIDQV(SEQ ID NO:142), DYHIDQV(SEQ ID NO:143), TSSNQIGLK(SEQ ID NO:144), SSNQIGLK(SEQ ID NO:145), QLPLTK(SEQ ID NO:146), TQLPLTK(SEQ ID NO:147), DSSTTK(SEQ ID NO:148), SSTTK(SEQ ID NO:149), PYDGR(SEQ ID NO:150), DGR, IEF, 및 LER로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성하는, 대리 펩티드.
  9. 제7항에 있어서, 펩티드는 아미노산 서열 TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27)를 포함하고, 아미노산 서열 TDYHIDQV(SEQ ID NO:142) 또는 DYHIDQV(SEQ ID NO:143)로 이루어진 전이 이온을 생성하는, 대리 펩티드.
  10. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 mCry3A 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, ITQLPLVK(SEQ ID NO:33), MTADNNTEALDSSTTK(SEQ ID NO:34) 및 VYIDK(SEQ ID NO:35)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 펩티드는 QLPLVK(SEQ ID NO:151), TQLPLVK(SEQ ID NO:152), ALDSSTTK(SEQ ID NO:153), EALDSSTTK(SEQ ID NO:154), YIDK(SEQ ID NO:155) 및 IDK로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성하는, 대리 펩티드.
  12. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 Vip3A 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, DGGISQFIGDK(SEQ ID NO:36), LITLTCK(SEQ ID NO:37), ELLLATDLSNK(SEQ ID NO:38), FEELTFATETSSK(SEQ ID NO:39), EVLFEK(SEQ ID NO:40), TASELITK(SEQ ID NO:41), DVSEMFTTK(SEQ ID NO:42), LLGLADIDYTSIMNEHLNK(SEQ ID NO:43), IDFTK(SEQ ID NO:44), TDTGGDLTLDEILK(SEQ ID NO:45), DIMNMIFK(SEQ ID NO:46), ALYVHK(SEQ ID NO:47), VNILPTLSNTFSNPNYAK(SEQ ID NO:48), ITSMLSDVIK(SEQ ID NO:49), QNLQLDSFSTYR(SEQ ID NO:50), DSLSEVIYGDMDK(SEQ ID NO:51), MIVEAKPGHALIGFEISNDSITVLK(SEQ ID NO:52), VYFSVSGDANVR(SEQ ID NO:53), NQQLLNDISGK(SEQ ID NO:54), VESSEAEYR(SEQ ID NO:55), YMSGAK(SEQ ID NO:56), DGSPADILDELTELTELAK(SEQ ID NO:57), VYEAK(SEQ ID NO:58), LDAINTMLR(SEQ ID NO:59), GKPSIHLK(SEQ ID NO:60), DENTGYIHYEDTNNNLEDYQTINK(SEQ ID NO:61), DNFYIELSQGNNLYGGPIVHFYDVSIK(SEQ ID NO:62), LLCPDQSEQIYYTNNIVFPNEYVITK(SEQ ID NO:63), SQNGDEAWGDNFIILEISPSEK(SEQ ID NO:64), NAYVDHTGGVNGTK(SEQ ID NO:65), LDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSK(SEQ ID NO:66), IANEQNQVLNDVNNK(SEQ ID NO:67), YEVTANFYDSSTGEIDLNK(SEQ ID NO:68), QNYALSLQIEYLSK(SEQ ID NO:69), QLQEISDK(SEQ ID NO:70), LLSPELINTNNWTSTGSTNISGNTLTLYQGGR(SEQ ID NO:71), YVNEK(SEQ ID NO:72) 및 QNYQVDK(SEQ ID NO:73)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 펩티드는 SQFIGDK(SEQ ID NO:156), GDK, TLTCK(SEQ ID NO:157), TCK, ATDLSNK(SEQ ID NO:158), LATDLSNK(SEQ ID NO:159), TFATETSSK(SEQ ID NO:160), FATETSSK(SEQ ID NO:161), FEK, LFEK(SEQ ID NO:162), SELITK(SEQ ID NO:163), ASELITK(SEQ ID NO:164), SEMFTTK(SEQ ID NO:165), DVS, IMNEHLNK(SEQ ID NO:166), MNEHLNK(SEQ ID NO:167), DFTK(SEQ ID NO:168), FTK, TLDEILK(SEQ ID NO:169), LTLDEILK(SEQ ID NO:170), MNMIFK(SEQ ID NO:171), NMIFK(SEQ ID NO:172), YVHK(SEQ ID NO:173), HK, VNI, VNIL(SEQ ID NO:174), SMLSDVIK(SEQ ID NO:175), TSMLSDVIK(SEQ ID NO:176), DSFSTYR(SEQ ID NO:177), LDSFSTYR(SEQ ID NO:178), IYGDMDK(SEQ ID NO:179), VIYGDMDK(SEQ ID NO:180), SNDSITVLK(SEQ ID NO:181), MIV, SGDANVR(SEQ ID NO:182), SVSGDANVR(SEQ ID NO:183), LLNDISGK(SEQ ID NO:184), LNDISGK(SEQ ID NO:185), SSEAEYR(SEQ ID NO:186), ESSEAEYR(SEQ ID NO:187), SGAK(SEQ ID NO:188), MSGAK(SEQ ID NO:189), TELTELAK(SEQ ID NO:190), DGSPADI(SEQ ID NO:191), YEAK(SEQ ID NO:192), EAK, NTMLR(SEQ ID NO:193), AINTMLR(SEQ ID NO:194), PSIHLK(SEQ ID NO:195), HLK, DYQTINK(SEQ ID NO:196), NK, DNF, DNFY(SEQ ID NO:197), PNEYVITK(SEQ ID NO:198), LLC, SPSEK(SEQ ID NO:199), LEISPSEK(SEQ ID NO:200), NAY, DHTGGVNGTK(SEQ ID NO:201), GNLNTELSK(SEQ ID NO:202), NTELSK(SEQ ID NO:203), LNDVNNK(SEQ ID NO:204), NDVNNK(SEQ ID NO:205), YE, DLNK(SEQ ID NO:206), QIEYLSK(SEQ ID NO:207), LQIEYLSK(SEQ ID NO:208), SDK, QEISDK(SEQ ID NO:209), YQGGR(SEQ ID NO:210), TLYQGGR(SEQ ID NO:211), NEK, VNEK(SEQ ID NO:212), DK, 및 VDK로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성하는, 대리 펩티드.
  14. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 dmEPSPS 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, MAGAEEIVLQPIK(SEQ ID NO:74), FPVEDAK(SEQ ID NO:75), EISGTVK(SEQ ID NO:76) 및 ILLLAALSEGTTVVDNLLNSEDVHYMLGALR(SEQ ID NO:77)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 펩티드는 PIK, EIVLQPIK(SEQ ID NO:213), PVEDAK(SEQ ID NO:214), VEDAK(SEQ ID NO:215), SGTVK(SEQ ID NO:216), GTVK(SEQ ID NO:217), ILLLAA(SEQ ID NO:218), 및 HYMLGALR(SEQ ID NO:219)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성하는, 대리 펩티드.
  16. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 PAT 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, DFELPAPPRPVRPVTQI(SEQ ID NO:78), LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79), MSPER(SEQ ID NO:80), HGGWHDVGFWQR(SEQ ID NO:81), NAYDWTVESTVYVSHR(SEQ ID NO:82), TEPQTPQEWIDDLER(SEQ ID NO:83), AAGYK(SEQ ID NO:84), YPWLVAEVEGVVAGIAYAGPWK(SEQ ID NO:85) 및 RPVEIRPATAADMAAVCDIVNHYIETSTVNFR(SEQ ID NO:86)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 펩티드는 DFE, DF, YTHLLK(SEQ ID NO:220), THLLK(SEQ ID NO:221), PER, SPER(SEQ ID NO:222), GFWQR(SEQ ID NO:223), VGFWQR(SEQ ID NO:224), STVYVSHR(SEQ ID NO:225), SHR, TEPQT(SEQ ID NO:226), DLER(SEQ ID NO:227), GYK, AGYK(SEQ ID NO:228), GPWK(SEQ ID NO:229) GIAYAGPWK(SEQ ID NO:230), TSTVNFR(SEQ ID NO:231), 및 NFR로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성하는, 대리 펩티드.
  18. 제16항에 있어서, 펩티드는 아미노산 서열 LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79)를 포함하고, 아미노산 서열 YTHLLK(SEQ ID NO:220) 또는 THLLK(SEQ ID NO:221)로 이루어진 전이 이온을 생성하는, 대리 펩티드.
  19. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 PMI 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하고, ENAAGIPMDAAER(SEQ ID NO:87), ALAILK(SEQ ID NO:88), SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89), GSQQLQLKPGESAFIAANESPVTVK(SEQ ID NO:90), FEAKPANQLLTQPVK(SEQ ID NO:91), STLLGEAVAK(SEQ ID NO:92), LINSVQNYAWGSK(SEQ ID NO:93), HNSEIGFAK(SEQ ID NO:94), VLCAAQPLSIQVHPNK(SEQ ID NO:95), TALTELYGMENPSSQPMAELWMGAHPK(SEQ ID NO:96), LSELFASLLNMQGEEK(SEQ ID NO:97) 및 QGAELDFPIPVDDFAFSLHDLSDK(SEQ ID NO:98)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 펩티드는 PMDAAER(SEQ ID NO:232), GIPMDAAER(SEQ ID NO:233), AILK(SEQ ID NO:234), LK, PWQTIR(SEQ ID NO:235), GEPWQTIR(SEQ ID NO:236), ANESPVTVK(SEQ ID NO:237), PVTVK(SEQ ID NO:238), LTQPVK(SEQ ID NO:239), PVK, GEAVAK(SEQ ID NO:240), LGEAVAK(SEQ ID NO:241), QNYAWGSK(SEQ ID NO:242), NYAWGSK(SEQ ID NO:243), NSEIGFAK(SEQ ID NO:244), HN, VLCAAQ(SEQ ID NO:245), PNK, WMGAHPK(SEQ ID NO:246), TALTE(SEQ ID NO:247), NMQGEEK(SEQ ID NO:248) LNMQGEEK(SEQ ID NO:249), SLHDLSDK(SEQ ID NO:250), 및 HDLSDK(SEQ ID NO:251)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 전이 이온을 생성하는, 대리 펩티드.
  21. 제19항에 있어서, 펩티드는 아미노산 서열 SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89)을 포함하고, 아미노산 서열 PWQTIR(SEQ ID NO:235) 또는 GEPWQTIR(SEQ ID NO:236)로 이루어진 전이 이온을 생성하는, 대리 펩티드.
  22. 제4항에 있어서, Cry1Ab 단백질은 SEQ ID NO:259의 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  23. 제22항에 있어서, Cry1Ab 단백질은 이벤트 Bt11로부터 유래되는, 대리 펩티드.
  24. 제7항에 있어서, eCry3.1Ab 단백질은 SEQ ID NO:260의 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  25. 제24항에 있어서, eCry3.1Ab 단백질은 이벤트 5307로부터 유래되는, 대리 펩티드.
  26. 제10항에 있어서, mCry3A 단백질은 SEQ ID NO:261의 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  27. 제26항에 있어서, mCry3A 단백질은 이벤트 MIR604로부터 유래되는, 대리 펩티드.
  28. 제12항에 있어서, Vip3A 단백질은 SEQ ID NO:262의 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  29. 제28항에 있어서, Vip3A 단백질은 이벤트 MIR162로부터 유래되는, 대리 펩티드.
  30. 제14항에 있어서, dmEPSPS 단백질은 SEQ ID NO:263의 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  31. 제30항에 있어서, dmEPSPS 단백질은 이벤트 GA21로부터 유래되는, 대리 펩티드.
  32. 제16항에 있어서, PAT 단백질은 SEQ ID NO:264의 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  33. 제32항에 있어서, PAT 단백질은 이벤트 Bt11, 59122, TC1507, DP4114 또는 T25로부터 유래되는, 대리 펩티드.
  34. 제19항에 있어서, PMI 단백질은 SEQ ID NO:265 또는 SEQ ID NO:266의 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  35. 제34항에 있어서, PMI 단백질은 이벤트 MIR162, 이벤트 MIR604, 이벤트 5307 또는 이벤트 3272로부터 유래되는, 대리 펩티드.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스제닉 단백질의 혼합물은 Cry1Ab 단백질, eCry3.1Ab 단백질, mCry3A 단백질, Vip3A 단백질, dmEPSPS 단백질, PAT 단백질 및 PMI 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 트랜스제닉 단백질을 포함하는, 대리 펩티드.
  37. 제36항에 있어서, 트랜스제닉 단백질의 혼합물은 Cry1Ab 단백질, eCry3.1Ab 단백질, mCry3A 단백질, Vip3A 단백질, dmEPSPS 단백질, PAT 단백질 및 PMI 단백질을 포함하는, 표지 대리 펩티드.
  38. 제37항에 있어서, 트랜스제닉 단백질의 혼합물은 Cry1A.105 단백질(SEQ ID NO:267), Cry2Ab 단백질(SEQ ID NO:268), Cry1F 단백질(SEQ ID NO:269), Cry34 단백질(SEQ ID NO:270) 및 Cry35 단백질(SEQ ID NO:271)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 트랜스제닉 단백질을 추가로 포함하는, 표지 대리 펩티드.
  39. 제1항에 있어서, 트랜스제닉 식물은 옥수수, 대두, 목화, 벼, 밀, 카놀라 및 가지로 이루어진 군으로부터 선택되는, 대리 펩티드.
  40. 제39항에 있어서, 트랜스제닉 옥수수 식물은 이벤트 Bt11, 이벤트 5307, 이벤트 MIR604 및 이벤트 GA21로 이루어진 군으로부터 선택된 트랜스제닉 옥수수 이벤트를 포함하는, 대리 펩티드.
  41. 제40항에 있어서, 트랜스제닉 옥수수 식물은 이벤트 Bt11, 이벤트 5307, MIR604 및 이벤트 GA21을 포함하는, 대리 펩티드.
  42. 제41항에 있어서, 트랜스제닉 옥수수 식물은 이벤트 3272, 이벤트 MON89034, 이벤트 DP4114, 이벤트 1577 또는 이벤트 59122를 추가로 포함하는, 대리 펩티드.
  43. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플은 잎 조직, 종자, 낟알, 화분, 또는 뿌리 조직으로부터 유래되는, 대리 펩티드.
  44. 제43항에 있어서, 생물학적 샘플은 이벤트 Bt11로부터의 Cry1Ab 단백질, 이벤트 5307로부터의 eCry3.1Ab 단백질, 이벤트 MIR604로부터의 mCry3A 단백질, 이벤트 GA21로부터의 EPSPS 단백질, Bt11, 59122, DP4114, TC1507 또는 T25로부터의 PAT 단백질, 또는 이벤트 MIR162, 이벤트 MIR604, 이벤트 5307 또는 이벤트 3272로부터의 PMI 단백질을 포함하는, 대리 펩티드.
  45. 제44항에 있어서, 생물학적 샘플은 이벤트 MON89034로부터의 Cry1A.105 단백질, 이벤트 1507로부터의 Cry1F 단백질, 또는 이벤트 59122로부터의 Cry34 및 Cry35 단백질을 추가로 포함하는, 대리 펩티드.
  46. 제1항의 적어도 두 개의 표지 대리 펩티드를 포함하는 검정 카세트(assay cassette).
  47. 표적 트랜스제닉 단백질과 비-트랜스제닉 단백질의 혼합물을 포함하는 트랜스제닉 식물로부터의 복합적인 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 트랜스제닉 단백질을 동시에 검출하거나 정량화하는 방법으로서,
    a. 트랜스제닉 식물로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    b. 생물학적 샘플로부터 단백질을 추출하여 단백질의 혼합물을 포함하는 추출물을 생성하는 단계;
    c. 단계 b의 추출물에서 비-트랜스제닉 불용성 단백질의 양을 감소시켜, 농축된 가용성 단백질의 추출물을 생성하는 단계;
    d. 단계 c의 추출물에서 가용성 단백질을 분해하여 펩티드 단편을 포함하는 추출물을 생성하는 단계로서, 펩티드 단편은 각 표적 트랜스제닉 단백질에 특이적인 적어도 하나의 대리 펩티드를 포함하는, 단계;
    e. 단계 d의 추출물에서 펩티드 단편을 농축시키는 단계,
    f. 제1항의 하나 이상의 표지 대리 펩티드를 첨가하는 단계로서, 각 표지 대리 펩티드는 표적 트랜스제닉 단백질의 각 대리 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖고, 첨가된 표지 대리 펩티드의 수는 혼합물 중 표적 트랜스제닉 단백질의 수와 동일한, 단계;
    g. 혼합물 중 비-대리 펩티드의 양을 감소시킴으로써 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드를 농축시키는 단계;
    h. 액체 크로마토그래피를 통해 단계 g로부터의 펩티드 단편 혼합물을 용해시키는 단계;
    i. 질량 분광법을 통해 단계 h로부터 생성된 펩티드 단편 혼합물을 분석하는 단계로서, 표지 대리 펩티드의 전이 이온 단편의 검출은 대리 펩티드가 유래된 표적 트랜스제닉 단백질의 존재를 가리키는, 단계; 및, 선택적으로,
    j. 단계 i의 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 표지 대리 펩티드의 전이 이온에 의해 발생된 질량 분광법 신호와 비교함으로써 생물학적 샘플에서 표적 트랜스제닉 단백질의 양을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 표적 트랜스제닉 단백질은 Cry1Ab 단백질, eCry3.1Ab 단백질, mCry3A 단백질, Vip3 단백질, 이중 돌연변이체 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(dmEPSPS) 단백질, 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제(PAT) 단백질 또는 포스포만노스 이소머라제(PMI) 단백질인, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 표적 트랜스제닉 단백질은 Cry1Ab이고, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21)를 포함하고, 아미노산 서열 PLTK(SEQ ID NO:132) 또는 SAEFNNII(SEQ ID NO:133)로 이루어진 전이 이온을 생성하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, Cry1Ab 표적 단백질은 아미노산 서열 PLTK(SEQ ID NO: 132)로 이루어진 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 생물학적 샘플에서 정량화되는, 방법.
  51. 제47항에 있어서, 표적 트랜스제닉 단백질은 eCry3.1Ab 단백질이고, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27)를 포함하고, 아미노산 서열 TDYHIDQV(SEQ ID NO:142) 또는 DYHIDQV(SEQ ID NO:143)로 이루어진 전이 이온을 생성하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, eCry3.1Ab 트랜스제닉 단백질은 아미노산 서열로 이루어진 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 비교함으로써 생물학적 샘플에서 정량화되는, 방법.
  53. 제38항에 있어서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 DGGISQFIGDK(SEQ ID NO:36)를 포함하고, 아미노산 서열 SQFIGDK(SEQ ID NO:156) 또는 GDK로 이루어진 전이 이온을 생성하는, 방법.
  54. 제38항에 있어서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79)를 포함하고, 아미노산 서열 YTHLLK(SEQ ID NO:220) 또는 THLLK(SEQ ID NO:221)로 이루어진 전이 이온을 생성하는, 방법.
  55. 제38항에 있어서, 표지 대리 펩티드는 아미노산 서열 SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89)을 포함하고, 아미노산 서열 PWQTIR(SEQ ID NO:235) 또는 GEPWQTIR(SEQ ID NO:236)로 이루어진 전이 이온을 생성하는, 방법.
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