KR20220002420A - 단백질 검출을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 액체 크로마토그래피 결합 탠덤 질량 분광법 다중 반응 모니터링(MRM)에 의해 농작물 샘플을 포함하여 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 HPPD 단백질을 직접적으로 정량화하는 특이적인 이온화 특징을 갖는 펩티드 바이오마커에 관한 것이다. MRM-기반 방법과 조합된 펩티드 바이오마커는 선택된 펩티드 바이오마커를 단독으로 또는 조합하여 사용하여 메이즈와 같은 농작물 내에서 단일 표적 단백질 또는 다중 표적 단백질을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시는 식물 매트릭스를 포함하여 여러 생물학적 매트릭스에서 광범위하고 신뢰 가능한 정량화를 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 여러 펩티드 바이오마커 조합이 제공된다.

Description

단백질 검출을 위한 조성물 및 방법
전자 제출된 서열 목록에 대한 참조
서열 목록의 공식 사본은, 2020년 4월 20일에 생성되고 크기가 1 킬로바이트이며 파일명이 "81875-WO-REG-ORG-P-1_SeqList.txt"인 ASCII 형식의 서열 목록으로 EFS-Web을 통해 전자 제출되었고, 명세서와 함께 파일링되었다. 이러한 ASCII 형식 문서에 포함된 서열 목록은 명세서의 일부이고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 복합적인 생물학적 샘플에서 표적 단백질을 선택적으로 검출하고, 정량화하고, 특성규명하기 위한 질량 분광법의 용도에 관한 것이다.
면역검정, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA)은 식물의 유전자 변형을 통해 도입된 단백질 또는 식물 내인성 단백질의 검출 및 정량화를 위해 현재 농업에서 선호되는 방법이다. 면역검정의 중요한 구성요소는 표적 단백질(항원)에 대한 특이성을 갖는 항체이다. 면역검정은 고도로 특이적일 수 있으며, 흔히 샘플은 분석되기 전에 단지 간단한 준비만을 필요로 한다. 더욱이, 면역검정은 광범위한 농도에 걸쳐 정성적으로 또는 정량적으로 사용될 수 있다. 전형적으로, 면역검정에는 관심 대상의 각 단백질에 대한 개별 시험이 필요하다. 항체는 동물에서 상승된 다클론성이거나, 세포 배양에 의해 생성된 단클론성일 수 있다. 이들의 성질에 의해, 다클론성 항체의 혼합물은 다중 인식 에피토프를 가질 것이며, 이는 감도를 증가시킬 수 있지만, 또한 존재하는 여러 항체 파라토프의 수에 따라 기타 단백질과의 서열 및 구조적 상동성의 가능성이 증가하므로 특이성을 감소시킬 가능성이 있다. 단클론성 항체는 단일 에피토프 또는 항원 결정기에 대해 균일한 친화성 및 특이성을 나타내고 방대한 양으로 생성될 수 있기 때문에 다클론성 항체에 비해 일부 장점을 제공한다. 그러나, 유사한 트랜스제닉 또는 내인성 단백질의 복합적인 혼합물에서 단일 단백질의 선택적 검출 및 정량화와 같은 보다 까다로운 적용에 있어 이들의 사용을 제한하는 모든 항체의 내재적 특성이 있다. 또한, 다클론성 항체와 단클론성 항체 둘 모두에는 검정에서 감도를 향상시키고 배경을 감소시키는 추가 정제 단계가 필요할 수 있다. 또한, ELISA 시스템은 이의 물리적 및 생물학적 특성에 극적인 영향을 미칠 수 있는 표적 단백질에 대한 미묘한 변화를 검출하지 못할 가능성이 있다. 예를 들어, 항체는 포스포릴화 또는 글리코실화와 같은 번역 후 변형에 의해 변경되었거나, 형태적으로 가려지거나, 부분 열화에 의해 변형된 특정 형태의 단백질 또는 펩티드를 인식하지 못할 수 있다. 이러한 변형의 확인은 이러한 단백질들의 물리적 및 생물학적 특성의 변화가 이들의 효소적, 임상적 또는 다른 생물학적 활성에 있어서 중요한 역할을 할 수 있기 때문에 필수적이다. 이러한 변화는 ELISA-기반 정량화 방법의 신뢰성 및 유용성을 제한할 수 있다.
현재, 농작물에서 단백질의 유효한 식별 및/또는 정량화의 수행은 면역검정의 정확성에 좌우된다. 성공적인 면역검정의 개발은 항체 개발에 사용되는 항원의 특정 특징, 즉, 항원의 크기, 소수성 및 3차 구조 및 항체의 질 및 정확성에 좌우된다. 항체의 특이성은 위양성 결과를 초래할 수 있는 유사한 물질과의 임의의 교차 반응을 설명하기 위해 신중히 확인되어야 한다. 업계의 현재 문제는 상업적으로 입수 가능한 시험 키트에서 다수의 항체들이 상이한 농작물에서 다양한 단백질 중의 유사한 단백질들을 구별하지 않는다는 점이다.
질량 분광법(MS)은 단백질 분석을 위한 ELISA의 다수의 한계를 극복하는 대안적인 플랫폼을 제공한다. MS-기반 분석 분야는, 탠덤 질량 분광법과 결합된 전기분무 액체 크로마토그래피(LC-MS/MS)에 의한 다중 반응 모니터링(MRM)과 같은, 표적화된 단백질 분석의 중요한 진보를 이루어냈다. 기본 개념은 단백질이 단백질 분해 후 이들의 특정 구성성분 펩티드(대리 펩티드)를 측정함으로써 정량화될 수 있다는 것이다. 선택한 펩티드에 대한 데이터 획득만으로, 더 높은 정밀성, 감도, 및 처리량을 갖는 측정이 가능해진다. 대리 펩티드의 MRM-기반 측정에 의한 단백질 정량화는 단백질 분석에서 가장 신속하게 성장하고 있는 MS 응용이다. MRM-기반 단백질 검정은 면역-기반 검정에 비해 두 가지 강력한 이점을 제공하는데, 첫 번째는 항체의 사용 없이 본질적으로 임의의 단백질에 대한 특이적 검정을 체계적으로 구성하는 능력이다. 두 번째는 단일 분석에서 다수의 펩티드의 다중화된 분석을 수행하는 표적화된 MS 분석의 능력이다. 또한, MRM은 직접적인 분석이고, 여기서 면역-기반 검정은 간접적이다. 면역-기반 검정은 특이적으로 결합하고 효소를 사용하여 적절하게 정량화될 수 있는 신호를 생성할 검출 시약과 함께 고체상에 고정될 수 있는 결찰 시약으로 구성된 결합 검정에 의존한다.
따라서, MRM-기반 검정에서 작용하는 데 필요한 모든 생화학적 특성을 갖고, 중복되는 아미노산 서열을 높은 비율로 가질 수 있는 표적 단백질에 절대적으로 특이적이라는 추가 특성을 갖는 대리 펩티드를 식별할 지속적 필요성(즉, 대리 펩티드의 전이 상태 중 하나 이상은 다중의 복합적인 매트릭스에 걸쳐 두 개의 밀접하게 관련된 표적 단백질을 간섭 없이 명확하게 구별할 수 있음)이 존재한다. 이러한 선택적인 대리 펩티드 및 이들의 전이 상태는, 서로 유사하거나 트랜스제닉 농작물에서의 트랜스제닉 단백질과 유사한 표적 단백질을 구별할 수 있어야 한다.
본 발명은 질량 분광법을 사용하여 복합적인 생물학적 매트릭스에 존재하는 표적 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하는 데 유용한 표지 대리 펩티드(labeled surrogate peptide) 및 이들의 각 전이 이온을 제공한다. 본 발명은 표지 대리 펩티드 및 전이 이온을 사용하여 복합적인 생물학적 매트릭스에서 표적 HPPD 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하기 위한 방법 및 시스템을 추가로 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 내부 표준 펩티드 마커는 경험적 분석 및 인 실리코 분해 분석을 통해 설계되고; 중질 아미노산 잔기로 화학적으로 합성되거나 안정 동위원소-표지(stable isotope-labeled) 아미노산(들) 또는 대사 중간체의 존재 하에 합성 유전자를 발현함으로써 유전적으로 합성된다. 특정 구현예에서, 내부 표준물은 탠덤 질량 분광법(MS/MS) 분석, 보다 구체적으로, 액체 크로마토그래피-결합 탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS) 분석을 포함하는 질량 분광법 분석(MS)에 의해 개별적으로 특성규명될 수 있다. 특성규명 후, 각 펩티드의 단일 동위원소 질량, 이의 대리 전하 상태, 대리 m/z 값, m/z 전이 이온, 및 각 전이 이온의 이온 유형과 같은, 펩티드의 사전 선택된 펩티드 매개변수가 수집될 수 있다. 다른 고려사항으로는 펩티드 크기 최적화, 번역 후 변형 방지, 공정 유도 변형 방지 및 높은 비율의 누락된 프로테아제 절단 방지가 포함된다.
일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 농작물로부터의 하나 이상의 생물학적 샘플에서 단백질의 혼합물 중에 p-하이드록시페닐피우르베이트 디옥시게나제(HPPD) 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하도록 질량 분광법 검정에서 기능하는 표지 대리 펩티드로서, 대리 펩티드는 표지 및 GNFSELFK(SEQ ID NO:1) 및 GNFSQLFK(SEQ ID NO:2)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 표지 대리 펩티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 표지 대리 펩티드는 안정 동위원소 표지(SIL) 아미노산의 혼입에 의해 표지된다. 다른 구현예에서, SIL 아미노산은 리신, 이소류신, 발린 또는 아르기닌이다. 다른 구현예에서, 식물은 보리, 벼, 대두, 밀, 귀리 또는 메이즈(maize)이다. 또 다른 구현예에서, 농작물은 보리, 벼, 대두, 밀 또는 벼이고, 대리 펩티드는 표지 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 농작물은 메이즈이고, 대리 펩티드는 표지 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 제1항의 적어도 두 개의 표지 대리 펩티드를 포함하는 검정 카세트(assay cassette)를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 표적 단백질과 비-표적 단백질의 혼합물을 포함하는 농작물로부터의 복합적인 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 HPPD 단백질을 동시에 검출하거나 정량화하는 방법을 제공하고, 본 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 농작물로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 단백질을 추출하여 단백질의 혼합물을 포함하는 추출물을 생성하는 단계; (c) 단계 b의 추출물에서 불용성 단백질의 양을 감소시켜, 농축된 가용성 단백질의 추출물을 생성하는 단계; (d) 단계 c의 추출물에서 가용성 단백질을 분해하여 펩티드 단편을 포함하는 추출물을 생성하는 단계로서, 펩티드 단편은 표적 단백질에 특이적인 적어도 하나의 대리 펩티드를 포함하는, 단계; € 단계 d의 추출물에서 펩티드 단편을 농축시키는 단계; (f) 본 발명의 하나 이상의 표지 대리 펩티드를 첨가하는 단계로서, 각 표지 대리 펩티드는 표적 단백질의 각 대리 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖고, 첨가된 표지 대리 펩티드의 수는 혼합물 중 표적 단백질의 수와 동일한, 단계; (g) 혼합물 중 비-대리 펩티드의 양을 감소시킴으로써 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드를 농축시키는 단계; (h) 액체 크로마토그래피를 통해 단계 g로부터의 펩티드 단편 혼합물을 용해시키는 단계; (i) 질량 분광법을 통해 단계 h로부터 생성된 펩티드 단편 혼합물을 분석하는 단계로서, 표지 대리 펩티드의 전이 이온 단편의 검출은 대리 펩티드가 유래된 표적 단백질의 존재를 가리키는, 단계; 및, 선택적으로, (j) 단계 i의 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 전이에 의해 발생된 질량 분광법 신호와 비교함으로써 생물학적 샘플에서 표적 단백질의 양을 계산하는 단계. 일부 구현예에서, 농작물은 보리, 벼, 대두, 밀 또는 벼이고, 대리 펩티드는 표지 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 농작물은 메이즈이고, 대리 펩티드는 표지 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 펩티드는 안정 동위원소 표지(SIL) 아미노산의 혼입에 의해 표지된다. 또 다른 구현예에서, SIL 아미노산은 리신, 이소류신, 발린 또는 아르기닌이다.
대리 펩티드의 다수의 상이한 조합이 본 발명의 HPPD 단백질로부터의 특이적 대리 펩티드 중 하나 이상과 MRM 검정에 의해 동시에 모니터링 및 정량화될 수 있고, 이에 따라 질량 분광법에 의해 생물학적 샘플로부터 얻어진 주어진 단백질 제제 중 그러한 단백질 각각의 총량을 측정하는 수단을 제공한다. MRM 기반 검정과 함께 이러한 펩티드는 상이한 성장 단계의 농작물에서 발현 수준을 결정하기 위한, 잎 조직, 종자 및 낟알, 화분 및 뿌리 조직을 포함하지만 이로 제한되지 않는 상이한 농작물 조직 및 기관에서 발현 수준을 결정하기 위한, 규제 위험 평가에 대한 잠재적 노출 수준을 결정하기 위한, 식품 가공, 비교, 및 세대 연구에서 단백질의 상이한 수준을 결정하기 위한 정량적 펩티드/단백질 분석을 포함하는 수많은 적용들을 갖는다. 가장 넓은 의미로, 7개의 단백질에 대한 이러한 고유의 대리 펩티드들은 모든 유형의 생물학적 및 비생물학적 매트릭스에서 농업적 적용, 생물학적 등가 시험, 바이오마커, 진단, 발견, 식품, 환경, 치료 모니터링을 포함하는 수많은 적용을 위해 MRM 검정과 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 표지 대리 펩티드를 포함하는 검정 카세트가 제공되며, 이는 본 발명의 임의의 하나 이상의 표적 단백질의 동시적이고 선택적인 검출 또는 정량화를 가능하게 한다.
본 발명은 또한 농작물로부터의 생물학적 샘플과 같은 복합적인 생물학적 매트릭스 내에서 표적 HPPD 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 농작물로부터의 샘플, 예를 들어, 잎, 종자 또는 낟알, 화분 또는 뿌리로부터의 샘플을 얻는 단계; 식물 샘플로부터 단백질을 추출하는 단계; 추출물에서 불용성 단백질의 양을 감소시킴으로써 표적 단백질 풀을 농축시키는 단계; 선택된 효소, 예를 들어, 트립신으로 추출물에서 가용성 단백질을 분해하여 펩티드 단편을 포함하는 추출물을 생성하는 단계로서, 펩티드 단편은 각 표적 단백질에 특이적인 적어도 하나의 대리 펩티드를 포함하는, 단계; 표적 단백질을 특이적으로 검출하는 SIL 펩티드의 검정 카세트를 첨가하는 단계로서, 각 표지 대리 펩티드는 표적 단백질의 각 대리 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖고, 첨가된 표지 대리 펩티드의 수는 혼합물 중 표적 단백질의 수와 동일한, 단계; 혼합물 중 비-대리 펩티드의 양을 감소시킴으로써 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드를 농축시키는 단계; 액체 크로마토그래피를 이용하여 펩티드 단편 혼합물을 용해시키는 단계; 질량 분광법을 이용하여 펩티드 단편 혼합물을 분석하는 단계로서, 표지 대리 펩티드의 전이 이온 단편의 검출은 대리 펩티드가 유래된 표적 단백질의 존재를 가리키는, 단계; 및, 선택적으로, 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 표지 대리 펩티드의 전이 이온에 의해 발생된 질량 분광법 신호와 비교함으로써 생물학적 샘플에서 표적 단백질의 양을 계산하는 단계를 포함한다. 본 발명의 단백질로부터 유래된 SIL 대리 펩티드 각각은 질량 분광법-기반 다중 반응 모니터링(MRM) 검정 동안 고유의 전이 이온을 갖는다. 이와 같이, 이러한 펩티드들은 충돌 에너지의 약간의 변화로 인해 상이한 정도의 이온화를 야기하는 선택적 MS 이온을 생성할 것이다. 예를 들어, 삼중 사극자 MS는 펩티드 특이적인 높은 m/z 이온을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 방법은 당업계에 알려져 있을 수 있는 더 낮은 m/z 강도 이온 마커의 사용에 비해 내인성 배경을 감소시키는 선택적 이점을 제공할 수 있다.
본 발명은 표적 단백질의 고처리량 검출 또는 정량화를 위한 시스템을 추가로 제공한다. 이러한 시스템은 표적 단백질에 특이적인 사전-설계된 표지 대리 펩티드의 카세트; 및 하나 이상의 질량 분광기를 포함한다.
본 발명의 다양한 목적, 특징, 양태, 및 이점은 첨부된 도면 및 서열 목록과 함께 본 발명의 바람직한 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 보다 명백해질 것이다.
서열의 간략한 설명
SEQ ID NO:1은 보리, 벼, 대두, 밀 및 귀리에서 HPPD 단백질의 선택적 검출 및 정량화를 위한 안정 동위원소-표지 대리 펩티드의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO:2는 메이즈에서 HPPD 단백질의 선택적 검출 및 정량화를 위한 안정 동위원소-표지 대리 펩티드의 아미노산 서열이다.
이러한 설명은 본 발명이 구현될 수 있는 모든 상이한 방식, 또는 본 발명에 추가될 수 있는 모든 특징의 상세한 카탈로그임을 뜻하지는 않는다. 예를 들어, 일 구현예와 관련하여 예시된 특징이 다른 구현예에 도입될 수 있거나, 특정 구현예와 관련하여 예시된 특징이 그러한 구현예로부터 삭제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 일부 구현예에서 본원에 기재된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 배제되거나 생략될 수 있다는 것을 고려한다. 또한, 본원에 제안된 다양한 구현예에 대한, 본 발명으로부터 벗어나지 않는 수많은 변화 및 부가는 본 개시의 비추어 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 하기 설명은 본 발명의 일부 특정 구현예를 예시하고자 하는 것이며, 이의 모든 치환, 조합 및 변화를 철저하게 명시하고자 하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 본 발명의 설명에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하려는 목적을 위한 것이며, 본 발명의 제한임을 뜻하지는 않는다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 기술하려는 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님이 이해되어야 한다. 본 발명에 관한 일반적인 참조는 다음 문헌들을 포함한다: Alwine et al. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. 74:5350-54; Baldwin (2004) Mol. Cell. Proteomics 3(1):1-9; Can and Annan (1997) Overview of peptide and protein analysis by mass spectrometry. In: Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel, et al. New York: Wiley, p. 10.21.1-10.21.27; Chang et al. (2000) Plant Physiol. 122(2):295-317; Domon and Aebersold (2006) Science 312(5771):212-17; Nain et al. (2005) Plant Mol. Biol. Rep. 23:59-65; Patterson (1998) Protein identification and characterization by mass spectrometry. In: Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel, et al. New York: Wiley, p. 10.22.1-10.22.24; Paterson and Aebersold (1995) Electrophoresis 16: 1791-1814; Rajagopal and Ahern (2001) Science 294(5551):2571-73; Sesikeran and Vasanthi (2008) Asia Pac. J. Clin. Nutr. 17 Suppl. 1:241-44; 및 Toplak et al. (2004) Plant Mol. Biol. Rep. 22:237-50.
정의
본원에서 그리고 첨부된 청구항에서 사용되는, 단수형태인 부정관사 및 정관사는 하나 또는 하나 보다 많은 것을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들어, "식물"에 대한 언급은 단일 식물 또는 다중 식물을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 "및/또는"은 관련이 있는 열거된 항목 중 하나 이상의 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안("또는")으로 해석되는 경우 조합의 결여를 지칭하고 이를 포괄한다.
용어 "약(about)"은 본원에서 대략, 거의, 쯤, 또는 영역 내를 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때, 이는 제시된 수치 값의 위와 아래로 경계를 확장함으로써 그 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"은 본원에서 20%, 바람직하게는 10% 초과 또는 미만의(더 높은 또는 더 낮은) 변동에 의해, 명시된 값보다 높게 그리고 낮게 수치를 수정하기 위해 사용된다. 온도와 관련하여 용어 "약"은 ± 1℃, 바람직하게는 ± 0.5℃를 의미한다. 용어 "약"은 본 발명의 문맥에서(예를 들어, 온도 또는 분자량 값과 조합하여) 사용되는 경우, 정확한 값(즉, "약"이 없음)이 바람직하다.
용어 "~을 포함하다(comprises)" 및/또는 "~을 포함하는(comprising)"은, 본 명세서에서 사용될 때, 명시된 특징, 정수, 단계, 작동, 요소 및/또는 구성요소의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 작동, 요소, 구성요소, 및/또는 이들의 군의 존재 또는 부가를 배제하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 전이 문구 "~로 필수적으로 이루어진(consisting essentially of)"(및 문법적 변형어)은 청구항의 범위가 청구항에 나열된 특정 물질 또는 단계, 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)을 실질적으로 변경시키지 않는 것들을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 용어 "~로 필수적으로 이루어진"은, 본 발명의 청구항에서 사용될 때, "~을 포함하는"과 등가인 것으로 해석됨을 뜻하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 트랜스제닉 "이벤트"라는 용어는 이종 DNA를 갖는 단일 식물 세포의 형질전환 및 재생성, 예를 들어, 관심 대상의 유전자를 포함하는 발현 카세트에 의해 생성된 재조합 식물을 지칭한다. 용어 "이벤트"는 본래의 형질전환체 및/또는 이종 DNA를 포함하는 형질전환체의 자손을 지칭한다. 용어 "이벤트"는 또한 형질전환체와 또 다른 옥수수 계통 사이의 성적 교배에 의해 생성된 자손을 지칭한다. 반복친에 대한 반복적인 여교배 후에도, 형질전환된 모체로부터 삽입된 DNA 및 측접한 DNA는 동일한 염색체 위치에서 교차의 자손에 존재한다. 정상적으로, 식물 조직의 형질전환은 여러 이벤트를 생성하며, 이들 각각은 식물 세포 게놈에서 상이한 위치에 DNA 작제물의 삽입을 나타낸다. 전이유전자의 발현 또는 기타 바람직한 특징에 기초하여, 특정 이벤트가 선택된다. 본 발명의 이러한 트랜스제닉 이벤트의 비제한적 예는, cry1Ab 및 pat 유전자를 포함하고 제US6114608호에 기재된 "이벤트 Bt11"(또한 "Bt11 이벤트" 또는 간단히 "Bt11"), eCry3.1Ab 및 PMI 유전자를 포함하고 제US8466346호에 기재된 "이벤트 5307"(또한 "5307 이벤트" 또는 간단히 "5307"), mCry3A 및 PMI 유전자를 포함하고 제US7361813호에 기재된 "이벤트 MIR604"(또한 "MIR604 이벤트" 또는 간단히 "MIR604"), Vip3A 및 PMI 유전자를 포함하고 제US8232456호에 기재된 "이벤트 MIR162"(또한 "이벤트 MIR162" 또는 간단히 "MIR162"), dmEPSPS 유전자를 포함하고 제US 6566587호에 기재된 "이벤트 GA21"(또한 "GA21 이벤트" 또는 간단히 "GA21"), 알파-아밀라제797E 및 PMI 유전자를 포함하고 제US7635799호에 기재된 "이벤트 3272"(또한 "3272 이벤트" 또는 간단히 "3272"), Cry1Ab를 포함하고 제US6713259호에 기재된 "이벤트 MON810"(또한 "MON810 이벤트" 또는 간단히 "MON810"), Cry1A.105 및 Cry2Ab 유전자를 포함하고 제US8062840호에 기재된 "이벤트 MON89034"(또한 "MON89034 이벤트" 또는 간단히 "MON89034"), Cry1F 및 PAT 유전자를 포함하고 제US7288643호에 기재된 "이벤트 TC1507"(또한 "TC1507 이벤트" 또는 간단히 "TC1507"), Cry34/Cry35 및 PAT 유전자를 포함하고 제US7323556호에 기재된 "이벤트 DAS59122"(또한 "DAS59122 이벤트" 또는 간단히 "DAS59122"), 및 Cry1F, Cry34/Cry35 및 PAT 유전자를 포함하고 제US9790561호에 기재된 "이벤트 DP4114"(또한 "DP4114 이벤트" 또는 간단히 "DP4114")를 포함한다.
용어 "단리된" 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 독소는 이의 자연 환경에 더 이상 존재하지 않는 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 독성 단백질이다. 본 발명의 단리된 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 또는 독소는 정제된 형태로 존재할 수 있거나 재조합 숙주에, 예컨대 트랜스제닉 세균 세포 또는 트랜스제닉 식물에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 일반적인 용어 "질량 분광법"은, 예를 들어, 전기분무 이온화(ESI), 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화(MALDI) MS, MALDI-비행 시간(TOF) MS, 대기압(AP) MALDI MS, 진공 MALDI MS, 탠덤 MS, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 임의의 적합한 질량 분광법의 방법, 장치 또는 구성을 지칭한다. 질량 분광법 장치는 일련의 자기장과 전기장을 통해 분자의 비행 경로를 측정함으로써 분자의 분자 질량(분자의 질량-대-전하 비율의 함수로서)을 측정한다. 질량-대-전하 비율은 하전된 입자의 전기역학에서 널리 사용되는 물리량이다. 특정 펩티드의 질량-대-전하 비율은 당업자에 의해 선험적으로 계산될 수 있다. 상이한 질량-대-전하 비율을 갖는 두 개의 입자는 동일한 전기장과 자기장에 적용될 때 진공에서 동일한 경로로 이동하지 않을 것이다. 본 발명은, 특히, 펩티드의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 이어서 탠덤 MS 분석의 사용을 포함한다. "탠덤 질량 분광법"에서, 대리 펩티드는 MS 기기에서 필터링될 수 있고, 대리 펩티드는 하나 이상의 "전이 이온"을 수득하기 위해 후속적으로 단편화되고, 이는 두 번째 MS 절차에서 분석된다(검출되고/되거나 정량화된다).
질량 분광법의 방법론 및 장치에 대한 상세한 개요는 본원에 참조로 포함되는 다음 참조문헌에서 찾아볼 수 있다: Can and Annan (1997) Overview of peptide and protein analysis by mass spectrometry. In: Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel, et al. New York: Wiley, p. 10.21.1-10.21.27; Paterson and Aebersold (1995) Electrophoresis 16: 1791-1814; Patterson (1998) Protein identification and characterization by mass spectrometry. In: Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel, et al. New York: Wiley, p. 10.22.1-10.22.24; 및 Domon and Aebersold (2006) Science 312(5771):212-17.
펩티드는 규정된 순서로 알파-아미노산의 링킹(linking)으로부터 형성된 짧은 폴리머이다. 펩티드는 또한 폴리펩티드, 예를 들어, 단백질의 프로테아제를 이용한 분해에 의해 생성될 수 있다.
"식물"은 임의의 발생 단계의 임의의 식물, 특히, 종자 식물이다.
"식물 세포"는 원형질체 및 세포벽을 포함하는 식물의 구조적 및 생리학적 단위이다. 식물 세포는 단리된 단일 세포 또는 배양된 세포의 형태, 또는, 예를 들어, 식물 조직, 식물 기관, 또는 전체 식물과 같은 고도로 조직화된 단위의 일부일 수 있다.
"식물 세포 배양물"은, 예를 들어, 원형질체, 세포 배양 세포, 식물 조직 중 세포, 화분, 화분관, 배주, 배낭, 접합체 및 배(embryo)와 같은 다양한 발생 단계의 식물 단위의 배양물을 의미한다.
"식물 물질"은 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃 부분, 과실, 화분, 난세포, 접합체, 종자, 절단물, 세포 또는 조직 배양물, 또는 식물의 임의의 다른 부분 또는 산물을 지칭한다.
"식물 기관"은 뿌리, 줄기, 잎, 꽃눈, 또는 배와 같은 식물의 독특하고 가시적으로 구조화되고 분화된 부분이다.
본원에서 사용되는 "식물 조직"은 구조적 및 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 그룹을 의미한다. 식물체내 또는 배양물내 식물의 임의의 조직이 포함된다. 이 용어는 전체 식물, 식물 기관, 식물 종자, 식물 배양물 및 구조적 및/또는 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 임의의 그룹을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 상기 열거된 바와 같거나 그 밖에 이러한 정의에 의해 포함되는 식물 조직의 임의의 특정 형태와 함께, 또는 이의 부재 하에서의 이 용어의 사용은 임의의 다른 유형의 식물 조직의 배제인 것을 뜻하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "대리 펩티드"는 단백질 분해, 예를 들어, 트립신 분해를 통해 표적 단백질로부터 유래된 펩티드로서, 표적 단백질이 복합적인 생물학적 매트릭스, 예컨대, 농작물로부터의 샘플에서 하나 이상의 다른 단백질 및/또는 트랜스제닉 단백질의 존재 하에 있을 때, 대리 펩티드와 조합되어, 표적 단백질을 차등적으로 검출하고/하거나 정량화하고, 생물학적 매트릭스에서 하나 이상의 다른 단백질 또는 트랜스제닉 단백질을 검출하고/하거나 정량화하지 않는 하나 이상의 전이 이온을 생성하기 위해 질량 분광법 검정에서 작용하는 펩티드를 지칭한다. "대리 펩티드"는 또한 표적 단백질에 대한 "시그니처 펩티드(signature peptide)"로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 HPPD 대리 펩티드는 HPPD 단백질이 하나 이상의 비-HPPD 단백질의 존재 하에 있을 때, HPPD-대리 펩티드와 조합되어, 복합적인 생물학적 매트릭스에서 표적 HPPD 단백질을 차등적으로 검출하고/하거나 정량화하는 하나 이상의 전이 이온을 생성한다. 본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 둘 이상의 표지 대리 펩티드는 복합적인 생물학적 매트릭스에서 둘 이상의 표적 단백질을 검출하고/하거나 정량화하기 위해 질량 분광법 검정에서 동시에 사용될 수 있다.
"표지 대리 펩티드"는 질량 분광법 검정에서 대리 펩티드의 용이한 검출을 위해 표지되는 비-자연 발생 대리 펩티드이다. 예를 들어, 표지는 리신, 이소류신, 발린 또는 아르기닌과 같은 안정 동위원소 표지 아미노산(SIL)일 수 있다. 따라서, 대리 펩티드의 하나 이상의 아미노산이 중동위원소로 표지된다는 점을 제외하고, SIL-표지 대리 펩티드는 비-표지 대리 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 대리 펩티드 GNFSELFK(SEQ ID NO:1)는 중질 리신(K)으로 표지되고, GNFSELFK [C13N15-K] 등으로 표기될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "적층된" 또는 "적층하는"은 식물의 게놈에 혼입되는 다중의 이종 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스제닉 단백질 또는 트랜스제닉 이벤트의 존재를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "표적 단백질"은 표적 단백질이 복합적인 생물학적 매트릭스에 존재할 때 표지 대리 펩티드에 의해 선택적으로 검출되고/되거나 정량화되도록 의도된 단백질을 의미한다.
뉴클레오티드는 본원에서 다음 표준 약어로 표시된다: 아데닌(A), 시토신(C), 티민(T), 및 구아닌(G). 아미노산도 마찬가지로 다음 표준 약어로 표시된다: 알라닌(Ala; A), 아르기닌(Arg; R), 아스파라긴(Asn; N), 아스파트산(Asp; D), 시스테인(Cys; C), 글루타민(Gln; Q), 글루탐산(Glu; E), 글리신(Gly; G), 히스티딘(His; H), 이소류신(Ile; 1), 류신(Leu; L), 리신(Lys; K), 메티오닌(Met; M), 페닐알라닌(Phe; F), 프롤린(Pro; P), 세린(Ser; S), 트레오닌(Thr; T), 트립토판(Trp; W), 티로신(Tyr; Y), 및 발린(Val; V).
본 발명은, 각각 질량 분광법 검정 결과에 상이하게 영향을 줄 수 있는, 표적 및 비-표적 단백질의 혼합물을 포함하는 농작물로부터 유래된 복합적인 생물학적 샘플, 예를 들어, 하나 이상의 농작물의 잎, 줄기, 뿌리, 화분 및 종자로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 HPPD 단백질의 차등 검출 및/또는 정량화를 위해 질량 분광법을 수행하는 데 유용한 조성물, 방법 및 시스템을 포괄한다.
질량 분광법 다중 반응 모니터링 검정(MRM)에 의한 표적 단백질 정량화의 정확성은 적절한 대리 펩티드의 선택 및 대리 펩티드/전이 이온 조합의 표적 단백질 구별 능력에 완전히 좌우된다. 본 발명의 대리 펩티드의 다수의 상이한 조합은 HPPD 단백질로부터의 특이적 펩티드 중 하나 이상과 MRM 검정에 의해 동시에 모니터링 및 검출될 수 있고, 따라서 질량 분광법에 의해 주어진 생물학적 샘플 내에서 표적 HPPD 단백질 각각을 식별하고 정량화하는 수단을 제공한다. 카세트를 구성하는 이용 가능한 대리 펩티드는 단일 MRM 검정에서 단독으로 또는 임의의 조합으로 분석될 수 있거나, 다중 MRM 검정에서 분석될 수 있다.
MRM 기반 검정과 함께 본 발명의 대리 펩티드는 상이한 성장 단계에서 발현 수준을 결정하기 위한, 환경적 위험 평가에 대한 잠재적 노출 수준을 결정하기 위한, 식품 가공에서 표적 단백질의 상이한 수준을 결정하기 위한, 비교 연구에서 발현 수준을 결정하기 위한, 및 세대간 연구에서 발현 수준을 비교하기 위한 정량적 펩티드/단백질 분석을 포함하는 수많은 적용들을 갖는다. 가장 넓은 의미로, 표적 단백질에 대한 이러한 고유의 대리 펩티드들은 특정 조직(즉, 잎, 뿌리, 알맹이, 화분) 내에서 농작물 또는 트랜스제닉 이벤트, 또는 다중 트랜스제닉 이벤트의 육종 스택일 수 있는 제초제 내성 형질을 모니터링하거나 정량화하기 위해 MRM 검정과 조합되어 사용될 수 있다.
MRM 기반 검정은 HPPD 단백질로부터 특이적 대리 펩티드의 상대 또는 절대 수준을 정량화하거나 측정할 수 있다. 이러한 단백질들의 상대 정량적 수준은 시그니처 피크 면적을 서로 비교함으로써 MRM 검정에 의해 결정될 수 있다. 개별 HPPD 대리 펩티드의 상대 수준은 상이한 샘플 또는 조직 유형으로부터 정량화될 수 있다. 일반적으로, 상대 정량적 수준은 MRM 측정에서의 펩티드 풍부도를 각 표적 대리 펩티드에 대한 내부 표준물로서의 안정 동위원소-표지(SIL) 합성 펩티드 유사체와 비교함으로써 결정된다. 당업계에서 전형적으로 교시된 것과는 달리, SIL 펩티드는 [13C6 15N2] 리신 또는 [13C6 15N4] 아르기닌의 혼입에 의해 표지되지만, 또한 이소류신 및 발린과 같은 다른 아미노산을 포함할 수 있다. SIL 표준물은 고순도일 필요가 있고, 아미노산 분석에 의해 정량적으로 표준화되어야 한다. 당업계에서 전형적으로 교시된 것과는 달리, 본 발명의 SIL은 단백질 분해 직후 샘플에 스파이킹되고, 이에 따라 후속적인 분석 단계에 대해 보정하는 역할을 한다. SIL은 액체 크로마토그래피 분리에서 비표지 대리 펩티드와 공용출되고, 동일한 MS/MS 단편화 패턴을 나타내지만, 동위원소 표지로 인해 질량만이 상이하다. 이에 의해 생성된 표지 대리 펩티드와 생성 이온 둘 모두의 질량 변화 때문에, 질량 분광기가 비표지 펩티드와 표지 펩티드를 구별하는 것이 가능하다. 복합적인 펩티드 분해물은 흔히 표적 펩티드에 대해 오인될 수 있는 여러 세트의 공용출 전이를 함유하기 때문에, 동위원소로 표지된 표준물의 공용출은 올바른 신호를 식별하고 위양성 정량화에 대항하는 최상의 보호를 제공한다. 공지된 농도의 스파이킹된 SIL 표준물이 각 샘플에 스파이킹되기 때문에, HPPD 단백질에 대해 상이한 표적 단백질로부터의 각 상응하는 대리 펩티드의 상대 정량적 양이 결정될 수 있다. 개별 펩티드, 또는 펩티드들의 상대 정량화는 샘플내 또는 샘플간 또 다른 펩티드, 또는 펩티드들의 양에 비례하여 실시될 수 있기 때문에, 피크 면적이 생물학적 샘플내에서 서로 상대적인지를 결정함으로써 존재하는 펩티드의 상대량을 결정하는 것이 가능하다. 상이한 샘플간에 개별 시그니처 피크 면적으로부터 추론된 상대 정량적 데이터는 일반적으로 샘플당 분석된 단백질의 양에 대해 정규화된다. 상대 정량화는 단일 샘플에서 동시에 다중 단백질로부터의 다수의 펩티드에 걸쳐 및/또는 하나의 펩티드/단백질을 다른 펩티드/단백질에 대하여 상대 단백질 양에 관한 추가 통찰을 얻기 위해 다수의 샘플들에 걸쳐 수행될 수 있다.
절대 정량적 수준은 하나의 생물학적 샘플에서 상응하는 단백질로부터의 개별 대리 펩티드의 시그니처 피크 면적을 샘플에서 하나 이상의 내부 표준물의 공지된 양과 비교함으로써 MRM 기반 검정에 의해 HPPD에 대하여 결정될 수 있다. 이는 표적 단백질을 함유하지 않는 음성 대조 매트릭스에 공지된 농도의 이들 단백질을 스파이킹함으로써 달성될 수 있다. 다중-반응 모니터링(MRM) 검정은 정확한 스파이킹된 농도의 표적 단백질을 갖는 비-표적 샘플을 칭량하는 단계; 용해 완충액에서 샘플을 추출하고 균질화시키는 단계; 샘플을 별개의 가용성 및 풍부한 불용성 단백질로 원심분리하고 추출의 복잡성을 감소시키는 단계; 가용성 단백질 샘플을 트립신으로 분해하고(조직 또는 생물학적 샘플은 샘플이 적절히 분해되도록 소정 시간 동안 트립신, 키모트립신, 펩신, 엔도프로테이나제 Asp-N 및 Lys-C를 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 프로테아제로 처리될 수 있음), 샘플을 원심분리하고, 고정 농도의 SIL 펩티드를 첨가하는 단계(절대 정량화에서 SIL이 지표로서 사용됨); 양이온 교환을 이용하여 고체상 추출에 의해 탈염시켜 매트릭스 효과 또는 간섭을 최소화하고 이온 억제를 감소시키는 단계; 및 탠덤 질량 분광법에 결합된 액체 크로마토그래피에 의해 샘플을 분석하는 단계로 구성된다. 전형적으로, 단일 복합 단백질/펩티드 용해물로부터 가능한 한 많은 펩티드를 식별하기 위해 이온 트랩 질량 분광기, 또는 글로벌 프로파일링을 수행할 수 있는 또 다른 형태의 질량 분광기가 전형적으로 분석을 위해 작동된다. MRM-기반 검정이 개발되고 임의 유형의 질량 분광기에서 수행될 수 있지만, MRM 검정에 가장 유리한 기기 플랫폼은 흔히 삼중 사극자 기기 플랫폼인 것으로 여겨진다. 7개 단백질에 고유한 관심 대상의 대리 펩티드 및 SIL은 LC-MS/MS에 의해 측정된다. 피크 면적 비율(대리 펩티드의 피크 면적/상응하는 SIL 펩티드의 피크 면적)이 관심 대상의 각 펩티드에 대하여 결정된다. 관심 대상의 7개 단백질의 농도는 피크 면적 비율을 이용하여 보정 곡선으로부터 역산된다. 절대 정량화는 다수의 펩티드에 걸쳐(단일 샘플에서 동시에 다중 단백질의 정량적 측정을 가능하게 함) 및/또는 다중 샘플에 걸쳐(개별 생물학적 샘플 또는 큰 샘플 세트에서 절대 단백질 양에 관한 통찰을 얻기 위함) 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 농작물로부터의 하나 이상의 생물학적 샘플에서 단백질의 혼합물 중에 p-하이드록시페닐피우르베이트 디옥시게나제(HPPD) 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하도록 질량 분광법 검정에서 기능하는 표지 대리 펩티드로서, 대리 펩티드는 표지 및 GNFSELFK(SEQ ID NO:1) 및 GNFSQLFK(SEQ ID NO:2)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 표지 대리 펩티드를 포괄한다. 일부 양태에서, 표지 대리 펩티드는 안정 동위원소 표지(SIL) 아미노산의 혼입에 의해 표지된다. 다른 양태에서, SIL 아미노산은 리신, 이소류신, 발린 또는 아르기닌이다. 다른 양태에서, 농작물은 보리, 벼, 대두, 밀, 귀리 또는 메이즈이다. 또 다른 양태에서, 농작물은 보리, 벼, 대두, 밀 또는 벼이고, 대리 펩티드는 표지 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 농작물은 메이즈이고, 대리 펩티드는 표지 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 GNFSELFK(SEQ ID NO:1) 및 GNFSQLFK(SEQ ID NO:2)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 두 개의 표지 대리 펩티드를 포함하는 검정 카세트를 포괄한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 표적 단백질과 비-표적 단백질의 혼합물을 포함하는 농작물로부터의 복합적인 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 HPPD 단백질을 동시에 검출하거나 정량화하는 방법을 포괄하고, 본 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 농작물로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 단백질을 추출하여 단백질의 혼합물을 포함하는 추출물을 생성하는 단계; (c) 단계 b의 추출물에서 불용성 단백질의 양을 감소시켜, 농축된 가용성 단백질의 추출물을 생성하는 단계; (d) 단계 c의 추출물에서 가용성 단백질을 분해하여 펩티드 단편을 포함하는 추출물을 생성하는 단계로서, 펩티드 단편은 표적 단백질에 특이적인 적어도 하나의 대리 펩티드를 포함하는, 단계; (e) 단계 d의 추출물에서 펩티드 단편을 농축시키는 단계; (f) 본 발명의 하나 이상의 표지 대리 펩티드를 첨가하는 단계로서, 각 표지 대리 펩티드는 표적 단백질의 각 대리 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖고, 첨가된 표지 대리 펩티드의 수는 혼합물 중 표적 단백질의 수와 동일한, 단계; (g) 혼합물 중 비-대리 펩티드의 양을 감소시킴으로써 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드를 농축시키는 단계; (h) 액체 크로마토그래피를 통해 단계 g로부터의 펩티드 단편 혼합물을 용해시키는 단계; (i) 질량 분광법을 통해 단계 h로부터 생성된 펩티드 단편 혼합물을 분석하는 단계로서, 표지 대리 펩티드의 전이 이온 단편의 검출은 대리 펩티드가 유래된 표적 단백질의 존재를 가리키는, 단계; 및, 선택적으로, (j) 단계 i의 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 전이에 의해 발생된 질량 분광법 신호와 비교함으로써 생물학적 샘플에서 표적 단백질의 양을 계산하는 단계. 일부 양태에서, 농작물은 보리, 벼, 대두, 밀 또는 벼이고, 대리 펩티드는 표지 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 농작물은 메이즈이고, 대리 펩티드는 표지 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 펩티드는 안정 동위원소 표지(SIL) 아미노산의 혼입에 의해 표지된다. 또 다른 양태에서, SIL 아미노산은 리신, 이소류신, 발린 또는 아르기닌이다.
당업계에는 어떤 대리 펩티드가 임의의 주어진 표적 단백질에 최상인지를 예측하는 다수의 상이한 방법이 제안된 다수의 문헌들이 있으며, 다수의 참조문헌, 예를 들어, 문헌[Mead et al. 2009. Mol. Cell. Proteomics 8:696-705] 및 미국 특허 제8,227,252호에는 질량 분광법을 이용하여 표적 단백질을 정량화하는 간단한 방법이 제안되어 있다. 그러나, 이러한 예측 방법 및 간단한 방법에 대한 의존은 예측 불가능한 요인들이 질량 분광법 기반 검정에 간섭하여 부정확한 정량화 및 감도의 손실을 초래할 수 있기 때문에, 혼란스러운 결과를 초래할 수 있다. 적어도 하나의 주요 요인은 생물학적 매트릭스 자체에 있다. 예를 들어, 농작물로부터의 잎, 뿌리, 화분 및 종자로부터의 생물학적 샘플과 동등하게 잘 작용할 대리 펩티드로부터 단일 전이 이온을 식별하는 것은 매우 예측 불가능하며 어렵다. 매트릭스의 화학적 조성, pH, 또는 이온 강도의 차이는 MS 기기에서 단백질분해, 펩티드 안정성, 응집, 또는 이온화에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 모든 관련 매트릭스, 특히 농작물에 대한 것들에 걸쳐 대리 펩티드 및 특이적 대리 펩티드/전이 이온 조합을 식별하고 경험적으로 시험하는 것은 이러한 검정의 예측 불가능한 성질을 극복하는 데 필수적이다. 본 발명은, 표적 단백질을 특이적으로 검출하고/하거나 정량화하기 위해 질량 분광법 검정을 개발하는 데 있어서 1) 단백질가수분해적으로 절단된 표적 단백질로부터 유래된 펩티드의 풀로부터 대리 펩티드를 시험 및 선택하고, SIL 대리 펩티드 및 전이 이온 펩티드의 조합을 시험하고, 모든 생물학적 매트릭스, 예를 들어, 농작물의 잎, 뿌리, 화분 또는 종자로부터의 생물학적 샘플 전체에 걸쳐 표적 단백질을 특이적으로 검출하고 정량화하는 조합을 선택하는 것; 및 2) 농작물, 특히 옥수수 식물의 잎, 뿌리, 화분 및 종자를 포함하는 모든 생물학적 매트릭스에서 모든 대리 펩티드 및 대리 펩티드/전이 이온 조합에 대해 작용하는 적절한 샘플 제조 방법 및 질량 분광기 조건을 경험적으로 결정하는 것을 포함하는 2-단계 접근을 이용한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 표적 트랜스제닉 단백질과 비-트랜스제닉 단백질의 혼합물을 포함하는 트랜스제닉 식물로부터의 복합적인 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 단백질을 동시에 검출하고/하거나 정량화하는 방법을 포괄하고, 여기서 본 방법은 다음 단계들을 포함한다: a) 트랜스제닉 식물로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; b) 생물학적 샘플로부터 단백질을 추출하여 단백질의 혼합물을 포함하는 추출물을 생성하는 단계; c) 단계 b의 추출물에서 비-트랜스제닉 불용성 단백질의 양을 감소시켜, 농축된 가용성 단백질의 추출물을 생성하는 단계; d) 단계 c의 추출물에서 가용성 단백질을 분해하여 펩티드 단편을 포함하는 추출물을 생성하는 단계로서, 펩티드 단편은 각 표적 단백질에 특이적인 적어도 하나의 비-표지 대리 펩티드를 포함하는, 단계; e) 단계 d의 추출물에서 펩티드 단편을 농축시키는 단계; f) 본 발명의 하나 이상의 표지 대리 펩티드를 첨가하는 단계로서, 각 표지 대리 펩티드는 표적 단백질로부터 유래된 각 비-표지 대리 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖고, 첨가된 표지 대리 펩티드의 수는 혼합물 중 표적 단백질의 수와 동일한, 단계; g) 혼합물 중 비-대리 펩티드의 양을 감소시킴으로써 비-표지 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드를 농축시키는 단계; h) 액체 크로마토그래피를 통해 단계 g로부터의 펩티드 단편 혼합물을 용해시키는 단계; i) 질량 분광법을 통해 단계 h로부터 생성된 펩티드 단편 혼합물을 분석하는 단계로서, 비-표지 대리 펩티드의 전이 이온 단편의 검출은 대리 펩티드가 유래된 표적 단백질의 존재를 가리키는, 단계; 및, 선택적으로, j) 단계 i의 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 표지 대리 펩티드의 전이 이온에 의해 발생된 질량 분광법 신호와 비교함으로써 생물학적 샘플에서 표적 단백질의 양을 계산하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 하기 특정 실시예가 포함된다. 이어지는 실시예에 개시된 기법은 본 발명의 실시에서 잘 작용하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기법을 나타내며, 이에 따라 이의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인지되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시에 비추어, 개시된 특정 구현예에서 많은 변화가 이루어질 수 있으며 본 발명의 개념, 사상 및 범위로부터 벗어남 없이 비슷하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 인지해야 한다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 작용제는 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서, 본원에 기재된 작용제를 대체할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 그러한 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구항에 정의된 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 여겨진다.
실시예
본 발명은 이의 특정 구현예와 연관하여 기술되었지만, 본 발명의 장치는 추가 변형이 가능하다는 것이 이해될 것이다. 본 특허 출원은, 본 발명의 임의의 변화, 사용, 또는 개조(일반적으로 본 발명의 원리를 따르며, 발명이 속하는 기술 분야 내의 공지되어 있거나 관례적인 실시 내에 속하고 기재 전에 본원의 필수적인 특징에 적용될 수 있으며 첨부된 청구항의 범위에 따르는 본 개시로부터의 일탈을 포함함)를 포함하는 것으로 하고자 한다.
본 명세서에서 언급되는 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 본원에서 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별적 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로, 참조로서 본원에 포함된다.
실시예 1. 질량 분광법 검정을 이용하는, 시중의 상업적 작물 물품에서 내인성 p- 하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제의 정량화에 대한 검증
본 연구의 목적은 탠덤 질량 분광법에 결합된 액체 크로마토그래피(LC-MS/MS)를 이용하여 다양한 상업적 작물(보리, 메이즈, 벼, 대두, 및 밀 종자, 및 보리, 메이즈, 귀리, 대두 및 밀 사료)에서 p-하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제(HPPD) 단백질의 정량화를 위한 질량 분광법(MS)-기반 방법을 검증하는 것이었다. HPPD 단백질에 고유한 대리 펩티드를 사용하여 상대 농도를 결정하였다. 연구에서 정량적 방법을 구현하기 전에, 우수 실험실 관리 표준(GLPS)에 따른 의도된 용도에 대하여 방법을 검증하였다. 상업적 작물 샘플을 사용하여 특이성, 선형성, 정량 한계, 캐리오버, 정밀성 및 정확성, 추출 효율 및 안정성을 포함하는 방법 성능 매개변수를 평가하였다.
특이성 평가는 시험된 임의의 상업적 작물 샘플에서 비-표지 펩티드(블랭크와 완충액 간의 두 전이의 평균 비율 차이는 30.0% 미만) 및 안정 동위원소-표지(SIL) 펩티드(QC0(내인성)의 SIL 신호는 5.0% 이하)의 머무름 시간에 유의한 간섭을 나타내지 않았다. 모든 특이성 매개변수가 허용 기준을 충족하였다.
표적 HPPD 단백질에 대한 대리물로서 사용된 각 시그니처 펩티드에 대한 정량 하한치(LLOQ)를 결정하였다. 정량 한계는 보리 종자의 경우 0.209 μg/g 건조 중량(DW)이고, 메이즈 종자의 경우 0.122 μg/g DW이고, 벼 종자의 경우 0.083 μg/g DW이고, 대두 종자의 경우 0.686 μg/g DW이고, 밀 종자의 경우 0.301 μg/g DW이고, 보리 사료의 경우 0.524 μg/g DW이고, 메이즈 사료의 경우 0.326 μg/g DW이고, 귀리 사료의 경우 0.660 μg/g DW이고, 대두 사료의 경우 1.001 μg/g DW이고, 밀 사료의 경우 0.640 μg/g DW였다.
각 상업적 작물에 대한 HPPD의 유효한 정량 범위(LLOQ 및 정량 상한치(ULOQ))는 표 1에 요약되어 있다.
[표 1]
정량 범위
Figure pct00001
검정내 및 검정간 CV는 세 가지 농도(저, 중 및 고)에서 QC0 샘플의 경우 25.0% 이하이고, 품질 관리(QC) 샘플의 경우 20.0% 이하였는데, 이는 우수한 방법 정밀성을 나타내는 것이다. 유사하게는, 검정내 및 검정간 편향%는 저, 중 및 고 QC 샘플의 경우 ±20.0% 내였는데, 이는 우수한 방법 정확성을 나타내는 것이다. 따라서, 모든 방법 정밀성 및 정확성 매개변수는 허용 기준을 충족하였다. 방법의 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성은 표 2에 요약되어 있다.
[표 2]
상업적 작물에서 HPPD에 대한 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성 범위
Figure pct00002
데이터 가중치가 1/x인 선형 방정식을 이용하여 농도/검출기 반응 관계를 나타냈다. 따라서, 모든 확립된 데이터는 허용 기준 내에 속했고, 선형성 평가에 적합한 것으로 확인되었다.
단백질 추출 방법의 효율은 보리 종자의 경우 59.9%이고, 메이즈 종자의 경우 69.8%이고, 벼 종자의 경우 73.9%이고, 대두 종자의 경우 64.9%이고, 밀 종자의 경우 54.3%이고, 보리 사료의 경우 69.8%이고, 메이즈 사료의 경우 76.3%이고, 귀리 사료의 경우 78.4%이고, 대두 사료의 경우 65.4%이고, 밀 사료의 경우 77.2%였다. 제1 라운드의 추출의 CV는 CV가 27.5%였던 밀 종자를 제외하고, 모든 상업적 작물에 대하여 20.0% 미만이었다. 그러나, 단일 추출로부터 얻어진 밀 종자의 정밀성 및 정확성 결과(QC0)는 20.0% 이하의 정밀성이 달성되었다는 것을 입증한다.
가공 안정성(건조 추출물)을 -20℃에서 6일 동안 평가하였다. 안정성 평가는 허용 기준을 충족하였다. CV는 25.0% 이하이고, 안정성과 0일차 QC 간의 피크 면적 비율 차이 %는 모든 상업적 작물에 대하여 ± 25.0% 내였다.
평가된 모든 성능 매개변수는 각각 8.2% 및 6.2%였던 보리 및 밀 종자의 최종 추출%, 뿐만 아니라 27.5% CV였던 밀 종자에 대한 제1 라운드의 추출의 정밀성을 제외하고 규정된 허용 기준을 충족하였다. 샘플 분석에서 HPPD의 농도는 단일 추출(제1 라운드)로부터 결정되고 추출 효율%에 대해 조정될 것이고, 정밀성 및 정확성 진행에서 밀 종자의 경우 20.0% 이하의 정밀성이 달성되었기 때문에, 연구 결과에 대한 영향은 없다. 본 연구의 결과에 기초할 때, 질량 분광법-기반 방법은 GLPS에 따른 상업적 작물에서 HPPD 단백질의 정량화에 적합할 것으로 확인되었다.
본 연구의 목적은 탠덤 질량 분광법에 결합된 액체 크로마토그래피(LC-MS/MS) 분석을 이용하여 다양한 상업적 작물(보리, 메이즈, 벼, 대두, 및 밀 종자, 및 보리, 메이즈, 귀리, 대두 및 밀 사료)에서 p-하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제(HPPD) 단백질의 정량화를 위한 질량 분광법(MS)-기반 방법을 검증하는 것이었다. HPPD 단백질에 고유한 대리 펩티드를 사용하여 상이한 식물 종/매트릭스 중 상대 농도를 결정하였다(표 3). 연구에서 정량적 방법을 구현하기 전에, 우수 실험실 관리 표준(GLPS)에 따른 의도된 용도에 대하여 방법을 검증하였다. 상업적 작물 샘플을 사용하여 특이성, 선형성, 정량 한계, 캐리오버, 정밀성 및 정확성, 추출 효율 및 안정성을 포함하는 방법 성능 매개변수를 평가하였다.
[표 3]
HPPD 대리 펩티드
Figure pct00003
본 연구를 위한 상업적 작물 물질은 선형성 샘플 및 품질 관리(QC) 샘플을 제조하는 데 사용된 다양한 식물 종으로부터의 매트릭스였다. 표 4에서는 매트릭스 물질의 공급원이 확인된다. 이들 샘플은 스폰서로부터 제공받았으며, 사용 시까지 -80℃ ± 10℃의 공칭 온도에서 저장하였다.
[표 4]
상업적 작물 물질
Figure pct00004
표준물 및 QC 샘플
선형성 평가를 위해 반향 곡선을 생성하였다. LLOQ(STD 1)와 ULOQ(STD 8) STD 둘 모두를 포함하는, 상이한 농도에서 SIL 펩티드로 강화된 상업적 작물 추출물을 사용하여 일련의 8개 비-제로 표준물(STD)을 제조하였다.
3개의 상이한 농도(저, 중 및 고)에서 비-표지 펩티드로 강화된 상업적 작물 추출물을 사용하여 QC 샘플을 제조하였다. 표 5 및 표 6은 공칭 농도를 나타낸 것이다.
[표 5]
상업적 작물 중 표준물의 농도(공칭)
Figure pct00005
aDW - 건조 중량
[표 6]
상업적 작물 중 QC 샘플의 농도(공칭a)
Figure pct00006
a 공칭 = QC0(비-표지 펩티드의 내인성 수준)으로 조정하기 전 공칭 농도
합성 펩티드
본 연구에 사용된 정제되고 정량화된 SIL 및 비-표지 합성 펩티드는 표 7에 열거되어 있다. JPT Peptide Technologies GmbH에 의해 합성 펩티드를 공급하고, 사용 시까지 -20℃의 공칭 온도에서 저장하였다.
[표 7]
합성 펩티드의 목록
Figure pct00007
분석 방법
하기 실험 및 데이터 평가 단계는 상업적 작물에서 HPPD 단백질의 정량을 결정하는 LC-MS/MS-기반 방법에 대한 검증 과정에 수반되었다. 간략히, 복합적인 생물학적 매트릭스에서 HPPD의 대리 펩티드를 식별하고 정량화하기 위한 LC-MS/MS 방법은 (i) 동결건조된 상업적 작물을 칭량하는 단계; (ii) 용해 완충액에서 식물 종/매트릭스 샘플로부터 단백질을 균질화/추출하는 단계; (iii) 가용성 및 불용성 단백질을 분리하도록 샘플을 원심분리하여 관심 단백질을 풍부하게 하고 샘플 복잡성을 감소시키는 단계; (iv) 가용성 단백질 샘플을 트립신으로 분해하는 단계; (v) 샘플을 원심분리하는 단계; (vi) SIL 펩티드를 첨가하는 단계(평가에 따라 고정되거나 가변적); (vii) 양이온 교환을 이용하여 고체상 추출에 의해 탈염시켜 매트릭스 효과 또는 간섭을 최소화하고 이온 억제를 감소시키는 단계; 및 (viii) LC-MS/MS에 의해 샘플을 분석하는 단계를 포함한다. 각 상업적 작물에 대한 HPPD 단백질에 고유한 관심 대리 펩티드 및 상응하는 SIL 펩티드를 LC-MS/MS에 의해 측정하였다. MultiQuantTM 소프트웨어(버전 3.0.2)를 이용하여 데이터를 분석하였고, 여기서 각 대리 펩티드(비-표지) 및 각 상응하는 SIL 펩티드의 크로마토그래피 피크 면적을 각 샘플에 대하여 통합하였다.
반향 곡선을 위해, 각 대리 펩티드에 대하여 SIL 펩티드의 피크 면적을 결정하였다. 이후, 각 대리 펩티드에 대하여, 각 표준 샘플에 대한 피크 면적 SIL 펩티드를 단백질 농도(x-축)의 함수로서 y-축 상에 플롯팅하여 반향 곡선을 생성하였다.
QC 샘플에 대하여, 피크 면적 비율(비-표지 펩티드의 피크 면적/상응하는 SIL 펩티드의 피크 면적)을 결정하였다. QC 샘플의 비-표지 펩티드 농도를 하기와 같이 계산하였다:
Figure pct00008
샘플 가공
10 mg 내지 18 mg의 각 상업적 작물을 칭량하고, 매트릭스 A 용해 비드(MP Biomedicals)를 함유하는 튜브에 첨가하였다. 용해 완충액(인산염-완충 식염수(PBS) 중 0.1% RapiGestTM(Waters))을 이후 각 샘플 튜브에 첨가하고, FastPrep®-24 균질화기(MP Biomedicals)를 사용하여 균질화시켰다. 그 후에, 샘플을 4℃에서 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 상청액을 옮겼으며; 그에 따라, 표 8에 기재된 바와 같이 PBS 중 0.1% RapiGest에 풀링하고 희석하였다. 이러한 희석된 상업적 작물을, 다양한 농도의 QC 샘플을 생성하는 비-표지 펩티드로 또는 표준물을 생성하는 SIL 펩티드로 강화시켰다.
[표 8]
매트릭스 희석 인자
Figure pct00009
가공한 각 표준물 및 QC 샘플에 대하여, 동일한 부피의 2,2,2-트리플루오로에탄올(TFE)을 첨가하여 단백질을 변성시키고, 이어서 100 mM 암모늄 바이카보네이트로 TFE를 10%로 희석하고, 37℃에서 14시간 내지 18시간 동안 인큐베이션하면서 0.1 μg/μL의 트립신을 이용하여 분해하였다. 분해 후, 샘플을 5%의 최종 포름산(FA) 농도로 산성화시키고, 블랭크 및 캐리오버 블랭크를 제외하고 검증 평가에 따라 가변 또는 고정 농도에서 각 샘플에 SIL 펩티드를 첨가하였다. 이후, 혼합-모드 양이온 교환(MCX) μ용리 플레이트를 사용하여 고체상 추출에 의해 샘플을 탈염시켰다. 용리액을 수거하고, 두 개의 MS 플레이트로 옮기고, 이를 건조 상태로 증발시키고, MS 분석까지 -20℃(공칭)에서 저장하였다.
가공된 샘플을 11 μL의 92.5/7.5 물/아세토니트릴(ACN) + 0.2% FA로 재가용화시키고, 이어서 음파처리하고, 볼텍싱하고, 원심분리하였다. QTRAP 6500 질량 분광기(AB Sciex)에 결합된 NanoAcquity 초성능 액체 크로마토그래피(UPLC)®(Waters) 상에 샘플당 8 마이크로리터의 물질을 주입하였다. HALO 펩티드 ES-C18 50 mm x 0.5 mm, 2.7 μm 컬럼(Canadian Life Science)을 사용하여 펩티드 분리를 달성하였다. 사용된 LC 구배는 하기 표 9에 나타나 있다. 유량은 28.000 μL/min였다. Turbo V MS 소스를 사용하여 양이온 모드에서 피분석물을 측정하였다. Analyst® 버전 1.6(AB Sciex)을 사용하여 데이터 획득을 수행하였다.
[표 9]
LC-MS/MS 검정의 LC 구배
Figure pct00010
a DMSO - 디메틸 설폭사이드
대리 펩티드 및 상응하는 SIL 펩티드는 HPPD 단백질에 고유하다. 각 대리 펩티드(비-표지) 및 각 상응하는 SIL 펩티드의 크로마토그래피 피크 면적을 MultiQuant 버전 3.0.2(AB Sciex)를 사용하여 각 샘플에 대하여 통합하였다.
반향 곡선을 위해, 각 대리 펩티드에 대하여 SIL 펩티드의 피크 면적을 결정하였다. 각 표준 샘플에 대한 피크 면적 SIL 펩티드를 단백질 농도(x-축)의 함수로서 y-축 상에 플롯팅하여 반향 곡선을 생성하였다.
QC 샘플에 대하여, 피크 면적 비율(비-표지 펩티드의 피크 면적/상응하는 SIL 펩티드의 피크 면적)을 결정하였다. QC 샘플의 비-표지 펩티드 농도를 상술된 바와 같이 계산하였다.
Microsoft Office Excel® 소프트웨어를 사용하여 평균, 표준 편차(SD), 및 변동 계수(CV) 계산을 수행하였다. 반올림되지 않은 값을 평균, SD, 및 CV의 계산에 사용하였으며, 그 후 개략적인 표에서는 적절하게 반올림하였다.
특이성
샘플 중 다양한 식물 매트릭스 구성요소의 존재 하에 대리 펩티드를 측정하고 구별하는 방법의 능력에 의해 특이성을 결정하였다. LC-MS/MS에 의해 HPPD 단백질에 대한 각 고유의 대리 펩티드의 존재 또는 부재를 결정함으로써 특이성을 측정하였다.
후술되는 바와 같이 모든 상업적 작물 추출물에서, 비-표지 펩티드의 경우 정량자 및 정성자 전이를 이용하여, 그리고 SIL 펩티드의 경우 정량자 전이만을 이용하여 검정 특이성을 평가하였다.
비-표지 펩티드
하기 분석을 수행하였다:
블랭크(n=3)에 대비하여 비-표지 펩티드로 강화된 분해된 소 혈청 알부민(BSA) 완충액(n=3)에서 모니터링된 두 전이(정량자/정성자)의 평균 비율을 비교함으로써 검정 특이성을 평가하였다. 블랭크는 SIL 또는 비-표지 펩티드의 첨가 없이 가공된 검출 가능한 양의 내인성 HPPD 단백질을 갖는 매트릭스로 간주된다.
차이%를 하기 식을 이용하여 계산하였다:
Figure pct00011
하기 허용 기준을 이용하여 비-표지 펩티드에 대한 특이성 평가의 적합성을 확인하였다: 블랭크와 완충액 간의 차이%는 30.0% 내여야 한다.
SIL 펩티드
하기 분석을 수행하였다:
블랭크(n=3)에 대비하여 QC0(내인성, n=3)에서 SIL 펩티드(정량자 전이)의 피크 면적을 결정함으로써 검정 특이성을 평가하였다. 블랭크는 SIL 또는 비-표지 펩티드의 첨가 없이 가공된 검출 가능한 양의 내인성 HPPD 단백질을 갖는 매트릭스로 간주된다.
QC0(내인성)의 %를 하기 식을 이용하여 계산하였다:
Figure pct00012
하기 허용 기준을 이용하여 SIL 펩티드에 대한 특이성 평가의 적합성을 확인하였다: 블랭크 샘플에서 평균 SIL 펩티드 피크 면적은 QC0(내인성) 샘플에서 SIL 펩티드의 평균 피크 면적의 5.0% 이하여야 한다.
선형성
선형성은 샘플 중 피분석물의 양 및 반응에 의해 수학적으로 정의된 결과를 도출하는 방법의 능력이다. 방법의 정확성에 기초하여 선형성을 평가하였다. 각 식물 종/매트릭스에서 HPPD에 대하여, 반향 곡선을 정의한 가장 단순한 회귀 모델, 즉, 선형 곡선 피트를 사용하였다. 상관 계수(R 값)를 이용하여 피트의 정성에 기초하여 모델을 적용하였다.
1/x의 데이터 가중치를 모든 펩티드에 적용하였다. 동일한 회귀 모델 및 동일한 데이터 가중치를 각 식물 종/매트릭스의 모든 검정 진행에 적용하였다.
다음 진행 허용 기준을 이용하여 선형성 평가의 적합성을 확인하였다: (1) 적어도 75.0%의 비-제로 표준물은 유효해야 하며, 편차가 25.0%를 넘지 않아야 하는 LLOQ를 제외하고, 공칭 농도의 20.0%를 넘는 편차가 없어야 하고; (2) 보간 곡선은 R ≥ 0.9900을 가져야 한다.
정량 한계
LLOQ 및 ULOQ는 허용 가능한 정확성 한계 내에서 대리 펩티드의 반응이 결정될 수 있는 최소 및 최대 농도이다. 기재된 바와 같은 반향 곡선을 이용하여 각 식물 종/매트릭스에서 대리 펩티드에 대하여 LLOQ 및 ULOQ를 결정하였다.
하기 허용 기준을 이용하여 LLOQ 및 ULOQ 평가의 적합성을 확인하였다: LLOQ 및 ULOQ 표준물은 상기 규정된 정확성 기준을 충족해야 한다.
HPPD에 대한 정량 범위는 분석 절차가 적합한 수준의 정확성 및 선형성을 갖는 것으로 입증된 상한치 농도와 하한치 농도 사이의 간격이다(표준물의 농도에 대해서는 표 5 참조). 이러한 방법의 선형성 평가로부터 얻어진 데이터를 사용하여 각 식물 종/매트릭스에서 HPPD에 대하여 정량 범위를 결정하였다. 정확성을 결정하여 절차에 대한 정량 범위로서 시험된 고농도 및 저농도를 효과적으로 검증하였다.
캐리오버는 후속 주입에 피분석물이 존재하는 경우이다. 본 연구에서, 캐리오버는 각 ULOQ 표준물 이후 주입된 두 개의 블랭크 샘플을 평가함으로써 선형성 평가 동안에 결정하였다. 이들에는 간섭이 없어야 한다. 하기 진행 허용 기준을 적용하여 모든 선형성 진행에 대해 캐리오버를 평가하였다. ULOQ 표준물 이후 주입된 제1 캐리오버 블랭크 샘플을 평가하였다. 제2 캐리오버 블랭크를 평가하였지만, 허용 기준에 속하지는 않았다. ULOQ 표준물 이후 주입된 제1 캐리오버 블랭크 샘플의 적어도 50%는 다음의 머무름 시간에, 후술되는 바와 같이 허용 가능한 간섭 내에 있어야 한다: SIL 펩티드:피크 면적은 LLOQ 표준물(들)의 SIL 펩티드의 평균 피크 면적의 20.0% 이하여야 한다. 또한, 정밀성 및 정확성뿐만 아니라 안정성 평가에서, 재가용화 완충액(RSB) 샘플을 분석하여 고 QC 샘플의 주입 후의 캐리오버를 평가하였다. 캐리오버를 평가하는 순서는 다음과 같았다: 고 QC, 이어서 두 개의 RSB 샘플.
진행 허용 기준
검증의 일부로서, 정밀성 및 정확성뿐만 아니라 안정성 진행은 진행 허용을 입증하기 위해 QC 샘플을 포함하였다. 상기 언급된 진행이 유효한 것으로 간주되기 위해서는 하기 기준이 충족되어야 한다. 각 식물 종/매트릭스를 허용 기준에 대해 독립적으로 처리하였다.
QC 샘플
QC 샘플은 진행을 허용하거나 거부하기 위한 기준을 제공한다. 공지된 농도의 비-표지 펩티드로 샘플 매트릭스를 강화시킴으로써 QC 샘플을 제조하였다. 하기 허용 기준을 이용하여 저 QC(QC1), 중간 범위 QC(QC2), 고 QC(QC3)를 사용한 QC 샘플의 적합성을 확인하였다: (1) 각각의 저, 중 및 고 농도에서 QC 샘플의 적어도 50%가 ±20.0% 편향 내에 있어야 하고; (2) 저, 중 및 고 농도에 걸쳐 QC 샘플의 적어도 67%가 이들의 공칭 값의 ±20.0% 편향 내에 있어야 한다.
정밀성 및 정확성
정밀성은 균질한 샘플의 다중 샘플링에 반복적으로 절차를 적용할 때 개별 시험 결과들 간의 일치 정도이다. 정확성은 균질한 샘플의 다중 샘플링에 반복적으로 절차를 적용할 때, 확인된 값과 허용된 참조 값 사이의 일치 정도이다. 본 연구에서, LC-MS/MS 검정을 위한 각 식물 종/매트릭스에서 HPPD 단백질의 정밀성 및 정확성을 검정-대-검정, 및 분석물-대-분석물 가변성을 평가함으로써 결정하였다.
방법 정밀성 및 정확성을 QC 샘플을 이용하여 평가하였다. 정밀성 및 정확성 검정을 세 가지 농도(저, 중 및 고)에서 QC 샘플로 수행하였다(표 5 및 표 6). 상업적 작물 추출물에서 QC 샘플을 제조하고, 비-표지 펩티드로 강화시켰다.
정밀성(CV) 및 정확성(편향)을 3일에 나눠 2개의 상이한 분석물로 3개의 독립적인 검정 진행에 걸쳐 평가하였다.
각 정밀성 및 정확성 진행은 각 QC 농도 당 3개의 복제물로 이루어졌다. QC0(내인성)도 포함하였으며, 삼중으로 분석하였다.
편향%를 하기 식을 이용하여 계산하였다:
Figure pct00013
섹션 0에서 명시된 진행 허용 기준을 충족한 정밀성 및 정확성 진행을 이용하여 검정내 정밀성 및 정확성을 평가하였다. 그 후에, 검정내 기준을 충족한 정밀성 및 정확성 진행을 이용하여 검정간 정밀성 및 정확성을 평가하였다. 하기 허용 기준을 이용하여 검정내 및 검정간 진행에 대한 정밀성 및 정확성 평가의 적합성을 확인하였다: (1) QC0 샘플에 대한 CV는 25.0% 이하여야 하고; (2) 저, 중, 및 고 농도 QC 샘플에 대한 CV는 20.0% 이하이고 ±20.0% 편향 내에 있어야 한다.
또한, 정밀성 및 정확성 진행의 배치 크기를 살펴봄으로써 연구 샘플 분석에 대한 검정 진행의 최장 주입 시간을 확립하였다. 최대 배치 크기를 갖는 정밀성 및 정확성 진행을 연구 샘플 분석에 대한 최장 주입 시간을 설정하는 데 사용하였다. 또한, QC0(내인성) 샘플의 경향 분석을 수행하였다.
추출 효율은 매트릭스로부터 회수된 관심 단백질(즉, HPPD)의 양이다. 추출 효율을 연이은 순차적 추출에 의해 결정하였다. 마지막 라운드에서 총 단백질의 5.0% 이하가 회수되는 경우, 추출 회수는 최종으로 간주된다. HPPD의 반복적 추출을 통해 상업적 작물을 이용하여 단백질 추출 방법의 효율을 평가하였다.
하나의 분석물을 각 상업적 작물의 3개의 복제물로 추출하였다. 불용성 물질을 수집하고, 3회 이상 추출하였고, 이때 분석을 위해 각 상청액을 보유하였다.
각 샘플에 대한 추출 효율을 하기 식을 이용하여 계산하였다:
Figure pct00014
하기 허용 기준을 이용하여 각 단백질에 대한 추출 효율의 적합성을 확인하였다: 최종 추출 결과가 모든 합한 추출로부터 각각의 개별 단백질에 대한 회수된 총 물질의 5.0% 이하일 때 순차적 추출이 완료된 것으로 간주될 것이다:
Figure pct00015
추출 효율(첫 반복의 복제물의 평균)은 60.0% 이상의 회수일 것으로 예상되고, 정밀성은 첫 라운드의 추출에 대하여 20.0% 이하여야 한다.
안정성
주어진 시간 간격 동안 특정 조건 하에 주어진 식물 종/매트릭스에서 HPPD 단백질의 안정성을 평가하였다. 가공된 샘플에서 대리 펩티드에 대하여, 각 식물 종/매트릭스에서 HPPD 단백질에 대한 안정성을 결정하였다.
가공된 샘플 안정성
건조 추출물의 가공된 샘플 안정성을 2개의 상이한 농도(저 및 고)에서 농도 당 3개의 복제물로 분석하였다. 새로 제조되고 가공된 QC 샘플을 LC-MS/MS에 의해 분석하였다(0일차로 간주함). 건조 안정성 샘플을 LC-MS/MS에 의해 바로 분석하지 않고, 사전-결정된 기간 동안 저장하였다.
건조 안정성 샘플을 -20℃의 공칭 온도에서 6일(146시간 16분) 동안 저장한 후, 재가용화하고, LC-MS/MS에 의해 분석하였다.
하기 허용 기준을 이용하여 가공된 샘플에서 대리 펩티드의 안정성을 확인하였다: (1) 가공된 0일차 및 안정성 샘플의 전체 평균 피크 면적 비율은 CV가 25.0% 이하여야 하고; (2) 안정성과 0일차 QC(동일한 주입일에 가공함) 간의 피크 면적 비율의 차이 백분율은 ± 25.0% 내에 있어야 한다.
Figure pct00016
검증 프로토콜에 따르면, 캐리오버 평가는 전반적인 설명에 적절히 개략되어 있고, 여기서는 피크 면적이 캐리오버 평가에 사용되는 것으로 명시되어 있지만, 착오로 인해 허용 기준에서 확인된 설명에 피크 면적 비율이 명시된다. 피크 면적은 평가를 수행하는 올바른 방안이므로, 본 연구에서는 피크 면적을 사용하여 간섭을 평가하였다. 따라서, 캐리오버 블랭크에서 간섭을 평가하기에 적합한 접근법이 적용되었기 때문에(즉, 피크 면적) 데이터 품질 및 무결성에 대한 영향은 없다.
검증 프로토콜에 따르면, 정량자 전이의 각 펩티드에 대한 피크 면적 비율(SIL/비-표지)이 선형 눈금에 보정 곡선 데이터를 플롯팅하는 데 사용된다. 그러나, 플롯팅을 위해 정량자 전이의 각 펩티드에 대한 피크 면적을 대신 사용하였다. 피크 면적 비율은 높은 스파이킹 농도에서 안정 동위원소 표지 펩티드로부터 비-표지 신호에 대한 영향으로 인해 선형성 평가에 사용될 수 없다. 선형성 평가가 수행되었기 때문에 데이터 품질 및 무결성에 대한 영향은 없다.
검증 프로토콜에 따르면, 4회의 순차적 추출(라운드)을 이용하여 추출 효율 평가가 수행된다. 두 개의 매트릭스(즉, 보리 및 밀 종자)의 경우, 추출 효율 결과는 하기 개략된 바와 같은 허용 기준을 충족하지 않았다.
보리 종자 - 최종 추출(제4 라운드) 결과는 8.2%(허용 기준: <5.0%)였다.
밀 종자 - 최종 추출(제4 라운드) 결과는 6.2%(허용 기준: <5.0%)였다. 제1 라운드의 추출의 정밀성은 27.5% CV(허용 기준: ≤ 20.0%)였다.
그러나, 다음 이유로 인해 연구의 결과에 대한 영향은 없다: (1) 보리 및 밀 종자에 대한 최종 추출 결과는 HPPD 단백질의 추출이 4회 추출 라운드 이후에 거의 완료되었다는 것을 보여준다. 또한, 샘플 분석에서 HPPD 농도는 단일 추출(제1 라운드)로부터 결정되고, 추출 효율%에 대하여 조정될 것이고; (2) 밀 종자의 경우, 제1 라운드의 추출의 정밀성(27.5% CV)은 20.0% CV 기준을 초과하였지만, 단일 추출로부터 얻어진 3회 검증 진행(진행 4 내지 진행 6)으로부터의 QC0(내인성)에 대한 정밀성 및 정확성 결과는 20.0% 이하의 정밀성이 달성되었다는 것을 입증한다.
검증 프로토콜에 따르면, 각 정밀성 및 정확성 진행을 위해, 두(2) 개의 RSB 샘플이 각 매트릭스의 종료 시 고 QC 샘플 이후에 주입된다. 그러나, 하나의 매트릭스(즉, 밀 종자)의 경우, 고 QC 샘플(QC3 복제물 3) 이후 주입된 RSB 샘플을 착오로 인해 펩티드 GNFSELFK(SEQ ID NO:1)가 아니라 펩티드 GNFSQLFK(SEQ ID NO:2)에 대하여 MRM 방법을 이용하여 획득하였다. 그러므로, 밀 종자에 대하여 RSB 캐리오버 평가를 수행하지 않았다.
그러나, 다음 이유로 인해 연구 결과에는 영향이 없었다: (1) 펩티드 GNFSELFK(SEQ ID NO:1)의 캐리오버는 임의의 다른 매트릭스(밀 사료 포함)에 대해서는 관찰되지 않았고, 이에 따라 펩티드 GNFSELFK(SEQ ID NO:1)가 캐리오버에 대한 어떠한 경향도 나타내지 않았고, 밀 종자 매트릭스에 대한 펩티드 GNFSELFK의 캐리오버는 개연성이 매우 낮은 것으로 추론될 수 있다는 것이 전반적인 결론이고; (2) 결과적으로, 이용 가능한 데이터세트에 의해, 펩티드 GNFSELFK(SEQ ID NO:1)뿐만 아니라 GNFSQLFK(SEQ ID NO:2)와 관련하여 모든 매트릭스(밀 종자 포함)에 대한 샘플 분석에 사용될 RSB 캐리오버 허용 기준(즉, QC0 피크 면적 대비 비-표지 펩티드 피크 면적의 RT에서 5.0% 이하)이 확립될 수 있다.
또한, 연구에 대한 영향이 없는 약간의 SOP 편차가 있었다. 이들은 연구 파일에 기록되어 있다. 생성되는 데이터의 품질 또는 무결성에 유해하게 영향을 미칠 다른 상황은 본 연구의 수행 동안 발생하지 않았다.
특이성
모든 상업적 작물 추출물에서 비-표지 및 SIL 펩티드에 대하여 검정 특이성을 평가하였다. 평가는 시험된 상업적 작물 샘플에서 대리 펩티드 및 상응하는 SIL 펩티드의 머무름 시간에 약간의 몇몇 간섭을 나타냈다. 비-표지 펩티드의 경우, 블랭크와 완충액 샘플 간의 두 전이의 평균 비율 차이 백분율은 시험된 모든 식물 종/매트릭스에서 30.0% 미만이었고, 모든 간섭은 QC0(내인성) 샘플에서 SIL 펩티드의 평균 피크 면적의 5.0% 이하이므로, 특이성 허용 기준을 충족하였다.
선형성
섹션 3.4 및 0에 기재된 바와 같이 반향 곡선을 이용하여 각 식물 종/매트릭스에서 HPPD 단백질에 대하여 선형성을 결정하였다. 반향 곡선을 정의한 가장 단순한 회귀 모델, 즉, 선형 회귀를 이용하였다. 1/x의 데이터 가중치를 모든 식물 종/매트릭스에 사용하였다. 표 10은 선형성 평가를 위한 표준 곡선 매개변수(기울기, 절편 및 R 값)를 요약한 것이다. 각 식물 종/매트릭스에서 HPPD 단백질에 대한 표준 곡선의 상관 계수(R)는 0.9900 이상이었다. 확립된 데이터 모두는 섹션 0에 기재된 바와 같은 허용 기준 내에 속했고, 선형성 평가에 적합한 것으로 확인되었다.
[표 10]
가중 인자가 1/x인 선형 방정식에 대한 상업적 작물에서의 반향 곡선 매개변수
Figure pct00017
각 식물 종/매트릭스에서 역산된 반향 곡선 표준 농도는 표 11에 제공되어 있다.
[표 11]
상업적 작물에서 역산된 반향 곡선 표준 농도
Figure pct00018
각 식물 종/매트릭스의 각 표준물에 대해 N=2
정량 한계
선형성 평가에서, 정확성(편향)은 각각 LLOQ 및 ULOQ 샘플의 경우 ±25.0% 및 ±20.0% 내에 있었고(표 11), 따라서 정량 한계는 최저 및 최고 비-제로 표준물의 농도에서 설정되었다. 표 12는 각 식물 종/매트릭스에서 HPPD에 대한 정량 상한치 및 하한치를 요약한 것이다.
[표 12]
상업적 작물에서 HPPD에 대한 정량 한계
Figure pct00019
각 식물 종/매트릭스에서 HPPD에 대한 정량 범위는 분석 절차가 적합한 수준의 정확성을 갖는 것으로 입증된 하한치(LLOQ) 농도와 상한치(ULOQ) 농도 사이의 간격이다. LLOQ 및 ULOQ 샘플은 각 식물 종/매트릭스에서 HPPD에 대한 정확성 기준을 충족하였다. 방법의 정량 범위를 각 식물 종/매트릭스에 대하여 설정하였다(표 13).
[표 13]
상업적 작물에서 HPPD의 정량 범위
Figure pct00020
캐리오버
시험된 상업적 작물 샘플에 대한 ULOQ 표준물 이후에 주입된 블랭크 샘플을 평가함으로써 선형성 평가에서 캐리오버를 결정하였다. 평가는 SIL 펩티드의 머무름 시간에 간섭을 나타내지 않았다. SIL 펩티드 피크 면적 비율은 ULOQ 표준물 이후에 주입된 제1 캐리오버 블랭크 샘플의 적어도 50%에서 LLOQ 표준물(들)의 SIL 펩티드의 평균 피크 면적 비율의 20.0% 이하이므로, 캐리오버 허용 기준을 충족하였다.
또한, 고 QC 샘플의 주입에 따른 RSB 샘플을 사용하여 정밀성 및 정확성뿐만 아니라 안정성 진행 동안 캐리오버를 평가하였다. 전반적으로, 평가는 블랭크 샘플에서 캐리오버를 나타내지 않았다. 연구 샘플 분석에 대한 RSB 블랭크 캐리오버 허용 기준은 QC0(내인성) 샘플에서 비-표지 펩티드의 평균 피크 면적의 5.0% 이하일 것이다.
정밀성 및 정확성
상업적 작물에 대한 HPPD 방법의 정밀성 및 정확성을 본원에 기재된 QC 샘플을 사용하여 평가하였다. 3회의 정밀성 및 정확성 진행이 있었다. 모두 진행 허용 기준을 충족하였다. 검정내 및 검정간 진행에 대한 정밀성(CV) 및 정확성(편향) 데이터는 표 14 내지 표 23(식물 종/매트릭스 당 표 1개)에 요약되어 있다.
검정내와 검정간 둘 모두의 경우, CV는 QC0 샘플에 대하여 25.0% 미만이었고, 저, 중 및 고 QC 샘플에 대하여 20.0% 미만이었으며, 따라서 방법 정밀성 평가는 적합했다.
검정내와 검정간 둘 모두의 경우, 편향은 저, 중 및 고 QC 샘플에 대하여 ±20.0% 내에 있었고; 따라서 방법 정확성 평가는 적합했다.
정밀성 및 정확성 배치의 가장 긴 주입 시간은 대략 36시간 58분이었고(187회 주입의 배치 크기), 따라서 이는 연구 샘플 분석에 대한 검정의 최장 주입 시간으로서 확립되었다.
정밀성 및 정확성 진행으로부터의 QC0(내인성) 샘플의 경향 분석을 수행하였다. 또한, 경향 분석을 연장하기 위해 샘플 분석에 대하여 QC0(내인성) 샘플을 분석하였다.
[표 14]
보리 종자에서 HPPD에 대한 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성 결과
Figure pct00021
공칭 = 계산에 사용된 실제 농도
각 진행에서 각 QC에 대해 N=3
N/Ap = 적용 불가
[표 15]
메이즈 종자에서 HPPD에 대한 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성 결과
Figure pct00022
공칭 = 계산에 사용된 실제 농도
각 진행에서 각 QC에 대해 N=3
N/Ap = 적용 불가
[표 16]
벼 종자에서 HPPD에 대한 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성 결과
Figure pct00023
공칭 = 계산에 사용된 실제 농도
각 진행에서 각 QC에 대해 N=3
N/Ap = 적용 불가
[표 17]
대두 종자에서 HPPD에 대한 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성 결과
Figure pct00024
공칭 = 계산에 사용된 실제 농도
각 진행에서 각 QC에 대해 N=3
N/Ap = 적용 불가
[표 18]
밀 종자에서 HPPD에 대한 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성 결과
Figure pct00025
공칭 = 계산에 사용된 실제 농도
각 진행에서 각 QC에 대해 N=3
N/Ap = 적용 불가
[표 19]
보리 사료에서 HPPD에 대한 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성 결과
Figure pct00026
공칭 = 계산에 사용된 실제 농도
각 진행에서 각 QC에 대해 N=3
N/Ap = 적용 불가
[표 20]
메이즈 사료에서 HPPD에 대한 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성 결과
Figure pct00027
공칭 = 계산에 사용된 실제 농도
각 진행에서 각 QC에 대해 N=3
N/Ap = 적용 불가
[표 21]
귀리 사료에서 HPPD에 대한 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성 결과
Figure pct00028
공칭 = 계산에 사용된 실제 농도
각 진행에서 각 QC에 대해 N=3
N/Ap = 적용 불가
[표 22]
대두 사료에서 HPPD에 대한 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성 결과
Figure pct00029
공칭 = 계산에 사용된 실제 농도
각 진행에서 각 QC에 대해 N=3
N/Ap = 적용 불가
[표 23]
밀 사료에서 HPPD에 대한 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성 결과
Figure pct00030
공칭 = 계산에 사용된 실제 농도
각 진행에서 각 QC에 대해 N=3
N/Ap = 적용 불가
추출 효율
표 24는 상업적 작물로부터 단백질 추출 방법의 효율을 요약한 것이다. HPPD에 대한 모든 식물 종/매트릭스는 단일 반복으로 허용 가능한 추출 효율에 도달하였다. 보리 종자(59.9%), 메이즈 종자(69.8%), 벼 종자(73.9%), 대두 종자(64.9%), 밀 종자(54.3%), 보리 사료(69.8%), 메이즈 사료(76.3%), 귀리 사료(78.4%), 대두 사료(65.4%) 및 밀 사료(77.2%)로부터의 HPPD의 평균 추출 효율은 방법이 허용 가능한 추출 효율 평가를 충족한다는 것을 입증한다. 더욱이, CV 값은 모든 식물 종/매트릭스에서 HPPD에 대하여 20.0% 미만이었고, 최종 추출 시 양은 보리 및 밀 종자를 제외하고 모든 상업적 작물에 대하여 5.0% 미만이었다.
[표 24]
상업적 작물로부터의 HPPD의 추출 효율
Figure pct00031
N = 4회 추출 반복 및 반복 당 3개 복제물
진행 3에서 추출 효율을 수행하였다
세부 사항은 부록 A의 표 A14를 참조한다
기울임꼴 및 굵게 표시된 값은 허용 기준 밖에 있는 것이고, 섹션 5.1.3을 참조한다
표 25는 -20℃의 공칭 온도에서 6일(146시간 16분) 동안 대리 펩티드의 건조 추출물 안정성을 요약한 것이다. 안정성 샘플의 평균 피크 반응 비율은 25.0% 이하의 CV였고, 안정성 샘플의 차이%는 0일차 QC 샘플과 비교할 때, 건조 가공된 샘플 안정성 평가에 대하여 ±25.0% 내에 있었다.
[표 25]
-20℃의 공칭 온도에서 6일(146시간 16분) 동안 상업적 작물 건조 추출물의 안정성
Figure pct00032
모든 QC에 대해 N = 3; N/Ap = 적용 불가
a 차이% - (안정성 QC-0일차 QC)/0일차 QC x 100
진행 7에서 건조 안정성을 수행하였다
세부 사항은 부록 A의 표 A15를 참조한다
본 연구의 목적은 LC-MS/MS를 이용하여 다양한 상업적 작물(보리, 메이즈, 벼, 대두, 및 밀 종자, 및 보리, 메이즈, 귀리, 대두 및 밀 사료)에서 p-하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제(HPPD) 단백질의 정량화를 위한 MS-기반 방법을 검증하는 것이었다. HPPD 단백질에 고유한 대리 펩티드를 사용하여 상대 농도를 결정하였다. 상업적 작물 샘플을 사용하여 특이성, 선형성, 정량 한계, 캐리오버, 정밀성 및 정확성, 추출 효율 및 안정성을 포함하는 방법 성능 매개변수를 평가하였다.
특이성 평가는 시험된 임의의 상업적 작물 샘플에서 비-표지 펩티드(블랭크와 완충액 간의 두 전이의 평균 비율 차이는 30.0% 미만) 및 SIL 펩티드(QC0(내인성)의 SIL 신호는 5.0% 이하)의 머무름 시간에 유의한 간섭을 나타내지 않았다. 모든 특이성 매개변수가 허용 기준을 충족하였다.
상업적 작물에서 HPPD에 대한 정량 하한치 및 정량 범위(fmol/mg DW 및 μg/g DW)는 표 26에 나타나 있다.
[표 26]
상업적 작물, 대리 펩티드, 정량 하한치 및 정량 범위의 목록
Figure pct00033
방법의 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성은 표 27에 요약되어 있다.
[표 27]
상업적 작물에서 HPPD에 대한 검정내 및 검정간 정밀성 및 정확성 범위
Figure pct00034
모든 상업적 작물에서 HPPD에 대한 농도/검출기 반응 관계를 적절히 나타내도록 선형 방정식을 결정하였다. 1/x의 데이터 가중치를 모든 상업적 작물에 사용하였다.
단백질 추출 방법의 효율은 보리 종자의 경우 59.9%이고, 메이즈 종자의 경우 69.8%이고, 벼 종자의 경우 73.9%이고, 대두 종자의 경우 64.9%이고, 밀 종자의 경우 54.3%이고, 보리 사료의 경우 69.8%이고, 메이즈 사료의 경우 76.3%이고, 귀리 사료의 경우 78.4%이고, 대두 사료의 경우 65.4%이고, 밀 사료의 경우 77.2%였다. 제1 라운드의 추출의 CV는 CV가 27.5%였던 밀 종자를 제외하고, 모든 상업적 작물에 대하여 20.0% 미만이었다. 그러나, 단일 추출로부터 얻어진 밀 종자에 대한 QC0(내인성)의 정밀성 및 정확성 결과는 20.0% 이하의 정밀성이 달성되었다는 것을 입증해 준다.
가공 안정성(건조 추출물)을 -20℃에서 6일 동안 평가하였다. 안정성 평가는 허용 기준을 충족하였다. CV는 25.0% 이하이고, 안정성과 0일차 QC 간의 피크 면적 비율 차이 %는 모든 상업적 작물에 대하여 ± 25.0% 내였다.
평가된 모든 성능 매개변수는 각각 8.2% 및 6.2%였던 보리 및 밀 종자의 최종 추출%, 뿐만 아니라 27.5% CV였던 밀 종자에 대한 제1 라운드의 추출의 정밀성을 제외하고 규정된 허용 기준을 충족하였다. 샘플 분석에서 HPPD의 농도는 단일 추출(제1 라운드)로부터 결정되고 추출 효율%에 대해 조정될 것이고, 정밀성 및 정확성 진행에서 밀 종자의 경우 20.0% 이하의 정밀성이 달성되었기 때문에, 연구 결과에 대한 영향은 없다. 본 연구의 결과에 기초할 때, 질량 분광법-기반 방법은 GLPS에 따라 본 연구에서 평가된 상업적 작물의 목록에 대한 HPPD 단백질의 정량화에 적합할 것으로 확인되었다.
본 발명은 이의 특정 구현예와 연관하여 기술되었지만, 본 발명의 장치는 추가 변형이 가능하다는 것이 이해될 것이다. 본 특허 출원은, 본 발명의 임의의 변화, 사용, 또는 개조(일반적으로 본 발명의 원리를 따르며, 발명이 속하는 기술 분야 내의 공지되어 있거나 관례적인 실시 내에 속하고 기재 전에 본원의 필수적인 특징에 적용될 수 있으며 첨부된 청구항의 범위에 따르는 본 개시로부터의 일탈을 포함함)를 포함하는 것으로 하고자 한다.
본 명세서에서 언급되는 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 본원에서 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별적 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로, 참조로서 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Syngenta Crop Protection AG Young, Scott <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR PROTEIN DETECTION <130> 81875-WO-REG-ORG-P1 <150> 62/839988 <151> 2019-04-29 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Glycine max <400> 1 Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Zea mays <400> 2 Gly Asn Phe Ser Gln Leu Phe Lys 1 5

Claims (12)

  1. 하나 이상의 농작물로부터의 하나 이상의 생물학적 샘플에서 단백질의 혼합물 중에 p-하이드록시페닐피우르베이트 디옥시게나제(HPPD) 단백질을 선택적으로 검출하거나 정량화하도록 질량 분광법 검정에서 기능하는 표지 대리 펩티드로서, 대리 펩티드는 표지 및 GNFSELFK(SEQ ID NO:1) 및 GNFSQLFK(SEQ ID NO:2)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 표지 대리 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 펩티드는 안정 동위원소 표지(stable isotope labeled: SIL) 아미노산의 혼입에 의해 표지되는, 표지 대리 펩티드.
  3. 제2항에 있어서, SIL 아미노산은 리신, 이소류신, 발린 또는 아르기닌인, 표지 대리 펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 식물은 보리, 벼, 대두, 밀, 귀리 또는 메이즈(maize)인, 표지 대리 펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 식물은 보리, 벼, 대두, 밀 또는 벼이고, 대리 펩티드는 표지 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  6. 제4항에 있어서, 상기 식물은 메이즈이고, 대리 펩티드는 표지 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는, 대리 펩티드.
  7. 제1항의 적어도 두 개의 표지 대리 펩티드를 포함하는 검정 카세트(assay cassette).
  8. 표적 단백질과 비-표적 단백질의 혼합물을 포함하는 농작물로부터의 복합적인 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적 HPPD 단백질을 동시에 검출하거나 정량화하는 방법으로서,
    a. 농작물로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    b. 생물학적 샘플로부터 단백질을 추출하여 단백질의 혼합물을 포함하는 추출물을 생성하는 단계;
    c. 단계 b의 추출물에서 불용성 단백질의 양을 감소시켜, 농축된 가용성 단백질의 추출물을 생성하는 단계;
    d. 단계 c의 추출물에서 가용성 단백질을 분해하여 펩티드 단편을 포함하는 추출물을 생성하는 단계로서, 펩티드 단편은 표적 단백질에 특이적인 적어도 하나의 대리 펩티드를 포함하는, 단계;
    e. 단계 d의 추출물에서 펩티드 단편을 농축시키는 단계,
    f. 제1항의 하나 이상의 표지 대리 펩티드를 첨가하는 단계로서, 각 표지 대리 펩티드는 표적 단백질의 각 대리 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖고, 첨가된 표지 대리 펩티드의 수는 혼합물 중 표적 단백질의 수와 동일한, 단계;
    g. 혼합물 중 비-대리 펩티드의 양을 감소시킴으로써 대리 펩티드 및 표지 대리 펩티드를 농축시키는 단계;
    h. 액체 크로마토그래피를 통해 단계 g로부터의 펩티드 단편 혼합물을 용해시키는 단계;
    i. 질량 분광법을 통해 단계 h로부터 생성된 펩티드 단편 혼합물을 분석하는 단계로서, 표지 대리 펩티드의 전이 이온 단편의 검출은 대리 펩티드가 유래된 표적 단백질의 존재를 가리키는, 단계; 및, 선택적으로,
    j. 단계 i의 전이 이온 단편으로부터 발생된 질량 분광법 신호를 전이에 의해 발생된 질량 분광법 신호와 비교함으로써 생물학적 샘플에서 표적 단백질의 양을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 농작물은 보리, 벼, 대두, 밀 또는 벼이고, 대리 펩티드는 표지 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 농작물은 메이즈이고, 대리 펩티드는 표지 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 펩티드는 안정 동위원소 표지(SIL) 아미노산의 혼입에 의해 표지되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, SIL 아미노산은 리신, 이소류신, 발린 또는 아르기닌인, 방법.
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