KR20210044233A - 흑색종의 전이 및 환자의 예후를 예측하기 위한 유전자 서명 - Google Patents

흑색종의 전이 및 환자의 예후를 예측하기 위한 유전자 서명 Download PDF

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KR20210044233A
KR20210044233A KR1020217005548A KR20217005548A KR20210044233A KR 20210044233 A KR20210044233 A KR 20210044233A KR 1020217005548 A KR1020217005548 A KR 1020217005548A KR 20217005548 A KR20217005548 A KR 20217005548A KR 20210044233 A KR20210044233 A KR 20210044233A
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알렉산더 메베스
도메니코 벨로모
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스카이라인덱스 비.브이.
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Abstract

본 개시내용은 피부 흑색종에 걸린 개체의 분류를 위한 유전자 서명을 제공한다. 본원에 제공된 "SLN 유전자 서명"은 개체를 예후에 기초하여 분류하고/하거나 개체를 전이-양성 또는 -음성 감시림프절(SLN)을 갖는 것으로서 분류한다. 본원에 제공된 "N-SLN 유전자 서명"은 개체를 전이-양성 또는 -음성 비-감시림프절(N-SLN)을 갖는 것으로서 분류한다.

Description

흑색종의 전이 및 환자의 예후를 예측하기 위한 유전자 서명
본 개시내용은 피부 흑색종에 걸린 개체의 분류를 위한 유전자 서명을 제공한다. 본원에 제공된 "SLN 유전자 서명"은 개체를 예후에 기초하여 분류하고/하거나 개체를 전이-양성 또는 -음성 감시림프절(SLN)을 갖는 것으로서 분류한다. 본원에 제공된 "N-SLN 유전자 서명"은 개체를 전이-양성 또는 -음성 비-감시림프절(N-SLN)을 갖는 것으로서 분류한다.
피부 흑색종은 대개 피부 진피의 기저층에 위치하는 색소 생성 멜라닌 세포로부터 발생하는 악성 종양이다. 대부분의 병변은 ABCDE 법칙: 비대칭성, 불규칙한 경계, 색조의 다양성, 6 ㎜를 초과하는 직경 및 전개, 즉 빠르게 변하는 성향에 의해 기재되는 바와 같은 징후와 함께 나타난다(문헌[Abbasi NR, Shaw HM, Rigel DS, et al. Early Diagnosis of Cutaneous Melanoma Revisiting the ABCD Criteria. JAMA. 2004;292(22):2771-2776]). 상기 부위는 전형적으로 무증상성이지만, 가려움 및/또는 출혈(특히 말기 단계에서)을 일으킬 수 있다. 의심 병변의 검출은 대개 피부의 자기-검사에 의해 수행되며, 상기 검사는 통상적으로 상기 ABCDE 기준 또는 "미운 오리새끼 징후(ugly duckling signs)"(문헌[Grob J. The 'Ugly Duckling' Sign: Identification of the Common Characteristics of Nevi in an Individual as a Basis for Melanoma Screening. Arch Dermatol. 1998;134:103-104])에 기초하여 수행할 것이 권장된다. 후속적으로 흑색종이 의사에 의해 공식적으로 진단되는 경우, 공지된 다수의 임상적 및 병적인 변종이 존재하기 때문에 구체적인 하위유형을 결정하는 것이 중요하다. 가장 흔한 형태는 피부 흑색종(사례의 약 70%를 차지하는 표재 확산성 흑색종)이며, 피부가 흰 사람들에서 특히 빈번히 발생한다. 상기 상태의 중증도는 대개 원발 영역 밖으로 이동하는 흑색종 세포의 능력에 따라 변한다. 이러한 이유로 인해 상기 종양이 국소화되는지 또는 림프절이나 기관으로 확산되는지를 평가하는 것이 무엇보다도 가장 유의미하다.
흑색종의 병기분류는 환자 예후 및 추가적인 모니터링 및 치료 전략을 결정하는데 중요하다. 이는 또한 9개 유럽 국가의 체계적인 문헌조사에서 보고된 5년 전체 생존수의 현저한 대조에서도 반영된다: 95%-100%(I기), 65%-92.8%(II기), 41%-71%(III기), 및 9%-28%(IV기). 이러한 차이는 국소화된 흑색종 병변과 반대로, 전이하는 흑색종의 능력에 크게 의존한다. 상이한 병기 부류간의 정확한 구별이 중요하며 상기 구별은 가장 통상적으로는, 원발 종양의 두께(T), 림프절로의 종양 세포의 존재 및/또는 정도(N) 및 다른 기관으로의 원위 전이의 존재(M)를 지칭하는 TNM 시스템에 기초한다. 원발성 종양-병기의 정도를 평가하는 경우, 의사는 종양 두께뿐만 아니라 추가적인 특징, 예를 들어 궤양의 존재 및 원발성 종양 세포의 유사분열률을 고려한다. 통상적으로, 높은 종양-병기의 환자에서만, 두꺼운 흑색종 및/또는 다른 변수, 예를 들어 궤양에 기인한 림프절 및 전이 확산이 평가될 것이다. 당해분야에서 이해되는 바와 같이, 예후는 환자의 의학적 성과의 예측을 지칭한다. 예를 들어, 개체를 불량한 예후 또는 양호한 예후를 갖는 것으로서 분류할 수 있다. 흑색종에 걸린 환자의 예후는 예를 들어 장기간 생존의 가능성, 전체 생존, 무진행 생존, 재발 대 질병 관해의 예측, 및 질병 진행을 가리킨다.
현재, 환자를 정확하게 계층화하고 예후를 예측하기 위해 광범위하게 적용되는 시술은 SLNB(감시림프절 생검) 방법을 통해 SLN에서 전이의 존재를 결정하는 것이다. 피부 흑색종 환자의 관리는 1990년대 초 SLNB 시술에 의한 림프 맵핑이 포함된 이래로 현저하게 진전되었다(문헌[Morton DL, Wen DR, Wong JH, et al. Technical details of intraoperative lymphatic mapping for early stage melanoma. Arch Surg. 1992;127(4):392-399]). 청색 염료 및 감마 탐침 검출 기능이 있는 방사성 추적기를 사용하는 이중-방식의 수술중 접근법의 실행에 의해 수술 기법이 개선되었다. 또한, 병리학적 평가가 SLN의 연속 박편화 및 면역조직화학의 사용에 의해 개선되었다. 그 결과, 제1 배액 림프절 또는 종양에 가깝게 위치한, 따라서 있음직한 전이 질병의 부위인 림프절(즉 SLN) 그룹이 보다 양호하게 식별되었다. 이러한 과정을 또한 "감시림프절 맵핑"이라 칭한다.
SLN 확실성의 유의미한 영향이 또한, 각각 72.3%의 종양-양성 SLN을 갖는 환자 및 90.2%의 종양 음성 SLN을 갖는 환자에 대한 5-년 생존률의 차이를 나타내는 MSLT-1 연구에서 입증되었다(문헌[Morton DL, Thompson JF, Cochran AJ, et al. Sentinel-Node Biopsy or Nodal Observation in Melanoma. new engl J Med. 2006;355(13):1307-1317]). 미국 암 합동 위원회(AJCC) 흑색종 지침의 제8판에 따르면, 상기 SLNB 시술은 ≥8 ㎜의 피부 흑색종을 갖는 환자에게 권장된다(문헌[Gershenwald JE, Scolyer RA, Hess KR, et al. Melanoma Staging: Evidence-Based Changes in the American Joint Committee on Cancer Eighth Edition Cancer Staging Manual. CA Cancer J Clin. 2017;67(6):472-492]). 상기 그룹의 환자에 대해서, SLNB 시술이 일반적으로 수행되며 추가의 치료는 전이의 수준에 따라 변한다. 경계선 그룹 내에서는, 특히 흑색종이 추가적인 불리한 예후 매개변수를 나타내는 경우 SLNB가 고려될 수 있다. <0.8 ㎜의 흑색종 두께를 갖는 환자의 경우, 일반적으로 표준 치료가 충분할 것으로 고려되며 SLNB는 권장되지 않는다. 상기 표준 치료는 넓은 가장자리를 갖는 원발성 흑색종의 국소 절제, 즉 종양의 수술적 절제를 수반한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "절제"는 인간 환자로부터 흑색종의 악성 조직 특징의 수술적 제거를 의미하는 것으로 이해된다. 하나의 실시태양에 따라, 절제는 상기 환자내에 남아있는 악성 조직의 존재가 이용 가능한 방법에 의해 검출될 수 없을 정도의 악성 조직의 제거를 의미하는 것으로 이해될 것이다.
상기 SLNB가 양성으로 분류되는 비율은 매우 가변적이며 원발성 종양의 공지된 예후 인자에 따라 크게 달라진다. 임상 I 또는 II기 환자의 경우, SLN 전이의 백분율은 15 내지 30%인 반면, 얇은 흑색종에서 상기 백분율은 5.2%인 것으로 입증되었다. 흑색종 전문가 패널 병기 결정 지침의 최신판은 0.8 ㎜에서 T1 흑색종의 하위범주화의 임상적 관련성을 언급하였다. 이는 T1 흑색종의 다수의 생존 연구에서 0.7 내지 0.8 ㎜의 영역에 잠재적인 임상적 절편이 존재한다는 탐지된 성향에 기초한다. 그러나, SLNB 후 환자의 장기 추적 조사에 따르면, 처음에는 종양이 없었던 감시림프절을 가진 환자에서 국소 결절 재발이 발생하는 것으로 나타났다. 이러한 정보를 통해 SLBN 시험 수행성능을 계산할 수 있었으며, 상기 수행성능은 전체 위음성 비율이 12.5%임을 확립하였다. 보다 최근에, 모튼(Morton) 등은 SLNB가 16.0% 양성인 중간 두께의 흑색종에서, 4.8%가 10년 추적검사 기간내에 재발에 기초한 위음성 시험 결과를 가짐을 보고하였다. 두꺼운 흑색종의 32.9% 양성 SLNB의 경우, 상기 위음성률은 10.3%였다.
SLNB는 피부 흑색종을 잠재적으로 병기분류하는 방법일 뿐만 아니라, SLN의 전이 분류에 따라 필요할 수도, 필요하지 않을 수도 있는 치료의 일부이다. 상기 SLNB 시술은 환자에 대해 합병증을 야기할 수 있으며 비용이 많이 든다. 따라서, 상기 시술은 대부분의 저 위험 병변으로부터 보다 높은 전이 확산 위험성을 갖는 것으로 간주되는 선택된 환자 그룹에서만 수행된다. 상기 전이의 위험성을 브레스로우 깊이(Breslow depth)로서 공지된 종양 침습 깊이, 및 종양 표면의 궤양을 포함한 임상병리학적 인자의 평가에 의해 평가할 수 있다. 피부에 수직으로 깊숙이 자라는 궤양성 종양 및 흑색종은 불리한 결과의 위험이 더 높다. 예를 들어, SLN 생검은 T1a 얇은 흑색종의 경우 권장되지 않으며, T1b 얇은-흑색종 환자의 경우 '권장될 수도 있고', T2 및 T3 중간 두께 흑색종 환자의 경우 권장되며, T4 두꺼운-흑색종 환자의 경우 '권장될 수도 있다'.
이러한 임상병리학적 변수의 개념은 일반적으로 종양 스펙트럼의 극단에서 고위험 환자를 식별할 수 있지만, 이러한 방법은 중간 병변에 대해서는 정확하지 않다. 더욱이, 고- 또는 저 위험 그룹내에 예외가 또한 존재한다. 예를 들어, '얇은' 흑색종(<0.8 ㎜ 침습 깊이)의 5%는, 상기 흑색종이 통상적으로 표준 임상병리학적 변수에 기초한 저 위험 프로파일을 갖는 것으로서 분류됨에도 불구하고, 국소적으로 전이되는 것으로 공지되어 있다. 95%의 생물학적으로 나태한 병변으로부터 더 높은 위험 병변을 보다 양호하게 구별하기 위해서, 종양의 유사분열률(유사분열/㎟)과 같은 추가적인 조직학적 변수 및 형광 제자리 하이브리드화(FISH)와 같은 추가적인 분자 방법이 도입되었다. 불행하게도, 이러한 기법은 단지 부분적으로만 성공하였으며, SLNB의 95% 이하가 음성이라는 사실을 생성시켰다. 그 결과, 현행 진단 기준으로, 대다수의 환자가 불필요한 SLNB 수술을 겪게되고 피할 수도 있었던 연관된 부작용을 발생시키는 과잉치료가 존재한다. 이와 역으로, 임상병리학적 인자에 기초하여 현재 SLNB가 적용되지 않는 환자들의 분획이 여전히 SLN에 전이를 나타내거나 또는 말기의 원위 전이를 나타낼 수 있다.
따라서, SLNB 시술이 절제된 조직 중의 SLN 양성 결절의 식별에는 정확하지만, 상기 SLNB 시술에 적격인 환자의 선택은 여전히 도전으로 남아있다. 본 발명의 하나의 목적은 전이-양성 SLN을 가질 위험성 및 따라서 SLNB 시술이 필요한 개체를 분류하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 예후를 예측하는 것이다. 상기 정보는 예를 들어 최적의 치료 전략을 결정하는데 유용할 수 있다.
본 발명은 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 샘플에서 유전자 발현 서명을 측정함을 포함하는 상기 개체의 분류 방법을 제공하며, 여기에서 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자: ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 3개 이상을 포함한다. 바람직하게, 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하고: ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8을 포함한다. 바람직하게, 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하고: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, SERPINE2, 및 TGFBR1, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하며: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2, 및 TGFBR1, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함한다: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1. 또한, 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하는 유전자 서명이 바람직하다: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1.
또한, 피부 흑색종에 걸린 개체의 샘플에서 하기의 유전자: ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 3개 이상의 발현 수준을 측정하고, 상기 발현 수준에 기초하여 치료 및/또는 진단 후처리 스케줄을 결정함을 포함하는, 상기 개체에 대한 치료 및/또는 진단 후처리 스케줄의 결정 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하고: ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8을 포함한다. 바람직하게, 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하고: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, SERPINE2, 및 TGFBR1, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하며: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2, 및 TGFBR1, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함한다: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1. 또한, 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하는 유전자 서명이 바람직하다: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1.
또한, 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 샘플에서 하기의 유전자: ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 3개 이상을 포함하는 유전자 발현 서명을 측정함을 포함하는, 상기 개체의 예후를 예측하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하고: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, SERPINE2, 및 TGFBR1, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하며: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2, 및 TGFBR1, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함한다: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1. 또한, 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하는 유전자 서명이 바람직하다: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1.
하나의 태양에서 상기 개체를 전이-양성 SLN을 갖는 것으로서 분류하거나 또는 전이-음성 SLN을 갖는 것으로서 분류한다. 하나의 태양에서, 상기 개체의 예후를 유전자 발현 수준에 기초하여 결정한다. 바람직하게, 개체를 불량한 예후 또는 양호한 예후를 갖는 것으로서 분류한다. 상기 개체를 상기 분류 및/또는 발현 수준에 기초하여 SLNB에 대해서 선택할 수 있다. 전이-양성 SLN 또는 다소 불량한 예후를 갖는 것으로서 분류된 개체를 SLNB 및/또는 보조 치료를 수행함으로써 치료한다.
본 발명은 또한 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 샘플에서 유전자 발현 서명을 측정함을 포함하는 상기 개체의 분류 방법을 제공하며, 여기에서 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 적어도 하나를 포함한다: KRT14, SPP1, FN1 및 LOXL3.
더욱이,
- 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 샘플에서 유전자 발현 서명을 측정하고, 여기에서 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하며: ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8,
- 상기 개체를 상기 유전자 발현 서명에 기초하여 전이-양성 SLN 및/또는 불량한 예후를 갖는 것으로서 분류하고,
- SLNB를 수행하고/하거나 상기 개체에게 암 치료를 제공함으로써 상기 개체를 치료함
을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하고: ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8을 포함한다. 바람직하게, 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하고: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, SERPINE2, 및 TGFBR1, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하며: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2, 및 TGFBR1, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함한다: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1. 또한, 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하는 유전자 서명이 바람직하다: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1.
본 발명은 또한
- 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 샘플에서 유전자 발현 서명을 측정하고, 여기에서 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 적어도 하나를 포함하며: KRT14, SPP1, FN1 및 LOXL3,
- 상기 개체를 상기 유전자 발현 서명에 기초하여 전이-양성 N-SLN을 가질 위험이 높은 것으로서 분류하고,
- 완전한 림프절 절제를 수행하고/하거나 상기 개체에게 암 치료를 제공함으로써 상기 개체를 치료함
을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법을 제공한다.
또한, 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체에서 유전자 서명을 분석하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
- 상기 개체의 원발성 피부 흑색종 병변으로부터 RNA를 추출하고;
- 하기의 유전자 ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 적어도 3개의 RNA 전사물을 역전사하여 상기 RNA 전사물의 cDNA를 생성시키고;
- 상기 RNA 전사물의 발현 수준의 측정을 위해서 상기 cDNA를 증폭시켜 상기 cDNA로부터 앰플리콘을 생성시킴
을 포함한다.
본 발명은 또한 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체에서 유전자 서명을 분석하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
- 상기 개체의 원발성 피부 흑색종 병변으로부터 RNA를 추출하고;
- 하기의 유전자 KRT14, SPP1, FN1 및 LOXL3 중 적어도 하나의 RNA 전사물을 역전사하여 상기 RNA 전사물의 cDNA를 생성시키고;
- 상기 RNA 전사물의 발현 수준의 측정을 위해서 상기 cDNA를 증폭시켜 상기 cDNA로부터 앰플리콘을 생성시킴
을 포함한다.
더욱이, 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 분류에 사용하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는
a) 하기의 유전자 중 3개 이상: ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8; 및/또는
b) 하기의 유전자 중 적어도 하나: KRT14, SPP1, FN1, 및 LOXL3, 및 임의로
c) 적어도 하나의 참조 유전자
를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 포함한다.
바람직하게, 키트는 하기의 유전자 중 3개 이상을 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 포함하고: ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8, 보다 바람직하게 상기 키트는 ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8을 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 포함한다. 바람직하게, 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하고: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, SERPINE2, 및 TGFBR1, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하며: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2, 및 TGFBR1, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함한다: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1. 또한, 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하는 유전자 서명이 바람직하다: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1.
도 1: 1) ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 유전자 서명(분자 모델), 2) 임상-병리학적 변수(연령 및 브레스로우 깊이), 3) 조합된 ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 유전자 서명 및 임상-병리학적 변수에 대한, DLCV에서 훈련된 로지스틱 회귀 분류기에 대한 평균 ROC 곡선. x-축은 위양성 발견율(즉 1-특이성)을 나타내고, y-축은 실제 발견율(즉 감도)을 나타낸다.
도 2: 전체 770명 환자 코호트에 대한, ITLP 점수 및 SLN 유전자 서명에 대한 ROC 곡선("로지스틱 회귀 모델"이라 칭한다). x-축은 위양성 발견율(즉 1-특이성)을 나타내고, y-축은 실제 발견율(즉 감도)을 나타낸다.
도 3: 상이한 ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 유전자 서브세트, 5개의 ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 유전자의 전체 세트, 및 ITLP 서명에 대한 ROC 곡선 아래 면적의 박스플롯.
도 4: 1) 유전자 발현, 2) 임상-병리학적 변수, 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수에 대한, DLCV에서 훈련된 로지스틱 회귀 분류기에 대한 평균 ROC 곡선. x-축은 위양성 발견율(즉 1-특이성)을 나타내고, y-축은 실제 발견율(즉 감도)을 나타낸다.
도 5: 상이한 유전자 서브세트 및 4개 유전자의 전체 세트에 대한 ROC 곡선 아래 면적의 박스플롯.
도 6: 전체 수행성능 비교: CL 대 GE 대 GECL. 1) 유전자 발현, 2) 임상-병리학적 변수, 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수에 대한, DLCV에서 훈련된 로지스틱 회귀 분류기에 대한 ROC 곡선.
도 7: NPV 대 SLNBRR. 1) 유전자 발현, 2) 임상-병리학적 변수, 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수에 대한, DLCV에서 훈련된 로지스틱 회귀 분류기에 대한 음성 예측값(NPV) 대 감시림프절 감소율(SLNB RR).
도 8: 유전자 서브세트-AUC 박스플롯. 전체 코호트상에서 훈련된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 유전자의 서브세트에 대한 로지스틱 회귀 분류기에 대한 ROC 곡선의 곡선 아래 면적(AUC)의 박스플롯.
본 개시내용은 부분적으로, 원발성 피부 흑색종 종양 조직 샘플의 분석을 수행하기 위한 방법, 키트, 유전자 서명 및 상기와 같은 유전자 서명의 검출 수단을 제공한다. 하나의 태양에서, 본 개시내용은 "SLN 유전자 서명"을 제공한다. 상기 SLN 유전자 서명은 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체를 분류하며, 특히 상기 유전자 서명은 전이-양성 SLN 및/또는 불량한 예후를 갖는 개체의 위험을 분류한다. 이러한 위험 평가는 SLNB 시술 및/또는 대안의 치료 전략이 타당한지의 여부를 판정하는 경우 의사와 환자에게 유용하다. 상기 평가는 또한 임상 시험에 포함시킬 환자를 선택하는 경우 유용하다.
본원에 사용되는 바와 같이, SLN은 종양으로부터 림프 배액을 수용하는 첫 번째 림프절(또는 제1 림프절 세트)이며 암이 확산될 가능성이 있는 첫 번째 림프절(또는 제1 림프절 세트)이다. N-SLN은 종양으로부터 림프 배액을 수용하는 첫 번째 림프절이 아닌 림프절이다. 상기와 같은 N-SLN은 종종 SLN과 동일한 결절 골반 중의 결절 또는 상기 SLN에 가까운 결절이다.
일부 실시태양에서, 상기 유전자 서명은 전이-양성 SLN의 위험성을 분류한다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 방법은 전이-양성 SLN을 갖거나 전이-음성 SLN을 갖는 개체를 분류한다. 일부 실시태양에서, 상기 유전자 서명은 개체의 예후를 분류한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 예후는 의학적 성과의 예측을 지칭하며 전체 생존, 흑색종 특이성 생존, 무반복 생존, 무재발 생존 및 원위 무재발 생존과 같은 척도에 기초할 수 있다.
SLN 유전자 서명의 한 가지 장점은 전이-음성 SLN으로서 분류된(및/또는 양호한 예후를 갖는 것으로서 분류된) 환자에 대한 시술 횟수를 감소시킬 수 있다는 것이다. 특히, 중간 병변을 갖는 환자는 SLN이 실제로 전이 음성일 가능성이 높게 SLNB 시술을 받았을 수 있다. 상기 SLN 유전자 서명을 갖는 상기와 같은 환자의 정확한 분류는 SLNB 시술의 필요성을 피하며, 상기 분류를 사용하여 중간 병변에 대한 현행 치료 표준으로서 상기 SLNB를 대체할 수 있다. 불필요한 SLNB의 감소는 전체적인 건강관리 비용을 감소시키며 SLN의 제거에 의해 야기된 합병증을 앓는 환자수를 감소시킨다. 또한, SLN 전이 양성 또는 음성으로서 개체의 분류는 또한 예후 정보를 제공하며 상기 분류를 사용하여 치료 또는 진단 후처리 스케줄을 결정할 수 있다.
놀랍게도, 상기 SLN 유전자 서명은 SLN 생검 치료 표준보다 더 정확하게 예후를 예측할 수 있다(실시예 7을 참조하시오). 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, SLN 생검보다 개선된 상기 유전자 서명의 예측력에 관한 한 가지 가능한 설명은 상기와 같은 생검 수행의 기술적인 한계와 관련된다(예를 들어, 생검을 위한 정확한 림프절의 식별, 종양 세포 검출 한계, 처리/분류 샘플에서 인간 오류). 상기 대안 외에 또는 상기 대안에서, 상기 개시된 유전자 서명은 생검으로 검출가능하기 전의 병기에서 SLN 전이를 예측할 수 있다(예를 들어, 종양이 전이되었고 종양 세포가 SLN으로 가는 경로에 있다). 이에 관하여, 상기 SLN 서명을 사용하여 임상 시험 및/또는 추가적인 치료에의 포함을 위한 기준으로서 상기 SLNB를 대체할 수 있다.
상기 SLN 유전자 서명의 추가적인 장점은 얇은 두께의 흑색종 환자를 식별할 수 있다는 것인데, 상기 흑색종 환자는 현행 치료 표준에서는 임상적 매개변수에 기초한 SLNB가 적합하지 않을 수 있지만, 상기 유전자 서명에 기초하면 전이-양성 SLN의 위험이 높다. 특히, 상기 유전자 서명은, 현재 지침에 따르면 SLNB에 적합하지 않은 얇은(<0.8 ㎜) 흑색종 환자에서 전이-양성 SLN의 식별을 크게 증가시킬 것이다. 상기와 같은 환자의 조기 검출 및 치료는 상기 환자 부분 모집단에 대한 무진행 및 전체 생존을 증가시킬 것이다.
본원에 개시된 실시예는 하기의 유전자: ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 하나 이상을 포함하는 유전자 발현 서명(즉 SLN 유전자 서명)이 개체를 분류하고 예후를 예측하고 특히 전이 양성 또는 음성으로서 SLN을 분류하는데 유용함을 입증한다. 상응하게, 하나의 태양에서, 본 개시내용은 하기의 유전자: ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 이상을 포함하는 유전자 서명을 제공한다. 적합한 유전자 서명은 하기의 조합: ITGB3 및 PLAT; ITGB3 및 SPP1; ITGB3 및 GDF15; ITGB3 및 IL8; PLAT 및 SPP1; PLAT 및 GDF15; PLAT 및 IL8; SPP1 및 GDF15; SPP1 및 IL8; GDF15 및 IL8을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유전자 서명은 ITGB3, PLAT, 및 SPP1, GDF15 및 IL8 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 SLN 유전자 서명은 하기의 유전자: ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 3개 이상을 포함한다. 일부 실시양에서, 상기 SLN 유전자 서명은 하기의 유전자: ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 4개 이상을 포함한다. 일부 실시양에서, 상기 SLN 유전자 서명은 하기의 유전자: ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 모두를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유전자 발현 서명은 하기의 유전자 중 3개 이상을 포함하고: ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8을 포함한다. 바람직하게, 상기 유전자 발현 서명은 GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, SERPINE2, 및 TGFBR1을 포함하고, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2, 및 TGFBR1을 포함하고, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 유전자 서명은 하기의 유전자: ITGB3, PLAT, GDF15, SPP1 및 IL8 중 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개를 포함한다. 바람직하게, 상기 유전자 서명은 ITGB3, PLAT, GDF15, 및 IL8을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 유전자 서명은 하기: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2, 및 TGFBR1 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개 또는 전부를 포함한다. 본 발명자는 또한 ADIPOQ가 없는 유전자 서명이 유사하게 수행함을 입증한다. 따라서, 일부 실시태양에서 상기 유전자 서명은 하기: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2, 및 TGFBR1 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 전부를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유전자 서명은 하기를 포함한다:
- ITGB3, PLAT, GDF15, IL8, MLANA, 및 LOXL4 및 SERPINE2 중 하나 또는 둘 다;
- ITGB3, PLAT, GDF15, IL8, MLANA, 및 SERPINE2 및 TGFBR1 중 하나 또는 둘 다;
- ITGB3, PLAT, GDF15, IL8, 및 MLANA 및 TGFBR1 중 하나 또는 둘 다;
- ITGB3, PLAT, GDF15, IL8, 및 TGFBR1 및 SERPINE2 중 하나 또는 둘 다;
- ITGB3, PLAT, GDF15, IL8, SERPINE2, 및 LOXL4 및 TGFBR1 중 하나 또는 둘 다;
- ITGB3, PLAT, GDF15, IL8, LOXL4;
- ITGB3, PLAT, GDF15, IL8, SERPINE2;
- ITGB3, PLAT, GDF15, IL8, TGFBR1; 또는
- ITGB3, PLAT, GDF15, IL8, MLANA.
일부 실시태양에서, 상기 유전자 서명은 하기: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개 또는 전부를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유전자 서명은 하기: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 전부를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 유전자 서명은 상기 언급한 유전자들로 이루어진다. 숙련가에게 이해되는 바와 같이, 상기 SLN 유전자 서명이 상기 언급한 유전자로 이루어질 때, 분석을 수행하는 방법은 추가적인 유전자의 발현을 측정함(예를 들어 표준화를 위해서)을 포함할 수 있지만, 상기 유전자 서명은 오직 개체의 분류에 사용된다.
ITGB3 유전자는 인테그린 베타-3을 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스(Homo sapiens) mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_000212.2(17 June 2018)하에서 찾을 수 있다.
PLAT 유전자는 플라스미노겐 활성제, 조직 유형을 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_001319189.1(1 July 2018) 하에서 찾을 수 있다.
SPP1 유전자는 분비된 인단백질 1을 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_001040058.1(24 June 2018) 하에서 찾을 수 있다.
GDF15 유전자는 성장 분화인자 15를 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_004864.3(17 June 2018) 하에서 찾을 수 있다.
IL8 유전자는 인터류킨 8을 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 AF043337.1(1 February 2001) 하에서 찾을 수 있다.
MLANA 유전자는 멜란-A를 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_005511(20 Oct 2018)에서 찾을 수 있다.
LOXL4 유전자는 리실 옥시다제 유사 4를 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_032211(22 Nov 2018)에서 찾을 수 있다.
ADIPOQ 유전자는 아디포넥틴, C1Q 및 콜라겐 도메인 함유를 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_004797(2 Dec 2018) 하에서 찾을 수 있다.
PRKCB 유전자는 단백질 키나제 C 베타를 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_212535(12 Nov 2018) 하에서 찾을 수 있다.
SERPINE2 유전자는 세르핀 패밀리 E 구성원 2를 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_006216(17 Nov 2018) 하에서 찾을 수 있다.
ADAM12 유전자는 ADAM 메탈로펩티다제 도메인 12를 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_003474(5 Aug 2018) 하에서 찾을 수 있다.
LGALS1 유전자는 갈렉틴 1을 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_002305(22 Nov 2018)를 암호화한다.
TGFBR1 유전자는 형질전환 성장인자 베타 수용체 1을 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_004612(28 Oct 2018) 하에서 찾을 수 있다.
본 개시내용은 샘플에서 SLN 유전자 서명을 측정함을 포함하는 개체의 분류 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 개체는 전이-양성 SLN 또는 전이-음성 SLN을 갖는 것으로서 분류될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 개체는 양호한 또는 불량한 예후를 갖는 것으로서 분류될 수 있다. SLN 전이와 연관된 유전자 신호는 앞서 보고되었다(문헌[Meves et al. J Clinical Oncology 2015 33:2509-2516]). 상기 알고리즘은 4개의 유전자 ITGB3, LAMB1, PLAT 및 TP53의 원발성 흑색종 유전자 발현과 조합된 임상병리학적 변수 연령, 브레스로우 깊이 및 궤양을 사용하여 SLN 전이를 예측한다. 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 SLN 유전자 서명은 앞서 보고된 서명을 능가한다.
하나의 태양에서, 본 개시내용은 "N-SLN 유전자 서명"을 제공한다. 상기 N-SLN 유전자 서명은 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체를 분류하며, 특히 상기 유전자 서명은 전이-양성 비-감시림프절(N-SLN)을 갖는 개체의 위험성을 분류한다. 상기 위험성 평가는 치료 옵션을 결정하고 환자의 예후를 측정할 때 의사 및 환자에게 유용하다.
일부 실시태양에서, 상기 N-SLN 유전자 서명은 전이-양성 N-SLN의 위험성을 분류한다. 개체를 전이-양성 N-SLN 또는 전이-음성 N-SLN을 갖는 것으로서 분류할 수 있다. 멀리 떨어져 위치한 림프절에의 종양 세포의 침습은 불량한 예후의 지표이며 보다 공격적인 형태의 치료의 사용을 제시한다. 조기 검출 및 치료는 환자 성과를 개선시킬 것으로 예상된다.
본원에 개시된 실시예는 하기의 유전자: KRT14, SPP1, FN1, LOXL3 중 하나 이상을 포함하는 유전자 발현 서명(즉 N-SLN 유전자 서명)이 개체를 분류하고 특히 전이-양성 N-SLN의 위험성을 측정하는데 유용함을 입증한다. 상응하게, 하나의 태양에서, 본 개시내용은 하기의 유전자: KRT14, SPP1, FN1, LOXL3 중 적어도 하나를 포함하는 유전자 서명을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 유전자 서명은 하기의 유전자: KRT14, SPP1, FN1, LOXL3 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 N-SLN 유전자 서명은 KRT14, SPP1, FN1, LOXL3을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 일부 실시태양에서 상기 유전자 서명은 상기 언급한 유전자들로 이루어진다. 숙련가에게 이해되는 바와 같이, 상기 N-SLN 유전자 서명이 상기 언급한 유전자들로 이루어지는 경우, 분석을 수행하는 방법은 추가적인 유전자의 발현을 측정함(예를 들어 표준화를 위해)을 포함할 수 있지만, 상기 유전자 서명은 오직 개체의 분류에만 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 N-SLN 유전자 서명을 피부 흑색종의 반복/재발을 앓고 있고/있거나 이미 SLN 생검을 받은 개체에서 측정한다.
KRT14 유전자는 케라틴 14를 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_000526.4(17 June 2018) 하에서 찾을 수 있다.
FN1 유전자는 피브로넥틴 1을 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_001306129.1(3 June 2018) 하에서 찾을 수 있다.
LOXL3 유전자는 리실 옥시다제 유사 3을 암호화한다. 예시적인 호모 사피엔스 mRNA 서열을 NCBI 데이터베이스에서 NM_001289165.1(30 June 2018) 하에서 찾을 수 있다.
본 개시내용은 샘플에서 N-SLN 유전자 서명을 측정함을 포함하는 개체의 분류 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 개체는 전이-양성 N-SLN 또는 전이-음성 N-SLN을 갖는 것으로서 분류될 수 있다. 일부 실시태양에서, SLN 유전자 서명 및 N-SLN 유전자 서명을 모두 측정하는 방법을 제공한다.
본원에 개시된 유전자 서명의 분석을 포유동물 및 인간을 포함한 임의의 개체에서 수행할 수 있지만, 인간이 바람직하다. 일부 실시태양에서, 상기 개체는 T1-T3의 피부 흑색종으로 진단되었다. 일부 실시태양에서, 상기 개체는, 특히 상기 유전자 서명이 SLN 유전자 서명인 경우, 원발성 흑색종의 SLN의 생검을 아직 겪지 않았다. 상기 유전자 서명은 불량한 성과 및/또는 림프관 침습과 함께, 어린 나이, 높은 유사분열률(예를 들어 2/㎟ 초과), 질병 전력, 질병 가족력을 갖는 개체의 분류에 특히 유용하다.
상기 유전자 발현 서명은 종양 세포가 SLN 또는 N-SLN으로 전이될 위험성 또는 가능성을 예측하는데 유용하다. 숙련가에게 명백한 바와 같이, 개체의 분류는 확률 또는 "위험성"을 지칭하며 위험성이 있는 것으로 예측된 모든 환자의 100%가 실제로 검출가능한 전이(감도 또는 양성 일치 퍼센트로서 지칭된다)를 갖는 것도 아니고, 전이를 갖지 않는 것으로 예측된 모든 환자의 0%가 실제로 전이(특이성 또는 음성 일치 퍼센트)가 제거되지 않는 것도 아니다. 실시예에 개시되는 바와 같이, SLN 및 N-SLN 유전자 발현 서명은 감도와 특이성 모두에 대해서 높은 수행성능 수준을 나타낸다. 실시예에 개시되는 바와 같이, 상기 SLN 유전자 서명은 흑색종에 걸린 개체의 예후를 치료 표준 SLN 생검보다 더 양호하게 예측할 수 있다. 따라서 본 개시내용은 상기 유전자 발현 서명이 개인의 예후를 예측하기에 유용함을 입증한다.
숙련가에게 공지된 바와 같이, 전이성 질병의 부피에 의해 측정되는 바와 같은 전이의 부하는 개체간 상이할 수 있다. 일부 실시태양에서, 전이는 종양 세포 클러스터의 존재를 지칭하며 고립되거나 드문 종양 세포만을 함유하는 림프절은 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 전이는 낭-외 연장이 있거나 없는, 직경이 적어도 0.1 ㎜인 세포 클러스터의 존재를 지칭한다.
유전자 발현을 측정하기에 적합한 샘플을 수득하는 것은 당업자의 권한내에 있다. 적합한 샘플은 원발성 피부 흑색종 병변 생검을 포함한다. 상기와 같은 생검은 절제된 병변(예를 들어 종양의 광범위 절제 제거)을 포함한다. 샘플을 유전자 발현 프로파일링에 적합한 것으로 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 처리하거나 보존할 수 있다. 예를 들어, 상기 샘플은 포르말린 고정된 파라핀 포매된 원발성 피부 흑색종 병변 생검뿐만 아니라 동결된 샘플일 수 있다.
바람직하게, 상기 샘플은 RNA-함유 샘플이다. mRNA 추출에 대한 일반적인 방법은 당해 분야에 주지되어 있으며 하기 문헌을 포함한 분자 생검의 표준 교과서에 개시되어 있다: Ausubel et al. (1997) Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons. Methods for RNA extraction from paraffin embedded tissues are disclosed, for example, in Rupp & Locker (1987) Lab Invest. 56:A67, 및 De Andres et al., BioTechniques 18:42044 (1995). 특히, RNA 단리를 상업적인 제조사, 예를 들어 퀴아겐(Qiagen)으로부터의 정제 키트, 완충제 세트 및 프로테아제를 제조사(퀴아겐 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)의 설명에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 배양 중 세포의 전체 RNA를 퀴아겐 RNeasy 미니-컬럼을 사용하여 단리할 수 있다. 다수의 RNA 단리 키트를 상업적으로 입수할 수 있으며 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
본원에 개시된 방법은 유전자 발현 서명을 측정함을 포함한다. 특히, 상기 방법은 유전자 발현 수준을 측정함을 포함한다. 유전자 발현 수준을, 핵산 또는 단백질 발현 수준의 측정에 의해 측정할 수 있다. 바람직하게, mRNA 발현 수준을 측정한다. 일부 실시태양에서, 핵산 또는 단백질을 샘플로부터 정제하고 유전자 발현을 핵산 또는 단백질 발현 분석에 의해 측정한다. 단백질 발현 수준을 ELISA, 면역세포화학, 유식 세포측정, 웨스턴 블럿팅, 프로테오믹 및 질량 분광분석을 포함한 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다.
바람직하게, 핵산 발현 수준을 측정한다. 핵산 발현 수준을 RT-PCR, 정량적인 PCR, 노던 블럿팅, 유전자 서열분석, 특히 RNA 서열분석 및 유전자 발현 프로파일링 기법을 포함한 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다. 서열분석-기반 유전자 발현 분석에 전형적인 방법은 유전자 발현의 연속 분석(SAGE), 및 대량 병렬 서명 서열분석(MPSS)에 의한 유전자 발현 분석을 포함한다.
바람직하게, 핵산은 RNA, 예를 들어 mRNA 또는 pre-mRNA이다. 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 측정된 RNA 발현 수준을 직접 검출하거나 또는 예를 들어 먼저 cDNA를 생성시키고/시키거나 RNA/cDNA를 증폭시킴에 의해 간접적으로 측정할 수 있다. 일부 실시태양에서, 원발성 흑색종 샘플을 수득하고; RNA를 조직 샘플로부터 추출한 다음; 관심 유전자(예를 들어 생물마커 및 하우스키핑 유전자)의 RNA 전사물을 역전사시켜 RNA 전사물의 cDNA를 생성시키고; 상기 RNA 전사물의 발현 수준 측정을 위해 상기 cDNA를 증폭시켜 상기 cDNA로부터 앰플리콘을 생성시킨다.
일부 실시태양에서, 유전자 발현을 나노스트링(NanoString) 유전자 발현 분석에 의해 측정할 수 있다. 나노스트링은 유전자 발현의 검출을 위한 멀티플렉스 방법이며 전사 또는 증폭의 사용 없이 직접적인 mRNA의 측정 방법을 제공한다. 나노스트링 및 그의 태양은 문헌[Geiss et al., "Direct multiplexed measurement of gene expression with color- coded probe pairs" Nature Biotechnology 26, 317 - 325 (2008)]에 기재되어 있다.
상기 발현 수준은 절대값일 필요가 없고, 오히려 표준화된 발현값 또는 상대적인 값일 수 있다. 예를 들어, 상기 발현 수준을 하우스키핑 또는 참조 유전자 발현에 대해 표준화할 수 있다. 상기와 같은 유전자는 ABCF1, ACTB, ALAS1, CLTC, G6PD, GAPDH, GUSB, HPRT1, LDHA, PGK1, POLR1B, POLR2A, RPL19, RPLPO, SDHA, TBP, 및 TUBB를 포함한다.
표준화는 또한 발현을 미세배열 데이터에 기초하여 측정할 때 유용하다. 표준화는 미세배열내 및 샘플간 변화에 대한 보정을 허용하여, 상이한 칩으로부터의 데이터를 동시에 분석할 수 있다. 확고한 다중-배열 분석(RMA) 알고리즘을 사용하여 탐침 세트 데이터를 모든 샘플에 대한 유전자 발현 수준으로 전-처리할 수 있다(문헌[Irizarry R A, et al., Biostatistics (2003)] 및 문헌[Irizarry R A, et al., Nucleic Acids Res. (2003)]). 또한, 애피메트릭스(Affymetrix)의 디폴트 전처리 알고리즘(MAS 5.0)을 또한 사용할 수 있다. 추가적인 발현 데이터 표준화 방법은 US20060136145에 기재되어 있다.
일부 실시태양에서, 상기 발현 수준을 실시간 PCR(즉 정량적인 PCR 또는 qPCR)을 사용하여 측정한다. 실시간 PCR(qPCR)에서, 표적의 증폭을 고정된 수의 주기후에 축적된 표적의 양보다 오히려 먼저 검출하는 경우 주기 중 시점에 의해 반응을 특성화한다. 신호가 먼저 검출되는 상기 시점을 임계 주기(Ct)라 칭한다.
일부 실시태양에서, 상기 유전자 서명의 발현을, 하우스키핑 유전자의 평균 Ct로부터 상기 서명 유전자의 Ct를 감함으로써 상기 하우스키핑 유전자의 발현에 대한 표준화에 의해 서로에 대해 정량분석한다. 일부 실시태양에서, 이어서 상기 ΔCt 값을 알고리즘에서 환자의 연령 및 흑색종 병변의 브레스로우 깊이와 조합하여 SLN 전이의 예측을 계산한다. 일부 실시태양에서, 상기 표준화에 사용되는 하우스키핑 유전자는 ACTB, RPLP0 및 RPL8이다. 그러나, 다른 하우스키핑 유전자를 사용할 수도 있다. 상기 유전자 발현 신호의 비를 후속적으로 알고리즘에서 임상 변수와 조합하여 환자 SLNB의 성과 예측을 계산할 수 있다. 결과를 2원 분류(음성 또는 양성)로서 나타낸다. "음성" 결과는 상기 개체가 전이-양성 SLN의 위험이 낮거나 또는 다소 상기 개체가 양호한 예후를 가짐을 표시하는 반면, "양성" 결과는 상기 개체가 전이-양성 SLN의 위험이 높거나 또는 다소 불량한 예후를 가짐을 표시할 것이다.
본원에 기재된 방법은 유전자 발현 서명에 기초하여 개체를 분류한다. 일부 실시태양에서, 개체에서 상기 서명의 하나 이상의 유전자의 차별적인 발현은 상기 개체가 전이의 위험이 있음을 가리키거나, 또는 다소 상기 개체의 예후를 가리킨다. 본원에 사용되는 바와 같이, "차별적으로 발현된"은 피실험자에서 측정된 발현 수준이 참조와 현저하게 상이함을 의미한다. 상기 참조는 단일 값이거나 또는 수치 범위일 수 있다. 적합한 참조값의 측정은 숙련가의 권한내에 있다. 일부 실시태양에서, 상기 참조값은 소정의 값이다. 일부 실시태양에서, 상기 참조값은 특정한 환자 부류에서 발현값의 평균이다. 예를 들어, 상기 참조값은 임상적으로 확인된 SLN 전이를 갖는 환자(또는 N-SLN 서명의 경우, 임상적으로 확인된 N-SLN 전이를 갖는 환자)의 부류에서 발현값의 평균일 수 있다. 참조값은 또한 방정식의 형태이거나 또는 방정식으로부터 유도될 수 있다. 상기 환자에서 발현 수준이 참조와 "현저하게" 상이한지의 여부를 측정하는 것은 당업자의 권한내에 있다.
예시적인 실시태양에서, 상기 참조값을 실시예에 기재된 바와 같은 SLNB를 겪은 흑색종 환자의 코호트로부터 측정한다. 유사한 연구로부터의 데이터를 또한 사용할 수 있음은 숙련가에게 명백하다.
차별적으로-발현된 유전자의 발현 수준과 특정한 환자 반응간의 상관성의 강도를 유의수준의 통계학적 검정에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 카이 제곱 검정을 사용하여 카이 제곱값을 각각 차별적으로-발현된 마커에 할당할 수 있으며, 이는 상기 마커의 발현의, 특정한 환자 반응 부류에의 상관성 강도를 가리킨다. 유사하게, T-통계학 측정 및 윌킨스(Wilkins) 측정 모두 상기 마커의 발현과 그의 특정한 환자 반응 부류간의 상관성의 강도를 가리키는 값 또는 점수를 제공한다. 또한, SAM 또는 PAM 분석 도구를 사용하여 상기 상관성 강도를 측정할 수 있다.
일부 실시태양에서, 개체로부터의 유전자 발현 서명을 참조 발현 서명에 비교하여 상기 개체로부터의 유전자 발현 서명이 상기 참조 프로파일에 충분히 유사한지를 결정한다. 한편으로, 개체로부터의 유전자 발현 서명을 다수의 참조 발현 서명에 비교하여, 개체로부터의 유전자 발현 프로파일에 가장 유사한 참조 발현 프로파일을 선택한다. 유사성을 검출하기 위해 2개 이상의 데이터 세트를 비교하는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 개체로부터의 유전자 발현 서명을 참조 발현 프로파일에 비교할 수 있다.
머신러닝 및 통계학에서, 분류는 범주 구성원이 알려진 관찰(또는 사례)을 함유하는 데이터의 훈련 세트를 기반으로, 새로운 관찰이 속하는 범주 세트를 식별함을 지칭한다. 특히 구체적인 실행에서, 분류를 실행하는 알고리즘은 분류기로서 공지된다. 다수의 분류기가 당해 분야에 공지되어 있으며, 선형 또는 비-선형 분류기 경계로, 예를 들어 비제한적으로 ClaNC, 가장 가까운 평균 분류기, 가중 투표 방법, 간단한 베이즈 분류기, 선형 판별 분석(LDA), 2차 판별 분석(QDA), 지지 벡터 머신(SVM), 또는 k-최근접 이웃(k-nn) 분류기가 있다. 바람직한 실시태양에서, 로지스틱 회귀 분류기가 사용된다. 로지스틱 회귀 분류기를 실행하는 예시적인 실시태양이 실시예에 기재되어 있다.
숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 유전자 발현 서명의 훈련을 수행하여 감도 또는 특이성을 촉진한다. 감도는 있는 그대로 정확하게 식별되는 실제 양성의 비율을 지칭하며 위음성(예를 들어, 실제로는 양성인 전이 음성으로서 분류된 환자)을 피하기 위해 높은 감도가 요구된다. 특이성은 있는 그대로 정확하게 식별되는 실제 음성의 비율을 지칭하며 위양성(예를 들어, 실제로는 음성인 전이 양성으로서 분류된 환자)을 피하기 위해 높은 특이성이 요구된다. 바람직하게, 상기 분류기는 전이를 갖는 개체를 식별하기 위해서 높은 감도에 대해 훈련된다.
일부 실시태양에서, 개체를 분류하는 방법은 상기 개체의 연령 및/또는 종양의 브레스로우 깊이를 추가로 이용한다. 임의로 궤양 및/또는 유사분열률을 측정할 수 있다. 브레스로우 깊이는 표피의 과립층 상부에서부터(또는 표면에 궤양이 있는 경우, 궤양의 기부에서부터) 종양의 넓은 기부를 가로질러 가장 깊은 침습 세포(진피/피하)까지로 측정된다. 궤양은 죽은 조직의 붕괴를 지칭하며 급속한 종양 성장을 반영하는 것으로 생각되고, 흑색종의 중심에서 세포사에 이른다. 유사분열률은 절제된 종양을 검사하고 유사분열을 나타내는 세포의 수를 카운트하여 측정될 수 있다. 상기 유사분열수가 높을수록, 종양이 전이되었을 가능성이 크다. 특정한 실시태양에서, GDF15, MLANA, PLAT, IL8,ITGB3,LOXL4, SERPINE2 및 TGFBR1을 포함하는 유전자 서명 및 연령 및 브레스로우 깊이의 임상적 변수를 포함하는 복합 모델이 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 유전자 서명은 AIDPOQ를 추가로 포함한다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 유전자 발현 서명을 측정하기 위한 키트를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 키트는 본원에 개시된 유전자 서명에 대한 qPCR을 수행하기 위한 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시태양에서 상기 키트는 하기의 유전자: ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상; 및/또는 하기의 유전자: KRT14, SPP1, FN1, LOXL3 중 하나 이상에 대한 qPCR을 수행하기 위한 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시태양에서 상기 키트는 하우스키핑 유전자, 예를 들어 ACTB, RPLP0 및 RPL8에 대한 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 키트는 하기 중 하나 이상을 추가로 포함한다: DNA 폴리머라제, 데옥시뉴클레오사이드 트라이포스페이트, 완충제, 및 Mg2+. 일부 실시태양에서 상기 키트는 하기의 유전자 중 3개 이상을 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 포함하고: ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8, 보다 바람직하게 상기 키트는 ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8을 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 포함한다. 바람직하게, 상기 유전자 발현 신호는 GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, SERPINE2, 및 TGFBR1를 포함하고, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2, 및 TGFBR1을 포함하며, 보다 바람직하게 상기 유전자 발현 서명은 GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 키트는 하나 이상, 바람직하게는 각각의 프라이머 쌍에 대한 대조용 핵산을 포함한다. 바람직하게, 상기 대조용 핵산은 cDNA이고 보다 바람직하게 상기 cDNA는 각각의 유전자의 적어도 하나의 인트론/엑손 경계에 걸쳐있는 서열에 상응한다. 상기와 같은 cDNA는 게놈 오염으로부터 유전자 발현을 구별하는데 유용하다. 일부 실시태양에서, 상기 프라이머 쌍의 하나 이상의 프라이머를 화학적으로 변형시킨다. 상기와 같은 변형된 프라이머는 형광 또는 방사성 표지된 프라이머를 포함한다.
본원에 개시된 유전자 발현 분석 결과는 진단학적 후처리 스케줄의 결정에 유용하다. 예를 들어 전이-양성 SLN 또는 불량한 예후를 갖는 것으로서 분류된 개체는 SLNB를 겪을 수 있다. 일부 실시태양에서, 면역요법을 SLN 양성인 것으로 예측되거나 또는 다소 불량한 예후를 갖는 것으로 예측되는 개체에게 투여한다. 후속적인 SLNB 판독결과는 상기 면역요법에 대한 반응의 척도일 수 있다.
상기 유전자 발현 서명에 기초하여, 적합한 치료 섭생을 결정할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "치료", "치료하다" 및 "치료하는"이란 용어는 흑색종 또는 그의 하나 이상의 증상의 역전, 개선, 개시의 지연, 또는 진행의 억제를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 전이-양성 SLN 또는 다소 불량한 예후를 갖는 것으로서 분류된 개체를 SLNB로 치료할 수 있다. 상기 SLN의 위치를 흑색종의 위치에 기초하여, 및/또는 숙련가에게 공지되고 본원에 기재된 바와 같은 방법, 예를 들어 "SLN 맵핑"으로 측정할 수 있다.
전이-양성 N-SLN을 수술적 시술, 예를 들어 수술적 림프절 절제를 수행하여 치료할 수 있다. 전이성-N-SLN을 완전한 림프절 절제 및/또는 다른 흑색종 치료 요법으로 치료할 수 있다. 일부 실시태양에서 상기 개체에게 암 치료를 투여한다. 일부 실시태양에서, "보조 치료"를 개체에게 투여한다. 본원에 사용되는 바와 같은 보조 치료는 하나 이상의 피부 종양의 수술적 절제(이때 모든 검출 가능하고 절제가능한 질병(예를 들어 암)이 환자로부터 제거되었으나, 통계학적 재발 위험성은 남아있다)후에 환자에게 하나 이상의 약물을 투여함을 지칭한다. 보조 치료는 상기 질병의 재발 가능성 또는 중증도의 감소에 유용하다.
유전자 발현 서명에 기초하여 사용이 지시될 수 있는 공지된 흑색종 요법은 하기를 포함한다:
- 화학요법: 예를 들어 다카바진(DTIC), 테모졸로미드(테모달), 카보플라틴(파라플라틴, 파라플라틴 AQ), 패클리탁셀(탁솔), 시스플라틴(플라티놀 AQ), 및 빈블라스틴(벨베);
- 표적 요법 약물: 예를 들어 BRAF 억제제(베무라페닙(젤보라프) 및 다브라페닙(타핀라)) 및 MEK 억제제(코비메티닙(코텔릭) 및 트라메티닙(메키니스트));
- 방사선 요법;
- 면역요법: 예를 들어 사이토카인(예를 들어 인터페론 알파-2b 또는 인터류킨-2) 면역관문 억제제(예를 들어 이필리무맙(예르보이), 니볼루맙(옵디보), 펨브롤리주맙(키트루다)), 또는 종양세포붕괴성 면역요법.
적합한 약물 요법의 투여를 임의의 적합한 경로에 의해 투여할 수 있다. 적합한 경로는 경구, 직장, 코, 국소(구강 및 설하 포함), 질, 및 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 피내, 척수강내 및 경막외)를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "포함하다" 및 그의 활용형은 상기 단어 다음의 항목이 포함되지만, 구체적으로 언급되지 않은 항목이 제외되지 않음을 의미하는 비제한적인 의미로 사용된다. 또한 "이루어지다"란 동사는 본원에 정의된 바와 같은 화합물 또는 부속 화합물이 구체적으로 정의된 것 이외의 추가적인 성분(들)을 포함할 수 있음을 의미하는 "로 필수적으로 이루어지다"에 의해 대체될 수 있으며, 상기 추가적인 성분(들)은 본 발명 특유의 특징을 변경시키지 않는다.
단수형은 하나 또는 하나 초과(즉 적어도 하나)의 지시대상을 지칭하는데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
"대략적으로" 또는 "약"이란 단어는 수치와 함께 사용될 때(대략적으로 10, 약 10) 바람직하게는 상기 값이 주어진 값의 1% 더 많거나 더 적은 10의 값일 수 있음을 의미한다.
본 발명을 하기의 실시예에서 추가로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않으며, 단지 본 발명을 명확히 하기 위해서 제공된다.
실시예
실시예 1: SLN 전이 상태를 예측하기 위한 유전자 서명
우리는 3차 의료 기관에서 SLN 생검을 겪은 813명의 연이은 흑색종 환자의 코호트를 모았다. 관심 결과는 SLN 및 SLN 생검시 조직학적으로 식별된 전이였다. 원발성 흑색종 진단 생검 조직 중 29개의 전이-촉진 기질 반응 유전자의 발현은 폴리머라제 쇄 반응에 의하였다. 정규화와 함께 로지스틱 회귀를, 이중-루프-교차-검증(DLCV) 훈련-검증 설계에서 임상병리학적 변수 및 분자 데이터에 적용하였다.
임상 데이터세트
상기 임상 변수 중 단지 6개만이 SLNB 양성과 SLNB 음성간에 유의수준 차이를 나타낸다:
·연령,
·브레스로우 깊이
·궤양
·유사분열률
·클라크(Clark) 수준
·혈관-림프 침습
상기 6개의 변수 중에서, 우리는 오직 연령, 브레스로우 깊이, 궤양 및 유사분열률만을 고려하고자 하며, 클라크 수준 및 혈관-림프 침습은 항상 입수할 수 있는 것도 아니고 그의 질이 SLNB를 수행하는 의료 제공자에 따라 다를 수 있기 때문에 고려하지 않는다.
우리는 유전자 발현을, 문헌[Meves et al. 2015]에서와 같이 사본수에 의해서가 아니라 델타 Ct에 의해서 정량분석하였는데, 우리의 서명과 함께 사본수를 사용하는 경우 수행성능의 차이가 그다지 현저하지 않을 뿐만 아니라 실험 부담이 증가하기 때문이다. KRT14 배경 보정을 또한 문헌[Meves et al. 2015]과 비교하여 중단하였다. 소위 ITLP-표준화를 또한 중단하였는데, 상기 표준화는 측정된 발현의 즉석 오버-룰링(ad-hoc over-ruling)에 기초하고 다수의 임의의 매개변수를 주로 임계 형태로 요구하기 때문이다.
양성 감시림프절 생검 환자 중에서, 전이성 질병의 부피에 의해 측정된 바와 같은 전이의 부하는 현저하게 상이할 수 있다:
Figure pct00001
0.1 ㎜ 미만 직경의 세포 클러스터를 갖는 샘플을 전이 양성으로 간주해야 하고 임상적 관점에서 일반적으로 음성으로 간주해야 하는지는 여전히 논란의 여지가 있다. 따라서, 우리는 1 또는 2의 전이성 질병 부피를 갖는 813명의 환자 중 43명의 환자를 상기 분류기의 훈련 세트에서 제외하기로 결정하였으며, 상기 세트에 대한 분류기의 수행성능을 별도로 평가하였다. 하기 29개의 유전자를 측정하였다:
KRT14, MLANA, MITF, ITGB3, PLAT, LAMB1, TP53, AGRN, THBS2, PTK2, SPP1, COL4A1, CDKN1A, CDKN2A, PLOD3, GDF15, FN1, TNC, THBS1, CTGF, LOXL1, LOXL3, ITGA5, ITGA3, ITGA2, CSRC, CXCL1, IL8, LAMB.
수행성능 측정
분류기의 수행성능을 평가하기 위해서, 분할표를 구성하였다. 상기 분할표로부터 2개의 기준, 즉 PPA(양성 일치 퍼센트) 및 NPA(음성 일치 퍼센트)가 유도되었다: 이를 하기와 같이 정의한다:
Figure pct00002
및
Figure pct00003
여기에서 TP는 진양성의 수를, FN은 위음성의 수를, TN은 진음성의 수를, FP는 위양성의 수를 나타낸다. 상기 PPA 및 NPA 기준에 대한 식은 각각 감도 및 특이성과 같다. 그러나, 비-황금 표준 참조(FISH 데이터)를 기준으로 비교가 이루어지기 때문에, PPA 및 NPA 용어가 사용될 것이다.
분류기의 훈련을 최적화하기 위해서, 최대화해야 하는(또는 오류 기준의 경우 최소화해야 하는) 단일 수행성능 기준이 요구된다. 이를 위해서, 상기 PPA 및 NPA의 평균이 사용될 것이다:
Figure pct00004
여기에서 p는 수행성능을 가리킨다. p=50은 무작위 수행성능을 나타내고, p=100은 완벽한 분류를 나타낸다.
다른 수행성능은
·음성 예측값
·양성 예측값
·정확도
·균형잡힌 정확도
·음성 결과에 대한 로그 가능도 비
·양성 결과에 대한 로그 가능도 비
·ROC 곡선 아래 면적
을 측정한다.
분류기
모든 분류기는 상기 29개 유전자의 발현 수준, 임상-병리학적 변수 및 이 둘 모두에 대해 훈련된다.
분류기: 최대 벌점 가능도를 갖는 로지스틱 회귀
우리는 R 패키지 glmnet에서 실행된 바와 같은 로지스틱 회귀 분류기를 사용하였다. 상기 매개변수는 간결한 표현을 얻기 위해서 L1-norm 벌점 항(LASSO 정규화)을 사용하여 최대 가능도 추정에 의해 추정된다.
분류기의 이중 루프 교차 검증
웨슬스 등(Wessels et al.)[Wessels et al. Bioinformatics, Volume 21, Issue 19, 2005, Pages 3755-3762]은 이중 루프 교차 검증(DLCV)에 의해 대량 신속처리 데이터로부터 진단 분류기를 형성시키기 위한 일반적으로 적용 가능한 프레임워크를 기재하였다. DLCV 연습은 개발자로 하여금 훈련 데이터 세트와 별개로 데이터에 대한 차후 적용성에 대해서 상기 분류기의 수행성능(일반화된 오류에 대한)을 평가/예측할 수 있게 한다. 상기 방법론은 특징 선택자로서 순방향 필터링, 개체 유전자를 평가하기 위한 기준으로서 t-통계학, 및 상이한 분류기와 결합하여 채택되었다. 훈련 및 검증 과정은 외부(검증) 루프에서 3겹 교차 검증의 100회 반복, 및 내부 루프에서 10겹 교차 검증을 사용하여 수행되었다. 내부 루프에서, 상기 알고리즘은 LASSO 정규화를 위한 최적의 매개변수 람다를 학습한다. 모든 지점에서 데이터 분할은 클래스 사전 확률에 관하여 계층화되었다.
이중 루프 교차 검증 방법을 몇 개의 단계로 기재할 수 있다:
1. 각각의 반복에 대해서, 데이터를 3개의 부분으로 분할(계층화)한다(각각의 반복에 대해 상이한 분할).
2. 각각의 겹에 대해서, 두 부분이 내부 루프(훈련 세트)에 사용되고; 세 번째 부분은 검증을 위한 외부 루프(검증 세트)에 사용된다.
3. 훈련 세트 데이터에 대해서, 10겹 교차 검증을 수행하여 LASSO 벌점 항에 사용된 최적의 람다를 평가한다(학습 곡선의 구성).
4. 이어서, 분류기를 최고의 최적 람다를 사용하여 완전한 훈련 세트상에서 훈련한다.
5. 최종적으로, 상기 분류기의 수행성능을 검증 세트상에서 평가한다.
6. 모든 반복을 완료한 후에, 평균 최적 람다를 갖는 모든 샘플을 사용하여 최종 분류기를 생성시킨다. 획득된 n의 평균수를 사용하여 상기 분류기를 훈련한다. 이어서 상기 분류기를 외부 검증 세트상에 적용할 것이다. 전형적으로, 데이터세트는 사전 클래스에 관하여 불균형하다. 따라서, 균형잡힌 정확도가 상기 사전 클래스를 고려하기 때문에 정확도보다 더 양호한 분류 수행성능이다. 각 반복에서, 내부 루프에서, 우리는 수행성능 기준으로서 브리어(Brier) 점수를 사용하였다.
유전자 발현(GE)에 기반한 분류기
유전자 발현에 기반한 로지스틱 분류기 모델의 매개변수는 하기와 같았다:
Figure pct00005
표 1은 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대해 전체 770명 환자 코호트 분류기상에서 훈련된 최종 분류기의 수행성능을 묘사한다. 상기 계수가 양인 경우, 보다 높은 값은 증가된 위험을 나타낸다. 상기 계수가 음인 경우, 감소된 값은 감소된 위험을 나타낸다. 보다 큰(절대) 계수를 갖는 변수는 보다 큰 기여를 한다.
표 2는 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대해, 100회 반복에 걸쳐 평균된, DLCV에서 훈련된 분류기의 수행성능을 묘사한다.
임상 변수(CL)에 기반한 분류기
임상 변수에 기반한 로지스틱 분류기 모델의 매개변수는 하기와 같았다:
Figure pct00006
표 3에서 매개변수 "연령"은 세로 입력하고 "브레스로우 깊이"는 밀리미터로 입력한다. 궤양은 부울(Boolean) 변수(예/아니오)이다. 상기 표는 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대해 전체 770명 환자 코호트 분류기상에서 훈련된 최종 분류기의 수행성능을 묘사한다. 표 4는 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대해, 100회 반복에 걸쳐 평균된, DLCV에서 훈련된 분류기의 수행성능을 묘사한다.
유전자 발현 및 임상 변수(GECL)에 기반한 분류기
임상 변수 및 유전자 발현에 기반한 로지스틱 분류기 모델의 매개변수는 하기와 같았다:
Figure pct00007
표 5는 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대해 전체 770명 환자 코호트 분류기상에서 훈련된 최종 분류기의 수행성능을 묘사한다.
표 6은 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대해, 100회 반복에 걸쳐 평균된, DLCV에서 훈련된 분류기의 수행성능을 묘사한다.
도 1은 1) 유전자 발현, 2) 임상-병리학적 변수, 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수에 대해 DLCV에서 훈련된 로지스틱 회귀 분류기에 대한 ROC 곡선을 묘사한다.
표 7은 1) 유전자 발현("GE"; 즉, ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 유전자 서명, 2) 임상-병리학적 변수("CL"; 즉, 연령 및 브레스로우 깊이), 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수("GECL")에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 평균 수행성능을 묘사한다. 3개의 상이한 조작점이 고려되었다: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV.
실시예 2(비교 실시예)
ITLP 점수(ITGB3, LAMB1, PLAT 및 TP53)에 기반한 분류기
표 8은 전체 770명 환자 코호트에 대한 ITLP 점수의 수행성능을 묘사한다.
ITLP 점수 및 임상 변수에 기반한 분류기
임상 변수 및 유전자 발현에 기반한 로지스틱 분류기 모델의 매개변수는 하기와 같았다:
Figure pct00008
표 9는 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대해 전체 770명 환자 코호트 분류기상에서 훈련된 최종 분류기의 수행성능을 묘사한다.
표 10은 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대해, 100회 반복에 걸쳐 평균된, DLCV에서 훈련된 분류기의 수행성능을 묘사한다.
실시예 3: 비교 분석
ITLP 대 ITGB3, PLAT, GDF15, SPP1 및 IL8 유전자 서명
도 2는 ITLP 점수 및 ITGB3, PLAT, GDF15, SPP1 및 IL8 유전자 서명에 대한 ROC 곡선(도면에서 "로지스틱 회귀"라 칭한다)을 묘사한다. ITGB3, PLAT, GDF15, SPP1 및 IL8 유전자 서명은 ITLP 서명을 명백히 능가한다.
실시예 4: 유전자 서브세트의 수행성능
선행 실시예는 유전자 서명에 대해서 5개의 유전자: ITGB3, PLAT, GDF15, SPP1 및 IL8을 사용하였다. 우리는 2, 3 및 4개 유전자의 모든 가능한 서브세트의 수행성능을 조사하였다. 하기의 서명에 대한 전체 유전자 수로부터 선택될 수 있는 특정 차원의 서브세트의 수는 하기와 같다: 2개 유전자의 서명으로부터 10개 서브세트, 3개 유전자의 서명으로부터 10개 서브세트, 4개 유전자의 서명으로부터 5개 서브세트, 및 5개 전부를 포함하는 하나의 서명. 우리는 ROC 곡선 아래 면적에 관하여 수행성능을 평가하고 ITLP 서명과 비교하였다. 상기 AUC(또는 그의 범위)는 ITLP의 경우 0.68, 2개의 모든 서브세트에 대해서 0.72-0.75, 3개의 모든 서브세트에 대해서 0.74-0.77, 4개의 모든 서브세트에 대해서 0.76-0.77 및 5개 유전자 서명의 경우 0.77이었다. 이를 또한 도 3에 도시한다. 상응하게, 하기의 유전자: ITGB3, PLAT, GDF15, SPP1 및 IL8 중 적어도 2개를 포함하는 모든 유전자 서명은 상기 ITLP 서명을 능가한다.
실시예 5: 낮은 전이 질병 부피를 갖는 43개 샘플에 대한 수행성능
낮은 전이 질병 부피(부피 1&2)를 갖는 환자를, 첫 번째 경우에, 분류기 훈련에 사용되는 코호트에서 제외시켰다. 0.1 ㎜ 미만 직경의 세포 클러스터를 갖는 샘플을 전이 양성으로 간주해야 하고 임상적 관점에서 일반적으로 음성으로 간주해야 하는지는 여전히 논란의 여지가 있다. 본 연구에서 43명의 환자를 부피 1 또는 2를 갖기 때문에 초기에 분석에서 제외하였다. 상기와 같은 환자에 대한 ITGB3, PLAT, GDF15, SPP1 및 IL8의 적용은 29명을 양성으로, 14명을 음성으로 분류시켰다.
실시예 6: 오분류 분석
위음성
오분류된 양성 샘플은 주로 궤양이 없고 혈관-림프 침습이 없는 얇은 흑색종(2 ㎜ 미만)을 갖는 환자의 것이다. 즉, 상기 환자는 매우 낮은 사전의 전이 발생 위험을 나타내는 환자이다. 상기 알고리즘의 100회 반복 모두에서 오분류된 샘플은 소수이다.
위양성
오분류된 음성 샘플은 주로 궤양이 있고 혈관-림프 침습이 있는 두꺼운 흑색종(2 ㎜ 초과)을 갖는 환자의 것이다. 즉, 상기 환자는 높은 사전의 전이 발생 위험을 나타내는 환자이다. 상기 알고리즘의 100회 반복 모두에서 오분류된 샘플은 소수이다.
분류기 출력 분포
예측 확률 분포는 긴 우측 테일을 갖는 가우시안이 아닌 단일-모드이다. 조작점을 선택하는데 사용되는 임계값은 상기 분포의 평균에 가깝다. 추정 확률은 0.6을 초과하지 않는다.
실시예 7: SLN 유전자 신호의 예후 연관성
3가지 유형의 생존에 대한 카플란-마이어 생존 추정을, 유전자 ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8(실시예에서 "GECL"이라 지칭된다)(표 19-21(a)), SLNB 상태(표 19-21(a)), 및 이 둘의 조합(표 22-24(a))을 포함하는 SLN 분류기에 대해 생성시켰다. 문헌에 공지된 바와 같이, 양성 SLNB 상태는 열등한 생존과 연관된다. 현저하게, 상기 GECL 모델은 생존 추정치에서 훨씬 더 강한 분리를 제공하였으며, 이는 또한 더 큰 위험 비에서도 자명하다(표 25(a)). 또한, 다변량 분석에서, 상기 GECL 분류기는 또한 훨씬 더 큰 위험 비 및 보다 현저한 p-값을 갖는다(표 26(a)를 참조하시오)). 상기 GECL 음성 그룹의 매우 양호한 흑색종 특이성 생존이 특히 주목되며, 160개월째에 생존 추정치는 0.966이다(표 19(a)).
유사하게, 3가지 유형의 생존에 대한 카플란-마이어 생존 추정을, 유전자 GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1, 및 TGFBR1(실시예에서 "GECL"이라 지칭된다)(표 19-21), SLNB 상태(표 19-21), 및 이 둘의 조합(표 22-24)을 포함하는 SLN 분류기에 대해 생성시켰다. 표 19-26(b)은 훈련시 0.97로 설정된 NPV에 대한 결과를 기재하는 반면, 표 19-26(c)는 훈련시 0.98로 설정된 NPV에 대한 결과를 기재한다. 상기 분류기에 대한 추가의 논의에 대해서 실시예 8을 참조하시오.
상기 GECL 분류기 출력으로부터의 결과를 SLNB 상태와 조합하여 4개의 그룹, 진양성(TP), 위양성(FP), 위음성(FN) 및 진음성(TN)을 제공하였다. 앞서 나타낸 바와 같이, 매우 적은 FN 사례, 및 상당한 백분율의 FP 사례가 존재한다. 현저하게, 위양성 그룹(GECL에 의해 양성, 음성 SLNB 상태)은 진음성 그룹과 매우 유사한 생존 추정치를 갖는다. 이는 상기 GECL 분류기 출력이 흑색종 환자에 대한 예후를 제공하는 수단으로서 SLNB 상태보다 우수함을 가리킨다.
다수의 시간 간격에서의 생존 확률을 평가하기 위해서 카플란-마이어 방법을 사용한다. 로그-순위 시험은 2개 이상 그룹간의 생존 곡선을 비교하는데 사용되는 비모수 시험이다.
위험 비(HR)는 주어진 시간 간격으로 발생하는, (하나의 그룹에서 결과의 위험)/(또 다른 그룹에서 결과의 위험)의 비로서 정의되었다. 1의 위험 비는 연관성의 결여를 의미하고, 1 초과의 위험 비는 증가된 위험을 암시하며, 1 미만의 위험 비는 보다 적은 위험을 암시한다. 위험 비는 단지 2개 그룹간의 상대적인 차이를 나타내는데 사용된다.
실시예 8: SLN 분류기의 개선
4개의 유전자 패널을 총 109개의 독특한 유전자에 대해 전체 855개의 코호트상에서 측정하였다. 그러나, 상기 샘플 중 일부에서 유전자 발현을 측정할 수 없었는데, 그 이유는 상기 샘플을 분석 당시에 검색할 수 없었거나 상기 샘플에 충분한 RNA가 존재하지 않았기 때문이다. 따라서, 상기 발견을 770명 환자 대신에 754명 환자의 코호트상에서 분석하였다. 상기 발견 코호트는 낮은 부피의 전이성 질병을 갖는 환자는 포함하지 않는다. 각각의 분류기에 대해서, 우리는
·전체 코호트상에서 훈련된 최종 분류기의 수행성능
·교차 검증에서 평균 수행성능(외부 루프의 경우 3겹, 및 내부 루프의 경우 10겹의 이중 루프 교차 검증의 100회 반복)을 보고한다. 전체 코호트를 포함하기 위해서 상기 3겹의 수행성능을 연결한다.
각각의 분류기에 대해서 상기 수행성능을 4개의 상이한 조작점에서 계산한다:
·MaxbACC: 최대의 균형잡힌 정확도
·SEeqSP: 특이성과 균등한 감도
·NPV97: 훈련시 97%와 균등한 음성 예측값
·NPV98: 훈련시 98%와 균등한 음성 예측값
임상-병리학적 모델(CL)
임상-병리학적 변수에 기반한 로지스틱 분류기 모델의 매개변수는 하기와 같다:
Figure pct00009
표 27은 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) NPV98, 훈련시 0.98로 설정된 NPV에 대해 전체 754명 환자 코호트상에서 훈련된 최종 분류기의 수행성능을 묘사한다. 상기 계수가 양인 경우, 보다 높은 값은 증가된 위험을 나타낸다. 상기 계수가 음인 경우, 감소된 값은 감소된 위험을 나타낸다. 보다 큰(절대) 계수를 갖는 변수는 보다 큰 기여를 한다.
표 28은 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) NPV98, 훈련시 0.98로 설정된 NPV에 대한, 100회 반복에 걸쳐 평균된, DLCV에서 훈련된 분류기의 수행성능을 묘사한다.
유전자 발현 모델(GE)
Figure pct00010
표 29는 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) NPV98, 훈련시 0.98로 설정된 NPV에 대해 전체 754명 환자 코호트상에서 훈련된 최종 분류기의 수행성능을 묘사한다. 상기 계수가 양인 경우, 보다 높은 값은 증가된 위험을 나타낸다. 상기 계수가 음인 경우, 감소된 값은 감소된 위험을 나타낸다. 보다 큰(절대) 계수를 갖는 변수는 보다 큰 기여를 한다.
표 30은 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) NPV98, 훈련시 0.98로 설정된 NPV에 대한, 100회 반복에 걸쳐 평균된, DLCV에서 훈련된 분류기의 수행성능을 묘사한다.
임상-병리학적 및 유전자 발현의 복합 모델(GECL)
Figure pct00011
표 31은 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) NPV98, 훈련시 0.98로 설정된 NPV에 대해 전체 754명 환자 코호트상에서 훈련된 최종 분류기의 수행성능을 묘사한다. 상기 계수가 양인 경우, 보다 높은 값은 증가된 위험을 나타낸다. 상기 계수가 음인 경우, 감소된 값은 감소된 위험을 나타낸다. 보다 큰(절대) 계수를 갖는 변수는 보다 큰 기여를 한다.
표 32는 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) NPV98, 훈련시 0.98로 설정된 NPV에 대한, 100회 반복에 걸쳐 평균된, DLCV에서 훈련된 분류기의 수행성능을 묘사한다.
도 6은 1) 유전자 발현, 2) 임상-병리학적 변수, 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수에 대해 DLCV에서 훈련된 로지스틱 회귀 분류기에 대한 ROC 곡선을 묘사하고, 도 7은 1) 유전자 발현, 2) 임상-병리학적 변수, 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수에 대해 DLCV에서 훈련된 로지스틱 회귀 분류기에 대한 음성 예측값(NPV) 대 감시림프절 감소율(SLNB RR)을 묘사한다.
상이한 조작점(OP)에서의 비교: CL 대 CE 대 GECL
표 33은 1) 유전자 발현("GE"; 즉, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1 유전자 서명, 2) 임상-병리학적 변수("CL"; 즉, 연령, 브레스로우 깊이 및 혈관림프_침습의 존재), 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수("GECL": 즉, 연령, 브레스로우 깊이, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2 및 TGFBR1)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 평균 수행성능을 묘사한다. 최대의 균형잡힌 정확도(max bACC) 조작점에 대한 것이다.
표 34는 1) 유전자 발현("GE"; 즉, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1 유전자 서명, 2) 임상-병리학적 변수("CL"; 즉, 연령, 브레스로우 깊이 및 혈관림프_침습의 존재), 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수("GECL": 즉, 연령, 브레스로우 깊이, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2 및 TGFBR1)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 평균 수행성능을 묘사한다. 특이성과 균등한 감도(SEeqSP)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
표 35는 1) 유전자 발현("GE"; 즉, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1 유전자 서명, 2) 임상-병리학적 변수("CL"; 즉, 연령, 브레스로우 깊이 및 혈관림프_침습의 존재), 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수("GECL": 즉, 연령, 브레스로우 깊이, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2 및 TGFBR1)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.97로 설정된 NPV(NPV97)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
표 36은 1) 유전자 발현("GE"; 즉, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1 유전자 서명, 2) 임상-병리학적 변수("CL"; 즉, 연령, 브레스로우 깊이 및 혈관림프_침습의 존재), 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수("GECL": 즉, 연령, 브레스로우 깊이, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2 및 TGFBR1)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.98로 설정된 NPV(NPV98)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
T 병기결정에 의해 계층화된 수행성능
표 37은 임상-병리학적 변수("CL"; 즉, 연령, 브레스로우 깊이 및 혈관림프_침습의 존재)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 T 단계에 의해 계층화된 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.97로 설정된 NPV(NPV97)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
표 38은 유전자 발현("GE"; 즉, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 T 단계에 의해 계층화된 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.97로 설정된 NPV(NPV97)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
표 39는 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수("GECL": 즉, 연령, 브레스로우 깊이, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2 및 TGFBR1)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 T 단계에 의해 계층화된 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.97로 설정된 NPV(NPV97)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
표 40은 임상-병리학적 변수("CL"; 즉, 연령, 브레스로우 깊이 및 혈관림프_침습의 존재)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 T 단계에 의해 계층화된 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.98로 설정된 NPV(NPV98)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
표 41은 유전자 발현("GE"; 즉, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 T 단계에 의해 계층화된 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.98로 설정된 NPV(NPV98)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
표 42는 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수("GECL": 즉, 연령, 브레스로우 깊이, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2 및 TGFBR1)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 T 단계에 의해 계층화된 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.98로 설정된 NPV(NPV98)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
임상 병기결정에 의해 계층화된 수행성능
표 43은 임상-병리학적 변수("CL"; 즉, 연령, 브레스로우 깊이 및 혈관림프_침습의 존재)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 임상 단계에 의해 계층화된 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.97로 설정된 NPV(NPV97)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
표 44는 유전자 발현("GE"; 즉, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 임상 단계에 의해 계층화된 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.97로 설정된 NPV(NPV97)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
표 45는 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수("GECL": 즉, 연령, 브레스로우 깊이, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2 및 TGFBR1)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 임상 단계에 의해 계층화된 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.97로 설정된 NPV(NPV97)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
표 46은 임상-병리학적 변수("CL"; 즉, 연령, 브레스로우 깊이 및 혈관림프_침습의 존재)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 임상 단계에 의해 계층화된 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.98로 설정된 NPV(NPV98)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
표 47은 유전자 발현("GE"; 즉, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, PRKCB, SERPINE2, ADAM12, LGALS1 및 TGFBR1)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 임상 단계에 의해 계층화된 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.98로 설정된 NPV(NPV98)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
표 48은 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수("GECL": 즉, 연령, 브레스로우 깊이, GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2 및 TGFBR1)에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 임상 단계에 의해 계층화된 평균 수행성능을 묘사한다. 훈련시 0.98로 설정된 NPV(NPV98)를 갖는 조작점에 대한 것이다.
유전자 서브세트
도 8은 GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2 및 TGFBR1 중에서 선택되고 전체 코호트상에서 훈련된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 유전자의 서브세트에 대한 로지스틱 회귀 분류기의 ROC 곡선의 곡선아래면적(AUC)의 박스플롯을 묘사한다.
표 49는 각 서명 중의 전체 유전자수로부터 선택될 수 있는 특정 차원의 서브세트의 수, 및 ROC 곡선 아래 최소 및 최대 면적에 대한 수행성능을 묘사한다.
실시예 9: 비-감시림프절(N-SLN) 프로파일러
비-감시림프절(N-SLN)의 제거와 함께, 완전한 림프절 절제(CLND)는 양성 감시림프절(SLN)을 갖는 임상적으로 결절-음성의 흑색종 환자에 대한 표준이었다. SLN 생검에 이은 즉시 CLND는 국소 질병 억제를 개선시키며, 무작위화된 임상 시험은 보다 낮은 부피의 SLN-양성 질병의 조기 수술이 결절 재발시의 수술보다 더 적은 장기간 후유증(예를 들어 림프 부종)을 생성시킴을 입증하였다. 더욱이, SLN 및 N-SLN 전이는 보조 요법을 위한 환자를 선택하는데 사용되는 불리한 예후 인자이다. 그러나, MSLT-II에 등록한 환자의 경우 CLND에 의한 생존 이득은 부여되지 않았으며, SLN 수술 단독보다 오히려 더 높은 합병증을 갖는다. CLND가 이득이 될 가능성이 있는 환자, 즉 N-SLN에서 국소 전이의 위험이 있는 환자를 식별하여 CLND에 대한 환자 선택을 개선시키는 신규의 방법이 필요하다. 여기에서 우리는 유전자 발현(KRT14, SPP1, FN1 및 LOXL3), 임상병리학적 변수(연령, 양성 SLN의 수, SLN의 가장 큰 치수, 최대 브레스로우 깊이 및 최대 유사분열률) 및 이 둘 모두에 기초하여, N-SLN의 상태, 즉 전이의 존재 또는 부재를 예측하는 3개의 분류기를 설계한다. 이들 분류기를 사용하여 환자가 CLND 시술을 겪어야 하는지를 선택할 수 있다.
사용되는 방법은 주로 실시예 1에 나타낸 바와 동일하였다. 동일한 29개 유전자를 평가하였다. 유전자 발현에 기반한 로지스틱 회귀 분류기 모델의 매개변수는 하기와 같다:
Figure pct00012
상기 모델의 수행성능
전체 코호트에서 환자의 수는 140명이었다.
표 11은 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대한, 100회 반복에 걸쳐 평균된, DLCV에서 훈련된 분류기의 수행성능을 묘사한다.
표 12는 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대한, 100회 반복에 걸쳐 평균된, DLCV에서 훈련된 분류기의 수행성능을 묘사한다.
임상 변수(CL)에 기반한 분류기
임상 변수에 기반한 로지스틱 회귀 분류기 모델의 매개변수는 하기와 같다:
Figure pct00013
표 13은 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대한, 전체 140명 환자 코호트 분류기상에서 훈련된 최종 분류기의 수행성능을 묘사한다.
표 14는 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대한, 100회 반복에 걸쳐 평균된, DLCV에서 훈련된 분류기의 수행성능을 묘사한다.
유전자 발현 및 임상 변수(GECL) 로지스틱 회귀 매개변수에 기반한 분류기
Figure pct00014
유전자 발현에 기반한 로지스틱 분류기 모델의 매개변수
표 15는 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대한, 전체 140명 환자 코호트 분류기상에서 훈련된 최종 분류기의 수행성능을 묘사한다.
표 16은 4개의 상이한 조작점: 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV, 4) LRNn025, 훈련시 0.25로 설정된 음성 시험 결과에 대한 로그 가능도 비에 대한, 100회 반복에 걸쳐 평균된, DLCV에서 훈련된 분류기의 수행성능을 묘사한다.
도 4는 1) 유전자 발현, 2) 임상-병리학적 변수, 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수에 대한, DLCV에서 훈련된 로지스틱 회귀 분류기에 대한 평균 ROC 곡선을 묘사한다. x-축은 위양성 발견율(즉 1-특이성)을 나타내고, y-축은 실제 발견율(즉 감도)을 나타낸다.
도 5: 상이한 유전자 서브세트 및 4개 유전자의 전체 세트에 대한 ROC 곡선 아래 면적의 박스플롯.
표 17은 1) 유전자 발현, 2) 임상-병리학적 변수, 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 평균 수행성능을 묘사한다. 3개의 상이한 조작점은 1) max bACC: 최대의 균형잡힌 정확도, 2) SEeqSP, 특이성과 균등한 감도, 3) NPV97, 훈련시 0.97로 설정된 NPV가 고려되었다.
N-SLN 프로파일러 서명은 4개 유전자: KRT14, SPP1, FN1 및 LOXL3를 포함한다. 우리는 또한 2, 3 및 4개 유전자의 모든 가능한 서브세트에서 또한 조사하였다.
각각의 서명에서 전체 유전자수로부터 선택될 수 있는 특정 차원의 서브세트의 수.
Figure pct00015
우리는 ROC 곡선아래면적에 대해 수행성능을 평가하였다(표 및 도면을 참조하시오).
4개 유전자의 전체 세트, 상이한 유전자 서브세트에 대한 곡선아래면적(AUC).
Figure pct00016
도 5는 상이한 유전자 서브세트 및 4개 유전자의 전체 세트에 대한 ROC 곡선 아래 면적의 박스플롯을 묘사한다.
우리는 N-SLN 프로파일러의 발견, 설계 및 전개를 기재한다. 우리는 상기 N-SLN 프로파일러를 사용하여 어느 환자가 CLND 시술을 겪어야 하는지를 선택할 수 있음을 입증하였다.
유전자 발현에 기반한 분류기의 수행성능이 중요한데, 그 이유는 (i) 상기 CLND 시술로 이득이 될 수 있는 환자를 선택할 수 있는 방법이 없고, (ii) 분류기에 의해 사용되는 임상병리학적 변수를 임상에서 항상 입수할 수 있는 것은 아니기 때문이다.
실시예 10
브레스로우 깊이에 기반한 사전-선택(BD<=2 대 BD>2)
브레스로우 깊이(BD)는 원발성 피부 흑색종의 특성화에 중요한 임상병리학적 변수이며, 얇은 흑색종(BD<=2 ㎜)은 두꺼운 흑색종(BD>2 ㎜)에 비해 분자 및 생리학적으로 상이한 특징을 가질 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 얇고 두꺼운 흑색종에 대해 2개의 상이한 조작점을 선택하는 것이 합리적일 수 있다. 브레스로우 깊이 <=2 ㎜를 갖는 얇은 흑색종(561개 샘플의 코호트)에 대해서, 우리는 선행 선택(7.8)에 기재된 바와 같은 분류기를 계속사용하며, 이때 조작점은 훈련시 NPV가 0.97이도록 선택한다:
표 18a는 1) 유전자 발현, 2) 임상-병리학적 변수, 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 평균 수행성능을 묘사한다. 선택된 조작점은 NPV97, 즉 훈련시 0.97로 설정된 NPV이다.
BD>2 ㎜를 갖는 두꺼운 흑색종(209개 샘플의 코호트)의 경우, 우리는 동일한 분류기를 사용하지만, 상이한 조작점, 즉 균형잡힌 정확도가 최대화되도록 선택된 점을 사용한다:
표 18b는 1) 유전자 발현, 2) 임상-병리학적 변수, 3) 조합된 유전자 발현 및 임상-병리학적 변수에 대한, DLCV에서 훈련된 분류기의 평균 수행성능을 묘사한다. 선택된 조작점은 상기 조작점이 균형잡힌 정확도를 최대화하도록 선택되었다.
브레스로우 깊이>2에 대한 수행성능은 브레스로우 깊이<=2 ㎜에 대한 수행성능보다 열등하지만 여전히 허용가능한데, 그 이유는 상기 분류기가 35%의 SLNB 양성의 사전 확률을 갖는 하위집단에서 90%의 NPV를 성취하기 때문이다: 시험을 받고 음성 결과가 나오면, 양성 SLN을 가질 확률은 35%에서 10%로 떨어진다.
피실험자가 림프절 양성인지 또는 결절 음성인지를 결정하는 방법
분류기에 의해 샘플이 림프절 양성으로서 또는 림프절 음성으로서 표지될 것인지의 여부를 예측하기 위한 분류 방법의 예로서(간략성을 위해 2개 유전자를 사용하여) 가상 데이터(표를 참조하시오)를 사용한다(방법/모델은 SLN 프로파일러 및 N-SLN 프로파일러 모두에 대해서 동일하며, 단지 유전자 및 임상 변수의 매개변수 및 정체만이 상이하다). 표는 2개 유전자(x,y) 토이 모델, 가상 유전자 발현 데이터 ΔCt, 추정된 로그 오즈비
Figure pct00017
, 추정된 확률 p, 및 컷오프 θ=0.19에 기초하여 추정된 출력 클래스 표지에 대한 모델 매개변수 β0, β1, β2를 기재한다. 상기 로그 오즈비 및 확률은 방정식 1에 기반하여 계산되며, 상기 확률은 방정식 2를 사용하여 계산된다. 상기 출력 표지는 상기 추정된 확률을 컷오프 θ와 비교하여 할당된다: 추정된 확률이 θ 이상인 경우, 샘플은 결절 양성으로서 분류되고; 추정된 확률이 θ 미만인 경우, 샘플은 결절 음성으로서 분류된다.
모델 매개변수 β0, β1, β2, 유전자 x,y에 대한 유전자 발현 데이터 ΔCt, 추정된 로그 오즈비
Figure pct00018
, 추정된 확률 p, 및 컷오프 θ=0.19에 기초하여 추정된 출력 클래스.
Figure pct00019
[식 1]
Figure pct00020
[식 2]
Figure pct00021
실시예 11
실시예 8에서 수행된 분석과 동일하게, 하기의 유전자 세트를 포함하는 8개의 유전자 및 2개의 임상병리학적 변수(연령 및 브레스로우 깊이)를 사용하는 본 발명의 바람직한 실시태양을 발견하였다: GDF15, MLANA, PLAT, IL8, ITGB3, LOXL4, SERPINE2, 및 TGFBR1. 로지스틱 회귀 모델의 매개변수는 하기에 제공된 바와 같다:
Figure pct00022
상이한 작동점을 평가하였으며, 다수의 작동점이 높은 NPV, 및 SLNB 시술 횟수의 실질적인 감소(SLNB.RR = SLNB 감소율)와 함께 임상적으로 관련된 분류기를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 0.116의 NPV975 작동점이 특히 바람직하며, 하기 표를 참조하시오.
8개 유전자 및 2개의 임상병리학적 변수를 갖는 GECL 모델의 수행성능에 대한 표
Figure pct00023
상기 8개 유전자 및 2개의 임상병리학적 변수를 갖는 GECL 모델의 수행성능과 실시예 1 및 8의 수행성능과의 비교는 상기 수행성능(NPV 및 SLNB.RR)이 단지 발현(GE) 또는 임상병리학적(CL)뿐인 모델을 능가하며, 실시예 1의 GECL 모델과 매우 유사하게 수행됨을 가리킨다.
카플란-마이어 분석을 수행하여, RFS, DRFS 및 MSS에 비해 SLNB와 교차하는 GECL 모델을 평가하였다. 5-년/60개월 생존률을 하기 표에 보고한다. 상기 GECL 및 SLNB는 모두 개별적으로 Pos/Neg인 그룹간에 큰 분리를 갖는다. 보다 중요하게, GECL에 의해 Pos로서 식별된 SLNB Neg 환자(및 그렇게 놓친 환자)는 생존율이 매우 낮다. 이는 예후 마커로서 상기 GECL 모델의 임상적 관련성을 입증한다.
Figure pct00024
[표 1]
Figure pct00025
[표 2]
Figure pct00026
[표 3]
Figure pct00027
[표 4]
Figure pct00028
[표 5]
Figure pct00029
[표 6]
Figure pct00030
[표 7]
Figure pct00031
[표 8]
Figure pct00032
[표 9]
Figure pct00033
[표 10]
Figure pct00034
[표 11]
Figure pct00035
[표 12]
Figure pct00036
[표 13]
Figure pct00037
[표 14]
Figure pct00038
[표 15]
Figure pct00039
[표 16]
Figure pct00040
[표 17]
Figure pct00041
[표 18a]
Figure pct00042
[표 18b]
Figure pct00043
[표 19a]
Figure pct00044
[표 19b]
Figure pct00045
[표 19c]
Figure pct00046
[표 20a]
Figure pct00047
[표 20b]
Figure pct00048
[표 20c]
Figure pct00049
[표 21a]
Figure pct00050
[표 21b]
Figure pct00051
[표 21c]
Figure pct00052
[표 22a]
Figure pct00053
[표 22b]
Figure pct00054
[표 22c]
Figure pct00055
[표 23a]
Figure pct00056
[표 23b]
Figure pct00057
[표 23c]
Figure pct00058
[표 24a]
Figure pct00059
[표 24b]
Figure pct00060
[표 24c]
Figure pct00061
[표 25a]
GECL 분류기 출력 및 SLNB 생검 결과로부터의 2개 곡선에 대한 위험 비 및 p-값
Figure pct00062
[표 25b]
Figure pct00063
[표 25c]
Figure pct00064
[표 26a]
GECL 분류기 출력 및 SLNB 생검으로부터의 2개 곡선에 대한 다변량 위험 비 및 p-값
Figure pct00065
[표 26b]
Figure pct00066
[표 26c]
Figure pct00067
[표 27]
Figure pct00068
[표 28]
Figure pct00069
[표 29]
Figure pct00070
[표 30]
Figure pct00071
[표 31]
Figure pct00072
[표 32]
Figure pct00073
[표 33]
Figure pct00074
[표 34]
Figure pct00075
[표 35]
Figure pct00076
[표 36] NPV 98
Figure pct00077
[표 37] CL
Figure pct00078
[표 38] GE
Figure pct00079
[표 39] GECL
Figure pct00080
[표 40] CL
Figure pct00081
[표 41] GE
Figure pct00082
Figure pct00083
[표 42]
Figure pct00084
[표 43]
Figure pct00085
[표 44] GE
Figure pct00086
[표 45]
Figure pct00087
[표 46]
Figure pct00088
[표 47]
Figure pct00089
[표 48]
Figure pct00090
[표 49]
Figure pct00091

Claims (48)

  1. 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 샘플에서 유전자 발현 서명을 측정함을 포함하는 상기 개체의 분류 방법으로서, 상기 유전자 발현 서명이 유전자 ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 3개 이상을 포함하는 방법.
  2. 피부 흑색종에 걸린 개체의 샘플에서 유전자 ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 3개 이상의 발현 수준을 측정하고, 상기 발현 수준에 기초하여 치료 및/또는 진단 후처리 스케줄을 결정함을 포함하는, 상기 개체에 대한 치료 및/또는 진단 후처리 스케줄의 결정 방법.
  3. 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 샘플에서 유전자 발현 서명을 측정함을 포함하는 상기 개체의 예후를 예측하는 방법으로서, 상기 유전자 발현 서명이 유전자 ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 3개 이상을 포함하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체를 전이-양성 SLN을 갖는 것으로서 분류하거나 또는 전이-음성 SLN을 갖는 것으로서 분류하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체를 분류 및/또는 발현 수준에 기초하여 SLNB에 대해서 선택하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    전이-양성 SLN을 갖는 것으로서 분류된 개체를 SLNB를 수행함으로써 치료하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체의 예후를 유전자 발현 수준에 기초하여 측정하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    개체를 불량한 예후 또는 양호한 예후를 갖는 것으로서 분류하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 유전자 ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8 중 3개 이상을 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8을 포함하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 MLANA, LOXL4, SERPINE2, 및 TGFBR1을 또한 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 ADIPOQ를 또한 포함하는 방법.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 PRKCB, ADAM12, LGALS1을 또한 포함하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 샘플에서 유전자 발현 서명을 측정함을 포함하는 상기 개체의 분류를 또한 포함하며, 상기 유전자 발현 서명이 유전자 KRT14, SPP1, FN1, LOXL3 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  15. 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 샘플에서 유전자 발현 서명을 측정함을 포함하는 상기 개체의 분류 방법으로서, 상기 유전자 발현 서명이 유전자 KRT14, SPP1, FN1 및 LOXL3 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    개체를 전이-양성 N-SLN을 갖거나 또는 전이-음성 N-SLN을 갖는 것으로서 분류하는 방법.
  17. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    전이-양성 N-SLN을 갖는 것으로서 분류된 개체를, 수술적 림프절 절제와 같은 수술적 시술을 수행함으로써 치료하는 방법.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    전이-양성 N-SLN을 갖는 것으로서 분류된 개체를, 상기 개체에게 암 치료를 제공함으로써 치료하는 방법.
  19. 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 치료 방법으로서,
    - 상기 개체의 샘플에서 유전자 발현 서명을 측정하고, 상기 유전자 발현 서명이 유전자 ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 3개 이상을 포함하며,
    - 상기 개체를 상기 유전자 발현 서명에 기초하여 전이-양성 SLN 및/또는 불량한 예후를 갖는 것으로서 분류하고,
    - SLNB를 수행하고/하거나 상기 개체에게 암 치료를 제공함으로써 상기 개체를 치료함
    을 포함하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 유전자 ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8 중 3개 이상을 포함하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8을 포함하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 MLANA, LOXL4, SERPINE2, 및 TGFBR1을 또한 포함하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    유전자 발현이 ADIPOQ를 또한 포함하는 방법.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 PRKCB, ADAM12, LGALS1을 또한 포함하는 방법.
  25. 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 치료 방법으로서,
    - 상기 개체의 샘플에서 유전자 발현 서명을 측정하고, 상기 유전자 발현 서명이 유전자 KRT14, SPP1, FN1 및 LOXL3 중 하나 이상을 포함하며,
    - 상기 개체를 상기 유전자 발현 서명에 기초하여 전이-양성 N-SLN을 가질 위험이 높은 것으로서 분류하고,
    - 완전한 림프절 절제를 수행하고/하거나 상기 개체에게 암 치료를 제공함으로써 상기 개체를 치료함
    을 포함하는 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분류 방법이 개체의 연령 및/또는 브레스로우 깊이(Breslow depth)를 측정하고, 임의적으로 흑색종 병변의 궤양을 또한 측정함을 또한 포함하는 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플이 원발성 피부 흑색종 병변의 생검인 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    발현을 RNA, 바람직하게는 mRNA의 검출에 의해 측정하는 방법.
  29. 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체에서 유전자 서명을 분석하는 방법으로서,
    - 상기 개체의 원발성 피부 흑색종 병변으로부터 RNA를 추출하고;
    - 유전자 ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 3개 이상의 RNA 전사물을 역전사하여 상기 RNA 전사물의 cDNA를 생성시키고;
    - 상기 RNA 전사물의 발현 수준의 측정을 위해서 상기 cDNA를 증폭시켜 상기 cDNA로부터 앰플리콘을 생성시킴
    을 포함하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 유전자 ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8 중 3개 이상을 포함하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8을 포함하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 MLANA, LOXL4, SERPINE2, 및 TGFBR1을 또한 포함하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 ADIPOQ를 또한 포함하는 방법.
  34. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서,
    유전자 발현 서명이 PRKCB, ADAM12, LGALS1을 또한 포함하는 방법.
  35. 제 29 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 KRT14, SPP1, FN1 및 LOXL3 중 하나 이상의 RNA 전사물을 역전사하여 상기 RNA 전사물의 cDNA를 생성시킴을 또한 포함하는 방법.
  36. 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체에서 유전자 서명을 분석하는 방법으로서,
    - 상기 개체의 원발성 피부 흑색종 병변으로부터 RNA를 추출하고;
    - 유전자 KRT14, SPP1, FN1 및 LOXL3 중 하나 이상의 RNA 전사물을 역전사하여 상기 RNA 전사물의 cDNA를 생성시키고;
    - 상기 RNA 전사물의 발현 수준의 측정을 위해서 상기 cDNA를 증폭시켜 상기 cDNA로부터 앰플리콘을 생성시킴
    을 포함하는 방법.
  37. 제 29 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    정량적인 PCR을 사용하여 수행하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서,
    앰플리콘 발현 수준이 샘플 중 하나 이상의 참조 RNA 전사물의 cDNA로부터의 앰플리콘의 수준에 대해 표준화되었으며, 바람직하게 상기 참조 RNA 전사물이 ACTB, RPLP0 및/또는 RPL8 중에서 선택되는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서,
    앰플리콘 발현 수준이 임계 주기(Ct) 값인 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체가 T1a 또는 T1b 얇은 흑색종을 가지며, 바람직하게는 상기 개체가 T1a 얇은 흑색종을 갖는 방법.
  41. 원발성 피부 흑색종에 걸린 개체의 분류에 사용하기 위한 키트로서,
    a) 유전자 ITGB3, PLAT, SPP1, GDF15 및 IL8 중 3개 이상; 및/또는
    b) 유전자 KRT14, SPP1, FN1, 및 LOXL3 중 하나 이상, 및
    임의적으로, c) 하나 이상의 참조 유전자
    를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 포함하는 키트.
  42. 제 41 항에 있어서,
    참조 유전자가 ACTB, RPLP0 및/또는 RPL8인 키트.
  43. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서,
    DNA 폴리머라제, 데옥시뉴클레오사이드 트라이포스페이트, 완충제, 및 Mg2+ 중 하나 이상을 또한 포함하는 키트.
  44. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8을 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 포함하는 키트.
  45. 제 44 항에 있어서,
    ITGB3, PLAT, GDF15 및 IL8을 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 포함하는 키트.
  46. 제 45 항에 있어서,
    MLANA, LOXL4, ADIPOQ, SERPINE2, 및 TGFBR1을 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 포함하는 키트.
  47. 제 46 항에 있어서,
    ADIPOQ를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 또한 포함하는 키트.
  48. 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서,
    PRKCB, ADAM12, LGALS1을 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 또한 포함하는 키트.
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