KR20210043028A - 신규 유산균 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 유산균에 관한 것으로, 구체적으로 인지기능 장애, 정신장애 또는 염증 질환 예방 및 치료에 유용한 신규 유산균인 락토바실러스 가세리 NK109(Lactobacillus gasseri NK109), 이의 포함하는 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

신규 유산균 및 이의 용도{NOVEL LACTIC ACID BACTERIA AND USE THEREOF}
본 발명은 신규한 유산균에 관한 것으로, 구체적으로 인지기능 장애, 정신장애 또는 염증 질환 예방 및 치료에 유용한 신규 유산균인 락토바실러스 가세리 NK109(Lactobacillus gasseri NK109), 이의 포함하는 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
인류가 풍요로운 사회로 점점 발전해 감에 따라 생활습관이 급속하게 서구화되면서, 육식 및 지방 위주의 서구화된 식생활, 불규칙한 식사, 과음, 운동 부족, 과도한 스트레스, 유해 환경에의 노출 등으로 인한 대장염 등의 장질환, 장내세균군집의 교란 등의 질병이 증가하고 있다. 이러한 장질환, 장내세균군집의 불균형의 증가는 알츠하이머, 파킨슨, 우울, 불안 등의 정신장애, 인지기능 장애 등을 급격하게 증가시킨다.
정신 장애를 겪는 환자들은 심할 경우 자살 사고로 이어질 수 있고, 특히 우울증 환자의 과반수 이상의 자살을 고려하는 것으로 보고된 바 있으며, 실제로 10 내지 15%의 환자들이 자살을 시행하는 것으로 알려져 있다.
정신 장애는 명확하고 객관적인 판단기준이 없어 각각의 환자마다 증상이 달리 나타날 수 있고, 정신 장애가 의심될 경우 정확한 진단 및 검사에 따른 치료가 요구되나, 정신 장애로 인한 병원치료에 대한 부정적인 사회 인식으로 제대로 된 치료가 이루어지지 않는 실정이다. 또한, 정신 장애를 치료하기 위해 사용되는 항우울제 등의 약물들은 치료 효과가 크지 않고, 심혈관계 질환 및 자살 등의 심각한 부작용이 나타날 수 있어 사용이 제한적이다.
한편, 천연물을 이용한 연구의 결과로서, 국내공개특허 제 10-2017-0061457호에서는 말굽버섯 추출물 및 자초 추출물을 이용한 정신 장애 치료용 조성물이 개시되어 있으나, 아직까지 정신 장애를 치료할 수 있는 효과적인 유산균에 대해서는 지속적인 연구가 필요한 실정이다.
한국공개특허 제10-2017-0061457호 한국공개특허 제 10-2011-0057550호 미국공개특허 제 2017-0056457호
본 발명의 목적은 락토바실러스 가세리 NK109 (Lactobacillus gasseri NK109) KCCM12565P 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 락토바실러스 가세리 NK109 (Lactobacillus gasseri NK109) KCCM12565P 균주에 관한 것이다.
본 발명의 락토바실러스 가세리 NK109는 인간 또는 마우스의 분변으로부터 분리 및 동정된 락토바실러스 가세리의 신규한 유산균임을 특징으로 한다.
본 발명의 락토바실러스 가세리 NK109의 동정 및 분류를 위한 16S rDNA 염기서열은 본 명세서에 첨부된 서열번호 1과 같다. 따라서, 본 발명의 락토바실러스 가세리 NK109는 서열번호 1의 16S rDNA를 포함할 수 있다.
상기 서열번호 1의 16S rDNA 염기서열의 분석 결과, 공지된 락토바실러스 가세리 균주들과 99%의 상동성을 나타내어 락토바실러스 가세리와 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보였다. 따라서 유산균을 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)로 동정하고, 락토바실러스 가세리 NK109로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2019. 07. 18일자로 기탁하였다(KCCM12565P).
상기 락토바실러스 가세리 NK109의 생리학적 특성은 당해 기술분야의 통상의 방법에 따라 분석할 수 있고, 구체적으로 락토바실러스 가세리 NK109는 D-갈락토오스, D-글루코오스, D-플루토오스, D-만노오스, N-아세틸-글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 에스큘린, 살리신, 셀로비오스, 말토오스, 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 녹말, 겐티오비오스, D-투라노오스 및 D-타가토오스를 탄소원으로 이용할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 락토바실러스 가세리 NK109는 대장균(Escherichai coli), 프로테오박테리아(Proteobacteria) 및 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균을 억제하는 것일 수 있다.
상기 대장균, 프로테오박테리아 및 클레브시엘라 옥시토카는 장질환, 인지기능 장애 및 정신장애를 유발하는 장내세균 군집 중 하나이다. 평상시 유지되고 있던 장내세균의 균형이 병원균 침입, 음식 변화, 항생제 사용 등으로 깨지면 대장의 막(膜)에 균열이 생기면서 장 누출(漏出)이 일어난다. 장 누출로 대장의 독성물질이 혈액 내부로 침투해서 대장 전체에 염증을 일으키고, 유익한 두뇌 조절물질(GABA·BNDF)이 감소되며, 세로토닌(serotonin)이 제대로 전달되지 않아 우울증, 자폐증 등의 인지기능 장애, 정신 장애 질환이 발생될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 대장균, 프로테오박테리아 및 클레브시엘라 옥시토카의 성장저해활성을 확인한 결과, 락토바실러스 속 균주 중에서도 특히 락토바실러스 가세리 NK109의 저해 효과가 우수함을 확인하였다(표 3)
이에 따라, 상기 락토바실러스 가세리 NK109는 인지기능 장애, 정신장애 및 염증 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 대한 치료 또는 개선 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 균주를 포함하는 인지기능 장애, 정신장애, 또는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 유산균은 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물일 수 있으나, 인지기능 장애, 정신장애 또는 염증 질환 장애의 예방 또는 치료 효과를 달성할 수 있는 유산균의 형태라면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 “생균체”는 본 발명의 신규한 유산균 그 자체를 의미하고, “사균체”는 가열, 가압 또는 약물 처리 등으로 살균 처리된 유산균을 의미하며, “파쇄물”은 유산균을 효소 처리, 균질화 또는 초음파 처리 등으로 파괴된 유산균을 의미한다.
본 발명에서 “추출물”은 유산균을 공지의 추출용매로 추출하여 수득한 산물을 의미한다.
본 발명에서, “배양물” 또는 “배양액”은 유산균을 공지의 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하며, 상기 산물은 신규한 유산균을 포함할 수 있다. 상기 배지는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 MRS 액체 배지, GAM 액체 배지, MRS 한천 배지, GAM 한천 배지, BL 한천 배지일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “인지기능 장애”는 기억력, 주의력, 언어능력, 시공간 능력, 판단력 등이 저하된 상태를 말하며, 경미한 경우에서 심한 경우를 모두 포함한다. 구체적으로 인지기능 장애는 알츠하이머형 치매증, 뇌혈관성 치매증, 픽(pick)병, 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병, 두부손상에 의한 치매 및 파킨슨(Parkinson)병을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 인지기능 장애가 유발된 모델 생쥐에 락토바실러스 가세리 NK109를 처리하여 인지기능 개선 효과를 확인한 결과, 인지기능이 현저히 개선됨을 확인하였다. 또한 뇌유래신경영양인자인 BDNF의 발현이 증가하고, TNF-α의 양이 감소함을 확인하였다(표 4 및 표 5).
상기 결과를 통해 신규 유산균인 락토바실러스 가세리 NK109를 포함하는 약학적 조성물이 인지기능 장애 예방 및 치료에 효과적임을 확인하였다.
본 발명에서 “정신장애”는 정신질환 또는 정신병이라고도 하며, 개인적, 사회적 기능에 있어 문제를 일으키는 행동-정신적인 이상을 말하며, 이에 의한 육체적 증상까지 포함할 수 있다. 원인으로는 선천적인 뇌 문제가 있을 수 있으며 심각한 스트레스적 요인 등이 있을 수 있다. 정신장애의 종류는 우울불안장애, 기분 장애, 불면증, 망상 장애, 강박 장애, 편두통, 스트레스, 기억 장애, 자폐증, 주의력결핍 과잉행동(ADHD), 주의력결핍질환(ADD), 공황발작 및 주의력 장애를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로 정신장애는 우울불안장애를 포함한다.
상기 우울불안장애는 우울증 및/또는 불안장애를 포함하는 정신장애의 일종으로, 원활하지 못한 대인관계를 야기할 수 있고 심할 경우, 비정상적, 병적인 불안과 공포로 인하여 일상 생활에 장애를 일으킬 수 있다. 상기 우울불안장애는 스트레스에 의한 우울증 및 불안장애, 분리 또는 격리 불안증, 편집증, 범공포증, 범강박증, 신경불안증 및 공황장애를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니며, 우울증 및 불안에 효과적인 본 발명의 신규 유산균을 통해 치료될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 불안 및 우울증 질환 모델 생쥐에 락토바실러스 가세리 NK109를 처리하여 정신장애 개선 효과를 확인한 결과, 스트레스에 의한 불안 및 우울 행동이 현저히 개선되는 것을 확인하였으며, 혈중 스트레스 지표 인자인 코티코스테론 및 IL-6의 양 또한 감소됨을 확인하였다(표 6 및 표 7)
상기 결과를 통해 신규 유산균인 락토바실러스 가세리 NK109를 포함하는 약학적 조성물이 우울불안장애 예방 및 치료에 효과적임을 확인하였다.
본 발명에서 “염증 질환”은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미이다. 발명의 염증 질환은 관절염, 통풍, 간염, 비만, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 대장염, 당뇨, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증 통증, 요도염, 방광염, 질염, 동맥경화증, 패혈증 및 치주염을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 염증 질환은 대장염일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기와 같은 염증 질환에 대한 조절, 예방, 개선 및 치료 효과에 더하여 염증 질환으로 인하여 변화된 장내 미생물을 정상화시킴으로써 염증 질환 및 이로 인한 합병증의 조절, 예방, 개선 및 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 생쥐로부터 분리된 대식세포에 염증 반응 유도물질인 리포폴리사카라이드(LPS)와 함께 락토바실러스 가세리 NK109를 처리한 결과 염증반응이 현저히 억제됨을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 대장염이 유도된 질환 모델 생쥐에 락토바실러스 가세리 NK109를 처리한 결과, 대장염의 지표인 대장의 길이가 정상 수준으로 회복되고, 대장염의 지표인자인 미엘로퍼옥시다아제, TNF-α, 클라딘-1의 활성이 감소함을 확인하였다(표 8).
상기 결과를 통해 락토바실러스 가세리 NK109를 포함하는 약학적 조성물이 염증 질환, 구체적으로 대장염의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 구체적으로 본 발명의 약학적 조성물은 홍삼 추출물을 더욱 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 인지기능 장애, 불안 및 우울증 질환 모델 생쥐에 락토바실러스 가세리 NK109 및 홍삼 추출물을 함께 처리한 결과, 락토바실러스 가세리 NK109를 단독으로 처리했을 때에 비해 인지기능 및 불안/우울 증상이 현저히 개선됨을 확인하였다(표 11).
상기 결과를 통해 락토바실러스 가세리 NK109를 포함하는 약학적 조성물에 천연물, 구체적으로 홍삼 추출물을 더 포함시킴으로써 인지기능, 정신장애 및 우울불안장애 예방 및 치료에 시너지 효과를 발휘할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명 화합물의 활성을 저해하지 않는 범위 내에서 추가적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제, 기타 약제학적으로 허용 가능한 첨가제롤 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여는 약제학적으로 유효한 양을 투여할 수 있다. “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 유효 용량 수준은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질환의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여할 수 있으나, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 도포 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 주사)할 수 있으나 경구 투여가 바람직하다. 질염의 예방 및 치료를 위해서는 질 내로 투여할 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제 등이 포함될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 점안제, 안연고제, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 안연고제, 점안제, 파스타제 또는 카타플 라스마제의 약제학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 국소 투여를 위한 제제는 임상적 처방에 따라 무수형 또는 수성형일 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 락토바실러스 가세리 NK109 균주를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 인지기능 장애, 정신장애 또는 염증 질환 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
구체적으로 상기 정신장애는 우울불안장애를 포함한다.
상기 “락토바실러스 가세리 NK109 균주”, “인지기능 장애”, “정신장애”, “우울불안장애” 및 “염증 질환”은 전술한 바와 동일하다.
상기 대상체는 동물을 말하며, 전형적으로 본 발명의 유산균을 이용한 치료로 유익한 효과를 나타낼 수 있는 포유동물일 수 있다. 이러한 대상체의 바람직한 예로 인간과 같은 영장류가 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 균주를 포함하는 인지기능 장애, 정신장애 또는 염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
구체적으로 상기 정신장애는 우울불안장애를 포함한다.
상기 “인지기능 장애”, “정신장애”, “우울불안장애” 및 “염증 질환”은 전술한 바와 동일하다.
구체적으로, 본 발명의 식품 조성물에 포함되는 유산균은 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물일 수 있으나, 인지기능 장애, 정신장애 또는 염증 질환 장애의 예방 또는 개선 효과를 달성할 수 있는 유산균의 형태라면 제한없이 사용될 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 식품 조성물은 홍삼 추출물을 더욱 포함하는 것일 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 유산균을 첨가할 수 있는 식품은 소시지, 육류, 빵, 초콜릿류, 스넥류, 캔디류, 과자류, 라면, 피자, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 음료수로 제형화할 경우에 신규한 유산균 이외에 첨가되는 액체 성분으로는 이에 한정되지는 않으나, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예, 말토오스, 수크로오스 등) 및 폴리사카라이드(예, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당), 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올일 수 있다.
상기 식품의 종류는 구체적으로 건강기능식품일 수 있다. 상기 건강기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 점증제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 0.001 내지 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기 건강기능식품은 식품의 생체 조절 기능을 강조한 식품으로 물리적, 생화학적, 생물공학적인 방법을 이용하여 특정 목적에 작용 및 발현하도록 부가가치를 부여한 식품이다. 이러한 건강기능 식품의 성분은 생체 방어와 신체 리듬의 조절, 질환의 방지 및 회복에 관계하는 신체 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발휘하도록 설계하여 가공하게 되며, 식품으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 감미료 또는 기능성 원료를 함유할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 가세리 NK109를 건강기능 식품(또는 건강기능 음료 첨가물)으로 사용할 경우, 상기 락토바실러스 가세리 NK109를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용하고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 락토바실러스 가세리 NK109의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 개선, 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 가세리 NK109(Lactobacillus gasseri NK109) KCCM12565P 균주, 이의 포함하는 약학적 조성물 또는 식품 조성물은 인지기능, 정신장애 및 염증 질환 개선 효과가 우수하다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 유산균 분리 및 동정
1-1. 사람 분변으로부터 유산균의 분리
사람 분변을 GAM 액체 배지(GAM broth; Nissui Pharmaceutical, Japan)에 넣고 현탁하였다. 이후, 상등액을 취해 BL 한천 배지(BL agar medium; Nissui Pharmaceutical, Japan)에 이식하고 37℃에서 약 48시간 동안 혐기적으로 배양한 후, 콜로니(colony)를 형성한 락토바실루스 속 균주들을 분리하였다.
1-2. 분리된 유산균의 동정
사람 분변으로부터 분리한 균주들의 생리학적 특성 및 선별한 균주의 계통분류학적인 위치를 확인하기 위하여 16S rDNA의 염기서열을 분석하여 균주의 종을 확정하고, 균주명을 부여하였다.
상기에서 수득한 균주의 염기서열을 분석한 결과, Lactobacillus속 균주들과 90-99% 수준의 염기서열 유사도를 나타내어, Lactobacillus속 균주임을 알 수 있었다. 구체적으로 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 2종, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 3종, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 4종, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 2종, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 2종, 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) 2종, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 4종, 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) 1종, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 2종, 락토바실러스 뮤코제(Lactobacillus mucosae) 2종, 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 3종 및 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii) 2종이 분리되었다.
하기 표 1에 분석 결과 균주의 종 및 균주명을 나타내었다.
번호 균주명 번호 균주명
1 Lactobacillus acidophilus NK101 16 Lactobacillus plantarum NK117
2 Lactobacillus acidophilus NK102 17 Lactobacillus plantarum NK118
3 Lactobacillus casei NK103 18 Lactobacillus plantarum NK119
4 Lactobacillus casei NK104 19 Lactobacillus salivarius NK120
5 Lactobacillus casei NK105 20 Lactobacillus brevis NK121
6 Lactobacillus gasseri NK106 21 Lactobacillus brevis NK122
7 Lactobacillus gasseri K107 22 Lactobacillus mucosae NK123
8 Lactobacillus gasseri NK108 23 Lactobacillus reuteri NK124
9 Lactobacillus gasseri NK109 24 Lactobacillus reuteri NK125
10 Lactobacillus sakei NK110 25 Lactobacillus johnsonii NK126
11 Lactobacillus sakei NK111 26 Lactobacillus johnsonii NK127
12 Lactobacillus paracasei NK113 27 Lactobacillus reuteri K1
13 Lactobacillus paracaseiNK114 28 Lactobacillus plantarum C29
14 Lactobacillus pentosus NK115 29 Lactobacillus mucosae NK41
15 Lactobacillus pentosus NK116
상기 표 1에 기재된 균주들의 16S rDNA를 확인한 결과, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) NK109의 16S rDNA는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 락토바실러스 가세리 NK109의 16S rDNA를 유전자 은행의 블라스트(BLAST) 프로그램을 이용하여 상동성을 분석한 결과 공지된 락토바실러스 가세리 균주는 검색되지 않았고, 공지된 락토바실러스 가세리 균주의 16S rDNA 서열과 99%의 상동성을 보였다. 상기 신규한 균주를 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) NK109라고 명명하였으며, 2019년 7월 18일에 공인기탁기관인 한국미생물보존센터(주소: 대한민국 서울 서대문구 홍제내 2가길 45 유림빌딩에 특허기탁하여 KCCM12565P의 수탁번호를 부여받았다.
1-3. API 키트를 이용한 생화학적 동정
락토바실러스 가세리 NK109의 생리학적 특성 중 탄소원을 이용하여 API Kit(모델명: API 20 strep; 제조사 : BioMerieux's, USA)에 의한 당 발효 시험으로 분석하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 2에서 “+”는 탄소원 이용성이 양성인 경우를 나타내고, "-"는 탄소원 이용성이 음성인 경우를 나타낸다.
탄소원 NK109
glycerol -
erythritol -
D-arabinose -
L-arabinose -
D-ribose -
D-xylose -
L-xylose -
D-adonitol -
methyl-β-D-xylopyranoside -
D-galactose +
D-glucose +
D-fructose +
D-mannose +
L-sorbose -
L-rhamnose -
dulcitol -
inositol -
mannitol -
sorbitol -
α-methyl-D-mannoside -
α-methly-D-glucoside -
N-acetyl-glucosamine +
amygdalin +
arbutin +
esculin +
salicin +
cellobiose +
maltose +
lactose +
melibiose -
sucrose +
trehalose +
inulin -
melezitose -
raffinose -
starch +
glycogen -
xylitol -
gentiobiose +
D-turanose +
D-lyxose -
D-tagatose +
D-fucose -
L-fucose -
D-arabitol -
L-arabitol -
glucoNaTe -
2-keto-gluconate -
5-keto-gluconate -
그 결과, 락토바실러스 가세리 NK109의 유전자 특성은 락토바실러스 가세리 균주와 99% 비슷하였으나, 생화학적 특성은 락토바실러스 아시도필러스와 99%로 가장 유사한 특성을 나타냄을 확인하였다.
실험예 1. 유산균의 항산화 활성 ( in vitro ) 측정
사람 분변으로부터 분리한 균주들의 항산화능을 확인하였다. 항산화능 평가는 자유라디칼(free radical) 소거활성을 측정하기 위하여 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)을 이용하였다.
구체적으로, DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 에탄올에 0.2 mM 농도가 되도록 녹여 DPPH 용액을 제조하였다. 상기 DPPH 용액 0.1 ㎖에 유산균 현탁액(1×108 CFU/㎖) 또는 비타민 C 용액(1 g/㎖)을 넣고 20분간 37℃에서 배양하였다. 배양액을 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 이후, 517 ㎚에서 상등액의 흡광도를 측정하고, 유산균의 항산화 활성을 계산하였다. 상기 유산균의 항산화 활성능에 대한 결과는 하기 표3에 나타내었다.
실험예 2. 유산균의 염증 억제 효능 확인
C57BL/6 생쥐(male, 6주령 20-23 g) 7 마리를 이용하였다. 생쥐의 복강에 멸균된 4% 티오글리콜산(thioglycolate) 2 ㎖를 투여하고, 96시간이 지난 뒤에 생쥐를 마취시켰다. 생쥐 복강에 RPMI 1640 배지 8 ㎖를 투여하고 5~10분 후에 생쥐 복강 내의 RPMI 배지(대식세포를 포함)를 다시 뽑아낸 뒤, 1000 rmp의 조건에서 10분간 원심분리하고 다시 RPMI 1640 배지로 2회 세척하였다. 대식세포를 각 웰(well)당 0.5×106의 수로 24-웰(well) 플레이트에 깔고, 유산균과 염증 반응 유도 물질인 LPS(lipopolysaccharide)를 2시간 또는 24시간 동안 처리한 후 상등액 및 세포를 수득하였다. 이때, 유산균 처리 농도는 1X104 CFU/㎖ 이었다.
상기 수득한 세포를 RIPA 버퍼(Gibco사)에 넣고 균질화하였다. 24시간 처리한 배양 상등액에서 TNF-α 등 사이토카인 발현량을 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 키트(eBioscience, San Diego, CA, U.S.A.)로 측정하였다. 먼저 상등액 0.05 ㎖를 TNF-α 항체가 코팅된 96 웰 플레이트에 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후 포스페이트 버퍼 살린-트윈(phosphate buffered saline-Tween, PBS-Tween)으로 세척하고, 발색제를 넣고 20분 동안 발색시켜 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 계산하였다.
또한, 2시간 동안 처리하여 수득한 세포로부터 p65(NF-κβ), p-p65(phosphor-NF-κβ) 및 β-actin의 발현량을 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 측정하였다.
구체적으로 상등액 50 ㎍을 취해 SDS 10%(w/v) 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 1시간 30분동안 전기영동을 하였다. 전기영동한 샘플을 니트로셀룰로스지에 100 V, 400 ㎃의 조건에서 1시간 10분간 트랜스퍼(transfer) 하였다. 샘플이 트랜스퍼된 니트로셀룰로스지를 5% 탈지분유(stim milk)로 30분간 블록킹(blocking)한 후, 5분씩 3회에 걸쳐 포스페이트 버퍼 살린-트윈으로 세척하고, 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)을 1 : 100의 비율로 추가하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 10분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)을 1 : 1000의 비율로 추가하여 1시간 20분간 반응시켰다. 이후, 15분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 형광발색 시킨 후 현상하고, 발색밴드의 강도(Intensity)를 측정하였다. 유산균의 대식세포 염증반응 억제 효능 시험 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
실험예 3. SH-SY5Y 신경세포의 BDNF(Brain-derived neurotrophic factor) 발현 측정
한국세포주은행에서 분양받은 SH-SY5Y 세포를 10% FBS 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하고, 12-웰(well) 플레이트에 웰 당 2×106 세포 수로 분주하였다. 이후, 각 웰에 유산균 (1×105 CFU/㎖)과 함께 리포 다당류(lipopolysaccharide)를 2 μg/㎖의 농도로 첨가하여 배양하고, BDNF 발현량을 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 측정하였다. 면역블롯팅 실험 방법은 실험예 2를 참고한다. 상기 유산균의 BDNF 발현량 측정 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
실험예 4. 장내미생물군집 내 기억력손상 및 불안/우울을 유발하는 프로테오박테리아( Proteobacteria ), 대장균( Escherichia coli ) 및 클레브시엘라 옥시토카( Klebsiella oxytoca )의 성장억제효과 확인
4-1. 프로테오박테리아( Proteobacteria ) 증식저해활성 측정
사람의 분변희석액(1x106 CFU/mL)과 분리유산균 배양희석액(1x106 CFU/mL)을 GAM배지(10 mL)에 각각 0.1 mL씩 이식한 후 혐기적으로 24시간 배양하였으며, 집균하여, QIAamp DNA stool mini kit (Qiagen, Germany)t로 DNA를 추출하고, qPCR를 수행하여 프로테오박테리아의 양을 측정하였다.
추출한 DNA(100 ng), 사이버 프리믹스(Syber premix, 다카라 바이오, 일본), 아래의 프라이머(Primer)를 넣고, 서머 사이클러(Thermal cyclier, 퀴아젠, 일본)에서 qPCR를 수행했다. 구체적으로 95℃ 30초동안 처리하고, 95℃ 5초, 63℃ 30초로 35 싸이클(cycle)하였다. 발현량은 박테리아 16S rDNA양으로 비교하여 계산하였다.
상기 프로테오박테리아(Proteobacteria) 증식저해활성 측정결과는 하기 표 3에 나타내었다.
4-2. 대장균( Escherichia coli ) 증식저해활성 측정
사람의 분변에서 분리한 Escherichia coli 배양희석액(1x106 CFU/mL)과 분리유산균 배양희석액(1x106 CFU/mL)을 GAM배지(10 mL)에 각각 0.1 mL씩 이식하고, 혐기적으로 24시간 배양하였다. 이후 EMB 한전배지에 이식하여 대장균 수를 측정하였다. 상기 대장균(Escherichia coli) 증식저해활성 측정결과를 하기 표 3에 나타내었다.
4-3 클레브시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca ) 증식저해활성 측정
사람의 분변에서 분리한 클레브시엘라 옥시토카 배양희석액(1x106 CFU/mL)과 분리유산균 배양희석액(1x106 CFU/mL)을 GAM배지(10 mL)에 각각 0.1 mL씩 이식하고, 혐기적으로 24시간 배양하였다. 이후 EMB 한전배지에 이식하여 클레브시엘라 옥시토카의 균수를 측정하였다. 상기 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) 증식저해활성 측정결과를 하기 표 3에 나타내었다.
번호 균주명 항산화능 대식세포의 TNF-a 발현억제능 SH-SY5Y 세포의 BDNF 발현유도능 Proteobacteria 증식억제능 Escherichia coli 증식억제능 Klebsiella oxytoca 증식억제능
1 Lactobacillus acidophilus NK101 + + + + + +
2 Lactobacillus acidophilus NK102 ++ + + + ++ +
3 Lactobacillus casei NK103 ++ +++ +++ ++ + ++
4 Lactobacillus casei NK104 + + ++ + + +
5 Lactobacillus casei NK105 +++ ++ ++ ++ + ++
6 Lactobacillus gasseri NK106 + + + + + +
7 Lactobacillus gasseri K107 + + +++ + ++ +
8 Lactobacillus gasseri NK108 ++ + + + ++ +
9 Lactobacillus gasseri NK109 +++ ++ ++ +++ +++ +++
10 Lactobacillus sakei NK110 + + + - - -
11 Lactobacillus sakei NK111 +++ + + + + +
12 Lactobacillus paracasei NK113 ++ ++ + + + +
13 Lactobacillus paracaseiNK114 + + + + ++ ++
14 Lactobacillus pentosus NK115 +++ + + + + +
15 Lactobacillus pentosus NK116 + + ++ + + +
16 Lactobacillus plantarum NK117 +++ + ++ + + +
17 Lactobacillus plantarum NK118 ++ + + + ++ +
18 Lactobacillus plantarum NK119 + + + + ++ +
19 Lactobacillus salivarius NK120 + + + + ++ +
20 Lactobacillus brevis NK121 ++ + + + - +
21 Lactobacillus brevis NK122 + + + + - +
22 Lactobacillus mucosae NK123 ++ + + + - +
23 Lactobacillus reuteri NK124 + + + + + ++
24 Lactobacillus reuteri NK125 ++ ++ ++ + + ++
25 Lactobacillus johnsonii NK126 + + + + + +
26 Lactobacillus johnsonii NK127 ++ + + + + +
27 Lactobacillus reuteri K1 ++ ++ + + + +
28 Lactobacillus plantarum C29 +++ +++ +++ + ++ +
29 Lactobacillus mucosae NK41 +++ +++ +++ + ++ +
* 유산균의 처리 최종 농도 : 1×105 CFU/㎖* 유산균의 활성 저해율 : -, <10%; +, 10-30%; ++, 30-60%; +++, >60%
* 유산균의 활성 회복율 : -, <10%; +, 10-30%; ++, 30-60%; +++, >60%
상기 표 3에 나타난 바와 같이 분리된 유산균들의 활성을 평가한 결과, 락토바실러스 속 유산균들 중 락토바실러스 가세리 NK109의 항산화 활성 및 염증반응 억제 효과가 뛰어남을 확인하였으며, 나아가 노화 및 치매 등에서 감소하는 뇌유래신경영양인자 BDNF의 발현을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 가세리 NK109 균주가 미생물 군집 내 프로테오박테리아, 대장균 및 클레브시엘라 옥시토카 균주의 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다.
상기 프로테오박테리아, 대장균 및 클레브시엘라 옥시토카는 치매, 불안, 우울 등을 유발하는 것으로 알려진 바에 따라 본 발명의 락토바실러스 가세리 NK109균주는 치매, 항우울증 등의 치료, 개선 및 예방에 활용될 수 있음을 시사한다.
실험예 5. 치매, 불안 및 우울증 질환 모델 생쥐 제작
실시예 1에서 분리한 유산균의 인지기능 및 정신장애 개선 효과를 확인하기 위하여, 치매 또는 불안/우울증 질환을 가진 생쥐를 제작하였으며, 상기 유산균 또는 이의 배양액을 처리하여 기억력 또는 불안/우을증 증상이 개선되는지 여부를 확인하였다.
5-1. 치매, 불안 및 우울증 질환 모델 생쥐 제작
C57BL/6 수컷 생쥐(5주령 19-21 g)를 한 군에 6마리씩으로 하여 1주간 실험실에 적응시켰다. 한 군은 정상군으로 나머지 군은 실험 군으로 하였다. 정상군에는 생리식염수를 투여하였으며, 실험군에는 대장균(1x109 CFU/mouse/day)을 매일 1회씩 5일간 경구투여하였다.
이후, 익일부터 1x109 CFU 살아있는(live) 유산균(NK109), 1x109 CFU 열처리 유산균(NK109T), 1x109 CFU 유산균 lysate 상등액(NK109C), 1x109 CFU 유산균 lysate 침전물(NK109P), 1 mg 플루옥세틴(fluoxetine)/kg 및 도네페질(donepezil) 5 mg/kg을 각각 5일간 매일 1회씩 투여하였다.
열처리 유산균의 경우 MRS배지에서 유산균 배양액을 원심분리하여 얻은 침전물을 1x1010 CFU/mL이 되도록 현탁하였으며, 70℃에서 10분씩 2회 열처리하여 제조하였다.
유산균 lysate 상등액 및 침전물의 경우MRS배지에서 유산균 배양액을 원심분리(5000 g, 20분)하고 얻은 침전물을 1x1010 CFU/mL이 되도록 현탁하였다. 1분씩 20회 초음파 처리한 후, 다시 원심분리(5000 g, 20분)하여 상등액(lysate 상등액) 및 침전물(lysate 침전물)을 얻었다.
실험예 6. 치매, 불안 및 우울증 질환 모델 생쥐를 이용한 유산균의 인지기능 개선 효과 확인
실시예 1로부터 분리한 유산균의 인지기능 개선 효능을 확인하기 위한 행동실험으로 Y자형 미로 실험, 신물 체인지 실험 및 반스 실험을 수행하였으며, 히포캠퍼스 및 혈액에서 BDNF, TNF-α, p65(NF-κβ), p-p65(phosphor-NF-κβ) 및 β-actin의 발현량을 2차에 걸쳐 확인하였다.
6-1. Y자형 미로 실험(Y-maze task)
Y자형 미로 실험을 통해 기억력 개선 또는 불안/우울증 개선 효과를 확인하였다.
구체적으로, Y자형 미로 측정 장치는 3개의 통로(arm)를 뻗어 알파벳 Y자 모양을 하고 있으며 각 가지는 길이 25 cm, 높이 14 cm, 폭 5 cm 이고 동일한 각도로 위치한다.
Y자형 미로의 한 통로의 끝에 실험동물의 머리 부분이 향하도록 두고 8 분 동안 자유롭게 통로를 돌아다니도록 하였다. 동물의 움직임을 기록하고 동물의 뒷발까지 통로로 들어간 경우를 통과한 것(arm entry)으로 보았다. 동물의 움직임을 교차횟수(alternation)로 나타내는데, 교차횟수란 동물이 연속적으로 3개의 통로를 통과하였을 때 한 번 교차한 것으로 정의된다. 자발적인 교차행동량은 실제 교차횟수와 최대 가능한 교차횟수 (즉, 총 교차횟수에서 2를 뺀 값)의 백분비로 표시하였다. Y 자형 미로 실험 결과는 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다.
6-2. 신물 체인지 실험(novel object recognition test [NOR T])
동물을 행동 관찰실로 옮겨 5분간 적응시킨 뒤 3분의 노출시행에서는 상자에 동일한 물체 두 개(1 set)를 30 cm 간격으로 놓고, 동물이 3분 동안 물체를 탐색하는 시간을 측정하였다. 하루 후 인출시행에서는 동일한 상자에 노출 시 계시했던 물체 한 개와 새롭게 대치된 물체 한 개를 준비해 놓고, 동물이 탐색하는 시간을 측정하였다. 측정 결과는 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다.
6-3. 반스 실험(Barnes maze task (BM T))
반스 실험을 이용하여 학습/기억 능력을 측정하였다. 반스 실험은 직경 5 cm의 회피용 구멍이 20개가 뚫려 있는 지름 89 cm, 높이 140 cm의 흰색 원판으로 구성되어 있으며, 하나의 회피용 구멍은 하단에 검정색의 안전지대(Safety zone)가 설치되어 실험용 동물의 회피장소로 이용될 수 있도록 제작하였다.
상기 제작된 반스 실험용 미로에 실험예 5에서 제작된 질환용 모델 생쥐를 원판의 중앙에 위치시켰다. 그 뒤 강력한 빛을 조사하여 생쥐가 빛을 피하여 어두운 안전지대를 찾아 가는 시간을 측정하였으며, 매일 1회씩 4일간 반복 시행을 통해 안전지대까지의 찾는 시간을 측정하였다. 측정 결과는 하기 표 4및 표 5에 나타내었다.
6-4. BDNF, p65(NF-κβ), p-p65(phosphor-NF-κβ) 및 β-actin의 발현량 측정
상기 실험예 5에서 제작한 질환 모델 생쥐에 1x109 CFU 살아있는(live) 유산균, 1x109 CFU 열처리 유산균(NK109T), 1x109 CFU 유산균 lysate 상등액(NK109C), 1x109 CFU 유산균 lysate 침전물(NK109P), 1 mg 플루옥세틴(fluoxetine)/kg, 및 도네페질(donepezil) 5 mg/kg을 각각 5일간 매일 1회씩 투여한 후, BDNF, p65(NF-κβ), p-p65(phosphor-NF-κβ)를 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 측정하였으며, TNF-α는 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 상기 측정 방법은 실험예 2의 방법을 참고한다.
측정 결과는 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다.
실험군 Y-maze T
(%)		 NOR T
(%)		 TNF-a
(ng/mg)		 Intensity of BDNF/ β-actin
정상군 67.6 70.9 1.9 0.41
Escherichia coli 투여군 53.4 54.2 4.6 0.25
E. coli + NK103 55.7 58.1 3.2 0.35
E. coli + NK105 57.3 61.8 2.9 0.34
E. coli + NK109 63.5 65.3 2.7 0.36
E. coli + NK115 55.8 55.2 3.1 0.37
E. coli + NK125 59.4 56.9 3.3 0.35
E. coli + Donepezil 63.2 62.2 3.9 0.35
실험군 Y-maze T
(%)		 NOR T
(%)		 BM T
(%, 4th day		 TNF-a Intensity of BDNF/ β-actin Intensity of
p-p65/p65
정상군 68.2 71.2 19.5 2.2 0.48 0.42
Escherichia coli 투여군 54.3 55.8 31.1 4.8 0.19 1.05
E. coli + NK109T 63.5 65.3 19.8 2.7 0.36 0.64
E. coli + NK109P 65.2 66.6 19.5 2.6 0.41 0.61
E. coli + NK109C 61.7 64.2 20.5 2.8 0.33 0.72
E. coli + Fluoxetine 63.2 62.2 22.1 3.9 0.35 0.83
상기 표 4 및 표 5는 각각 1차 및 2차 측정 결과를 나타낸 것이다. 분리된 유산균들을 생쥐에 처리하여 인지기능 개선 효과를 확인한 결과 락토바실러스 가세리 NK109를 처리할 때 인지기능이 개선되며, BDNF의 발현이 현저히 증가됨을 확인하였다.
실험예 7. 치매, 불안 및 우울증 질환 모델 생쥐를 이용한 유산균의 정신장애 개선 효과 확인
실시예 1로부터 분리한 유산균의 정신 장애 개선 효능을 확인하기 위한 행동실험으로 고가플러스미로(elevated plus maze, EPM), 강제수영 실험(Forced Swimming Test, FST), 꼬리 매달기 실험(Tail Suspension Test, TST)을 수행하였으며, 혈액 중에서 IL-6, 코티코스테론(corticosterone)의 발현량을 2차에 걸쳐 확인하였다.
7-1. 고가플러스미로(elevated plus maze, EPM) 시험
고가플러스미로는 우울, 불안증 또는 스트레스 등의 정신 장애의 정도를 측정하기 위한 실험 장치이다. 본 시험에 사용된 고가플러스미로 실험 장치는 두 개의 개방 통로(Open arm, 30 X 7 cm)와 20 cm 높이의 벽을 가진 두 개의 폐쇄 통로(Enclosed arm, 30 X 7 cm)가 바닥으로부터 50 cm만큼 높고, 중앙 플랫폼으로부터 7 cm씩 뻗어 있는 검정색 플렉시 유리 장치이다. 20 룩스의 밝기에 비디오 카메라가 위에 설치되어 있는 방에서 고가플러스미로에 놓인 마우스의 움직임을 기록하였다.
구체적으로, C57BL/6 마우스를 EPM의 정중앙에 머리가 오도록 개방 통로를 향하게 하여 놓고, 5분 동안 개방 통로와 폐쇄 통로에서 보낸 시간과 횟수를 측정하였다. 통로의 진입(Arm entry)은 네 발이 모두 들어간 것을 인정하였다.
전체 실험 시간 중 개방 통로에서 보낸 시간(Time spent in open arms, OT)은 [개방 통로에서 보낸 시간/(개방 통로에서 보낸 시간 + 폐쇄 통로에서 보낸시간)] X 100으로 계산하였다. 그리고 개방 통로 진입(open arm entries, OE)는 [개방 통로 입장/(개방 통로 입장 + 폐쇄 통로 입장)] X 100으로 계산하였다. 매 행동실험 종료 후에는 70% 에탄올로 남아있는 냄새를 제거하였다.
공지된 시험 결과 해석에 따라, 개방 통로에서 보낸 시간(OT) 및 개방 통로 진입(OE)이 감소하는 경우 우울, 불안증 등의 정신 장애 증상이 나타난 것으로 해석하였다. 측정 결과는 하기 표 6 및 표 7에 나타내었다.
7-2. 강제수영 실험(Forced Swimming Test, FST)
높이 40 cm, 직경 20 cm인 수조에 온도 25 ±1°C의 물을 30 cm높이까지 채웠다. 상기 실험예 5에서 제작한 질환 모델 생쥐를 한 마리씩 수조에 넣고 총 6분 중 최초 2분은 적응시간으로 측정하지 않고, 마지막 4분 동안의 실험동물 부동상태(immobility) 시간을 측정하였다. 부동상태는 머리만을 물 위로 드러내기 위한 최소한의 움직임만 하면서 똑바로 서서 움직이지 않고 떠있는 상태를 의미한다. 측정 결과는 하기 표 6 및 표 7에 나타내었다.
7-3. 꼬리 매달기 실험(Tail Suspension Test, TST)
Steru 등(Steru L, Chermat R, Thierry B, Simon P (1985) The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice, Psychopharmacology, Vol.85; pp.367-370)의 방법에 따라 직경 35 cm 및 높이 50 cm인 통속에 마우스 꼬리 끝 1 cm 정도에 고정 장치를 장착 후 지면에서 50 cm 떨어진 위치에 매달았다. 총 6분 동안 실험동물의 부동상태(immobility) 시간을 측정하였다. 측정 결과는 하기 표 6 및 표 7에 나타내었다.
실험군 EPM FST 혈액 IL-6 혈액 코르티코스테론
정상군 12.4 22.4 21.6 15.6
Escherichia coli 투여군 4.7 42.6 54.8 198.4
E. coli + NK103 7.7 33.6 41.4 182.2
E. coli + NK105 7,2 34.8 40.2 15.5
E. coli + NK109 9.9 24.5 30.5 132.1
E. coli + NK115 7.1 32.9 38.5 182.7
E. coli + NK125 6.5 40.5 40.9 195.3
E. coli + Donepezil 9.2 34.4 35.2 152.5
실험군 EPM FST TST 혈액 IL-6 혈액 코르티코스테론
정상군 11.2 21.5 26.6 22.2 14.5
Escherichia coli 투여군 7.5 38.3 49.2 58.2 286
E. coli + NK109T 10.5 24.4 31.5 32.3 225
E. coli + NK109P 10.6 23.7 29.2 28.5 210
E. coli + NK109C 9.5 26.1 33.9 35.7 241
E. coli + Fluoxetine 9.8 32.1 33.5 39.2 202.5
상기 표 6 및 표 7은 각각 1차 및 2차 측정 결과를 나타낸 것이다. 상기 실시예 1에서 분리된 유산균들을 생쥐에 처리하여 정신 장애 개선 효과를 확인한 결과, 락토바실러스 가세리 NK109를 투여한 군은 고가플러스미로시험의 개방통로에서 보내는 시간과 빈도가 증가하고 혈중 코티코스테론의 양이 현저히 감소됨을 확인하였다.
또한 대장군(Escherichia coli)만 투여했을 때에 비해 락토바실러스 가세리 NK109를 투여한 군에서 강제수영실험 및 꼬리 매달기 실험에서의 부동상태 시간이 현저히 감소됨을 확인하였다.
상기 결과들은 락토바실러스 가세리 NK109가 우울, 불안증 등의 정신장애 개선에 효과적인 균주임을 시사한다.
실험예 8. 유산균의 대장염 개선 효능 확인
상기 실험예 5에서 제작한 질환 모델 생쥐를 마취시키고, 장길이, MPO, TNF-α, 클라딘-1(장 밀착 연접 단백질), β-액틴(β-actin) 등의 염증 반응 지표 물질을 측정하였다.
8-1. 장길이측정
복부를 해부하여 대장을 분리하여 장길이를 측정하였으며, 상기 장길이 측정 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
8-2. 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
대장조직 100㎎에 0.5% 헥사데실 트리메틸 암모늄 브롬화물(hexadecyl trimethyl ammonium bromide) 함유 10 mM 인산칼슘 완충액(potassium phosphate buffer, pH 7.0) 200 ㎕를 넣고 균질화(homogenization)하였다. 4℃및 10,000 g의 조건에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이를 조효소액으로 사용하였다. 조효소액 50 ㎕를 0.95 ㎖ 의 반응액(1.6 mM 태투러매탈 밴자단(tetramethyl benzidin)과 0.1 mM H2O2 함유)에 넣고 37℃에서 반응시키면서 650 ㎚에서 경시적으로 흡광도를 측정하였다. 상기 미엘로퍼옥시다아제의 활성은 반응물로서 생긴 H2O2 1μmol/ml을 1 유닛으로 계산하였다. 상기 측정 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
8-3. 염증 지표 측정
p-p65, p65, TNF-α, 클라딘-1(장 밀착 연접 단백질), β-액틴(β-actin)과 같은 염증 반응 지표 물질을 측정하였다. 구체적으로, 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정 실험과 동일한 방법으로 상등액을 얻고, 상등액 50 ㎍을 취해 면역블롯팅을 수행하였다. 또한, 사이토카인은 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 상기 측정 방법은 실험예 2의 방법을 참고한다.
측정 결과는 하기 표 8 에 나타내었다.
실험군 Weight gain(g) Colon length (㎝) MPO 활성
(μU/㎎)		 TNF-α
(pg/㎎)		 Intensity of claudin-1/ β-actin Intensity of
p-p65/p65
정상군 0.65 6.3 0.54 36 0.28 0.21
Escherichia coli 투여군 -1.12 5.1 1.79 123 0.11 0.52
E. coli + NK109T 0.25 5.9 0.95 57 0.25 0.34
E. coli + NK109P 0.26 6.0 0.9 55 0.26 0.33
E. coli + NK109C 0.23 5.7 1.0 61 0.24 0.41
E. coli + Fluoxetine 0.19 5.5 1.24 79 0.22 0.42
상기 표 8에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 가세리 NK109를 처리할 때 장길이가 회복되고 MPO 저해능 및 염증 지표들이 개선되었음을 확인하였다.
상기 결과들은 락토바실러스 가세리 NK109가 대장염 개선에 효과적인 균주임을 시사한다.
실험예 9. 장내미생물군집에 미치는 효능 확인
장내미생물군집에서 피르미쿠테스(Firmicutes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 박테로이데테스(Bacteroidetes) 등의 점유율을 측정하기 위해 실시간 PCR(real-time PCR) 또는 454 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하였다.
구체적으로, 질환 모델 생쥐로부터 얻은 분변의 DNA는 QIAamp DNA stool mini kit(Qiagen, Germany) 를 사용하여 분리하였다. qPCR은 하기 표 9의 프라이머를 사용하여 분석하였다. 결과는 하기 표 10에 나타내었다.
종류 염기서열(5'-3')
피르미쿠테스(Firmicutes) 정방향(F) (서열번호 2) GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA,
역방향(R) (서열번호 3) AGCTGACGACAACCATGCAC
박테로이데테스(Bacteroidetes) 정방향(F) (서열번호 4) GTTTAATTCGATGATACGCGAG
역방향(R) (서열번호 5) TTAASCCGACACCTCACGG
deta/gamma- 프로테오박테리아(Proteobacteria) 정방향(F) (서열번호 6) GCTAACGCATTAAGTRYCCCG
역방향(R) (서열번호 7) GCCATGCRGCACCTGTCT
대장균(Escherichia coli) 정방향(F) (서열번호 8) GACCCGGCACAAGCATAAGC
역방향(R) (서열번호 9) CCACCTGCAGCAACAAGAGG
클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) 정방향(F) (서열번호 10) GATACGGAGTATGCCTTTACGGTG
역방향(R) (서열번호 11) TAGCCTTTATCAAGCGGATACTGG-
박테리아 16S rDNA 정방향(F) (서열번호 12) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
역방향(R) (서열번호 13) AAGGAGGTGWTCCARCC
[실험군]/[정상군]
실험군 Firmicutes Bacteroidetes Proteobacteria Escherichia coli Klebsiella oxytoca
정상군 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Escherichia coli 투여군 2.4 0.6 5.2 6.2 3.8
E. coli + NK109 1.5 0.8 1.5 1.8 1.7
E. coli + NK109P 1.4 0.7 1.4 1.9 1.6
E. coli + NK109C 1.9 0.6 3.1 2.5 2.1
E. coli + Fluoxetine 2.3 0.5 4.5 4.6 2.9
상기 표 10에 나타난 바와 같이 락토바실러스 가세리 NK109를 처리할 때, 피르미쿠테스, 프로테오박테리아, 대장균, 클레브시엘라 옥시토카에서 박테로이데테스가 감소되는 것을 확인하였다.
상기 결과는 락토바실러스 가세리 NK109가 장내미생물군집 내 프로테오박테리아, 대장균 등을 제어할 수 있음을 시사한다.
실험예 10. 천연물과의 병용효과 확인
상기 실험예 5의 대장균으로 인지기능을 손상시킨 질환 모델 생쥐(수컷, 19-21g)에 락토바실러스 가세리 NK109(생균, 1x109 CFU) 및 홍삼추출물 건조물(정관장, 50 mg/kg)을 질환 모델 생쥐에 5일간 경구투여하고 익일에 고가플러스미로(EPM), 강제수영 실험(FST), Y자형 미로 실험(Y-maze task) 및 신물 체인지 실험(NOR T)으로 인지기능을 측정하였다. 측정결과는 하기 표 11에 나타내었다.
실험군 OT in EPM (%) Immobility in FST (%) Y-maze task (%) NOR T (%)
정상군 9.8 17.2 70.5 27.7
Escherichia coli 투여군 3.1 52.3 58.5 15.7
E. coli + NK109 8.9 32.9 70.2 21.7
E. coli + NK109 + 홍삼 9.4 32.5 70.3 22.4
E. coli + 홍삼 5.6 38.5 62.8 20.2
E. coli + Donepezil 8.3 39.5 69.2 24.5
상기 표 11에 나타난 바와 같이 락토바실러스 가세리 NK109에 홍삼 추출물 을 함께 처리하였을 때, 락토바실러스 가세리 NK109를 단독으로 처리하였을 때에 비해 인지기능과 항우울/항불안 효과가 향상됨을 확인하였다.
상기 결과는 천연물인 홍삼 추출물이 인지기능개선, 우울불안장애 예방 및 치료에 시너지 효과를 가질 수 있음을 시사한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12565P 20190718
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Claims (14)

  1. 락토바실러스 가세리 NK109 (Lactobacillus gasseri NK109) KCCM12565P.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 가세리 NK109 (Lactobacillus gasseri NK109) KCCM12565P는 서열번호 1의 16S rDNA 염기서열을 포함하는, 락토바실러스 가세리 NK109 (Lactobacillus gasseri NK109) KCCM12565P.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 가세리 NK109(Lactobacillus gasseri NK109) KCCM12565P는 대장균(Escherichai coli), 프로테오박테리아(Proteobacteria) 및 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균을 억제하는 것인, 락토바실러스 가세리 NK109(Lactobacillus gasseri NK109) KCCM12565P.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 가세리 NK109(Lactobacillus gasseri NK109) KCCM12565P는 인지기능 장애, 정신장애 및 염증 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 대한 치료 또는 개선 효과를 나타내는 것인, 락토바실러스 가세리 NK109(Lactobacillus gasseri NK109) KCCM12565P.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 포함하는, 인지기능 장애, 정신장애 또는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 균주는 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물인 것인 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 인지기능 장애는 알츠하이머형 치매증, 뇌혈관성 치매증, 픽(pick)병, 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병, 두부손상에 의한 치매 및 파킨슨(Parkinson)병을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상인 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 정신장애는 우울불안장애, 기분 장애, 불면증, 망상 장애, 강박 장애, 편두통, 스트레스, 기억 장애, 자폐증, 주의력결핍 과잉행동(ADHD), 주의력결핍질환(ADD), 공황발작 및 주의력 장애를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상인 약학적 조성물.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 염증 질환은 대장염인 약학적 조성물.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 홍삼 추출물을 더욱 포함하는 것인 약학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 포함하는 인지기능 장애, 정신장애 또는 염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 균주는 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물인 것인 식품 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 홍삼 추출물을 더욱 포함하는 것인 식품 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태인 식품 조성물.
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