KR20210041871A - 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염, 위염 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염, 위염 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 식품 조성물은 글라이코매크로펩타이드는 물론 합성 N-아세틸뉴라민산에 비해서도 현저히 우수한 헬리코박터 파이로리 억제 활성이나 위염 억제 효과를 나타낸다.

Description

글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염, 위염 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Compositions for prevention, improvement or treatment of Helicobacter pylori infection, gastritis comprising enzyme hydrolysate of glycomacropeptide as active ingredient}

글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염, 위염 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

헬리코박터 파이로리는 1983년에 호주의 마샬(Marshall)과 워렌(Warren)에 의해 발견되었으며, 위염 및 위궤양 환자의 위점막 생검조식으로부터 그람음성의 만곡형 간균으로 관찰되어, B형 만성위염과 위십이지장 궤양을 유발시키며 위암발생의 일차적 결정요인으로 알려져 있다.

헬리코박터 파이로리는 요소 분해효소인 우레아제(urease)를 분비하여 위액내의 요소 1 분자를 가수분해하여 2분자의 암모니아를 형성한다. 우레아제가 인체 위장관 표피 세포에 헬리코박터 파이로리를 감염시키고, 군락형성(colonization)을 돕는 것에 대한 밀접한 관련성이 보고되어 있다.

상기 헬리코박터 파이로리의 활성을 저해하기 위해 항생제 요법이 사용될 수 있으나, 항생제의 부작용, 내성 균주의 출현, 재감염율을 예방할 수 없다는 등의 효율성이 떨어지는 문제가 있다.

한국등록특허공보 제10-1613964호

본 발명의 다른 목적은 독성이 없는 천연 재료로부터 헬리코박터 파이로리 감염, 위염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적은 독성이 없는 천연 재료로부터 헬리코박터 파이로리 감염, 위염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면,

글라이코매크로펩타이드를 프로테아제(protease)에 의해 효소분해시킨 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 포함하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 식품 조성물이 제공된다.

상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 총중량을 기준으로 N-아세틸뉴라민산이 5 내지 8 중량% 함유될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,

글라이코매크로펩타이드를 프로테아제(protease)에 의해 효소분해시킨 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 포함하는 위염 예방 또는 개선용 식품 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

글라이코매크로펩타이드를 프로테아제(protease)에 의해 효소분해시킨 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 포함하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

글라이코매크로펩타이드를 프로테아제(protease)에 의해 효소분해시킨 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 포함하는 위염 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 글라이코매크로펩타이드 또는 N-아세틸뉴라민산 보다 현저히 우수한 헬리코박터 파이로리 감염, 위염 예방 또는 치료 활성이 있으므로, 헬리코박터 파이로리 감염, 위염 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 헬리코박터 파이로리 감염, 위염 예방 또는 개선용 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 실험예 2의 H. pylori P1WT 억제 활성 비교 실험 사진이다.
도 2 및 도 3은 실험예 2의 H. pylori P1WT 억제 활성 측정 결과이다.
도 4 및 도 5는 실험예 2의 H. pylori P12WT 억제 활성 비교 결과이다.
도 6 및 도 7은 H. pylori SS1 억제 활성 비교 결과이다.
도 8은 실험예 3의 위염 억제 활성 분석 실험의 사진이다.
도 9는 실험예 3의 위염 억제 활성 분석 결과이다.
도 10은 실험예 4의 AGS 세포에 의한 IL-8 억제 효능 측정 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물은 글라이코매크로펩타이드를 프로테아제(protease)에 의해 효소분해시킨 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 한다.

상기 글라이코매크로펩타이드는 카파 카제인의 친수성 부분으로, 이를 분리하는 방법은 산업적으로 잘 확립되어 있다. 예를 들어 치즈의 제조를 위해 우유로부터 카제인 분획을 분리하거나 또는 우유를 응유효소, 예를 들어 송아지 키모신("레닛")과 배양시킨다. 키모신은 상기 카파-카제인의 Phe(105)-Met(106) 펩타이드 결합을 매우 선택적으로 절단하므로, 상기 효소 반응에 의해 상기 카파-카제인의 친수성 글라이코매크로펩타이드 부분을 절단하며 이에 의해 상기 카제인 분획이 즉시 응집되고 침전된다. 이때 카파 카제인의 글라이코매크로펩타이드 부분이 잘라짐에 따라, 친수성 글라이코매크로펩타이드는 용액 중에서 다양한 유청 단백질들과 함께 남아 소위 치즈 또는 스위트 유장을 형성한다. 상기 치즈 또는 스위트 유장의 다른 유청단백질로부터 글라이코매크로펩타이드가 분리될 수 있다.

상기 프로테아제는 바실러스 속 유래의 프로테아제를 사용할 수 있다.

구체적으로, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 유래의 프로텍스 7L(Protex 7L), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 유래의 서브틸리신 (subtilisin), 프로텍스 30L(Protex 30L), 프로텍스 89L(Protex 89L), 바실러스리케니포르미스(Bacillus licheniformis)유래의 프로텍스 6L(Protex 6L) 등을 사용할 수 있으나, 이 중 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 유래의 엔도프로테아제(endoprotease)인 프로텍스 7L을 사용하는 것이 본 발명의 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물을 제조하는데 가장 바람직하다.

상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 글라이코매크로펩타이드로부터 N-아세틸뉴라민산을 분리하는 프로테아제에 의한 효소분해물이다. 상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물의 제조방법은 글라이코매크로펩타이드 10 내지 15 중량% 함유하는 기질 용액에 글라이코매크로펩타이드 100중량부 기준으로 0.5 내지 2중량부, 더욱 바람직하게는 1 내지 1.5중량부의 프로테아제를 투입하여 40 내지 60 ℃에서 6 내지 8 시간 반응시킨 후 효소를 실활시켜 효소분해물을 제조한다.

상기 글라이코매크로펩타이드를 프로테아제로 처리한 효소분해물에는 단백질 100 중량부에 대하여 5 내지 15 중량부의 N-아세틸뉴라민산이 함유되고, 상기 효소분해물 고형분 전체 중량을 기준으로 5 내지 8 중량%의 N-아세틸뉴라민산이 포함된다.

상기 본 발명의 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 효소분해되지 않은 글라이코매크로펩타이드 자체보다 현저히 항-헬리코박터 파이로리 활성이 증가되고, 또한 N-아세틸뉴라민산의 함량이 10 배 이상되는 합성 N-아세틸뉴라민산에 비해서도 항-헬리코박터 파이로리 활성이 훨씬 뛰어나다.

한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 본 발명의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물이 헬리코박터 파이로리 감염의 예방 또는 치료 효과를 나타내는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 헬리코박터 파이로리 감염의 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 0.03 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 글라이코매크로펩타이드를 프로테아제(protease)에 의해 효소분해시킨 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물에서, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

음료를 제조하는 경우 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(‘NG-NANA’)의 제조

치즈 유청으로부터 얻은 글라이코매크로펩타이드(이하, ‘GMP’ 라고도 함) 75kg에 물 530kg을 넣고 용해하여 GMP 수용액을 제조하였다. 여기에 1.13kg의 프로테아제(protease) Protex 7L(MULTIFECT PR 7L, (주)옥전바이오텍)(EC 3.4.24.28, EC 3.4.21.62)을 첨가하고 52℃로 승온하여 7시간 동안 효소가수분해 반응시킨 후, 95℃에서 30 분 동안 효소를 실활시켰다. 여과 보조제인 규조토를 이용하여 고형분 함량이 20중량% 이하가 되도록 여과한 후 95℃에서 1시간 동안 살균하고, 분무건조(Inlet 170~180℃, Outlet 80~90℃)하여 실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(‘NG-NANA’) 분말을 수득하였다.

비교예 1: 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(‘G-NANA7’)의 제조

치즈 유청으로부터 얻은 글라이코매크로펩타이드(GMP)를 7 중량%가 되도록 물에 넣고 용해하였다. 상기 글라이코매크로펩타이드 용액에 프로테아제를 1 중량%가 되도록 첨가하고 40 ℃에서 5 시간 반응시킨 후, 95 ℃에서 30 분 동안 효소를 실활시켰다. 상기 효소를 실활시킨 반응액의 일부는 동결건조하여 실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(이하, 'G-NANA7'이라고도 함)을 제조하였다.

비교예 2: 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(‘G-NANA’)의 제조

비교예 1에서 효소를 실활시킨 반응액의 나머지를 25 ℃에서 4000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상등액에 에탄올을 80 중량%가 되도록 첨가하고 교반한 후, 다시 25 ℃에서 4000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 침전물을 농축 및 건조하여 비교예 2의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(이하, 'G-NANA'라고도 함)을 제조하였다.

비교예 3: N- 아세틸뉴라민산 표준품(‘S- NANA ’) 준비

순도 98 중량%의 N-아세틸뉴라민산 표준품(이하, 'S-NANA'라고도 함)을 준비하였다.

[ 실험예 ]

실험예 1: N- 아세틸뉴라민산 함량 측정

시료는 100 mg을 분취하여 1차 증류수 10 ㎖에 용해하고, 30분 동안 초음파 처리한 후 에탄올로 5 배 희석하고, 원심분리 후 여과하여 고속액체크로마토그래피로 N-아세틸뉴라민산의 함량을 분석하였다. 순도 98 중량%의 N-아세틸뉴라민산 표준품('S-NANA')을 사용하여 농도에 따른 표준 곡선을 작성하였고, 각각 상기 글라이코매크로펩타이드크로펩타이드(GMP), 실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(NG-NANA), 비교예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(G-NANA7) 및 비교예 2의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물(G-NANA)의 N-아세틸뉴라민산 함량을 측정하였다.

글라이코매크로펩타이드크로펩타이드(GMP)에는 약 7-8 중량%의 N-아세틸뉴라민산이 함유된 것으로 알려져 있으나, 효소분해되지 않은 GMP에는 N-아세틸뉴라민산이 검출되지 않았고, 실시예 1의 NG-NANA는 6.9중량%, 비교예 1의 G-NANA7에는 7.1 중량% N-아세틸뉴라민산, 비교예 2의 G-NANA에는 32.4 중량%의 N-아세틸뉴라민산을 함유하고 있는 것을 알 수 있다.

실험예 2: 항-헬리코박터 파이로리 활성 측정

1) 실험방법

H. pylori P1WT, SS1은 페트리 디쉬에 브루셀라 브로쓰를 멸균하고 60 ℃이하로 식힌 후 항생제 vancomycin 10㎍/㎖, trimethoprim 5㎍/㎖, nystatin 1㎍/㎖와 10% FBS를 첨가한 브로쓰를 8 ㎖ 넣고 배양된 헬리코박터 파이로리를 1㎖ 넣어 37℃, 10% CO₂ 배양기에서 24 시간 배양하였다.

NG-NANA, GMP, G-NANA7, G-NANA, S-NANA는 생체 외(in vitro) 실험 시 브로쓰에 용해하고, 생체 내(in vivo)실험 시 PBS로 농도에 맞게 용해한 후, pH를 7로 맞춘 후 사용하였다.

상기 배양한 헬리코박터 파이로리를 3000rpm, 20min, 4℃ 원심분리 후 상층액 브로쓰를 제거하고 PBS로 H. pylori 펠릿을 풀어주었다. 헬리코박터 파이로리 균수(CFU)는 1.20±10⁹cfu/㎖로 50㎕씩 넣고 37℃, 10% CO₂ 배양기에서 24 시간 배양하였다. 상기 배양 후 OD 620 nm에서 흡광도를 측정하고, 브루셀라 아가에 50㎕씩 넣어 접종한 후 37℃, 10% CO₂ 배양기에서 4~5일간 배양 후 콜로니를 계수하였다.

2) H. pylori P1WT 억제 활성 비교 결과

H. pylori P1WT 균주를 0.01 중량%부터 10 중량%까지 농도별로 처리된 실험군과 함께 24 시간 배양한 후 콜로니를 확인하여 620 nm에서 흡광도 및 균수를 측정하였다. 실험 사진을 도 1에 나타내었고, 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다. 도 1에서 A는 무처리군(1-1: 실험 직후, 1-2: 24시간 후), B는 실시예 1의 NG-NANA 처리군(2-1: 0.05중량%, 2-2: 0.1중량%, 2-3: 0.5중량%, 2-4: 2.0중량% 처리 24시간 후), C는 비교예 2의 G-NANA 처리군(3-1: 0.05중량%, 2-2: 0.1중량%, 2-3: 0.5중량%, 2-4: 2.0중량% 처리 24시간 후)이다.

이에 따르면, 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 NG-NANA 처리군은 0.5 중량%부터 H. pylori P1WT의 생육이 현저히 저해되는 것으로 나타났다. 비교예 2의 G-NANA는 실시예 1의 NG-NANA에 비해 N-아세틸뉴라민산이 약 5배 포함된 것을 고려하여 H. pylori P1WT의 생육 저해능을 비교하면 NG-NANA 0.5중량% 처리군과 G-NANA 0.1중량% 처리군을 대비할 수 있다. 이에 따르면, NG-NANA 0.5중량% 처리군은 10² 수준으로 H. pylori P1WT 생육 억제능을 나타내는데 비해, G-NANA 0.1중량% 처리군은 10⁴ 수준으로 생육 억제능을 나타내므로 NG-NANA에 비해 N-아세틸뉴라민산 함량을 기준으로 헬레코박터 파이로리 억제 활성이 낮은 것으로 나타났다.

또한, S-NANA은 N-아세틸뉴라민산 함량이 98 중량%이므로 NG-NANA에 비해 N-아세틸뉴라민산 함량이 약 14배 높은 것을 알 수 있다. 그러나 S-NANA 처리군과 NG-NANA 처리군은 헬레코박터 파이로리 억제 활성에서 유사한 수준으로 나타났다. 이와 같은 결과로부터 NG-NANA의 항-헬리코박터 활성의 일부는 NG-NANA에 포함된 N-아세틸뉴라민산으로부터 유래한 것일 수 있으나, 글라이코매크로펩타이드를 프로타아제로 효소 분해한 효소분해물로부터 유래하는 것이 더 클 것으로 추정된다.

GMP는 2 중량%까지 첨가하더라도 헬리코박터 파이로리의 억제 효과가 거의 없었고, 8 중량% 사용하였을 때 약간의 헬리코박터 파이로리 억제 활성을 나타내었으나 NG-NANA의 2 중량%와 비교했을 때 10⁶ 이상 균수에서 차이가 발생하였다.

3) H. pylori P12WT 억제 활성 비교 결과

H. pylori P12WT 균주를 0.01 중량%부터 5 중량%까지 농도별로 처리된 실험군과 함께 24 시간 배양한 후 콜로니를 확인하여 620 nm에서 흡광도 및 균수를 측정하여 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

이에 따르면, 실시예 1의 NG-NANA 처리군은 0.5 중량%부터 H. pylori P12WT의 생육이 현저히 저해되는 것으로 나타났다. 또한, S-NANA은 N-아세틸뉴라민산 함량이 98 중량%이므로 NG-NANA에 비해 N-아세틸뉴라민산 함량이 약 14배 높은 것을 알 수 있다. 그러나 S-NANA 처리군과 NG-NANA 처리군은 헬레코박터 파이로리 억제 활성에서 유사한 수준으로 나타나, NG-NANA의 항-헬리코박터 활성의 일부는 NG-NANA에 포함된 N-아세틸뉴라민산으로부터 유래한 것일 수 있으나, 글라이코매크로펩타이드를 프로타아제로 효소 분해한 효소분해물로부터 유래하는 성분에 의한 것을 알 수 있다.

4) H. pylori SS1 억제 활성 비교 결과

H. pylori SS1 균주를 0.01 중량%부터 5 중량%까지 농도별로 처리된 실험군과 함께 24 시간 배양한 후 콜로니를 확인하여 620 nm에서 흡광도 및 균수를 측정하여 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

이에 따르면, 실시예 1의 NG-NANA 처리군은 0.5 중량%부터 H. pylori SS1의 생육이 현저히 저해되는 것으로 나타났다. 비교예 2의 G-NANA는 실시예 1의 NG-NANA에 비해 N-아세틸뉴라민산이 약 5배 포함된 것을 고려하여 H. pylori SS1의 생육 저해능을 비교하면 NG-NANA 0.5중량% 처리군과 G-NANA 0.1중량% 처리군을 대비할 수 있다. 이에 따르면, NG-NANA 처리군이 G-NANA 처리군에 비하여 N-아세틸뉴라민산 함량을 기준으로 헬레코박터 파이로리 억제 활성이 더 높은 것으로 나타났다.

또한, S-NANA은 N-아세틸뉴라민산 함량이 98 중량%이므로 NG-NANA에 비해 N-아세틸뉴라민산 함량이 약 14배 높은 것을 알 수 있다. 그러나 S-NANA 처리군은 0.5중량% 처리군에서 억제 활성이 나타나 NG-NANA에 비해 오히려 낮은 H. pylori SS1 생육 저해능을 나타내었다. 이와 같은 결과로부터 NG-NANA의 항-헬리코박터 활성의 일부는 NG-NANA에 포함된 N-아세틸뉴라민산으로부터 유래한 것일 수 있으나, 글라이코매크로펩타이드를 프로타아제로 효소 분해한 효소분해물로부터 유래하는 것이 더 클 것으로 추정된다.

실험예 3: 위염억제 활성 분석

위염 억제 활성 분석은 실시예 1의 NG-NANA, 비교예 2의 G-NANA, 양성대조군 시료로 Ranitidine (Sigma사 제품 R0101)를 사용하여 실시하였다. 실험동물은 3주령 수컷 ICR 마우스(라온바이오)를 사용하였으며, HCl in ethanol(HCl/ethanol) 투여에 의해 유도되는 위염모델에 있어서, G-NANA 시료의 경구투여가 위염 발생을 억제하는 가를 판정하였다.

구체적으로, ICR 마우스는 각 그룹당 4마리씩으로 하여 실시하였고, 위염은 하루 밤 절식시킨 ICR 마우스에 150 mM HCl/ethanol을 200 ㎕씩 경구 투여하여 유도하였고, NG-NANA 및 G-NANA는 HCl/ethanol을 투여하기 전에 1일 1회 총 7일간 1 mg/mouse의 양으로 경구투여 하였다. 양성대조군 시료는 Ranitidine을 40 mg/kg의 양으로 1일 1회 총 2회 투여하였으며, NG-NANA, G-NANA 및 ranitidine의 투여 종료 1시간 후에 HCl/ethanol을 투여하여 위염을 유발시켰다. HCl/ethanol 투여 1시간 후에 마우스를 희생하여 위를 적출하고, 적출된 위의 아래쪽 날문을 막고, 위쪽 들문으로 formalin을 주입하여 48시간 동안 위 조직을 고정하고, 고정된 위 조직을 넓게 펼친 후 사진 촬영하여 도 8에 나타내었다. 또한, 위 스크래치 부위의 출혈면적을 MS office pixel 시스템을 이용하여 정량화하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.

이에 따르면, 위염 대조군과 대비하여 ranitidine, G-NANA 및 NG-NANA 투여군 모두에서 스크래치와 이에 따른 출혈면적이 감소하였으며, 출혈면적의 측정에서도 위염 억제효과를 나타내었다. 특히 NG-NANA 투여군은 G-NANA 투여군과 대비하여 유의차 있는 효과를 나타내었으며, 양성대조군인 ranitidine과 거의 동등한 효과를 나타내었다. 즉, NG-NANA에 의한 위 염증 억제활성은 HCl/ethanol에 의해 유발되는 위벽 스크래치의 억제는 물론 염증부위의 출혈도 억제하는 항위염 활성을 나타내었다.

실험예 4: AGS 세포에 의한 IL -8 억제 효능 측정

H. pylori가 위점막의 상피세포와 상호작용할 때, 다양한 사이토카인(cytokine)의 생성을 촉진하게 되는데 이 중에서도 IL-8(interleukin-8)의 분비가 가장 현저하게 나타난다. 그리고 IL-8은 위염의 직접적인 원인이 되는 뉴트로필(neutrophil) 또는 마크로파지(macrophge)까지 유도하게 된다. 따라서 H. pylori 감염에 의해 유도되는 IL-8의 생성을 억제하는 것이 위염발생을 억제하는 한 방법이 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 NG-NANA가 IL-8의 생성을 억제하는지 시험하였다.

먼저, 한천배지에서 배양된 H. pylori P1WT를 10㎖의 PBS 완충액(buffer)으로 씻어낸 후, 4?, 9000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 침전된 세포를 1㎖의 RPMI1640 배지에 현탁하고 현탁액의 소량을 취하여 1:50으로 희석한 뒤 660nm에서 현탁도를 재어 실험을 하였다. 실험군은 AGS 세포에 H. pylori P1WT를 처리한 후 배지에 녹인 NG-NANA, S-NANA을 농도별로 각각 처리하였다. 18시간 뒤 각각 배지를 취하여 4?, 12,000rpm에서 3분간 원심분리하고 그 상등액을 취한 후 ELISA 방법(Human IL-8 Immunoassay kit, BD)으로 IL-8 의 생성량 변화를 측정하여 그 결과를 도 10에 나타내었다.

이에 따르면, 헬리코박터 파이로리에 감염되지 않은 군(-)에서는 IL-8의 생성이 거의 없었고, NG-NANA 처리군에서는 0.5중량% 처리군부터 농도 의존적으로 현저히 감소하였다. 이에 반해, S-NANA 처리군은 NG-NANA에 비해 N-아세틸뉴라민산 함량이 약 14배 높으면서도 S-NANA 0.5중량% 처리군에서 IL-8 생성이 NG-NANA 0.5중량% 처리군과 대비하여 약간 높은 수준으로 나타났다. 따라서 실시예 1의 NG-NANA는 헬리코박터 파이로리 감염에 의해 유도, 생성되는 IL-8의 생성량을 감소시킴으로써 위염의 발생율도 감소시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

아래에 본 발명의 제조예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하기 위한 것이다.

제조예 1: 약학적 제제의 제조

1-1. 산제의 제조

실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 500 ㎎

유당 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충전하여 산제를 제조한다.

1-2. 정제의 제조

실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 500 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캅셀제의 제조

실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 500 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 500 ㎎

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-5. 액제의 제조

실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 100 ㎎

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충전하여 멸균시켜 액체를 제조한다.

제조예 2: 건강기능식품(분말형)의 제조

실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 0.13 ㎎

비타민 B₂ 0.15 ㎎

비타민 B₆ 0.5 ㎎

비타민 B₁₂ 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎎

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제조예 3: 건강기능식품( 음료형 )의 제조

실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

제조예 4: 건강기능식품( 츄잉검 )의 제조

껌베이스 20 %

설탕 76.36~76.76 %

실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 0.24~0.64 %

후르츠향 1 %

물 2 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.

제조예 5: 건강기능식품(밀가루 식품)의 제조

실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 0.5 내지 5 중량부를 밀가루 100 중량부에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

제조예 6: 건강기능식품(유제품)의 제조

실시예 1의 글라이코매크로펩타이드 효소분해물 5 내지 10 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

Claims (5)

1. 글라이코매크로펩타이드를 프로테아제(protease)에 의해 효소분해시킨 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 포함하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 총중량을 기준으로 N-아세틸뉴라민산이 5 내지 8 중량% 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
3. 글라이코매크로펩타이드를 프로테아제(protease)에 의해 효소분해시킨 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 포함하는 위염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
4. 글라이코매크로펩타이드를 프로테아제(protease)에 의해 효소분해시킨 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 포함하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 글라이코매크로펩타이드를 프로테아제(protease)에 의해 효소분해시킨 글라이코매크로펩타이드 효소분해물을 유효성분으로 포함하는 위염 예방 또는 치료용 약학 조성물.

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