KR101676325B1 - 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유기태화 칼슘 0.5 내지 5 중량% 및 N-아세틸뉴라민산 4 내지 8 중량%를 함유하는 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물은 N-아세틸뉴라민산과 비교했을 때, 위점막 세포에 손상을 가져오지 않으면서, 궤양과 같은 조직 손상에서 발견되는 대표적인 염증성 사이토카인 인터루킨 6(IL-6)가 유의적으로 감소되고, 헬리코박터 파이로리 억제 활성이 뛰어나다.

Description

유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법 {Compositions for prevention or treatment of Helicobacter pylori infection comprising glycomacropeptide hydrolysate with high content of organic calcium as an essential component, and preparation method thereof}
본 발명은 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
헬리코박터 파이로리는 1983년에 호주의 마샬(Marshall)과 워렌(Warren)에 의해 발견되었으며, 위염 및 위궤양 환자의 위점막 생검조식으로부터 그람음성의 만곡형 간균으로 관찰되어, B형 만성위염과 위십이지장 궤양을 유발시키며 위암발생의 일차적 결정요인으로 알려져 있다.
헬리코박터 파이로리는 요소 분해효소인 우레아제(urease)를 분비하여 위액내의 요소 1 분자를 가수분해하여 2분자의 암모니아를 형성한다. 우레아제가 인체 위장관 표피 세포에 헬리코박터 파이로리를 감염시키고, 군락형성(colonization)을 돕는 것에 대한 밀접한 관련성이 보고되어 있다.
상기 헬리코박터 파이로리의 활성을 저해하기 위해 항생제 요법이 사용될 수 있으나, 항생제의 부작용, 내성 균주의 출현, 재감염율을 예방할 수 없다는 등의 효율성이 떨어지는 문제가 있다.
한편 미네랄은 체내에서 합성될 수 없으므로 외부로부터 공급되어야 하며, 주로 염산염, 황산염, 질산염, 인산염, 탄산염 등의 무기태 미네랄의 형태로 공급되지만, 무기태 미네랄은 생체 이용율이 매우 낮다.
반면에 유기태 미네랄은 생체 이용율은 높지만 가격이 높거나 위생적인 문제로 인하여 식품, 의약, 사료, 비료 등의 미네랄 급원으로 널리 사용하는데에는 한계에 직면해 있다.
한국특허공보 제10-0513011호는 칼슘과 고분자 핵산물질을 결합시킨 가용성 칼슘-핵산물질 복합체를 제조하고 있으나, 연어 정소에서 추출한 고분자 핵산물질을 사용하여 위생상 문제가 있을 수 있고, 제조방법이 복잡하며, 생산비용은 높은 반면 생산수율이 낮고, 칼슘 이외의 다른 미네랄의 유기태화가 가능한지 불확실하다는 한계가 있었다.
또한 한국특허공보 제10-1166546호는 살균처리되지 않은 유청 분말에 칼슘을 결합시켜 유기태화 칼슘 강화 유단백질을 제조하고 있으나, 원료가 되는 살균처리되지 않은 유청 분말의 확보가 용이하지 않고, 생산수율이 낮으며, 가열 공정이 포함되어 에너지 비용이 상승하고, 칼슘 이외의 다른 미네랄의 유기태화가 가능한지 불확실하다는 한계가 있었다.
본 발명의 목적은 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료 활성을 갖는 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 유기태화 칼슘 0.5 내지 5 중량% 및 N-아세틸뉴라민산 4 내지 8 중량%를 함유하는 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물은 탄소수 6 내지 12의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물을 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 유기태화 칼슘 0.5 내지 5 중량% 및 N-아세틸뉴라민산 4 내지 8 중량%를 함유하는 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 탄소수 6 내지 12의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물을 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 글라이코마크로펩타이드 분말 100 중량부와 염화칼슘 분말 5 내지 500 중량부를 혼합한 후, 상기 염화칼슘 분말의 1 내지 50배 중량의 물을 혼합하여 반응시키는 제1반응 단계; 및 상기 제1반응 단계의 반응물에 뉴라미니다아제를 첨가하여 효소반응시키는 제2반응 단계;를 포함하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료 활성을 갖는 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법을 제공한다.
상기 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법은 상기 제1반응 단계의 반응물에 에탄올 또는 에탄올 수용액을 혼합하여, 혼합물의 에탄올 농도를 55 내지 95 중량%로 조정하여 에탄올 혼합물을 얻고, 상기 에탄올 혼합물로부터 침전물을 얻은 후, 상기 침전물에 뉴라미니다아제를 첨가하여 효소반응시키는 제2반응 단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물은 N-아세틸뉴라민산과 동일 용량으로 동물에 투여할 때, 위점막 세포에 손상을 가져오지 않으면서, N-아세틸뉴라민산에 비해 궤양과 같은 조직 손상에서 발견되는 대표적인 염증성 사이토카인 인터루킨 6(IL-6)가 유의적으로 감소되고, 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물에 함유된 N-아세틸뉴라민산의 함량은 훨씬 낮음에도 불구하고 헬리코박터 파이로리 억제 활성은 동등하게 나타났다.
또한 본 발명의 유기태와 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물과 탄소수 6 내지 12의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물을 함께 투여될 경우, 헬리코박터 파이로리 억제 활성이 현저히 증진되어, 위점막 세포의 손상 가능성을 현저히 낮은 농도로 투여 농도를 낮추면서 헬리코박터 파이로리를 효과적으로 억제할 수 있다.
도 1의 A는 농도별로 에탄올을 혼합한 시료의 사진이고, B는 A의 시료를 원심분리 한 후의 사진으로, 1은 제조예 1-1, 2는 제조예 2-7, 3은 제조예 2-6, 4는 제조예 2-5, 5는 제조예 2-4, 6은 제조예 2-3, 7은 제조예 2-2 및 8은 제조예 2-1의 사진이다.
도 2의 좌측 사진은 제조예 3-1, 우측 사진은 제조예 3-2이고, A는 GMP와 염화칼슘 분마을 혼합하고 물을 혼합하여 60 분 동안 교반한 제1단계 반응물의 사진이며, B는 제1단계 반응물에 반응물과 에탄올의 중량비율이 4:6이 되도록 에탄올을 혼합하고 원심분리한 후의 사진이고, C는 침전물을 동결건조한 후의 사진이며, D는 상등액을 동결건조한 후의 사진이다.
도 3는 제조예 4에서 상기 N-아세틸뉴라민산의 함량을 측정한 크로마토그램을 나타낸 것으로, A는 반응전의 글라이코마크로펩타이드(GMP), B는 제조예 4-1의 효소반응 5 시간째의 생성물, C는 제조예 4-2의 효소반응 5 시간째 생성물이다.
도 4는 제조예 4에서 입도 분석 결과를 나타낸 그래프로서, A는 반응전의 글라이코마크로펩타이드(GMP), B는 제조예 4-1의 효소반응 5 시간째의 생성물, C는 제조예 4-2의 효소반응 5 시간째 생성물이다.
도 5는 제조예 4에서 XRD를 통해 결정구조분석을 실시한 것으로, A는 반응전의 글라이코마크로펩타이드(GMP), B는 제조예 4-1의 효소반응 5 시간째의 생성물, C는 제조예 4-2의 효소반응 5 시간째 생성물이다.
도 6의 A는 제조예 5에서 제1단계 반응 후의 사진이고, B는 제1단계 반응물에 에탄올을 혼합하고 원심분리한 후의 사진이다. 1부터 4까지는 각각 제조예 5-1-1부터 제조예 5-1-4이다.
도 7은 실험예 2에서, A는 무처리구, B는 GMP 처리군, C는 S-NANA 처리군, D는 CaNANA-GMP 처리군의 24 시간 배양 후의 플레이트 사진이고, 2-1부터 2-4까지는 GMP를 각각 0.05, 0.1, 0.5 및 2 중량% 첨가한 플레이트이고, 3-1부터 3-2까지는 S-NANA를 각각 0.05, 0.1, 0.5 및 2 중량% 첨가한 플레이트이고, 4-1부터 4-2까지는 CaNANA-GMP를 각각 0.05, 0.1, 0.5 및 2 중량% 첨가한 플레이트이다.
도 8은 실험예 3에서, 제조예 5-1-3의 유기태 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물, N-아세틸뉴라민 및 카프릭산 에스터의 헬리코박터 파이로리 SS-1-passed-5 균주에 대한 농도별 항균활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 실험예 4에서 헬리코박터 파이로리 감염 예방 및 치료 효과를 각각 확인하기 위한 실험 설계를 나타낸 도면이다.
도 10은 실험예 4에서 안와채혈하여 모은 혈액에서 각 실험군의 IL-6, IL-1, TNF-α, IL-10 함량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 실험예 4에서 예방군의 위 조직을 H&E로 염색한 사진이다. A는 음성 대조군, B는 헬리코박터 파이로리를 감염시킨 양성 대조군, C는 S-NANA 실험군이고 D는 CaNANA-GMP 단독 실험군이다.
도 12는 치료군에서의 위 조직을 H&E로 염색한 사진이다. A는 음성 대조군, B는 헬리코박터 파이로리를 감염시킨 양성 대조군, C는 S-NANA 실험군이고 D는 CaNANA-GMP 단독 실험군이다.
본 발명은 글라이코마크로펩타이드 분말 100 중량부와 염화칼슘 분말 5 내지 500 중량부를 혼합한 후, 상기 염화칼슘 분말의 1 내지 50배 중량의 물을 혼합하여 반응시키는 제1반응 단계; 및 상기 제1반응 단계의 반응물에 뉴라미니다아제를 첨가하여 효소반응시키는 제2반응 단계;를 포함하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료 활성을 갖는 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법을 제공한다.
상기 글라이코마크로펩타이드는 카파-카제인의 친수성 부분으로, 이를 분리하는 방법은 산업적으로 잘 확립되어 있다. 예를 들어 치즈의 제조를 위해 우유로부터 카제인 분획을 분리하거나 또는 우유를 응유효소, 예를 들어 송아지 키모신("레닛")과 배양시킨다. 키모신은 상기 카파-카제인의 Phe(105)-Met(106) 펩타이드 결합을 매우 선택적으로 절단하므로, 상기 효소 반응에 의해 상기 카파-카제인의 친수성 글라이코마크로펩타이드 부분을 절단하며 이에 의해 상기 카제인 분획이 즉시 응집되고 침전된다. 이때 카파-카제인의 글라이코마크로펩타이드 부분이 잘라짐에 따라, 친수성 글라이코마크로펩타이드는 용액 중에서 다양한 유청 단백질들과 함께 남아 소위 치즈 또는 스위트 유장을 형성한다. 상기 치즈 또는 스위트 유장의 다른 유청단백질로부터 글라이코마크로펩타이드가 분리될 수 있다.
상기 글라이코마크로펩타이드 분말의 유단백 함량은 50 내지 100 중량%, 바람직하게는 75 내지 95 중량%으로, 원료의 종류, 제조방법 및 제조사에 따라 유단백 함량은 변화할 수 있다.
상기 글라이코마크로펩타이드 분말에 포함된 유단백 100 중량부에 대하여, 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말인 염화칼슘 분말 5 내지 500 중량부, 바람직하게는 20 내지 250 중량부, 더욱 바람직하게는 50 내지 150 중량부 첨가된다. 상기 염화칼슘 분말 함량이 상기 하한치 미만이 경우에는 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물에서 유기태화 칼슘 함량을 원하는 수준으로 증가시키는데에 한계가 있고, 상기 상한치를 초과하더라도 칼슘의 유기태화에 소요되는 기질인 유단백 함량이 한계에 다다를 수 있어 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물에서 유기태화 칼슘 함량이 더 증가하지 않고, 투입된 무기태 칼슘 대비 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드의 생산수율이 오히려 감소한다.
상기 물은 식품, 의약, 사료 또는 비료나 그 첨가제에 사용되는 물이면 특별히 제한할 필요가 없으나, 바람직하게는 다른 금속염의 영향을 적게하기 위해 탈이온수를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 제1반응 단계에서 혼합하는 물의 양은 상기 염화칼슘 분말의 1 내지 50 배, 바람직하게는 5 내지 40 배, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 배이다. 상기 혼합하는 물의 양이 너무 적은 경우 상기 글라이코마크로펩타이드 분말과 염화칼슘 분말을 용해시키기 어려울 수 있고, 혼합하는 물의 양이 너무 많을 경우 염화칼슘 분말과 물의 혼합에 따른 발열 반응이 충분치 못하여 별도의 가열 공정이 필요하게 되므로 제조비용이 상승할 수 있다.
상기 염화칼슘 분말은 용해엔탈피가 음성으로, 물에 용해되어 발열반응을 일으키면서 칼슘과 유단백질의 킬레이트 결합이 형성될 수 있도록 한다.
염화칼슘 분말은 CaCl2 , CaCl2·H2O, CaCl2·2H2O 일 수 있다.
상기 제1반응 단계의 반응은 10 내지 100 ℃에서 10 분 내지 5일 동안 수행될 수 있다. 별도의 가열처리 없이 상온에서 반응시킬 수 있고, 별도의 가열처리가 없더라도 제1반응은 염화칼슘 분말과 물의 혼합에 따른 발열 반응의 반응열에 의해 반응 온도가 상승한다. 별도의 가열처리 없이 반응시켜 얻은 제1반응 단계의 반응물은 반응물의 생성을 육안으로 확인하기 어렵지만 원심분리, 예를 들어 500 내지 50,000 rpm에서 1 내지 60 분 원심분리를 통해 명확한 침전을 형성하지는 않지만 하부에 겔상이 형성된다.
상기 제1반응 단계의 반응을 50 내지 100 ℃, 바람직하게는 70 내지 90 ℃에서 가열할 경우, 반응물은 원심분리를 하지 않더라도 겔상의 반응물을 형성한다.
상기 제1반응 단계의 가열처리하지 않은 반응물 또는 가열처리한 반응물은 원심분리, 예를 들어 500 내지 50,000 rpm에서 1 내지 60 분 원심분리를 통해 침전물과 상등액이 명확히 구별되지 않고 뿌연 흰색 겔상이 형성된다.
본 발명에서 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 생산수율을 증대시키기 위해서 상기 제1반응 단계의 반응물에 에탄올 또는 에탄올 수용액을 혼합하여, 혼합물의 에탄올 농도를 55 내지 95 중량%, 바람직하게는 60 내지 80 중량%로 조정하는 에탄올 혼합 단계를 수행한다.
상기 하한치의 에탄올 농도 이상에서 제1반응 단계의 반응물이 겔상을 유지하여 명확히 침전물로 분리되기 용이하고, 상기 상한치의 에탄올 농도 이하로 사용할 때 다음 공정에서 에탄올 제거에 비용이 감소한다.
상기 에탄올로는 주정을 사용할 수 있고, 상기 에탄올 수용액은 70 내지 100 중량%의 에탄올을 함유하는 에탄올 수용액, 바람직하게는 75 내지 98 중량%의 에탄올을 함유하는 에탄올 수용액을 사용할 수 있다.
상기 제2반응 단계의 침전물 또는 그 침전물을 물로 희석한 희석액에 잔류하는 에탄올 함량은 5 중량% 이하, 바람직하게는 0.001 내지 2 중량% 이하로 잔류 에탄올 농도를 낮추어야 뉴라미니다아제 활성에 미치는 영향을 최소화할 수 있다.
상기 제2반응 단계의 침전물에서 잔류 에탄올 함량을 낮추기 위해 특별히 한정할 필요는 없으나, 감압 또는 건조 등의 방법이 활용될 수 있다.
상기 제2반응 단계에서 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 생산수율 증대를 위해 10 내지 65 ℃, 바람직하게는 35 내지 55 ℃에서 반응시킨다. 상기 반응 온도의 상한치를 초과하거나 상기 하한치 미만이 될 경우 뉴라미니다아제의 활성이 낮아, N-아세틸뉴라민산의 함량이 저하되고, 이에 따라 항균 활성이 저하될 수 있다.
더욱 바람직하게는 상기 제2반응 단계는 글라이코매크로펩타이드 3 내지 10 중량% 함유하는 제1반응 단계의 반응물에 글라이코매크로펩타이드 단위 g 당 0.05 내지 0.5 U의 뉴라미니다아제를 투입하여 pH 4 내지 6에서 35 내지 55 ℃에서 2 내지 10 시간 반응시킨 후 효소를 실활시켜 효소분해물을 제조한다.
상기 제1반응 단계 및 상기 제2반응 단계에서 반응 시간은 15 분 내지 5 일, 바람직하게는 20 분 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 25 분 내지 12 시간, 가장 바람직하게는 30분 내지 2 시간이다. 상기 제1반응 단계의 반응시간이 상기 범위를 벗어나면 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물에서 킬레이트된 칼슘 함량이 감소할 수 있고, 상기 제2반응 단계의 반응시간이 상기 범위를 벗어나면 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 N-아세틸뉴라민산의 함량이 저하될 수 있다.
염화칼슘 분말을 사용하는 경우 칼슘이 킬레이트화되는 양이 증가함에 따라 염소 이온의 함량이 증가한다. 이러한 증가된 염소 이온은 물로 세척하는 공정으로 간단히 제거될 수 있다. 예를 들어 염화칼슘 분말을 용해하기 위해 사용된 물의 부피의 0.5 내지 10 배의 물, 바람직하게는 1 내지 2 배의 물을 사용하여 1 내지 5회 반복 세척을 통해 염소 이온의 농도를 무해한 수준으로 낮출 수 있다. 상기 세척은 적절한 양의 물을 첨가한 후 원심분리하여 상등액을 제거하는 방식, 예를 들어 500 내지 50,000 rpm에서 1 내지 60 분 원심분리할 수 있고, 이러한 원심분리과정은 온도 조건 설정없이 실온에서 수행될 수 있으나, 25 ℃ 이하, 바람직하게는 15 ℃ 이하로 온도를 일정하게 설정하여 수행될 수 있다.
본 발명은 유기태화 칼슘 0.5 내지 5 중량% 및 N-아세틸뉴라민산 4 내지 8 중량%를 함유하는 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물을 유효성분으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
유기태화 칼슘의 함량은 글라이코마크로펩타이드에 포함된 유단백질과 염화칼슘 분말의 혼합비율 등 제1반응 단계를 조절함으로써 조절할 수 있고, 헬리코박터 파이로리 억제 활성을 증진시키기 위한 유기태화 칼슘의 함량은 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물에서 0.5 내지 5 중량%, 바람직하게는 1 내지 4.5 중량%, 더욱 바람직하게는 2 내지 4 중량%이다.
N-아세틸뉴라민산 함량은 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드에 첨가하는 뉴라미나다아제의 첨가비율이나 반응시간 등의 제2반응 단계를 조절함으로써 조절할 수 있고, 헬리코박터 파이로리 억제 활성을 위한 N-아세틸뉴라민산 함량은 4 내지 8 중량%, 바람직하게는 5 내지 7.5 중량%, 더욱 바람직하게는 6 내지 7 중량%이다. 본 발명에서의 상기 N-아세틸뉴라민산 함량은 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물에 함유된 유리 N-아세틸뉴라민산 함량이다.
한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 본 발명의 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물이 헬리코박터 파이로리 감염의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타내는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 탄소수 6 내지 12의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물을 더 포함할 수 있다.
상기 탄소수 6 내지 12의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물은 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물 100 중량부에 대하여 1 내지 80 중량부, 바람직하게는 5 내지 40 중량부, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 중량부 첨가하는 것이 헬리코박터 파이로리 항균 활성의 상승 작용에 바람직하다.
상기 탄소수 6 내지 10의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물은 카프로익산, 카프릴릭산, 카프릭산 및 그 에스터 화합물이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 카프릭산 또는 카프릭산의 에스터 화합물이고, 가장 바람직하게는 카프릭산의 에스터 화합물이다.
상기 본 발명의 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물은 열풍건조, 분무건조, 동결건조 등 적절한 방법을 통해 건조시켜 분말 형태로 이용하는 것이 사용에 편리하다.
본 발명의 약학 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학 조성물은 1일 0.0001 내지 0.03 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에서, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에서 상기 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드의 가수분해물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드의 가수분해물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량%로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
음료를 제조하는 경우 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드의 가수분해물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 글라이코매크로펩타이드의 효소분해물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드의 가수분해물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 본 발명을 참고예, 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: 제1반응 단계의 반응온도에 따른 킬레이트된 미네랄 분석
1) 시료의 제조방법
치즈 제조 후 생성되는 유청을 농축 후 건조하여 제조된 유청분말(매일유업, 이하 'WPS'라고도 함)을 시료로 사용하였다. 상기 유청분말의 단백질 함량은 14 중량%, 지방 함량은 7 중량%, 회분 함량은 0.5 중량%, 나머지는 탄수화물이었고, 상기 유청분말은 5 분 이상의 가열 또는 살균 처리를 행하지 않은 것이었다.
상기 WPS를 물에 25 중량%로 희석하여 혼합하고, 대조군은 WPS(CNTL)은 가열처리하지 않고, 나머지는 각각 60, 70, 80 및 90 ℃로 30 분간 가열하여, WPS가 보유한 고유의 미네랄의 킬레이트화 정도를 비교하였다. 상기 가열처리한 실험군은 25 ℃에서 3,000rpm으로 20분 원심분리에 의해 침전물과 상등액으로 구분되었다. 상기 침전물에 2 배 중량의 정제수를 혼합 및 교반한 후 상기 조건과 동일하게 원심분리하는 세척과정을 5회 반복한 후 동결건조하였다.
2) 실험결과
상기 각각의 실험군에 함유된 미네랄 함량은 IPC방법으로 통해 분석하여 표 1에 나타내었다.
Figure 112015044256911-pat00001
가열처리하지 않은 WPS(CNTL)에 포함된 WPS 고유 미네랄 함량은 칼슘 4,700ppm, 칼륨 21,910ppm, 마그네슘 988ppm, 망간 6,776ppm, 인 6,620ppm, 그리고 황 1,327ppm으로 총 42,363ppm이 검출되었고, 나머지 미네랄들은 10ppm 미만이었다.
가열온도에 따른 킬레이트된 미네랄의 함량은 80 ℃ 처리군이 96,616ppm으로WPS(CNTL) 대비 2.28배의 증가하였고, 70 ℃ 처리군(91,898ppm)은 2.17배, 90 ℃ 처리군(81,413ppm)은 1.92배, 그리고 60 ℃ 처리군(77,991ppm)은 1.84배 순이였다.
WPS(CNTL) 대비 나트륨을 제외한 모든 미네랄 수치가 현저히 증가하였다. 먼저 칼슘의 경우 WPS(CNTL) 대비 4.7 내지 8 배 증가되었고, 철은 5 내지 44 배, 아연은 5.5 내지 9.4 배, 구리는 1.36 내지 105 배, 그리고 마그네슘은 2.6 내지 3.8 배 등 전체적으로 현저히 증가하였다.
따라서 제1반응 단계는 50 내지 100 ℃, 바람직하게는 70 내지 90 ℃에서 수행될 수 있고, 이는 본 참고예 1과 같이 별도의 가열처리를 통해 상기 온도에서 반응이 이루어질 수도 있지만, 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말이 별도로 첨가되는 경우 상기 미네랄과 물의 발열반응에 따른 반응온도의 증가로도 상기 조건은 달성될 수 있을 것으로 예상되었다.
참고예 2: 제1반응 단계의 반응시간에 따른 킬레이트된 미네랄 분석
1) 시료의 제조방법
상기 참고예 1에서 가장 높은 미네랄 킬레이트 활성을 나타내었던 80 ℃로 반응온도를 설정하고, 반응시간은 10, 30, 60, 120 및 180 시간으로 늘려가면서 가열하여, WPS가 보유한 고유의 미네랄의 킬레이트화 정도를 비교하였다. 상기 가열처리한 실험군은 참고예 1과 동일하게 원심분리 및 세척 후 동결건조하였다.
2) 실험결과
상기 각각의 실험군에 함유된 미네랄 함량은 IPC방법으로 통해 분석하여 표 2에 나타내었다.
Figure 112015044256911-pat00002
가열시간 10분째까지는 총 미네랄 함량에서 거의 변화가 없었으나, 30 분째에는 WPS에 비해서 킬레이트된 미네랄 함량이 1.94 배로 증가하였다가, 60 분, 120 분, 180 분까지 시간이 증가하면서 1.84 배, 1.79 배, 1.75 배로 서서히 감소하였다.
따라서 가열시간은 적어도 10 분을 초과하여 15 분 이상, 바람직하게는 20 분 이상, 더욱 바람직하게는 30 분 이상 처리하는 것이 바람직하고, 그 이상 가열처리할 수도 있으나, 가열시간이 길어지면 오히려 킬레이트되는 미네랄 함량이 오히려 감소하는 것을 알 수 있었다.
참고예 3: 제1반응 단계에서 탈지분유 기질 및 가열처리 여부에 따른 킬레이트된 미네랄 분석 및 생산수율 확인
1) 시료의 제조방법
유기태화 기질로 유청분말 대신 탈지분유(단백질 함량 35 중량%)를 사용하는 것이 가능한지 확인하였고, 제1반응 단계의 반응조건에서 80 ℃에서 30분 동안 가열처리한 실험군과 별도의 가열처리하지 않은 실험군으로 나누어 유기태화 미네랄 강화 유단백질을 제조하였다.
탈지분유 10 중량부(유단백 기준 3.5 중량부)와 수용성 미네랄 분말로 염화칼슘 분말[CaCl2·2H2O, Junsei, 일본], 황산제1철[FeSO4·7H2O, Yakuri Pure Chemical] 분말, 황산아연[ZnSO4·7H2O, 빅솔, 한국] 분말, 황산동[CuSO4·5H2O, Yakuri Pure Chemical] 분말 및 이산화셀레늄[SeO2] 분말 중에서 선택되는 각각의 미네랄 분말 5 중량부를 분말 혼합하고, 상기 분말 혼합물에 물 100 중량부를 혼합하여 500 rpm으로 10 분 동안 교반하고, 80 ℃에서 30 분 동안 150 rpm으로 교반한 가열처리 실험군과 500 rpm으로 10 분 동안 교반하고, 30 분 동안 150 rpm으로 교반한 비열처리 실험군으로 구분하였다. 상기 반응물은 참고예 1과 동일하게 원심분리할 경우 침전물과 상등액으로 분리되었고, 얻어진 침전물을 원심분리 및 세척 후 동결건조하였다.
상기 제조된 유기태화 미네랄 강화 유단백질은 '(사용한 미네랄)-(가열여부)(사용한 유제품)'으로 나타내었고, 사용한 미네랄에서 'M'은 상기 5종의 미네랄을 각 1 중량부씩 혼합하여 5 중량부 사용한 것이다.
2) 실험결과
상기 각각의 실험군에 함유된 미네랄 함량은 IPC방법으로 통해 분석하여 비열처리 실험군은 표 3에, 가열처리 실험군은 표 4에 나타내었다.
Figure 112015044256911-pat00003
SMP는 침전물 획득이 불가능하여 생산수율이 0% 이었고, Ca-NHSMP, Fe-NHSMP 및 Cu-NHSMP는 침전물은 생성되었으나 생산수율은 2 % 미만으로 정확한 측정이 어려웠다. 그러나 Zn-NHSMP와 Se-NHSMP 그리고 5종의 미네럴을 복합 처리한 M-NHSMP처리구는 32.8%, 28.9% 그리고 77.9%의 높은 생산수율을 보였다.
SMP에 함유된 칼슘은 10,800ppm, 철은 4ppm, 아연은 31.6ppm, 구리는 0ppm, 셀레늄은 4.61ppm 등을 나타내었다.
Ca-NHSMP는 생산수율은 낮았지만 칼슘 함량이 70,520 ppm으로 SMP의 약 7 배이상 증가하였고, 역시 생산수율이 낮았던 Fe-NHSMP의 경우도 철 함량이 14,000 ppm으로 약 3,500배, Cu-NHSMP는 구리 함량이 약 36,000ppm이상으로 현저히 증가하였다.
생산수율이 약 33%로 높았던 Zn-NHSMP는 아연 함량이 16,000ppm으로 SMP 대비 약 508배, Se-NHSMP는 56,310ppm으로 약 13,000배 이상을 상회하였으며, 가장 높은 생산수율(77.9%)을 보였던 복합미네랄 처리군인 M-NHSMP의 경우는 5종 미네럴중 칼슘은 59,690ppm, 철은 12,910ppm 그리고 셀레늄의 함유량이 47,900ppm으로 높게 나타났는데 아연과 구리이온의 경우는 낮게 나타남으로서, 투입된 미네랄들에서 이온경쟁성을 나타내는 것으로 추정되었다.
상기 결과로부터 제1반응 단계에서 칼슘, 철, 구리 미네랄 분말의 경우 생산수율이 낮았지만, 제조된 유기태화 미네랄 강화 유단백질은 현저히 증진된 미네랄 함량을 나타내므로, 생산수율만 증진시킬 수 있다면 제1반응 단계를 비열처리 조건으로 수행하는 것도 가능할 것으로 판단하였다.
제1반응 단계를 비열처리가 아닌 가열처리하였을 때의 킬레이트된 미네랄 함량과 생산수율을 확인하였다.
Figure 112015044256911-pat00004
비열처리 조건에서 생산수율이 2 % 미만으로 측정이 어려웠던, 칼슘, 철, 구리의 경우에도 가열처리 조건에서는 Ca-HSMP는 41.4%, Fe-HSMP 42.8% 그리고 Cu-HSMP처리구는 39%로 생산수율이 현저히 증가하였음을 확인하였다.
그러나 비열처리 조건에서 이미 생산수율이 높았던 아연, 셀레늄 및 복합미네랄에서는 Zn-HSMP 41.8%, Se-HSMP 32.8%, M-HSMP 84%로 비열처리 조건에 비해 5 내지 10 % 정도의 생산수율 증가만 확인할 수 있었다.
따라서 제1반응 단계에서 가열처리를 생산수율 향상은 생산수율이 낮았던 특정 미네랄에서만 효과가 크게 나타났다.
또한 가열처리 조건과 비열처리 조건의 킬레이트된 미네랄 함량을 비교한 결과 미네랄을 단독으로 사용했을 때에는 가열처리 조건이 생산수율은 증가하지만 해당 미네랄의 킬레이트된 함량은 오히려 감소하는 경향을 나타내었고, 유일하게 복합미네랄을 혼합한 M-HSMP에서만 비열처리 조건에 비해 가열처리 조건에서 칼슘은 28%(76,780ppm), 철은 33%(17,150ppm), 아연은 83%(567ppm), 구리는 73%(3,570ppm) 그리고 셀레늄의 경우는 36%(65,330ppm)으로 증가하는 것을 알 수 있었다.
다만 비열처리 조건에서 킬레이트되었던 구리는 가열처리 조건인 Cu-HSMP에서 구리가 검출되지 않아 오히려 가열처리 조건에서 제거됨을 알 수 있었다.
상기 결과로부터 유청분말은 물론 유단백을 함유한 탈지분유 역시 유기태화 미네랄 강화 미네랄 제조의 기질로 활용할 수 있음을 확인하였고, 제1반응 단계에서는 생산수율에 차이가 있을 수는 있으나 가열처리 조건은 물론 비열처리 조건도 미네랄의 킬레이트화는 진행되므로 비열처리 조건으로 진행하는 것도 가능함을 확인하였다.
제조예 1: 제1반응 단계에서 글라이코마크로펩타이드 기질 및 가열처리 여부에 따른 성상 확인
1) 시료의 제조방법
치즈 유청으로부터 얻은 단백질 함량 80 중량%인 글라이코마크로펩타이드(이하, 'GMP'라고도 함) 분말 100 g 및 염화칼슘 분말[CaCl2·2H2O, Junsei, 일본] 20 g을 혼합하고, 상기 분말 혼합물에 물 200 g을 혼합하여 500 rpm으로 60 분 동안 교반하여 제1단계 반응물(제조예 1-1)을 제조하였다.
상기 제조예 1-1과 동일하게 제조하되 500 rpm에서 60 분 동안 교반한 후 80 ℃에서 30 분 동안 150 rpm으로 교반하여 제1단계 반응물(제조예 1-2)를 제조하였다.
2) 실험결과
상기 제조예 1-1 및 1-2의 반응물은 25 ℃에서 3,000rpm으로 20분 원심분리하여, 원심분리 전과 후의 성상을 비교하여 표 5에 나타내었다. 성상 평가(침전, 용해, 응고, 부착, 겔화 현상)를 비교하였는데, 매우심함(+++), 심함(++), 초기현상 발생(+), 변화없음(-)으로 구분하여 결과를 확인하였다.
구분 성상 평가(원심전/원심후) 혼합 30분 후온도(℃)
침전 응고 부착 부유 겔화 색상
제조예1-1 ++/+ +/- +/+ ++/- -/+++ 투명/흰색 55
제조예1-2 -/- -/- +/+ +++/- +++/+++ 흰색/흰색 55
상기 제조예 1-1의 제1단계 반응물은 원심분리 전에는 약간의 침전이 있는 투명 액상이었으나, 원심분리 후 침전물과 상등액이 명확히 구분되지 않는 겔상을 형성함이 확인되었고, 제조예 1-2의 제1단계 반응물은 원심분리 전부터 겔상을 형성하고 있었다.
제조예 2: 제1반응 단계의 반응물의 에탄올 첨가 비율에 따른 성상, 생산수율 및 유기태화 미네랄 함량 확인
1) 시료의 제조방법
상기 제조예 1-1의 제1단계 반응물에 에탄올을 첨가하여 에탄올 첨가 비율에 따른 성상, 생산수율 및 유기태화 미네랄 함량을 측정하였다.
상기 제조예 1-1의 제1단계 반응물과 에탄올의 중량비율이 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7 및 2:8이 되도록, 에탄올을 혼합하였다(각각 제조예 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6 및 2-7).
2) 실험결과
도 1의 A는 농도별로 에탄올을 혼합한 시료의 사진이고, B는 A의 시료를 원심분리 한 후의 사진으로, 1은 제조예 1-1, 2는 제조예 2-7, 3은 제조예 2-6, 4는 제조예 2-5, 5는 제조예 2-4, 6은 제조예 2-3, 7은 제조예 2-2 및 8은 제조예 2-1의 사진이다.
상기 제조예 2-1 내지 및 2-7의 반응물에 에탄올을 첨가한 후 500 rpm에서 10분 동안 혼합하고, 25 ℃에서 3,000rpm으로 20분 원심분리하여, 원심분리 전과 후의 성상을 비교하여 표 8에 나타내었다.
생산수율은 상기 원심분리 후, 침전물이 형성된 시료에 대해 침전물 대비 2 배 정도의 정제수를 혼합 및 현탁하여 25 ℃에서 3,000 rpm으로 20분 원심분리하는 세척 과정을 5 회 실시하여 최종 동결건조후 생산물의 무게를 최초 사용된 기질인 글라이코마크로펩타이드 무게에 대비하여 중량%로 계산하여 표 6에 함께 나타내었다.
구분 성상 평가(에탄올혼합후/에탄올혼합후 원심후) 생산수율(%)
침전 응고 부착 부유 겔화 색상
제조예1-1 ++/+ +/- +/+ ++/- -/+++ 투명/흰색 NT
제조예2-1 -/+ +++/+++ -/- -/- ++/+ 흰색/흰색 NT
제조예2-2 -/- +++/+++ -/- -/- +++/+++ 흰색/흰색 NT
제조예2-3 -/- +++/+++ -/- -/- +++/+++ 흰색/흰색 NT
제조예2-4 -/- +++/+++ -/- -/- +++/+++ 흰색/흰색 NT
제조예2-5 -/+++ +/- +/- -/- +++/- 흰색/투명 122.4
제조예2-6 -/+++ +/- +/- -/- +++/- 흰색/투명 119.0
제조예2-7 -/+++ -/- +/- -/- ++/- 흰색/투명 112.0
에탄올의 중량비가 60 중량% 이상인 제조예 2-5의 반응물부터 원심분리 후 침전이 명확히 형성되었으며, 상기 침전물을 세척 및 원심분리를 반복하여 생산수율을 확인한 결과 최초 기질인 글라이코마크로펩타이드의 대부분이 침전물을 형성하였음을 확인할 수 있었다.
상기 제조예 2-5, 2-6 및 2-7의 반응물의 유기태화 칼슘 함량을 글라이코마크로펩타이드(GMP)와 비교하여 IPC 분석을 통해 표 7에 나타내었다.
Figure 112015044256911-pat00005
상기 제조예 2-5 내지 2-7의 제1반응 단계 반응물은 글라이코마크로펩타이드에 비해서 유기태 칼슘의 함량이 1000 내지 2000 배 증가하였고, 전체 인(P)과 황(S)를 포함한 전체 미네랄 함량 역시 30 % 이상 증가하였음을 확인하였다.
제조예 3: 제1반응 단계의 반응물의 가열 여부에 따른 성상, 생산수율 및 유기태화 미네랄 함량 확인
1) 시료의 제조방법
상기 제조예 2에서 생산 수율과 유기태화 칼슘의 함량이 적합했던 제조예 2-5의 에탄올 혼합비율을 이용하여, 글라이코마크로펩타이드(이하, 'GMP'라고도 함) 분말 66 g 및 염화칼슘 분말[CaCl2·2H2O, Junsei, 일본] 13 g을 혼합하고, 상기 분말 혼합물에 물 267 g을 혼합하여 500 rpm으로 60 분 동안 교반하여 제1단계 반응물(346g)에 에탄올 519 g을 혼합한 후(제조예 3-1), 성상을 평가하고, 25 ℃, 4000 rpm에서 20 분 동안 원심분리한 후 다시 성상을 평가하고, 침전물과 상등액을 구분하여 각각의 무게를 측정하여 생산 수율을 계산하고, 이들 각각에 킬레이트된 미네랄 함량을 IPC 분석하였다.
상기 제조예 3-1과 동일하게 제1단계 반응에서 500 rpm에서 60 분 동안 교반한 후 80 ℃에서 30 분 동안 150 rpm으로 교반하여 가열처리한 후, 다시 동일하게 에탄올을 혼합하여 제조예 3-2를 제조하고 평가하였다.
2) 실험결과
도 2의 좌측 사진은 제조예 3-1, 우측 사진은 제조예 3-2이고, A는 GMP와 염화칼슘 분마을 혼합하고 물을 혼합하여 60 분 동안 교반한 제1단계 반응물의 사진이며, B는 제1단계 반응물에 반응물과 에탄올의 중량비율이 4:6이 되도록 에탄올을 혼합하고 원심분리한 후의 사진이고, C는 침전물을 동결건조한 후의 사진이며, D는 상등액을 동결건조한 후의 사진이다.
상기 제조예 3-1 및 3-2의 제1단계 반응물에 에탄올을 첨가하여 500 rpm에서 10분 동안 혼합하고, 25 ℃에서 4,000rpm으로 20분 원심분리하여, 원심분리 전과 후의 성상을 비교하여 표 8에 나타내었다.
침전물의 생산수율은 상기 원심분리 후, 침전물이 형성된 시료에 대해 침전물 대비 2 배 정도의 정제수를 혼합 및 현탁하여 25 ℃에서 3,000 rpm으로 20분 원심분리하는 세척 과정을 5 회 실시하여 최종 동결건조후 생산물의 무게를 최초 사용된 기질인 글라이코마크로펩타이드 무게에 대비하여 중량%로 계산하여 표 10에 함께 나타내었다. 상등액의 생산수율은 상등액을 바로 동결전조하여 생산물의 무게를 최초 사용된 기질인 글라이코마크로펩타이드 무게에 대비하여 중량%로 계산하였다.
구분 성상 평가(에탄올혼합후/에탄올혼합후 원심후) 생산수율(%)
침전 응고 부착 부유 겔화 색상
제조예3-1 -/+++ +/- +/- -/- +++/- 흰색/투명 침전물 117%
상등액 12.6%
제조예3-2 -/+++ +/- +/- -/- +++/- 흰색/투명 침전물 95%
상등액 13.6%
에탄올의 중량비가 60 중량%가 되도록 혼합한 제조예 3-1 및 3-2는 제1반응 단계에서 가열처리 여부에 관계없이, 최초 기질인 글라이코마크로펩타이드의 대부분이 침전물을 형성하였음을 확인할 수 있었다.
상기 제조예 3-1 및 3-2의 제1단계 반응물의 에탄올 침전물의 유기태화 미네랄 함량을 글라이코마크로펩타이드(GMP)와 비교하여 IPC 분석을 통해 표 9에 나타내었다.
Figure 112015044256911-pat00006
상기 제조예 3-1 및 3-2의 제1단계 반응물의 에탄올 침전물은 제1단계 반응에서 가열처리 여부에 관계없이 글라이코마크로펩타이드에 비해서 유기태 칼슘의 함량이 1500 배 정도 증가하였다.
제조예 4: 제2반응 단계의 반응물의 반응시간에 따른 N- 아세틸뉴라민산 함량, 입도 및 XRD 분석
1) 시료의 제조방법
상기 제조예 3에서 제조한 제조예 3-1 및 3-2의 침전물의 동결건조 분말, 대조군으로 글라이코마크로펩타이드(GMP) 분말을 각각 7 중량%로 희석한 후, 0.2 U/g의 뉴라미니다아제 1 중량%를 첨가하여 55 ℃에서 5 시간 제2반응 단계를 수행하였다. 상기 반응물은 열풍건조하여 각각 제조예 4-1 및 4-2, 대조군인 글라이코마크로펩타이드 가수분해물(GMPH) 분말로 하였다.
2) 실험결과
상기 시료 제조과정에서 효소반응 0 시간, 3 시간 및 5 시간째에 각각 N-아세틸뉴라민산 함량을 표 10에 나타내었다.
효소반응시간(hr) GMPH 제조예 4-1 제조예 4-2
0 0 0 0
3 63,209 ppm 46,814 ppm 44,550 ppm
5 67,577 ppm 67,224 ppm 66,493 ppm
GMP에서 생성될 수 있는 이론적인 최대 N-아세틸뉴라민산의 생성량은 70,000 ppm으로 GMP를 기질로 했을 때는 효소반응 3 시간만에 90 % 이상의 N-아세틸뉴라민산이 생성되었다. 그러나 유기태화 칼슘이 킬레이트된 글라이코마크로펩타이드를 기질로 이용한 제조예 4-1 및 4-2에서는 3 시간 경에는 65 % 내외가 생성되었고, 5 시간 경에 95 % 이상의 생성되었다.
도 3은 상기 N-아세틸뉴라민산의 함량을 측정한 크로마토그램을 나타낸 것으로, A는 반응전의 글라이코마크로펩타이드(GMP), B는 제조예 4-1의 효소반응 5 시간째의 생성물, C는 제조예 4-2의 효소반응 5 시간째 생성물이다.
도 4는 입도 분석 결과를 나타낸 그래프로서, A는 반응전의 글라이코마크로펩타이드(GMP), B는 제조예 4-1의 효소반응 5 시간째의 생성물, C는 제조예 4-2의 효소반응 5 시간째 생성물이다. GMP의 평균 입자크기는 1249 ㎛이었으나, 제조예 4-1 및 4-2의 효소반응 생성물은 평균 입자크기가 16-19 ㎛로 현저히 감소하였다.
도 5는 XRD를 통해 결정구조분석을 실시한 것으로, A는 반응전의 글라이코마크로펩타이드(GMP), B는 제조예 4-1의 효소반응 5 시간째의 생성물, C는 제조예 4-2의 효소반응 5 시간째 생성물이다. 제조예 4-1 및 4-2의 효소반응 생성물은 GMP와 달리 칼슘의 킬레이트화에 따른 특이적인 피크를 형성함을 확인할 수 있다.
제조예 5: 제1반응 단계의 수용성 칼슘의 첨가량, 다른 수용성 미네랄 첨가 및 복 합미네날 첨가에 따른 유기태화 미네랄 함량 및 N- 아세틸뉴라민산 함량 분석
1) 시료의 제조방법
표 11의 제조방법으로 제1반응 단계 및 에탄올 혼합 단계를 수행하였다.
Figure 112015044256911-pat00007
제조예 5-1-1 내지 5-1-4는 염화칼슘 분말[CaCl2·2H2O, Junsei, 일본]의 첨가량을 감소시켜 가면서 제조한 칼슘이 킬레이트된 글라이코마크로펩타이드(Ca-GMP)을 제조한 것이다.
상기 제1반응 단계 및 에탄올 혼합 단계를 수행하여 얻은 제조예들의 침전물을 동결건조하여 분말화시키고, 분말을 각각 7 중량%로 희석한 후, 0.2 U/g의 뉴라미니다아제 1 중량%를 첨가하여 55 ℃에서 5 시간 제2반응 단계를 수행하였다.
2) 실험결과
도 6의 A는 제1단계 반응 후의 사진이고, B는 제1단계 반응물에 에탄올을 혼합하고 원심분리한 후의 사진이다. 1부터 4까지는 각각 제조예 5-1-1부터 제조예 5-1-4이다.
상기 제조예들의 제1단계 반응물에 에탄올을 첨가하여 500 rpm에서 10분 동안 혼합하고, 25 ℃에서 4,000rpm으로 20분 원심분리하여, 원심분리 전과 후의 성상을 비교하여 표 14에 나타내었다. 또한 생산수율은 상기 원심분리 후, 침전물이 형성된 시료에 대해 침전물 대비 2 배 정도의 정제수를 혼합 및 현탁하여 25 ℃에서 3,000 rpm으로 20분 원심분리하는 세척 과정을 5 회 실시하여 최종 동결건조후 생산물의 무게를 최초 사용된 기질인 글라이코마크로펩타이드 무게에 대비하여 중량%로 계산하여 표 12에 함께 나타내었다.
Figure 112015044256911-pat00008
상기 결과 제조예 5-1-1에서 거품이 발생하는 점을 제외하고는 모든 제조예에서 큰 문제는 발생하지 않았다.
생산수율 면에서는 제조예 5-1-1은 생산수율은 높았으나 원심분리를 통한 침전물의 분리에 다소 어려움이 있었다.
상기 제조예들의 유기태화 미네랄 함량을 IPC 분석을 통해 표 13에 나타내었다.
Figure 112015044256911-pat00009
제조예 5-1-1 내지 5-1-4에서는 염화칼슘 분말의 사용량이 감소함에 따라 킬레이트된 칼슘의 함량이 감소함을 알 수 있었다.
상기 제1반응 단계, 에탄올 혼합 단계 및 제2반응 단계를 수행하여 얻은 분말의 N-아세틸뉴라민산 함량을 분석하여 표 14에 나타내었다.
Figure 112015044256911-pat00010
상기 결과 미네랄의 킬레이트 양에 관계없이 제2반응 단계를 통해 5 시간 효소반응시 일정한 N-아세틸뉴라민산이 생성됨을 확인하였다.
실험예 1: 에탄올 혼합 단계의 에탄올 잔류 농도에 따른 제2반응 단계의 N- 아세틸뉴라민산 생성 능력 차이 확인
제조예 5-1-1의 제1반응 단계 및 에탄올 혼합 단계에서는 생성된 침전물을 건조하면서 에탄올이 제거되고, 이를 물로 7 중량%로 희석하므로 에탄올의 잔류 농도는 0.1 중량% 미만이다. 그러나 상기 에탄올 혼합 단계의 침전물을 건조하지 않고 바로 물로 희석할 경우 에탄올의 잔류 농도는 1-2 중량%까지 높아질 수 있으므로, 제조예 5-1-1의 침전물의 건조물에 물로 희석할 때를 대조군으로, 각각 5 중량%, 10 중량% 및 20 중량%의 에탄올 수용액으로 희석하여 제2반응 단계를 제조예 5-1-1과 동일하게 수행하고 이때의 N-아세틸뉴라민산의 함량을 측정하여 표 15에 나타내었다.
Figure 112015044256911-pat00011
에탄올 5 중량% 함유 에탄올 수용액으로 제2반응 단계를 수행한 경우 대조군에 비해 다소 낮은 N-아세틸뉴라민산 생성능을 나타내었으나, 효소반응에 큰 영향을 주지 않았으나, 에탄올 농도가 높아지면서 N-아세틸뉴라민산의 생성능은 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 유기태 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 헬리코박터 파 이로리 P1WT 균주에 대한 항균능력 확인
제조예 5-1-3의 유기태 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물(N-아세틸뉴라민산 6.3 중량%, 유기태화 칼슘 3.1 중량%, 이하 'CaNANA-GMP'라고도 함), 순도 98 중량%의 N-아세틸뉴라민산 표준품(이하, 'S-NANA'라고도 함) 및 글라이코마크로펩타이드(GMP)의 헬리코박터 파이로리 P1WT에 대한 항균활성을 확인하였다.
헬리코박터 파이로리 P1WT는 페트리 디쉬에 브루셀라 브로쓰를 멸균하고 60 ℃이하로 식힌 후 항생제 vancomycin 10㎍/㎖, trimethoprim 5㎍/㎖, nystatin 1㎍/㎖와 10% FBS를 첨가한 브로쓰를 8 ㎖ 넣고 배양된 헬리코박터 파이로리를 1㎖ 넣어 37℃, 10% CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다.
상기 배양한 헬리코박터 파이로리를 3000rpm, 20min, 4℃ 원심분리 후 상층액 브로쓰를 제거하고 PBS로 H. pylori 펠릿을 풀어준 후 96 웰 플레이트에 100㎕ 넣어 분관광도계를 이용하여 OD 600 nm에서 0.6을 맞춘 후 사용하였다.
헬리코박터 파이로리 균수(CFU)는 각각의 물질을 농도별로 희석하여 6 웰 플레이트에 2㎖씩 넣고 OD 600nm를 0.6으로 맞춘 헬리코박터 파이로리를 50㎕씩 넣고 37℃, 10% CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다. 상기 배양 후 OD 600 nm에서 흡광도를 측정하고, 브루셀라 아가에 Brucella Agar에 50㎕씩 넣어 접종한 후 37℃, 10% CO2 배양기에서 4~5일간 배양 후 콜로니를 계수하여 표 16에 나타내었다.
Figure 112015044256911-pat00012
도 7의 A는 무처리구, B는 GMP 처리군, C는 S-NANA 처리군, D는 CaNANA-GMP 처리군의 24 시간 배양 후의 플레이트 사진이고, 2-1부터 2-4까지는 GMP를 각각 0.05, 0.1, 0.5 및 2 중량% 첨가한 플레이트이고, 3-1부터 3-2까지는 S-NANA를 각각 0.05, 0.1, 0.5 및 2 중량% 첨가한 플레이트이고, 4-1부터 4-2까지는 CaNANA-GMP를 각각 0.05, 0.1, 0.5 및 2 중량% 첨가한 플레이트이다.
글라이코마크로펩타이드(GMP)는 전혀 항균 활성을 나타내지 않았고, 합성 N-아세틸뉴라민산(S-NANA)와 제조예 5-1-1의 유기태 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드(CaNANA-GMP)에서는 0.5 중량%에서 헬리코박터 파이로리 균주에 대해 동등한 항균 활성을 나타내었다.
그러나 CaNANA-GMP는 S-NANA에 비해서 1/14 미만의 N-아세틸뉴라민산 함량을 갖는다는 점에서 CaNANA-GMP의 항균 효과는 단순한 N-아세틸뉴라민산에 의한 것이 아닌 복합적인 작용에 의한 것임을 암시하고 있었다.
실험예 3: 유기태 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 헬리코박터 파 이로리 SS -1- passed -5 균주에 대한 항균능력 확인
헬리코박터 SS-1-passed-5 의 균주로 knrrc 연구소재은행 헬리코박터 은행에서 분양받았고, 분양받은 균주는 Brucella medium(보성사이언스)에 항생제를 첨가하여 배양하였다.
제조예 5-1-3의 유기태 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물(N-아세틸뉴라민산 6.3 중량%, 유기태화 칼슘 3.1 중량%, 이하 'CaNANA-GMP'라고도 함), 순도 98 중량%의 N-아세틸뉴라민산 표준품(이하, 'S-NANA'라고도 함) 및 카프릭산 에스터(이하, '700'이라고 함, 순도 100%)의 헬리코박터 파이로리 SS-1-passed-5 균주에 대한 항균활성을 확인하여 도 8에 나타내었다.
S-NANA는 0.1 중량%부터 유의성있는 항헬리코박터 효과를 나타내었고, 농도 증가에 따른 항헬리코박터의 활성의 증가는 크지 않았다. CaNANA-GMP 는 0.25 중량% 이상의 농도부터 항생효과를 보였고 0.5 중량%에서는 S-NANA 0.1 내지 0.5 중량%와 동등한 항헬리코박터 활성을 나타내었다. CaNANA-GMP에는 N-아세틸뉴라민산이 6.3 중량%만 포함되었다는 것을 고려하면, CaNANA-GMP 0.5 중량%에 함유된 N-아세틸뉴라민산의 함량은 약 0.03 % 정도로 S-NANA에 비해 1/3 정도의 N-아세틸뉴라민산을 함유했음에도 동등한 항헬리코박터 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
한편 계면활성제인 카프릭산 에스터(700) 0.01 내지 0.1 중량%에서 유의적인 항헬리코박터 활성을 나타내지는 않았으나, CaNANA-GMP 0.5 중량%에 카프릭산 에스터 0.05 내지 0.1 중량%를 함께 첨가했을 때 항헬리코박터 활성이 유의적으로 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 동물실험을 통한 헬리코박터 파이로리 감염 예방 및 치료 효과 확인
(1) 실험방법
실험예 3에서 헬리코박터 파이로리 억제 활성이 유의적으로 확인된 S-NANA 0.5 중량%, CaNANA-GMP 0.5 중량%, 'CaNANA-GMP 0.5 중량% 및 카프릭산 에스터 0.05 중량% 복합'을 실험군으로 도 9에 나타낸 실험 설계로 헬리코박터 파이로리 감염 예방 및 치료 효과를 각각 확인하였다. 음성대조군은 생리식염수만 투여하였고, 양성대조군은 헬리코박터 파이로리만 투여하였다.
예방 효과 확인시험에서는 헬리코박터 파이로리와 시료를 1 주일 동안 3회 구강 투여하고, 일주일 후에는 매일 시료를 구강 투여하였다.
치료 효과 확인시험에서는 헬리코박터 파이로리만 1주일 동안 3회 구강투여하여 헬리코박터 파이로리에 감염시키고, 일주일 후 시료만 매일 3 주 동안 구강 투여하였다.
실험동물은 6 주령된 ICR 웅성을 오리엔트 바이오(대전)로부터 구입하여 일주일간 적응시킨 뒤 사용하였고, 단국대학교 실험동물윤리위원회에 따른 법규를 준수하여 사육하였다. 각각의 실험군에서 시료는 매일 고정된 시간에 시료를 구강 투여하였다.
각각의 실험군이 종료되는 시점 전날 쥐들은 절식시켰고 희생 당일 안와채혈로 혈액을 채취하고 CO2 에 질식사시켰다. 희생된 쥐의 위, 간, 비장을 각각 채취하여 간과 비장은 동결보관하여 고구려 대학에 이관하여, 상기 조직은 중성 포르말린에 3일 이상 두었다가 파라핀 포매를 거쳐 블록으로 보관한 후 실험에 사용하였다.
(2) 실험결과: 체중
이틀에 한번씩 체중 측정하였다. 모든 S-NANA 실험군을 제외한 모든 실험군에서 유사한 체중 증가율을 나타내었다. 그러나 S-NANA 실험군은 다른 실험군과 달리 오히려 실험 시작시의 체중에서 5 % 정도 감소하였다.
(3) 실험결과: 염증성 싸이토카인
안와채혈하여 모은 혈액은 2,500 rpm에서 20분간 원심분리하여 혈청만 따로 분리하고 -80 ℃에 보관하였다가 ELISA 분석 당일 각각의 분석 버퍼에 4배씩 희석하여 사용하였다. ELISA kit는 R&D (Minneapolis, MN, USA) 제품을 사용하였고 IL-6, IL-1, TNF-α, IL-10 총 4 가지를 분석하여 도 10에 나타내었다.
인터루킨 6(IL-6)의 경우 CaNANA-GMP 단독, CaNANA-GMP 및 카프릭산 에스터 복합의 예방군과 치료군 모두 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 또한 CaNANA-GMP 단독, CaNANA-GMP 및 카프릭산 에스터 복합 실험군은 S-NANA 실험군에 비해서도 유의하게 감소하였다. IL-6는 T 세포와 대식 세포에 의해 염증으로 이끌어 내는 외상, 특히 화상이나 궤양 같은 조직 손상에서 발견되는 대표적인 염증인자로서, Th-2 세포에서 분비되는 IL-6는 정상적 면역환경에서는 항체 생성을 적절히 자극하지만, Th cell이 과잉 활성화되는 등 면역체계 균형이 나빠지면 체내 각종 염증 반응, 앨러지 반응 및 자가 면역계 질환 등의 발현과정에 있어 최대 염증 반응 인자가 된다.
인터루킨 1β(IL-1β)의 경우 CaNANA-GMP 단독, CaNANA-GMP 및 카프릭산 에스터 복합의 예방군과 치료군 모두 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. IL-1는 염증의 진행 과정에서 체온을 상승시켜 병원체 증식을 억제하거나 살상시키는 대표적 싸이토카인이지만, IL-1이 지속적으로 증가되면 IL-6 생산을 촉진하여 염증 반응을 더욱 악화시킬 수 있는 물질로 알려져 있다.
TNF-α는 헬리코박터 파이로리 감염 양성 대조군에 비교하여 S-NANA 실험군은 다소 증가하는 경향을 나타내고, 이와는 달리 CaNANA-GMP 단독, CaNANA-GMP 및 카프릭산 에스터 복합 실험군은 다소 감소하는 경향을 나타내기는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았다. 이는 뒤의 위 조직 병리 결과에서도 나오겠지만 헬리코박터 파이로리 감염에 의한 궤양 자체가 대식세포의 침윤을 유도하지 않기 때문인 것으로 추정된다.
궤양 등의 조직손상은 빠른 수복을 위한 대식세포 침윤이 제일 먼저 유도되는데 헬리코박터 파이로리에 감염된 위 조직 어디에도 대식세포 침윤은 확인할 수 없었다. 이것은 궤양 수복을 위한 대식세포의 활성화를 헬리코박터 파이로리 가 저해하여 TNF-α 나 IL-10 의 생성을 억제하는 것으로 추정된다. 이는 IL-10에서도 CaG-NANA 및 카프릭산 에스터 복합 실험군 중 치료군을 제외하고는 모든 실험군에서 높게 나온 결과로부터도 추정할 수 있다.
다만 CaG-NANA 및 카프릭산 에스터 복합 실험군 중 치료군에서 IL-10 이 낮은 이유는 면역 균형이 정상수준으로 돌아왔기 때문에 IL-10 발현이 억제된 것으로 추정된다.
(4) 실험결과: 위 조직 병리 결과
도 11 및 도 12는 각각 예방군 및 치료군에서의 위 조직을 H&E로 염색한 사진이다. 파라핀에 포매된 위 블록을 4 ㎛ 두께로 절삭하고 H&E 염색 후 100배에서 촬영하였다. A는 음성 대조군, B는 헬리코박터 파이로리를 감염시킨 양성 대조군, C는 S-NANA 실험군이고 D는 CaNANA-GMP 단독 실험군이다.
정상의 위 조직(도 11 및 도 12의 A)은 점막의 상피세포부터 아섬유조직을 거쳐 아래부분의 근조직까지 손상없이 고르게 주름이 분포되어 있으나 헬리코박터 파이로리에 의해 궤양이 발생하면 위 점막의 손실로 근조직이 드러나게 된다(도 11 및 도 12 B의 노란 동그라미 친 부분).
그러나 궤양이 발생하였음에도 불구하고 혈관부위로부터 대식세포가 유출되어 손상부위에 집결을 하였거나 점막부위의 손상에 의한 출혈은 전혀 발견할 수 없었다.
예방군(도 11)과 치료군(도 12)에서 D의 CaNANA-GMP 단독 실험군은 점막 상피가 약간 손상되긴 하였으나 정상대조군과 거의 비슷한 형태를 유지하고 있으며 기저부위도 완벽하게 정상이었다.
그러나 C의 S-NANA 실험군은 치료군으로 사용되었을 경우 점막세포 손상을 약간 나타내었다.
아래에 본 발명의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하기 위한 것이다.
<제제예 1> 약학 제제의 제조
1-1. 산제의 제조
제조예 5-1-3의 CaNANA-GMP 500 ㎎
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
제조예 5-1-3의 CaNANA-GMP 500 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캅셀제의 제조
제조예 5-1-3의 CaNANA-GMP 500 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-4. 주사제의 제조
제조예 5-1-3의 CaNANA-GMP 500 ㎎
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-5. 액제의 제조
제조예 5-1-3의 CaNANA-GMP 100 ㎎
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액체를 제조한다.
<제제예 2> 건강기능식품 제제의 제조
2-1. 분말 제제의 제조
제조예 5-1-3의 CaNANA-GMP 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎎
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
2-2. 음료형 제제의 제조
제조예 5-1-3의 CaNANA-GMP 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
2-3. 츄잉검의 제조
껌베이스 20 %
설탕 76.5 %
제조예 5-1-3의 CaNANA-GMP 0.5 %
후르츠향 1 %
물 2 %
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.
2-4. 유제품의 제조
제조예 5-1-3의 CaNANA-GMP 5 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

Claims (6)

  1. 유기태화 칼슘 0.5 내지 5 중량% 및 N-아세틸뉴라민산 4 내지 8 중량%를 함유하는 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드의 뉴라미니다아제 효소분해물을 유효성분으로 하고, 헬리코박터 파이로리 생육 억제 활성을 가지며, 염증성 사이토카인 인터루킨-6를 감소시키는, 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 탄소수 6 내지 12의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물을 더 포함하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 유기태화 칼슘 0.5 내지 5 중량% 및 N-아세틸뉴라민산 4 내지 8 중량%를 함유하는 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드의 뉴라미니다아제 효소분해물을 유효성분으로 하고, 헬리코박터 파이로리 생육 억제 활성을 가지며, 염증성 사이토카인 인터루킨-6를 감소시키는, 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 탄소수 6 내지 12의 중쇄지방산 또는 그 에스터 화합물을 더 포함하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 글라이코마크로펩타이드 분말에 포함된 유단백 100 중량부에 대하여 염화칼슘 분말 5 내지 500 중량부를 혼합한 후, 상기 염화칼슘 분말의 1 내지 50배 중량의 물을 혼합하여 반응시키는 제1반응 단계; 및 상기 제1반응 단계의 반응물에 뉴라미니다아제를 첨가하여 효소반응시키는 제2반응 단계;를 포함하고,
    유기태화 칼슘 0.5 내지 5 중량% 및 N-아세틸뉴라민산 4 내지 8 중량%를 함유하며,
    헬리코박터 파이로리 생육 억제 활성을 가지며, 염증성 사이토카인 인터루킨-6를 감소시키는, 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료 활성을 갖는 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 제1반응 단계의 반응물에 에탄올 또는 에탄올 수용액을 혼합하여, 혼합물의 에탄올 농도를 55 내지 95 중량%로 조정하여 에탄올 혼합물을 얻고, 상기 에탄올 혼합물로부터 침전물을 얻은 후, 상기 침전물에 뉴라미니다아제를 첨가하여 효소반응시키는 제2반응 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 감염 예방 또는 치료 활성을 갖는 유기태화 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법.
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KR101166546B1 (ko) * 2009-11-20 2012-07-19 매일유업주식회사 유기태화 칼슘 함유량이 높은 유단백질의 제조방법
KR20130008833A (ko) * 2011-07-13 2013-01-23 매일유업주식회사 Ｎ―아세틸뉴라민산을 포함하는 글리코마크로펩티드 뉴라미니다아제 분해물을 유효성분으로 하는 천연 항균제 조성물

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Simon PM, et al., Infect Immun., Vol. 65(2), pages 750-757 (1997.02. 공개)* *

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