KR20210041604A - pH 선택성을 보이는 조건부 활성 단백질 - Google Patents

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Abstract

(i) 돌연변이를 모 폴리펩티드에 도입하여 모 폴리펩티드를 진화시킴으로써, 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 더 낮은 pI를 보이는 돌연변이 폴리펩티드를 제조하는 단계; (ii) 이 돌연변이 폴리펩티드를 대상으로 정상 생리학적 조건하에서 제1 검정을 실시하여, 돌연변이 폴리펩티드의 정상 생리학적 조건하에서의 활성을 측정하고, 비정상 조건하에서 제2 검정을 실시하여, 돌연변이 폴리펩티드의 비정상 조건하에서의 활성을 측정하는 단계[단 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건은 동일하되, 값은 상이한 조건임]; 및 (iii) 제1 검정에서의 활성에 비하여 제2 검정에서의 동일 활성 증가를 보이는 조건부 활성 폴리펩티드를 돌연변이 폴리펩티드로부터 선택하는 단계를 포함하는, 모 폴리펩티드로부터 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공된다. 또한 조건부 활성 폴리펩티드와 용도도 제공된다.

Description

pH 선택성을 보이는 조건부 활성 단백질
본 발명은, 조건부 활성을 보이는 폴리펩티드 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 pH 의존적 활성을 보이는 조건부 활성 폴리펩티드와, 이 조건부 활성 폴리펩티드를 모 폴리펩티드로부터 제조하는 방법에 관한 것이다.
단백질, 특히 효소 또는 항체가 상이한 조건하에서 활성을 보이거나 안정화되도록 이 단백질을 다양한 특징에 대해 진화시키기 위한 방법을 기술한 많은 문헌이 있다. 예를 들어 효소는 더 높은 온도에서 안정화되도록 진화되어 왔다. 고온에서 효소 활성 개선이 있는 경우에, 개선의 실질적 부분은 Q10 룰에 의해 공통적으로 기술되는 더 높은 운동 활성의 결과이며, 효소의 경우에 매 10℃의 증가에 대해 산출량이 배가되는 것으로 평가된다.
더욱이, 단백질의 정상 작동 조건하에서 이 단백질을 탈 안정화함으로써, 정상 작동 조건하에서 해당 단백질 활성을 감소시키는 자연 돌연변이가 존재한다. 예를 들어 낮은 온도에서는 활성이긴 하지만, 통상적으로 돌연변이체의 기원이 되는 야생형 단백질의 활성에 비하여 감소한 수준으로 활성인, 공지의 온도 돌연변이체가 존재한다.
비정상 조건에서의 활성과 동일하거나 더 우수한 활성을 유지하면서, 보통의 작업 조건에서 모 폴리펩티드를 비활성 또는 사실상 비활성(50%, 30% 또는 10% 미만의 활성, 특히 1%의 활성)이 되도록 진화시키는 것은, 탈안정화 돌연변이(들)가, 탈안정화 효과에 반대작용을 하지 않는 활성 증가 돌연변이(들)와 공존할 것을 필요로 한다. 탈안정화 돌연변이(들)는 Q10과 같은 표준 룰에 의해 예측되는 효과보다 큰 폴리펩티드의 활성을 감소시키므로, 예를 들어 정상 작업 조건하에 덜 활성화되거나 비활성화되면서 비정상 조건에서 효율적으로 작업하는 단백질을 진화시키는 능력은, 조건부 활성 폴리펩티드를 제조해 낼 것으로 예측된다.
조건부로 활성인 폴리펩티드, 예를 들어 어떤 조건에서는 실질적으로 활성이 더 작거나 비활성이지만, 다른 조건에서는 활성인 폴리펩티드를 제조하는 것이 요망된다. 또한 임의의 환경에서 활성 또는 비활성이거나, 아니면 시간이 경과함에 따라서 활성화되거나 비활성화되는 폴리펩티드를 제조하는 것도 요망된다. 온도 이외에, 폴리펩티드가 조건부 활성에 대해 진화되거나 개선될 수 있는 다른 조건은 pH, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스 및 전해질 농도를 포함한다. 또한 폴리펩티드의 활성에 더하여, 진화 동안 다른 특성, 예를 들어 화학적 저항성 및 단백 분해 저항성을 개선하는 것이 종종 요망된다.
또한, 폴리펩티드의 등전점(pI)은 폴리펩티드의 반감기(t1/2)와 역으로 상관되어 있음이 관찰된 바 있다[문헌(Momany et al.,"Relationship between in vivo degradative rates and isoelectric points of proteins," PNAS, vol., 73, pp. 3093-3097, 1976) 참조]. 혈장 중 항체의 반감기는 자체의 등전점 값과 양으로 상관되어 있기 때문에, 이는, 특히 항체의 경우 그러하다. 특히 pI 값이 더 높은 항체는 pI 값이 더 낮은 항체에 비해 전신 제거율(clearance)이 더 클 뿐 아니라, 생체내 이용률이 더 낮다. 항체의 pI 값이 1 유닛 내지 2 유닛 감소하는 것은 혈장 중 제거율 감소(즉 반감기 증가)와 상관되어 있는 것으로 보였다. 문헌[Ryman, CPT Pharmacometrics Syst. Pharmacol., vol. 6, pp. 576-588, 2017]을 참조한다.
폴리펩티드의 pI를 변경시키기 위한 전략들이 기술된 바 있다. 예를 들어 미국 특허 제9,908,932호에는 pI가 약 5.45 내지 약 6.55인 단백질 하위군을 7개 가지는 재조합 단백질의 등전 프로필을 바꾸는 방법이 개시되어 있다. 이 방법은, (a) 제1 시기 동안 생성물을 생산하기 충분한 조건하에서 재조합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 생산용 바이오리액터 내에서 배양하는 단계; 및 (b) 적어도 6시간으로 이루어진 제2 시기 동안 생성물의 등전 프로필을 더욱 산성인 프로필로 바꾸기 충분한 조건하에 이 생성물을 항온처리하는 단계를 포함한다. 등전 프로필이 바뀐 생성물은 7개의 단백질 하위군중 4번째 및 5번째로 산성이 큰 단백질 하위군 양의 증가와, 7개의 단백질 하위군중 1번째 및 2번째로 염기성이 큰 단백질 하위군 양의 감소를 보인다.
미국 특허 제9,605,061호에는 중쇄 불변 도메인 및 경쇄 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되는 불변 도메인내 비 원산 아미노산으로의 치환을 비롯하여 아미노산 돌연변이 적어도 6개를 도입함으로써 항체의 pI를 변경하기 위한 방법이 개시되어 있다. 치환되는 아미노산은 그 pI가 원산 아미노산의 pI보다 더 낮으므로, 돌연변이 항체의 pI는 모 항체의 pI에 비하여 적어도 0.5 로그만큼 낮아진다.
US 2009/0324589는, 가변 영역의 잔기들을 비롯해 항체 표면에 노출된 잔기들을 변경함으로써 항체의 표면 전하를 제어하여 혈중 IgG 항체의 반감기를 증가시키기 위한 방법을 개시하고 있다. 이 방법은, (a) FcRn 결합 도메인을 포함하는 모 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 변경하여, 모 폴리펩티드 표면에 노출된 아미노산 잔기 적어도 1개의 전하를 바꾸는 단계; (b) 이 변경된 핵산을 발현하도록 숙주 세포를 배양하여, 돌연변이 폴리펩티드가 발현되도록 만드는 단계; 및 (c) FcRn 결합 도메인을 포함하도록 발현된 돌연변이 폴리펩티드를 숙주 세포 배양액으로부터 수집하는 단계를 포함한다.
특정의 환경에서, 그리고/또는 특정의 조건하에 활성 및/또는 선택성이 더 크고, 바람직하게는 혈장중 반감기가 증가한 조건부 활성 폴리펩티드는 여전히 필요한 실정이다. 반감기도 또한 증가한 조건부 활성 폴리펩티드는 비정상 조건이 조성된 병소, 예컨대 종양 미세환경에서 우선적으로 작용할 것일 뿐 아니라, 자체의 반감기 증가로 말미암아 전반적인 활성의 증가 또는 연장된 작용을 제공하기도 할 것이다. 뿐 아니라, 이 조건부 활성 폴리펩티드는 우선적으로 정상 조직/장기(즉 정상 생리학적 조건이 조성된 조직/장기)에 대해서는 덜 유해한 부작용을 일으킬 것이다. 부작용 감소 잠재성은 고용량 조건부 활성 폴리펩티드 또는 더 연장된 조건부 활성 폴리펩티드 치료를 허용하여, 더 큰 효능을 달성할 것이다
WO 2010/104821 및 WO 2011/009058은, 조건부 활성 단백질을 진화 및 스크리닝하기 위한 방법을 개시한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 모 폴리펩티드로부터 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, (i) 돌연변이 1개 이상을 모 폴리펩티드에 도입하여 모 폴리펩티드를 진화시킴으로써, 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 더 낮은 pI를 보이는 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상을 제조하는 단계, (ii) 이 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상을 대상으로 정상 생리학적 조건하에서 제1 검정을 실시함으로써 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상의 정상 생리학적 조건하에서의 활성을 측정하고, 비정상 조건하에서 제2 검정을 실시하여, 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상의 비정상 조건하에서의 활성을 측정하는 단계[단 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건은 동일하되, 그 값은 상이한 조건임], 그리고 (iii) 제1 검정에서의 활성에 비하여 제2 검정에서의 동일 활성 증가를 보이는 조건부 활성 폴리펩티드를 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상으로부터 선택하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
상기 구현예에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 pI가 모 폴리펩티드의 pI보다 더 낮을 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 7.4 이하의 pI, 또는 7.3 이하의 pI, 또는 7.2 이하의 pI, 또는 7.1 이하의 pI, 또는 7.0 이하의 pI를 보일 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 돌연변이 1개 이상은 모 폴리펩티드에 치환되어 들어간 아미노산의 pI보다 더 높은 pI를 보이는, 모 폴리펩티드내 아미노산 잔기에 대한 아미노산 잔기의 아미노산 치환 적어도 1개를 포함할 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 돌연변이 1개 이상은 상기 치환을 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 포함할 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 돌연변이 1개 이상은 모 폴리펩티드의 pI보다 더 낮은 pI를 보이는 아미노산 잔기의 삽입 적어도 1개를 포함할 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 돌연변이 1개 이상은 상기 삽입을 2개, 3개, 4개 또는 5개 포함할 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 돌연변이 1개 이상은 모 폴리펩티드의 pI보다 더 높은 pI를 보이는 아미노산 잔기의 결실 적어도 1개를 포함할 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 돌연변이 1개 이상은 상기 결실을 2개, 3개, 4개 또는 5개 포함할 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 돌연변이 1개 이상은 돌연변이 폴리펩티드의 표면상에 노출된 위치에 존재할 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 진화 단계는 추가 돌연변이 1개 이상을 돌연변이 폴리펩티드에 도입하는 것을 포함할 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나는, 단계 (ii) 이전에 돌연변이 폴리펩티드의 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%가 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 더 낮은 pI를 보임을 확인하기 위한 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 구현예는 단계 (ii) 이전에 pI가 모 폴리펩티드의 pI보다 더 높은 돌연변이 폴리펩티드를 폐기하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나는 조건부 활성 폴리펩티드의 pI를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 조건부 활성 폴리펩티드의 pI는 모 폴리펩티드의 pI보다 적어도 0.1 유닛, 또는 적어도 0.2 유닛, 또는 적어도 0.3 유닛, 또는 적어도 0.4 유닛, 또는 적어도 0.5 유닛, 또는 적어도 0.6 유닛, 또는 적어도 0.8 유닛, 또는 적어도 1.0 유닛, 또는 적어도 1.2 유닛, 또는 적어도 1.4 유닛, 또는 적어도 1.5 유닛, 또는 적어도 1.7 유닛, 또는 적어도 2.0 유닛, 또는 적어도 2.5 유닛, 또는 적어도 3.0 유닛, 또는 적어도 3.5 유닛, 또는 적어도 4.0 유닛, 또는 적어도 5.0 유닛 더 낮을 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 모 폴리펩티드는 항체, 효소, 호르몬, 성장 인자, 시토카인, 조절 단백질, 기능성 펩티드, 바이오시밀러(biosimilar), 면역 조절제, 수용체 및 리간드로부터 선택될 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 모 폴리펩티드는 전장 항체, 단일 사슬 항체, 항체 단편, 중쇄, 경쇄, Fab 및 Fc 도메인으로부터 선택되는 항체일 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 모 폴리펩티드는 치료용으로 개발되고 있는 후보 항체 또는 치료용 항체일 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 모 폴리펩티드는 IgG 항체일 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 돌연변이 1개 이상은 IgG 항체의 가변 영역에 있을 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 돌연변이 1개 이상은 IgG 항체의 불변 영역에 있을 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 돌연변이 1개 이상은 IgG 항체의 상보성 결정 영역 1개 이상에 있을 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 조건은 pH, 온도, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스 및 전해질 농도로부터 선택될 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 조건은 pH일 수 있다.
상기 구현예에서, 제1 검정의 pH는 7.2 이상 내지 7.6 미만일 수 있고, 제2 검정의 pH는 7.2 미만 또는 7.6 이상이다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 제2 검정에서의 조건부 활성 폴리펩티드의 활성 대 제1 검정에서의 동일 활성의 비는 적어도 1.3, 또는 1.5, 또는 적어도 1.7, 또는 적어도 2.0, 또는 적어도 3.0, 또는 적어도 4.0, 또는 적어도 6.0, 또는 적어도 8.0, 또는 적어도 10.0, 또는 적어도 20.0, 또는 적어도 40.0, 또는 적어도 60.0, 또는 적어도 100.0일 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 제1 검정과 제2 검정 둘 다는 분자량이 900 a.m.u. 미만, 500 a.m.u. 미만, 200 a.m.u. 미만, 또는 100 a.m.u. 미만인 분자 또는 이온이 존재할 때 수행될 수 있다.
상기 구현예들에서, 분자 또는 이온은 히스티딘, 히스타민, 수소화 아데노신 이인산염, 수소화 아데노신 삼인산염, 시트르산염, 중탄산염, 아세트산염, 젖산염, 이황화물, 황화수소, 암모늄, 인산이수소 및 이것들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다.
상기 구현예에서, 분자 또는 이온은 농도가 약 3 mM 내지 약 200 mM, 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 5 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 25 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM, 약 35 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 50 mM 내지 약 100 mM 범위인 중탄산염 이온일 수 있다.
상기 구현예에서, 분자 또는 이온은 농도가 1 mM 내지 100 mM, 2nM 내지 500 nM, 3 nM 내지 200 nM, 5 nM 내지 100 nM 범위인 이황화물 이온일 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 분자 또는 이온은 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 이황화나트륨 또는 이황화칼륨으로부터 선택될 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 생리학적 조건은 정상 생리학적 pH일 수 있고, 비정상 조건은 정상 생리학적 pH와 상이한 비정상 pH이며, 분자 또는 이온의 pKa는 정상 생리학적 pH와 비정상 pH 사이이다.
상기 구현예에서, 분자 또는 이온의 pKa는 비정상 pH로부터 0.1 유닛, 0.2 유닛, 0.3 유닛, 0.4 유닛, 0.5 유닛, 0.6 유닛, 0.8 유닛, 또는 1.0 유닛, 2.0 유닛 이하 떨어져 있을 수 있다.
제2 양상에서, 본 발명은 pI를 보이는 모 폴리펩티드로부터 유래한 조건부 활성 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 조건부 활성 폴리펩티드는 (a) 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 이보다 더 낮은 pI를 보이고, (b) 비정상 조건하 제2 검정에서의 활성 대 정상 생리학적 조건하 제1 검정에서의 동일 활성의 비가 적어도 1.3이되, 단 조건부 활성 폴리펩티드의 활성은 분자량이 900 a.m.u. 미만인 분자 또는 이온 적어도 1개의 존재하에서 측정된다.
제2 양상에서, 분자량은 500 a.m.u. 미만, 200 a.m.u. 미만, 또는 100 a.m.u. 미만일 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 비정상 조건하 제2 검정에서의 활성 대 정상 생리학적 조건하 제1 검정에서의 동일 활성의 비는 적어도 1.5, 또는 적어도 1.7, 또는 적어도 2.0, 또는 적어도 3.0, 또는 적어도 4.0, 또는 적어도 6.0, 또는 적어도 8.0, 또는 적어도 10.0, 또는 적어도 20.0, 또는 적어도 40.0, 또는 적어도 60.0, 또는 적어도 100.0일 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 조건부 활성 폴리펩티드의 pI는 모 폴리펩티드의 pI보다 적어도 0.1 유닛, 또는 적어도 0.2 유닛, 또는 적어도 0.3 유닛, 또는 적어도 0.4 유닛, 또는 적어도 0.5 유닛, 또는 적어도 0.6 유닛, 또는 적어도 0.8 유닛, 또는 적어도 1.0 유닛, 또는 적어도 1.2 유닛, 또는 적어도 1.4 유닛, 또는 적어도 1.5 유닛, 또는 적어도 1.7 유닛, 또는 적어도 2.0 유닛, 또는 적어도 2.5 유닛, 또는 적어도 3.0 유닛, 또는 적어도 3.5 유닛, 또는 적어도 4.0 유닛, 또는 적어도 5.0 유닛 더 낮을 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 항체, 효소, 호르몬, 성장 인자, 시토카인, 조절 단백질, 기능성 펩티드, 바이오시밀러, 면역 조절제, 수용체 및 리간드로부터 선택될 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 전장 항체, 단일 사슬 항체, 항체 단편, 중쇄, 경쇄, Fab 및 Fc 도메인으로부터 선택되는 항체일 수 있다.
상기 구현예에서, 항체는 IgG 항체일 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 조건은 pH, 온도, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스 및 전해질 농도로부터 선택될 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 정상 생리학적 조건은 7.2 이상 내지 7.6 미만의 범위의 pH일 수 있고, 비정상 조건은 5.5 내지 7.2 미만의 범위의 pH이다.
상기 구현예에서, 분자 또는 이온의 pKa는 정상 생리학적 pH 및 비정상 pH 사이일 수 있다.
상기 구현예에서, 분자 또는 이온의 pKa는 비정상 pH로부터 0.1 유닛, 0.2 유닛, 0.3 유닛, 0.4 유닛, 0.5 유닛, 0.6 유닛, 0.8 유닛, 또는 1.0 유닛, 2.0 유닛 이하 떨어져 있을 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 분자 또는 이온은 히스티딘, 히스타민, 수소화 아데노신 이인산염, 수소화 아데노신 삼인산염, 시트르산염, 중탄산염, 아세트산염, 젖산염, 이황화물, 황화수소, 암모늄, 인산이수소 및 이것들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 분자 또는 이온은 농도가 약 3 mM 내지 약 200 mM, 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 5 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 25 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM, 약 35 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 50 mM 내지 약 100 mM 범위인 중탄산염 이온일 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 분자 또는 이온은 농도가 1 mM 내지 100 mM, 2 nM 내지 500 nM, 3 nM 내지 200 nM, 5 nM 내지 100 nM 범위인 이황화물 이온일 수 있다.
상기 구현예들 중 임의의 하나에서, 분자 또는 이온은 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 이황화나트륨 또는 이황화칼륨으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 조건부 활성 폴리펩티드 유효량만큼과, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 고형 종양, 염증성 관절, 또는 뇌 질환이나 장애의 치료를 위한, 조건부 활성 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 고형 종양, 염증성 관절, 또는 뇌 질환이나 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 조건부 활성 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 고형 종양, 염증성 관절, 또는 뇌 질환이나 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
도 1은, 3개의 아미노산 잔기가 데옥시헤모글로빈의 T 4차 구조를 안정화하는 염 다리 2개를 형성함으로써, 산소에 대한 친화성 저하를 초래하는, 데옥시헤모글로빈 내 염 다리 형성을 보여주는 도해이다.
정의
본원에 제공된 실시예들의 이해를 돕기 위하여, 자주 등장하는 임의의 방법들 및/또는 용어들이 본원에 정의될 것이다. 하기 용어들의 정의들은 미국 특허 제8,709,755호 B2 전체를 참조로 하여 내려진다: "제제(agent)", "모호한 염기 요구조건", "아미노산", "증폭(amplification)", "키메라 특성(chimeric property)", "동족체(cognate)", "비교 윈도우(comparision window)", "보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)", "~에 상응하다", "분해 유효량", "한정된 서열 구조 틀", "한정된 서열 커널", "분해", "지향성 결찰(directional ligation)", "DNA 셔플링", "약물(drug)" 또는 "약물 분자", "유효량", "에피토프(epitope)", "효소", "진화(evolution)" 또는 "진화시키는 것(evolving)", "단편(fragment)" 또는 "유도체(derivative)" 또는 "유사체(analog)", "단일 아미노산 치환의 완전 범위", "유전자(gene)", "유전적 불안정성", "비 상동성(heterologous)", "상동성(homologous)" 또는 "부분 상동성(homeologous)", "산업적 응용", "동일한" 또는 "동일성", "동일성의 구역", "단리된(isolated)", "단리된 핵산", "리간드", "결찰(ligation)", "링커(linker)" 또는 "스페이서(spacer)", "미세환경", "진화될 분자 특성", "돌연변이(mutation)", "N,N,G/T", "정상 생리학적 조건" 또는 "야생형 작동 조건", "핵산 분자", "핵산 분자", "~를 암호화하는 핵산 서열" 또는 "~의 DNA 암호화 서열" 또는 "~를 암호화하는 뉴클레오티드", "효소(단백질)를 암호화하는 핵산" 또는 "효소(단백질)를 암호화하는 DNA" 또는 "효소(단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드", "특이적 행산 분자 종", "작업 핵산 샘플을 핵산 라이브러리로 조립하는 것", "핵산 라이브러리", "구성물", "올리고뉴클레오티드"(또는 동의어로서 "올리고"), "상동성", "작동 가능하게 결합된", "모 폴리뉴클레오티드 세트", "환자(patient)" 또는 "피험체(subject)", "생리학적 조건", "군집(population)", "프로폼(pro-form)", "의사랜덤(pseudorandom)", "유사 반복 단위(quasi-repeated unit)", "랜덤 펩티드 라이브러리", "랜덤 펩티드 서열", "수용체", "재조합(recombinant)" 효소, "합성" 효소, "관련된 폴리뉴클레오티드", "환원 재편성(reductive reassortment)", "기준 서열", "반복 지수(RI)", "제한 위치", "선별성 폴리뉴클레오티드", "서열 동일성", "유사성", "특이적으로 결합하다", "특이적 잡종화(specific hybridization)", "특이적 폴리뉴클레오티드", "엄격한 잡종화 조건", "실질적으로 동일한", "실질적으로 순수한 효소", "실질적으로 순수한", "치료하는 것(treating)", "가변성 분절(variable segment)" 및 "변이체".
하기 용어들의 정의들은 WO 2017/078839 전체를 참조로 하여 내려진다:
"약", "활성", "항체", "항체 의존적 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC", "항원" 또는"Ag", "안티센스 RNA," "바이오시밀러" 또는 "후속 바이오로직스(follow-on biologics)," "바이오시밀러 항체", "암" 또는 "암성," "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR" 또는 "CARs," "시토카인" 또는 "시토카인들", "전해질", "전장 항체", "성장 인자", "호르몬", "면역 조절제", "개체" 또는 "대상체", "라이브러리", "리간드", "수용체", "마이크로RNA" 또는 "miRNA," "다중 특이적 항체", "나노입자", "자연 발생", "재조합 항체", "조절 단백질", "소형 간섭 RNA" 또는 "siRNA," "치료용 단백질", "치료적 유효량", "종양 미세환경", "야생형".
본원에 사용된 바와 같은 용어, 즉 폴리펩티드의 "표면에 노출된 아미노산 잔기"는, 폴리펩티드가 액체(예컨대 혈액, 인간의 혈청, 세포질 등)중에 존재할 때, 적어도 자체의 측쇄 일부가 액체와 접촉하는, 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 지칭한다. 폴리펩티드 표면에 노출된 아미노산 잔기는 X-선 결정학에 의해 확정될 수 있다. 표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기도 또한, 예를 들어 컴퓨터 프로그램, 예컨대 InsightII 프로그램(Accelrys)이 실행되어 얻어진 항체의 3차원 모델에서의 좌표들이 이용되어 확정될 수 있다. 이러한 목적에 이용 가능한 또 다른 소프트웨어로서는, 예를 들어 SYBYL 바이오폴리머 모듈(Biopolymer Module) 소프트웨어(Tripos Associates)를 포함한다. 알고리즘이 사용자 인풋 크기 매개변수를 요구하면, 계산에 사용된 프로브의 "크기"는 반경 약 1.4 암스트롬(Å) 이하로 설정될 수 있다. 예를 들어 퍼스널 컴퓨터용 소프트웨어를 사용하여 표면 노출된 아미노산 잔기와 영역을 확정하기 위한 방법은 Pacios에 의한 문헌[Pacios, Comput. Chem, vol. 18, pp. 377-386, 1994; J. Mol. Model., vol. 1, pp. 46-53, 1995]에 기술되었다.
"조건부 활성 폴리펩티드"라는 용어는, 적어도 하나의 조건(예컨대 비정상 조건) 하에서 모 폴리펩티드보다 활성이 더 크고, 제2의 조건(예컨대 정상 생리학적 조건) 하에서는 모 폴리펩티드보다 활성이 더 작은, 모 폴리펩티드의 변이체 또는 돌연변이체를 지칭하거나, 또는, 제2 조건(예컨대 정상 생리학적 조건)하에서보다 적어도 1개의 조건(예컨대 비정상 조건) 하에서 활성이 더 큰, 모 폴리펩티드의 변이체 또는 돌연변이체를 지칭한다. 일 구현예에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 제1의 정상 생리학적 조건하에서보다 제2의 비정상 조건하에서 적어도 1.3배, 또는 적어도 1.5배, 또는 적어도 2.0배, 또는 적어도 2.5배, 또는 적어도 3.0배, 또는 적어도 5.0배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 15배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 100 배 더 활성이 크다. 이 조건부 활성 폴리펩티드는 몸의 1군데 이상의 병소에서 활성을 보일 수 있고/있거나 몸의 다른 병소에서 증가 또는 감소한 활성을 보일 수 있다. 예를 들어 하나의 양상에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 실질적으로 체온에서는 비활성이지만, 체온보다 더 낮은 온도에서는 활성이다. 조건부 활성 폴리펩티드는 조건부 활성 단백질, 단백질 단편, 항체, 항체 단편, 효소, 효소 단편, 수용체 및 수용체 단편, 시토카인 및 이의 단편, 호르몬 및 이의 단편, 리간드 및 이의 단편, 조절 단백질 및 이의 단편, 성장 인자 및 이의 단편, 그리고 스트레스 단백질, 볼트(vault) 관련 단백질, 뉴런 단백질, 소화관 단백질, 성장 인자, 미토콘드리아 단백질, 세포기질 단백질, 동물 단백질, 구조 단백질, 식물 단백질, 그리고 이러한 단백질들 중 임의의 것의 단편을 비롯한 단백질을 포함한다. 본원에 기술된 조건부 활성 폴리펩티드 각각은, 바람직하게 조건부 활성 생체 폴리펩티드이다.
폴리펩티드에 대해 본원에 사용된 바와 같은 "혈장중 반감기의 증가" 또는 "혈장중 반감기의 연장"이란 용어는, 혈장중 폴리펩티드의 체류 시간(혈장중 반감기(t1/2)) 증가 또는 혈장중 제거율(CL) 감소를 지칭한다. 이는, 시간이 경과함에 따른 농도 곡선의 곡선하 면적(AUC)로 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 폴리펩티드의 "등전점" 또는 "pI"란 용어는, 폴리펩티드가 순 전하를 운반하지 않을 때의 pH를 지칭한다. 폴리펩티드의 pI는 실험을 통하여 확정될 수 있거나, 또는 폴리펩티드 아미노산 서열을 기반으로 산정될 수 있다. 예를 들어 pI는 당 업자에게 공지된 폴리펩티드의 등전 포커싱 전기영동(isoelectric focusing electrophoresis)에 의해 확정될 수 있다. pI의 이론상 산정치는 아미노산 서열 분석 소프트웨어(GENETYX 등)를 사용하여 폴리펩티드의 아미노산을 기반으로 확정될 수 있다.
모 폴리펩티드의 "등전점 변이체" 또는 "pI 변이체"란 용어는, pI 가 더 높은 아미노산 잔기의 pI가 더 낮은 아미노산 잔기로의 치환, 모 폴리펩티드의 pI보다 더 높은 pI를 보이는 아미노산 잔기의 결실, 또는 모 폴리펩티드의 pI보다 더 낮은 pI를 보이는 아미노산 잔기의 삽입을 통하여 돌연변이 폴리펩티드의 기원인 모 폴리펩티드의 pI에 비해 pI가 감소한, 모 폴리펩티드의 돌연변이 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명은 조건부 활성 pI 변이체뿐 아니라 모 폴리펩티드의 pI와 동일한 pI를 보이는 조건부 활성 폴리펩티드까지 확대된다.
본원에 사용된 바와 같은 "모 폴리펩티드" 및 "모 단백질"이란 용어는, 본원에 기술된 방법이 사용되어 진화되는 결과, 조건부 활성 폴리펩티드로 제조될 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 모 폴리펩티드는 비 자연 발생 단백질일 수 있다. 예를 들어 치료용 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 돌연변이 또는 변이 폴리펩티드는 모 폴리펩티드로서 사용될 수 있다. 모 폴리펩티드의 예들로서는 항체, 항체 단편, 효소, 효소 단편, 시토카인 및 이의 단편, 호르몬 및 이의 단편, 리간드 및 이의 단편, 수용체 및 이의 단편, 조절 단백질 및 이의 단편, 그리고 성장 인자 및 이의 단편을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "pH-의존적"이란 용어는, 어떤 폴리펩티드가 상이한 값의 pH에서 상이한 특성 또는 활성을 가지게 되는 경향을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "폴리펩티드"란 용어는, 아미노산인 단량체들이 펩티드 또는 이황화물 결합을 통해 서로 연결된 아미노산 중합체를 지칭한다. "폴리펩티드"란, 전장 자연 발생 아미노산 사슬 또는 이의 단편, 돌연변이체 또는 이의 변이체, 예를 들어 결합 상호작용에서 관심 있는 아미노산 사슬의 선택된 영역일 수 있다. 폴리펩티드는 또한 합성 아미노산 사슬 또는 자연 발생 아미노산 사슬이나 이의 단편의 조합, 그리고 합성 아미노산 사슬일 수도 있다. 단편이란, 전장 단백질의 일부분으로서, 통상적으로 길이가 약 8개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 바람직하게 약 8개 아미노산 내지 약 300개 아미노산, 더욱 바람직하게 약 8개 아미노산 내지 약 200개 아미노산, 그리고 더욱더 바람직하게 약 10개 아미노산 내지 약 50개 또는 100개 아미노산인 아미노산 서열일 것이다. 추가로, 자연 발생 아미노산 이외의 아미노산, 예를 들어 β-알라닌, 페닐 글리신 및 호모아르기닌도 본 폴리펩티드에 포함될 수 있다. (유전자에 의해 암호화되는 것이 아닌) 보통 마주치는 아미노산도 또한 이 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 아미노산은 D-광학 이성체 또는 L-광학 이성체 중 어느 하나일 수 있다. D-이성체는 이하에 추가로 기술된 구체적인 내용 중에 사용되기에 바람직하다. 추가로, 예를 들어 폴리펩티드 링커 서열들 중 기타 펩티도모의체도 또한 유용하다[Spatola, 1983, in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins, Weinstein, ed., Marcel Dekker, New York, p. 267 참조]. 일반적으로 "단백질"이란 용어는, 공유 또는 비 공유 결합에 의해 서로 결합된 폴리펩티드 사슬 2개 또는 수개 포함하는 구조를 포함하는 이외에, 용어 "폴리펩티드"와 임의의 유의적인 차이를 전달하도록 의도되지는 않는다.
"소 분자"란 용어는, 통상적으로 분자량이 900 a.m.u. 미만이거나, 더욱 바람직하게는 분자량이 500 a.m.u. 미만이거나, 또는 더욱 바람직하게는 분자량이 200 a.m.u. 미만이거나, 또는 더욱더 바람직하게는 분자량이 100 a.m.u. 미만인 분자를 지칭한다. 동일한 분자량 범위가 이 검정에 사용된 이온에 적용된다. 본 발명의 검정 및 환경에 있어 소 분자 또는 이온은, 주로 검정 또는 환경의 pH에 따라, 종종 분자와 이 분자의 탈양성자화된 이온의 혼합체로서 존재할 수 있다.
상세한 설명
본 발명은 모 폴리펩티드로부터 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 (i) 돌연변이 1개 이상을 모 폴리펩티드에 도입하여 모 폴리펩티드를 진화시킴으로써, 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 더 낮은 pI를 보이는 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상을 제조하는 단계, (ii) 이 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상을 대상으로 정상 생리학적 조건하에서 제1 검정을 실시하여, 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상의 정상 생리학적 조건하에서의 활성을 측정하고, 비정상 조건하에서 제2 검정을 실시하여, 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상의 비정상 조건하에서의 활성을 측정하는 단계[단 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건은 동일하되, 값은 상이한 조건임], 그리고 (iii) 정상 생리학적 조건하 제1 검정에서의 활성에 비하여 비정상 조건하 제2 검정에서의 동일 활성 증가를 보이는 조건부 활성 폴리펩티드를 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상으로부터 선택하는 단계를 포함한다.
A. 폴리펩티드의 pI에 영향을 미치는 돌연변이
모 폴리펩티드는, 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 이에 비해 감소한 pI를 보이는 조건부 활성 폴리펩티드를 생산하도록 돌연변이될 수 있다. 바람직하게 조건부 활성 폴리펩티드의 pI는 모 폴리펩티드의 pI에 비하여 감소할 것이다. 대안적으로, 또는 동시에, 조건부 활성 폴리펩티드의 pI는 7.4 이하, 또는 7.3 이하, 또는 7.2 이하, 또는 7.1 이하, 또는 7.0 이하일 수 있다. 이 조건부 활성 폴리펩티드는 또한 pH 선택성, 즉 예를 들어 7.2 이상 내지 7.6 미만의 범위일 수 있는 정상 생리학적 pH에서의 활성보다, 활성이 요망되는 pH에서의 활성이 더 큰 성질을 보일 것이다.
아미노산 잔기 치환, 결실, 삽입 및 이것들의 조합을 비롯하여 임의의 적합한 돌연변이유발 기술이 사용될 수 있다. 아미노산 잔기 치환은 모 폴리펩티드내 원산 아미노산 잔기를, 치환된 원산 아미노산 잔기의 아미노산 pI보다 더 낮은 Pi를 보이는 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것이다. 아미노산의 pI는 표 1에 보인다. 이 표는 폴리펩티드내에 위치하는 아미노산 잔기가 아닌 오히려 개별 분자로서의 아미노산의 pI를 보여주는 것이지만, 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 일부일 때, 이 아미노산 잔기의 pI의 영향력은 표 1의 아미노산의 pI 경향을 따른다. 그러므로, 예를 들어 더 높은 pI를 보이는 원산 아미노산 잔기의, 더 높은 pI를 보이는 이 원산 아미노산의 pI보다 더 낮은 Pi를 보이는 아미노산 잔기로의 치환은, 폴리펩티드의 pI를 낮출 것이다. 실제로, 모 폴리펩티드내 원산 아미노산 잔기는, pI가 원산 아미노산의 pI보다 더 낮은 또 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 예를 들어 만일 원산 아미노산 잔기가 염기성 아미노산의 잔기이면, 이는 폴리펩티드의 pI를 낮추기 위해 약산성 아미노산 잔기 또는 강산성 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 다른 예에서, 만일 원산 아미노산 잔기가 약산성 아미노산 잔기이면, 이는 폴리펩티드의 pI를 낮추기 위하여 강산성 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
Figure pct00001
몇몇 구현예들에서, 2개 이상의 아미노산 잔기가 모 폴리펩티드에 치환되어 들어가, 모 폴리펩티드의 pI에 영향을 미친다. 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이 이상의 아미노산 잔기 치환이 모 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 각각의 치환은 pI가 더 높은 아미노산 잔기 대신에 pI가 더 낮은 아미노산 잔기를 치환한다. 다른 구현예들에서, 치환의 오로지 일부만이 pI가 더 높은 아미노산 잔기 대신에 pI가 더 낮은 아미노산 잔기를 치환한다. 후자의 경우 치환들의 조합은, 다수 치환의 전반적인 효과가 돌연변이 폴리펩티드의 pI를 모 폴리펩티드의 pI와 동일하게 유지시키거나, 또는 모 폴리펩티드의 pI보다 더 낮은 돌연변이 폴리펩티드 pI를 제공하도록 선택된다.
몇몇 구현예들에서, pI에 영향을 미치는데 사용된 아미노산 잔기 치환은 보존적 치환, 비보존적 치환 또는 이것들의 조합일 수 있다.
모 폴리펩티드 pI를 감소시키는 아미노산 잔기 결실은, 모 폴리펩티드 pI보다 더 높은 pI를 보이는 아미노산 잔기를 결실시키는 것을 포함한다. 예를 들어 모 폴리펩티드의 pI가 약 7.2이면, 염기성 아미노산 잔기중 임의의 것 1개 이상의 모 폴리펩티드로부터의 결실은 모 폴리펩티드 pI를 감소시킬 것이다. 몇몇 구현예들에서, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 이 이상의 아미노산 잔기가 모 폴리펩티드로부터 결실된다. 몇몇 구현예들에서, 각각의 결실은 모 폴리펩티드 pI 보다 낮은 pI를 보이는 아미노산 잔기를 결실시킨다. 다른 구현예들에서, 결실의 오로지 일부만이 모 폴리펩티드 pI 보다 높은 pI를 보이는 아미노산 잔기를 결실시킨다. 후자의 경우, 결실들의 조합은, 다수 결실의 전반적인 효과가 폴리펩티드 pI를 유지시키거나 낮추도록 선택된다.
모 폴리펩티드의 pI를 감소시키는 아미노산 잔기 삽입은, 모 폴리펩티드의 pI보다 낮은 pI를 보이는 아미노산 잔기를 삽입하는 것을 포함한다. 예를 들어 모 폴리펩티드의 pI가 약 7.2일 때, 약산성 아미노산 또는 강산성 아미노산의 잔기들 중 임의의 것 1개 이상의 모 폴리펩티드로의 삽입은, 모 폴리펩티드 pI의 감소를 초래할 것이다. 몇몇 구현예들에서, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 이 이상의 아미노산 잔기가 모 폴리펩티드에 삽입된다. 몇몇 구현예들에서, 각각의 삽입은, 모 폴리펩티드의 pI보다 낮은 pI를 보이는 아미노산 잔기를 삽입시킨다. 다른 구현예들에서, 삽입의 오로지 일부만이 모 폴리펩티드의 pI보다 낮은 pI를 보이는 아미노산 잔기를 삽입시킨다. 후자의 경우, 삽입들의 조합은, 다수 삽입의 전반적인 효과가 폴리펩티드 pI를 유지시키거나 낮추도록 선택된다.
몇몇 구현예들에서, 전술된 아미노산 잔기 치환, 아미노산 잔기 결실 및 아미노산 잔기 삽입중 2개 이상의 조합은 모 폴리펩티드의 pI에 영향을 미치기 위해 사용된다. 예를 들어 돌연변이 폴리펩티드는 1개 이상의 아미노산 잔기 치환 및 1개 이상의 아미노산 잔기 결실을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 돌연변이 폴리펩티드는 1개 이상의 아미노산 잔기 치환 및 1개 이상의 아미노산 잔기 삽입을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 돌연변이 폴리펩티드는 1개 이상의 아미노산 잔기 결실 및 1개 이상의 아미노산 잔기 삽입을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 돌연변이 폴리펩티드는 1개 이상의 아미노산 잔기 치환, 1개 이상의 아미노산 잔기 결실, 그리고 1개 이상의 아미노산 잔기 삽입 모두를 가질 수 있다. 각각의 경우, 삽입, 치환 및/또는 결실 모두 또는 오로지 일부만이, 치환되는 아미노산의 pI 또는 폴리펩티드의 pI중 어느 하나보다 더 낮은 pI를 보이는 아미노산 잔기를 이용할 수 있다. 각각의 경우에, 삽입, 치환 및/또는 결실의 조합은, 다수의 삽입, 치환 및/또는 결실의 전반적인 효과가 폴리펩티드 pI를 유지 또는 낯추도록 선택된다.
요망되는 돌연변이 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 더 낮은 pI를 보일 것이다. 몇몇 돌연변이 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 pI와 동일한 pI를 보일 것이다. 다른 돌연변이 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 pI보다 적어도 0.1 유닛, 또는 적어도 0.2 유닛, 또는 적어도 0.3 유닛, 또는 적어도 0.4 유닛, 또는 적어도 0.5 유닛, 또는 적어도 0.6 유닛, 또는 적어도 0.8 유닛, 또는 적어도 1.0 유닛, 또는 적어도 1.2 유닛, 또는 적어도 1.4 유닛, 또는 적어도 1.5 유닛, 또는 적어도 1.7 유닛, 또는 적어도 2.0 유닛, 또는 적어도 2.5 유닛, 또는 적어도 3.0 유닛, 또는 적어도 3.5 유닛, 또는 적어도 4.0 유닛, 또는 적어도 5.0 유닛 더 낮은 pI를 보일 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 치환되는 원산 아미노산 잔기, 결실되는 아미노산 잔기 및/또는 아미노산 잔기가 삽입되는 위치는 모 폴리펩티드 표면상에 노출된다. 노출된 아미노산 잔기 또는 위치에서의 돌연변이는 모 폴리펩티드의 3차원 구조를 훼손시킬 가능성이 더 낮은 것으로 이해된다.
아미노산 잔기 치환, 삽입 및 결실은 모 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열상에서, 예를 들어 위치 유도성 돌연변이유발법(Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)) 또는 중첩 확장 PCR(overlap extension PCR)에 의해 수행될 수 있다. 모 폴리펩티드가 항체이면, 돌연변이는 또한 항체의 친화성 성숙, 또는 항체 중쇄 또는 경쇄의 사슬 셔플링(chain shuffling), 또는 파아지 전시 라이브러리가 사용되는 항원 확장 기반 선택(antigen panning-based selection)에 의해 달성될 수 있다(Smith et al., Methods Enzymol. 217:228-257 (1993)). 이러한 돌연변이유발법은 단독으로 또는 적당한 조합을 이루며 수행될 수 있다.
몇몇 추가의 구현예들에서, 모 폴리펩티드 pI를 유지하거나 이에 비하여 pI를 감소시키는 돌연변이에 더하여, 돌연변이 폴리펩티드에서는 또한 pI를 유지하거나 낮추기 위해 돌연변이가 도입된 위치를 제외한 위치에서 추가의 돌연변이유발이 진행될 수 있다. 추가의 돌연변이유발은 임의의 공지된 돌연변이유발법, 예를 들어 US 2013/0116125에 상세히 기술되어 있는 포괄적 위치 진화(Comprehensive Positional Evolution), 포괄적 위치 결실(Comprehensive Positional Deletion), 포괄적 위치 삽입(Comprehensive Positional Insertion) 또는 이것들의 조합을 이용할 수 있다.
예를 들어 모 폴리펩티드는 모 폴리펩티드 pI를 유지하거나 또는 이 pI를 감소시키는 아미노산 잔기 치환을 1개 이상 포함하도록 돌연변이될 수 있다. 예를 들어 돌연변이된 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드 pI를 낮추도록 이미 도입된 돌연변이 1개 이상을 가지는 위치 이외의 위치에, 예를 들어 포괄적 위치 치환, 포괄적 위치 결실 및 포괄적 위치 삽입을 포함한 포괄적 위치 진화의 대상이 될 수 있다.
임의의 폴리펩티드의 pI는 등전 포커싱 겔 전기영동법(예컨대 모세관 등전 포커싱 겔 전기영동 또는 기타 방법(예를 들어 문헌(Righetti et al., Methods Biochem. Anal. 54:379-409, 2011; Friedman et al., Methods Enzymol. 463:515-540, 2009; Koshel et al., Proteomics 12:2918-2926, 2012; Sommer et al., Electrophoresis 30:742-757, 2009; Shimura et al., Electrophoresis 30:11-28, 2009)에 기술된 방법 참조)에 의해 확정될 수 있다. 뿐 아니라, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기반으로 폴리펩티드의 pI를 추산 또는 산정할 수 있는 방법, 예컨대 문헌(Ribeiro J M. Sillero A., Computers in Biology & Medicine 20(4):235-42, 1990; Ribeiro J M. Sillero A., Computers in Biology & Medicine 21(3): 131-41, 1991; and Sillero A. Ribeiro J M., Analytical Biochemistry 179(2):319-25, 1989)에 기술된 방법도 있다.
항체, 효소, 호르몬, 성장 인자, 시토카인, 조절 단백질, 기능성 펩티드, 바이오시밀러, 면역 조절제, 치료용 단백질, 수용체 및 리간드를 포함한 임의의 단백질이 본 발명의 모 폴리펩티드로 사용될 수 있다. 모 폴리펩티드는 또한 상기 단백질들중 임의의 것의 단편일 수 있다. 예를 들어 모 폴리펩티드는 조직 플라스미노겐 활성인자, 스트렙토키나아제, 우로키나제, 레닌, 히알루로니다제, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP), 성분 P(SP), 뉴로펩티드 Y(NPY), 혈관 작용성 장 펩티드(VTP), 바소프레신 및 안지오스타틴일 수 있다. 다른 예를 들자면, 모 폴리펩티드는 스트레스 단백질, 볼트 관련 단백질(vault-related protein), 뉴런 단백질, 소화관 단백질, 성장 인자, 미토콘드리아 단백질, 시토졸 단백질, 동물 단백질, 구조 단백질, 식물 단백질 또는 이들 단백질중 임의의 것의 단편일 수 있다.
하나의 예시적 구현예에서, 모 폴리펩티드는 항체이다. 모 항체는 치료용 항체 또는 치료용으로 개발중인 후보 항체일 수 있다. 모 항체의 예로서는 리툭시맙(리툭산(Rituxan)®, IDEC/Genentech/Roche)(예를 들어 미국 특허 제5,736,137호 참조), 비호지킨 림프종 치료용으로 승인된 키메라 항 CD20 항체; HuMax-CD20, 항 CD20(현재 Genmab에 의해 개발중임), 항 CD20 항체(미국 특허 제5,500,362호에 기술됨), AME-133(Applied Molecular Evolution), hA20(Immunomedics, Inc.), HumaLYM(Intracel) 및 PRO70769(PCT/US2003/040426, 발명의 명칭 "면역글로불린 변이체 및 이의 용도")를 포함한다. 표피 성장 인자 수용체 군의 일원을 표적화하는 항체 다수, 예컨대 EGFR(ErbB-1), Her2/neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4)를 표적화하는 항체는 본 발명의 pI 조작 불변 영역(들)으로부터 이익을 얻을 수 있다. 예를 들어 본 발명의 pI 조작 불변 영역(들)은 트라스투주맙(허셉틴(Herceptin)®, Genentech)(예를 들어 미국 특허 제5,677,171호 참조), 유방암 치료용으로 승인된 인간화 항 Her2/neu 항체; 퍼투주맙(rhuMab-2C4, OmnitargTM)(현재 Genentech에 의해 개발중임; 항 Her2 항체(미국 특허 제4,753,894호에 기술됨; 세툭시맙(얼비툭스(Erbitux)®, Imclone)(미국 특허 제4,943,533호; PCT WO 96/40210), 키메라 항EGFR 항체(다양한 암에 대해 임상 실험중임); ABX-EGF(미국 특허 제6,235,883호)(현재 Abgenix-Immunex-Amgen에 의해 개발중임); HuMax-EGFr(미국 특허 출원 제10/172,317호)(현재 Genmab에 의해 개발중임); 425, EMD55900, EMD62000 및 EMD72000(Merck KGaA)(미국 특허 제5,558,864호; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al, 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3): 129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, l05(2):273-80); TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba(미국 특허 제5,891,996호; 미국 특허 제6,506,883호; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81); mAb-806(Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci USA. l00(2):639-44); KSB-102(KS Biomedix); MR1-1(WAX, National Cancer Institute)(PCT WO 0162931A2); 및 SC100(Scancell)(PCT WO 01/88138)과 상당히 유사한 항체에서 그 용도를 찾을 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 pI 조작 불변 영역(들)은 알렘투주맙(캄파스(Campath)®, Millenium), 현재 만성 B 세포 림프구성 백혈병 치료용으로 승인된 인간화 모노클로날 항체에서 그 용도를 찾을 수 있다. 본 발명의 조작된 불변 영역(들)은 뮤로모납-CD3(오르토클론(Orthoclone) OKT3®), Ortho Biotech/Johnson & Johnson에 의해 개발된 항 CD3 항체, 이브리투모맙 티욱세탄(제발린(Zevalin)®), IDEC/Schering AG에 의해 개발된 항 CD20 항체, 겜투주맙 오조가미신(마일로타그(Mylotarg)®), Celltech/Wyeth에 의해 개발된 항 CD33 항체(p67 단백질), 알레파셉트(아메바이브(Amevive)®), Biogen에 의해 개발된 항 LFA-3 Fc 융합체, Centocor/Lilly에 의해 개발된 아비식시맙(레오프로(ReoPro)®), Novartis에 의해 개발된 바실릭시맙(시뮬렉트(Simulect)®), MedImmune에 의해 개발된 팔리비주맙(시나기스(Synagis)®), 인플릭시맙(레미케이드(Remicade)®), Centocor에 의해 개발된 항 TNF알파 항체, 아달리무맙(휴미라(Humira)®), Abbott에 의해 개발된 항 TNF알파 항체, 휴미케이드(Humicade)TM, Celltech에 의해 개발된 항 TNF알파 항체, 에타너셉트(엔브렐(Enbrel®), Immunex/Amgen에 의해 개발된 항 TNF알파 Fc 융합체, ABX-CBL, Abgenix에 의해 개발중인 항 CD147 항체, ABX-IL8, Abgenix에 의해 개발중인 항 IL8 항체, ABX-MA1, Abgenix에 의해 개발중인 항 MUCl8 항체, 펨투모맙(R1549, 90Y-muHMFGl), Antisoma에 의해 개발중인 항 MUC1, 테렉스(Therex; R1550), Antisoma에 의해 개발중인 항 MUC1 항체, Antisoma에 의해 개발중인 안지오맙(AngioMab; AS1405), Antisoma에 의해 개발중인 HuBC-1, Antisoma에 의해 개발중인 티오플라틴(Thioplatin; AS1407), 안테그렌(Antegren)®(나탈리주맙), Biogen에 의해 개발중인 항 알파-4-베타-1(VLA-4) 및 알파-4-베타-7 항체, VLA-1 mAb, Biogen에 의해 개발중인 항 VLA-1 인테그린 항체, LTBR mAb, Biogen에 의해 개발중인 항 림포톡신 베타 수용체(LTBR) 항체, CAT-152, Cambridge Antibody Technology에 의해 개발중인 항 TGF-132 항체, J695, Cambridge Antibody Technology 및 Abbott에 의해 개발중인 항 IL-l2 항체, CAT-192, Cambridge Antibody Technology 및 Genzyme에 의해 개발중인 항 TGFβ1 항체, CAT-213, Cambridge Antibody Technology에 의해 개발중인 항 에오탁신1 항체, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences Inc.에 의해 개발중인 림포스타트-B(LymphoStat-B)TM 항 Blys 항체, TRAIL-RlmAb, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences, Inc.에 의해 개발중인 항 TRAIL-R1 항체, 아바스틴(Avastin)TM(베바시주맙, rhuMAb-VEGF), Genentech에 의해 개발중인 항 VEGF 항체, Genentech에 의해 개발중인 항 HER 수용체군 항체, 항 조직 인자(ATF), Genentech에 의해 개발중인 항 조직 인자 항체, 졸에어(Xolair)TM(오말리주맙), Genentech에 의해 개발중인 항 IgE 항체, 랩티바(Raptiva)TM(에팔리주맙), Genentech 및 Xoma에 의해 개발중인 항 CD11a 항체, Genentech 및 Millenium Pharmaceuticals에 의해 개발중인 MLN-02 항체(구 LDP-02), HuMax CD4, Genmab에 의해 개발중인 항 CD4 항체, HuMax-ILl5, Genmab 및 Amgen에 의해 개발중인 항 IL15 항체, Genmab 및 Medarex에 의해 개발중인 휴맥스-인플람(HuMax-Inflam), 휴맥스-캔서(HuMax-Cancer), Genmab 및 Medarex 및 Oxford GcoSciences에 의해 개발중인 항 헤파라나아제 I 항체, Genmab 및 Amgen에 의해 개발중인 휴맥스-림포마, Genmab에 의해 개발중인 휴맥스-TAC, IDEC-131, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발중인 항 CD40L 항체, IDEC-151(클레놀릭시맙), IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발중인 항 CD4 항체, IDEC-114, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발중인 항 CD80 항체, IDEC-152, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발중인 항 CD23, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발중인 항 대식세포 이주 인자(MIF) 항체, BEC2, Imclone에 의해 개발중인 항 이디오타입 항체, IMC-1C11, Imclone에 의해 개발중인 항 KDR 항체, DC101, Imclone에 의해 개발중인 항 flk-l 항체, Imclone에 의해 개발중인 항 VE 카데린 항체, CEA-CideTM(라베투주맙), Immunomedics에 의해 개발중인 항 암배아항원(CEA) 항체, 림포사이드(LymphoCide)TM(에프라투주맙(Epratuzumab)), Immunomedics에 의해 개발중인 항 CD22 항체, Immunomedics에 의해 개발중인 AFP-Cide, Immunomedics에 의해 개발중인 마이엘로마사이드(MyelomaCide), Immunomedics에 의해 개발중인 LkoCide, Immunomedics에 의해 개발중인 프로스타사이드(ProstaCide), MDX-010, Medarex에 의해 개발중인 항 CTLA4 항체, MDX-060, Medarex에 의해 개발중인 항 CD30 항체, Medarex에 의해 개발중인 MDX-070, Medarex에 의해 개발중인 MDX-018, 오시뎀(Osidem)TM(IDM-1), Medarex 및 Immuno-Designed Molecules에 의해 개발중인 항 Her2 항체, 휴맥스(HuMax)TM-CD4, Medarex 및 Genmab에 의해 개발중인 항 CD4 항체, HuMax-IL15, Medarex 및 Genmab에 의해 개발중인 항 ILl5 항체, CNTO 148, Medarex 및 Centocor/J&J에 의해 개발중인 항 TNFα 항체, CNTO 1275, Centocor/J&J에 의해 개발중인 항 시토카인 항체, MOR101 및 MOR102, MorphoSys에 의해 개발중인 항 세포내 어드헤신 분자-1(ICAM-1)(CD54) 항체, MOR201, MorphoSys에 의해 개발중인 항 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR-3) 항체, 누비온(Nuvion)®(비실리주맙), Protein Design Labs에 의해 개발중인 항 CD3 항체, HuZAFTM, Protein Design Labs에 의해 개발중인 항 감마 인터페론 항체, Protein Design Labs에 의해 개발중인 항α5β1 인테그린, Protein Design Labs에 의해 개발중인 항 IL-12, ING-1, Xoma에 의해 개발중인 항 Ep-CAM 항체, 그리고 MLN01, Xoma에 의해 개발중인 항 베타2 인테그린 항체, Seattle Genetics에 의해 개발중인 pI-ADC 항체를 포함하되, 이에 한정되지 않는 기타 임상 제품 및 후보들과 상당히 유사한 항체 다수에서 그 용도를 찾을 수 있다[본 단락에서 상기 언급된 참조문헌 모두는 명백히 본원에 참조로 인용되어 있음].
모 항체는 전장 항체, 항체 단편, 단일 사슬 항체, Fab 또는 Fc 도메인일 수 있다. 모 항체는 IgG 항체일 수 있다. 몇몇 항체 이소타입들중 IgG 항체는 분자량이 충분히 크므로, 이의 주요 대사 경로는 신장 배설을 통하지 않는다. IgG 항체는 FcRn을 매개로 샐비지 경로(salvage pathway)를 통해 재순환되는 것으로 공지되어 있으므로, 생체내 반감기가 길다. IgG 항체는 주로 내피 세포에서의 대사 경로를 통해 대사되는 것으로 가정된다(He et al., J. Immunol. vol. 160, pp. 1029-1035, 1998). 특히 IgG 항체가 내피 세포에 비특이적으로 흡수되면, IgG 항체는 FcRn과 결합함으로써 재순환되고, 이때 FcRn과 결합하지 못한 IgG 항체는 분해되는 것으로 생각된다. 예를 들어 W02007/114319 및 W02009/041643에 기술된 바와 같이, IgG 항체의 혈장중 반감기는 IgG 항체의 pI와 역으로 관련되어 있다.
IgG 항체들중 모 항체는 큰 효과기 작용을 비롯하여 여러 가지 이유로 치료용 항체와 이소타입이 공통된 IgG1 항체일 수 있다. 그러나 IgG1의 중쇄 불변 영역은 IgG2의 중쇄 불변 영역pI보다 더 높은 pI를 보인다(8.10 대 7.31). 생성된 IgG1의 pI는 IgG1 골격의 특정 위치에 몇몇 IgG2 아미노산 잔기들이 도입될 때 낮아질 뿐 아니라, 모 IgG1 항체의 혈장중 반감기보다 더 긴 혈장중 반감기를 보이기까지 한다. 예를 들어 IgG1은 137번 위치에 글리신을 가지고, IgG2는 동일한 위치에 글루탐산(강산성 아미노산)을 가진다. IgG1 137번 위치에 있는 글리신이 글루탐산으로 치환되면, 돌연변이 IgG1 항체의 pI는 감소하게 될 것이고, 그 결과 IgG1 항체의 반감기는 증가할 것이다.
몇몇 구현예들에서, pI를 모 폴리펩티드의 pI만큼 유지하거나 이보다 감소시키기 위한 것으로서, 본원에 기술된 돌연변이들 1개 이상 또는 돌연변이들의 조합은 항체 중쇄, 항체 경쇄, 또는 항체 중쇄와 항체 경쇄 둘 다에서 일어난다.
B. 항체 중쇄에서의 돌연변이
몇몇 구현예들에서, 폴리펩티드의 pI를 유지 또는 감소시키기 위한 것으로서 본원에 기술된 돌연변이 또는 돌연변이들의 조합은 IgG 항체 중쇄의 적어도 CH1 영역에서 일어난다. 이러한 구현예들에서, 돌연변이는 CH1 영역의 119번, 131번, 133번, 137번, 138번, 164번, 192번, 193번, 196번, 199번, 203번, 205번, 208번, 210번, 214번, 217번 및 219번 위치에서의 돌연변이와, 이들 위치에서의 돌연변이들의 임의의 조합으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 돌연변이는 치환, 결실 또는 삽입을 통하여 이들 17개의 위치중 하나, 또는 이들 17개의 위치의 가능한 모든 조합 및 하위조합(sub-combination)에 도입될 수 있다. 예를 들어 돌연변이 항체는 이들 17개의 위치중 1개 이상에 CH1 치환을 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개 또는 17개 가질 수 있다. 그러므로 CH1 영역에 임의의 돌연변이 하나 또는 돌연변이들의 조합이 일어날 수 있다. 또한 CH1 영역에서의 돌연변이 1개 이상은, 선택적으로 CH2, CH3, 경첩(hinge) 및 LC 영역중 임의의 영역에서의 기타 돌연변이 1개 이상 또는 돌연변이들의 조합과 합하여질 수 있다. 이러한 경우, CH1, CH2, CH3, 경첩 및 LC 영역에서의 돌연변이들의 조합은 돌연변이 항체의 pI를 모 항체의 pI에 비하여 감소시키도록 선택될 수 있다.
중쇄 pI를 감소시킬 수 있는 유용한 치환은, IgG 항체 중쇄의 CH1 영역내 121번, 124번, 129번, 132번, 134번, 126번, 152번, 155번, 157번, 159번, 101번, 161번, 162번, 165번, 176번, 177번, 178번, 190번, 191번, 194번, 195번, 197번, 212번, 216번 및 218번 위치중 1개 이상에서의 아스파르트산 잔기 또는 글루탐산 잔기의 치환을 포함한다.
항체 중쇄 CH1 영역에서의 특이적 치환은 119번 위치의 비 원산(non-native) 글루탐산, 131번 위치의 비 원산 시스테인, 133번 위치의 비 원산 아르기닌, 리신 또는 글루타민, 137번 위치의 비 원산 글루탐산, 138번 위치의 비 원산 세린, 164번 위치의 비 원산 글루탐산, 192번 위치의 비 원산 아스파라긴; 193번 위치의 비 원산 페닐알라닌, 196번 위치의 비 원산 리신, 199번 위치의 비 원산 트레오닌, 203번 위치의 비 원산 아스파르트산, 205번 위치의 비 원산 글루탐산 또는 글루타민, 208번 위치의 비 원산 아스파르트산, 210번 위치의 비 원산 글루탐산 또는 글루타민, 214번 위치의 비 원산 트레오닌, 217번 위치의 비 원산 아르기닌 및 219번 위치의 비 원산 시스테인, 그리고 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
몇몇 구현예들에서, 돌연변이는 221번, 222번, 223번, 224번, 225번, 233번, 234번, 235번 및 236번 위치를 비롯하여 항체 중쇄의 경첩 영역에서 일어난다. 특히 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 돌연변이, 구체적으로 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환이 221번 ~ 225번 위치에서 일어날 수 있다. 뿐 아니라 가능한 모든 조합이 단독으로, 또는 다른 영역의 다른 돌연변이들과 함께 고려된다.
항체 중쇄의 경첩 영역에서의 특이적 돌연변이는 221번 위치에서의 결실, 222번 위치의 비 원산 발린 또는 트레오닌, 223번 위치에서의 결실, 224번 위치의 비 원산 글루탐산, 225번 위치에서의 결실, 235번 위치에서의 결실, 236번 위치에서의 결실 또는 비 원산 알라닌, 그리고 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇 경우에서, 오로지 이들 돌연변이1개 이상만이 항체 중쇄의 경첩 영역에 도입되고, 다른 구현예들에서, 이들 돌연변이중 1개 이상은 임의의 조합을 이루고 있는 모 항체 기타 영역내 돌연변이 1개 이상과 합하여진다.
몇몇 구현예들에서, 돌연변이는 274번, 296번, 300번, 309번, 320번, 322번, 326번, 327번, 334번 및 339번 위치를 포함한 항체 중쇄 CH2 영역에서 일어날 수 있다. 특히 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 돌연변이가 항체 중쇄 CH2 영역내 이들 10개의 위치에서 임의의 조합을 이루며 일어날 수 있다.
항체 중쇄 CH2 영역에서의 특이적 치환은 274번 위치의 비 원산 글루타민 또는 글루탐산, 296번 위치의 비 원산 페닐알라닌, 300번 위치의 비 원산 페닐알라닌, 309번 위치의 비 원산 발린, 320번 위치의 비 원산 글루탐산, 322번 위치의 비 원산 글루탐산, 326번 위치의 비 원산 글루탐산, 327번 위치의 비 원산 글리신, 334번 위치의 비 원산 글루탐산, 339번 위치의 비 원산 트레오닌, 그리고 이들 치환의 임의의 조합뿐 아니라, 항체의 다른 영역에서의 다른 돌연변이 1개 이상과의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
돌연변이는 항체 중쇄 CH3 영역의 355번, 359번, 362번, 384번, 389번, 392번, 397번, 418번, 419번, 444번 및 447번 위치에서의 돌연변이로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 돌연변이 항체는 CH3 영역내 이들 위치에서 임의의 조합을 이루는 돌연변이 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개를 가질 수 있다. 또한 본원에 기술된 바와 같이, CH3 영역내 임의의 돌연변이 1개 이상은 항체 CH2, CH1, 경첩 및 LC 영역에서의 다른 돌연변이 1개 이상과 합하여질 수 있다.
항체 중쇄 CH3 영역에서의 특이적 치환들은 355번 위치의 비 원산 글루타민 또는 글루탐산, 384번 위치의 비 원산 세린, 392번 위치의 비 원산 아스파라긴 또는 글루탐산, 397번 위치의 비 원산 메티오닌, 419번 위치의 비 원산 글루탐산, 359번 위치의 비 원산 글루탐산, 362번 위치의 비 원산 글루탐산, 389번 위치의 비 원산 글루탐산, 418번 위치의 비 원산 글루탐산, 444번 위치의 비 원산 글루탐산, 그리고 447번위치의 비 원산 아스파르트산과, 이들 치환중 2개 이상의 임의의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
그러므로 하기 항체 중쇄 결실 또는 치환의 가능한 모든 조합이 구현될 수 있는데, 이때 각각의 돌연변이는 선택적으로 포함 또는 배제된다: 119번 위치의 비 원산 글루탐산, 131번 위치의 비 원산 시스테인, 133번 위치의 비 원산 아르기닌, 리신 또는 글루타민, 137번 위치의 비 원산 글루탐산, 138번 위치의 비 원산 세린, 164번 위치의 비 원산 글루탐산, 192번 위치의 비 원산 아스파라긴, 193번 위치의 비 원산 페닐알라닌, 196번 위치의 비 원산 리신, 199번 위치의 비 원산 트레오닌, 203번 위치의 비 원산 아스파르트산, 205번 위치의 비 원산 글루탐산 또는 글루타민, 208번 위치의 비 원산 아스파르트산, 210번 위치의 비 원산 글루탐산 또는 글루타민, 214번 위치의 비 원산 트레오닌, 217번 위치의 비 원산 아르기닌 및 219번 위치의 비 원산 시스테인, 221번 위치에서의 결실, 222번 위치의 비 원산 발린 또는 트레오닌, 223번 위치에서의 결실, 224번 위치의 비 원산 글루탐산, 225번 위치에서의 결실, 235번 위치에서의 결실, 221번 위치에서의 결실, 222번 위치의 비 원산 발린 또는 트레오닌, 223번 위치에서의 결실, 224번 위치의 비 원산 글루탐산, 225번 위치에서의 결실 및 235번 위치에서의 결실, 274번 위치의 비 원산 글루타민 또는 글루탐산, 296번 위치의 비 원산 페닐알라닌, 300번 위치의 비 원산 페닐알라닌, 309번 위치의 비 원산 발린, 320번 위치의 비 원산 글루탐산, 322번 위치의 비 원산 글루탐산, 326번 위치의 비 원산 글루탐산, 327번 위치의 비 원산 글리신, 334번 위치의 비 원산 글루탐산, 339번 위치의 비 원산 트레오닌, 355번 위치의 비 원산 글루타민 또는 글루탐산, 384번 위치의 비 원산 세린, 392번 위치의 비 원산 아스파라긴 또는 글루탐산, 397번 위치의 비 원산 메티오닌, 419번 위치의 비 원산 글루탐산, 359번 위치의 비 원산 글루탐산, 362번 위치의 비 원산 글루탐산, 389번 위치의 비 원산 글루탐산, 418번 위치의 비 원산 글루탐산, 444번 위치의 비 원산 글루탐산 및 447번 위치의 비 원산 아스파르트산.
C. 항체 경쇄에서의 돌연변이
몇몇 구현예들에서, 돌연변이는 IgG 항체의 경쇄에서 일어날 수 있다. 돌연변이는 경쇄의 126번, 145번, 152번, 156번, 169번, 199번, 202번 및 207번 위치로부터 독립적으로 선택되는 위치에 위치할 수 있다. 항체는 경쇄내 이들 위치에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 돌연변이를 임의의 조합을 이루어 가질 수 있다. 또한 경쇄 돌연변이중 임의의 하나 또는 조합은 전술된 항체 중쇄 돌연변이들 중 임의의 것 1개 이상과 합하여질 수 있다.
항체 경쇄내 특이적 치환은 126번 위치의 비 원산 글루타민 또는 글루탐산, 145번 위치의 비 원산 글루타민, 글루탐산 또는 트레오닌; 152번 위치의 비 원산 아스파르트산, 156번 위치의 비 원산 글루탐산, 169번 위치의 비 원산 글루타민 또는 글루탐산, 199번 위치의 비 원산 글루탐산, 202번 위치의 비 원산 글루탐산 및 207번 위치의 비 원산 글루탐산을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
D. 중쇄 및 경쇄 돌연변이
몇몇 구현예들에서, 돌연변이 항체는 전술된 바와 같이 중쇄와 경쇄 둘 다에 돌연변이를 가질 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 돌연변이 항체는 중쇄에만 돌연변이를 가질 수 있는데, 이 경우 돌연변이 항체는 모 항체의 경쇄를 가질 것이다. 몇몇 구현예들에서, 돌연변이 항체는 경쇄에만 돌연변이를 가질 수 있는데, 이 경우 돌연변이 항체는 모 항체의 중쇄를 가질 것이다.
그러므로 항체 중쇄 및 경쇄에서의 하기 돌연변이들의 가능한 임의의 조합이 구현될 수 있는데, 이때 각각의 돌연변이는 선택적으로 포함되거나 배제된다: a) 중쇄: 119번 위치의 비 원산 글루탐산, 131번 위치의 비 원산 시스테인, 133번 위치의 비 원산 아르기닌, 리신 또는 글루타민, 137번 위치의 비 원산 글루탐산, 138번 위치의 비 원산 세린, 164번 위치의 비 원산 글루탐산, 192번 위치의 비 원산 아스파라긴, 193번 위치의 비 원산 페닐알라닌, 196번 위치의 비 원산 리신, 199번 위치의 비 원산 트레오닌, 203번 위치의 비 원산 아스파르트산, 205번 위치의 비 원산 글루탐산 또는 글루타민, 208번 위치의 비 원산 아스파르트산, 210번 위치의 비 원산 글루탐산 또는 글루타민, 214번 위치의 비 원산 트레오닌, 217번 위치의 비 원산 아르기닌 및 219번 위치의 비 원산 시스테인, 221번 위치에서의 결실, 222번 위치의 비 원산 발린 또는 트레오닌, 223번 위치에서의 결실, 224번 위치의 비 원산 글루탐산, 225번 위치에서의 결실, 235번 위치에서의 결실, 221번 위치에서의 결실, 222번 위치의 비 원산 발린 또는 트레오닌, 223번 위치에서의 결실, 224번 위치의 비 원산 글루탐산, 225번 위치에서의 결실, 235번 위치에서의 결실, 274번 위치의 비 원산 글루타민 또는 글루탐산, 296번 위치의 비 원산 페닐알라닌, 300번 위치의 비 원산 페닐알라닌, 309번 위치의 비 원산 발린, 320번 위치의 비 원산 글루탐산, 322번 위치의 비 원산 글루탐산, 326번 위치의 비 원산 글루탐산, 327번 위치의 비 원산 글리신, 334번 위치의 비 원산 글루탐산, 339번 위치의 비 원산 트레오닌, 355번 위치의 비 원산 글루타민 또는 글루탐산, 384번 위치의 비 원산 세린, 392번 위치의 비 원산 아스파라긴 또는 글루탐산, 397번 위치의 비 원산 메티오닌, 419번 위치의 비 원산 글루탐산, 359번 위치의 비 원산 글루탐산, 362번 위치의 비 원산 글루탐산, 389번 위치의 비 원산 글루탐산, 418번 위치의 비 원산 글루탐산, 444번 위치의 비 원산 글루탐산 및 447번 위치에서의 결실 또는 비 원산 아스파르트산; b) 경쇄: 126번 위치의 비 원산 글루타민 또는 글루탐산, 145번 위치의 비 원산 글루타민, 글루탐산 또는 트레오닌, 152번 위치의 비 원산 아스파르트산, 156번 위치의 비 원산 글루탐산, 169번 위치의 비 원산 글루타민 또는 글루탐산, 199번 위치의 비 원산 글루탐산, 202번 위치의 비 원산 글루탐산 및 207번 위치의 비 원산 글루탐산.
E. 항체 불변 영역에서의 돌연변이
몇몇 구현예들에서, 1개 이상의 돌연변이가 항체, 예컨대 IgG 항체의 중쇄 불변 영역, 경쇄 불변 영역 또는 둘 다에 위치할 수 있다. 예를 들어 항체의 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역에는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 돌연변이가 존재할 수 있다.
중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역에서의 돌연변이는 모 항체의 pI를 모 항체 pI에 비하여 적어도 0.2 유닛, 0.4 유닛, 0.6 유닛, 0.8 유닛, 1.0 유닛, 1.2 유닛, 1.4 유닛, 1.6 유닛, 1.8 유닛, 2.0 유닛, 2.5 유닛, 3.0 유닛, 3.5 유닛, 4.0 유닛, 4.5 유닛 또는 5.0 유닛만큼 감소시키는데 충분할 수 있다.
F. 모 항체의 가변 영역
몇몇 구현예들에서, 1개 이상의 돌연변이는 항체, 예컨대 IgG 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 둘 다에 위치한다. 하나의 구현예에서, 돌연변이는 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR), 예컨대 CDR1, CDR2 및 CDR3중 1개 이상 및/또는 구조 틀 영역(FR), 예컨대 FR1, FR2, FR3 및 FR4중 1개 이상에 위치한다. 가변 영역에 돌연변이를 도입하는 것은, 불변 영역에서의 돌연변이와 비교되었을 때 이점을 제공할 수 있는데, 그 이유는 불변 영역에서의 돌연변이는 잠정적으로 면역원성 증가를 유도할 수 있기 때문이다.
하나의 예에서, 위치한 돌연변이는 항원 결합에 의해 마스킹(masking)되지 않은 가변 영역내 위치들에 존재한다. 항원 결합에 의해 마스킹되지 않은 위치는 항원이 결합한 항체의 표면에 노출된 채 남아있는 위치이다. 대안적으로, 돌연변이는 항원 결합을 거의 방해하지 않는 위치에 일어날 수 있다.
CDR과 FR을 동정하기 위한 방법은 공지되어 있다(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature, vol. 342, p. 877, 1989). FR내 변경 가능한 아미노산 잔기는, 비공유 결합을 통해 항원과 직접 결합하는 잔기(Amit et al, Science, 233:747-53, 1986), CDR 구조에 어떤 영향력 또는 영향을 미치는 잔기(Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987), 그리고 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 상호작용에 연루된 잔기(특허 공보 EP 239400A1)를 포함한다.
전술된 돌연변이유발법은 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상으로 된 세트를 만든다. 이러한 돌연변이 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 이보다 더 낮은 pI를 보일 수 있다. 전술된 다양한 돌연변이유발법이 사용되어 제조될 수 있는 돌연변이 폴리펩티드 몇몇은 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 이보다 더 높은 pI를 보일 수 있다. 이는, 예를 들어 포괄적 위치 진화, 포괄적 위치 결실, 포괄적 위치 삽입 또는 이것들의 조합에 의해 도입된 것으로서, pI를 유지하거나 감소시키기 위한 목적으로 도입된 돌연변이들의 영향력을 극복할 수 있는 추가의 돌연변이를 통하여 달성될 수 있다. 이러한 이유로 몇몇 구현예에서 본 발명은, 특정 돌연변이 폴리펩티드 또는 돌연변이 폴리펩티드의 적어도 상당 부분이 모 폴리펩티드의 pI보다 더 낮은 pI를 보임을 확인시켜준다. 이는, 돌연변이 폴리펩티드 상당 부분이 모 폴리펩티드 pI보다 더 낮은 pH를 보이는 영역에 집중적으로 존재함을 입증해주는, 등전 포커싱 겔 전기영동에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어 돌연변이 폴리펩티드 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%는 모 폴리펩티드의 pI보다 더 낮은 pI를 보일 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 본 발명은, 선택적으로 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 이보다 더 높은 pI를 보이는 돌연변이 폴리펩티드 일부 또는 전부를 배제하기 위해 돌연변이 폴리펩티드를 필터링(filtering)한다. 이러한 돌연변이 폴리펩티드의 필터링은 또한 등전 포커싱 겔 전기영동에 의해 달성될 수 있으며, 이를 통하여 모 폴리펩티드의 pI보다 더 낮은 pH를 보이는 영역에 집중된 돌연변이 폴리펩티드는 수집되어 추가 공정에 사용될 수 있다. 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 이보다 더 높은 pH를 보이는 영역에 집중된 돌연변이 폴리펩티드는 배제될 수 있다.
G. 조건부 활성 폴리펩티드의 스크리닝
돌연변이 폴리펩티드는 조건부 활성에 대해 스크리닝된다. 조건부 활성을 보이고 pI가 모 폴리펩티드의 pI보다 더 낮은 폴리펩티드는 이러한 방식으로 동정될 수 있다. 이는, 특히 치료용 항체와 같은 항체의 특징들의 바람직한 조합이다.
조건부 활성 폴리펩티드를 선택하기 위해 돌연변이 폴리펩티드를 스크리닝하는 방법은 WO 2017/078839에 기술되어 있다. 조건부 활성 폴리펩티드는 정상 생리학적 조건에서 벗어난 비정상 조건에서의 활성의, 대응하는 정상 생리학적 조건에서의 동일한 돌연변이 폴리펩티드의 동일 활성에 비한 증가에 대해 스크리닝하고, 선택적으로는
(a) 정상 생리학적 조건에서 벗어난 비정상 조건에서의 활성의, 동일한 비정상 조건에서의 모 폴리펩티드의 동일 활성에 비한 증가에 대해 스크리닝하거나,
(b) 정상 생리학적 조건에서의 활성의, 동일한 정상 생리학적 조건에서의 모 폴리펩티드의 동일 활성에 비한 감소에 대해 스크리닝하거나, 또는
(c) 상기 (a)와 (b)를 조합함으로써 선택될 수 있다.
조건부 활성 폴리펩티드는 선택성, 즉 비정상 조건에서의 활성 대 정상 생리학적 조건에서의 활성의 비가 적어도 약 1.3, 또는 적어도 약 1.5, 또는 적어도 약 1.7, 또는 적어도 약 2.0, 또는 적어도 약 3.0, 또는 적어도 약 4.0, 또는 적어도 약 6.0, 또는 적어도 약 8.0, 또는 적어도 약 10.0, 또는 적어도 약 20.0, 또는 적어도 약 40.0, 또는 적어도 약 60.0, 또는 적어도 약 100.0일 수 있다.
비정상 조건과 정상 생리학적 조건은 동일한 조건이되 그 값은 상이하다. 예를 들어 비정상 및 정상 생리학적 조건은 2가지의 상이한 온도 또는 2가지의 상이한 pH 값일 수 있다. 조건은 온도, pH, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스 및 전해질 농도뿐 아니라, 이러한 조건들 2가지 이상의 조합으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어 온도에 관한 정상 생리학적 조건은 정상 인간 체온인 37.0℃일 수 있는 반면, 온도에 관한 비정상 조건은 상기 온도 37.0℃와는 상이한 온도, 예컨대 종양 미세환경 온도(정상 생리학적 온도보다 1℃ 내지 2℃ 높을 수 있는 온도)일 수 있다. 다른 예에서, 정상 생리학적 조건은 7.2 ~ 7.8, 또는 7.2 ~ 7.6 범위인 인간의 정상 생리학적 pH일 수 있고, 비정상 pH, 예컨대 5.5 ~ 7.2, 6 ~ 7, 또는 6.2 ~ 6.8 범위의 pH는 종양 미세환경에서 살펴볼 수 있는 바와 같다.
정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에서의 검정은 검정 배지 중에서 수행될 수 있다. 검정 배지는, 예를 들어 완충제뿐만 아니라, 기타 성분들을 함유할 수 있는 용액일 수 있다. 검정 배지 중에 사용될 수 있는 통상의 완충제는 시트르산염 완충제, 예를 들어 시트르산나트륨, 인산염 완충제, 중탄산염 완충제, 예를 들어 Krebs 완충제, 인산염 완충 염수(PBS) 완충제, Hank 완충제, Tris 완충제, HEPES 완충제 등을 포함한다. 기타 검정에 적합한 것으로서, 당 업계의 숙련자에게 공지된 완충제들이 사용될 수 있다. 이러한 완충제는 인간 또는 동물의 체액, 예를 들어 혈장 또는 림프액의 조성을 가지는 성분 또는 이것의 특징을 모의하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 검정 용액은 무기 화합물, 이온 및 유기 분자, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어 인간이나 동물의 체액 중에서 통상 발견되는 것들로부터 선택된 성분 적어도 1개를 함유할 수 있다. 이러한 성분의 예들은 영양 성분과 대사물질뿐만 아니라, 체액에서 발견될 수 있는 기타 임의의 성분들을 포함한다. 본 발명은, 이 성분이 완충계의 일부일 수 있거나 그렇지 않음을 고려한다. 예를 들어 검정 용액은 중탄산염이 첨가되어 있되, 이 중탄산염이 PBS 완충제의 일부가 아닌, PBS 완충제일 수 있다. 대안적으로 중탄산염은 크렙스 완충제의 한 성분이다.
성분은 (제1 조건과 제2 조건에 대한) 두 가지 검정 용액 중에 실질적으로 동일한 농도로 존재할 수 있는 한편, 이 두 가지 검정 용액은 다른 측면, 예컨대 pH, 온도, 전해질 농도 또는 삼투압에 있어서 상이하다. 그러므로 성분은, 제1 조건과 제2 조건, 또는 정상 생리학적 조건과 비정상 조건과 같은 두 가지 조건들 각각의 사이에 차이가 있는 것보다는 차이가 없는 것이 사용된다
몇몇 구현예들에서, 성분은 포유동물, 특히 인간에 있어서 해당 성분의 정상 생리학적 농도와 매우 유사하거나 동일한 농도로 두 가지 검정 용액 중에 존재한다.
무기 화합물 또는 이온은 붕산, 염화칼슘, 질산칼슘, 인산 디-암모늄, 황산망간, 인산 모노-암모늄, 인산 모노-칼륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 황산구리, 황산철, 황산망간, 황산아연, 황산마그네슘, 질산칼슘, 칼슘, 구리, 철, 망간 및 아연의 킬레이트, 몰리브덴산암모늄, 황산암모늄, 탄산칼슘, 인산마그네슘, 이황산나트륨, 이황산칼륨, 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 질산칼륨, 염화수소산, 이산화탄소, 황산, 인산, 탄산, 요산, 염화수소, 우레아, 인 이온, 황 이온, 염화물 이온, 마그네슘 이온, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 암모늄 이온, 철 이온, 아연 이온 및 구리 이온 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
무기 화합물 중 일부의 정상 생리학적 농도의 예들은 다음과 같은 경우들을 포함한다: 요산은 농도 범위 2 ㎎/dL ~ 7.0 ㎎/dL, 칼슘 이온은 농도 범위 8.2 ㎎/dL ~ 11.6 ㎎/dL, 염화물 이온은 농도 범위 355 ㎎/dL ~ 381 ㎎/dL, 철 이온은 농도 범위 0.028 ㎎/dL ~ 0.210 ㎎/dL, 칼륨 이온은 농도 범위 12.1 ㎎/dL ~ 25.4 ㎎/dL, 나트륨 이온은 농도 범위 300 ㎎/dL ~ 330 ㎎/dL 및 탄산은 농도 범위 15 mM ~ 30 mM, 시트르산염 이온은 약 80 μM, 히스티딘 이온은 0.05 mM ~ 2.6 mM, 히스타민은 0.3 μM ~ 1 μM, HAPT 이온(수소화된 아데노신 트리포스페이트) 1 μM ~ 20 μM, 그리고 HADP 이온은 1 μM ~ 20 μM.
몇몇 구현예들에서, 제1 조건과 제2 조건 둘 다, 또는 정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다 각각에 대한 검정 용액 중에 존재하는 이온은 수산화물 이온, 할로겐화물 이온(염화물, 브롬화물, 요오드화물), 옥시할로겐화물 이온, 황산염 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 중황산염 이온, 탄산염 이온, 중탄산염 이온, 설폰산염 이온, 옥시할로겐화물 이온, 질산염 이온, 아질산염 이온, 인산염 이온, 인산수소 이온, 인산중수소 이온, 과황산염 이온, 모노 과황산염 이온, 붕산염 이온, 암모늄 이온, 또는 유기 이온, 예를 들어 카르복실산염 이온, 페놀산염 이온, 설폰산염 이온(오르가노황산염, 예를 들어 황산메틸), 바나듐산염 이온, 텅스텐산염 이온, 붕산염 이온, 오르가노보론산염 이온, 시트르산염 이온, 옥살산염 이온, 아세트산염 이온, 펜타붕산염 이온, 히스티딘 이온 및 페놀산염 이온으로부터 선택된다.
제1 조건과 제2 조건 둘 다, 또는 정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다 각각에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은 예를 들어 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 알라닌, 이소루신, 아르기닌, 루신, 아스파라긴, 리신, 아스파르트산, 메티오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 글루타민, 트립토판, 글리신, 발린, 피롤리신, 프롤린, 셀레노시스테인, 세린, 티로신 및 이것들의 혼합물들로부터 선택될 수 있다.
아미노산들 중 몇몇의 정상 생리학적 농도의 예들은, 알라닌 3.97±0.70 ㎎/dL, 아르기닌 2.34±0.62 ㎎/dL, 글루탐산 3.41±1.39 ㎎/dL, 글루타민 5.78±1.55 ㎎/dL, 글리신 1.77±0.26 ㎎/dL, 히스티딘 1.42±0.18 ㎎/dL, 이소루신 1.60±0.31 ㎎/dL, 루신 1.91±0.34 ㎎/dL, 리신 2.95±0,42 ㎎/dL, 메티오닌 0.85±0.46 ㎎/dL, 페닐알라닌 1.38±0.32 ㎎/dL, 트레오닌 2.02±6.45 ㎎/dL, 트립토판 1.08±0.21 ㎎/dL, 티로신 1.48±0.37 ㎎/dL 그리고 발린 2.83±0.34 ㎎/dL을 포함한다.
제1 조건과 제2 조건 둘 다, 또는 정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다 각각에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은 비 단백질, 질소 함유 화합물, 예를 들어 크레아틴, 크레아티닌, 구아니디노 아세트산, 요산, 알란토인, 아데노신, 우레아, 암모니아 및 콜린으로부터 선택될 수 있다. 이러한 화합물들 중 일부의 정상 생리학적 조건의 예들은 다음과 같은 경우들을 포함한다: 크레아틴 1.07±0.76 ㎎/dL, 크레아티닌 0.9 ㎎/dL ~ 1.65 ㎎/dL, 구아니디노 아세트산 0.26±0.24 ㎎/dL, 요산 4,0±2.9 ㎎/dL, 알란토인 0.3 ㎎/dL ~ 0.6 ㎎/dL, 아데노신 1.09±0.385 ㎎/dL, 우레아 27.1±4.5 ㎎/dL, 그리고 콜린 0.3 ~ 1.5 ㎎/dL.
정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은 유기산, 예를 들어 시트르산, α-케토글루타르산, 숙신산, 말산, 푸마르산, 아세토아세트산, β-하이드록시부티르산, 젖산, 피루브산, α-케톤산, 아세트산 및 휘발성 지방산으로부터 선택될 수 있다. 이러한 유기산들 중 일부의 정상 생리학적 농도의 예들은 다음과 같은 경우들을 포함한다: 시트르산 2.5±1.9 ㎎/dL, α-케토글루타르산 0.8 ㎎/dL, 숙신산 0.5 ㎎/dL, 말산 0.46±0,24 ㎎/dL, 아세토아세트산 0.8 ㎎/dL ~ 2.8 ㎎/dL, β-하이드록시부티르산 0.5±0,3 ㎎/dL, 젖산 8 ㎎/dL ~ 17 ㎎/dL, 피루브산 1.0±0.77 ㎎/dL, α-케톤산 0.6 ㎎/dL ~ 2.1 ㎎/dL, 휘발성 지방산 1.8 ㎎/dL.
정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은 당(탄수화물), 예를 들어 글루코스, 펜토스, 헥소스, 자일로스, 리보스, 만노스 및 갈락토스뿐만 아니라, 이당체, 예를 들어 락토스, GlcNAcβ1-3Gal, Galα1-4Gal, Manα1-2Man, GalNAcβ1-3Gal 및 O-, N-, C- 또는 S-글리코시드로부터 선택될 수 있다. 이러한 당들 중 일부의 정상 생리학적 농도의 예들은 다음과 같은 경우들을 포함한다: 글루코스 83±4 ㎎/dL, 다당체 102±73 ㎎/dL(헥소스로서), 글루코사민 77±63 ㎎/dL, 헥수로네이트 0.4 ㎎/dL ~ 1.4 ㎎/dL(글루쿠론산으로서) 및 펜토스 2.55±0.37 ㎎/dL.
정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은 지방 또는 이의 유도체, 예컨대 콜레스테롤, 레시틴, 세팔린, 스핑고미엘린 및 담즙산으로부터 선택될 수 있다. 이러한 화합물들 중 일부의 정상 생리학적 농도의 예들은 다음과 같은 경우들을 포함한다: 유리 콜레스테롤 40 ㎎/dL ~ 70 ㎎/dL, 레시틴 100 ㎎/dL ~ 200 ㎎/dL, 세팔린 0 ㎎/dL ~ 30 ㎎/dL, 스핑고미엘린 10 ㎎/dL ~ 30 ㎎/dL 및 담즙산 0.2 ㎎/dL ~ 0.3 ㎎/dL(콜산으로서).
정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은 단백질, 예를 들어 피브리노겐, 항 혈우병 글로불린, 면역 γ 글로불린, 면역 유글로불린, 동종응집소, β-슈도글로불린, 당단백, 지단백 및 알부민으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 포유동물 혈청 알부민의 정상 생리학적 농도는 3.5 ㎎/dL ~ 5.0 ㎎/dL이다. 하나의 구현예에서, 알부민은 소 혈청 알부민이다.
정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은 비타민, 예컨대 비타민 A, 카로틴, 비타민 E, 아스코르브산, 티아민, 이노시톨, 엽산, 바이오틴, 판토텐산, 리보플라빈으로부터 선택될 수 있다. 이러한 비타민들 중 일부의 정상 생리학적 농도의 예들은 다음과 같은 경우들을 포함한다: 비타민 A 0.019 ㎎/dL ~ 0.036 ㎎/dL, 비타민 E 0.90 ㎎/dL ~ 1.59 ㎎/dL, 이노시톨 0,42 ㎎/dL ~ 0.76 ㎎/dL, 엽산 0.00162 ㎎/dL ~ 0.00195 ㎎/dL 및 바이오틴 0.00095 ㎎/dL ~ 0.00166 ㎎/dL.
무기 화합물, 이온 또는 유기 분자의 (정상 생리학적 조건하에서의 검정과 비정상 조건하에서의 검정 둘 다에 대한) 검정 용액 중 무기 화합물, 이온 또는 유기 분자의 농도는, 인간 또는 동물의 혈청 중 무기 화합물, 이온 또는 유기 분자의 생리학적 농도의 정상 범위 내 일 수 있다. 그러나, 정상 생리학적 범위를 벗어난 농도도 또한 적용될 수 있다. 예를 들어 인간 혈청 중 마그네슘의 정상 범위는 1.7 ㎎/dL ~ 2.2 ㎎/dL이고, 칼슘의 정상 범위는 8.5 ㎎/dL ~ 10.2 ㎎/dL이다. 검정 용액 중 마그네슘 이온의 농도는 약 0.17 ㎎/dL ~ 약 11 ㎎/dL일 수 있다. 검정 용액 중 칼슘 이온의 농도는 약 0.85 ㎎/dL 내지 약 51 ㎎/dL일 수 있다. 일반적인 규칙으로서, 검정 용액 중 무기 화합물, 이온 또는 유기 분자의 농도는, 인간 혈청 중 무기 화합물, 이온 또는 유기 분자의 정상 생리학적 농도의 5%, 또는 10%, 또는 20%, 또는 30%, 또는 40%, 또는 50%, 또는 60%, 또는 70%, 또는 80%만큼 낮을 수 있거나, 또는 인간 혈청 중 무기 화합물, 이온 또는 유기 분자의 정상 생리학적 농도의 1.5배, 또는 2배, 또는 3배, 또는 4배, 또는 5 배, 또는 7배, 또는 9배, 또는 10배, 또는 심지어 20배만큼 높을 수 있다. 검정 용액의 상이한 성분들은 자체의 각 정상 생리학적 농도와는 상이한 농도 수준으로 사용될 수 있다.
정상 생리학적 조건하에서의 검정과 비정상 조건하에서의 검정은 돌연변이 폴리펩티드의 활성을 측정하는데에 사용된다. 검정 동안 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 둘 다는 검정 용액 중에 존재한다. 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 관계는, 예를 들어 항체-항원, 리간드-수용체, 효소-기질 또는 호르몬-수용체일 수 있다. 돌연변이 폴리펩티드가 자체의 활성을 발휘하기 위해서, 돌연변이 폴리펩티드는 이의 결합 파트너와 접촉하여 결합할 수 있어야 한다. 그 다음, 돌연변이 폴리펩티드의 이의 결합 파트너에 대한 활성이 발휘되고, 이 활성은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 간에 결합이 일어난 후 측정된다.
몇몇 구현예들에서, 검정에 사용된 이온은 스크리닝되는 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너, 구체적으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는 것 사이에 가교를 형성하는 역할을 할 수 있다. 그러므로 이온은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 둘 다의 수소 결합 및/또는 이온 결합을 통한 결합을 가능하게 할 수 있다. 이는 큰 분자(돌연변이 폴리펩티드나 이의 결합 파트너)가 도달하기 어려울 수 있는 위치에 이온이 도달하도록 허용함으로써, 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 도울 수 있다. 몇몇 경우들에서, 검정 용액 중 이온은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너가 서로 결합할 확률을 높일 수 있다. 또한 이온은, 큰 분자(돌연변이 폴리펩티드나 이의 결합 파트너)와의 결합에 의해 부가적으로나 대안적으로 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 도울 수 있다. 이러한 결합은, 큰 분자의 입체구조를 변경할 수 있고/있거나 더 큰 분자가, 자체의 결합 파트너와의 결합을 촉진하는 특정 입체구조로 유지되도록 만들 수 있다.
이온들은, 가능하게는 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너와 이온 결합을 형성함으로써 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 도울 수 있음이 관찰되었다. 그러므로 스크리닝은 더욱더 효율적일 수 있고, 이온 없이 진행되는 동일 검정에 비교되었을 때 더 많은 히트(hit)(후보 조건부 활성 폴리펩티드)가 동정될 수 있다. 적합한 이온은 마그네슘 이온, 황산염 이온, 중황산염 이온, 탄산염 이온, 시트르산염 이온, HAPT 이온, HADP 이온, 중탄산염 이온, 질산염 이온, 아질산염 이온, 인산염 이온, 인산수소 이온, 인산이수소 이온, 과황산염 이온, 모노 과황산염 이온, 붕산염 이온, 젖산염 이온, 스트르산염 이온, 히스티딘 이온, 히스타민 이온 및 암모늄 이온으로부터 선택될 수 있다.
이온들은 이온의 pKa와 가까운 pH에서 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 돕는 기능을 함이 발견되었다. 이러한 이온은 돌연변이 폴리펩티드의 크기에 비하여는 비교적 작은 것이 바람직하다
하나의 구현예에서, 비정상 조건이 정상 생리학적 조건하에서의 정상 생리학적 pH와 상이한 pH이면, 후보 조건부 활성 폴리펩티드에 대한 히트 수를 증가시키는데에 적합한 이온은, 검정에서 시험될 비정상 pH에 가까운 pKa를 가지는 이온들로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 이온의 pKa는 비정상 pH로부터 2 pH 단위(pH unit) 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 1 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.8 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.6 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.5 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.4 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.3 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.2 pH 단위 이하 떨어져 있거나 또는 비정상 pH로부터 0.1 pH 단위 이하 떨어져 있을 수 있다.
pKa가 상이한 온도에서 약간 달라질 수 있는, 본 발명에 유용한 이온의 예시적 pKa는 다음과 같다: 암모늄 이온 pKa 약 9.24, 인산 이수소 pKa 약 7.2, 아세트산 pKa 약 4.76, 히스티딘 pKa 약 6.04, 중탄산염 이온 pKa 약 6.4, 시트르산염 pKa 약 6.4, 젖산염 이온 pKa 약 3.86, 히스타민 pKa 약 6.9, HAPT pKa 6.95(HATP3 - <=> ATP4- + H+) 및 HADP pKa 약 6.88(HADP3- <=> ADP4- + H+).
하나의 구현예에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 이황화물의 존재 하에 검정 및 선택된다. 이황화물의 pKa는 7.05이다. 몇몇 구현예들에서, 상이한 농도의 이황화물이 정상 및 비정상 조건에서 이루어지는 검정에 사용될 수 있다. 대안적으로 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 배지의 이황화물 농도는 대략 동일하고, 또한 특정 조건에 대한 값에서는 약간의 차이가 있는데, 예를 들어 본 검정은 상이한 pH들에서 수행될 수 있다. 검정에 사용될 이황화물의 농도는 1 mM ~ 100 mM일 수 있다. 바람직하게 검정 배지의 이황화물 농도는 2 nM ~ 500 nM, 또는 3 nM ~ 200 nM, 또는 5 nM ~ 100 nM이다. 몇몇 양상에서, 이황화물 농도는 1 mM ~ 20 mM, 또는 2 mM ~ 10 mM일 수 있다. 이황화물의 존재하에 수행되는 검정은 공지되어 있다.
임의의 구현예들에서, 일단 비정상 조건에 대한 pH(즉 비정상 pH)가 공지되면, 후보 조건부 활성 폴리펩티드에 대한 히트를 증가시키는데에 적합한 이온은, 비정상 pH이거나 이와 가까운 pH에서의 pKa를 가지는 이온들로부터 선택될 수 있는데, 예를 들어 후보 이온의 pKa는 비정상 pH로부터 4 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 3 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 2 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 1 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.8 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.6 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.5 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.4 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.3 pH 단위 이하 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.2 pH 단위 이하 떨어져 있거나 또는 비정상 pH로부터 0.1 pH 단위 이하 떨어져 있을 수 있다.
상기 진술된 바와 같이, 이온은, 자체의 pKa이거나 이와 가까운 pKa에서의 pH에서 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 돕는데에 가장 효과적이다. 예를 들어 pH 7.2 ~ 7.6인 검정 용액 중 (pKa 약 6.4인) 중탄산염 이온은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 돕는데에 있어서 그다지 효과적인 것으로 확인되지 않았다. 검정 용액의 pH가 6.7로 감소하였다가 다시 약 6.0으로 더 감소함에 따라서, 중탄산염 이온은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 간 결합을 돕는데에 점차 더 효과적이게 되었다. 결과적으로, pH 7.2 ~ 7.6에서의 검정에서보다 pH 6.0에서의 검정에서 더 많은 히트들이 동정될 수 있었다. 유사하게, 히스티딘은 pH 7.4에서 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 간 결합을 돕는데에 그다지 효과적이지 못하였다. 검정 용액의 pH가 6.7로 감소하였다가 다시 약 6.0으로 더 감소함에 따라서, 히스티딘은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 돕는데에 있어서 점차 더 효과적이게 되었고, 이러한 특징은 또한, 예를 들어 약 6.2 ~ 6.4 범위의 pH에서 더 많은 히트들이 동정될 수 있게 해준다.
정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액의 pH(즉 정상 생리학적 pH) 및 비정상 조건에 대한 검정 용액의 pH(즉 비정상 pH)가 상이할 때, 정상 생리학적 pH와 비정상 pH의 거의 중간 지점으로부터 거의 비정상 pH에 이르기까지의 범위에 pKa를 보이는 이온은, 스크리닝되는 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합에 큰 도움이 될 수 있음이 발견되었다. 결과적으로, 스크리닝 검정은 비정상 조건에서 큰 활성을 보이는 히트 또는 후보 조건부 폴리펩티드를 더 많이 확인함에 있어서 훨씬 더 효율적이다.
몇몇 구현예들에서, pKa는 비정상 pH로부터 떨어져 있는 pH 단위 적어도 1개일 수 있다. 비정상 pH가 산성 pH일 때, 적합한 이온의 pKa는 (비정상 pH - 1)로부터, 비정상 pH와 정상 생리학적 pH 사이 중간 지점에 이르기까지의 범위 내에 있을 수 있다. 비정상 pH가 염기성 pH일 때, 적합한 이온의 pKa는 (비정상 pH + 1)로부터, 비정상 pH와 정상 생리학적 pH 사이 중간 지점에 이르기까지의 범위 내에 있을 수 있다. 이온은 본 출원에 기술된 것들로부터 선택될 수 있다. 그러나 본 출원에 명시되어 있지 않은 더 많은 이온들도 사용될 수 있다. 일단 비정상 pH 및 정상 생리학적 pH가 스크리닝 검정을 위해 선택되면, 당 업계의 숙련자는 비정상 조건에서 높은 활성을 보이는 더 많은 히트를 동정함에 있어서 스크리닝의 효율을 증가시키기에 적합한 pKa를 보이는 임의의 이온을 선택하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 지도 원리를 이용할 수 있음이 이해된다.
예를 들어 예시적 스크리닝에 있어서 비정상 pH가 8.4이고, 정상 생리학적 pH가 7.4일 때, 약 7.9(중간 지점) 내지 9.4(즉 8.4 + 1)의 범위에 있는 pKa를 보이는 임의의 이온이 스크리닝에 사용될 수 있다. 상기 범위에 있는 pKa를 보이는 몇몇 이온들은, 트리신(pKa 8.05), 히드라진(pKa 8.1), 비신(pKa 8.26), N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산)(pKa 8.3), N-트리스[하이드록시메틸]메틸-3-아미노프로판설폰산(pKa 8.4), 타우린(pKa 9.06)으로부터 유래하는 이온들을 포함한다. 다른 예로서, 예시적 스크리닝에 대해 비정상 pH가 6이고, 정상 생리학적 pH가 7.4일 때, 약 5(즉 6 - 1) 내지 6.7(중간 지점)의 범위에 있는 pKa를 보이는 임의의 이온이 스크리닝에 사용될 수 있다. 상기 범위에 있는 pKa를 보이는 몇몇 이온들은, 말레이트(pKa 5.13), 피리딘(pKa 5.23), 피페라진(pKa 5.33), 카코딜산염(pKa 6.27), 숙신산염(pKa 5.64), 2-(N-모폴리노)에탄설폰산(pKa 6.10), 시트르산염(pKa 6.4), 히스티딘(pKa 6.04) 및 비스-트리스(pKa 6.46)로부터 유래하는 이온들을 포함한다. 당 업계의 숙련자는 이 범위에 속하는 pKa를 보이는 이온으로 전환될 수 있는 것으로 공지된 화합물(무기 화합물 및 유기 화합물 둘 다 포함)을 확인하기 위해 다수의 화학 매뉴얼과 교과서를 참고할 수 있을 것이다. 적합한 pKa를 보이는 화합물들 가운데, 분자량이 더 작은 화합물이 바람직할 수 있다.
결론적으로 본 발명은, 조건부 활성 폴리펩티드의 제조는 결국 야생형 단백질로부터 딱 맞는 폴리펩티드 돌연변이체를 생산하는 것뿐만 아니라, 검정 용액 중 적합한 pKa를 보이는 이온을 사용하는 것에 의존적임을 예기치 않게 발견하였다. 본 발명은, 이온이 큰 라이브러리로부터 큰 활성을 보이는 돌연변이체들을 효율적으로 선택하는 것을 촉진할 수 있기 때문에, (예를 들어 CPE 및 CPS를 통해) 돌연변이 폴리펩티드의 큰 라이브러리를 제조하는 것 이외에도 적합한 이온(적절한 pKa를 보이는 이온)을 발견하고자 하는 노력들도 또한 행하여져야 할 것으로 생각한다. 또한 적합한 이온이 없이 행하여지는 스크리닝은 그 효율이 떨어지고, 큰 활성을 보이는 돌연변이체가 발견될 확률 또한 감소되는 것으로 생각한다. 결과적으로 큰 활성을 보이는 동일한 수만큼의 돌연변이체를 적합한 이온이 없이 얻기 위해서는 스크리닝의 라운드가 다수 회 행하여질 필요가 있을 수 있는 것이다.
검정 용액 중 이온은 검정 용액 성분으로부터 현장에서 생성될 수 있거나, 또는 검정 용액 중에 직접 포함될 수 있다. 예를 들어 공기로부터 유래하는 CO2는 검정 용액 중에 용해되어, 탄산염 이온과 중탄산염 이온을 제공할 수 있다. 추가의 예를 들어, 인산 이수소 나트륨이 검정 용액에 첨가되면, 인산이수소 이온이 제공될 수 있다.
이 성분의 (정상 생리학적 조건하에서의 검정 및 비정상 조건하에서의 검정 둘 다에 대한) 검정 용액 중 농도는, 포유동물, 예를 들어 인간의 자연 발생 체액 중에서 통상 발견되는 성분과 동일한 성분의 농도와 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 다른 구현예들에서, 특히 어떤 성분이 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 돕는 기능을 할 수 있는 이온일 때, 해당 성분의 농도는 더 높을 수 있는데, 그 이유는 이와 같은 이온 더 높은 농도만큼은 돌연변이 폴리펩티드 및 이의 결합 파트너와 이온 결합을 형성할 수 있어서, 실질적으로 결합을 촉진하고, 더 많은 히트 또는 후보 조건부 활성 폴리펩티드가 발견될 확률을 증가시키기 때문이다.
몇몇 구현예들에서, 검정 용액 중 이온 농도는, 특히 정상 생리학적 농도를 초과하는 농도가 사용될 때, 검정이 이용되어 더 많은 히트가 발견될 확률과 양의 상관관계에 있을 수 있다. 예를 들어 인간 혈청 중 중탄산염 이온의 농도는 약 15 mM ~ 30 mM이다. 하나의 예에서, 검정 용액 중 중탄산염 이온의 농도가 3 mM로부터 10 mM, 20 mM, 30 mM, 50 mM 및 100 mM로 증가함에 따라서, 중탄산염 농도가 각각 증가함과 아울러 검정 중 히트의 수도 또한 증가하게 된다. 이를 살펴보았을 때, 검정 용액에는 농도 약 3 mM 내지 약 200 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 150 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 20 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 25 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 30 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 35 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 40 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 50 mM 내지 약 100 mM의 중탄산염이 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 검정 용액 중 시트르산염의 농도는 약 30 μM 내지 약 120 μM, 또는 약 40 μM 내지 약 110 μM, 또는 약 50 μM 내지 약 110 μM, 또는 약 60 μM 내지 약 100 μM, 또는 약 μM 내지 약 90 μM, 또는 약 μM일 수 있다.
하나의 구현예에서, 정상 생리학적 조건은 7.2 ~ 7.6 범위의 정상 생리학적 pH이고, 비정상 조건은 5.5 ~ 7.2, 6 ~ 7, 또는 6.2 ~ 6.8 범위의 비정상 pH이다. 정상 생리학적 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액은 정상 생리학적 pH를 보이고, 중탄산염 이온은 50 mM 함유한다. 비정상 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액은 비정상 pH를 보이고, 중탄산염 이온은 50 mM 함유한다. 중탄산염 이온의 pKa는 약 6.4이므로, 중탄산염 이온은 비정상 pH 6.0 ~ 6.4, 예를 들어 pH 6.0 또는 6.2에서 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 간 결합을 도울 수 있다.
또 다른 구현예에서, 정상 생리학적 조건은 7.2 ~ 7.6 범위의 정상 생리학적 pH이고, 비정상 조건은 5.5 ~ 7.2, 6 ~ 7, 또는 6.2 ~ 6.8 범위의 비정상 pH이다. 정상 생리학적 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액은 정상 생리학적 pH를 보이고, 시트르산염 이온은 80 μM 함유한다. 비정상 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액은 비정상 pH를 보이고, 시트르산염 이온은 80 μM 함유한다. 시트르산염 이온의 pKa는 6.4이므로, 시트르산염 이온은 비정상 조건 pH 6.0 ~ 6.4에서의 검정 용액 중 돌연변이 폴리펩티드와 결합 파트너 간 결합을 효과적으로 도울 수 있다. 그러므로, pH 6.0 ~ 6.4의 조건하에서 더 큰 결합 활성을 보이고, pH 7.2 ~ 7.8의 조건하에서는 더 작은 활성을 보이는 후보 조건부 활성 폴리펩티드가 더 많이 동정될 수 있다. 다른 이온, 예를 들어 아세트산염, 히스티딘, 중탄산염, HATP 및 HADP는 유사한 방법으로 작용을 하여, 해당 이온을 함유하는 검정 용액이 해당 이온의 pKa와 거의 동일한 pH에서 더 큰 결합 활성을 보이고, 해당 이온의 pKa와 상이한 pH(예를 들어 정상 생리학적 pH)에서 더 작은 결합 활성을 보이는 돌연변이 폴리펩티드를 효과적으로 스크리닝할 수 있도록 만들 수 있다.
또 다른 구현예에서, 정상 생리학적 조건은 37 ℃의 정상 생리학적 온도이고, 비정상 조건은 38℃ ~ 39℃(몇몇 종양 미세환경의 온도)의 비정상 온도이다. 정상 생리학적 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액은 정상 생리학적 온도를 보이고, 중탄산염 이온을 20 mM 함유한다. 비정상 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액은 비정상 온도를 보이고, 중탄산염 이온을 20 mM 함유한다.
또 다른 구현예에서, 정상 생리학적 조건은 정상 인간 혈청 중 전해질의 구체적인 농도이고, 비정상 조건은, 동물 또는 인간의 체내 상이한 병소에 존재할 수 있거나, 또는 인간 혈청 중 전해질의 정상 생리학적 농도를 변경하는, 동물 또는 인간의 조건으로부터 말미암을 수 있는 동일 전해질의 농도(상이하고 비정상적인 농도)이다.
돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너 간 결합은 또한 다수의 기타 방식으로 영향받을 수 있다. 통상적으로, 이 영향력은 하나 이상의 추가 성분이 검정 배지에 포함됨으로써 발휘될 것이다. 이와 같은 추가의 성분들은 돌연변이 폴리펩티드, 이의 결합 파트너 중 어느 하나, 또는 둘 다와 상호작용하도록 디자인될 수 있다. 또한, 이 같은 추가의 성분들은 2개 이상의 상호작용의 조합뿐만 아니라, 결합에 영향을 주는 상호작용들 중 2개 이상의 유형의 조합을 이용할 수 있다.
하나의 구현예에서, 관심 있는 결합 상호작용은 항체와 항원 사이의 상호작용이다. 이 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분들은 검정 용액에 포함되어, 항체 또는 항원, 아니면 이 둘 다에 영향력을 발휘할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 결합 상호작용은 향상될 수 있다.
돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 이온 결합을 형성하여, 돌연변이 폴리펩티드와 결합 파트너 간 결합을 도울 수 있는 이온 이외에, 본 발명은 또한 돌연변이 폴리펩티드 및 이의 결합 파트너 사이의 결합을 돕는데에 사용될 수 있는 기타 성분들도 포함한다. 하나의 구현예에서, 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 수소 결합을 형성할 수 있는 분자들이 사용된다. 다른 구현예에서, 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 소수성 상호작용을 할 수 있는 분자들이 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 반 데르 발스 상호작용을 할 수 있는 분자들이 고려된다.
수소 결합은 음전기 원자, 예를 들어 탄소, 질소, 산소, 황, 염소 또는 플루오르(수소 결합 공여체)와, 전자 공여 원자, 예를 들어 질소, 산소, 황, 염소 또는 플루오르(수소 결합 수용체)의 비 공유 전자쌍 사이의 비교적 약한 비 공유성 상호작용이다.
돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 수소 결합을 형성할 수 있는 성분들은 유기 분자뿐만 아니라, 극성 결합을 가지는 무기 분자를 포함한다. 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이 돌연변이 폴리펩티드에 대한 결합 파트너는 통상 수소 결합을 형성할 수 있는 아미노산을 함유한다. 적합한 아미노산은 수소 결합을 형성할 수 있는 극성기를 기는 측쇄를 가진다. 적합한 아미노산의 비 제한적 예들로서는 글루타민(Gln), 글루탐산(Glu), 아르기닌(Arg), 아스파라긴(Asn), 아스파르트산(Asp), 리신(Lys), 히스티딘(His), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 티로신(Tyr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met) 및 트립토판(Trp)을 포함한다.
이와 같은 아미노산은 수소 공여체 및 수소 수용체 둘 다로서의 역할을 할 수 있다. 예를 들어 -OH기(Ser, Thr 및 Tyr에서 살펴볼 수 있음)에서의 산소 원자, -C=O기(Glu 및 Asp에서 살펴볼 수 있음)에서의 산소 원자, -SH기 또는 -SC기(Cys 및 Met에서 살펴볼 수 있음)에서의 황 원자, -NH3 +기(Lys 및 Arg에서 살펴볼 수 있음)에서의 질소 원자, 그리고 -NH-기(Trp, His 및 Arg에서 살펴볼 수 있음)에서의 질소 원자는 모두 수소 수용체로서의 역할을 할 수 있다. 또한 본 목록 중 수소 원자를 포함하는 기들(예를 들어 -OH, -SH, NH3 + 및 -NH-)은 수소 공여체로서의 역할을 할 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너의 주쇄는 또한 하나 이상의 수소 결합을 형성하는데에 참여할 수도 있다. 예를 들어 주쇄는, 예를 들어 펩티드 결합에서와 같이 -(C=O)-NH-의 반복 구조를 가질 수 있다. 이 구조 내 산소 및 질소 원자는 수소 수용체로서의 역할을 할 수 있는 한편, 수소 원자는 수소 결합에 참여할 수 있다.
수소 결합에 사용될 수 있는 수소 또는 산소 원자를 수반하는 극성 결합 적어도 1개를 가지는 무기 화합물은, 예를 들어 H2O, NH3, H2O2, 히드라진, 탄산염, 황산염 및 인산염을 포함할 수 있다. 유기 화합물, 예를 들어 알코올; 페놀; 티올; 지방족, 아민, 아미드; 에폭시화물, 카르복실산; 케톤, 알데히드, 에테르, 에스테르, 유기염화물 및 유기 플루오르화물을 포함한다. 수소 결합을 형성할 수 있는 화합물은 화학 문헌, 예를 들어 그 개시내용이 전체로서 참조로 본원에 첨부되어 있는 "The Nature of the Chemical Bond," by Linus Pauling, Cornell University Press, 1940, pages 284 ~ 334에 널리 공지되어 있다.
몇몇 구현예들에서, 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 펜탄올, 1-헥산올, 2-옥탄올, 1-데칸올, 사이클로헥산올, 그리고 고급 알코올; 디올, 예를 들어 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 디에틸렌 글리콜 및 폴리알킬렌 글리콜을 포함할 수 있다. 적합한 페놀은 하이드로퀴논, 레소르시놀, 카테콜, 페놀, o-, m- 및 p-크레솔, 티몰, 알파 및 베타-나프톨, 피로갈롤, 구아이아콜 및 플로로글루신올을 포함한다. 적합한 티올은 메탄티올, 에탄티올, 1-프로판티올, 2-프로판티올, 부탄티올, tert-부틸 머캅탄, 펜탄티올, 헥산티올, 티오페놀, 디머캅토숙신산, 2-머캅토에탄올 및 2-머캅토인돌을 포함한다. 적합한 아민은 메틸아민, 에틸아민, 프로필아민, 이소프로필아민, 아닐린, 디메틸아민 및 메틸에틸아민, 트리메틸아민, 아지리딘, 피페리딘, N-메틸피페리딘, 벤지딘, 사이클로헥실 아민, 에틸렌 디아민, 헥사메틸렌 디아민, o-, m- 및 p-톨루이딘 및 N-페닐피페리딘을 포함한다. 적합한 아미드는 에탄아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N,N-디메틸 포름아미드, N,N-디메틸 메톡시 아세트아미드 및 N-메틸-N-p-시아노에틸 포름아미드를 포함한다. 에폭시화물은 산화에틸렌, 산화프로필렌, tert-부틸 하이드로퍼옥사이드, 산화스티렌, 에폭시화물 글리시돌, 산화사이클로헥센, 과산화 디-tert-부틸, 큐멘 하이드로퍼옥사이드, 에틸벤젠 하이드로퍼옥사이드, 산화이소부틸렌 및 1,2-에폭시옥탄을 포함할 수 있다. 카르복실산은 테레프탈산, 이소프탈산, 프탈산, 살리실산, 벤조산, 아세트산, 라우르산, 아디프산, 젖산, 시트르산, 아크릴산, 글리신, 헥사-하이드로벤조산, o-, m- 및 p-톨루산, 니코틴산, 이소니코틴산 및 파라-아미노벤조산을 포함할 수 있다. 케톤은 아세톤, 3-프로파논, 부타논, 펜타논, 메틸에틸 케톤, 디이소부틸 케톤, 에틸 부틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 메틸 tert-부틸 케톤, 사이클로헥사논, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 프로필 케톤, 메틸 부틸 케톤, 메틸 아밀 케톤, 메틸 헥실 케톤, 디에틸 케톤, 에틸 부틸 케톤, 디프로필 케톤, 디이소부틸 케톤, 디아세톤 알코올, 포론, 이소포론, 사이클로헥사논, 메틸 사이클로헥사논 및 아세토페논을 포함할 수 있다. 알데히드는 포름알데히드, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 부티르알데히드, 벤잘데히드, 신남알데히드, 소부티르알데히드, 발레르알데히드, 옥탈데히드, 벤잘데히드, 신남알데히드, 사이클로헥사논, 살리실알데히드 및 퍼푸랄을 포함할 수 있다. 에스테르는 아세트산에틸, 아세트산메틸, 포름산에틸, 아세트산부틸, 젖산에틸, 부티르산에틸, 아세트산프로필, 포름산에틸, 포름산프로필, 포름산부틸, 포름산아밀, 아세트산메틸, 아세트산에틸, 아세트산프로필, 아세트산부틸, 아세트산아밀, 아세트산메틸이소아밀, 아세트산메톡시부틸, 아세트산헥실, 아세트산사이클로헥실, 아세트산벤질, 프로피온산메틸, 프로피온산에틸, 프로피온산부틸, 프로피온산아밀, 부티르산메틸, 부티르산에틸, 부티르산부틸, 부티르산아밀, 아세토아세트산메틸 및 아세토아세트산에틸을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 에테르는 디메틸 에테르, 메틸 에틸 에테르, 디에틸 에테르, 메틸 프로필 에테르 및 디메톡시에탄을 포함한다. 에테르는 사이클릭일 수 있는데, 예를 들어 산화에틸렌, 테트라하이드로푸란 및 디옥산일 수 있다.
유기 염화물은 클로로포름, 펜타클로로에탄, 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 사염화탄소, 테트라클로로메탄, 테트라클로로에탄, 펜타클로로에탄, 트리클로로에틸렌, 테트라클로로에틸렌 및 이염화에틸렌을 포함한다. 유기플루오르화물은 플루오로메탄, 디플루오로메탄, 트리플루오로메탄, 트리플루오로에탄, 테트라플루오로에탄, 펜타플루오로에탄, 디플루오로프로판, 트리플루오로프로판, 테트라플루오로프로판, 펜타플루오로프로판, 헥사플루오로프로판 및 헵타플루오로프로판을 포함할 수 있다.
수소 결합은 결합의 세기에 의해 강한 수소 결합, 중간 수소 결합 또는 약한 수소 결합으로 구분될 수 있다(Jeffrey, George A.: An introduction to hydrogen bonding, Oxford University Press, 1997). 강한 수소 결합은 공여체-수용체 간 거리가 2.2 Å ~ 2.5 Å이고, 에너지는 14 kcal/mol ~ 40 kcal/mol이다. 중간 수소 결합은 공여체-수용체 간 거리가 2.5 Å ~ 3.2 Å이고, 에너지는 4 kcal/mol ~ 15 kcal/mol이다. 약한 수소 결합은 공여체-수용체 간 거리가 3.2 Å ~ 4.0 Å이고, 에너지는 4 kcal/mol 미만이다. 에너지 준위를 가지는 수소 결합의 몇몇 예들은 다음과 같은 것들이 있다: F-H...:F(38.6 kcal/mol), O-H...:N(6.9 kcal/mol), O-H...:O(5.0 kcal/mol), N-H...:N(3.1 kcal/mol) 및 N-H...:0(1.9 kcal/mol). 추가로 문헌[Perrin et al. "Strong" hydrogen bonds in chemistry and biology, Annual Review of Physical Chemistry, vol. 48, pages 511-544, 1997; Guthrie, "Short strong hydrogen bonds: can they explain enzymic catalysis?" Chemistry & Biology March 1996, 3: 163-170]을 참조한다.
몇몇 구현예들에서, 본 발명에 사용된 성분들은 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 강한 수소 결합을 형성할 수 있다. 이러한 성분들은 강한 전기 음성도를 보이는 원자를 가지는 경향이 있다. 가장 강한 전기 음성도를 가지는 것으로 알려진 원자들 및 그 순서는 F > O > Cl > N와 같다. 그러므로, 바람직하게 본 발명은 수소 결합을 형성함에 있어서 플루오르, 하이드록실기 또는 카르보닐기를 포함하는 유기 화합물을 사용한다. 하나의 구현예에서, 유기플루오르는 강한 수소 결합을 형성하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 소수성 상호작용을 할 수 있는 성분들이 사용된다. 이러한 성분들은 소수성 기를 가지는 유기 화합물을 포함한다.
소수성 상호작용은 소수성 화합물 또는 어느 화합물의 소수성 영역과, 또 다른 소수성 화합물 또는 또 다른 화합물의 소수성 영역 간에 가역적으로 유인하는 상호작용이다. 이러한 상호작용 유형은 문헌["Hydrophobic Interactions," A. Ben-Nairn (1980), Plenum Press, New York]에 기술되어 있다.
소수성 물질은 자체의 무극성으로 말미암아 물 분자에 의해 반발된다. 수용액 중 비교적 무극성인 분자 또는 기가 물보다는 다른 무극성 분자 또는 기와 회합될 때, 이는 "소수성 상호작용"이라 지칭된다.
돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너는 통상적으로 소수성 상호작용을 할 수 있는 아미노산을 포함한다. 이와 같은 아미노산은 통상적으로 소수성 상호작용을 할 수 있는 무극성 기와 함께 적어도 1개의 측쇄를 가지는 것으로 특징지어질 것이다. 소수성 아미노산은, 예를 들어 알라닌(Ala), 이소루신(Ile), 루신(Leu), 페닐알라닌(Phe), 발린(Val), 프롤린(Pro), 글리신(Gly)을 포함하며, 드물게는 메티오닌(Met) 및 트립토판(Trp)도 포함한다.
돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 소수성 상호작용을 할 수 있는 성분들은 소수성 분자, 또는 소수성 기를 적어도 1개 함유하는 분자인 유기 화합물들을 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 이 같은 소수성 성분들은 방향족 탄화수소, 치환된 방향족 탄화수소, 다 방향족 탄화수소, 방향족 또는 비 방향족 헤테로사이클, 사이클로알칸, 알칸, 알켄 및 알킨으로부터 선택된 탄화수소일 수 있다. 소수성 기는 방향족 기, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐 및 알키닐 기를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "알킬", "알케닐" 및 "알키닐"이란 용어는, 1개 내지 30개의 탄소 원자를 가지는 불포화 지방족 기, 예를 들어 직쇄 알케닐/알키닐 기, 분지쇄 알케닐/알키닐 기, 사이클로알케닐(비 사이클릭) 기, 알킬 치환 사이클로알킬 기 및 사이클로알킬 치환 알케닐/알키닐 기를 지칭한다. 이러한 탄화수소 기들은 또한 하나 이상의 탄소 원자 상에서 치환될 수도 있다.
소수성 상호작용의 세기는 서로 상호작용할 수 있는 "소수성 물질(hydrophobe)"의 가용 양을 기반으로 결정됨이 이해될 수 있다. 그러므로 소수성 상호작용은, 예를 들어 소수성 상호작용에 수반되는 분자들 내 소수성 기의 "소수"성 및/또는 이 "소수"성의 정도를 증가시킴으로써 조정될 수 있다. 예를 들어 원래 형태가 소수성인 기는 탄화수소 사슬을 포함할 수 있고, 탄소 주쇄를 이루는 탄소들 중 하나에 소수성 측쇄를 결합시킴으로써 소수성(소수성기가 수반되는 소수성 상호작용의 세기를 증가시키는 능력)이 증가하도록 변형될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이는 다양한 폴리사이클릭 화합물, 예를 들어 다양한 스테로이드 화합물 및/또는 이의 유도체, 예를 들어 스테롤 류 화합물, 더욱 구체적으로는 콜레스테롤의 결합을 포함할 수 있다. 일반적으로 측쇄는 선형 사슬, 방향족, 지방족, 사이클릭, 폴리사이클일릭일 수 있거나, 또는 당 업계의 숙련자들에 의해 고려되는 바와 같은 소수성 측쇄의 기타 임의의 다양한 유형일 수 있다.
돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 반 데르 발스 상호작용을 할 수 있는 성분의 유형은 일반적으로 극성기를 가지는 화합물이지만, 항상 그러한 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같은 "반 데르 발스 상호작용"이란, 쌍극자-쌍극자 간 상호작용에 의해 유발되는 원자들, 기들, 분자들 및 표면들 사이의 인력 및/또는 근처 원자들, 기들, 분자들의 양자 역학으로 말미암은 유동적 분극 시 상관관계를 지칭한다.
본 발명에 있어서의 반 데르 발스 상호작용은 돌연변이 폴리펩티드 또는 결합 파트너 및 성분 사이의 인력이다. 반 데르 발스 상호작용은 3가지 발생원으로부터 발생한다. 첫 번째, 일부 분자들/기들은 전기적으로 중성일지라도 영구 전기 쌍극자일 수 있다. 일부 분자들/기들의 구조에 있어서 전자 전하 분포의 고정된 왜곡으로 말미암아, 분자/기의 한쪽은 항상 어느 정도 "+"이고, 반대쪽은 어느 정도 "-"이게 된다. 이와 같은 영구 쌍극자가 서로 정렬되는 경향은 순 인력(net attractive force)을 초래한다. 이는 2개의 영구 쌍극자들 간의 상호작용이다(Keesom 힘).
두 번째, 영구 쌍극자인 분자들의 존재는 일시적으로 또 다른 근처 극성 또는 무극성 분자의 전자 전하를 왜곡시킬 수 있고, 이로 말미암아 추가의 분극이 유도된다. 추가의 인력이 영구 쌍극자와 이웃하는 유도 쌍극자의 상호작용으로부터 기인하게 된다. 이는 영구 쌍극자와 상응하는 유도 쌍극자 사이의 상호작용으로서, Debye 힘이라 칭하여질 수 있다. 세 번째, 수반된 어떠한 분자들도 영구 쌍극자가 아니지만(예를 들어 유기 액체 벤젠), 분자들 내에 일시적으로 유도된 쌍극자 2개를 가지는 분자들 사이에 인력이 존재한다. 이는, 일시적 유도 쌍극자 2개 사이의 상호작용으로서, London 분산 력이라 칭하여질 수 있다.
반 데르 발스 상호작용을 할 수 있는 결합 파트너 및/또는 돌연변이 폴리펩티드 내에 다수의 아미노산이 존재한다. 이러한 아미노산, 예를 들어 글루타민(Gln), 아스파라긴(Asn), 히스티딘(His), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 티로신(Tyr), 스테인(Cys), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp)은 극성 측쇄를 가질 수 있다. 이러한 아미노산들, 예를 들어 알라닌(Ala), 이소루신(Ile), 루신(Leu), 페닐알라닌(Phe), 발린(Val), 프롤린(Pro), 글리신(Gly)은 또한 무 극성기를 가지는 측쇄를 가질 수도 있다.
돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 반 데르 발스 상호작용을 할 수 있는 성분들은, 검정 용액에 가용성인 극성 또는 무극성 무기 화합물을 포함한다. 검정 용액은 일반적으로 수용액이므로, 이 같은 극성 또는 무극성 무기 화합물은 물에 가용성인 것이 바람직하다. 반 데르 발스 상호작용에 바람직한 물질들은 극성이어서, 쌍극자-쌍극자 상호작용을 할 수 있는 것들이다. 예를 들어 AlF3는 극성 Al-F 결합들을 가지고, 물에 가용성(20℃에서 물 100 ㎖ 중 약 0.67 g 용해)이다. HgCl2는 극성 Hg-Cl 결합을 가지고, 20℃에서 물 100 ㎖ 중 약 7.4 g 용해된다. PrCl2는 극성 Pr-Cl 결합을 가지고, 20℃에서 물 100 ㎖ 중 약 1 g 용해된다.
반 데르 발스 상호작용을 할 수 있는 적합한 극성 화합물은 알코올, 티올, 케톤, 아민, 아미드, 에스테르, 에테르 및 알데히드를 포함한다. 이와 같은 화합물의 적합한 예들은 수소 결합과 관련하여 전술되어 있다. 반 데르 발스 상호작용을 할 수 있는 적합한 무극성 화합물은 방향족 탄화수소, 치환된 방향족 탄화수소, 폴리방향족 탄화수소, 방향족 또는 비 방향족 헤테로사이클, 사이클로알칸, 알칸, 알켄, 알킨을 포함한다.
수소 결합 성분, 소수성 성분 및 반 데르 발스 성분은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너의 결합에 다수의 방식으로 영향을 주기 위해 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 수소 결합, 소수성 상호작용 및/또는 반 데르 발스 상호작용은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 간에 가교를 형성할 수 있다. 이러한 가교는 돌연변이 폴리펩티드와 결합 파트너가 서로 더 근위에 위치하도록 하여, 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 결합 파트너가 서로에 대해 결합을 촉진하는 형태로서 결합하고/결합하거나 자리 잡도록 촉진할 수 있다.
다른 구현예에서, 수소 결합 및/또는 소수성 상호작용은, 예를 들어 돌연변이 폴리펩티드와 결합 파트너가, 결합 확률을 높이는 형태로서 서로 모이거나 회합하도록 유도하여, 이 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너의 결합 확률을 높일 수 있다. 그러므로 이러한 상호작용들 중 하나 이상은, 돌연변이 폴리펩티드 및 결합 파트너가 더 가까이 모이도록 만들거나, 또는 이 돌연변이 폴리펩티드와 결합 파트너가, 예를 들어 결합 위치들이 서로 더 가까이에 유인되도록 유도하거나, 분자들의 비 결합 부분들이 서로 더 멀리 떨어지도록 정렬시켜 결합 위치가 서로 더욱 가까이 위치하도록 만듦으로써 결합을 촉진하는 형태로 정렬되도록 만들기 위해 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 수소 결합 및/또는 소수성 상호작용은 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너의 입체구조에 영향을 미쳐, 이 입체구조가, 돌연변이 폴리펩티드 및 이의 결합 파트너의 결합에 더욱 유연하도록 만들 수 있다. 구체적으로 돌연변이 폴리펩티드의 아미노산들 중 하나 이상 및/또는 결합 파트너의 결합 또는 상호작용은, 돌연변이 폴리펩티드/결합 파트너 결합 반응에 유리한 돌연변이 폴리펩티드 또는 결합 파트너 내에서 입체구조 변형 하나 이상을 유발시킬 수 있다.
본 발명은 검정들 2쌍을 수행하는데, 하나의 검정은, 정상 생리학적 조건에서 돌연변이 폴리펩티드의 기원이 된 모 폴리펩티드 활성과 비교되었을 때, 이러한 정상 생리학적 조건에서의 검정에서 돌연변이 폴리펩티드 활성의 감소를 추구하는 것이고, 다른 하나의 검정은, 비정상 조건에서 돌연변이 폴리펩티드의 기원이 된 모 폴리펩티드 활성과 비교되었을 때, 이러한 비정상 조건에서의 검정에서 돌연변이 폴리펩티드 활성의 증가를 추구하는 것이다. WO 2017/078839에 기술된 예들은 정상 생리학적 pH에서보다 활성이 요망되는 비정상 pH에서 활성이 더 큰 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하는 것에 관한 예시이다.
하나의 구현예에서, 돌연변이 폴리펩티드를 대상으로 정상 생리학적 조건에서의 검정과 비정상 조건에서의 검정이 수행된다. 조건부 활성 폴리펩티드는 비정상 조건하 검정에서의 활성이, 정상 생리학적 조건하 검정에서의 돌연변이 폴리펩티드의 동일 활성에 비해 증가한 돌연변이 폴리펩티드들로부터 선택된다.
본 발명의 검정들의 쌍들에 사용된 조건은 검정 용액 또는 매질의 온도, pH, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스, 전해질 농도, 그리고 기타 임의의 성분의 농도로부터 선택될 수 있다. 그러므로, 검정 배지의 특정 성분은 검정들의 쌍 둘 다에서와 실질적으로 동일한 농도로 사용될 수 있다. 이러한 경우, 성분은 통상 인간이나 동물의 특정 환경, 예를 들어 혈청, 종양 미세환경, 활액막 환경, 신경 환경 또는 투여 점에서 우연히 마주할 수 있거나, 투여된 치료제가 횡단할 수 있거나, 또는 치료지점에서 우연히 마주할 수 있는 임의의 기타 환경을 모의하기 위한 목적으로 존재한다. 이 같은 환경들을 모의하는 성분 하나 이상을 선택함에 있어서 한 가지 중요한 양상은, 검정들의 쌍들이 사용되어 수행된 선택 공정의 결과들을 이러한 성분이 개선할 수 있다는 점이다. 예를 들어 특정 환경을 모의하는 것은, 해당 환경 중 특정 성분의 돌연변이 폴리펩티드에 대한 다양한 효과들이 선택 공정에서 평가될 수 있도록 허용한다. 특정 환경의 성분들은, 예를 들어 돌연변이 폴리펩티드를 변경할 수 있거나 이와 결합할 수 있거나, 돌연변이 폴리펩티드의 활성을 억제할 수 있거나, 돌연변이 폴리펩티드를 비활성화할 수 있는 식일 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 검정 용액의 성분 하나 이상은 바람직하게 소 분자 또는 이온, 예를 들어 이황화물, 황화수소, 히스티딘, 히스타민, 시트르산염, 중탄산염, 젖산염 및 아세트산염이다. 하나의 구현예에서, 소 분자 또는 이온 성분은 바람직하게 검정 용액 중 약 100 μM 내지 약 100 mM, 더욱 바람직하게 약 0.5 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 농도로 존재한다.
검정 용액 중 성분의 농도는, 포유동물, 예를 들어 인간의 자연 발생 체액 중에서 통상 발견되는 동일 성분의 농도와 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 이는, 체액 중 성분의 정상 생리학적 농도라고 칭하여질 수 있다. 다른 구현예들에서, 검정 용액 중 특정 성분의 농도는, 포유동물, 예를 들어 인간의 자연 발생 체액 중에서 통상 발견되는 동일 성분의 농도에 못 미치거나 이보다 더 높을 수 있다.
다른 구현예에서, 성분은 검정들의 쌍들 각각에 실질적으로 상이한 농도로 존재할 수 있다. 이러한 경우, 성분의 존재, 부재 또는 농도는 검정 대상 조건이 되는데, 그 이유는 성분의 농도가, 정상 생리학적 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액과, 비정상 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액 사이에 차이가 나는 조건이기 때문이다. 그러므로 본 발명의 방법에 관한 이 구현예에 의해 생산되는 조건부 활성 폴리펩티드는 적어도 부분적으로 성분의 농도에 의존적인 활성에 대해 선택될 것이다.
몇몇 구현예들에서, 성분은 검정 용액들 한 쌍에 존재할 수 있지만, 검정 용액들 다른 쌍에는 전혀 존재하지 않을 수 있다. 예를 들어 비정상 조건에 대한 검정 용액 중 젖산염의 농도는 종양 미세환경 내 젖산염의 농도를 모의하는 수준으로 설정될 수 있다. 젖산염은 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액들의 쌍에는 존재하지 않을 수 있다.
하나의 구현예에서, 정상 생리학적 조건은 정상 생리학적 조건을 나타내는 제1 젖산염 농도이고, 비정상 조건은 체내 특정 병소에 존재하는 비정상 조건을 나타내는 제2 젖산염 농도이다.
다른 예에서, 글루코스는 종양 미세환경에서 발견될 수 있는 글루코스의 부재를 모의하기 위해 비정상 조건에 대한 검정 용액 중에 존재할 수 없는 한편, 글루코스는 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액들 쌍에서 혈장 글루코스 농도를 모의하는 수준으로 설정될 수 있다. 이 특징은, 수송 중 활성이 없어진다거나 최소화되지 않고, 또한 조건부 활성 폴리펩티드가 비정상 조건에 대한 검정 용액의 성분 농도가 조성된 환경에 도달할 때 이 조건부 활성 폴리펩티드가 활성화되지 않으면서, 조건부 활성 폴리펩티드를 병소 또는 환경에 우선적으로 전달하기 위해 이용될 수 있다.
예를 들어 종양 미세환경은 인간 혈청과 비교되었을 때, 통상 더 낮은 글루코스 농도와 더 높은 젖산염 농도를 보인다. 글루코스의 정상 생리학적 농도는 혈청 중 약 2.5 mM 내지 약 10 mM의 범위에 있다. 다른 한편, 글루코스 농도는 통상 종양 미세환경에서 0.05 mM 내지 0.5 mM의 범위로 매우 낮다. 하나의 구현예에서, 정상 생리학적 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액의 글루코스 농도는 약 2.5 mM 내지 약 10 mM의 범위이고, 비정상 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액의 글루코스 농도는 약 0.05 mM 내지 약 0.5 mM의 범위에 있다. 이와 같이 제조된 조건부 활성 폴리펩티드는 저 글루코스 환경(종양 미세환경)에서의 활성이 고 글루코스 환경(정상 조직 또는 혈액)에서의 활성보다 더 크다. 이 조건부 활성 폴리펩티드는 종양 미세환경에서는 기능성일 것이지만, 수송시 혈류 중에서는 낮은 활성을 보일 것이다.
혈청 중 젖산염의 정상 생리학적 농도는 약 1 mM 내지 약 2 mM의 범위에 있다. 다른 한편, 젖산염 농도는 통상 종양 미세환경에서 10 mM 내지 20 mM의 범위에 있다. 하나의 구현예에서, 정상 생리학적 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액의 젖산염 농도는 약 1 mM 내지 약 2 mM의 범위에 있고, 비정상 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액의 젖산염 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM의 범위에 있다. 이와 같이 제조된 조건부 활성 폴리펩티드는 고 젖산염 농도 환경(종양 미세환경)에서의 활성이 저 젖산염 농도 환경(정상 조직 또는 혈액)에서의 활성보다 더 크다. 그러므로 이 조건부 활성 폴리펩티드는 종양 미세환경에서는 기능성일 것이지만, 수송시 혈류 중에서는 낮은 활성을 보일 것이다.
유사하게, 근육통의 젖산염 농도는 정상보다 더 높다(비정상이다). 그러므로 근육통 환경에서 활성을 보이게 될 돌연변이 폴리펩티드를 찾을 때, 비정상 조건에서의 검정들의 쌍은 근육통 환경을 모의하도록 더 높은 농도의 젖산염 존재 하에서 수행될 수 있는 한편, 정상 생리학적 조건에서의 검정들의 쌍은 더 낮은 농도의 젖산염 존재 하에서, 또는 젖산염 부재 하에서 수행될 수 있다. 이러한 방식으로, 돌연변이 폴리펩티드는 젖산염 농도가 증가한 근육통 환경에서 향상된 활성에 대해 선택될 수 있다. 이러한 조건부 활성 폴리펩티드는, 예를 들어 소염제로서 유용할 수 있다.
다른 구현예에서, 2개 이상의 성분은 검정 용액들의 쌍 둘 다에서 사용될 수 있다. 이와 같은 유형의 검정에 있어서, 조건부 활성 폴리펩티드는 전술된 2가지 유형의 검정 둘 다의 특징들이 이용되어 선택될 수 있다. 대안적으로, 조건부 활성 폴리펩티드의 선택성은 2개 이상의 성분이 사용될 때 증가할 수 있다. 예를 들어 종양 미세환경으로 되돌아가는 것(비정상 조건에서의 검정들의 쌍)은 높은 젖산염 농도와 낮은 글루코스 농도 둘 다가 조성된 검정 배지 중에서 수행될 수 있는 한편, 정상 생리학적 조건에서의 검정들의 대응하는 쌍은 비교적 더 낮은 젖산염 농도와 비교적 더 높은 글루코스 농도 둘 다가 조성된 검정 배지 중에서 수행될 수 있다.
본 발명은, 무기 화합물, 이온 및 유기 분자로부터 선택된 각각의 성분은, 해당 성분의 상이한 농도에서보다 이 성분의 어느 한 농도에서 더욱 활성인 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하기 위해, 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있음을 고려한다.
정상 환경(정상 생리학적 조건) 및 비정상 환경(비정상 조건) 사이의 조건(들)을 차별화하는 것으로서 대사물질 하나 이상의 농도를 상이하게 조성하는 것을 바탕으로 하는 검정은, 특히 혈장 중에서보다 종양 미세환경에서 더욱 활성인 조건부 활성 폴리펩티드의 선택에 적합할 수 있는데, 그 이유는 종양 미세환경은 통상 혈장 중 대사물질의 농도와 비교되었을 때, 상이한 농도의 동일 대사물질을 유의적 수만큼 가지기 때문이다.
Kinoshita외 다수는 정상 뇌 및 뇌 종양에서의 대사물질들을 비교하였다["Absolute Concentrations of Metabolites in Human Brain Tumors Using In Vitro Proton Magnetic Resonance Spectroscopy," NMR IN BIOMEDICINE, vol. 10, pp.2-12, 1997]. 이 연구팀은, 정상 뇌 내 N-아세틸 아스파르트산염 농도는 5000 ~ 6000 μM이지만, 교모세포종의 경우에는 300 μM ~ 400 μM에 불과하고, 성상세포종의 경우에는 1500 μM ~ 2000 μM이며, 악성 성상세포종의 경우에는 600 μM ~ 1500 μM임을 발견하였다. 또한, 정상 뇌 내 이노시톨 농도는 1500 μM ~ 2000 μM이지만, 교모세포종의 경우에는 2500 μM ~ 4000 μM이고, 성상세포종의 경우에는 2700 μM ~ 4500 μM이며, 악성 성상세포종의 경우에는 3800 μM ~ 5800 μM이다. 정상 뇌 내 포스포릴에탄올아민의 농도는 900 μM ~ 1200 μM이지만, 교모세포종의 경우에는 2000 μM ~ 2800 μM이고, 성상세포종의 경우에는 1170 μM ~ 1370 μM이며, 악성 성상세포종의 경우에는 1500 μM ~ 2500 μM이다. 정상 뇌 내 글리신 농도는 600 μM ~ 1100 μM이지만, 교모세포종의 경우에는 4500 μM ~ 5500 μM이고, 성상세포종의 경우에는 750 μM ~ 1100 μM이며, 악성 성상세포종의 경우에는 1900 μM ~ 3500 μM이다. 정상 뇌 내 알라닌 농도는 700 μM ~ 1150 μM이지만, 교모세포종의 경우에는 2900 μM ~ 3600 μM이고, 성상세포종의 경우에는 800 μM ~ 1200 μM이며, 악성 성상세포종의 경우에는 300 μM ~ 700 μM이다. 이러한 대사물질들은 또한 혈중 농도가 상이할 수 있는데, 예를 들어 N-아세틸 아스파르트산염의 혈중 농도는 약 85000 μM이고; 이노시톨의 혈중 농도는 약 21700 μM이며; 글리신의 혈중 농도는 약 220 μM ~ 400 μM이고; 알라닌의 혈중 농도는 약 220 μM ~ 300 μM이다.
그러므로 적어도 N-아세틸 아스파르트산염, 이노시톨, 글리신 및 알라닌을 비롯한 이러한 대사물질들은 뇌 종양에서는 활성이지만, 혈액 또는 정상 뇌 조직에서는 활성이 아닌 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하기 위해 검정 용액 중에 상이한 농도로 사용될 수 있다. 예를 들어 교모세포종의 종양 미세환경에서는 활성이지만, 혈액 또는 정상 뇌 조직에서는 활성이 아니거나 적어도 활성이 작은 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하기 위해서, N-아세틸 아스파르트산염 농도가 85000 μM인 검정 용액은 정상 생리학적 조건하에서의 검정들 쌍에 사용될 수 있고, N-아세틸 아스파르트산염 농도가 350 μM인 검정 용액은 비정상 조건하에서의 검정들 쌍에 사용될 수 있다.
Mayers외 다수는, 췌장 환자의 예비 진단 혈장 중 분지 쇄 아미노산을 비롯한 다수의 상이한 대사물질들의 농도를 연구하였다["Elevated circulating branched chain amino acids are an early event in pancreatic adenocarcinoma development," Nature Medicine, vol. 20, pp. 1193-1198, 2014]. 췌장암 환자에는 몇 가지 대사물질이, 췌장암이 발병하지 않은 인간의 혈액 중 해당 대사물질의 농도와는 상이한 농도로 혈류 중에 존재함이 발견되었다. Mayers외 다수(상동)는 또한, 췌장암 환자는 자신의 혈장 중에 정상 피험체의 혈장 중과는 비교되게 유의적으로 증가한 분지형 아미노산을 가진다는 것을 발견하였다. 증가한 농도로 존재하는 분지형 아미노산은 이소루신, 루신 및 발린을 포함한다(Mayers외 다수(상동)의 표 1). Mayers외 다수(상동)의 도 1에 보인 다른 대사물질들도 췌장암 환자의 혈장 중에, 정상의 건강한 인간의 혈류 중 농도와 유의미하게 상이한 농도로 존재한다. 이러한 대사물질들은 적어도 아세틸글리신, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 2-아미노아디프산염, 타우로데옥시콜산염/타우로케노데옥시콜산염, 아코니트산염, 이소시트르산염, 젖산염, α-글리세로인산염 및 요산염을 포함한다. 그러므로 임의의 대사물질들은 췌장암 환자와 정상의 건강한 환자의 혈류 중에 상이한 농도로 존재한다는 발견을 바탕으로 하였을 때, 췌장암 환자의 종양 미세환경은 또한, 건강한 환자의 췌장 미세환경에 존재할 대사물질의 농도와 상이한 농도로 이 같은 대사물질을 가질 것임이 예상될 수 있다.
그러므로 하나의 구현예에서, 이러한 대사물질 중 하나 이상은 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액 중에, 건강한 개체의 혈장 중 해당 대사물질의 농도(즉 대사물질의 정상 생리학적 농도)와 근사한 양만큼 사용될 수 있다. 예를 들어 건강 개체의 혈장 중 정상 생리학적 농도로서 공지된 농도는, 이소루신의 경우 약 1.60 ± 0.31 ㎎/dL이고, 루신의 경우 약 1.91 ± 0.34 ㎎/dL이며, 발린의 경우 약 2.83 ± 0.34 ㎎/dL이다. 정상 생리학적 조건용인 검정 용액은 이와 같은 분지형 아미노산들 중 하나 이상을 상기와 같은 범위 내에 속하는 정상적인 생리학적 농도만큼 가질 수 있다. 비정상 조건용인 검정 용액은 동일한 분지형 아미노산을, 건강한 개체 중 이와 대응하는 분지형 아미노산의 정상 생리학적 농도보다 약 5배, 또는 약 10배, 또는 약 20배, 또는 약 50배, 또는 약 70배, 또는 약 100배, 또는 약 150배, 또는 약 200배, 또는 약 500배 높은 농도로 가질 수 있다. 이는, Mayer외 다수(상동)가 발견한 것을 바탕으로 하였을 때 췌장암 미세환경이 이러한 분지형 아미노산을 유의적으로 증가한 농도만큼 가질 것으로 예상된다는 사실을 반영할 것인데, 그 이유는 Mayers외 다수(상동)에 의해 검출된, 혈장에서 발견되는 더 높은 농도의 분지형 아미노산들은 종양 미세환경으로부터 기인하여 혈류 중에 희석되기 때문이다. 유사하게 비정상 조건하에서의 검정은 특정 대사물질의 농도가 정상 개체에서보다 췌장암 환자에서 유의적으로 낮더라도, 이 췌장암 환자의 혈액 중 다른 대사물질의 농도를 반영할 수 있다. 이러한 방식으로, 스크리닝은 실제 환경을 모의할 수 있으며, 이로써 해당 특정 환경에 대하여 최고의 활성을 보이는 돌연변이체가 선택되는 것이 보장된다.
다른 몇몇 구현예들에서, 췌장암 환자의 실제 혈장 환경을 모의하기 위해서, 정상 생리학적 조건용인 검정 용액은 하나 이상의 분지형 아미노산을 췌장암 환자의 혈장 중 농도를 모의하는 농도로 포함할 수 있다. 이러한 구현예들에서, 비정상 조건용 검정 용액은 동일한 분지형 아미노산을, 췌장암 환자의 혈장 중 대응 분지형 아미노산의 농도보다 약 2배, 또는 약 3배, 또는 약 4배, 또는 약 5배, 또는 약 7배, 또는 약 8배, 또는 약 10배, 또는 약 15배, 또는 약 20배 또는 약 50배 높은 농도로 가질 수 있으며, 이는, 이처럼 높은 농도가 종양 미세환경으로부터 기인하고, 혈류 중 농도는 종양의 미세환경 중 실제 농도의 희석된 만큼을 나타낸다는 사실을 반영한다. 유사하게, 기타 대사물질은 또한 정상 생리학적 조건용 및 비정상 조건용 검정 용액 중 상이한 농도로 존재할 수 있으며, 이는, 혈류에 대해 수집된 데이터로부터 예상되는 실제 차이들을 반영한다. 몇몇 경우에서, 특정 대사물질의 결핍은 췌장 환자의 혈류 중에서 주목될 수 있는데, 이 경우, 혈류 중 측정된 농도를 반영하는 농도는 정상 생리학적 조건에 대한 검정에 사용될 수 있고, 더욱더 낮은 농도는 비정상 조건에 대한 검정에 사용될 수 있으며, 이로부터 상기 대사물질이 종양 미세환경에서 소모될 것 같다는 예상이 뒷받침된다. 검정 용액이 사용되어 이처럼 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는 췌장암 환자의 혈장 중에서보다 췌장암 미세환경에서 활성이 더욱 클 것이다.
몇몇 구현예들에서, 췌장암 환자의 전체 혈장이 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어 하나의 구현예에서, 췌장암 환자의 혈장 성분 하나 이상의 모의는 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건하에서의 검정들 중 어느 하나 또는 둘 다를 위한 검정 용액에 적용될 수 있다. 예시적 구현예에서, 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액의 pH는 췌장암 환자의 혈장이 30 wt.% 첨가되어 7.2 내지 7.6이고, 비정상 조건에 대한 검정 용액의 pH는 췌장암 환자의 혈장이 30 wt.% 첨가되어 6.2 내지 6.8이다. 이 구현예에서, 췌장암 환자의 혈장은 (1) 조건부 활성 폴리펩티드가 pH 7.2 ~ 7.6의 혈액 중에서 활성화되지 않도록 보장하고, 또한 (2) 췌장암 환자의 혈액 중에서 발견되는 대사물질의 이러한 조성물의 존재 하에서조차도 종양 미세환경 내 pH 5.5 ~ 7.2, 6 ~ 7, 또는 6.2 ~ 6.8에서 조건부 활성 폴리펩티드가 활성화될 수 있도록 보장하기 위해 제시된다. 이는, 췌장암 환자를 위한 치료를 조정할 것이다.
또 다른 예시적 구현예에서, 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액의 pH는 췌장암 환자의 혈장이 30 wt.% 첨가되어 7.2 내지 7.6이고, 비정상 조건에 대한 검정 용액의 pH는 췌장암 환자의 임의의 혈장이 첨가되지 않고 5.5 내지 7.2 또는 6.2 내지 6.8이다.
무기 화합물, 이온 및 유기 분자로부터 선택된 동일 성분은 상기 논의된 몇 가지 유형의 검정 각각에서 사용될 수 있다. 예를 들어 젖산염의 경우, 이 젖산염은 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액들의 쌍들 중 실질적으로 동일한 농도로 사용될 수 있다. 그 다음, 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건은 하나 이상의 양상, 예를 들어 온도, pH, 다른 성분의 농도 등에서 차이가 날 것이다. 상이한 구현예에서, 젖산염은 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 간 차별화 요인들 중 하나로서 사용될 수 있는데, 이는 젖산염이 정상 생리학적 조건(비 종양 미세환경)에서보다 비정상 종양 미세환경에서 더 높은 농도로 존재하는 사실을 반영한다.
몇몇 구현예들에서, 2개 이상의 성분은 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건에 대한 검정 용액 둘 다에 실질적으로 동일한 농도로 첨가된다. 예를 들어 시트르산염 및 소 혈청 알부민(BSA) 둘 다가 검정 용액에 첨가된다. 시트르산염 농도는 약 80 μM일 수 있으며, BSA 농도는 두 검정 용액들 중 약 10% ~ 약 20%로 존재할 수 있다. 더욱 구체적으로, 정상 생리학적 조건하에서의 검정들의 쌍을 위한 검정 용액의 pH는 농도 약 80 μM의 시트르산염과, 농도 약 10% ~ 약 20%의 BSA가 포함될 때 7.2 ~ 7.6의 범위에 있을 수 있다. 비정상 조건하에서의 검정들의 쌍을 위한 검정 용액의 pH는 농도 약 80 μM의 시트르산염과, 농도 약 10% ~ 약 20%의 BSA가 포함될 때 6.2 ~ 6.8의 범위에 있을 수 있다.
하나의 구현예에서, 혈청은 정상 생리학적 조건과 비정상 조건에 대한 두 검정 용액들에 실질적으로 동일한 농도로 첨가될 수 있다. 혈청은 다수의 무기 화합물, 이온, 유기 분자(예를 들어 폴리펩티드)를 가지므로, 검정 용액은 두 검정 용액들 간에 실질적으로 동일한 농도로 제시되는, 무기 화합물, 이온, 유기 분자로부터 선택되는 성분들 다수개 및 다수 개를 함유할 수 있다. 검정 용액은 혈청을 5 vol.% ~ 30 vol.%, 또는 7 vol.% ~ 25 vol.%, 또는 10 vol.% ~ 20 vol.%, 또는 10 vol.% ~ 15 vol.% 함유할 수 있다. 다른 몇몇 구현예들에서, 정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액들은 혈청을 함유하지 않는다. 혈청은 인간의 혈청, 소 혈청, 또는 임의의 다른 포유동물 유래 혈청일 수 있다. 다른 몇몇 구현예들에서, 검정 용액은 혈청을 함유하지 않는다.
정상 생리학적 조건과 비정상 조건에 대한 검정 용액들은 pH가 상이할 수 있다. 이러한 검정 용액의 pH는 중탄산염을 사용하는 것을 통하여 완충제 중 CO2 및 O2 수준을 이용해 조정될 수 있다.
몇몇 다른 구현예들에서, 2개 이상의 성분들 중 적어도 1개가 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건에 대한 검정 용액에 상이한 농도로 첨가된다. 예를 들어 젖산염 및 소 혈청 알부민(BSA) 둘 다가 검정 용액에 첨가된다. 젖산염 농도는 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액과 비정상 조건에 대한 검정 용액 간에 상이할 수 있는 한편, BSA는 상기 두 검정 용액 중에 동일한 농도로 존재할 수 있다. 비정상 조건에 대한 검정 용액 중 젖산염의 농도는 30 ㎎/dL 내지 50 ㎎/dL일 수 있고, 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액 중 젖산염의 농도는 8 ㎎/dL 내지 15 ㎎/dL일 수 있다. 다른 한편, BSA는 상기 두 검정 용액 중에 동일한 농도, 예를 들어 약 10% ~ 20%로 존재한다. 이러한 검정 용액들이 사용되어 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는 BSA의 존재 하에 젖산염이 낮은 농도, 즉 8 ㎎/dL ~ 15 ㎎/dL로 존재할 때보다 젖산염이 높은 농도, 즉 30 ㎎/dL ~ 50 ㎎/dL로 존재할 때 활성이 더 크다.
몇몇 구현예들에서, 검정 용액은 활성이 2개 이상의 조건에 의존적인 조건부 활성 폴리펩티드의 선택을 위해 디자인될 수 있다. 하나의 예시적 구현예에서, 조건부 활성 폴리펩티드의 활성은 pH 및 젖산염 둘 다에 의존적일 수 있다. 이러한 조건부 활성 폴리펩티드의 선택을 위한 검정 용액은, pH 7.2 ~ 7.6이고, 젖산염 농도는 8 ㎎/dL 내지 15 ㎎/dL인, 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액일 수 있다. 비정상 조건에 대한 검정 용액의 pH는 6.2 ~ 6.8이고, 젖산염 농도는 30 ㎎/dL ~ 50 ㎎/dL일 수 있다. 선택적으로, 정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액은 또한 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 간 결합을 도와주는 이온을 포함할 수 있어서, 후보 생체 활성 폴리펩티드에 대한 히트의 수가 증가할 수 있다.
또 다른 예시적 구현예에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 pH, 글루코스 및 젖산염에 의존적인 활성을 가질 수 있다. 이러한 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하기 위한 검정 용액은 pH 7.2 ~ 7.6이고, 글루코스 농도가 2.5 mM ~ 10 mM의 범위이며, 젖산염 농도가 8 ㎎/dL ~ 15 ㎎/dL의 범위인, 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액일 수 있다. 비정상 조건에 대한 검정 용액은 pH 6.2 ~ 6.8이고, 글루코스 농도가 0.05 mM ~ 0.5 mM의 범위이며, 젖산염 농도가 30 ㎎/dL ~ 50 ㎎/dL의 범위일 수 있다. 선택적으로 정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액은 또한 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 도와서, pH 6.2 ~ 6.8에서 결합 파트너와 결합하는 후보 생체 활성 폴리펩티드의 수를 증가시키기 위한 이온을 포함할 수도 있다. 이러한 검정 용액이 사용되어 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는, pH 7.2 ~ 7.6, 글루코스 농도 2.5 mM ~ 10 mM, 그리고 젖산염 농도 8 ㎎/dL 내지 15 ㎎/dL의 환경에서보다 pH 6.2 ~ 6.8, 글루코스 농도 0.05 mM ~ 0.5 mM, 그리고 젖산염 농도 30 ㎎/dL 내지 50 ㎎/dL의 환경에서 더욱 활성이 크다.
무기 화합물, 이온 및 유기 분자로부터 선택되는 성분 2개 이상은, 선택된 조건부 활성 폴리펩티드가 전달될 병소/위치(즉 표적화된 위치)에서의 환경을 모의하는 비정상 조건에 대한 검정 용액을 제조하기 위한 것이다. 몇몇 구현예들에서, 표적화된 위치에서의 환경에 제시된 성분 적어도 3개가 검정 용액에 첨가될 수 있거나, 또는 표적화된 위치에서의 환경에 제시된 성분 적어도 4개가 검정 용액에 첨가될 수 있거나, 또는 표적화된 위치에서의 환경에 제시된 성분 적어도 5개가 검정 용액에 첨가될 수 있거나, 또는 표적화된 위치에서의 환경에 제시된 성분 적어도 6개가 검정 용액에 첨가될 수 있다.
하나의 구현예에서, 표적화된 위치(즉 조건부 활성 폴리펩티드가 더 큰 활성을 보일 위치)에서 채취된 유체가 비정상 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액으로서 직접 사용될 수 있다. 예를 들어 활액막 액은 피험체, 바람직하게는 관절 질병을 앓고 있어서 그의 치료를 필요로 하는 피험체로부터 채취될 수 있다. 채취된 활액막 액(선택적으로는 희석액)은 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하기 위하여 비정상 조건에서의 검정들 쌍에서 검정 용액으로서 사용될 수 있다. 채취된 활액막 액(선택적으로는 희석된 활액막 액)이 비정상 조건하에서의 검정을 위한 검정 용액, 그리고 정상 생리학적 조건하에서의 검정을 위한 인간 혈장을 모의하는 검정 용액으로 사용되면, 이 선택된 조건부 활성 폴리펩티드(예를 들어 TNF-알파)는 다른 병소나 장기에서보다 관절에서 더욱 활성이 클 것이다. 예를 들어 염증성 관절을 가지는 피험체(예를 들어 관절염이 발병한 피험체)는 TNF-알파로 치료될 수 있다. 그러나 TNF-알파는 통상 다른 조직과 장기에 피해를 주는 심각한 부작용을 보인다. 활액막 액 중에서 더욱 활성이 크지만 혈액 중에서는 활성이 없거나 활성이 작은 조건부 활성 TNF-알파는, 몸의 나머지 부분에 대한 TNF-알파의 부작용을 줄이거나 잠재적으로는 억제하면서, 관절에 대한 TNF-알파의 활성을 발휘시킬 것이다.
다수의 조건에 따라서 활성을 보이는 조건부 활성 폴리펩티드의 개발은, 피험체 몸속 표적 위치에 대한 조건부 활성 폴리펩티드의 개선된 선택성을 달성할 것이다. 조건들 중 오로지 몇 가지만이 조성되는 다른 병소에 조건부 활성 폴리펩티드가 제공되었을 때, 이 조건부 활성 폴리펩티드는 비활성이거나 적어도 유의적으로 활성이 작은 것이 이상적이다. 하나의 구현예에서, pH 6.2 ~ 6.8, 글루코스 농도 0.05 mM ~ 0.5 mM, 그리고 젖산염 농도 30 ㎎/dL ~ 50 ㎎/dL에서 활성인 조건부 활성 폴리펩티드는 종양 미세환경에 특이적으로 전달될 수 있는데, 그 이유는 이 조건들이 모두 종양 미세환경에서 보이기 때문이다. 다른 조직 또는 장기는 이와 같이 조성된 조건들 3개 전부는 아니고 이 조건들 중 1개 또는 2개를 보일 수 있으므로, 조건부 활성 폴리펩티드를 다른 조직 또는 장기 내에서 완전히 활성화하기에 충분치 않다. 예를 들어 운동을 마친 근육은 pH가 6.2 ~ 6.8의 범위로 낮을 수 있다. 그러나, 이 근육은 또 다른 검정 대상 조건을 보이지 않을 수도 있는 것이다. 그러므로, 조건부 활성 폴리펩티드는 운동을 마친 근육에서 비활성이거나 적어도 활성이 작다.
몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 폴리펩티드의 활성이, 이 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하는데에 사용된 조건에 진정으로 의존하는지를 확인하기 위한 단계들이 수행될 수 있다. 예를 들어 조건부 활성 폴리펩티드는 3가지 조건, 즉 pH 6.2 ~ 6.8, 글루코스 농도 0.05 mM ~ 0.5 mM, 그리고 젖산염 농도 30 ㎎/dL ~ 50 ㎎/dL에 의존하는 것으로 선택된다. 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는 이후 3가지 조건 각각에서 따로따로, 그리고 3가지 조건들의 쌍들이 조성된 환경들에서 시험될 수 있고, 그 결과 이 조건부 활성 폴리펩티드가 이와 같은 시험 조건들 또는 환경들에서 비활성인지 또는 활성이 작은지가 확인될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 혈청 중 임의의 성분들은 의도적으로 최소화될 수 있거나, 또는 검정 배지에서 제하여질 수 있다. 예를 들어 항체가 스크리닝될 때, 항체와 결합하거나 이에 흡착하는 혈청의 성분들은 검정 배지 중에 최소로 포함될 수 있거나 이에서 제할 수 있다. 조건부 활성이 아니고, 오히려 다수의 상이한 조건들 하에서 오로지 혈청 중에 존재하는 성분과만 결합하는 결합 돌연변이 항체를 포함하여, 이와 같이 결합한 항체는 위 양성(false positive)을 보일 수 있다. 그러므로, 검정에서 돌연변이체와 잠재적으로 결합할 수 있는 성분들을 최소화하거나 제하기 위해서는 검정 성분의 조심스러운 선택이 이루어질 수 있고, 그 결과 검정에서 원하는 결합 파트너 이외의 성분과 결합함으로 말미암는 조건부 활성에 대해 양성인 것으로 부주의하게 확인될 수 있는, 비 기능성 돌연변이체의 수가 감소할 수 있다. 예를 들어 인간 혈청 중 성분들과 결합하는 성향을 갖는 돌연변이 폴리펩티드가 스크리닝되는 몇몇 구현예에서, 인간 혈청 성분들에 결합하는 돌연변이 폴리펩티드에 의해 유발되는 위 양성 가능성을 줄이거나 없애기 위하여 BSA가 검정 용액 중에 사용될 수 있다. 기타 유사한 대체물도 동일한 목적을 달성하기 위해 구체적인 경우에 제조될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 검정 조건들은 세포 막 가까이, 예컨대 세포 막 내부, 세포 막 또는 세포 막 외부에 있는 환경, 또는 관절 내부 환경을 모의한다. 세포 막 환경에서 스크리닝될 때 결합 활성에 영향을 줄 수 있는 몇몇 요인들로서는 수용체 발현, 내부화, 항체 약물 복합체(ADC) 효능 등을 포함한다.
검정 포맷은 당 업자에게 공지된 임의의 적합한 검정일 수 있다. 그 예들로서는, ELISA, 효소 활성 검정, 시험관 내 실제 조직 스크리닝(장기 등), 조직 슬라이드, 전체 동물, 세포주 및 3D 시스템 사용을 포함한다. 예를 들어 적합한 세포 기반 검정은 WO 2013/040445에 기술되어 있고, 조직 기반 검정은 미국특허 제7,993,271호에 기술되어 있으며, 전체 동물 기반 스크리닝 방법은 미국특허출원 제2010/0263599호에 기술되어 있고, 3D 시스템 기반 스크리닝 방법은 미국특허출원 제2011/0143960호에 기술되어 있다.
몇몇 구현예들에서, 진화 단계는 상기 논의된 조건부 활성 특징들 이외에도 기타 원하는 특성들을 동시에 가질 수 있는 돌연변이 폴리펩티드를 제조해 낼 수 있다. 진화될 수 있는 기타 원하는 특성들로서 적합한 것들은 결합 활성, 발현, 인간화 등을 포함할 수 있다. 그러므로 본 발명은 이 같은 기타 원하는 특성들 중 적어도 1개 또는 그 이상이 개선된 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하는데에 사용될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는, 예를 들어 선택된 조건부 활성 폴리펩티드의 다른 특성, 예를 들어 결합 활성, 발현, 인간화 등을 개선하기 위한 제2 진화 단계에서, 본원에 개시된 돌연변이유발 기술들 중 하나가 사용되어 추가로 돌연변이될 수 있다. 제2 진화 단계 후, 돌연변이 폴리펩티드는 조건부 활성과 개선된 특성 둘 다에 대해 스크리닝될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 모 폴리펩티드가 진화되어 돌연변이 폴리펩티드로 제조된 후에는, 정상 생리학적 조건하에서의 제1 활성과 비교되었을 때 비정상 조건하의 검정에서 증가한 제1 활성을 보이는 제1 조건부 활성 폴리펩티드가 선택된다. 그 다음, 상기 제1 조건부 활성 폴리펩티드는 추가로 하나 이상의 추가 진화, 발현 및 선택 단계의 대상이 될 수 있고, 그 결과 (1) 정상 생리학적 조건하의 검정에서의 제2 활성과 비교되었을 때 비정상 조건하의 검정에서 증가한 제2 활성을 보이거나, 또는 (2) 비정상 조건에서의 제1 활성과 정상 생리학적 조건에서의 제1 활성 간 비가, 제1 조건부 활성 폴리펩티드 및/또는 모 폴리펩티드에서보다 더 큰, 적어도 제2 조건부 활성 폴리펩티드가 선택된다. 이 제2 조건부 활성 폴리펩티드는, 비정상 조건하에서의 제1 활성 및 제2 활성 둘 다가, 정상 생리학적 조건하에서의 각각의 활성에 비하여 더 클 수 있을 뿐만 아니라, 모 폴리펩티드에 비하여 정상 생리학적 조건하에서 제1 활성과 제2 활성 둘 다가 더 작을 수 있다.
임의의 구현예들에서, 본 발명은 비정상 조건에서의 활성과 정상 생리학적 조건에서의 활성의 활성 비가 큰(예컨대 비정상 조건과 정상 생리학적 조건 간 선택성이 더 큰) 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하는 것을 목표로 한다. 비정상 조건에서의 활성과 정상 생리학적 조건에서의 활성의 비 또는 선택성은 적어도 약 2:1, 또는 적어도 약 3:1, 또는 적어도 약 4:1, 또는 적어도 약 5:1, 또는 적어도 약 6:1, 또는 적어도 약 7:1, 또는 적어도 약 8:1, 또는 적어도 약 9:1, 또는 적어도 약 10:1, 또는 적어도 약 11:1, 또는 적어도 약 12:1, 또는 적어도 약 13:1, 또는 적어도 약 14:1, 또는 적어도 약 15:1, 또는 적어도 약 16:1, 또는 적어도 약 17:1, 또는 적어도 약 18:1, 또는 적어도 약 19:1, 또는 적어도 약 20:1, 또는 적어도 약 30:1, 또는 적어도 약 40:1, 또는 적어도 약 50:1, 또는 적어도 약 60:1, 또는 적어도 약 70:1, 또는 적어도 약 80:1, 또는 적어도 약 90:1, 또는 적어도 약 100:1일 수 있다.
하나의 구현예에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 비정상 조건에서의 활성과 정상 생리학적 조건에서의 활성 간 비가 적어도 약 5:1, 또는 적어도 약 6:1, 또는 적어도 약 7:1, 또는 적어도 약 8:1, 또는 적어도 약 9:1, 또는 적어도 약 10:1, 또는 적어도 약 15:1, 또는 적어도 약 20:1, 또는 적어도 약 40:1, 또는 적어도 약 80:1일 수 있는 항체이다. 하나의 구현예에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 종양 위치를 표적화하는데에 사용되는데, 이 경우 조건부 활성 폴리펩티드는 종양 위치(종양 미세환경)에서 활성을 가지고, 종양 위치가 아닌 위치(정상 생리학적 조건)에서는 유의적으로 활성이 작거나 비활성이다.
하나의 구현예에서, 본 조건부 활성 폴리펩티드는 다른 제제, 예컨대 본원의 어딘가에 개시되어 있는 제제와 접합되도록 의도되는 항체이다. 조건부 활성 항체는 비정상 조건에서의 활성과 정상 생리학적 조건에서의 활성의 비가 더 클 수 있다. 예를 들어 다른 제제와 접합될 조건부 활성 항체는 비정상 조건에서의 활성과 정상 생리학적 조건에서의 활성의 비가 적어도 약 10:1, 또는 적어도 약 11:1, 또는 적어도 약 12:1, 또는 적어도 약 13:1, 또는 적어도 약 14:1, 또는 적어도 약 15:1, 또는 적어도 약 16:1, 또는 적어도 약 17:1, 또는 적어도 약 18:1, 또는 적어도 약 19:1, 또는 적어도 약 20:1일 수 있다. 이는, 접합된 제제가, 예를 들어 독성이거나 방사성일 때 특히 중요할 수 있는데, 그 이유는 이처럼 접합된 제제는 발병 위치나 치료 위치(즉 비정상 조건이 조성된 위치)에서 농축될 것이 요망되기 때문이다.
H. 조건부 활성 폴리펩티드의 pI 확인
몇몇 구현예들에서, 전술된 기술중 임의의 것이 사용되었을 때 선택된 조건부 활성 폴리펩티드의 pI는 모 폴리펩티드의 pI보다 더 낮은 것으로 확인된다. 예를 들어 조건부 활성 폴리펩티드의 pI는 모 폴리펩티드의 pI보다 적어도 0.1 유닛, 또는 적어도 0.2 유닛, 또는 적어도 0.3 유닛, 또는 적어도 0.4 유닛, 또는 적어도 0.5 유닛, 또는 적어도 0.6 유닛, 또는 적어도 0.8 유닛, 또는 적어도 1.0 유닛, 또는 적어도 1.2 유닛, 또는 적어도 1.4 유닛, 또는 적어도 1.5 유닛, 또는 적어도 1.7 유닛, 또는 적어도 2.0 유닛, 또는 적어도 2.5 유닛, 또는 적어도 3.0 유닛, 또는 적어도 3.5 유닛, 또는 적어도 4.0 유닛, 또는 적어도 5.0 유닛만큼 더 낮을 수 있다.
I. 조건부 활성 폴리펩티드
다른 양상에서, 본 발명은 모 폴리펩티드의 pI보다 더 낮은 pI를 보이는 조건부 활성 폴리펩티드를 제공한다. 본 조건부 활성 폴리펩티드는 정상 생리학적 조건에서 벗어난 비정상 조건에서, 대응하는 정상 생리학적 조건에서의 동일한 돌연변이 폴리펩티드의 활성에 비해 증가한 동일 활성을 보이며, 선택적으로는
(a) 정상 생리학적 조건에서 벗어난 비정상 조건에서, 동일한 비정상 조건에서의 모 폴리펩티드의 활성에 비하여 증가한 동일 활성,
(b) 정상 생리학적 조건에서, 동일한 정상 생리학적 조건에서의 모 폴리펩티드 활성에 비하여 감소한 동일 활성, 또는
(c) 상기 (a)와 (b)의 조합
을 보일 수 있다.
본 조건부 활성 폴리펩티드는 비정상 조건에서는 활성을 보이는 반면, 정상 생리학적 조건에서는 가역적으로나 불가역적으로 비활성화될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 이러한 조건부 활성 폴리펩티드는 비정상 조건에서, 정상 생리학적 조건에서의 모 폴리펩티드의 활성과 동일하거나 더 큰, 동일 활성을 보일 수 있다.
조건부 활성 폴리펩티드는, 제한된 기간 동안 숙주내에서 활성인 치료제 개발에 특히 유용하다. 이는, 치료제의 연장된 작용이 숙주에 유해하되, 요망되는 치료법을 수행하는데 제한된 활성이 필요할 때 특히 유용하다. 유리한 응용 예로서는 국소 또는 전신 치료뿐 아니라, 국소화된 치료를 포함한다. 조건부 활성 폴리펩티드의 이점 한 가지는, 유해한 부작용을 잠정적으로 감소시키는 이 폴리펩티드의 능력으로 말미암아, 이 조건부 활성 폴리펩티드가 치료적 응용에 고용량으로 사용될 수 있도록 할 수 있다는 점이다. 정상 생리학적 조건하에서의 비활성화는 유해한 부작용을 감소시키는데 사용될 수 있다.
정상 생리학적 조건하에서의 비활성화는 폴리펩티드의 용량과 비활성화 속도의 조합에 의해 확정될 수 있다. 이 조건 기반 비활성화는 비교적 짧은 기간내에 상당히 부정적인 부작용을 일으킬 수 있는 효소 치료제에 특히 중요하다.
본 조건부 활성 폴리펩티드는 또한 시간이 경과함에 따라 가역적으로나 불가역적으로 활성화 또는 비활성화될 수 있거나, 또는 체내 임의의 미세환경, 예컨대 체내 특정 장기에 위치할 때에만 활성화 또는 비활성화될 수 있다. 예시적 미세환경으로서는 종양, 활액막 액, 방광 또는 신장을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
몇몇 구현예들에서, 본 조건부 활성 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 표적 항원 1개 이상에 대한 항체 또는 항체 단편이다.
비정상 조건과 정상 생리학적 조건은 상기 논의된 바와 같으며, 온도, pH, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스, 전해질 농도, 그리고 이러한 조건들 2가지 이상의 조합으로부터 선택되는 조건일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 조건은 pH이고, 조건부 활성 폴리펩티드는 pH 의존적인 활성을 보인다. 특히 본 조건부 활성 폴리펩티드는 비정상 pH에서, 정상 생리학적 pH에서의 활성에 비하여 증가한 활성을 보인다.
하나의 양상에서, 본 발명은 pKa가, 활성이 요망되는 pH의 0.5 유닛, 1 유닛, 1.5 유닛, 2 유닛, 2.5 유닛, 3 유닛 또는 4 유닛 이내인 종이 존재할 때 pH 의존적 활성을 보이는 조건부 활성 폴리펩티드에 관한 것이다. 다른 양상에서, 본 발명은 pKa가 약 4 내지 약 10이거나, 또는 약 4.5 내지 약 9.5이거나, 또는 약 5 내지 약 9이거나, 또는 약 5.5 내지 약 8이거나, 또는 약 6.0 내지 약 7.0인 종의 존재 하에서 pH 의존적 활성을 보이는 조건부 활성 폴리펩티드에 관한 것이다.
조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 유의적 영향을 미치는, 검정 배지 중에 존재하는 종은 적어도 2가지 이온화 상태, 즉 비하전 또는 저 하전된(less charged) 상태와, 하전 또는 고 하전된(more charged) 상태를 가지는 종인 경향이 있다. 결과적으로 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치는 종의 pKa는, 해당 종이 특정 pH에서 폴리펩티드의 특정 활성에 영향을 미치는 정도를 확정하는데에 역할을 할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 히스티딘, 히스타민, 수소화 아데노신 이인산염, 수소화 아데노신 삼인산염, 시트르산염, 중탄산염, 아세트산염, 젖산염, 이황화물, 황화수소, 암모늄, 인산이수소 및 이것들의 임의의 조합으로부터 선택되는 종의 존재하에 pH 의존적 활성을 보이는 조건부 활성 폴리펩티드에 관한 것이다. 몇몇 구현예들에서, pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드는 제2 pH에서, 제1의 상이한 pH에서의 활성보다 더 큰 활성을 보인다[단 이때 상기 두 활성은 이들 종이 존재할 때의 검정에서 측정됨]. 조건부 활성 폴리펩티드의 pH 의존성을 확정하기 위해서, 폴리펩티드의 동일한 활성은 pH 값이 2가지로 상이한 동일 검정 배지에서 검정된다.
동일 검정 배지중 제2 pH에서의 활성 대 동일 검정 배지중 제1 pH에서의 동일 활성의 비는 pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드의 선택성이라 지칭된다. pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드의 선택성은 적어도 약 1.3, 또는 적어도 약 1.5, 또는 적어도 약 1.7, 또는 적어도 약 2.0, 또는 적어도 약 3.0, 또는 적어도 약 4.0, 또는 적어도 약 6.0, 또는 적어도 약 8.0, 또는 적어도 약 10.0, 또는 적어도 약 20.0, 또는 적어도 약 40.0, 또는 적어도 약 60.0, 또는 적어도 약 100.0이다
빈번하게, pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드는 하전 아미노산 잔기를, 이 조건부 활성 폴리펩티드의 기원인 모 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 비하여 증가한 수(또는 비율)만큼 함유함이 관찰되었다. 양으로 하전된 아미노산 잔기들이 3개 존재하고(즉 리신, 아르기닌 및 히스티딘); 음으로 하전된 아미노산 잔기들은 2개 존재한다(즉 아스파르트산염 및 글루타메이트). 몇몇 구현예들에서, 이러한 하전 아미노산 잔기는, pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드의 기원인 모 폴리펩티드에 비하여 pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드에 지나치게 많이 출현한다. 결과적으로 pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드는 검정 배지중 하전된 종과 상호작용할 가능성이 더 높은데, 그 이유는 하전된 아미노산 잔기의 수가 모 폴리펩티드에서에 비하여 증가하였기 때문이다. 결국 이는 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 영향을 미친다.
검정 배지 중 상이한 종들이 존재할 때 pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드는 통상적으로 상이한 활성을 가짐도 또한 관찰되었다. 적어도 2가지 이온화 상태, 즉 비하전 또는 저 하전된 상태와, 하전 또는 고 하전된 상태를 가지는 종은 pKa 값에 따라서 특정 pH에서 더욱 큰 정도로 해리될 수 있으므로, 조건부 활성 폴리펩티드 중에 존재하는 하전 아미노산 잔기들과의 상호작용 확률이 증가하게 된다. 이 특징은 조건부 활성 폴리펩티드의 선택성 및/또는 pH 의존적 활성을 향상시키는데에 사용될 수 있다.
조건부 활성 폴리펩티드상 전하(들)의 성질은, 이 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치기에 적합한 종을 확인하는데에 사용되는 하나의 요인일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 본 조건부 활성 폴리펩티드는 모 폴리펩티드에 비하여 양으로 하전된 아미노산 잔기들(리신, 아르기닌 및 히스티딘)을 더 많이 가질 수 있다. 대안적으로 본 조건부 활성 폴리펩티드는 모 폴리펩티드에 비하여 더 많은 음 하전 아미노산 잔기, 즉 아스파르트산염 및 글루탐산염을 가질 수 있다. 그러므로 본 조건부 활성 폴리펩티드는, 활성이 요망되는 환경에 존재하는 특정 종과의 상호작용 수준이 요망되는 정도이고/정도이거나, 감소된 활성이 요망되는 환경에 존재하는 특정 종과의 상호작용 수준이 요망되는 정도인 것으로 선택될 수 있다.
pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드상 하전된 아미노산 잔기들의 위치는 또한 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 영향을 미칠 수도 있다. 예를 들어 하전된 아미노산 잔기와 조건부 활성 폴리펩티드 결합 부위가 근위에 위치하면, 이 폴리펩티드의 결합 활성은 영향을 받을 수 있다
몇몇 구현예들에서, 본 조건부 활성 폴리펩티드와 하전된 환경 종의 상호작용은 pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드의 활성을 차단하거나 방해할 수 있다. 예를 들어 하전된 환경 종과 상호작용하는, 하전된 아미노산은 조건부 활성 폴리펩티드의 결합 위치에 대해 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 나타낼 수 있다.
다른 구현예들에서, 하전된 환경 종과 조건부 활성 폴리펩티드의 상호작용은 폴리펩티드 상 상이한 기들, 특히 하전되었거나 분극된 기들 사이에 염 다리를 형성할 수 있다. 염 다리의 형성은 폴리펩티드 구조를 안정화하는 것으로 공지되어 있다(Donald, et al., "Salt Bridges: Geometrically Specific, Designable Interactions," Proteins, 79(3): 898-915, 2011; Hendsch, et al., "Do salt bridges stabilize proteins? A continuum electrostatic analysis," Protein Science, 3:211-226, 1994). 염 다리는, "호흡(breathing)"이라 칭하여지는, 거듭되는 작은 구조적 변형을 보통 수행하는 단백질 구조를 안정화하거나 고정할 수 있다(Parak, "Proteins in action: the physics of structural fluctuations and conformational changes," Curr Opin Struct Biol., 13(5):552-557, 2003). 구조의 변동은 조건부 활성 단백질이 자체의 파트너를 효율적으로 인지하여 결합하는 것을 허용할 수 있기 때문에, 단백질 구조의 "호흡"은 단백질 기능과 이의 결합에 중요하다(Karplus, et al., "Molecular dynamics and protein functions," PNAS, vol. 102, pp. 6679-6685, 2015). 염 다리가 형성됨으로써, 조건부 활성 폴리펩티드 상 결합 위치, 특히 결합 포켓(binding pocket)은 이 폴리펩티드 자체의 파트너에 대해 감소한 접근 가능성을 보일 수 있는데, 이는 아마도 염 다리가, 상기 파트너가 결합 위치에 접근하는 것을 직접 차단할 수 있거나, 또는 단백질 구조의 “호흡”을 감소시킬 수 있기 때문일 것이다. 결합 부위로부터 멀리 떨어진 염 다리에 의할지라도, 염 다리의 알로스테릭 효과는 결합 위치의 입체구조를 변경하여 결합을 억제할 수 있다. 그러므로 이 폴리펩티드는 염 다리가 조건부 활성 폴리펩티드의 구조를 안정화(고정)한 후, 자체의 파트너와의 결합에 있어서 감소한 활성을 보이게될 수 있으며, 이로써 활성 감소가 초래된다.
폴리펩티드로서, 그 구조가 염 다리에 의해 안정화된 폴리펩티드에 관하여 공지되어 있는 예의 하나로서는 헤모글로빈이 있다. 구조 연구와 화학 연구는, 화학기 세트 적어도 2개(pKa 값이 pH 7 근처인 히스티딘 β146 및 α122의 측쇄와 아미노 말단)가 헤모글로빈내 염 다리 형성에 관여함을 규명하였다. 데옥시헤모글로빈에 있어서, β146의 말단 카르복실레이트기는 또 다른 αβ 이량체의 α 서브유닛 중 리신 잔기와 염 다리를 형성한다. 이러한 상호작용은 히스티딘 β146의 측쇄를, 이 측쇄가 동일 사슬 내 음으로 하전된 94번 위치의 아스파르트산염과 염 다리를 형성하는데에 참여할 수 있는 자리에 고정시키되, 다만 이때 히스티딘 잔기의 이미다졸기에는 양성자가 첨가된다(도 1). 높은 pH에서, 히스티딘 β146의 측쇄는 양성자화되지 않으며, 염다리도 형성되지 않는다. 그러나 pH가 강하됨에 따라서, 히스티딘 β146의 측쇄는 양성자첨가되고, 히스티딘 β146과 아스파르트산염 β94 사이에는 염 다리가 형성되어, 데옥시헤모글로빈의 4차 구조는 안정화되고, 이로 말미암아 (낮은 pH일 때) 능동적으로 대사를 수행하는 조직에서 산소가 방출되는 경향은 더 커진다. 헤모글로빈은 산소에 대해 pH 의존적 결합 활성을 보이는데, 즉 낮은 pH에서는 염 다리가 형성됨으로 말미암아 산소에 대한 결합 활성이 감소하게 된다. 다른 한편으로, 높은 pH에서는 이 염 다리가 형성되지 않음으로 말미암아 산소에 대한 결합 활성은 증가하게 된다.
이와 유사하게, 중탄산염 이온과 같은 이온은, 조건부 활성 폴리펩티드내에 염 다리를 형성함으로써 조건부 활성 폴리펩티드와 이의 파트너의 결합 활성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어 중탄산염 이온의 pKa보다 더 높은 pH에서, 중탄산염 이온은 음으로 하전된다. 음으로 하전된 중탄산염 이온은 조건부 활성 폴리펩티드상 양으로 하전된 기 또는 분극된 기 사이에 염 다리를 형성할 수 있다. 이 염 다리는 조건부 활성 폴리펩티드와 이의 파트너의 결합을 차단하거나 감소시킬 수 있다. 중탄산염 이온의 pKa 값인 6.4보다 더 낮은 pH에서 이 중탄산염은 양성자첨가되므로, 하전되지 않는다. 하전되지 않은 중탄산염은 염 다리를 형성할 수 없으므로, 조건부 활성 폴리펩티드와 이의 파트너의 결합에 이런 식으로 영향을 미치지 않을 것이다. 이러한 시나리오에서 조건부 활성 폴리펩티드는, 중탄산염의 pKa값인 6.4보다 더 높은 pH에서보다 6.4보다 더 낮은 pH에서 이의 파트너와의 결합 활성이 더 클 수 있다. 이러한 예에서, 본 조건부 활성 폴리펩티드는 중탄산염 이온이 존재할 때 조건부 활성이다(즉 본 조건부 활성 폴리펩티드는 pH 의존적 활성을 보인다).
어떤 종, 예컨대 중탄산염이 검정 배지 중에 존재하지 않을 때, 조건부 활성 폴리펩티드는 자체의 조건부 활성을 잃을 수 있다. 이는 아마도 조건부 활성 폴리펩티드상에 있던, 폴리펩티드 구조를 안정화(고정)하는 염 다리들이 없어지기 때문일 것이다. 그러므로 중탄산염이 존재하지 않을 때, 결합 파트너는 임의의 pH에서 조건부 활성 폴리펩티드상 결합 위치에의 접근 수준이 유사할 수 있고, 이로써 임의의 pH에서 유사한 활성이 발휘되고 조건부 활성은 없어진다.
다른 구현예들에서, 소 분자 또는 이온과 조건부 활성 폴리펩티드 사이의 상호작용은, 자체의 활성을 변경하는 방식으로 폴리펩티드의 구조를 변경할 수 있다. 예를 들어 구조 변경은 결합 부위의 결합 에너지, 입체 장애 또는 위치를 변경함으로써 조건부 활성 폴리펩티드의 결합 친화성을 개선할 수 있다. 이러한 경우들에 있어서, 활성이 요망되는 pH에서 조건부 활성 폴리펩티드와 결합하는 소 분자 또는 이온를 선택하는 것이 요망될 수 있다.
비록 염 다리(이온 결합)들은 화합물과 이온으로 하여금 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 가장 강하고 가장 통상적인 방식으로 영향을 주도록 만들지만, 이러한 화합물 및 이온과, 조건부 활성 폴리펩티드 간 기타 상호작용들도 또한 이 조건부 활성 폴리펩티드의 구조를 안정화 또는 고정하는데에 기여할 수 있음이 이해되어야 할 것이다. 이러한 기타 상호작용들로서는 수소 결합, 소수성 상호작용 및 반 데르 발스 상호작용을 포함한다.
몇몇 구현예들에서, 적합한 화합물이나 이온을 선택하기 위하여 조건부 활성 폴리펩티드는, 이것의 진화 기원인 모 폴리펩티드와 비교되고, 이로부터 조건부 활성 폴리펩티드 중 음으로 하전된 아미노산 잔기의 비율이 더 높은지, 아니면 양으로 하전된 아미노산 잔기의 비율이 더 높은지가 확인된다. 그러면 활성이 요망되는 pH와 정상 생리학적 pH 각각에서 적합한 전하를 가지는 이온 또는 화합물은 자체의 크기와 pKa 값을 기반으로 선택되어, 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치는데 사용될 수 있다. 예를 들어 조건부 활성 폴리펩티드가 모 폴리펩티드보다 양 하전 아미노산 잔기의 비율이 더 높으면, 통상 적합한 소 분자 또는 이온이 조건부 활성 폴리펩티드와 상호작용하려면 이 소 분자 또는 이온은 정상 생리학적 pH에서 음으로 하전되어야 하며, 활성이 요망되는 pH에서는 하전되지 않아야 한다. 다른 한편으로, 조건부 활성 폴리펩티드가 모 폴리펩티드보다 음 하전 아미노산 잔기의 비율이 더 높으면, 통상 적합한 소 분자 또는 이온이 조건부 활성 폴리펩티드와 상호작용하려면 이 소 분자 또는 이온은 정상 생리학적 조건에서 양 하전되어야 하고, 활성이 요망되는 pH에서는 하전되지 않아야 한다.
다른 구현예들에서, 조건부 활성 폴리펩티드의 활성은 소 분자 또는 이온과, 이 조건부 활성 폴리펩티드의 결합 파트너인 표적 폴리펩티드의 상호작용에 의해 제어된다. 이러한 경우, 상기 논의된 바와 동일한 원리들이 또한 적용될 수 있되, 다만 그 목표는 소 분자 또는 이온과 표적 폴리펩티드 간 상호작용을 일으키는 것이다. 표적 폴리펩티드는, 예를 들어 조건부 활성 항체에 대한 항원, 또는 조건부 활성 수용체에 대한 리간드일 수 있다.
적합한 소 분자 또는 이온은, 활성이 요망되는 pH에서 하전되지 않거나 덜 하전되는 상태로부터, 정상 생리학적 pH에서 하전되거나 더 많이 하전되는 상태로 전환시키는 임의의 무기 또는 유기 화합물 또는 이온일 수 있다. 그러므로 소 분자 또는 이온의 pKa는 통상 활성이 요망되는 pH와 정상 생리학적 pH 사이에 있어야 한다. 예를 들어 중탄산염의 pKa는 6.4이다. 그러므로, 예컨대 pH 7.4에서 음으로 하전된 중탄산염은 조건부 활성 폴리펩티드 내 하전된 아미노산 잔기들에 결합하여 이 폴리펩티드의 활성을 감소시킬 것이다. 다른 한편, 더 낮은 pH, 예컨대 pH 6.0에서 저 하전 중탄산염은 조건부 활성 폴리펩티드에 동일한 양으로 결합할 것이므로, 조건부 활성 폴리펩티드의 활성을 더 높일 수 있다.
이황화물의 pKa는 7.05이다. 그러므로 정상 생리학적 pH, 예컨대 pH 7.4에서 더 많이 음으로 하전된 이황화물은 조건부 활성 폴리펩티드 내 양으로 하전된 아미노산 잔기들과 결합하여 이 폴리펩티드의 활성을 낮출 것이다. 다른 한편, 낮은 pH, 예컨대 pH 6.2 ~ 6.8에서 저 하전 황화수소/이황화물은 조건부 활성 폴리펩티드에 동일한 수준으로 결합하지 않을 것이므로, 조건부 활성 폴리펩티드의 활성을 더 높일 수 있다.
pKa가 활성이 요망되는 pH와 정상 생리학적 pH 사이인 소 분자 또는 이온이 본 발명에 사용되기 바람직하다. 바람직한 종은 이황화물, 황화수소, 히스티딘, 히스타민, 시트르산염, 중탄산염, 아세트산염 및 젖산염으로부터 선택된다. 이러한 소 분자 또는 이온 각각의 pKa는 6.2 내지 7.0이다. 또한, 기타 소 분자, 예컨대 트리신(pKa 8.05) 및 비신(pKa 8.26)도 사용될 수 있다. 기타 적합한 소 분자 또는 이온은, 예를 들어 본 출원의 원리를 이용하는 문헌들[CRC Handbook of Chemistry and Physics, 96th Edition, CRC 출판사, 2015 및 the Chemical Properties Handbook, McGraw-Hill Education, 1998]과 같은 교과서에서 찾아볼 수 있다.
검정 배지 또는 환경중 소 분자 또는 이온의 농도는, 바람직하게 대상체내 소 분자 또는 이온의 생리학적 농도이거나 그 근처이다. 예를 들어 인간 혈청중 중탄산염의 생리학적 농도는 15 mM 내지 30 mM의 범위이다. 그러므로 검정 배지 중 중탄산염의 농도는 10 mM 내지 40 mM, 또는 15 mM 내지 30 mM, 또는 20 mM 내지 25 mM, 또는 약 20 mM일 수 있다. 검정 배지 중 이황화물의 농도는 3 nM 내지 500 nM, 또는 5 nM 내지 200 nM, 또는 10 nM 내지 100 nM, 또는 10 nM 내지 50 nM일 수 있다.
본 발명에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 선택되어 어떤 농도로 사용되고, 이로써 환경 중 특정 종의 생리학적 정상 농도는 관심 pH 범위에서의 조건부 활성 폴리펩티드 활성에 유의적인 영향을 미칠 것이다. 그러므로 다수의 치료적 처치에 있어, 조건부 활성 폴리펩티드가 활성화되는 것을 최소화하거나 막으며 혈류를 통해 치료적 처치의 달성이 허용되도록 하기 위해서는 혈액 또는 인간 혈청의 pH인 pH 7.2 ~ 7.4 근처에서 조건부 활성 폴리펩티드에 대한 활성이 작은 것이 유리할 수 있다. 결과적으로 이러한 처치를 위해서는, 혈류 pH에서 충분한 정도의 소 분자 이온화를 보장하여, 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 유의미한 영향을 미치도록, pKa가 pH 7.2 ~ 7.4 이하인 소 분자 또는 이온을 선택하는 것이 유리할 것이다. 이와 동시에, 소 분자 또는 이온의 양성자첨가에 의해 조건부 활성 폴리펩티드의 활성화를 보장하여, 조건부 활성 폴리펩티드상 결합 위치들을 해방시키기 위해서, 소 분자 또는 이온의 pKa는 조건부 활성 폴리펩티드의 활성이 요망되는 pH 또는 그 이상이어야 한다.
소 분자 또는 이온은 입체 장애를 최소화함으로써 표적 폴리펩티드 또는 조건부 활성 폴리펩티드상 소형 포켓에의 최대 접근이 보장되도록, 분자량이 작고/작거나 입체구조가 비교적 작은 것이 바람직하다. 이러한 이유로, 소 분자 또는 이온은 통상 분자량이 900 a.m.u. 미만이거나, 더욱 바람직하게는 500 a.m.u. 미만이거나, 더욱 바람직하게는 200 a.m.u. 미만이거나, 더욱더 바람직하게는 100 a.m.u. 미만이다. 예를 들어 이하 실시예 13과 실시예 14에 보인 바와 같이, 수소 황화물, 이황화물 및 중탄산염은 모두 분자량이 작고, 표적 폴리펩티드 또는 조건부 활성 폴리펩티드 상 포켓들에 대한 접근 경로를 제공하는 작은 구조를 가진다.
소 분자 또는 이온은 조건부 활성 또는 환경에 대해 선택하는데 사용되는 검정에서 실질적으로 동일한 농도(예컨대 중탄산염의 경우 약 20 μM)로 존재할 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 소 분자 또는 이온은 상이한 환경에 상이한 농도로 존재할 수 있으므로, 검정에 이 점을 모의하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어 이황화물은 인간의 혈청에서보다 종양 미세환경에서 그 농도가 더 높다. 그러므로 제2의 검정은 산성 pH 및 이황화물의 더 높은 농도를 보이는 종양 미세환경을 모의할 수 있는 반면에, 제1 검정은 중성 또는 약염기성 pH 및 이황화물의 더 낮은 농도를 보이는 인간 혈청을 모의할 수 있다. 산성 pH는 6.0 내지 6.8의 범위일 수 있는 반면에, 중성 또는 약염기성 pH는 약 7.4일 수 있다. 종양 미세환경을 모의하는 제2 검정에 대한 이황화물의 더 높은 농도는 30 μM일 수 있는 반면에, 인간 혈청을 모의하는 제1 검정에 대한 이황화물의 더 낮은 농도는 10 μM 이하, 또는 5 μM일 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 폴리펩티드는, 2개 이상의 상이한 소 분자 및/또는 이온이 존재할 때, 예를 들어 중탄산염과 히스티딘이 조합을 이루며 존재할 때, pH 의존적이다.
소 분자 또는 이온이 존재하지 않을 때, 조건부 활성 폴리펩티드는 자체의 pH 의존성을 상실할 수 있다. 그러므로 소 분자 또는 이온이 존재하지 않을 때, 조건부 활성 폴리펩티드는 활성이 요망되는 비정상 pH와, 정상 생리학적 pH 사이에서 유사한 활성을 보일 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 활성이 요망되는 비정상 pH는 산성 pH인 반면에, 정상 생리학적 pH는 염기성 또는 중성 pH이다. 예를 들어 비정상 pH는 약 5.5 내지 약 7.2, 또는 약 6.0 내지 약 7.0, 또는 약 6.2 내지 약 6.8의 범위의 pH일 수 있다. 정상 생리학적 pH는 7.2 이상 내지 7.6 미만의 범위의 pH일 수 있다. 산성 pH에서 활성이 더 크고, 염기성 또는 중상 pH에서 활성이 더 작은 조건부 활성 폴리펩티드는 비정상 pH가 약 5.5 내지 약 7.2, 또는 약 6.2 내지 약 6.8로 산성인 종양 미세환경을 표적화할 수 있다.
다른 구현예들에서, 활성이 요망되는 비정상 pH는 염기성 pH인 반면에, 정상 생리학적 pH는 산성 또는 중성 pH이다. 예를 들어 pH 의존적 폴리펩티드가 더 큰 활성을 보이는 비정상 pH는, 예컨대 7.6 ~ 7.9로 염기성 pH(예컨대 활액막 액)일 수 있다(Jebens et al., "On the viscosity and pH of synovial fluid and pH of blood," Journal of Bone and Joint Surgery, vol. 41 B, pp. 388-400, 1959 참조). 정상 생리학적 pH는 혈액의 pH, 즉 조건부 활성 폴리펩티드가 작은 활성을 보이는 pH인 pH 7.2 이상 ~ 7.6 이하일 수 있다. 이러한 조건부 활성 폴리펩티드는 관절 질환 및 관절의 염증을 표적화하는데에 적합할 수 있다.
다른 구현예들에서, 본 조건부 활성 폴리펩티드는 뇌를 표적화하도록 디자인될 수 있다. 혈액 뇌 장벽의 안팎 pH에는 차이가 있는데, 뇌쪽의 pH는 혈액 또는 인간 혈청의 pH보다 약 0.2 pH 단위만큼이 낮다. 그러므로 조건부 활성 폴리펩티드의 활성이 더 큰 뇌의 비정상 pH(뇌 pH)는 약 7.0 내지 약 7.2일 수 있는 한편, 정상 생리학적 pH는 7.2 이상 ~ 7.6 미만일 수 있다.
조건부 활성 폴리펩티드는 효소, 시토카인, 수용체, 특히 세포성 수용체, 조절 폴리펩티드, 가용성 폴리펩티드, 항체 또는 호르몬일 수 있다.
조건부 활성 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 단편일 수 있다. 예를 들어 조건부 활성 폴리펩티드는 항체 단편, 단일 사슬 항체, 효소의 단편, 수용체의 단편, 시토카인의 단편 또는 호르몬의 단편일 수 있다. 항체 단편은 항체의 Fc 단편일 수 있다.
Fc 단편은 조건부 활성 Fc 단편을 제조하기 위한 모 폴리펩티드로 사용될 수 있다. Fc 단편과 보체의 결합은 항체 의존적 세포 매개 세포독성을 제공하는데 사용될 수 있다. 비정상 pH는 5.5 내지 7.2 또는 6.2 내지 6.8의 범위로서, 종양 미세환경의 pH와 같이 산성일 수 있는 반면에, 정상 생리학적 pH는 7.2 이상 내지 7.6 미만의 범위이다. 비정상 pH는, pH가 통상 약 4.0인 리소좀내 pH와는 상이하다. 또한, 리소좀은 임의의 기타 폴리펩티드와 같이 Fc 단편이 분해에 대해 표적화되는 장소이다. 리소좀내 보체는 존재하지 않으며, 세포 매개 세포독성도 리소좀을 통해 일어나지 않는다.
조건부 활성 폴리펩티드는 기능성 도메인을 2개 가질 수 있는데, 단 기능성 도메인 중 적어도 1개, 바람직하게 둘 다는 pH 의존적 활성을 보인다. 이 2개의 기능성 도메인은 동시에 진화될 수 있으며, 선택은 동일 돌연변이 폴리펩티드내 2개의 기능성 도메인을 동정하는 방식으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 기능성 도메인 2개는 독립적으로 진화하여 선택될 수 있다. 이 경우, 기능성 도메인 2개는 키메라 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
하나의 양상에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 단백질과 같은 인자가 존재할 때, 활성이 요망되는 비정상 pH에서는 모 폴리펩티드 활성에 비하여 증가한 활성을, 그리고 정상 생리학적 pH에서는 모 폴리펩티드 활성에 비하여 감소한 활성을 보인다. 단백질은 혈액, 인간의 혈청 또는 체내 미세환경, 예컨대 종양 미세환경, 염증성 부위, 활액막 액, 뇌 등에 존재하는 단백질일 수 있다. 적합한 단백질 하나는 알부민, 구체적으로 포유동물 알부민, 예컨대 소 알부민 또는 인간 알부민일 수 있다.
하나의 양상에서, 단백질, 예컨대 알부민은 조건부 활성 폴리펩티드를 스크리닝 및 선택하기 위해 사용되는 검정 용액 중에 존재한다. 다른 양상에서, 단백질, 예컨대 알부민을 함유하는 검정 용액은 또한 선택된 조건부 활성 폴리펩티드의 활성을 동일하거나 상이한 조건하에서 시험하는데 사용될 수도 있다.
J. 조건부 활성 폴리펩티드의 조작
본 발명의 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는 WO 2017/078839[표제 “조건부 활성 폴리펩티드의 조작,”“마스킹된 조건부 활성 폴리펩티드의 조작,” 및“조건부 활성 항체의 조작.”인 섹션들]에 기술된 방법들 중 임의의 것이 사용되어 추가로 조작될 수 있다. 또한 본 발명의 조건부 활성 폴리펩티드 및 조작된 조건부 활성 폴리펩티드는 WO 2017/078839에 기술된 바와 같이 암 살상 바이러스인 바이러스 입자에 삽입될 수 있다.
K. 조건부 활성 폴리펩티드의 제조
본 발명의 선택된 조건부 활성 폴리펩티드 및 조작된 조건부 활성 폴리펩티드는 치료용, 예방용, 진단용, 연구용 및 관련 용도로 사용되기 위해 WO 2017/078839(표제 “조건부 활성 폴리펩티드의 제조”인 섹션)에 기술된 방법이 사용되어 제조될 수 있다.
G. 약학 조성물
조건부 활성 폴리펩티드 또는 조작된 조건부 활성 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물뿐 아니라, 이러한 약학 조성물의 용도가 WO 2017/078839에 기술되어 있다. 본 발명은 치료, 예방 및 진단 응용예에 사용될 수 있는 조건부 활성 폴리펩티드 또는 이 조건부 활성 폴리펩티드의 추가로 조작된 것을 함유하는 약학 조성물로 확대된다.
L. 조건부 활성 폴리펩티드의 용도
본 발명은 또한 고형 종양, 염증성 관절, 또는 뇌 질환이나 장애의 치료적 처치 또는 예방적 처치를 위한 조건부 활성 폴리펩티드의 용도를 포함한다.
본 발명의 조건부 활성 폴리펩티드를 고형 종양, 염증성 관절, 또는 뇌 질환이나 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써, 고형 종양, 염증성 관절 또는 뇌 질환 또는 장애를 치료하는 방법도 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용되는 바와 같이, 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한, 단수 형태를 나타내는 "하나", "하나의", 그리고 "상기"는 복수의 인용대상들을 포함하는 것임이 주목되어야할 것이다. 또한, "하나"(또는 "하나의"), "하나 이상의" 및 "적어도 하나"라는 용어는 본원에서 호환되어 사용될 수 있다. "~를 포함하는(comprising)", "~를 포함하는(including)", "~를 가지는" 및 "~로부터 구성된"이라는 용어도 또한 호환되어 사용될 수 있다.
달리 명시되지 않으면, 명세서 및 청구의 범위에 사용된 성분의 양, 예컨대 분자량, 퍼센트, 비율, 반응 조건 등과 같은 특성 등을 표현하는 모든 수치는, 모든 경우 ("약"이라는 용어가 존재하건 존재하지 않건 간에) 이 "약"이라는 용어에 의해 변경되는 것으로 이해되어야 한다. 그러므로, 달리 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구의 범위에 제시된 수치 매개 변수는 본 발명에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라서 달라질 수 있는 근사치이다. 적어도, 그리고 청구 범위에 균등론의 적용을 제한하려는 시도가 아닌 것으로서, 각각의 수치 매개변수는 적어도 보고된 유의적 숫자들의 수를 고려하고, 통상의 반올림 기법을 적용하여 해석되어야할 것이다. 수치 범위와 본 발명의 넓은 범주를 제시하는 매개변수들이 근사치임에도 불구, 특정 예에 제시된 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치 값은 원래, 그 각각의 시험 측정치에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 기인하는 임의의 오차들을 포함한다.
본 명세서에 개시된 각 구성 요소, 화합물, 치환기 또는 매개변수는 단독 사용, 또는 본 명세서에 개시된 또 다른 구성 요소, 화합물, 치환기 또는 매개변수 각각 및 모두 중 하나 이상과의 조합 사용에 대해 개시되는 것으로 해석되어야 함이 이해될 것이다.
본 명세서에 개시된 각각의 구성 요소, 화합물, 치환기 또는 매개 변수에 대한 각각의 양/수치 또는 양/수치 범위는, 본 명세서에 개시된 임의의 기타 구성 요소(들), 화합물(들), 치환기(들) 또는 매개 변수(들)에 대해 개시된 각각의 양/수치 또는 양/수치 범위와 함께 개시되는 것으로 해석되어야 할 것임과, 본 명세서에 개시된 2개 이상의 구성 요소(들), 화합물(들), 치환기(들) 또는 매개 변수(들)에 대한 양/수치 또는 양/수치 범위의 임의의 조합도 또한 본 명세서의 목적을 위해 개시되기도 함도 또한 이해되어야 할 것이다.
또한 본 명세서에 개시된 각각의 범위는 유의적 숫자와 동일한 값을 가지는, 개시된 범위 내 각각의 특정 수치에 관한 개시로서 해석되어야 함도 추가로 이해된다. 그러므로 1 ~ 4의 범위는 수치 1, 2, 3 및 4의 분명한 개시로서 해석되어야한다. 또한 본 명세서에 개시된 각각의 범위 중 각각의 하한은, 동일한 구성 성분, 화합물들, 치환기 또는 매개변수에 대해 본 명세서에 개시된 각각의 범위의 각각의 상한 및, 각각의 범위 내 각각의 특정 수치와 함께 개시되는 것으로 해석되어야 함도 추가로 이해된다. 따라서, 본 발명은 각각의 범위의 각각의 하한과, 각각의 범위의 각각의 상한 또는 각각의 범위 내 각각의 특정 수치를 조합하거나, 또는 각각의 범위의 각각의 상한과, 각각의 범위 내 각각의 특정 수치를 조합함으로써 도출되는 모든 범위의 개시로서 해석되어야 한다.
또한, 본 명세서 또는 실시예에 개시된 구성 성분, 화합물, 치환기 또는 매개변수의 특정 양/수치는 어떤 범위의 하한 또는 상한 중 어느 하나의 개시로서 해석되어야 하므로, 본 출원의 어느 곳에 개시된 동일 구성 성분, 화합물, 치환기 또는 매개변수에 대한 범위 또는 특정 양/수치의 기타 임의의 하한 또는 상한과 조합되어 이 구성 성분, 화합물, 치환기 또는 매개변수에 대한 어떤 범위를 이룰 수 있다.
본원에 인용된 모든 문서들은 전체로서 본원에 참조로서 첨부되어 있거나, 대안적으로는 문서들이 구체적으로 필요한 개시내용을 제공하기 위해 첨부되어 있다. 본 출원인(들)은 개시된 임의의 구현예들을 공중에게 헌정할 의향이 없으며, 개시된 임의의 변형 또는 변경이 문자 그대로 청구항들의 범위 안에 포함될 수 없는 경우, 이 변형 또는 변경은 균등론 하에 균등물의 일부로서 간주된다.
그러나, 본 발명의 다수 특징 및 이점이 전술된 본 발명의 설명에 제시되어 있긴 하지만, 본 발명의 기능과 구조에 관한 세부 설명과 함께 본 발명은 오로지 예시를 위한 것으로서, 특히 본 발명의 원리에 속하는 부분들의 형태, 크기 및 정렬의 문제에 있어서의 변화는, 첨부된 청구항에 표현된 용어들의 일반적인 넓은 의미들에 의해 지정되는 최대한도로 세부적으로 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.

Claims (51)

  1. (i) 돌연변이 1개 이상을 모 폴리펩티드에 도입하여 모 폴리펩티드를 진화시킴으로써, 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 더 낮은 pI를 보이는 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상을 제조하는 단계;
    (ii) 상기 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상을 대상으로 정상 생리학적 조건하에서 제1 검정을 실시하여, 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상의 정상 생리학적 조건하에서의 활성을 측정하고, 비정상 조건하에서 제2 검정을 실시하여, 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상의 비정상 조건하에서의 활성을 측정하는 단계이되, 단 상기 정상 생리학적 조건 및 상기 비정상 조건은 동일하되, 값은 상이한 조건인 단계; 및
    (iii) 제1 검정에서의 활성에 비하여 비정상 조건하 제2 검정에서의 동일 활성 증가를 보이는 조건부 활성 폴리펩티드를 돌연변이 폴리펩티드 1개 이상으로부터 선택하는 단계
    를 포함하는, 모 폴리펩티드로부터 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조건부 활성 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 pI보다 더 낮은 pI를 보이는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조건부 활성 폴리펩티드는 7.4 이하의 pI, 또는 7.3 이하의 pI, 또는 7.2 이하의 pI, 또는 7.1 이하의 pI, 또는 7.0 이하의 pI를 보이는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 1개 이상은 모 폴리펩티드에 치환되어 들어간 아미노산의 pI보다 더 높은 pI를 보이는, 모 폴리펩티드내 아미노산 잔기에 대한 아미노산 잔기의 아미노산 치환 적어도 1개를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 돌연변이 1개 이상은 상기 치환을 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 1개 이상은 모 폴리펩티드의 pI보다 더 낮은 pI를 보이는 아미노산 잔기의 삽입 적어도 1개를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 돌연변이 1개 이상은 상기 삽입을 2개, 3개, 4개 또는 5개 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 1개 이상은 모 폴리펩티드의 pI보다 더 높은 pI를 보이는 아미노산 잔기의 결실 적어도 1개를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 돌연변이 1개 이상은 상기 결실을 2개, 3개, 4개 또는 5개 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이중 1개 이상은 돌연변이 폴리펩티드의 표면상에 노출된 위치에 존재하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진화 단계는 추가 돌연변이 1개 이상을 돌연변이 폴리펩티드에 도입하는 것을 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii) 이전에 돌연변이 폴리펩티드의 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%가 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 더 낮은 pI를 보임을 확인하기 위한 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 단계 (ii) 이전에 pI가 모 폴리펩티드의 pI보다 더 높은 돌연변이 폴리펩티드를 폐기하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건부 활성 폴리펩티드의 pI를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건부 활성 폴리펩티드의 pI는 모 폴리펩티드의 pI보다 적어도 0.1 유닛, 또는 적어도 0.2 유닛, 또는 적어도 0.3 유닛, 또는 적어도 0.4 유닛, 또는 적어도 0.5 유닛, 또는 적어도 0.6 유닛, 또는 적어도 0.8 유닛, 또는 적어도 1.0 유닛, 또는 적어도 1.2 유닛, 또는 적어도 1.4 유닛, 또는 적어도 1.5 유닛, 또는 적어도 1.7 유닛, 또는 적어도 2.0 유닛, 또는 적어도 2.5 유닛, 또는 적어도 3.0 유닛, 또는 적어도 3.5 유닛, 또는 적어도 4.0 유닛, 또는 적어도 5.0 유닛 더 낮은 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모 폴리펩티드는 항체, 효소, 호르몬, 성장 인자, 시토카인, 조절 단백질, 기능성 펩티드, 바이오시밀러, 면역 조절제, 수용체 및 리간드로부터 선택되는 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모 폴리펩티드는 전장 항체, 단일 사슬 항체, 항체 단편, 중쇄, 경쇄, Fab 및 Fc 도메인으로부터 선택되는 항체인 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모 폴리펩티드는 치료용 항체 또는 치료용으로 개발되고 있는 후보 항체인 방법.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모 폴리펩티드는 IgG 항체인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이 1개 이상은 IgG 항체의 가변 영역에 있는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이 1개 이상은 IgG 항체의 불변 영역에 있는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 돌연변이 1개 이상은 IgG 항체의 상보성 결정 영역 1개 이상에 있는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건은 pH, 온도, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스 및 전해질 농도로부터 선택되는 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건은 pH인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 제1 검정의 pH는 7.2 이상 내지 7.6 미만이고, 제2 검정의 pH는 7.2 미만 또는 7.6 이상인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 검정에서의 조건부 활성 폴리펩티드의 활성 대 제1 검정에서의 동일 활성의 비는 적어도 1.3, 또는 1.5, 또는 적어도 1.7, 또는 적어도 2.0, 또는 적어도 3.0, 또는 적어도 4.0, 또는 적어도 6.0, 또는 적어도 8.0, 또는 적어도 10.0, 또는 적어도 20.0, 또는 적어도 40.0, 또는 적어도 60.0, 또는 적어도 100.0인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 검정과 상기 제2 검정 둘 다는 분자량이 900 a.m.u. 미만, 500 a.m.u. 미만, 200 a.m.u. 미만, 또는 100 a.m.u. 미만인 분자 또는 이온이 존재할 때 수행되는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 분자 또는 이온은 히스티딘, 히스타민, 수소화 아데노신 이인산염, 수소화 아데노신 삼인산염, 시트르산염, 중탄산염, 아세트산염, 젖산염, 이황화물, 황화수소, 암모늄, 인산이수소 및 이것들의 임의의 조합으로부터 선택되는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 분자 또는 이온은 농도가 약 3 mM 내지 약 200 mM, 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 5 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 25 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM, 약 35 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 50 mM 내지 약 100 mM 범위인 중탄산염 이온인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 분자 또는 이온은 농도가 1 mM 내지 100 mM, 2nM 내지 500 nM, 3 nM 내지 200 nM, 5 nM 내지 100 nM 범위인 이황화물 이온인 방법.
  31. 제27항에 있어서, 상기 분자 또는 이온은 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 이황화나트륨 또는 이황화칼륨으로부터 선택되는 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리학적 조건은 정상 생리학적 pH이고, 상기 비정상 조건은 정상 생리학적 pH와 상이한 비정상 pH이며, 분자 또는 이온의 pKa는 정상 생리학적 pH와 비정상 pH 사이인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 분자 또는 이온의 pKa는 비정상 pH로부터 0.1 유닛, 0.2 유닛, 0.3 유닛, 0.4 유닛, 0.5 유닛, 0.6 유닛, 0.8 유닛, 또는 1.0 유닛, 2.0 유닛 이하 떨어져 있는 방법.
  34. pI를 보이는 모 폴리펩티드로부터 유래한 조건부 활성 폴리펩티드로서, 상기 조건부 활성 폴리펩티드는
    a. 모 폴리펩티드의 pI와 동일하거나 이보다 더 낮은 pI를 보이고;
    b. 비정상 조건하 제2 검정에서의 활성 대 정상 생리학적 조건하 제1 검정에서의 동일 활성의 비가 적어도 1.3이되,
    단 상기 조건부 활성 폴리펩티드의 활성은 분자량이 900 a.m.u. 미만인 분자 또는 이온 적어도 1개의 존재하에서 측정되는 조건부 활성 폴리펩티드.
  35. 제34항에 있어서, 상기 분자량은 500 a.m.u. 미만, 200 a.m.u. 미만, 또는 100 a.m.u. 미만인 조건부 활성 폴리펩티드.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 비정상 조건하 제2 검정에서의 활성 대 정상 생리학적 조건하 제1 검정에서의 동일 활성의 비는 적어도 1.5, 또는 적어도 1.7, 또는 적어도 2.0, 또는 적어도 3.0, 또는 적어도 4.0, 또는 적어도 6.0, 또는 적어도 8.0, 또는 적어도 10.0, 또는 적어도 20.0, 또는 적어도 40.0, 또는 적어도 60.0, 또는 적어도 100.0인 조건부 활성 폴리펩티드.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건부 활성 폴리펩티드의 pI는 모 폴리펩티드의 pI보다 적어도 0.1 유닛, 또는 적어도 0.2 유닛, 또는 적어도 0.3 유닛, 또는 적어도 0.4 유닛, 또는 적어도 0.5 유닛, 또는 적어도 0.6 유닛, 또는 적어도 0.8 유닛, 또는 적어도 1.0 유닛, 또는 적어도 1.2 유닛, 또는 적어도 1.4 유닛, 또는 적어도 1.5 유닛, 또는 적어도 1.7 유닛, 또는 적어도 2.0 유닛, 또는 적어도 2.5 유닛, 또는 적어도 3.0 유닛, 또는 적어도 3.5 유닛, 또는 적어도 4.0 유닛, 또는 적어도 5.0 유닛 더 낮은 조건부 활성 폴리펩티드.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건부 활성 폴리펩티드는 항체, 효소, 호르몬, 성장 인자, 시토카인, 조절 단백질, 기능성 펩티드, 바이오시밀러, 면역 조절제, 수용체 및 리간드로부터 선택되는 조건부 활성 폴리펩티드.
  39. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건부 활성 폴리펩티드는 전장 항체, 단일 사슬 항체, 항체 단편, 중쇄, 경쇄, Fab 및 Fc 도메인으로부터 선택되는 항체인 조건부 활성 폴리펩티드.
  40. 제39항에 있어서, 상기 항체는 IgG 항체인 조건부 활성 폴리펩티드.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건은 pH, 온도, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스 및 전해질 농도로부터 선택되는 조건부 활성 폴리펩티드.
  42. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정상 생리학적 조건은 7.2 이상 내지 7.6 미만의 범위의 pH이고, 상기 비정상 조건은 5.5 내지 7.2 미만의 범위의 pH인 조건부 활성 폴리펩티드.
  43. 제42항에 있어서, 상기 분자 또는 이온은 정상 생리학적 pH 및 비정상 pH 사이의 pKa를 보이는 조건부 활성 폴리펩티드.
  44. 제43항에 있어서, 상기 분자 또는 이온의 pKa는 비정상 pH로부터 0.1 유닛, 0.2 유닛, 0.3 유닛, 0.4 유닛, 0.5 유닛, 0.6 유닛, 0.8 유닛, 또는 1.0 유닛, 2.0 유닛 이하 떨어져 있는 조건부 활성 폴리펩티드.
  45. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자 또는 이온은 히스티딘, 히스타민, 수소화 아데노신 이인산염, 수소화 아데노신 삼인산염, 시트르산염, 중탄산염, 아세트산염, 젖산염, 이황화물, 황화수소, 암모늄, 인산이수소 및 이것들의 임의의 조합으로부터 선택되는 조건부 활성 폴리펩티드.
  46. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자 또는 이온은 농도가 약 3 mM 내지 약 200 mM, 약 5 mM 내지 약 150 mM, 약 5 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 25 mM 내지 약 100 mM, 약 30 mM 내지 약 100 mM, 약 35 mM 내지 약 100 mM, 약 40 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 50 mM 내지 약 100 mM 범위인 중탄산염 이온인 조건부 활성 폴리펩티드.
  47. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자 또는 이온은 농도가 1 mM 내지 100 mM, 2 nM 내지 500 nM, 3 nM 내지 200 nM, 5 nM 내지 100 nM 범위인 이황화물 이온인 조건부 활성 폴리펩티드.
  48. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자 또는 이온은 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 이황화나트륨 또는 이황화칼륨으로부터 선택되는 조건부 활성 폴리펩티드.
  49. 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 의한 조건부 활성 폴리펩티드 유효량만큼과, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  50. 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 의한 조건부 활성 폴리펩티드의, 고형 종양, 염증성 관절, 또는 뇌 질환이나 장애의 치료를 위한 용도.
  51. 고형 종양, 염증성 관절, 또는 뇌 질환이나 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 의한 조건부 활성 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 고형 종양, 염증성 관절, 또는 뇌 질환이나 장애를 치료하는 방법.
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