CN112566929A - 具pH选择性的条件活性蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种自亲本多肽产生条件活性多肽的方法，其包括以下步骤：(i)通过将突变引入到所述亲本多肽中来进化所述亲本多肽以产生pI等于或低于所述亲本多肽的pI的突变多肽；(ii)使所述突变多肽经受正常生理条件下的第一分析以测量所述突变多肽在所述正常生理条件下的活性，及使所述突变多肽经受在异常条件下的第二分析以测量所述突变多肽在所述异常条件下的活性，其中所述正常生理条件及所述异常条件为相同条件但具有不同值；及(iii)从所述突变多肽中选择所述条件活性多肽，相比于在所述第一分析中的相同活性，所述条件活性多肽在所述第二分析中表现出增加的活性。本发明还提供条件活性多肽及用途。

Description

具pH选择性的条件活性蛋白质

技术领域

本发明涉及具有条件活性的多肽领域。具体地说，本发明涉及具有pH依赖性活性的条件活性多肽和一种自亲本多肽产生条件活性多肽的方法。

背景技术

存在相当多文献描述进化蛋白质的方法，以便各种特征(尤其酶或抗体)在不同条件下具有活性或稳定性。举例来说，酶已经进化成在较高温度下为稳定的。在较高温度下存在酶活性提高的情形下，实质大部分提高可归因于通常由Q10规则所描述的较高动力活性，其中据估计在酶的情况下，每增加10℃转换加倍。

另外，存在使蛋白质在其正常操作条件下不稳定的自然突变，由此降低在正常操作条件下的蛋白质活性。举例来说，存在在较低温度下具有活性但与衍生其的野生型蛋白质相比通常处于降低水准的已知温度突变。

将亲本多肽进化成在其常用操作条件下为无活性或几乎无活性(活性低于50％、30％或10％及尤其活性为1％)，同时保持与其在异常条件下的活性相等或更佳的活性可能需要一或多个不稳定突变与一或多个不会对抗不稳定效应的活性增加突变共存。预期所述不稳定突变将降低比由标准规则(例如Q10)所预测的效应更大的多肽活性，因而进化在异常条件下有效运行(例如同时在其正常操作条件下为较低活性或失活)的多肽的能力能产生条件活性多肽。

期望产生作为条件活性(例如在一个条件下为较低活性或几乎无活性及在另一条件下具有活性)的多肽。还期望产生在某些环境中活化或失活或随时间推移活化或失活的多肽。除温度以外，多肽可进化或改善条件活性的其它条件包含pH、渗透压、渗透压度、氧化应激及电解质浓度。除多肽的活性之外，常常需要在进化期间提高包含耐化学性及抗蛋白水解的其它特性。

此外，已观察到，多肽的等电点(pI)与多肽的半衰期(t_1/2)反比相关，参见Momany等人，“蛋白质的活体内降解速率与等电点之间的关联(Relationship between in vivodegradative rates and isoelectric points of proteins)”，美国国家科学院院刊(PNAS)，第73卷，第3093-3097页，1976。这对于抗体来说尤其如此，因为血浆中抗体的半衰期已与其等电点值正相关。具体地说，与具有较低pI值的抗体相比，具有较高pI值的抗体不仅具有更快的全身清除率，而且具有较低生物可用性。抗体的pI降低1到2个单位已表明与血浆清除率的降低相关(即较长半衰期)。参见Ryman，药物剂量学及系统药理学(Pharmacometrics Syst.Pharmacol.)，第6卷，第576-588页，2017。

已经描述用于改变多肽的pI的策略。举例来说，美国专利第9,908,932号公开一种转变具有七个蛋白质亚群的重组蛋白质的等电分布的方法，其中pI在约5.45与约6.55之间。所述方法包括以下步骤：(a)将包括编码重组蛋白质的核酸的哺乳动物细胞培养在足以产生产物的条件下的生产用生物反应器中持续第一时间段；及(b)在足以将产物的等电分布朝向更多酸性分布转变的条件下培育产物第二时间段，所述第二时间段由至少6个小时组成。具有经转变等电分布的产物展示七个蛋白质亚群中的第四及第五大部分酸性蛋白质亚群的数量增加，及七个蛋白质亚群中的第一及第二大部分碱性蛋白质亚群的数量减少。

美国专利第9,605,061号公开一种用于通过引入至少6个氨基酸突变来调节抗体的pI的方法，所述方法包含在选自重链恒定域及轻链恒定域中的一者或两者的恒定域中用非天然氨基酸取代。取代氨基酸具有低于天然氨基酸的pI，使得突变型抗体的pI相对于亲本抗体的pI降低至少0.5log。

US 2009/0324589公开一种通过经由修饰暴露在抗体表面上的残基来控制抗体的表面电荷从而增加血液中的IgG抗体的半衰期的方法，所述残基包含可变区中的残基。所述方法包括以下步骤：(a)调节包括FcRn结合域的编码亲本多肽的核酸以改变暴露在亲本多肽的表面上的至少一个氨基酸残基的电荷；(b)培养宿主细胞以表达经修饰核酸从而表达突变多肽；以及(c)从宿主细胞培养物中收集包括FcRn结合域的经表达突变多肽。

仍需要在特定环境及/或在特定条件下具有较高活性及/或选择性，且在血浆中还优选地具有增加半衰期的条件活性多肽。还具有增加半衰期的条件活性多肽将不仅优先作用于存在异常条件的位置，例如肿瘤微环境，而且由于其增加的半衰期还提供延长作用或整体活性的增加。另外，这些条件活性多肽将潜在地对存在正常生理条件的正常组织/器官造成较小的有害副作用。减小副作用的潜力允许用条件活性多肽或更高剂量的条件活性多肽进行更长期的治疗，导致更高功效。

WO 2010/104821及WO 2011/009058公开用于进化及筛选条件活性蛋白质的方法。

发明内容

在一个方面，本发明涉及一种自亲本多肽产生条件活性多肽的方法，所述方法包括以下步骤：(i)通过将一或多个突变引入到所述亲本多肽中来进化所述亲本多肽以产生pI等于或低于所述亲本多肽的pI的一或多个突变多肽；(ii)使所述一或多个突变多肽经受正常生理条件下的第一分析以测量所述一或多个突变多肽在所述正常生理条件下的活性，及使所述一或多个突变多肽经受异常条件下的第二分析以测量所述一或多个突变多肽在所述异常条件下的活性，其中所述正常生理条件及所述异常条件为相同条件但具有不同值；及(iii)从所述一或多个突变多肽中选择所述条件活性多肽，相比于在所述第一分析中的相同活性，所述条件活性多肽在所述第二分析中表现出增加的活性。

在前述实施例中，条件活性多肽的pI可低于亲本多肽的pI。

在前述实施例中的任一者中，条件地活性多肽可具有低于7.4的pI、或低于7.3的pI、或低于7.2的pI、或低于7.1的pI或低于7.0的pI。

在前述实施例中的任一者中，一或多个突变可包括针对亲本多肽中的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基的氨基酸取代，所述氨基酸残基的pI比经取代到亲本多肽中的氨基酸的pI高。

在前述实施例中的任一者中，一或多个突变可包括所述取代中的2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。

在前述实施例中的任一者中，一或多个突变可包括pI低于亲本多肽的pI的氨基酸残基的至少一个插入。

在前述实施例中的任一者中，一或多个突变可包括所述插入中的2、3、4或5个插入。

在前述实施例中的任一者中，一或多个突变可包括pI高于亲本多肽的pI的氨基酸残基的至少一个缺失。

在前述实施例中的任一者中，一或多个突变可包括所述缺失中的2、3、4或5个缺失。

在前述实施例中的任一者中，所述突变中的一或多个突变可定位于暴露在突变多肽表面上的位置中。

在前述实施例中的任一者中，进化步骤可包括将一或多个额外突变引入到突变多肽中。

前述实施例中的任一者可进一步包括步骤(ii)之前的用于确定至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％或至少98％的突变多肽的pI等于或低于亲本多肽的pI的步骤。

前述实施例可进一步包括在步骤(ii)之前舍弃pI大于亲本多肽的pI的突变多肽的步骤。

前述实施例中的任一者可进一步包括测量条件活性多肽的pI的步骤。

在前述实施例中的任一者中，条件活性多肽的pI可低于亲本多肽的pI至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.8、或至少1.0、或至少1.2、或至少1.4、或至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少2.5、或至少3.0、或至少3.5、或至少4.0、或至少5.0个单位。

在前述实施例中的任一者中，亲本多肽可选自抗体、酶、激素、生长因子、细胞因子、调节蛋白、功能肽、生物类似物、免疫调节剂、受体及配位体。

在前述实施例中的任一者中，亲本多肽可为选自全长抗体、单链抗体、抗体片段、重链、轻链、Fab及Fc域的抗体。

在前述实施例中的任一者中，亲本多肽可为治疗性抗体或研发用于医疗用途的候选抗体。

在前述实施例中的任一者中，亲本多肽可为IgG抗体。

在前述实施例中的任一者中，一或多个突变可处于IgG抗体的可变区中。

在前述实施例中的任一者中，一或多个突变可处于IgG抗体的恒定区中。

在前述实施例中的任一者中，一或多个突变可处于IgG抗体的一或多个互补决定区中。

在前述实施例中的任一者中，条件可选自pH、温度、渗透压、渗透压度、氧化应激及电解质浓度。

在前述实施例中的任一者中，条件可为pH。

在前述实施例中，第一分析的pH可大于7.2到低于7.6，且第二分析的pH低于7.2或大于7.6。

在前述实施例中的任一者中，条件活性多肽在第二分析中的活性与在第一分析中的相同活性的比率可为至少1.3、或1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少3.0、或至少4.0、或至少6.0、或至少8.0、或至少10.0、或至少20.0、或至少40.0、或至少60.0或至少100.0。

在前述实施例中的任一者中，第一分析及第二分析两者可在分子量小于900a.m.u.、小于500a.m.u.、小于200a.m.u.或小于100a.m.u.的分子或离子存在的情况下执行。

在前述实施例中，分子或离子可选自组氨酸、组胺、氢化二磷酸腺苷、氢化三磷酸腺苷、柠檬酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、乳酸盐、二硫化物、硫化氢、铵、磷酸二氢盐及其任何组合。

在前述实施例中，分子或离子可为浓度在约3mM到约200mM、约5mM到约150mM、约5mM到约100mM、约10mM到约100mM、约20mM到约100mM、约25mM到约100mM、约30mM到约100mM、约35mM到约100mM、约40mM到约100mM或约50mM到约100mM的范围内的碳酸氢根离子。

在前述实施例中，分子或离子可为浓度在1mM到100mM、2nM到500nM、3nM到200nM、5nM到100nM的范围内的二硫化物离子。

在前述实施例中的任一者中，分子或离子可选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、二硫化钠或二硫化钾。

在前述实施例中的任一者中，生理条件可为正常生理pH且异常条件为与正常生理pH不同的异常pH，且分子或离子具有在正常生理pH与异常pH之间的pKa。

在前述实施例中，分子或离子的pKa可距离异常pH至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8或1.0、2.0个单位。

在第二方面，本发明涉及一种衍生自具有pI的亲本多肽的条件活性多肽，所述条件活性多肽具有：(a)等于或低于亲本多肽的pI的pI；及(b)在异常条件下的第二分析中的活性与在正常生理条件下的第一分析中的相同活性的比率为至少1.3，其中条件活性多肽的活性在至少一种分子量小于900a.m.u.的分子或离子存在的情况下测量。

在第二方面，分子量可小于500a.m.u.、小于200a.m.u.或小于100a.m.u.。

在前述实施例中的任一者中，在异常条件下的第二分析中的活性与在正常生理条件下的第一分析中的相同活性的比率可为至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少3.0、或至少4.0、或至少6.0、或至少8.0、或至少10.0、或至少20.0、或至少40.0、或至少60.0、或至少100.0。

在前述实施例中的任一者中，条件活性多肽的pI可低于亲本多肽的pI至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.8、或至少1.0、或至少1.2、或至少1.4、或至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少2.5、或至少3.0、或至少3.5、或至少4.0、或至少5.0个单位。

在前述实施例中的任一者中，条件活性多肽可选自抗体、酶、激素、生长因子、细胞因子、调节蛋白、功能肽、生物类似物、免疫调节剂、受体及配位体。

在前述实施例中的任一者中，条件活性多肽可为选自全长抗体、单链抗体、抗体片段、重链、轻链、Fab及Fc域的抗体。

在前述实施例中，抗体可为IgG抗体。

在前述实施例中的任一者中，条件可选自pH、温度、渗透压、渗透压度、氧化应激及电解质浓度。

在前述实施例中的任一者中，正常生理条件可为在大于7.2到小于7.6范围内的pH，且异常条件为在5.5到小于7.2范围内的pH。

在前述实施例中，分子或离子可具有在正常生理pH与异常pH之间的pKa。

在前述实施例中，所述分子或离子的所述pKa可距离所述异常pH至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8或1.0、2.0个单位。

在前述实施例中的任一者中，所述分子或离子可选自组氨酸、组胺、氢化二磷酸腺苷、氢化三磷酸腺苷、柠檬酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、乳酸盐、二硫化物、硫化氢、铵、磷酸二氢盐及其任何组合。

在前述实施例中的任一者中，所述分子或离子可为浓度在约3mM到约200mM、约5mM到约150mM、约5mM到约100mM、约10mM到约100mM、约20mM到约100mM、约25mM到约100mM、约30mM到约100mM、约35mM到约100mM、约40mM到约100mM或约50mM到约100mM的范围内的碳酸氢根离子。

在前述实施例中的任一者中，所述分子或离子可为浓度在1mM到100mM、2nM到500nM、3nM到200nM、5nM到100nM的范围内的二硫化物离子。

在前述实施例中的任一者中，所述分子或离子可选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、二硫化钠或二硫化钾。

在又另一方面，本发明涉及一种医药组合物，其包括有效量的条件活性多肽及药学上可接受的载剂。

在又另一方面，本发明是关于一种用于治疗实体肿瘤、发炎关节或脑部疾病或病症的条件活性多肽的用途。

在又另一方面，本发明是关于一种治疗物理肿瘤、发炎关节或脑部疾病或病症的方法，所述方法包括向需要所述治疗的患者给予所述条件活性多肽。

附图说明

图1为展示在去氧血红素中形成盐桥的图式，其中三个氨基酸残基形成两个盐桥，这使去氧血红素的T四级结构稳定，从而导致对氧的亲和力降低。

定义

为了促进对本文所提供的实例的理解，本文将对某些频繁出现的方法及/或术语加以定义。以下术语的定义以全文引用的方式并入美国专利第8,709,755B2号：“试剂”、“不明确的基本要求”、“氨基酸”、“扩增”、“嵌合特性”、“同源”、“比较窗”、“保守氨基酸取代”、“对应于”、“降解有效”、“已确定序列构架”、“已确定序列内核”、“消化”、“定向连接”、“DNA改组”、“药物或药物分子”、“有效量”、“抗原决定基”、“酶”、“进化(evolution)”或“进化(evolving)”、“片段”或“衍生物”或“类似物”、“全范围的单氨基酸取代”、“基因”、“基因不稳定性”、“异源”、“同源(homologous)”或“同源(homeologous)”、“工业应用”、“一致”或“一致性”、“一致性区域”、“经分离”、“经分离核酸”、“配位体”、“连接”、“连接基团”或“间隔基”、“微环境”、“待进化的分子特性”、“突变”、“N,N,G/T”、“正常生理条件”或“野生型操作条件”、“核酸分子”、“核酸分子”、“核酸序列编码”或“DNA编码序列”或“核苷酸序列编码”、“编码酶(蛋白质)的核酸”或“编码酶(蛋白质)的DNA”或“编码酶(蛋白质)的聚核苷酸”、“特异性核酸分子物种”、“将工作核酸样本组装到核酸库中”、“核酸库”、“构筑”、“寡核苷酸”(或同义“寡核苷酸(oligo)”)、“同源(homologous)”、“可操作地连接”、“亲本聚核苷酸组”、“患者”或“个体”、“生理条件”、“群体”、“前形式”、“伪随机”、“准重复单位”、“随机肽库”、“随机肽序列”、“受体”、“重组”酶、“合成”酶、“相关聚核苷酸”、“还原再配”、“参考序列”、“重复索引(RI)”、“限制位点”、“可选择聚核苷酸”、“序列一致性”、“相似性”、“特异性结合”、“特异性杂交”、“特异性聚核苷酸”、“严格杂交条件”、“大体上一致”、“大体上纯的酶”、“大体上纯的”、“治疗”、“可变区段”及“变异体”。

以下术语的定义以全文引用的方式并入WO 2017/078839：“大约”、“活性”、“抗体”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”、“抗原”或“Ag”、“反义RNA”、“生物类似物(biosimilar)”或“生物类似物(follow-on biologic)”、“生物类似物抗体”、“癌”或“癌性”、“嵌合抗原受体”或“CAR”或“CARs”、“细胞因子(cytokine)”或“细胞因子(cytokines)”、“电解质”、“全长抗体”、“成长因子”、“激素”、“免疫调节剂”、“个体(individual)”或“个体(subject)”、“库”、“配位体”、“受体”、“微RNA”或“miRNA”、“多特异性抗体”、“纳米粒子”、“天然存在的”、“重组抗体”、“调节蛋白”、“小干扰RNA”或“siRNA”、“治疗蛋白”、“治疗有效量”、“肿瘤微环境”、“野生型”。

如本文所使用的术语“暴露在多肽的表面上的氨基酸残基”是指多肽的氨基酸残基，当多肽存在于液体(例如血液、人类血清、细胞质等)中时，所述氨基酸残基具有其与液体接触的侧链的至少一部分。可以通过X射线结晶学确定暴露在多肽的表面上的氨基酸残基。可以暴露在表面上的氨基酸残基还可以例如使用来自抗体的三维模型的坐标，使用例如InsightII程式(美国智能软件公司(Accelrys))的计算机程式来确定。可用于这类目的的其它软件包含例如SYBYL生物聚合物模块软件(Tripos联合公司(Tripos Associates))。当算法需要用户输入大小参数时，用于计算中的探针的“大小”可设定为约1.4埃

或小于半径。举例来说，用于使用个人计算机的软件来确定表面暴露的氨基酸残基及区域的方法已由Pacios(Pacios，计算化学杂志(Comput.Chem)，第18卷，第377-386页，1994；分子建模杂志(J.Mol.Model.)，第1卷，第46-53页，1995)描述。

术语“条件活性多肽”是指相比于亲本多肽在至少一个条件(例如异常条件)下更有活性及相比于亲本多肽在第二条件(例如正常生理条件)下活性较低的亲本多肽的变异体或突变体，或是指在至少一个条件(例如异常条件)下比在第二条件(例如正常生理条件)下更有活性的亲本多肽的变异体或突变体。在一个实施例中，条件活性多肽在第二异常条件下比在第一正常生理条件下更有活性至少1.3、或至少1.5、或至少2.0、或至少2.5、或至少3.0、或至少5.0、或至少10、或至少15、或至少20、或至少40、或至少60、或至少80或至少100倍。这种条件活性多肽可在身体的一或多个所选位置中表现出活性及/或在体内的另一个位置表现出增加或降低的活性。举例来说，在一个方面，条件活性多肽在体温下几乎无活性，但在低温下有活性。条件活性多肽包含条件活性蛋白质、蛋白质片段、抗体、抗体片段、酶、酶片段、受体及受体片段、细胞因子及其片段、激素及其片段、配位体及其片段、调节蛋白及其片段、生长因子及其片段，以及包含应力蛋白、穹窿相关蛋白、神经元蛋白、消化道蛋白、生长因子、粒线体蛋白质、胞浆蛋白、动物蛋白、结构蛋白、植物蛋白及这些蛋白质中的任一者的片段的蛋白质。本文所描述的条件活性多肽中的每一者优选地为条件活性生物多肽。

如本文所使用的多肽的术语“血浆中的半衰期的增加”或“血浆中的半衰期的延长”是指多肽在血浆中的滞留时间增加(血浆中的半衰期(t_1/2))，或血浆中清除率(CL)降低。这可表示为随时间推移的浓度曲线下面积(AUC)。

如本文所使用的多肽的术语“等电点”或“pI”是指多肽不携载净电荷的pH。多肽的pI可以实验方式来确定，或基于多肽的氨基酸序列来计算。举例来说，可通过多肽的等电聚焦电泳来确定pI，这为熟习所属领域者已知的。pI的理论计算值可基于多肽的氨基酸使用氨基酸序列分析软件(GENETYX等)来确定。

亲本多肽的术语“等电点变异体”或“pI变异体”是指与衍生突变多肽的亲本多肽相比具有降低pI的亲本多肽的突变多肽，所述突变多肽是经由用具有较低pI的氨基酸残基取代具有较高pI的氨基酸残基、使pI高于亲本多肽的pI的氨基酸残基缺失，或插入pI低于亲本多肽的pI的氨基酸残基而衍生。本发明延伸到条件活性pI变异体以及具有与亲本多肽相同pI的条件活性多肽两者。

如本文所使用的术语“亲本多肽”及“亲本蛋白”是指可进化以使用本文所描述的方法产生条件活性多肽的多肽或蛋白质。亲本多肽可为非天然存在的蛋白质。举例来说，治疗性多肽或蛋白质或突变体或变异体多肽可用作亲本多肽。亲本多肽的实例包含抗体、抗体片段、酶、酶片段、细胞因子及其片段、激素及其片段、配位体及其片段、受体及其片段、调节蛋白及其片段，及生长因子及其片段。

如本文所使用的术语“pH依赖性”是指在不同pH值下具有不同特性或活性的多肽。

如本文所使用的术语“多肽”是指氨基酸聚合物，其中氨基酸经由肽或双硫键连接在一起。多肽可为全长天然存在的氨基酸链或其片段、突变体或变异体，例如在结合交互作用中所关注的氨基酸链的所选区域。多肽还可为合成氨基酸链，或天然存在的氨基酸链或其片段与合成氨基酸链的组合。片段是指作为全长蛋白质的一部分的氨基酸序列，且通常长度将在约8与约500个氨基酸之间，优选地为约8到约300个氨基酸，更优选地约8到约200个氨基酸，且甚至更优选长度为约10到约50或100个氨基酸。另外，除天然存在的氨基酸以外的氨基酸(例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸及高精氨酸)可包含于多肽中。非基因编码的常见氨基酸也可包含于多肽中。氨基酸可为D-或L-光学异构体中的任一者。D-异构体优选地用于下文进一步所描述的特定上下文中。另外，其它肽模拟物也适用于例如多肽的连接序列中(参见Spatola，1983，在氨基酸、肽及蛋白质的化学及生物化学(Chemistry andBiochemistry of Amino Acids.Peptides and Proteins)中，Weinstein编，纽约马塞尔德克尔有限公司(Marcel Dekker，New York),第267页)。大体而言，除旨在包含包括通过共价或非共价键结而固持在一起的两个或若干多肽链的结构以外，术语“蛋白质”不旨在表达与术语“多肽”的任何显著差异。

术语“小分子”是指通常分子量低于900a.m.u.、或更优选低于500a.m.u.或更优选低于200a.m.u.或甚至更优选地低于100a.m.u.的分子。相同分子量范围适用于这些分析中所使用的离子。在本发明的分析及环境中，小分子或离子通常可以分子与分子的去质子化离子的混合物形式存在，其主要视分析或环境的pH而定。

具体实施方式

本发明提供一种用于自亲本多肽产生条件活性多肽的方法。所述方法包括以下步骤：(i)通过将一或多个突变引入到亲本多肽中来进化亲本多肽以产生pI等于或低于亲本多肽的pI的一或多个突变多肽；(ii)使一或多个突变多肽经受正常生理条件下的第一分析以测量一或多个突变多肽在正常生理条件下的活性，及使一或多个突变多肽经受异常条件下的第二分析以测量一或多个突变多肽在异常条件下的活性，其中正常生理条件及异常条件为相同条件但具有不同值；及(iii)从一或多个突变多肽中选择条件活性多肽，相比于在正常生理条件下于第一分析中的相同活性，所述条件活性多肽在异常条件下于第二分析中表现出增加的活性。

A.突变影响多肽的pI

亲本多肽可突变以产生具有与亲本多肽的pI相比相同或降低的pI的条件活性多肽。优选地，条件活性多肽将具有与亲本多肽的pI相比降低的pI。替代地，或同时，条件地活性多肽可具有低于7.4、或低于7.3、或低于7.2、或低于7.1或低于7.0的pI。这种条件活性多肽还将表现pH选择性，即在需要活性的pH下比在正常生理pH下具有更高活性，所述正常生理pH可在大于7.2到低于7.6的范围内。

可使用任何适合的突变诱发技术，包含氨基酸残基取代、缺失、插入及其组合。氨基酸残基取代用另一个氨基酸残基来置换亲本多肽中的天然氨基酸残基，所述另一个氨基酸残基的pI低于置换的天然氨基酸残基的氨基酸的pI。氨基酸的pI展示于表1中。尽管此表将氨基酸的pI展示为单个分子而非定位于多肽中的氨基酸残基，但当多肽的部分遵循表1中氨基酸的pI的趋势时氨基酸残基的pI的效应。因此，举例来说，用pI低于天然氨基酸的较高pI的氨基酸残基置换具有较高pI的天然残基氨基酸将降低多肽的pI。实际上，亲本多肽中的天然氨基酸残基可经pI低于天然氨基酸的pI的另一个氨基酸残基取代。举例来说，如果天然氨基酸残基为碱性氨基酸残基，那么其可经弱酸性氨基酸残基或强酸性氨基酸残基取代，以便降低多肽的pI。在另一实例中，如果天然氨基酸残基为弱酸性氨基酸残基，那么其可经强酸性氨基残基取代以降低多肽的pI。

表1.氨基酸的pI

在一些实施例中，两个或更多个氨基酸残基经取代到亲本多肽中以影响亲本多肽的pI。举例来说，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸残基取代可引入到亲本多肽中。在一些实施例中，各取代用具有较高pI的氨基酸残基来取代具有较低pI的氨基酸残基。在其它实施例中，仅一部分取代用具有较高pI的氨基酸残基来取代具有较低pI的氨基酸残基。在后者情况下，选择取代的组合使得多重取代的整体效应将保持突变多肽的pI与亲本多肽的pI相同，或为突变多肽提供比亲本多肽的pI更低的pI。

在一些实施例中，用于影响pI的氨基酸残基取代可为保守取代、非保守取代或其组合。

降低亲本多肽的pI的氨基酸残基缺失包含使具有比亲本多肽的pI更高的pI的氨基酸残基缺失。举例来说，当亲本多肽的pI为约7.2时，从亲本多肽中缺失任何一或多个碱性氨基酸残基将降低亲本多肽的pI。在一些实施例中，至少两个、三个、四个、五个或多于五个氨基酸残基从亲本多肽中缺失。在一些实施例中，各缺失使pI低于亲本多肽的pI的氨基酸残基缺失。在其它实施例中，仅一部分缺失使pI高于亲本多肽的pI的氨基酸残基缺失。在后者情况下，选择缺失的组合使得多重缺失的整体效应将保持或降低多肽的pI。

降低亲本多肽的pI的氨基酸残基插入包含插入pI低于亲本多肽的pI的氨基酸残基。举例来说，当亲本多肽的pI为约7.2时，将任何一或多个弱酸性氨基酸残基或强酸性氨基酸插入到亲本多肽中将导致亲本多肽的pI降低。在一些实施例中，至少两个、三个、四个、五个或多于五个氨基酸残基插入到亲本多肽中。在一些实施例中，各插入插入pI低于亲本多肽的pI的氨基酸残基。在其它实施例中，仅一部分插入插入pI低于亲本多肽的pI的氨基酸残基。在后者情况下，选择插入组合使得多重插入的整体效应将保持或降低多肽的pI。

在一些实施例中，上述氨基酸残基取代、氨基酸残基缺失及氨基酸残基插入中的两者或多于两者的组合用于影响亲本多肽的pI。举例来说，突变多肽可包含一或多个氨基酸残基取代及一或多个氨基酸残基缺失。在另一实例中，突变多肽可具有一或多个氨基酸残基取代及一或多个氨基酸残基插入。在又另一实例中，突变多肽可具有一或多个氨基酸残基缺失及一或多个氨基酸残基插入。在又其它实例中，突变多肽可皆具有一或多个氨基酸残基取代、一或多个氨基酸残基缺失及一或多个氨基酸残基插入。在各情况下，所有或仅一部分插入、取代及/或缺失可使用pI低于多肽的pI或将取代的氨基酸的pI的氨基酸残基。在各情况下，选择插入、取代及/或缺失的组合使得多重插入、取代及/或缺失的整体效应将保持或降低多肽的pI。

所需突变多肽将具有与亲本多肽的pI相同或低于其的pI。一些突变多肽将具有与亲本多肽的pI相同的pI。其它突变多肽可具有低于亲本多肽的pI至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.8、或至少1.0、或至少1.2、或至少1.4、或至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少2.5、或至少3.0、或至少3.5、或至少4.0、或至少5.0个单位的pI。

在一些实施例中，将取代的天然氨基酸残基、将缺失的氨基酸残基及/或插入氨基酸残基的位置暴露在亲本多肽的表面上。应理解，在经暴露氨基酸残基或位置的突变具有较低概率破坏亲本多肽的三维结构。

氨基酸残基取代、插入及缺失可在编码亲本多肽的核苷酸序列上例如通过定点突变诱发(Kunkel等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82:488-492(1985))或重叠延伸PCR来执行。当亲本多肽为抗体时，突变亦可通过抗体的亲和力成熟；或通过抗体重链或轻链的链改组；或通过使用噬菌体呈现库进行基于抗原淘选的选择(Smith等人，酶方法(Methods Enzymol.)217:228-257(1993))来达成。这些突变诱发方法可单独执行或以适当的组合执行。

在一些其它实施例中，除相对于亲本多肽的pI保持或降低pI的突变之外，突变多肽还可在除具有经引入以保持或降低pI的突变的位置以外的位置经受额外突变诱发。额外突变诱发可使用任何已知突变诱发方法，例如已在US2013/0116125中详细描述的综合位置进化、综合位置缺失、综合位置插入或其组合。

举例来说，亲本多肽可经突变以包含一或多个相对于亲本多肽的pI保持或降低pI的氨基酸残基取代。举例来说，突变多肽还可在除具有一或多个已经引入以降低多肽的pI的突变的位置以外的位置经受综合位置进化，包含例如综合位置取代、综合位置缺失及综合位置插入。

任何多肽的pI可通过等电聚焦凝胶电泳(例如毛细管等电聚焦凝胶电泳)或其它方法(参见例如描述于Righetti等人，生物化学分析方法(Methods Biochem.Anal.)54:379-409，2011；Friedman等人，酶方法(Methods Enzymol.)463:515-540，2009；Koshel等人，蛋白质组学(Proteomics)12:2918-2926，2012；Sommer等人，电泳法(Electrophoresis)30:742-757，2009；Shimura等人，电泳法(Electrophoresis)30:11-28，2009中的方法)而确定。此外，存在可基于其氨基酸序列来评估或计算多肽的pI的方法，例如描述于Ribeiro JM.Sillero A.，生物与医学计算机(Computers in Biology&Medicine)20(4):235-42，1990；Ribeiro J M.Sillero A.，生物与医学计算机21(3):131-41，1991；以及SilleroA.Ribeiro J M.，分析生物化学(Analytical Biochemistry)179(2):319-25，1989中的方法。

任何蛋白质(包含抗体、酶、激素、生长因子、细胞因子、调节蛋白、功能肽、生物类似物、免疫调节剂、治疗蛋白、受体及配位体)可用作本发明的亲本多肽。亲本多肽还可为以上蛋白质中的任一者的片段。举例来说，亲本多肽可为组织纤维蛋白溶酶原活化因子、链球菌激酶、尿激酶、肾素、玻尿酸酶、降血钙素基因相关肽(CGRP)、物质P(SP)、神经肽Y(NPY)、血管活性肠肽(VTP)、升压素或血管抑制素。另举例来说，亲本多肽可为应力蛋白、穹窿相关蛋白、神经元蛋白、消化道蛋白、生长因子、粒线体蛋白质、胞浆蛋白、动物蛋白、结构蛋白、植物蛋白或这些蛋白质中的任一者的片段。

在一个示范性实施例中，亲本多肽为抗体。亲本抗体可为治疗性抗体，或研发用于医疗用途的候选抗体。亲本抗体的实例包含利妥昔单抗(rituximab)(

IDEC/Genentech/Roche)(参见例如美国专利第5,736,137号)，一种经审批通过以治疗非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin′s lymphoma)的嵌合抗CD20抗体；HuMax-CD20，目前由Genmab所研发的抗CD20，描述于美国专利第5,500,362号中的抗CD20抗体；AME-133(应用分子进化(Applied Molecular Evolution))；hA20(免疫医学公司(Immunomedics,Inc.))；HumaLYM(Intracel)；及PRO70769(PCT/US2003/040426，名称为“免疫球蛋白变体及其用途(Immunoglobulin Variants and Uses Thereof)”)。多种靶向表皮生长因子受体家族成员的抗体(包含EGFR(ErbB-1)、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4))可得益于本发明的pI工程化恒定区。举例来说，本发明的pI工程化恒定区可用于大体上类似于以下的抗体中：曲妥珠单抗(trastuzumab)(

Genentech)(参见例如美国专利第5,677,171号)，一种经审批通过以治疗乳癌的人源化抗Her2/neu抗体；帕妥珠单抗(pertuzumab)(rhuMab-2C4，Omnitarg^TM)，目前由基因技术公司(Genentech)研发；抗HER2抗体，其描述于美国专利第4,753,894号中；西妥昔单抗(cetuximab)(

Imclone)(美国专利第4,943,533号；PCT WO 96/40210)，一种用于多种癌症的临床试验中的嵌合抗EGFR抗体；ABX-EGF(美国专利第6,235,883号)，目前由安根尼克斯公司-印木内克斯公司-安进公司(Abgenix-Immunex-Amgen)研发；HuMax-EGFR(美国专利申请案第10/172,317号)，目前由Genmab研发；425、EMD55900、EMD62000及EMD72000(Merck KGaA)(美国专利第5,558,864号；Murthy等人1987，生物化学与生物物理学研究(Arch Biochem Biophys.)252(2):549-60；Rodeck等人，1987，细胞生物化学杂志(J Cell Biochem.)35(4):315-20；Kettleborough等人，1991，蛋白质工程化(Protein Eng.)4(7):773-83)；ICR62(癌症研究协会(Instituteof Cancer Research))(PCT WO 95/20045；Modjtahedi等人，1993，分子生物物理学杂志(J.Cell Biophys.)1993，22(1-3):129-46；Modjtahedi等人，1993，英国癌症杂志(Br JCancer.)1993，67(2):247-53；Modjtahedi等人，1996，英国癌症杂志，73(2):228-35；Modjtahedi等人，2003，国际癌症杂志(Int J Cancer)，105(2):273-80)；TheraCIM hR3(加拿大YM生物技术(YM Biosciences，Canada)及古巴免疫分子中心(Centro de ImmunologiaMolecular，Cuba))(美国专利第5,891,996号；美国专利第6,506,883号；Mateo等人，1997，免疫技术学(Immunotechnology)，3(1):71-81)；mAb-806(路德维格癌症研究所(LudwigInstitute for Cancer Research)，Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth等人2003，美国国家科学院院刊.100(2):639-44)；KSB-102(KS Biomedix)；MR1-1(WAX，美国国家癌症研究所(National Cancer Institute))(PCT WO 0162931A2)；以及SC100(Scancell)(PCT WO01/88138)中。在另一优选实施例中，本发明的pI工程化的恒定区可用于阿仑单抗(alemtuzumab)(

Millenium)，一种目前批准用于治疗B细胞慢性淋巴球性白血病的人源化单株抗体。本发明的工程化的恒定区可用于大体上类似于其它临床产物及候选物的多种抗体，所述抗体包含但不限于莫罗莫那-CD3(muromonab-CD3)(Orthoclone

)，由Ortho生物技术公司/强生公司(Ortho Biotech/Johnson&Johnson)研发的抗CD3抗体；替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)

由IDEC/Schering AG研发的抗CD20抗体；吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)

由Celltech/Wyeth研发的抗CD33(p67蛋白质)抗体；阿法赛特(alefacept)

由Biogen研发的抗LFA-3Fc融合物；阿昔单抗(abciximab)

由森托科/礼来公司(Centocor/Lilly)研发；巴利昔单抗(basiliximab)

由诺华(Novartis)研发；帕利珠单抗(palivizumab)

由MedImmune研发；英利昔单抗(infliximab)

由森托科(Centocor)研发的抗TNFα抗体；阿达木单抗(adalimumab)

由雅培(Abbott)，Humicade^TM研发的抗TNFα抗体，由Celltech研发的抗TNFα抗体；依那西普(etanercept)

由印木内克斯公司/安进公司(Immunex/Amgen)研发的抗TNFαFc融合物；ABX-CBL，由安根尼克斯公司(Abgenix)研发的抗CD147抗体；ABX-IL8，由安根尼克斯公司(Abgenix)研发的抗IL8抗体；ABX-MA1，由安根尼克斯公司(Abgenix)研发的抗MUC18抗体；潘妥莫单抗(Pemtumomab)(R1549，90Y-muHMFG1)，由Antisoma研发的抗MUC1；Therex(R1550)，由Antisoma研发的抗MUC1抗体；AngioMab(AS1405)，由Antisoma所研发；HuBC-1，由Antisoma所研发；Thioplatin(AS1407)，由Antisoma所研发；

(那他珠单抗(natalizumab))，由Biogen研发的抗α-4-β-1(VLA-4)及α-4-β-7抗体；VLA-1mAb，由Biogen研发的抗VLA-1整联蛋白抗体；LTBR mAb，由Biogen研发的抗淋巴毒素β受体(LTBR)抗体；CAT-152，由剑桥抗体技术(Cambridge Antibody Technology)研发的抗TGF-132抗体；J695，由剑桥抗体技术(Cambridge Antibody Technology)及雅培(Abbott)研发的抗IL-12抗体；CAT-192，由剑桥抗体技术(Cambridge Antibody Technology)及美国健赞公司(Genzyme)研发的抗TGFβ1抗体；CAT-213，由剑桥抗体技术(Cambridge AntibodyTechnology)研发的抗Eotaxin1抗体；LymphoStat-B^TM，由剑桥抗体技术(CambridgeAntibody Technology)及人类基因组科技技术公司(Human Genome Sciences Inc.)研发的抗Blys抗体；TRAIL-R1mAb，由剑桥抗体技术(Cambridge Antibody Technology)及人类基因组科技技术公司(Human Genome Sciences,Inc.)研发的抗TRAIL-R1抗体；Avastin^TM(贝伐单抗(bevacizumab)，rhuMAb-VEGF)，由基因技术(Genentech)研发的抗VEGF抗体，由基因技术(Genentech)研发的抗HER受体家族抗体；抗组织因子(ATF)，由基因技术(Genentech)研发的抗组织因子抗体；Xolair^TM(奥马珠单抗(Omalizumab))，由基因技术(Genentech)研发的抗IgE抗体；Raptiva^TM(艾法珠单抗(Efalizumab))，由基因技术(Genentech)及Xoma研发的抗CD11a抗体；MLN-02抗体(先前LDP-02)，由基因技术(Genentech)及美国千禧制药公司(Millenium Pharmaceuticals)研发；HuMax CD4，由Genmab研发的抗CD4抗体；HuMax-IL15，由Genmab及安进公司(Amgen)研发的抗IL15抗体；HuMax-Inflam，由Genmab及Medarex研发；HuMax-癌症，由Genmab及Medarex及OxfordGcoSciences研发的抗肝素酶I抗体；HuMax-淋巴瘤，由Genmab及安进公司(Amgen)研发；HuMax-TAC，由Genmab研发；IDEC-131及由艾迪制药公司(IDEC Pharmaceuticals)研发的抗CD40L抗体；IDEC-151(克立昔单抗(Clenoliximab))，由艾迪制药公司(IDECPharmaceuticals)研发的抗CD4抗体；IDEC-114，由艾迪制药公司(IDEC Pharmaceuticals)研发的抗CD80抗体；IDEC-152，由艾迪制药公司(IDEC Pharmaceuticals)研发的抗CD23，由艾迪制药公司(IDEC Pharmaceuticals)研发的抗巨噬细胞移转因子(MIF)抗体；BEC2，由Imclone研发的抗个体基因型抗体；IMC-1C11，由Imclone研发的抗KDR抗体；DC101，由Imclone研发的抗flk-1抗体，由Imclone研发的抗VE钙黏素抗体；CEA-Cide^TM(拉贝珠单抗(labetuzumab))，由免疫医学公司(Immunomedics)研发的抗癌胚抗原(CEA)抗体；LymphoCide^TM(依帕珠单抗(Epratuzumab))，由免疫医学公司(Immunomedics)研发的抗CD22抗体；AFP-Cide，由免疫医学公司(Immunomedics)研发；MyelomaCide，由免疫医学公司(Immunomedics)研发；LkoCide，由免疫医学公司(Immunomedics)研发；ProstaCide，由免疫医学公司(Immunomedics)研发；MDX-010，由美达雷克斯Medarex研发的抗CTLA4抗体；MDX-060，由美达雷克斯(Medarex)研发的抗CD30抗体；MDX-070，由美达雷克斯(Medarex)研发；MDX-018，由美达雷克斯(Medarex)研发；Osidem^TM(IDM-1)及由美达雷克斯(Medarex)及免疫设计分子技术公司(Immuno-Designed Molecules)研发的抗Her2抗体；HuMax^TM-CD4，由美达雷克斯(Medarex)及Genmab研发的抗CD4抗体；HuMax-IL15，由美达雷克斯(Medarex)及Genmab研发的抗IL15抗体；CNTO 148，由美达雷克斯(Medarex)及森托科/强生公司(Centocor/J&J)研发的抗TNFα抗体；CNTO 1275，由森托科/强生公司(Centocor/J&J)研发的抗细胞因子抗体；MOR101及MOR102，由MorphoSys研发的抗细胞间黏附分子1(ICAM-1)(CD54)抗体；MOR201，由MorphoSys研发的抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体；

(维西珠单抗(visilizumab))，由蛋白质设计实验室(Protein Design Labs)研发的抗CD3抗体；HuZAF^TM，由蛋白质设计实验室(Protein Design Labs)研发的抗γ干扰素抗体；抗α5β1整联蛋白，由蛋白质设计实验室(Protein Design Labs)研发；抗IL-12，由蛋白质设计实验室(Protein Design Labs)研发；ING-1，由Xoma研发的抗Ep-CAM抗体；及MLN01，由Xoma研发的抗β2整联蛋白抗体；pI-ADC抗体，由西雅图基因技术公司(SeattleGenetics)研发，此段落中所有以上所引用的文献明确地以引用的方式并入本文中。

亲本抗体可为全长抗体、抗体片段、单链抗体、Fab或Fc域。亲本抗体可为IgG抗体。在若干同型抗体中，IgG抗体具有足够较大分子量，且因此其主要代谢路径不经由肾排泄。已知IgG抗体通过FcRn经由补救路径再循环，且因此具有较长的活体内半衰期。IgG抗体经假定为主要经由内皮细胞中的代谢路径而代谢(He等人，免疫学杂志(J.Immunol.)，第160卷，第1029-1035页，1998)。具体地说，咸信当非特异性地将IgG抗体吸收到内皮细胞中时，IgG抗体通过结合到FcRn再循环，同时降解未结合到FcRn的IgG抗体。如例如WO2007/114319及WO2009/041643中所描述，IgG抗体的血浆半衰期与其pI反相关。

在IgG抗体中，亲本抗体可为IgG1抗体，由于多种原因(包含高效应功能)，所述抗体为治疗性抗体的常见同型。然而，IgG1的重恒定区的pI高于IgG2的pI(8.10对比7.31)。通过在特定位置利用氨基酸残基取代将一些IgG2氨基酸残基引入到IgG1主链中，所得IgG1的pI降低，且另外相比于亲本IgG1抗体在血浆中表现出更长的半衰期。举例来说，IgG1具有在位置137的甘氨酸，且IgG2具有在相同位置的谷氨酸(强酸性氨基酸)。用谷氨酸取代IgG1的位置137的甘氨酸将降低突变IgG1抗体的pI，其将延长IgG1抗体的半衰期。

在一些实施例中，本文所描述的用于相对于亲本多肽的pI保持或降低pI的突变或突变组合中的一或多者位于抗体重链、抗体轻链中或位于抗体重链及抗体轻链两者中。

B.抗体重链中的突变

在一些实施例中，本文所描述的出于保持或降低多肽的pI的目的的突变或突变组合至少在IgG抗体的重链的CH1区域中进行。在这些实施例中，突变可独立地选自在CH1区的位置119、131、133、137、138、164、192、193、196、199、203、205、208、210、214、217及219的突变及在这些位置的任何突变组合。突变可以通过在这些17个位置中的一者或这些17个位置的所有可能组合及亚组合上的取代、缺失或插入来引入。举例来说，突变型抗体可以在这些17个位置中的一或多者具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个CH1取代。因此，CH1区中的任何单个突变或突变组合为可能的。此外，CH1区中的一或多个突变可任选地与CH2、CH3、铰链及LC区中的任一者中的一或多个其它突变或突变组合合并。在此情况下，CH1、CH2、CH3、铰链及LC区中的突变组合可选择以相对于亲本抗体的pI降低突变型抗体的pI。

可降低重链的pI的适用取代包含在IgG抗体重链的CH1区中的位置121、124、129、132、134、126、152、155、157、159、101、161、162、165、176、177、178、190、191、194、195、197、212、216及218中的一或多个位置的天冬氨酸或谷氨酸残基的取代。

抗体重链的CH1区中的特定取代可包含(但不限于)位置119的非天然谷氨酸；位置131的非天然半胱氨酸；位置133的非天然精氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺；位置137的非天然谷氨酸；位置138的非天然丝氨酸；位置164的非天然谷氨酸；位置192的非天然天冬酰胺；位置193的非天然苯丙氨酸；位置196的非天然赖氨酸；位置199的非天然苏氨酸；位置203的非天然天冬氨酸；位置205的非天然谷氨酸或谷氨酰胺；位置208的非天然天冬氨酸；位置210的非天然谷氨酸或谷氨酰胺；位置214的非天然苏氨酸；位置217的非天然精氨酸及位置219的非天然半胱氨酸及其任何组合。

在一些实施例中，突变在抗体重链的铰链区中进行，所述铰链区包含在位置221、222、223、224、225、233、234、235及236处。具体地说，1、2、3、4或5个突变及尤其1、2、3、4或5个取代可在位置221到225进行。此外，涵盖单独或与其它区域中的其它突变一起的所有可能组合。

抗体重链的铰链区中的特定突变可包含(但不限于)位置221的缺失、位置222的非天然缬氨酸或苏氨酸、位置223的缺失、位置224的非天然谷氨酸、位置225的缺失、位置235的缺失、位置236的缺失或非天然丙氨酸及其任何组合。在一些情况下，仅一或多个这些突变经引入于抗体重链的铰链区中，且在其它实施例中，这些突变中的一或多者与亲本抗体的其它区中的突变中的一或多者以任何组合合并。

在一些实施例中，突变可在抗体重链的CH2区中进行，所述CH区包含在位置274、296、300、309、320、322、326、327、334及339处。具体地说，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变可在抗体重链的CH2区的这些10个位置中以任何组合进行。

抗体重链的CH2区中的特定取代可包含(但不限于)位置274的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置296的非天然苯丙氨酸、位置300的非天然苯丙氨酸、位置309的非天然缬氨酸、位置320的非天然谷氨酸、位置322的非天然谷氨酸、位置326的非天然谷氨酸、位置327的非天然甘氨酸、位置334的非天然谷氨酸、位置339的非天然苏氨酸及这些取代的任何组合，以及与其它抗体区中的一或多个其它突变组合。

突变可独立地选自在抗体重链的CH3区的位置355、359、362、384、389、392、397、418、419、444及447的突变。突变型抗体可以任何组合在CH3区中的这些位置具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变。另外，如本文所描述，CH3区中的任何一或多个突变可与抗体的CH2、CH1、铰链及LC区中的一或多个其它突变合并。

抗体重链的CH3区中的特定取代可包含(但不限于)位置355的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置384的非天然丝氨酸、位置392的非天然天冬酰胺或谷氨酸、位置397的非天然甲硫氨酸、位置419的非天然谷氨酸、位置359的非天然谷氨酸、位置362的非天然谷氨酸、位置389的非天然谷氨酸、位置418的非天然谷氨酸、位置444的非天然谷氨酸及位置447的非天然天冬氨酸以及这些取代中的两者或多于两者的任何组合。

因此，可进行以下抗体重链缺失或取代的所有可能，其中各突变任选地包含或排除：位置119的非天然谷氨酸；位置131的非天然半胱氨酸；位置133的非天然精氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺；位置137的非天然谷氨酸；位置138的非天然丝氨酸；位置164的非天然谷氨酸；位置192的非天然天冬酰胺位置193的非天然苯丙氨酸；位置196的非天然赖氨酸；位置199的非天然苏氨酸；位置203的非天然天冬氨酸；位置205的非天然谷氨酸或谷氨酰胺；位置208的非天然天冬氨酸；位置210的非天然谷氨酸或谷氨酰胺；位置214的非天然苏氨酸；位置217的非天然精氨酸及位置219的非天然半胱氨酸；位置221的缺失；位置222的非天然缬氨酸或苏氨酸；位置223的缺失；位置224的非天然谷氨酸；位置225的缺失；位置235的缺失；位置221的缺失；位置222的非天然缬氨酸或苏氨酸；位置223的缺失；位置224的非天然谷氨酸；位置225的缺失及位置235的缺失；位置274的非天然谷氨酰胺或谷氨酸；位置296的非天然苯丙氨酸；位置300的非天然苯丙氨酸；位置309的非天然缬氨酸；位置320的非天然谷氨酸；位置322的非天然谷氨酸；位置326的非天然谷氨酸；位置327的非天然甘氨酸；位置334的非天然谷氨酸；位置339的非天然苏氨酸；位置355的非天然谷氨酰胺或谷氨酸；位置384的非天然丝氨酸；位置392的非天然天冬酰胺或谷氨酸；位置397的非天然甲硫氨酸；位置419的非天然谷氨酸；位置359的非天然谷氨酸；位置362的非天然谷氨酸；位置389的非天然谷氨酸；位置418的非天然谷氨酸；位置444的非天然谷氨酸及位置447的非天然天冬氨酸。

C.抗体轻链中的突变

在一些实施例中，突变可在IgG抗体的轻链中。突变可位于独立地选自轻链的位置126、145、152、156、169、199、202及207的位置处。抗体可在任何组合中的这些位置处的轻链中具有1、2、3、4、5、6、7或8个突变。另外，任何单个或轻链突变的组合可与上述抗体重链突变中的任一者或多者合并。

抗体轻链中的特定取代可包含(但不限于)位置126的非天然谷氨酰胺或谷氨酸；位置145的非天然谷氨酰胺、谷氨酸或苏氨酸；位置152的非天然天冬氨酸；位置156的非天然谷氨酸；位置169的非天然谷氨酰胺或谷氨酸；位置199的非天然谷氨酸；位置202的非天然谷氨酸及位置207的非天然谷氨酸。

D.重链及轻链突变

在一些实施例中，突变型抗体可具有如上文所描述的在重链及轻链两者中的突变。在一些实施例中，突变型抗体可具有仅在重链中的突变，在此情况下突变型抗体将具有亲本抗体的轻链。在一些实施例中，突变型抗体可具有仅在轻链中的突变，在此情况下突变型抗体将具有亲本抗体的重链。

因此，可进行以下突变在抗体重链及轻链中的任何可能组合，其中各突变任选地包含或排除：a)重链：位置119的非天然谷氨酸；位置131的非天然半胱氨酸；位置133的非天然精氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺；位置137的非天然谷氨酸；位置138的非天然丝氨酸；位置164的非天然谷氨酸；位置192的非天然天冬酰胺；位置193的非天然苯丙氨酸；位置196的非天然赖氨酸；位置199的非天然苏氨酸；位置203的非天然天冬氨酸；位置205的非天然谷氨酸或谷氨酰胺；位置208的非天然天冬氨酸；位置210的非天然谷氨酸或谷氨酰胺；位置214的非天然苏氨酸；位置217的非天然精氨酸及位置219的非天然半胱氨酸；位置221的缺失；位置222的非天然缬氨酸或苏氨酸；位置223的缺失；位置224的非天然谷氨酸；位置225的缺失；位置235的缺失；位置221的缺失；位置222的非天然缬氨酸或苏氨酸；位置223的缺失；位置224的非天然谷氨酸；位置225的缺失及位置235的缺失；位置274的非天然谷氨酰胺或谷氨酸；位置296的非天然苯丙氨酸；位置300的非天然苯丙氨酸；位置309的非天然缬氨酸；位置320的非天然谷氨酸；位置322的非天然谷氨酸；位置326的非天然谷氨酸；位置327的非天然甘氨酸；位置334的非天然谷氨酸；位置339的非天然苏氨酸；位置355的非天然谷氨酰胺或谷氨酸；位置384的非天然丝氨酸；位置392的非天然天冬酰胺或谷氨酸；位置397的非天然甲硫氨酸；位置419的非天然谷氨酸；位置359的非天然谷氨酸；位置362的非天然谷氨酸；位置389的非天然谷氨酸；位置418的非天然谷氨酸；位置444的非天然谷氨酸及位置447的缺失或非天然天冬氨酸；以及轻链：b)位置126的非天然谷氨酰胺或谷氨酸；位置145的非天然谷氨酰胺、谷氨酸或苏氨酸；位置152的非天然天冬氨酸；位置156的非天然谷氨酸；位置169的非天然谷氨酰胺或谷氨酸；位置199的非天然谷氨酸；位置202的非天然谷氨酸及位置207的非天然谷氨酸。

E.抗体的恒定区中的突变

在一些实施例中，一或多个突变可位于抗体(例如IgG抗体)的重链恒定区、轻链恒定区或两者中。举例来说，在抗体的重链恒定区及/或轻链恒定区中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变。

相比于亲本抗体的pI，重链恒定区及/或轻链恒定区中的突变可足以降低亲本抗体的pI至少0.2、0.4、0.6、08、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0个单位。

F.亲本抗体的可变区

在一些实施例中，一或多个突变位于抗体(例如IgG抗体)的重链可变区、轻链可变区或两者中。在一个实施例中，突变位于互补决定区(CDR)中的一或多者(例如CDR1、CDR2及CDR3中的一或多者)及/或构架区(FR)，例如抗体的重链及/或轻链的FR1、FR2、FR3及FR4中的一或多者。将突变引入到可变区中可提供相比于恒定区中的突变的优势，因为恒定区中的突变可潜在地导致免疫原性增加。

在一个实例中，经定位的突变位于可变区内未由抗原结合掩盖的位置。未由抗原结合掩盖的位置为仍暴露在抗原结合抗体的表面上的位置。或者，可在不会大体上干扰抗原结合的位置进行突变。

用于识别CDR及FR的方法为已知的(Kabat等人，免疫相关蛋白的序列(Sequenceof Proteins of Immunological Interest)(1987)，美国国家卫生研究所(NationalInstitute of Health)，马里兰贝塞斯达(Bethesda,Md.)；Chothia等人；自然(Nature)，第342卷，第877页，1989)。FR中的可修饰氨基酸残基包含经由非共价键直接键结到抗原的残基(Amit等人，科学(Science)，233:747-53，1986)，对CDR结构有一些影响或效应的残基(Chothia等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，196:901-917，1987)，及涉及重链可变区与轻链可变区之间的交互作用的残基(专利公开案EP 239400A1)。

上文所描述的突变诱发方法产生一或多个突变多肽的集合。这些突变多肽的pI可等于或低于亲本多肽的pI。可使用上文所描述的各种突变诱发方法产生的一些突变多肽的pI可等于或大于亲本多肽的pI。这可以通过例如由综合位置进化、综合位置缺失、综合位置插入或其组合引入的额外突变所引起，这可以克服出于保持或降低pI的目的而引入的突变的效应。出于此原因，在一些实施例中，本发明确定特定突变多肽或至少大部分突变多肽的pI低于亲本多肽的pI。这可以通过等电聚焦凝胶电泳来实现，所述电聚焦凝胶电泳表明大部分突变多肽聚焦于pH低于亲本多肽的pI的区域。举例来说，至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少98％的突变多肽的pI可低于亲本多肽的pI。

在一些实施例中，本发明任选地过滤突变多肽以排除pI等于或高于亲本多肽的pI的突变多肽中的一些或全部。这些突变多肽的过滤还可以通过等电聚焦凝胶电泳来实现，借此聚焦于pH低于亲本多肽的pI的区域的突变多肽可经收集且用于进一步处理。聚焦于pH等于或高于亲本多肽的pI的区域的突变多肽可经排除。

G.筛选条件活性多肽

筛选突变多肽的条件活性。以此方式，可识别相比于亲本多肽具有条件活性及较低pI的多肽。此为期望的特征组合，尤其对于例如治疗性抗体的抗体。

用于选择条件活性多肽的筛选突变多肽的方法已描述于WO 2017/078839中。条件活性多肽可以通过以下来选择：相比于同一突变多肽在相对应正常生理条件下的相同活性，筛选在从正常生理条件偏离的异常条件下的增加活性，且任选地，

(a)相比于在相同异常条件下的亲本多肽的相同活性，筛选在从正常生理条件偏离的异常条件下的增加活性，

(b)与在相同正常生理条件下的亲本多肽的相同活性相比，筛选在正常生理条件下的降低活性，或

(c)上文(a)及(b)的组合。

条件活性多肽可具有选择性，即在异常条件下的活性与在正常生理条件下的活性的比率为至少约1.3、或至少约1.5、或至少约1.7、或至少约2.0、或至少约3.0、或至少约4.0、或至少约6.0、或至少约8.0、或至少约10.0、或至少约20.0、或至少约40.0、或至少约60.0或至少约100.0。

异常条件及正常生理条件为相同条件的不同值。举例来说，异常及正常生理条件可为两种不同温度或两种不同pH值。条件可选自温度、pH、渗透压、渗透压度、氧化应激、电解质浓度以及两个或大于两个此类条件的组合。

举例来说，温度的正常生理条件可为37.0℃的正常人体温度，而温度的异常条件可为不同于温度37.0℃的温度，例如肿瘤微环境中的温度可高于正常生理温度1到2℃。在另一实例中，正常生理条件可为在肿瘤微环境中可发现的7.2到7.8或7.2到7.6范围内的正常人类生理pH及例如5.5到7.2、6到7或6.2到6.8范围内的异常pH。

在正常生理条件及异常条件两者下的分析可在分析培养基中执行。分析培养基可为可含有例如缓冲液以及其它组分的溶液。可用于分析培养基中的常见缓冲液包含柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸钠)、磷酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂(例如Krebs缓冲液)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液、汉克氏缓冲液(Hank′s buffer)、Tris缓冲液、HEPES缓冲液等。可使用适用于分析的熟习所属领域者已知的其它缓冲液。这些缓冲液可用于模拟人类或动物体液(例如血浆或淋巴液)的组合物的特征或组分。

适用于本发明的方法的分析溶液可含有至少一种选自无机化合物、离子及有机分子的组分，优选为通常发现于例如人类或动物的哺乳动物的体液中的组分。这类组分的实例包含营养组分及代谢物，以及可在体液中发现的任何其它组分。本发明设想此组分可为或可不为缓冲液系统的部分。举例来说，分析溶液可为添加碳酸氢盐的PBS缓冲液，其中碳酸氢盐不为PBS缓冲液的部分。或者，碳酸氢盐为Krebs缓冲液中的组分。

组分可以大体上相同的浓度存在于两种分析溶液中(对于第一及第二条件)，而两种分析溶液在例如pH、温度、电解质浓度或渗透压的其它方面不同。因此，组分用作常量，而非第一及第二条件的两种条件，或对应地正常生理条件与异常条件之间的差。

在一些实施例中，组分以接近或相同于哺乳动物(尤其在人体内)的组分的正常生理浓度的浓度存在于两种分析溶液中。

无机化合物或离子可选自以下中的一或多者：硼酸；氯化钙；硝酸钙；磷酸二铵；硫酸镁；磷酸一铵；磷酸一钾；氯化钾；硫酸钾；硫酸铜；硫酸铁；硫酸锰；硫酸锌；硫酸镁；硝酸钙；钙、铜、铁、锰及锌的螯合物；钼酸铵；硫酸铵；碳酸钙；磷酸镁；二硫化钠；二硫化钾；碳酸氢钠；碳酸氢钾；硝酸钾；盐酸；二氧化碳；硫酸；磷酸；碳酸；尿酸；氯化氢；尿素；磷离子；硫离子；氯离子；镁离子；钠离子；钾离子；铵离子；铁离子；锌离子及铜离子。

无机化合物中的一些的正常生理浓度的实例包含：2到7.0mg/dL浓度范围内的尿酸、8.2到11.6mg/dL浓度范围内的钙离子、355到381mg/dL浓度范围内的氯离子、0.028到0.210mg/dL浓度范围内的铁离子、12.1到25.4mg/dL浓度范围内的钾离子、300到330mg/dL浓度范围内的钠离子、15到30mM浓度范围内的碳酸、约80μM的柠檬酸根离子、0.05到2.6mM范围内的组氨酸离子、0.3到1μM范围内的组胺、1到20μM范围内的HAPT离子(氢化三磷酸腺苷)及1到20μM范围内的HADP离子。

在一些实施例中，存在于第一条件及第二条件两者下或对应正常生理条件及异常条件下的分析溶液中的离子选自氢氧根离子、卤素离子(氯、溴、碘)、卤氧根离子、硫酸根离子、镁离子、钙离子、硫酸氢根离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、磺酸根离子、卤氧根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、过硫酸根离子、单过氧硫酸根离子、硼酸根离子、铵离子或有机离子，例如羧酸根离子、酚盐离子、磺酸根离子(例如甲基硫酸盐的有机硫酸盐)、钒酸根离子、钨酸根离子、硼酸根离子、有机硼酸根离子、柠檬酸根离子、草酸根离子、乙酸根离子、五硼酸根离子、组氨酸根离子及酚盐离子。

存在于第一条件及第二条件两者下或对应正常生理条件及异常条件的分析溶液中的有机化合物可选自例如氨基酸及其混合物，所述氨基酸例如组氨酸、丙氨酸、异白氨酸、精氨酸、白氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、吡咯赖氨酸、脯氨酸、硒半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸。

氨基酸中的一些的正常生理浓度的实例包含：3.97±0.70mg/dL的丙氨酸、2.34±0.62mg/dL的精氨酸、3.41±1.39mg/dL的谷氨酸、5.78±1.55mg/dL的谷氨酰胺、1.77±0.26mg/dL的甘氨酸、1.42±0.18mg/dL的组氨酸、1.60±0.31mg/dL的异白氨酸、1.91±0.34mg/dL的白氨酸、2.95±0.42mg/dL的赖氨酸、0.85±0.46mg/dL的甲硫氨酸、1.38±0.32mg/dL的苯丙氨酸、2.02±6.45mg/dL的苏氨酸、1.08±0.21mg/dL的色氨酸、1.48±0.37mg/dL的酪氨酸及2.83±0.34mg/dL的缬氨酸。

存在于第一条件及第二条件两者下或对应正常生理条件及异常条件下的分析溶液中的有机化合物可选自非蛋白质含氮化合物，例如肌酸、肌酸酐、胍基乙酸、尿酸、尿囊素、腺苷、尿素、氨及胆碱。这些化合物中的一些的正常生理浓度的实例包含：1.07±0.76mg/dL的肌酸、0.9到1.65mg/dL的肌酸酐、0.26±0.24mg/dL的胍基乙酸、4.0±2.9mg/dL的尿酸、0.3到0.6mg/dL的尿囊素、1.09±0.385mg/dL的腺苷、27.1±4.5mg/dL的尿素及0.3到1.5mg/dL的胆碱。

存在于正常生理条件及异常条件下的分析溶液中的有机化合物可选自有机酸，例如柠檬酸、α-酮基戊二酸、琥珀酸、苹果酸、反丁烯二酸、乙酰乙酸、β-羟基丁酸、乳酸、丙酮酸、α-酮酸、乙酸及易失性脂肪酸。这些有机酸中的一些的正常生理浓度的实例包含：2.5±1.9mg/dL的柠檬酸、0.8mg/dL的α-酮基戊二酸、0.5mg/dL的琥珀酸、0.46±0.24mg/dL的苹果酸、0.8到2.8mg/dL的乙酰乙酸、0.5±0.3mg/dL的羟基丁酸、8到17mg/dL的乳酸、1.0±0.77mg/dL的丙酮酸、0.6到2.1mg/dL的α-酮酸、1.8mg/dL的易失性脂肪酸。

存在于正常生理条件及异常条件两者下的分析溶液中的有机化合物可选自糖(碳水化合物)以及双醣，所述糖例如葡萄糖、己醣、木糖、核糖、甘露糖及半乳糖，所述双醣包含乳糖、GlcNAcβ1-3Gal、Galα1-4Gal、Manα1-2Man、GalNAcβ1-3Gal及O-、N-、C-或S-醣苷。这些糖中的一些的正常生理浓度的实例包含：83±4mg/dL的葡萄糖、102±73mg/dL的多醣(如己醣)、77±63mg/dL的葡糖胺、0.4到1.4mg/dL的己醣醛酸(如葡糖醛酸)及2.55±0.37mg/dL的戊糖。

存在于正常生理条件及异常条件两者下的分析溶液中的有机化合物可选自脂肪或其衍生物，例如胆固醇、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂及胆酸。这些化合物中的一些的正常生理浓度的实例包含：40到70mg/dL的游离胆固醇、100到200mg/dL的卵磷脂、0到30mg/dL的脑磷脂、10到30mg/dL的鞘磷脂及02.到0.3mg/dL的胆汁酸(作为胆酸)。

存在于正常生理条件及异常条件两者下的分析溶液中的有机化合物可选自蛋白质，例如血纤维蛋白原、抗血友病球蛋白、免疫γ球蛋白、免疫优球蛋白、同种凝集素、β假球蛋白、醣蛋白、脂蛋白及白蛋白。举例来说，哺乳动物血清白蛋白的正常生理浓度为3.5到5.0g/dL。在一个实施例中，白蛋白为牛血清白蛋白。

存在于正常生理条件及异常条件两者下的分析溶液中的有机化合物可选自维生素，例如维生素A、胡萝卜素、维生素E、抗坏血酸、硫胺素、肌醇、叶酸、生物素、泛酸、核黄素。这些维生素中的一些的正常生理浓度的实例包含：0.019到0.036mg/dL的维生素A、0.90到1.59mg/dL的维生素E、0.42到0.76mg/dL的肌醇、0.00162到0.00195mg/dL的叶酸及0.00095到0.00166mg/dL的生物素。

分析溶液(在正常生理条件及异常条件下的两种分析液)中的无机化合物、离子或有机分子的浓度可在人类或动物血清中的无机化合物、离子或有机分子的生理浓度的正常范围内。然而，还可以使用正常生理范围之外的浓度。举例来说，人类血清中的镁离子的正常范围为1.7到2.2mg/dL，且钙为8.5到10.2mg/dL。分析溶液中的镁离子的浓度可为约0.17mg/dL到约11mg/dL。分析溶液中的钙离子浓度可为约0.85mg/dL到约51mg/dL。一般情况下，分析溶液中的无机化合物、离子或有机分子的浓度可低至人类血清中的无机化合物、离子或有机分子的正常生理浓度的5％、或10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％，或高至人类血清中的无机化合物、离子或有机分子的正常生理浓度的1.5倍、或2倍、或3倍、或4倍或5倍、或7倍或9倍或10倍亦或20倍。分析溶液的不同组分可以相对于其各别正常生理浓度的不同浓度水准使用。

在正常生理条件及异常条件下的分析用于测量突变多肽的活性。在分析期间，突变多肽及其结合配偶体皆存在于分析溶液中。突变多肽与其结合配偶体之间的关系可为例如抗体-抗原、配位体-受体、酶-受质或激素-受体。为了使突变多肽表现其活性，突变多肽应能够与其结合配偶体接触及结合。随后表现出突变多肽在其结合配偶体上的活性且在突变多肽与其结合配偶体结合之后测量。

在一些实施例中，用于分析中的离子可在经筛选突变多肽与其结合配偶体(尤其包含带电荷氨基酸残基的那些)之间形成桥键中起作用。由此，离子可能够经由氢键及/或离子键结合到突变多肽及其结合配偶体。这可以通过允许离子到达大分子(突变多肽或其结合配偶体)可能难以到达的位点来帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合。在一些情况下，分析溶液中的离子可增加突变多肽与其结合配偶体彼此结合的概率。此外，离子可另外地或可替代地通过结合到大分子(突变多肽或其结合配偶体)来帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合。此结合可更改大分子的构形及/或使得较大分子保持有助于与其结合配偶体结合的特定构形。

已观察到，离子可帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合，有可能通过与突变多肽及其结合配偶体形成离子键。因此，相比于无离子的相同分析，筛选可为更加高效的且可识别更多命中(候选条件活性多肽)。适合的离子可选自镁离子、硫酸根离子、硫酸氢根离子、碳酸根离子、柠檬酸根离子、HAPT离子、HADP离子、碳酸氢根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、过硫酸根离子、单过氧硫酸根离子、硼酸根离子、乳酸根离子、柠檬酸根离子、组氨酸根离子、组胺根离子及铵离子。

已发现，在靠近离子的pKa的pH下，离子用以帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合。相对于突变多肽的大小，这类离子优选地相对较小。

在一个实施例中，当异常条件为不同于在正常生理条件下的正常生理pH的pH时，适用于增加候选条件活性多肽的命中数的离子可选自pKa接近在分析中待测试的异常pH的离子。举例来说，离子的pKa可距离异常pH至多2个pH单位、距离异常pH至多1个pH单位、距离异常pH至多0.8个pH单位、距离异常pH至多0.6个pH单位、距离异常pH至多0.5个pH单位、距离异常pH至多0.4个pH单位、距离异常pH至多0.3个pH单位、距离异常pH至多0.2个pH单位或距离异常pH至多0.1个pH单位。

适用于本发明的示范性离子pKa(离子pKa在不同温度下可略微变化)如下：铵离子具有约9.24的pKa、磷酸二氢盐具有约7.2的pKa、乙酸具有约4.76的pKa、组氨酸具有约6.04的pKa、碳酸氢根离子具有约6.4的pKa、柠檬酸盐具有6.4的pKa、乳酸根离子具有约3.86的pKa、组胺具有约6.9的pKa、HATP具有6.95的

及HADP具有6.88的

在一个实施例中，在二硫化物存在下分析且选择条件活性多肽。二硫化物具有7.05的pKa。在一些实施例中，不同浓度的二硫化物可用于表示正常及异常生理条件的分析。替代地，正常生理条件及异常条件下的分析培养基具有大致相同的二硫化物浓度，且同样在特定条件值中具有一些偏差，例如分析可在不同pH下进行。待用于分析中的二硫化物浓度可为1mM到100mM。优选地，分析培养基具有2到500nM、或3到200nM或5到100nM的二硫化物浓度。在一些方面，二硫化物浓度可为1mM到20mM，或2mM到10mM。在二硫化物存在的情况下所进行的分析为已知的。

在某些实施例中，一旦异常条件下的pH(即异常pH)为已知的，那么适用于增加候选条件活性多肽的命中的离子可选自pKa处于或接近异常pH的离子，例如候选离子可具有距离异常pH至多4个pH单位、距离异常pH至多3个pH单位、距离异常pH至多2个pH单位、距离异常pH至多1个pH单位、距离异常pH至多0.8个pH单位、距离异常pH至多0.6个pH单位、距离异常pH至多0.5个pH单位、距离异常pH至多0.4个pH单位、距离异常pH至多0.3个pH单位、距离异常pH至多0.2个pH单位或距离异常pH至多0.1个pH单位的pKa。

如上文所陈述，在处于或接近离子pKa的pH下，离子最有效地帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合。举例来说，已发现，在pH 7.2到7.6下的分析溶液中，碳酸氢根离子(具有约6.4的pKa)不会非常有效地帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合。随着分析溶液中的pH降低到6.7且进一步降低到约6.0，碳酸氢根离子变得更加有效地帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合。因此，相比于在pH 7.2到7.6下的分析，在pH 6.0下的分析中可识别更多命中。类似地，组氨酸在pH 7.4下不会非常有效地帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合。随着分析溶液的pH降低到6.7且进一步降低到约6.0，组氨酸变得更加有效地帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合，例如还允许在约6.2到6.4范围内的pH下识别更多命中。

已发现，当正常生理条件(即正常生理pH)及异常条件(即异常pH)下的分析溶液的pH不同时，具有在约正常生理pH及异常pH的中点到约异常pH范围内的pKa的离子可极大地帮助所筛选的突变多肽与其结合配偶体之间的结合。因此，筛选分析更加高效地发现更多命中或在异常条件下具有高活性的候选条件多肽。

在一些实施例中，pKa甚至可距离异常pH至少一个pH单位。当异常pH为酸性pH时，适合离子的pKa可在(异常pH-1)到异常pH与正常生理pH之间的中点范围内。当异常pH为碱性pH时，适合离子的pKa可在(异常pH+1)到异常pH与正常生理pH之间的中点范围内。离子可选自描述于本申请中的那些离子。然而，还可以使用更多本申请案中尚未明确描述的离子。应理解，一旦选择异常pH及正常生理pH用于筛选分析，那么熟习所属领域者可使用本文所描述的导引原理来选择任何具有适合pKa的离子，用于增加在异常条件下识别更多具有高活性的命中的筛选效率。

举例来说，当异常pH为8.4且正常生理pH为7.4时，对于示范性筛选，任何具有在约7.9(中点)到9.4(即8.4+1)范围内的pKa的离子可用于筛选。一些具有此范围中的pKa的离子包含衍生自麦黄酮(pKa 8.05)、肼(pKa 8.1)、二甘氨酸(pKa 8.26)、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸)(pKa 8.3)、N-参[羟基甲基]甲基-3-氨基丙烷磺酸(pKa 8.4)、牛磺酸(pKa 9.06)的离子。另举例来说，当异常pH为6且正常生理pH为7.4时，对于示范性筛选，任何具有在约5(即6-1)到6.7(中点)范围内的pKa的离子可用于筛选。一些具有此范围中的pKa的离子包含衍生自苹果酸盐(pKa 5.13)、吡啶(pKa 5.23)、哌嗪(pKa 5.33)、二甲胂酸盐(pKa 6.27)、琥珀酸(pKa 5.64)、2-(N-吗啉基)乙磺酸(pKa 6.10)、柠檬酸盐(pKa 6.4)、组氨酸(6.04)及bis-tris(6.46)的离子。熟习所属领域者将能够查阅大量化学手册及课本以识别可转化为具有属于所述范围中的pKa的离子的已知化学化合物，包含化学无机化合物及有机化学化合物。在具有适合pKa的化学化合物中，具有较小分子量的化学化合物可为优选的。

因此，本发明未预期地发现最终识别的条件活性多肽的生产不仅取决于产生正确的多肽突变体，而且取决于在分析溶液中使用具有适合pKa的离子。本发明设想除产生突变多肽的较大文库之外(例如经由CPE及CPS)，还应努力寻找用于分析溶液中的适合离子(具有适当pKa)，这是因为离子可有助于有效地从较大文库中选择具有高活性的突变体。进一步设想，在无适合离子的情况下，筛选为不太高效的且发现具有高活性的突变体的概率降低。因此，在无适合离子的情况下可能需要多重回合的筛选以达成相同数目的具有高活性的突变体。

分析溶液中的离子可由分析溶液的组分原位形成或直接包含于分析溶液中。举例来说，来自空气的CO₂可溶解于分析溶液中以提供碳酸根及碳酸氢根离子。另举例来说，磷酸二氢钠可添加到分析溶液中以提供磷酸二氢根离子。

分析溶液中的这类组分的浓度(用于在正常生理条件下的分析及在异常条件下的分析)可与通常在哺乳动物(例如人类)的天然存在的体液中发现的相同组分的浓度相同或大体上相同。在其它实施例中，组分的浓度可为较高的，尤其当组分为可用以帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合的离子时，这是因为已观察到，较高浓度的这类离子可与突变多肽及其结合配偶体形成离子键，实际上有助于结合及增加发现更多命中或候选条件活性多肽的概率。

在一些实施例中，分析溶液中的离子的浓度可与使用分析发现更多命中的概率正相关，尤其当使用超过正常生理浓度的浓度时。举例来说，人类血清具有约15到30mM的碳酸氢根离子的浓度。在一个实例中，随着分析溶液中的碳酸氢根离子的浓度从3mM增加到10mM、到20mM、到30mM、到50mM及到100mM，分析中的命中数目也随碳酸氢根浓度的每次增加而增加。考虑到这种情况，分析溶液可使用在约3mM到约200mM、或约5mM到约150mM或约5mM到约100mM、或约10mM到约100mM或约20mM到约100mM或约25mM到约100mM或约30mM到约100mM或约35mM到约100mM或约40mM到约100mM或约50mM到约100mM的范围内的碳酸氢根浓度。

在另一实施例中，分析溶液中的柠檬酸盐浓度可为约30μM到约120μM、或约40μM到约110μM、或约50μM到约110μM、或约60μM到约100μM、或约μM到约90μM、或约μM。

在一个实施例中，正常生理条件为在7.2到7.6范围内的正常生理pH，且异常条件为在5.5到7.2、6到7或6.2到6.8范围内的异常pH。在正常生理条件下的用于分析的分析溶液具有正常生理pH及50mM的碳酸氢根离子。在异常条件下的用于分析的分析溶液具有异常pH及50mM的碳酸氢根离子。因为碳酸氢根离子的pKa为约6.4，所以碳酸氢根离子可在6.0到6.4的异常pH(例如pH 6.0或6.2)下帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合。

在又一实施例中，正常生理条件为在7.2到7.6的范围内的正常生理pH，且异常条件为在5.5到7.2、6到7或6.2到6.8范围内的异常pH。在正常生理条件下的用于分析的分析溶液具有正常生理pH及80μM的柠檬酸根离子。在异常条件下的用于分析的分析溶液具有异常pH及80μM的柠檬酸根离子。因为柠檬酸根离子具有6.4的pKa，所以柠檬酸根离子可在具有pH 6.0到6.4的异常条件下的分析溶液中有效地帮助突变多肽与结合配偶体之间的结合。因此可识别更多候选条件活性多肽，其在pH 6.0到6.4的条件下具有较高结合活性，且在7.2到7.8的pH条件下具有较低活性。其它离子(包含乙酸根、组氨酸根、碳酸氢根、HATP及HADP)以相似方式起作用，使得含有离子的分析溶液能够有效地筛选在约为离子的pKa的pH下具有较高结合活性及在不同于离子的pKa的pH(例如正常生理pH)下具有较低结合活性的突变多肽。

在又一实施例中，正常生理条件为37℃的正常生理温度，且异常条件为38到39℃的异常温度(一些肿瘤微环境中的温度)。在正常生理条件下的用于分析的分析溶液具有正常生理温度及20mM的碳酸氢根离子。在异常条件下的用于分析的分析溶液具有异常温度及20mM的碳酸氢根离子。

在又一实施例中，正常生理条件为在正常人类血清中的电解质的特定浓度，且异常条件为相同电解质在不同异常浓度下的浓度，所述异常浓度可存在于动物或人类中的不同部位或可由改变人类血清中的电解质的正常生理浓度的动物或人类条件所造成。

突变多肽及/或其结合配偶体之间的结合也可以大量其它方式受到影响。通常，此影响将通过在分析溶液中包含一或多个额外组分来施加。这些额外组分可经设计成与突变多肽、结合配偶体或两者交互作用。另外，这些额外组分可使用两种或大于两种交互作用的组合以及两种或大于两种类型交互作用的组合以影响结合。

在一个实施例中，所关注的结合交互作用处于抗体与抗原之间。在此实施例中，一或多个额外组分可包含于分析溶液中以对抗体、抗原或两者施加影响。以此方式，所需结合交互作用可增强。

除可与突变多肽及/或其结合配偶体形成离子键以帮助突变多肽与结合配偶体之间的结合的离子之外，本发明还包含可用以帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合的其它组分。在一个实施例中，使用可与突变多肽及/或其结合配偶体形成氢键的分子。在另一实施例中，可使用能够与突变多肽及/或其结合配偶体进行疏水性交互作用的分子。在又一实施例中，涵盖能够与突变多肽及/或其结合配偶体进行凡得瓦(Van der Waals)交互作用的分子。

氢键为共价键结于负电性原子(例如碳、氮、氧、硫、氯或氟)(氢键供体)的氢与电子供体原子(例如氮、氧、硫、氯或氟)(氢键受体)的非共享电子对之间相对弱的非共价交互作用。

能够与突变多肽及/或其结合配偶体形成氢键的组分包含有机分子以及具有极性键的无机分子。突变多肽及/或用于突变多肽的结合配偶体通常含有可形成氢键的氨基酸。适合的氨基酸具有能够形成氢键的带有极性基的侧链。适合的氨基酸的非限制性实例包含谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)及色氨酸(Trp)。

这些氨基酸可充当氢供体及氢受体。举例来说，例如可在Ser、Thr及Tyr中发现的-OH基团中的氧原子、例如可在Glu及ASP中发现的-C＝O基团中的氧原子、例如可在Cys及Met中发现的-SH基团或-SC-中的硫原子、例如可在Lys及Arg中发现的-NH₃ ⁺基团中的氮原子及例如可在Trp、His及Arg中发现的-NH-基团中的氮原子皆可充当氢受体。另外，此列表中的包含氢原子的基团(例如-OH、-SH、NH₃ ⁺及-NH-)可充当氢供体。

在一些实施例中，突变多肽及/或其结合配偶体的主链还可参与形成一或多个氢键。举例来说，主链可具有例如在肽键中的-(C＝O)-NH-的重复结构。在此结构中的氧及氮原子可充当氢受体，而氢原子可参与氢键。

具有至少一个包括可用于氢键的氢或氧原子的极性键的无机化合物可包含例如H₂O、NH₃、H₂O₂、肼、碳酸盐、硫酸盐及磷酸盐。有机化合物，例如醇；酚；硫醇；脂肪族、胺、酰胺；环氧化物、羧酸；酮、醛、醚、酯、有机氯化物及有机氟化物。可形成氢键的化合物在化学文献中为已知的，例如在例如“化学键的属性(The Nature of the Chemical Bond)”，由Linus Pauling，康奈尔大学出版(Cornell University Press)，1940，第284到334页中所论述的那些化合物。

在一些实施例中，醇可包含甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、l-己醇、2-辛醇、l-环己醇及高级醇；二醇，例如乙二醇、丙二醇、甘油、二甘醇及聚伸烷二醇。适合的酚包含对苯二酚；间苯二酚；儿茶酚；苯酚；邻、间及对甲酚；瑞香草酚；α-及β-萘酚；连苯三酚；愈创木酚及间苯三酚。适合的硫醇包含甲硫醇、乙硫醇、1-丙硫醇、2-丙硫醇、丁硫醇、叔丁基硫醇、戊硫醇、己硫醇、硫酚、二巯基丁二酸、2-巯基乙醇及2-巯基吲哚。适合的胺包含甲胺；乙胺；丙胺；异丙胺；苯胺；二甲胺及甲基乙基胺；三甲胺；氮丙啶；哌啶；N-甲基哌啶；联苯胺；环己胺；乙二胺；己二胺；邻、间及对甲苯胺及N-苯基哌啶。适合的酰胺包含乙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺及N-甲基-N-对氰乙基甲酰胺。环氧化物可包含环氧乙烷、环氧丙烷、叔丁基过氧化氢物、氧化苯乙烯、环氧缩水甘油、氧化环己烯、二叔丁基过氧化物、氢过氧化异丙苯或氢过氧化乙苯、环氧异丁烷及1,2-环氧辛烷。羧酸可包含对苯二甲酸；间苯二甲酸；邻苯二甲酸；水杨酸；苯甲酸；乙酸；月桂酸；己二酸；乳酸；柠檬酸；丙烯酸；甘氨酸；六氢苯甲酸；邻、间及对甲苯甲酸；烟碱酸；异烟酸及对氨基苯甲酸。酮可包含丙酮、3-丙酮、丁酮、戊酮、甲乙酮、二异丁酮、乙基丁基酮、甲基异丁基酮、甲基叔丁基酮、环己酮、丙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、甲基丁基酮、甲基戊基酮、甲基己基酮、二乙基酮、乙基丁基酮、二丙基酮、二异丁基酮、二丙酮醇、佛尔酮、异佛尔酮、环己酮、甲基环己酮及苯乙酮。醛可包含甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、苯甲醛、桂皮醛、异丁醛、戊醛、辛醛、苯甲醛、桂皮醛、环己酮、水杨醛及糠醛。酯包含乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸丁酯、甲酸戊酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸甲酯异戊酯、乙酸甲氧基丁酯、乙酸己酯、乙酸环己酯、乙酸苄酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯、丙酸戊酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯、丁酸戊酯、乙酰乙酸甲酯及乙酰乙酸乙酯。可用于本发明中的醚包含二甲醚、甲基乙基醚、二乙醚、甲基丙基醚及二甲氧乙烷。醚可为环状，例如环氧乙烷、四氢呋喃及二噁烷。

有机氯化物包含氯仿、五氯乙烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、四氯甲烷、四氯乙烷、五氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯及二氯乙烯。有机氟化物可包含氟甲烷、二氟甲烷、三氟甲烷、三氟乙烷、四氟乙烷、五氟乙烷、二氟丙烷、三氟丙烷、四氟丙烷、五氟丙烷、六氟丙烷及七氟丙烷。

氢键可由键的强度划分：强、中或弱氢键(Jeffrey，George A.；氢键概论(Anintroduction to hydrogen bonding)，牛津大学出版(Oxford University Press)，1997)。强氢键具有2.2到

的供体-受体距离及在14到40kcal/mol范围内的能量。中氢键具有2.5到

的供体-受体距离及在4到15kcal/mol范围内的能量。弱氢键具有3.2到

的供体-受体距离及在<4kcal/mol范围内的能量。具有能阶的氢键的一些实例为F-H^…:F(38.6kcal/mol)、O-H^…:N(6.9kcal/mol)、O-H^…:O(5.0kcal/mol)、N-H^…:N(3.1kcal/mol)及N-H^…:O(1.9kcal/mol)。更多参见Perrin等人化学及生物学中的“强”氢键(“Strong”hydrogen bonds in chemistry and biology)，物理化学年度评论(Annual Review ofPhysical Chemistry)，第48卷，第511-544页，1997；Guthrie，“短强氢键：其能够解释酶催化吗？(Short strong hydrogen bonds:can they explain enzymic catalysis？)”化学与生物学(Chemistry&Biology)1996年3月，3:163-170。

在一些实施例中，本发明中所使用的组分可与突变多肽及/或其结合配偶体形成强氢键。这些组分倾向于具有带有强负电性的原子。已知具有最强负电性的原子以此次序为F>O>Cl>N。因此，本发明优选地使用包含氟、羟基或羰基的有机化合物来形成氢键。在一个实施例中，有机氟可用于本发明中以形成强氢键。

在另一实施例中，可使用能够与突变多肽及/或其结合配偶体进行疏水性交互作用的组分。此类组分包含具有疏水性基团的有机化合物。

疏水性交互作用为疏水性化合物或化合物的疏水域与另一个疏水性化合物或其它化合物的疏水域之间的可逆吸引交互作用。这类型交互作用已描述于“疏水性交互作用(Hydrophobic Interactions)”，A.Ben-Nairn(1980)，纽约普莱纽姆出版(Plenum Press，New York)中。

疏水性材料由于其非极性本质而受水分子排斥。当水溶液中的相对非极性分子或基团与其它非极性分子或基团而非水结合时，此称为“疏水性交互作用”。

突变多肽及其结合配偶体通常包含能够进行疏水性交互作用的氨基酸。氨基酸将通常表征为具有至少一个带有能够进行疏水性交互作用的非极性基团的侧链。疏水性氨基酸包含例如丙氨酸(Ala)、异白氨酸(Ile)、白氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、缬氨酸(Val)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)，较小程度上包含甲硫氨酸(Met)及色氨酸(Trp)。

能够与突变多肽及/或其结合配偶体进行疏水性交互作用的组分包含作为疏水性分子或含有至少一个疏水性部分的分子的有机化合物。在一些实施例中，这些疏水性组分可为选自芳香族烃、经取代的芳香族烃、聚芳香族烃、芳香族或非芳香族杂环、环烷烃、烷烃、烯烃及炔烃的烃。疏水性基团可包含芳香族基团、烷基、环烷基、烯基及炔基。如本文所使用的术语“烷基”、“烯基”及“炔基”是指具有一到三十个碳原子的不饱和脂肪族基，包含直链烯基/炔基、分支链烯基/炔基、环烯基(脂环)、经烷基取代的环烷基及经环烷基取代的烯基/炔基。这类烃部分还可在一或多个碳原子上经取代。

可理解，疏水性交互作用的强度是基于可彼此交互作用的“疏水物”的可用量。因此，可通过例如增加涉及疏水性交互作用的分子中的疏水性部分的量及/或“疏水性”性质来调节疏水性交互作用。举例来说，疏水性部分在其原始形式中可包含烃链，可以通过将疏水性侧链附接到其碳主链的碳中的一者而经改质，以增加其疏水性(增加所述部分所涉及的疏水性交互作用的强度的能力)。在一优选实施例中，此可包含各种多环化合物的附接，包含例如各种甾族化合物及/或其衍生物，例如固醇类型化合物，更具体地说胆固醇。大体而言，侧链可为直链、芳香族、脂肪族、环状、多环或由熟习所属领域者所设想的任何各种其它类型的疏水性侧链。

能够与突变多肽及/或其结合配偶体进行凡得瓦交互作用的组分类型通常但不始终为具有极性部分的化合物。如本文中所使用，“凡得瓦交互作用”是指原子、部分、分子及表面之间的吸引力，所述吸引力由于量子机构动力学所导致的偶极子-偶极子交互作用及/或附近原子、部分、分子的波动极化中的相关性所引起。

本发明中的凡得瓦交互作用为突变多肽或结合配偶体与组分之间的吸引力。凡得瓦交互作用可产生于三个来源。首先，尽管一些分子/部分为电中性，但可为永久性电偶极子。由于一些分子/部分的结构中的电子电荷分布的固定畸变，分子/部分的一侧始终为略微阳性而相对侧略微阴性。这类永久性偶极子彼此对准的倾向产生净吸引力。此为两种永久性偶极子之间的交互作用(基桑力(Keesom force))。

其次，作为永久性偶极子的分子的存在可暂时使在其它附近极性或非极性分子中的电子电荷畸变，由此诱发进一步极化。额外吸引力由永久性偶极子与相邻感应偶极子的交互作用而产生。此为永久性偶极子与相对应感应偶极子之间的交互作用，可称为德拜(Debye)力。第三，即使无所涉及分子为永久性偶极子(例如有机液态苯)，但吸引力存在于分子中具有两种瞬时感应偶极子的分子间。此为两种瞬时感应偶极子之间的交互作用，可称为伦敦分散力(London dispersion force)。

在能够进行凡得瓦交互作用的突变多肽及/或结合配偶体中存在许多氨基酸。这些氨基酸可具有极性侧链，包含谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、组氨酸(His)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)。这些氨基酸还可具有带有非极性基团的侧链，包含丙氨酸(Ala)、异白氨酸(Ile)、白氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、缬氨酸(Val)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)。

能够与突变多肽及/或其结合配偶体进行凡得瓦交互作用的组分包含可溶于分析溶液中的极性或非极性无机化合物。分析溶液通常为水溶液，且因此这些极性或非极性无机化合物优选地可溶于水。用于凡得瓦交互作用的优选材料为那些极性材料，使得其能够进行偶极子-偶极子交互作用。举例来说，AlF₃具有极性AL-F键且可溶于水(在20℃下约0.67g/100ml水)。HgCl₂具有极性Hg-Cl键且在20℃下可以7.4g/100ml溶于水中。PrCl₂具有极性Pr-Cl键且在20℃下可以约1g/100ml溶于水中。

能够进行凡得瓦交互作用的适合极性化合物包含醇、硫醇、酮、胺、酰胺、酯、醚及醛。上文已结合氢键描述这些化合物的适合实例。能够进行凡得瓦交互作用的适合非极性化合物包含芳香族烃、经取代的芳香族烃、聚芳香族烃、芳香族或非芳香族杂环、环烷烃、烷烃、烯烃、炔烃。

可使用氢键组分、疏水性组分及凡得瓦组分来以多种方式影响突变多肽及其结合配偶体的结合。在一个实施例中，氢键、疏水性交互作用及/或凡得瓦交互作用可在突变多肽与其结合配偶体之间形成桥键。这种桥键可使得突变多肽及结合配偶体彼此更接近以有助于结合的方式将突变多肽及/或结合配偶体相对于彼此结合及/或定位。

在另一实施例中，通过例如使多肽及结合配偶体以增加结合概率的方式彼此组合或结合，氢键及/或疏水性交互作用可增加突变多肽结合到其结合配偶体的概率。因此，这些交互作用中的一或多者可单独或以组合形式使用以使突变多肽及结合配偶体更近地组合在一起，或以有助于结合的方式布置突变多肽及结合配偶体，例如通过使结合位更近地拉伸在一起或使分子的非结合部分布置得更远离彼此，由此允许结合位更靠近彼此定位。

在又一实施例中，氢键及/或疏水性相互作用可影响突变多肽及/或其结合配偶体的构形以提供更有利于突变多肽与其结合配偶体结合的构形。具体地说，与突变多肽及/或结合配偶体的氨基酸中的一或多者结合或交互作用可在突变多肽或结合配偶体中产生一或多个有利于突变多肽/结合配偶体结合反应的构形变化。

本发明进行两对分析，一对分析寻找当与在正常生理条件下衍生突变多肽的亲本多肽相比时在所述正常生理条件下的分析中的突变多肽的活性的降低，及第二对分析寻找当与在异常条件下衍生突变多肽的亲本多肽相比时在所述异常条件下的分析中的突变多肽活性的增加。描述于WO 2017/078839中的实例说明选择条件活性多肽，所述条件活性多肽在需要活性的异常pH下比在正常生理pH下更有活性。

在一个实施例中，突变多肽经受在正常生理条件下的分析及在异常条件下的分析。条件活性多肽选自突变多肽，与在正常生理条件下的分析中的突变多肽的相同活性相比，所述突变多肽在异常条件下的分析中的活性增加。

用于本发明的分析对中的条件可选自温度、pH、渗透压、渗透压度、氧化应激、电解质浓度及分析溶液或培养基的任何其它组分的浓度。因此，分析培养基的特定组分可以大体上相同的浓度用于两对分析中。在此情况下，通常存在用于模拟人类或动物中的特定环境(例如血清、肿瘤微环境、滑膜环境、类神经环境或在投药点可遇到、给予治疗可经由或在治疗点可遇到的任何其它环境)的组分。选择一或多种模拟这些环境的组分的一个重要方面为使用分析对可改善所执行的选择过程的结果。举例来说，模拟特定环境允许在选择过程中评估彼环境的特定组分对突变多肽的各种影响。特定环境的组分可例如更改突变多肽或与突变多肽结合，抑制突变多肽的活性，使突变多肽不活化等。

在一些实施例中，分析溶液的一或多种组分优选为小分子或离子，例如二硫化物、硫化氢、组氨酸、组胺、柠檬酸盐、碳酸氢盐、乳酸盐及乙酸盐。在一个实施例中，小分子或离子组分优选地以约100μm到约100mM、或更优选地约0.5到约50mM或约1到约10mM的浓度存在于分析溶液中。

分析溶液中的组分的浓度可与通常在哺乳动物(例如人类)的天然存在的体液中发现的相同组分的浓度相同或大体上相同。此可称为体液中的组分的正常生理浓度。在其它实施例中，分析溶液中的特定组分的浓度可低于或大于通常在哺乳动物(例如人类)的天然存在的体液中发现的相同组分的浓度。

在另一实施例中，组分可以大体上不同的浓度存在于分析对中的各者中。在此情况下，组分的存在、不存在或浓度变成将分析的条件，这是因为组分的浓度为区分用于在正常生理条件下分析的分析溶液与用于在异常条件下分析的分析溶液之间的条件。因此，通过本发明的方法的此实施例所产生的条件活性多肽将选择至少部分取决于组分的浓度的活性。

在一些实施例中，组分可存在于一对分析溶液中，但在另一对分析溶液中完全不存在。举例来说，异常条件下的分析溶液中的乳酸盐浓度可设定为模拟肿瘤微环境中的乳酸盐浓度的水准。乳酸盐可不存在于正常生理条件下的所述对分析溶液中。

在一个实施例中，正常生理条件为表示正常生理条件的第一乳酸盐浓度，且异常条件为表示存在于体内特定位置中的异常条件的第二乳酸盐浓度。

在另一实例中，葡萄糖可不存在于异常条件下的分析溶液中，以模拟可在肿瘤微环境中发现的葡萄糖的缺失，同时葡萄糖可设定为模拟在正常生理条件下的一对分析溶液中的血浆葡萄糖浓度的水准。此特征可用于将条件活性多肽优选地递送到输送中无活性或活性极低的位置或环境，及当其到达异常条件下的分析溶液中的组分浓度存在的环境时，活化条件活性多肽。

举例来说，与人类血清相比，肿瘤微环境通常具有较低葡萄糖浓度及较高乳酸盐浓度。血清中的葡萄糖的正常生理浓度在约2.5mM到约10mM范围内。另一方面，在肿瘤微环境中，葡萄糖浓度在0.05mM到0.5mM范围内通常极低。在一个实施例中，用于正常生理条件下的分析的分析溶液具有在约2.5mM到约10mM的范围内的葡萄糖浓度，且用于异常条件下的分析的分析溶液具有在约0.05mM到约0.5mM的范围内的葡萄糖浓度。与在较高葡萄糖环境中(在正常组织或血液中)相比，由此产生的条件活性多肽在低葡萄糖环境中(在肿瘤微环境中)具有较高活性。此条件活性多肽将在肿瘤微环境中起作用，但在血流中的输送中具有低活性。

血清中的乳酸盐的正常生理浓度在约1mM到约2mM范围内。另一方面，在肿瘤微环境中，乳酸盐浓度通常在10mM到20mM范围内。在一个实施例中，用于正常生理条件下的分析的分析溶液具有在约1mM到约2mM的范围内的乳酸盐浓度，且用于异常条件下的分析的分析溶液具有在约10mM到约20mM的范围内的乳酸盐浓度。与在较低乳酸盐环境中(在正常组织或血液中)相比，由此产生的条件活性多肽在高乳酸盐浓度环境中(在肿瘤微环境中)具有较高活性。此条件活性多肽将由此在肿瘤微环境中起作用，但在血流中的输送中具有低活性。

类似地，众所周知，酸痛肌肉相比于正常肌肉具有较高(异常)乳酸盐浓度。因此，当寻求在酸痛肌肉环境中将具有活性的突变多肽时，在异常条件下的一对分析可在存在较高乳酸盐浓度的情况下进行以模拟酸痛肌肉环境，而在正常生理条件下的一对分析可在较低乳酸盐浓度或不存在乳酸盐的情况下进行。以此方式，突变多肽可经选择在乳酸盐浓度增加的酸痛肌肉环境中增强活性。举例来说，这种条件活性多肽可用作抗炎剂。

在另一实施例中，两种或大于两种组分可用于两对分析溶液中。在这类型分析中，可使用上文所描述的两种类型分析的特征来选择条件活性多肽。替代地，可使用两种或大于两种组分来增加条件活性多肽的选择性。举例来说，返回到肿瘤微环境，在异常条件下的一对分析可在具有高乳酸盐浓度及低葡萄糖浓度的分析培养基中进行，而在正常生理条件下的相应一对分析可在具有相对较低乳酸盐浓度及相对较高葡萄糖浓度的分析培养基中进行。

本发明设想选自无机化合物、离子及有机分子的各组分可单独或以组合形式使用以选择在组分的一种浓度下比在相同组分的不同浓度下更有活性的条件活性多肽。

依赖于一或多种代谢物的不同浓度作为正常环境(正常生理条件)与异常环境(异常条件)之间的区分条件的分析可尤其适用于选择在肿瘤微环境中比在血浆中更有活性的条件活性多肽，因为肿瘤微环境通常具有大量代谢物，所述代谢物具有与血浆中的相同代谢物浓度相比不同的浓度。

Kinoshita等人，曾以“使用活体外质子磁性共振波谱的人类大脑肿瘤中代谢物的绝对浓度(Absolute Concentrations of Metabolites in Human Brain Tumors UsingIn Vitro Proton Magnetic Resonance Spectroscopy)”(NMR IN BIOMEDICINE，第10卷，第2-12页，1997)一文，比较正常脑部及脑瘤中的代谢物。这个研究组发现N-乙酰基天冬氨酸盐在正常脑部中具有5000到6000μM的浓度，但浓度在神经胶母细胞瘤中仅为300到400μM、在星形细胞瘤中为1500到2000μM，及在分化不良星形细胞瘤中为600到1500μM。此外，肌醇在正常脑部中具有1500到2000μM的浓度，但浓度在神经胶母细胞瘤中为2500到4000μM、在星形细胞瘤中为2700到4500μM，及在分化不良星形细胞瘤中为3800到5800μM。磷酸乙醇胺在正常脑部中具有900到1200μM的浓度，但浓度在神经胶母细胞瘤中为2000到2800μM，在星形细胞瘤中为1170到1370μM，及在分化不良星形细胞瘤中为1500到2500μM。甘氨酸在正常脑部中具有600到1100μM的浓度，但浓度在神经胶母细胞瘤中为4500到5500μM、在星形细胞瘤中为750到1100μM，及在分化不良星形细胞瘤中为1900到3500μM。丙氨酸在正常脑部中具有700到1150μM的浓度，但浓度在神经胶母细胞瘤中为2900到3600μM、在星形细胞瘤中为800到1200μM，及在分化不良星形细胞瘤中为300到700μM。这些代谢物也会在血液中具有不同浓度，例如N-乙酰基天冬氨酸盐在血液中具有约85000μM的浓度；肌醇在血液中具有约21700μM的浓度；甘氨酸在血液中具有约220到400μM的浓度；丙氨酸在血液中具有约220到300μM的浓度。

因此，这些代谢物(包含至少N-乙酰基天冬氨酸盐、肌醇、甘氨酸及丙氨酸)可以不同浓度用于分析溶液中以选择在脑瘤中有活性但在血液或正常脑组织中不具有活性的条件活性多肽。举例来说，具有浓度为85000μM的N-乙酰基天冬氨酸盐的分析溶液可用于在正常生理条件下的一对分析，且具有浓度为350μM的N-乙酰基天冬氨酸盐的分析溶液可用于在异常条件下的一对分析以选择在神经胶母细胞瘤的肿瘤微环境中有活性但在血液或正常脑组织中无活性或至少活性较低的条件活性多肽。

Mayers等人，曾以“循环分支链氨基酸升高为胰腺癌发展中的早期事件(Elevatedcirculating branched chain amino acids are an early event in pancreaticadenocarcinoma development)”，自然医学(Nature Medicine)(第20卷，第1193-1198页，2014)一文，研究胰脏患者的预诊断血浆中的各种不同代谢物(包含分支链氨基酸)的浓度。发现在胰脏肿瘤患者中，相对于无胰脏癌的人类的血液中的代谢物的浓度，存在以不同浓度存在于血流中的若干种相同的代谢物。前述Mayers等人还发现与正常个体相比，胰脏癌患者在其血浆中具有显著升高的分支链氨基酸。以升高浓度存在的分支链氨基酸包含异白氨酸、白氨酸及缬氨酸(上述Mayers等人的表1)。存在Mayers等人(同前文献)的图1中所展示的其它代谢物，所述代谢物以与正常健康人类中的浓度明显不同的浓度存在于胰脏癌患者的血浆中。这些代谢物包含至少乙酰基甘氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、2-氨基己二酸、牛磺去氧胆酸酯/牛磺鹅去氧胆酸酯、乌头酸盐、异柠檬酸盐、乳酸盐、α-甘油磷酸盐及尿酸盐。因此，基于某些代谢物以不同浓度存在于胰脏癌患者及正常健康患者的血浆中的发现，可预测，胰脏癌的肿瘤微环境对于这些代谢物亦将具有不同于存在于健康患者的胰脏微环境中的浓度。

因此，在一个实施例中，这些代谢物中的一或多者可以接近于健康个体中的血浆中的这些代谢物浓度(即代谢物的正常生理浓度)的量用于正常生理条件下的分析溶液。举例来说，健康个体血浆中的已知正常生理浓度为异白氨酸约1.60±0.31mg/dL、白氨酸约1.91±0.34mg/dL及缬氨酸约2.83±0.34mg/dL。正常生理条件下的分析溶液可具有在这些分支链氨基酸中的一或多者的这些范围内的正常生理浓度。异常条件下的分析溶液可具有以下浓度的相同分支链氨基酸，其比相应分支链氨基酸在健康个体中的正常生理浓度高约5倍、或约10倍、或约20倍、或约50倍、或约70倍、或约100倍、或约150倍、或约200倍或约500倍。这将反映事实，所述事实为基于Mayers等人在上文的发现，胰脏肿瘤微环境将预期具有明显升高的这些分支链氨基酸浓度，这是因为由Mayers等人在上述检测的血浆中发现这些分支链氨基酸的较高浓度来源于肿瘤微环境且在血流中经稀释。类似地，在异常条件下的分析可反映胰脏癌患者的血液中的其它代谢物的浓度，即使特定代谢物的浓度在癌症患者中明显低于正常个体中的浓度。以此方式，筛选可模拟实际环境且借此确保选择用于其特定环境的最高活性突变体。

在一些其它实施例中，正常生理条件下的分析溶液可包括一或多种分支链氨基酸，所述氨基酸的浓度模拟胰脏癌患者的血浆中的浓度以模拟这些患者的实际血浆环境。在这类实施例中，异常条件下的分析溶液可具有相同分支链氨基酸，所述氨基酸的浓度相比于胰脏癌患者血浆中的相对应分支链氨基酸的浓度高约2倍、或约3倍、或约4倍、或约5倍、或约7倍、或约8倍、或约10倍、或约15倍、或约20倍或约50倍以反映事实，所述事实为这些较高浓度起源于肿瘤微环境且血流中的浓度表示肿瘤微环境的实际浓度的稀释。类似地，其它代谢物也可在正常生理条件及异常条件下的分析溶液中具有不同浓度以反映从血流中所收集的数据预期的实际差异。在一些个例中，可在胰脏患者的血流中注意到特定代谢物的缺乏，在此情况下反映血流中的经测量浓度的浓度可用于正常生理条件下的分析，且甚至较低浓度可用于异常条件下的分析中以解释所述代谢物很可能在肿瘤微环境中消耗的预期。与在胰脏癌患者的血浆中相比，由此使用分析溶液而选择的条件活性多肽将在胰脏癌微环境中更有活性。

在一些实施例中，胰脏癌患者的全部血浆可用于本发明中。举例来说，在一个实施例中，胰脏癌患者的血浆的一或多种组分的模拟可用于在正常生理条件及异常条件下的分析中的一或两者的分析溶液。在一示范性实施例中，正常生理条件下的分析溶液的pH在7.2到7.6范围内且具有30wt％经添加胰脏癌患者的血浆，且异常条件下的分析溶液的pH在6.2到6.8范围内且具有30wt％经添加胰脏癌患者的血浆。在此实施例中，存在胰脏癌患者的血浆以(1)确保条件活性多肽在pH 7.2到7.6下的血液中不经活化，及(2)还确保条件活性多肽在肿瘤微环境中由pH 5.5到7.2、6到7或6.2到6.8活化，即使在胰脏癌患者的血液中发现此代谢物的组合物存在的情况下。这将为胰脏癌患者定制治疗方案。

在另一示范性实施例中，正常生理条件下的分析溶液的pH在7.2到7.6范围内且具有30wt％经添加胰脏癌患者的血浆，且异常条件下的分析溶液的pH在5.5到7.2或6.2到6.8范围内且不含任何经添加胰脏癌患者的血浆。

选自无机化合物、离子及有机分子的相同组分可用于如上文所述的若干种分析中的各者中。举例来说，在乳酸盐的情况下，乳酸盐可以大体上相同浓度用于正常生理条件及异常条件下的一对分析溶液中。正常生理条件及异常条件随后将在一或多个其它方面(例如另一组分的温度、pH、浓度等)中不同。在一不同实施例中，乳酸盐可用作正常生理条件与异常条件之间的区分因素中的一者以反映乳酸盐在异常肿瘤微环境中比在正常生理条件(非肿瘤微环境)中具有较高浓度的事实。

在一些实施例中，将两种或大于两种组分以大体上相同浓度添加到正常生理条件及异常条件下的分析溶液中。举例来说，将柠檬酸盐及牛血清白蛋白(BSA)两者添加到分析溶液中。在两种分析溶液中，柠檬酸盐浓度可为约80μM且BSA浓度可为约10-20％。更具体地说，用于正常生理条件下的一对分析的分析溶液可具有在7.2到7.6范围内的pH，其中柠檬酸盐浓度为约80μM及BSA浓度为约10-20％。用于异常条件下的一对分析的分析溶液可具有在6.2到6.8范围内的pH，其中柠檬酸盐浓度为约80μM及BSA浓度为约10-20％。

在一个实施例中，血清可添加到处于大体上相同浓度的正常生理条件及异常条件下的两种分析溶液中。因为血清具有大量无机化合物、离子、有机分子(包含多肽)，所以分析溶液将具有多种及大量选自无机化合物、离子、有机分子的组分，所述组分在两种分析溶液之间以大体上相同的浓度存在。分析溶液可具有5到30vol％、或7到25vol％、或10到20vol％、或10到15vol％的血清。在一些其它实施例中，正常生理条件及异常条件下的分析溶液不含血清。血清可为人类血清、牛血清或来自任何其它哺乳动物的血清。在一些其它实施例中，分析溶液不含血清。

正常生理条件及异常条件下的分析溶液可具有不同pH。可经由使用碳酸氢盐利用缓冲液中的CO₂及O₂含量来调节这类分析溶液的pH。

在一些其它实施例中，将两种或大于两种组分中的至少一者以不同浓度添加到正常生理条件及异常条件下的分析溶液中。举例来说，将乳酸盐及牛血清白蛋白(BSA)两者添加到分析溶液中。乳酸盐浓度可在正常生理条件及异常条件下的分析溶液之间不同，而BSA在两种分析溶液中可具有相同浓度。乳酸盐可在异常条件下的分析溶液中具有在30到50mg/dL范围内的浓度且在正常生理条件下的分析溶液中具有在8到15mg/dL范围内的浓度。另一方面，BSA在两种分析溶液中具有相同浓度，例如约10-20％。因此在存在BSA的情况下，使用这些分析溶液选择的条件活性多肽在30到50mg/dL的高乳酸盐浓度下比在8到15mg/dL的低乳酸盐浓度下更有活性。

在一些实施例中，分析溶液可经设计用于选择活性取决于两种或大于两种条件的条件活性多肽。在一个示范性实施例中，条件活性多肽可具有取决于pH及乳酸盐的活性。用于选择此种条件活性多肽的分析溶液可为具有7.2到7.6的pH、乳酸盐浓度在8到15mg/dL范围内的正常生理条件下的分析溶液。异常条件下的分析溶液可具有6.2到6.8的pH，乳酸盐浓度在30到50mg/dL范围内。任选地，正常生理条件及异常条件下的分析溶液还可包括离子以帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合，由此以增加候选生物活性多肽的命中数。

在另一示范性实施例中，条件活性多肽可具有取决于pH、葡萄糖及乳酸盐的活性。用于选择此种条件活性多肽的分析溶液可为具有7.2到7.6的pH、葡萄糖浓度在2.5到10mM范围内、乳酸盐浓度在8到15mg/dL范围内的正常生理条件下的分析溶液。异常条件下的分析溶液可具有6.2到6.8的pH、葡萄糖浓度在0.05到0.5mM范围内、乳酸盐浓度在30到50mg/dL范围内。任选地，正常生理条件及异常条件下的分析溶液还可包括离子以帮助突变多肽与其结合配偶体之间的结合，由此以增加在pH 6.2到6.8下结合到结合配偶体的候选生物活性多肽的数目。相比于在pH 7.2到7.6、葡萄糖浓度为2.5到10mM及乳酸盐浓度为8到15mg/dL的环境中，使用这类分析溶液的经选择条件活性多肽在pH 6.2到6.8、葡萄糖浓度为0.05到0.5mM及乳酸盐浓度为30到50mg/dL的环境中更有活性。

选自无机化合物、离子及有机分子的两种或大于两种组分是用于制造异常条件下的分析溶液，所述分析溶液模拟所选择条件活性多肽将递送到位置/位点(即靶位)处的环境。在一些实施例中，可将存在于靶位的环境中的至少三种组分添加到分析溶液中，或可将存在于靶位的环境中的至少四种组分添加到分析溶液中，或可将存在于靶位的环境中的至少五种组分添加到分析溶中，或可将存在于靶位的环境中的至少六种组分添加到分析溶液中。

在一个实施例中，从靶位(其中条件活性多肽将更有活性)所撷取的液体可直接用作分析溶液以在异常条件下分析。举例来说，可从个体，优选地从需要治疗的患有关节病症的个体撷取滑液。任选地经稀释的所撷取的滑液可用作在异常条件下的一对分析中的分析溶液以选择条件活性多肽。通过使用任选地经稀释的所检索的滑液作为在异常条件下分析的分析溶液，及模拟在正常生理条件下的用于分析的人类血浆的分析溶液，相比于在其它位置或器官，经选择的条件活性多肽(例如TNF-α)在关节处将更有活性。举例来说，患有发炎性关节(例如关节炎)的个体可用TNF-α治疗。然而，TNF-α通常具有损害其它组织及器官的严重副作用。在滑液中更有活性但在血液中无活性或活性较低的条件活性TNF-α将递送TNF-α的活性到关节，同时减小或潜在地消除TNF-α对身体的其余部分的副作用。

具有依赖于多种条件的活性的条件活性多肽的研发将导致条件活性多肽对个体体内的靶位的选择性提高。理想地，在仅存在条件中的一些的其它位置，条件活性多肽不具有活性或至少活性明显降低。在一个实施例中，在pH 6.2到6.8、葡萄糖浓度为0.05到0.5mM及乳酸盐浓度为30到50mg/dL时具有活性的条件活性多肽可特异性地递送到肿瘤微环境，这是因为这些条件皆存在于肿瘤微环境中。其它组织或器官可存在一或两个这些条件而非全部三个，由此不足以彻底地活化另一组织或器官中的条件活性多肽。举例来说，经锻炼肌肉可具有在6.2到6.8范围内的低pH。然而，其可能不具有另一分析条件。由此条件活性多肽在经锻炼肌肉中不具有活性或至少活性较低。

在一些实施例中，可采取步骤以确认条件活性多肽的活性真正地取决于用于选择条件活性多肽的条件。举例来说，选择取决于三个条件的条件活性多肽：pH6.2-6.8、葡萄糖浓度为0.05到0.5mM及乳酸盐浓度为30到50mg/dL。所选择的条件活性多肽可随后在三个条件中的各者下单独测试及在具有所述三个条件对的环境中测试，以确认条件活性多肽在这些测试条件或环境中不具有活性或活性较低。

在一些实施例中，可将血清的某些组分有目的地降到最低或自分析培养基中省略。举例来说，当筛选抗体时，与抗体结合或吸附抗体的血清组分可在分析培养基中降到最低或自其省略。这类结合抗体可产生伪阳性，从而包含结合突变抗体，其不具有条件活性而仅在多种不同条件下结合到存在于血清中的组分。因此，谨慎选择分析组分以使可潜在地与分析中的突变体结合的组分降到最低或省略，这可用于降低由于在分析中结合到除所需结合配偶体以外的组分而无意地鉴别为条件活性为阳性的非功能性突变体数目。举例来说，在筛选倾向于与人类血清中的组分结合的突变多肽的一些实施例中，BSA可用于分析溶液中以便减小或消除由突变多肽与人类血清的组分结合所引起的伪阳性的可能性。在特定情况下还可进行其它类似替代以达成相同目标。

在一些实施例中，分析条件模拟细胞膜附近(例如细胞膜内部、细胞膜处或细胞膜外部)的环境或关节中的环境。当在细胞膜环选境中筛选时可影响结合活性的一些因素包含受体表达、内化、抗体药物复合物(ADC)性能等。

分析的形式可为任何熟习所属领域者已知的适合分析。实例包含ELISA、酶活性分析、活体外真实组织筛选(器官等)、组织切片、整个动物、细胞系及3D系统的使用。举例来说，适合的基于细胞的分析描述于WO 2013/040445中，基于组织的分析描述于US 7,993,271中，基于整个动物的筛选方法描述于US2010/0263599中，基于3D系统的筛选方法描述于US 2011/0143960中。

在一些实施例中，进化步骤可产生可同时具有除如上文所述的条件活性特征以外的其它所需特性的突变多肽。可进化的其它适合所需特性可包含结合活性、表达、人源化等。因此，本发明可用于产生条件活性多肽，所述条件活性多肽在这些其它所需特性中的至少一或多者中亦得到提高。

在一些实施例中，所选择条件活性多肽可使用本文中所公开的突变诱发技术中的一者在例如第二进化步骤中进一步突变，以提高所选择条件活性多肽的另一特性，例如结合活性、表达、人源化等。在第二进化步骤之后，可针对条件活性及改进特性筛选突变多肽。

在一些实施例中，在进化亲本多肽以产生突变多肽之后，选择第一条件活性多肽，相比于在正常生理条件中的第一活性，所述第一条件活性多肽在异常条件下的分析中表现出第一活性的增加。第一条件活性多肽可随后进一步经受一或多种额外进化、表达及选择步骤以选择至少第二条件活性多肽，(1)与在正常生理条件下的分析中的第二活性相比，所述第二条件活性多肽在异常条件下的分析中表现出第二活性增加，或(2)与第一条件活性多肽及/或亲本多肽相比，在异常条件下的第一活性与在正常生理条件下的第一活性之间的比率较大。与在正常生理条件下的各别活性相比，第二条件活性多肽在异常条件下可具有较高的第一活性及第二活性，以及与亲本多肽相比，在正常生理条件下可具有较低的第一活性及第二活性。

在某些实施例中，本发明旨在产生条件活性多肽，其具有异常条件下的活性与正常生理条件下的活性的较大活性比率(例如异常与正常生理条件之间的较大选择性)。异常条件下的活性与正常生理条件下的活性的比率或选择性可为至少约2:1、或至少约3:1、或至少约4:1、或至少约5:1、或至少约6:1、或至少约7:1、或至少约8:1、或至少约9:1、或至少约10:1、或至少约11:1、或至少约12:1、或至少约13:1、或至少约14:1、或至少约15:1、或至少约16:1、或至少约17:1、或至少约18:1、或至少约19:1、或至少约20:1、或至少约30:1、或至少约40:1、或至少约50:1、或至少约60:1、或至少约70:1、或至少约80:1、或至少约90:1或至少约100:1。

在一个实施例中，条件活性多肽为抗体，其可具有至少约5:1、或至少约6:1、或至少约7:1、或至少约8:1、或至少约9:1、或至少约10:1、或至少约15:1、或至少约20:1、或至少约40:1或至少约80:1的异常条件下的活性与正常生理条件下的活性之间的比率。在一个实施例中，条件活性多肽用于靶向肿瘤部位，其中条件活性多肽在肿瘤部位(在肿瘤微环境中)有活性，且在非肿瘤部位(正常生理条件)活性明显较低或无活性。

在一个实施例中，条件活性多肽为打算与另一试剂(例如本文中别处公开的那些试剂)共轭的抗体。条件活性抗体可具有异常条件下的活性与正常生理条件下的活性的较高比率。举例来说，将与另一试剂共轭的条件活性抗体可具有至少约10:1、或至少约11:1、或至少约12:1、或至少约13:1、或至少约14:1、或至少约15:1、或至少约16:1、或至少约17:1、或至少约18:1、或至少约19:1或至少约20:1的异常条件下的活性与正常生理条件下的活性的比率。当共轭试剂为例如毒性或放射性时这可尤其重要，这是因为此种共轭试剂宜集中于病症或治疗部位(其中存在异常条件)。

H.确定条件活性多肽的pI

在一些实施例中，使用上文所描述的技术中的任一者确认所选择条件活性多肽的pI低于亲本多肽的pI。举例来说，条件活性多肽的pI可低于亲本多肽的pI至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.8、或至少1.0、或至少1.2、或至少1.4、或至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少2.5、或至少3.0、或至少3.5、或至少4.0个单位或低于亲本多肽的pI至少5.0个单位。

I.条件活性多肽

在另一方面中，本发明提供pI低于亲本多肽的pI的条件活性多肽。相比于相同突变多肽在相对应正常生理条件下的相同活性，条件活性多肽具有在从正常生理条件偏离的异常条件下的增加活性，且还可任选地具有，

(a)与在相同异常条件下的亲本多肽的相同活性相比，在从正常生理条件偏离的异常条件下的增加活性，

(b)与在相同正常生理条件下的亲本多肽的相同活性相比，在正常生理条件下的降低活性，或

(c)上文(a)及(b)的组合。

条件活性多肽在正常生理条件下可以可逆或不可逆地失活，而在异常条件下具有活性。在一些实施例中，这些条件活性多肽在异常条件下的活性可等于或高于在正常生理条件下的亲本多肽的活性。

条件活性多肽对于研发在宿主体内有限时间段有效的疗法尤其有价值。此在治疗的延长作用将对宿主有害，但需要有限的活性以执行所需治疗的情况下尤其有价值。有益应用的实例包含局部或全身性治疗以及局域化治疗。条件活性多肽的一个优势为由于其潜在地减小有害副作用的能力，其能够在治疗性应用中使用较高剂量。在正常生理条件下的失活可用于减小有害副作用。

在正常生理条件下的失活可由投药及多肽的失活速率的组合来确定。这基于条件的失活对于酶疗法尤其重要，所述疗法可在相对短时间段内造成显著负面的副作用。

条件活性多肽亦可随时间推移可逆或不可逆地活化或失活，或仅当其位于体内特定微环境(包含在体内特定器官中)时活化或失活。示范性微环境可包含(但不限于)肿瘤、滑液及膀胱或肾脏的微环境。

在一些实施例中，条件活性多肽为如本文所描述的针对一或多种靶抗原的抗体或抗体片段。

异常条件及正常生理条件如上文所论述且可为选自温度、pH、渗透压、渗透压度、氧化应激、电解质浓度以及两种或大于两种此类条件的组合的条件。在一些实施例中，条件为pH且条件活性多肽具有pH依赖性的活性。具体地说，与在正常生理pH下相比，条件活性多肽在异常pH下具有增加的活性。

在一个方面，本发明涉及条件活性多肽，其在pKa在所需活性的pH的0.5、1、1.5、2、2.5、3或4个单位内的物种存在的情况下具有pH依赖性活性。在另一方面，本发明涉及条件活性多肽，其在pKa为约4到约10、或约4.5到约9.5或约5到约9、或约5.5到约8或约6.0到约7.0的物种存在的情况下具有pH依赖性活性。

存在于分析培养基中的对条件活性多肽的活性具有显著影响的物种往往为具有至少两种电离状态的物种：不带电荷或带电荷较少的状态及带电荷或带电荷较多的状态。因此，影响条件活性多肽的活性的物种的pKa可在确定物种将在特定pH下对多肽的特定活性的影响程度中起作用。

在另一方面中，本发明涉及条件活性多肽，其在选自组氨酸、组胺、氢化二磷酸腺苷、氢化三磷酸腺苷、柠檬酸盐、碳酸氢盐、醋酸盐、乳酸盐、二硫化物、硫化氢、铵、磷酸二氢盐及其任何组合的物种存在的情况下具有pH依赖性活性。在一些实施例中，相比于在第一不同pH下，pH依赖性条件活性多肽在第二pH下具有较高活性，所述两种活性在这些物种存在下的分析中经测量。为确定条件活性多肽的pH依赖性，在相同分析培养基中以两种不同pH值分析多肽的相同活性。

在相同分析培养基中，第二pH下的活性与第一pH下的相同活性的比率称为pH依赖性条件活性多肽的选择性。pH依赖性条件活性多肽具有至少约1.3、或至少约1.5、或至少约1.7、或至少约2.0、或至少约3.0、或至少约4.0、或至少约6.0、或至少约8.0、或至少约10.0、或至少约20.0、或至少约40.0、或至少约60.0或至少约100.0的选择性。

已观察到，与衍生条件活性多肽的亲本多肽的氨基酸残基相比，通常地pH依赖性条件活性多肽含有增加数目(或比例)的带电氨基酸残基。存在三种带正电荷氨基酸残基：赖氨酸、精氨酸及组氨酸；及两种带负电荷氨基酸残基：天冬氨酸及谷氨酸。在一些实施例中，与衍生pH依赖性条件活性多肽的亲本多肽相比，这些带电氨基酸残基在pH依赖性条件活性多肽中过度表达。因此，pH依赖性条件活性多肽更可能在分析培养基中与带电物种交互作用，这是因为带电氨基酸残基的数目相对于亲本多肽已增加。这又影响条件活性多肽的活性。

同样已观测到，在分析培养基中存在不同物质的情况下，pH依赖性条件活性多肽通常具有不同活性。取决于其pKa值，具有至少两种电离状态(不带电荷或带电荷较少的状态及带电荷或带电荷较多的状态)的物种可在特定pH下更大程度地分解，从而增加与存在于条件活性多肽中的带电氨基酸残基进行交互作用的概率。此特征可用于增强条件活性多肽的选择性及/或pH依赖性活性。

条件活性多肽上的电荷性质可为用于确定影响条件活性多肽的活性的适合物种的一个因素。在一些实施例中，与亲本多肽相比，条件活性多肽可具有更多带正电荷氨基酸残基：赖氨酸、精氨酸及组氨酸。替代地，与亲本多肽相比，条件活性多肽可具有更多带负电荷氨基酸残基：天冬氨酸及谷氨酸。因此，条件活性多肽可经选择以与存在于所需活性的环境中的特定物种进行所需程度的交互作用及/或与存在于需要经降低活性的环境中的特定物种进行所需程度的交互作用。

pH依赖性条件活性多肽上的带电荷氨基酸残基的位置亦可对条件活性多肽的活性有影响。举例来说，带电荷氨基酸残基接近条件活性多肽的结合位点可影响多肽的结合活性。

在一些实施例中，带电荷环境物种与条件活性多肽的交互作用可阻断或妨碍pH依赖性条件活性多肽的活性。举例来说，与带电荷环境物种进行交互作用的带电荷氨基酸可在条件活性多肽的结合位点上表现变构效应。

在其它实施例中，带电荷环境物种与条件活性多肽的交互作用可在多肽上的不同部分(尤其带电荷或极化部分)之间形成盐桥。已知盐桥的形成以稳定多肽结构(Donald等人，“盐桥：在几何上特别的可设计交互作用(Salt Bridges:Geometrically Specific,Designable Interactions)”，蛋白质(Proteins)，79(3):898-915，2011；Hendsch等人，“盐桥能稳定蛋白质吗？连续的静电分析(Do salt bridges stabilize proteins？Acontinuum electrostatic analysis)”，蛋白质科学(Protein Science)，3:211-226，1994)。盐桥可稳定或固定蛋白质结构，其通常经历称为”呼吸”的恒定微小结构变化(Parak，“作用中的蛋白质：结构波动及构形变化的物理学(Proteins in action:thephysics of structural fluctuations and conformational changes)”，生物结构的当代观点(Curr Opin Struct Biol.)，13(5):552-557，2003)。蛋白质结构“呼吸”对蛋白质功能及其结合为重要的，此係因为结构性波动可准许蛋白质有效识别且与其配偶体结合(Karplus等人，“分子动力学及蛋白质功能(Molecular dynamics and proteinfunctions)”，PNAS，第102卷，第6679-6685页，2015)。通过形成盐桥，条件活性多肽上的结合位点(尤其结合袋)可不太可能进入其配偶体，这可能是因为盐桥可直接阻断配偶体进入结合位点或可减少蛋白质结构“呼吸”。即使盐桥远离结合位点，但盐桥的变构效应可更改结合位点的构形以抑制结合。因此，在盐桥稳定(固定)条件活性多肽的结构之后，多肽在结合到其配偶体时可变得不太有活性，导致活性降低。

具有由盐桥稳定的结构的多肽的一个已知实例为血红素。结构性及化学研究已揭露，至少两组化学基团对血红素中的盐桥负责：组氨酸β146及α122的氨基端及侧链，其具有接近pH 7的pKa值。在去氧血红素中，β146的末端羧酸酯基团与另一αβ二聚体的α次单位中的赖氨酸残基形成盐桥。此交互作用将组氨酸β146的侧链锁定在其可参与相同链中具有带负电荷天冬氨酸94的盐桥的位置上，前提是组氨酸残基的咪唑基经质子化(图1)。在高pH下，组氨酸β146的侧链不经质子化且盐桥不会形成。然而，当pH下降时，组氨酸β146的侧链变得质子化且在组氨酸β146与天冬氨酸β94之间形成盐桥，由此稳定去氧血红素的四级结构，导致在活性代谢组织(较低pH)释放氧的更大倾向。血红素对氧展示pH依赖性结合活性，因此在低pH下，针对氧的结合活性由于盐桥的形成而降低。另一方面，在高pH下，针对氧的结合活性由于缺失这些盐桥而增加。

类似地，例如碳酸氢根离子的离子可通过在条件活性多肽中形成盐桥来降低条件活性多肽与其配偶体的结合活性。举例来说，在大于碳酸氢根离子的pKa的pH下，碳酸氢根离子带负电荷。带负电荷的碳酸氢根离子可在条件活性多肽上的带正电荷部分或极性部分之间形成盐桥。这些盐桥可阻断或减少条件活性多肽与其配偶体的结合。在低于其pKa 6.4的pH下，碳酸氢根离子经质子化且因此经中和。不带电荷的碳酸氢根不能够形成盐桥，且因此不会以此方式影响条件活性多肽与其配偶体的结合。在此情境下，相比于在大于6.4的较高pH下，条件活性多肽可在低于碳酸氢根的pKa 6.4的pH下与其配偶体具有较高结合活性。在此实例中，条件活性多肽在碳酸氢根离子存在的情况下为条件活性，即表现出pH依赖性活性。

当分析培养基中不存在例如碳酸氢盐的物种时，条件活性多肽可失去其条件活性。此可能由于在条件性活性多肽上缺乏盐桥以稳定(固定)多肽的结构。因此，在缺乏碳酸氢盐的情况下，结合配偶体可在任何pH下对条件活性多肽上的结合位点具有类似进入水准，由此在任何pH下产生类似活性及消除条件活性。

在其它实施例中，小分子或离子与条件活性多肽之间的交互作用可以改变其活性的方式改变多肽的结构。举例来说，结构中的改变可通过改变结合位点的位置、位阻或结合能来提升条件活性多肽的结合亲和力。在此类情况下，可能需要选择在所需活性的pH下与条件活性多肽结合的小分子或离子。

应理解，尽管盐桥(离子键)为化合物及离子影响条件活性多肽的活性的最强效且最常见方式，但此类化合物及离子与条件活性多肽之间的其它交互作用亦可有助于稳定或固定条件活性多肽的结构。此类其它交互作用包含氢键、疏水性交互作用及凡得瓦交互作用。

在一些实施例中，为选择适合的化合物或离子，将条件活性多肽与进化其的亲本多肽进行比较，以确定条件活性多肽是否具有较高比例的带负电荷氨基酸残基或带正电荷氨基酸残基。分别在所需活性的pH及正常生理pH下具有适合的电荷的化合物或离子可随后基于其大小及pKa值来选择，以用于影响条件活性多肽的活性。举例来说，当条件活性多肽具有比亲本多肽更高比例的带正电荷氨基酸残基时，适合的小分子或离子应通常在正常生理pH下带负电荷以与条件活性多肽交互作用，且应在所需活性的pH下为中性的。另一方面，当条件活性多肽具有比亲本多肽更高比例的带负电荷氨基酸残基时，适合的小分子或离子应通常在正常生理pH下带正电荷以与条件活性多肽交互作用，且在所需活性的pH下为中性的。

在其它实施例中，条件活性多肽的活性受小分子或离子与作为条件活性多肽的结合配偶体的靶多肽的交互作用的控制。在此情况下，除目标为在小分子或离子与靶多肽之间形成交互作用之外，如上文所论述的相同原理同样为可适用的。靶多肽可为例如条件活性抗体的抗原或条件活性受体的配位体。

适合的小分子或离子可为任何无机或有机化合物或离子，其从在所需活性的pH下的不带电荷或带电荷较少的状态转变到在正常生理pH下的带电荷或带较多电荷的状态。因此，小分子或离子应通常具有在所需活性的pH与正常生理pH之间的pKa。举例来说，碳酸氢盐具有6.4的pKa。因此，在例如pH 7.4下，带负电荷碳酸氢盐将与条件活性多肽中的带电荷氨基酸残基结合且降低活性。另一方面，在例如pH 6.0的较低pH下，带较少电荷的碳酸氢盐将不以相同数量与条件活性多肽结合，且因此允许条件活性多肽的更高活性。

二硫化物具有pKa 7.05。因此，在例如pH 7.4的正常生理pH下，带较多负电荷的二硫化物将与条件活性多肽中的带正电荷氨基酸残基结合且降低其活性。另一方面，在例如pH 6.2到6.8的较低pH下，带较少电荷的硫化氢/二硫化物将不以相同水准与条件活性多肽结合，且因此允许条件活性多肽的更高活性。

具有所需活性的pH与正常生理pH之间的pKa的小分子或离子优选用于本发明中。优选的物种选自二硫化物、硫化氢、组氨酸、组胺、柠檬酸盐、碳酸氢盐、醋酸盐及乳酸盐。这些小分子或离子中的各者的pKa在6.2与7.0之间。此外，还可使用其它小分子，例如麦黄酮(pKa 8.05)及二甘氨酸(pKa 8.26)。其它适合的小分子或离子可发现于教科书中，例如由CRC出版的CRC化学与物理手册(CRC Handbook of Chemistry and Physics)，第96版，2015及使用本申请案的原理的化学性质手册(Chemical Properties Handbook)，麦格劳希尔教育出版社(McGraw-Hill Education)，1998中。

分析培养基或环境中的小分子或离子的浓度优选地为处于或接近个体内小分子或离子的生理浓度。举例来说，人类血清内的碳酸氢盐的生理浓度在15到30mM的范围内。因此，分析培养基中的碳酸氢盐浓度可为10mM到40mM、或15mM到30mM、或20mM到25mM或约20mM。分析培养基中的二硫化物浓度可为3到500nM、或5到200nM、或10到100nM或10到50nM。

在本发明中，以一定浓度选择及使用条件活性多肽，借此环境中的特定物种的正常生理浓度将对条件活性多肽在所关注的pH范围内的活性有显著影响。因此，在许多治疗处理中，对于血液或人类血清的约pH 7.2到7.4的条件活性多肽，具有低活性可为有利的，以允许经由血流递送治疗性处理同时最小化或防止条件活性多肽活化。因此，对于这类处理，选择pKa低于pH 7.2到7.4的小分子或离子将为有利的，以便确保在血流pH下足够量的小分子电离以对条件活性多肽的活性有显著影响。同时，小分子或离子的pKa应等于或高于所需条件活性多肽的活性的pH，以便确保通过质子化小分子或离子来活化条件活性多肽，从而释放条件活性多肽上的结合位点。

分子或离子优选地具有低分子量及/或相对较小构形以通过最小化位阻来确保最大化进入靶多肽或条件活性多肽上的小袋。出于这个原因，小分子或离子通常具有低于900a.m.u.、或更优选低于500a.m.u.、或更优选低于200a.m.u.或甚到更优选地低于100a.m.u.的分子量。举例来说，硫化氢、二硫化物及碳酸氢盐皆具有低分子量及小结构，所述小结构提供进入靶多肽或条件活性多肽上的小袋，如下文中实例13及14中示出。

小分子或离子可以大体上相同的浓度存在于用于选择条件活性的分析或环境中，例如约20μM的碳酸氢盐。在一些实施例中，小分子或离子可以不同浓度存在于不同环境中且因此可能需要在分析中模拟这种情形。举例来说，二硫化物在肿瘤微环境中比在人类血清中具有更高浓度。因此，第二分析可模拟具有酸性pH及更高浓度的二硫化物的肿瘤微环境，而第一分析可模拟具有中性或略微碱性pH及较低浓度的二硫化物的人类血清。酸性pH可在6.0到6.8的范围内而中性或略微碱性pH可为约7.4。用于模拟肿瘤微环境的第二分析的更高浓度的二硫化物可为30μM，而用于模拟人类血清的第一分析的较低浓度的二硫化物可为10μM或更低，或5μM。

在一些实施例中，当两种或大于两种不同小分子及/或离子(例如碳酸氢盐及组氨酸的组合)存在时，条件活性多肽为pH依赖性。

当小分子或离子不存在时，条件活性多肽可失去其pH依赖性。因此，在缺乏小分子或离子的情况下，条件活性多肽可在所需活性的异常pH与正常生理pH之间具有相似活性。

在一些实施例中，所需活性的异常pH为酸性pH，而正常生理pH为碱性或中性pH。举例来说，异常pH可为在约5.5到7.2、或约6.0到7.0、或约6.2到6.8范围内的pH。正常生理pH可为在大于7.2到低于7.6范围内的pH。在酸性pH下更有活性且在碱性或中性pH下活性较低的条件活性多肽可靶向肿瘤微环境，其中异常pH为约5.5到7.2或约6.2到6.8的酸性。

在其它实施例中，所需活性的异常pH为碱性pH，而正常生理pH为酸性或中性pH。举例来说，pH依赖性多肽更有活性的异常pH可为例如7.6到7.9的碱性pH，例如在滑液中，(参见Jebens等人，“关于滑液的粘度及pH和血液的pH(On the viscosity and pH ofsynovial fluid and pH of blood)”，骨与关节外科杂志(Journal of Bone and JointSurgery)，第41B卷，第388-400页，1959)。正常生理pH可为大于7.2到低于7.6的血液pH，在所述pH下条件活性多肽为较低活性。这些条件活性多肽可适用于靶向关节疾病及关节发炎。

在其它实施例中，条件活性多肽可设计成靶向大脑。在血脑屏障两侧存在pH差异，其中大脑侧上的pH低于血液或人类血清的pH约0.2个pH单位。因此，条件活性多肽更有活性的大脑异常pH可为约7.0到7.2(大脑pH)，而正常生理pH可为大于7.2到低于7.6。

条件活性多肽可为酶、细胞因子、受体(尤其细胞受体)、调节多肽、可溶多肽、抗体或激素。

条件活性多肽可为亲本多肽的片段。举例来说，条件活性多肽可为抗体片段、单链抗体、酶片段、受体片段、细胞因子片段或激素片段。抗体片段可为抗体的Fc片段。

Fc片段可用作亲本多肽，以用于产生条件活性Fc片段。Fc片段与互补序列的结合可用于提供抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。异常pH可为5.5到7.2或6.2到6.8的范围内的酸性，例如肿瘤微环境中的pH，而正常生理pH在大于7.2到低于7.6的范围内。异常pH不同于溶酶体中的pH，在所述溶酶体中pH通常为约4.0。此外，溶酶体为Fc片段(如任何其它多肽)经靶向用于降解的位置。在溶酶体中不存在互补序列及无细胞介导的细胞毒性经由溶酶体而引起。

条件活性多肽可具有两个功能域，其中至少一个(优选地两个)功能域具有pH依赖性活性。这些两个功能域可同时进化且可以识别同一突变多肽中的两个功能域的方式来执行选择。替代地，两个功能域可各自进化且经选择。在此情况下，两个功能域可稠合到嵌合多肽中。

在一个方面，在例如蛋白质的因素存在的情况下，条件活性多肽展示与亲本多肽相比在所需活性的异常pH下活性增加，及与亲本多肽相比在正常生理pH下活性降低。蛋白质可为存在于血液、人类血清或身体的微环境(例如肿瘤微环境、发炎区域、滑液、大脑等)中的蛋白质。一种适合的蛋白质可为白蛋白，尤其哺乳动物白蛋白，例如牛白蛋白或人类白蛋白。

在一个方面，例如白蛋白的蛋白质存在于用于筛选及选择条件活性多肽的分析溶液中。在另一方面，具有例如白蛋白的蛋白质的分析溶液亦可用于在相同或不同条件下测试所选择条件活性多肽的活性。

J.条件活性多肽的工程化

可使用WO 2017/078839中名称为“条件活性多肽的工程化(Engineering ofconditionally active polypeptides)”、“工程化掩盖活性多肽(Engineering maskedconditionally active polypeptide)”及“条件活性抗体的工程化(Engineering ofconditionally active antibodies)”的章节中描述的方法中的任一者来进一步工程化本发明的所选择条件活性多肽。此外，如WO 2017/078839中所描述，本发明的条件活性多肽及经工程化的条件活性多肽可插入到作为溶瘤病毒的病毒颗粒中。

K.条件活性多肽的生产

可使用WO 2017/078839中名称为“条件活性多肽的生产(Production of theConditionally Active polypeptides)”的章节中描述的方法来产生本发明的所选择条件活性多肽及经工程化的条件活性多肽，以用于治疗用途、预防用途、诊断用途、研究及相关目的。

G.医药组合物

包括条件活性多肽或经工程化的条件活性多肽的医药组合物以及这种医药组合物的用途描述于WO 2017/078839中。本发明延伸到含有条件活性多肽或条件活性多肽的另一工程化版的医药组合物，其可用于治疗、预防及诊断应用。

L.条件活性多肽的用途

本发明还包含用于实体肿瘤、发炎关节或脑部疾病或病症的治疗性或防治性治疗的条件活性多肽的用途。

本发明的范围还包含通过向需要所述治疗的患者给予本发明的条件活性多肽来治疗实体肿瘤、发炎关节或脑部疾病或病症的方法。

必须注意，除非上下文另外明确说明，否则如本文及随附权利要求书所用的单数形式“一(a/an)”及“所述(the)”包含多个参考物。此外，术语“一(a或an)”、“一或多个”及“至少一个”可在本文中互换使用。术语“包括”、“包含”、“具有”及“由…构建”也可互换使用。

除非另外指示，否则说明书及权利要求书中使用的表达成分数量、特性(例如分子量、百分比、比率、反应条件等)的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰，无论术语“约”是否存在。因此，除非有相反指示，否则说明书及权利要求书中所阐述的数值参数为近似值，其可视本发明设法获得的所需特性而变化。至少且不试图将等效物原则的应用限制于权利要求书的范围，各数值参数至少应根据所报告的有效数字的个数且通过应用普通舍入技术来解释。尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围及参数为近似值，但尽可能精确地报导特定实例中所阐述的数值。然而，任何数值均固有地含有因其各别测试测量值中发现的标准差所必然引起的某些误差。

应理解，本文所公开的各组分、化合物、取代基或参数应解释为单独或与本文所公开的每一种其它组分、化合物、取代基或参数中的一或多者组合使用来进行公开。

同样应理解，本文所公开的各组分、化合物、取代基或参数的各量/值或量/值范围应解释为也与针对本文公开的任何其它组分、化合物、取代基或参数所公开的各量/值或量/值范围组合进行公开，且因此两种或更多种本文所公开的组分、化合物、取代基或参数的量/值或量/值范围的任何组合也出于本说明书的目的彼此组合进行公开。

应进一步理解，本文中所公开的各范围应解释为公开具有相同数目的有效数字的所公开范围内的各特定值。因此，1到4的范围应解释为表示值1、2、3及4的公开内容。应进一步理解，本文所公开的各范围的各下限应解释为与在本文所公开的相同组分、化合物、取代基或参数的各范围内的各上限及各范围内的各特定值组合进行公开。因此，本发明应解释为通过将各范围的各下限与各范围的各上限或与各范围内的各特定值组合或通过将各范围的各上限与各范围内的各特定值组合所导出的所有范围的公开内容。

此外，本说明书或实例中所公开的组分、化合物、取代基或参数的特定量/值应解释为范围的下限或上限的公开内容，且因此可与范围的任何其它下限或上限或本申请案中别处所公开的相同组分、化合物、取代基或参数的特定量/值组合，以形成组分、化合物、取代基或参数的范围。

本文中提及的所有文献均以全文引用的方式并入本文中，或者提供其特定依赖的本发明。本申请人并不打算将任何所公开的实施例均贡献于公众，且达到任何所公开的修饰或变化字面上均不属于权利要求书的范围内，但其在等效物原则下视为其一部分的程度。

然而，应了解，尽管已于先前描述中连同本发明的结构及功能的细节一起阐述本发明的许多特征及优势，但本发明仅为示范性的，且可详细地作出改变，尤其关于本发明的原理内的部分的形状、大小及布置，以最大程度地通过表达所附权利要求书的术语的广泛一般含义指示。

Claims (51)

1.一种自亲本多肽产生条件活性多肽的方法，其包括以下步骤：

(i)通过将一或多个突变引入到所述亲本多肽中来进化所述亲本多肽以产生pI等于或低于所述亲本多肽的pI的一或多个突变多肽；

(ii)使所述一或多个突变多肽经受正常生理条件下的第一分析以测量所述一或多个突变多肽在所述正常生理条件下的活性，及使所述一或多个突变多肽经受异常条件下的第二分析以测量所述一或多个突变多肽在所述异常条件下的活性，其中所述正常生理条件及所述异常条件为相同条件但具有不同值；以及

(iii)从所述一或多个突变多肽中选择所述条件活性多肽，相比于在所述第一分析中的相同活性，所述条件活性多肽在所述第二分析中表现出增加的活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述条件活性多肽的pI低于所述亲本多肽的所述pI。

3.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法，其中所述条件活性多肽具有低于7.4的pI、或低于7.3的pI、或低于7.2的pI、或低于7.1的pI或低于7.0的pI。

4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多个突变包括针对所述亲本多肽中的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基的氨基酸取代，所述氨基酸残基的pI比取代到所述亲本多肽中的所述氨基酸的pI高。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述一或多个突变包括所述取代中的2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。

6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多个突变包括至少一个氨基酸残基的插入，所述氨基酸残基的pI低于所述亲本多肽的所述pI。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述一或多个突变包括所述插入中的2、3、4或5个插入。

8.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多个突变包括至少一个氨基酸残基的缺失，所述氨基酸残基的pI高于所述亲本多肽的所述pI。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述一或多个突变包括所述缺失中的2、3、4或5个缺失。

10.根据权利要求1到9中任一权利要求所述的方法，其中所述突变中的一或多个突变定位于暴露在所述突变多肽的表面上的位置中。

11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的方法，其中所述进化步骤包括将一或多个额外突变引入到所述突变多肽中。

12.根据权利要求1到11中任一权利要求所述的方法，其进一步包括步骤(ii)之前的用于确定至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少98％的所述突变多肽的pI等于或低于所述亲本多肽的所述pI的步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括在步骤(ii)之前舍弃pI大于所述亲本多肽的所述pI的突变多肽的步骤。

14.根据权利要求1到13中任一权利要求所述的方法，其进一步包括测量所述条件活性多肽的pI的步骤。

15.根据权利要求1到14中任一权利要求所述的方法，其中所述条件活性多肽的所述pI低于所述亲本多肽的所述pI至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.8、或至少1.0、或至少1.2、或至少1.4、或至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少2.5、或至少3.0、或至少3.5、或至少4.0、或至少5.0个单位。

16.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的方法，其中所述亲本多肽选自抗体、酶、激素、生长因子、细胞因子、调节蛋白、功能肽、生物类似物、免疫调节剂、受体及配位体。

17.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的方法，其中所述亲本多肽为选自全长抗体、单链抗体、抗体片段、重链、轻链、Fab及Fc域的抗体。

18.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的方法，其中所述亲本多肽为治疗性抗体或研发用于医疗用途的候选抗体。

19.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的方法，其中所述亲本多肽为IgG抗体。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述一或多个突变处于所述IgG抗体的可变区。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述一或多个突变处于所述IgG抗体的恒定区。

22.根据权利要求19所述的方法，其中所述一或多个突变处于一或多个所述IgG抗体的互补决定区。

23.根据权利要求1到22中任一权利要求所述的方法，其中所述条件选自pH、温度、渗透压、渗透压度、氧化应激及电解质浓度。

24.根据权利要求1到22中任一权利要求所述的方法，其中所述条件为pH。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一分析的所述pH大于7.2到小于7.6，且所述第二分析的所述pH小于7.2或大于7.6。

26.根据权利要求1到25中任一权利要求所述的方法，其中所述条件活性多肽在所述第二分析中的所述活性与在所述第一分析中的相同活性的比率为至少1.3、或1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少3.0、或至少4.0、或至少6.0、或至少8.0、或至少10.0、或至少20.0、或至少40.0、或至少60.0或至少100.0。

27.根据权利要求1到26中任一权利要求所述的方法，其中所述第一分析及所述第二分析皆在分子量小于900a.m.u.、小于500a.m.u.、小于200a.m.u.或小于100a.m.u.的分子或离子存在的情况下执行。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述分子或离子选自组氨酸、组胺、氢化二磷酸腺苷、氢化三磷酸腺苷、柠檬酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、乳酸盐、二硫化物、硫化氢、铵、磷酸二氢盐及其任何组合。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述分子或离子为浓度在约3mM到约200mM、约5mM到约150mM、约5mM到约100mM、约10mM到约100mM、约20mM到约100mM、约25mM到约100mM、约30mM到约100mM、约35mM到约100mM、约40mM到约100mM或约50mM到约100mM的范围内的碳酸氢根离子。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述分子或离子为浓度在1mM到100mM、2nM到500nM、3nM到200nM、5nM到100nM的范围内的二硫化物离子。

31.根据权利要求27所述的方法，其中所述分子或离子选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、二硫化钠或二硫化钾。

32.根据权利要求27到31中任一权利要求所述的方法，其中所述生理条件为正常生理pH且所述异常条件为与所述正常生理pH不同的异常pH，且所述分子或离子具有在所述正常生理pH与所述异常pH之间的pKa。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述分子或离子的所述pKa距离所述异常pH至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8或1.0、2.0个单位。

34.一种衍生自具有pI的亲本多肽的条件活性多肽，所述条件活性多肽具有：

a.等于或低于所述亲本多肽的所述pI的pI；以及

b.在异常条件下的第二分析中的活性与在正常生理条件下的第一分析中的相同活性的比率为至少1.3，

其中所述条件活性多肽的所述活性在至少一种分子量小于900a.m.u.的分子或离子存在的情况下测量。

35.根据权利要求34所述的条件活性多肽，其中所述分子量小于500a.m.u.、小于200a.m.u.或小于100a.m.u.。

36.根据权利要求34到35中任一权利要求所述的条件活性多肽，其中在异常条件下的所述第二分析中的所述活性与在所述正常生理条件下的所述第一分析中的相同活性的比率为至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少3.0、或至少4.0、或至少6.0、或至少8.0、或至少10.0、或至少20.0、或至少40.0、或至少60.0、或至少100.0。

37.根据权利要求34到36中任一权利要求所述的条件活性多肽，其中所述条件活性多肽的所述pI低于所述亲本多肽的所述pI至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.8、或至少1.0、或至少1.2、或至少1.4、或至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少2.5、或至少3.0、或至少3.5、或至少4.0、或至少5.0个单位。

38.根据权利要求34到37中任一权利要求所述的条件活性多肽，其中所述条件活性多肽选自抗体、酶、激素、生长因子、细胞因子、调节蛋白、功能肽、生物类似物、免疫调节剂、受体及配位体。

39.根据权利要求34到37中任一权利要求所述的条件活性多肽，其中所述条件活性多肽为选自全长抗体、单链抗体、抗体片段、重链、轻链、Fab及Fc域的抗体。

40.根据权利要求39所述的条件活性多肽，其中所述抗体为IgG抗体。

41.根据权利要求34到40中任一权利要求所述的条件活性多肽，其中所述条件选自pH、温度、渗透压、渗透压度、氧化应激及电解质浓度。

42.根据权利要求34到40中任一权利要求所述的条件活性多肽，其中所述正常生理条件为在大于7.2到小于7.6范围内的pH，且所述异常条件为在5.5到小于7.2范围内的pH。

43.根据权利要求42所述的条件活性多肽，其中所述分子或离子具有在所述正常生理pH与所述异常pH之间的pKa。

44.根据权利要求43所述的条件活性多肽，其中所述分子或离子的所述pKa距离所述异常pH至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8或1.0、2.0个单位。

45.根据权利要求34到44中任一权利要求所述的条件活性多肽，其中所述分子或离子选自组氨酸、组胺、氢化二磷酸腺苷、氢化三磷酸腺苷、柠檬酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、乳酸盐、二硫化物、硫化氢、铵、磷酸二氢盐及其任何组合。

46.根据权利要求34到44中任一权利要求所述的条件活性多肽，其中所述分子或离子为浓度在约3mM到约200mM、约5mM到约150mM、约5mM到约100mM、约10mM到约100mM、约20mM到约100mM、约25mM到约100mM、约30mM到约100mM、约35mM到约100mM、约40mM到约100mM或约50mM到约100mM的范围内的碳酸氢根离子。

47.根据权利要求34到44中任一权利要求所述的条件活性多肽，其中所述分子或离子为浓度在1mM到100mM、2nM到500nM、3nM到200nM、5nM到100nM的范围内的二硫化物离子。

48.根据权利要求34到44中任一权利要求所述的条件活性多肽，其中所述分子或离子选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、二硫化钠或二硫化钾。

49.一种医药组合物，其包括有效量的根据权利要求34到48中任一权利要求所述的所述条件活性多肽及药学上可接受的载剂。

50.一种根据权利要求34到48中任一权利要求所述的条件活性多肽的用途，其用于治疗实体肿瘤、发炎关节或脑部疾病或病症。

51.一种治疗实体肿瘤、发炎关节或脑部疾病或病症的方法，其包括向需要所述治疗的患者给予根据权利要求34到48中任一权利要求所述的条件活性多肽。

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