KR20210039970A - 비만의 예방, 치료 또는 개선용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HN001 균주 및 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) HN002 균주에 관한 것으로, 상기 균주 및 이의 배양액이 나타내는 항비만 효과에 따라, 본 발명에서는 상기 균주 또는 이들의 배양액을 비만의 예방, 치료 또는 개선 용도를 제공한다.
Description
본 발명은 비만의 예방, 치료 또는 개선 효과를 가지는 신규 비피도박테리움 롱검 균주 및 비피도박테리움 비피둠 균주, 그리고 이들의 용도에 관한 것이다.
생활수준의 향상으로 인해 현대사회는 지방과 당분의 섭취는 늘고 섬유질의 섭취는 줄어든 식사 문화가 정착되고 있으며, 특히 외식 문화가 발달함에 따라 고단백 위주의 식단 선호 현상이 두드러지고 있다. 그럼에도 오히려 육체적 활동은 줄어드는 방향으로 현대인의 생활 습관이 변화하고 있으며, 이에 따라 비만 인구가 급속히 늘고 있는 것이 현실이다. 고열량 식품의 섭취가 증가하고 섬유질 섭취가 줄어들면서 비만, 특히 복부 비만이 사회적으로 심각한 문제로 떠오르고 있다. 비만은 지방조직이 과잉 증가한 상태를 말하며 비만에 의한 체중의 증가는 에너지 대사의 불균형을 통한 지방의 증가에 기인한다고 할 수 있다.
비만의 유해성은 비만 그 자체로 지방조직에 의한 복부의 압박으로 인하여 변비와 소화불량, 위장장해 등을 일으키는 경우가 많을 뿐만 아니라, 이로 인해 많은 성인병들의 위험요소가 된다는데 문제가 있다. 비만은 당뇨, 고혈압, 관상동맥질환 및 암과의 직접적으로 연관되어 있는 것으로 알려져 있으며 WHO에서는 비만을 21세기 만성질환으로 규정하고 있다. 국내 성인의 유병률은 2030년에 50% 이상까지 급증하리라 예상하고 있으며 따라서 국가 및 개인적 경제부담이 크게 증가할 것으로 분석된다. 이에 국내외에서 비만을 예방하고 치료하는 연구에 많은 관심과 투자가 이루어지고 있다.
지방세포는 백색 지방세포(white adipose tissue)와 갈색 지방세포(brown adipose tissue)로 나뉘는데, 백색 지방세포는 에너지를 저장하는 역할을 하는 세포로 트리글리세리드와 같은 지질 성분이 백색 지방세포에 축적되어 저장될 수 있다. 갈색 지방세포는 에너지를 소모하여 열을 발생시키고 지방을 연소시키는 특성이 있는 지방세포로, 비만의 측면에서 백색 지방세포와 정반대의 역할과 기능을 하는 지방세포이다. 따라서, 체내에 존재하는 백색 지방세포를 에너지를 소비하며 열 항상성을 유지하는 갈색 지방세포로 전환시키는 갈색지방화(browning)은 이미 형성된 비만을 치료, 개선할 수 있으며 백색 지방세포의 형성 대신 갈색 지방세포의 형성을 유도할 수 있다면 비만의 예방 효과를 달성할 수 있을 것으로 기대된다. 백색 지방세포는 또한 "beiging"이라고 하는 지방세포의 전환을 통해 갈색 지방세포와 유사한 기능과 활성을 보이는 베이지 지방세포로의 변화를 유도할 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 발명자는, 백색 지방세포의 형성을 저해하고 이를 베이지색 지방세포로 변화시키거나 갈색 지방세포로의 분화를 촉진할 수 있는 활성이 우수한 유산균을 새롭게 발명하고, 비만을 예방, 치료, 개선할 수 있는 유산균의 용도, 효과를 새롭게 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 종래 한국등록특허 제1778734호에서는 "비피도박테리움 롱검 KACC 91563으로부터 분리된 ESBP 및 이를 이용한 항알레르기 조성물"에 관한 발명이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1401530호에서는 "공액리놀레산을 생산하는 비피도박테리움 롱검 균주 및 그 용도"가 개시되어 유산균을 다른 기술 분야에 이용하고자 했던 연구 결과는 있었으나, 유산균 균주, 특히 비피도박테리움 롱검이나 비피도박테리움 비피둠으로 분류되는 유산균 균주를 이용하여 비만을 예방, 치료하고자 했던 연구 결과는 전혀 없었다.
본 발명은 체지방의 감소 효능이 우수하여, 항비만 활성이 있는 유산균 균주 또는 이의 배양액을 이용하여 비만을 예방하거나 치료하기 위한 용도의 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 유산균 균주 또는 이의 배양액을 이용하여 비만을 예방하거나 개선하기 위한 용도의 건강기능식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 유산균 균주 또는 이의 배양액을 이용하여 비만을 예방하거나 개선하기 위한 용도의 사료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면은, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 수탁번호 KCTC13936BP로 기탁된 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HN001 균주 및 수탁번호 KCTC13935BP로 기탁된 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) HN002 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HN001 균주 또는 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) HN002 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HN001 균주 또는 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) HN002 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HN001 균주 또는 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) HN002 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 유산균 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주 및 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) 균주는, 지방세포로 분화될 수 있는 3T3-L1과 같은 지방세포나 C3H10T1/2와 같은 중간엽 줄기세포에 처리되었을 때, 갈색 지방세포 또는 베이지색 지방세포의 형성을 촉진할 수 있는 활성이 있다. 백색 지방세포의 형성은 감소시키고 백색 지방세포의 갈색지방화(browning)를 촉진함에 따라, 상기 균주는 체중의 증가를 억제하거나 체내에 축적된 지질 성분을 감소시킬 수 있다. 또한, 이미 형성된 백색 지방세포를 갈색지방화시킬 수 있으므로, 단순히 지질 성분이나 체중을 감소시키기만 하는 것보다도 비만의 치료나 개선에 탁월한 효과가 있으며, 근본적으로 비만을 치료, 개선할 수 있다.
또한, 본 발명의 유산균 비피도박테리움 롱검과 비피도박테리움 비피둠 균주 또는 이들의 배양액을 개체에 투여하는 경우, 고지방식이의 섭취에 따른 체중 증가가 억제되고 발열 관련 유전자, 갈색지방/베이지색 지방세포 특이적 유전자의 발현량이 증가하며, 트리글리세리드, 콜레스테롤, LDL, HDL 등 지질 성분의 양이 감소하는 효과가 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 상기 균주들은 우수한 항비만 효과를 나타내며, 다른 비피도박테리움 롱검과 비피도박테리움 비피둠 균주들보다 이러한 효과가 탁월한 바, 비만의 예방이나 치료, 지질대사의 개선을 위한 식품, 의약품 또는 사료로 유용하게 사용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 3T3-L1 지방세포에 유산균 라이브러리로부터 얻은 다양한 유산균을 처리한 다음, ORO(Oil red O) 염색, TEM(Transmission Electronic Microscope) 관찰을 수행한 결과를 나타내며, 그 중에서도 우수한 효과를 나타낸 13번 균주(HN002 균주) 및 28번 균주(HN001 균주)의 결과를 나타낸다. 도 1의 A는 ORO 염색 결과를 나타낸 것이며, B는 이를 통해 측정한 트리글리세리드(TG)의 축적량을 비교하여 나타낸 그래프이다. 도 1의 C는 상기 3T3-L1 세포의 TEM 관찰 결과이다. PA는 pre-adipocyte, MDI는 MDI(methyl-isobutyl-xanthine, dexamethasone, insulin)만을 처리한 군, Rosi는 MDI와 함께 Rosiglitazone을 처리한 군을 의미한다.
도 2는 3T3-L1 지방세포 및 C3H10T1/2 마우스 중간엽 줄기세포에 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 균주(28번 균주) 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주(13번 균주)를 처리하고, qRT-PCR 및 웨스턴 블랏을 통해 열발생, 갈색 지방세포 마커의 발현량을 측정해 비교한 것이다. MDI는 MDI(methyl-isobutyl-xanthine, dexamethasone, insulin)만을 처리한 군, Rosi는 MDI와 함께 Rosiglitazone을 처리한 군을 의미한다.
도 3은 3T3-L1 지방세포 및 C3H10T1/2 마우스 중간엽 줄기세포에 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 균주및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주를 처리하고, qRT-PCR을 통해 베이지색 지방세포 마커와 백색 지방세포 마커의 발현량을 측정해 비교한 것이다. MDI는 MDI(methyl-isobutyl-xanthine, dexamethasone, insulin)만을 처리한 군, Rosi는 MDI와 함께 Rosiglitazone을 처리한 군을 의미한다.
도 4는 3T3-L1 지방세포에 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 균주(28번 균주) 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주(13번 균주)를 처리하고, qRT-PCR 및 웨스턴 블랏을 통해 지질 분해(lipolysis) 관련 마커의 발현량을 측정해 비교한 것이다. MDI는 MDI(methyl-isobutyl-xanthine, dexamethasone, insulin)만을 처리한 군, Rosi는 MDI와 함께 Rosiglitazone을 처리한 군을 의미한다.
도 5는 비만 유도 마우스 모델을 대상으로 한 항비만 효과 확인 실험 과정을 나타낸 그림이다. BS는 bacterial supernatant를, BP는 bacterial pellet을 의미한다.
도 6은 G1 내지 G7 각 군의 마우스의 체중 변화를 측정하여 비교한 그래프이다.
도 7은 G1 내지 G7 각 군의 마우스를 대상으로 H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 수행한 결과, 그리고 이를 바탕으로 지방세포의 크기를 측정해 비교한 그래프이다.
도 8은 G1 내지 G7 각 군의 마우스의 각 기관 무게를 측정하여 비교한 그래프이다.
도 9a는 G1 내지 G7 각 군의 마우스의 지방세포에 발현되는 열발생 관련 마커의 발현을 qRT-PCR을 통해 측정하여 비교한 결과이다.
도 9b는 G1 내지 G7 각 군의 마우스의 지방세포에 발현되는 열발생 관련 마커의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 측정하여 비교한 결과이다.
도 2는 3T3-L1 지방세포 및 C3H10T1/2 마우스 중간엽 줄기세포에 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 균주(28번 균주) 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주(13번 균주)를 처리하고, qRT-PCR 및 웨스턴 블랏을 통해 열발생, 갈색 지방세포 마커의 발현량을 측정해 비교한 것이다. MDI는 MDI(methyl-isobutyl-xanthine, dexamethasone, insulin)만을 처리한 군, Rosi는 MDI와 함께 Rosiglitazone을 처리한 군을 의미한다.
도 3은 3T3-L1 지방세포 및 C3H10T1/2 마우스 중간엽 줄기세포에 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 균주및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주를 처리하고, qRT-PCR을 통해 베이지색 지방세포 마커와 백색 지방세포 마커의 발현량을 측정해 비교한 것이다. MDI는 MDI(methyl-isobutyl-xanthine, dexamethasone, insulin)만을 처리한 군, Rosi는 MDI와 함께 Rosiglitazone을 처리한 군을 의미한다.
도 4는 3T3-L1 지방세포에 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 균주(28번 균주) 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주(13번 균주)를 처리하고, qRT-PCR 및 웨스턴 블랏을 통해 지질 분해(lipolysis) 관련 마커의 발현량을 측정해 비교한 것이다. MDI는 MDI(methyl-isobutyl-xanthine, dexamethasone, insulin)만을 처리한 군, Rosi는 MDI와 함께 Rosiglitazone을 처리한 군을 의미한다.
도 5는 비만 유도 마우스 모델을 대상으로 한 항비만 효과 확인 실험 과정을 나타낸 그림이다. BS는 bacterial supernatant를, BP는 bacterial pellet을 의미한다.
도 6은 G1 내지 G7 각 군의 마우스의 체중 변화를 측정하여 비교한 그래프이다.
도 7은 G1 내지 G7 각 군의 마우스를 대상으로 H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 수행한 결과, 그리고 이를 바탕으로 지방세포의 크기를 측정해 비교한 그래프이다.
도 8은 G1 내지 G7 각 군의 마우스의 각 기관 무게를 측정하여 비교한 그래프이다.
도 9a는 G1 내지 G7 각 군의 마우스의 지방세포에 발현되는 열발생 관련 마커의 발현을 qRT-PCR을 통해 측정하여 비교한 결과이다.
도 9b는 G1 내지 G7 각 군의 마우스의 지방세포에 발현되는 열발생 관련 마커의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 측정하여 비교한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1.
비피도박테리움 롱검 균주 및 비피도박테리움 비피둠 균주
본 발명의 일 측면은, 신규 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주 또는 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) 균주를 제공한다.
상기 비피도박테리움 롱검 균주는 비피도박테리움 롱검 HN001 균주이며, 상기 비피도박테리움 롱검 HN001 균주는 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC 13936BP, Bifidobacterium longum DS0956의 이름으로 2019년 9월 2일 기탁된 균주이다.
상기 비피도박테리움 비피둠 균주는 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주이며, 상기 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주는 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC 13935BP, Bifidobacterium bifidum DS0908의 이름으로 2019년 9월 2일 기탁된 균주이다.
상기 비피도박테리움 롱검 균주 및 비피도박테리움 비피둠 균주는 항비만 활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 비피도박테리움 롱검 균주 및 비피도박테리움 비피둠 균주는, 갈색 지방세포로의 분화를 촉진하거나, 백색 지방세포의 갈색지방화(browning)를 촉진하여 갈색 지방세포 또는 베이지색 지방세포(beige adipocyte)의 형성을 촉진하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 비피도박테리움 롱검 균주 및 비피도박테리움 비피둠 균주는 지방세포에서 열발생 관련 유전자, 갈색 지방세포 특이 유전자, 또는 베이지색 지방세포 특이 유전자의 발현을 촉진하는 것일 수 있으며, 백색 지방세포 특이 유전자의 발현을 억제하는 것일 수 있다. 상기 비피도박테리움 롱검 균주 및 비피도박테리움 비피둠 균주는, Ucp1(uncoupling protein 1), Pgc1a(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha), Prdm16(PR/SET domain 16), Pparg(peroxisome proliferator activated receptor gamma), PRDM16, CD137, Cox2, Fgf21(fibroblast growth factor 21), P2RX5(purinergic receptor P2X 5) 및 Tbx1(T-box 1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 촉진시키는 활성을 가지는 것일 수 있으며, Past1, Resistin 또는 Sarpina3k 유전자의 발현을 억제시키는 활성을 가지는 것일 수 있다.
상기 비피도박테리움 롱검 균주 및 비피도박테리움 비피둠 균주는, 지방세포에서 지질의 분해를 촉진하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
구체적으로, 비피도박테리움 롱검 균주 및 비피도박테리움 비피둠 균주는, 지방세포에서 Atgl, Hsl, Plin1, 및 Plin5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키거나, HSL의 인산화를 촉진시켜 지질의 분해를 촉진하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
백색 지방세포는 지질과 같은 에너지를 저장하는 역할을 하는 지방세포로 백색 지방세포가 증가할 경우 비만을 유발할 수 있다. 이와는 달리, 갈색 지방세포는 열발생이나 지질의 분해 활성이 있는 지방세포이므로 백색 지방세포와는 반대의 역할을 할 수 있으며, 베이지색 지방세포는 갈색 지방세포와 유사한 활성을 나타내며 백색 지방세포의 갈색지방화(browning)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 비피도박테리움 롱검 균주 및 비피도박테리움 비피둠 균주는, 지방세포로 분화될 수 있는 세포의 분화 과정에서 백색 지방세포보다는 갈색 지방세포로의 분화를 촉진할 수 있는 활성이 있으며, 백색 지방세포의 갈색지방화를 촉진할 수 있는 활성이 있으므로, 갈색 지방세포 또는 베이지색 지방세포의 형성을 촉진할 수 있다. 또한, 다른 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피둠으로 분류되는 균주들과 비교할 때, 상기와 같은 활성이 더 우수한 특징이 있다. 따라서, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 균주 및 비피도박테리움 비피둠 균주는 비만을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 용도로 유용하게 이용될 수 있다.
2.
유산균을 포함하는 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 유산균을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 유산균은 상기 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주 또는 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) 균주를 포함한다.
상기 유산균을 포함하는 조성물은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 유산균을 포함하는 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 담체, 부형제 및/또는 첨가제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제, 젤(예컨대, 하이드로젤) 또는 동결건조제제의 형태일 수도 있으며, 상기 첨가제로 분산제, 안정화제 또는 동결보호제를 추가적으로 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 동결건조제제의 경우, 상기 균주를 동결보호제와 함께 동결건조하여 분말의 형태로 사용하는 것을 포함하며, 상기 동결보호제는 탈지분유, 말토덱스트린, 덱스트린, 트레할로스, 말토오스, 유당, 만니톨, 사이클로덱스트린, 글리세롤 및/또는 꿀일 수 있다. 또한, 보존 담체와 혼합하여 흡착시킨 후 건조시켜 고체화하여 사용하는 것을 포함하며, 상기 보존 담체는 규조토, 활성탄 및/또는 탈지강일 수 있다.
본 발명의 상기 유산균을 포함하는 조성물은 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 상기 담체, 부형제 또는 첨가제 중 어느 하나와 혼합하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.
상기 균주, 담체, 부형제 및 첨가제에 대한 설명은 전술한 바와 같다. 상기 첨가제로 동결보호제를 이용하는 경우, 상기 유산균을 포함하는 조성물은 상기 균주와 동결보호제를 혼합하고, 상기 혼합물을 -45 ℃ 내지 -30 ℃에서 동결하는 과정을 거친 후, 30 ℃ 내지 40 ℃에서 건조하여 믹서기로 갈아 동결건조된 분말 형태로 제조되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 동결하는 과정은 -45 ℃ 내지 -30 ℃의 온도 조건, 5 내지 50 mTorr의 압력 조건에서 65 내지 75 시간 동안 진공동결하는 과정일 수 있다.
본 발명의 조성물에 동결보호제가 더 포함될 경우, 상기 조성물이 동결 건조되는 과정에서 상기 균주의 손상이나 사멸이 억제될 수 있으며, 동결건조된 형태의 조성물은 보관, 유통, 저장 과정에서 유리한 장점이 있다. 또한, 상기 동결건조된 형태의 조성물은 분말의 형태로 섭취될 수 있으며, 이 경우 체내에서 상기 조성물 내 균주가 성장 또는 대사하면서 이의 활성을 나타낼 수 있다.
3.
유산균을 포함하는 조성물의 비만의 예방, 치료 또는 개선 용도
본 발명의 또 다른 측면은 상기 유산균을 포함하는 조성물의 비만 예방, 치료 또는 개선 용도를 제공한다.
상기 비만의 예방, 치료 또는 개선은, 체중의 감소, 체중의 증가를 억제하는 것, 지방 조직 무게의 감소, 지질(예컨대, 트리글리세리드, HDL, LDL을 포함하는 콜레스테롤)의 감소, 백색 지방세포의 감소, 갈색 지방세포의 증가, 또는 베이지색 지방세포의 증가일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유산균을 포함하는 조성물은 의약품, 식품 또는 사료일 수 있다. 상기 유산균을 포함하는 조성물은 상기 조성물이 의약품일 경우, 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있고, 상기 조성물이 식품일 경우, 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품일 수 있으며, 상기 조성물이 사료일 경우, 비만 예방 또는 개선용 사료 조성물일 수 있다.
본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 균주에 대해서는 전술한 바와 같으며, 본 발명의 일 구현 예에서, 상기 약학 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물이 포함하는 상기 균주는 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노 구형입자와 같은 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
이 외에도, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 레밍턴의 약학적 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 생약 추출물 또는 생약 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 비만의 억제 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선치료, 호르몬치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 다른 오염물질에 의해 유발되는 질환의 치료제 또는 피부 노화 개선을 위한 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으며, 일례로 본 발명의 펩타이드를 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.0001 ㎍ 내지 500 mg, 예컨대 0.01 ㎍ 내지 100 mg 투여할 수 있다. 또한, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 예컨대 하루 2회 내지 3회 분할 투여될 수 있다.
본 발명은 상기 약학 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 비만 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 대상은 사람 또는 사람을 제외한 동물일 수 있으며, 비만이 아닌 상태이거나 비만인 상태일 수 있다. 상기 대상이 비만이 아닌 상태인 경우, 상기 약학 조성물을 대상에게 약학적으로 유효한 양만큼 투여하여 비만을 예방할 수 있고, 상기 대상이 비만인 상태인 경우, 상기 약학 조성물을 대상에게 약학적으로 유효한 양만큼 투여하여 비만을 치료할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제형, 투여 방법, 투여량 및 조성물에 함유되는 유효성분의 농도는 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물은 체중의 증가 또는 지방의 축적을 억제할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 장기간 섭취하는 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
상기 균주에 대해서는 전술한 바와 같으며, 비만 예방 또는 개선을 목적으로 사료첨가제 조성물로 첨가할 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.
본 발명에서 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 비만을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 용도의 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HN001 균주 또는 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) HN002 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HN001 균주 또는 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) HN002 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 조성물의 비만을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 비만을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 조성물을 생산하기 위한 상기 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HN001 균주 또는 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) HN002 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
재료 및 방법
사용 시약
덱사메타손(Dexamethasone), IBMX(isobutyl-1-metylxanthine), 인슐린(insulin), 로지글리타존(Rosiglitazone, Rosi), Oil Red O dye, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 및 4% 포름알데히드(formaldehyde)는 시그마 알드리치(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
DMEM(Dulbecco Modified Eagle's Media), 신생 송아지 혈청 (NBCS) 및 재조합 인간 BMP4는 Gibco社(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 소 태아 혈청은 아틀라스 바이오록지컬社 (Fort Collins, CO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 페니실린-스트렙토마이신 용액은 Hyclone Laboratories, Inc. 社(South Logan, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
유산균 분리
유산균의 분리는 절대혐기적 조건에서 MRS 배지를 사용하였고, 혐기조건을 위해 N2 가스를 이용하여 배지 내 존재하는 산소를 제거시킨 후 멸균하여 수행하였다. 채취한 분변 시료 0.1 g을 10 ㎖ MRS 배지에 현탁한 후 단계적으로 희석하여 MRS 평판배지 또는 혈액 아가 배지에 100 ㎕씩 도말하여 37 ℃에서 2일간 혐기조건으로 배양하였다. 그 결과 생성된 단일 콜로니를 계대배양하여 순수 분리하고 장기보존하며 사용하였다.
유산균의 동정
항비만 활성을 확인하여 선발한 본 발명의 유산균의 분자생물학적 동정을 위하여 16S rRNA 유전자를 타겟으로 하는 유니버셜 프라이머인 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC A-3')와 1492R (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')을 사용하였고, 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 수행하였다. 분석하여 얻은 염기 서열들은 EZbiocloud (http://www.ezbiocloud.net/)에서 동정검색을 통해 염기서열을 확인하였다.
qRT-PCR 분석
유산균 배양액이 처리된 세포로부터 유전자의 발현을 알아보기 위해 총 RNA를 RNA 추출 키트(Valencia, CA, USA, Qiagen사)를 제조사의 설명서에 따라 사용하여 추출하고, Scandrop Analytik jena AG 분광계(Jena, Germany)를 이용하여 RNA의 농도를 측정하였다. Maxime RT PreMix 키트(Intron Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 1㎍의 RNA를 cDNA로 합성하고, PCR 반응을 Veriti 96-웰 열 사이클러(thermal cycler, Applied Biosystems, Singapore)에서 수행하였다. 정량적 실시간 PCR은 iQTM SYBR Green Supermix 키트(Bio-Rad, Singapore)를 이용하여 CFX96TM 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad, Singapore) 상에서 수행하였다. 각 유전자들의 발현량은 Gapdh(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 이용하여 정량하였다(Yoon D, Imran KM, Kim YS. 2018 Toxicol Appl Pharmacol. Feb 1;340:9-20).
고지방식이 유도 비만마우스 투여에 의한 항비만 효능 조사
마우스에게 고지방식이를 섭취시켜 비만모델을 유도시킨 후, 본 발명의 유산균 배양액 또는 균체를 상기 마우스에게 투여하여 효능을 비교하였다. 본 연구에 사용된 마우스는 3주령의 C57BL/6, SPF 수컷 마우스로, 입수 후 7일간의 순화기간을 거쳐 건강한 동물만을 시험에 사용하였다. 고지방식이는 45% kcal의 high fat diet, D12451(Research Diet)를 이용하였고 이를 마우스에게 4주간 급이시킨 후 선별하여 그룹을 나누어 비만 모델(DIO, Diets induced obesity)을 확립하였다. 그리고 하기 표 1에 기재된 군 구성으로 7주간 식이를 급이시켜 실험을 수행하였고, 유산균 배양액을 투여한 경우에는 마우스 한 마리당 1.5 ㎖의 유산균 배양액의 상층액을 동결건조 한 다음 150 ㎕의 증류를 첨가하여 매일 1회 투여하였으며, 유산균 균체를 투여한 경우 109 cell/kg의 농도로 투여하였다.
| Group | Animal number | Sex | Treat Dose concent. (Vol) |
| G1 (Saline, Non-45% kcal HFD) | 8 | male | 150 ㎕/Head |
| G2 (Saline, 45%kcal HFD) | 8 | 150 ㎕/Head | |
| G3 (HN002 균주 배양상층액, 45%kcal HFD) | 8 | 150 ㎕/Head | |
| G4 (HN001 균주 배양상층액, 45%kcal HFD) | 8 | 150 ㎕/Head | |
| G5 (HN002 균주 cell, 45%kcal HFD) | 8 | 150 ㎕/Head | |
| G6 (HN001 균주 cell, 45%kcal HFD) | 8 | 150 ㎕/Head | |
| G6 (Rosiglitazone, 45%kcal HFD) | 8 | 150 ㎕/Head |
모든 동물에 대하여 매일 1회 일반 증상을 관찰하고 체중과 식이량은 시검기간 중 주 5회 측정하였다. 시험기간 종료 후 호흡마취를 이용하여 마취하고 심장채혈을 통하여 혈액을 채집하였고, 군당 2수씩 지방부위를 적출하여 4% Paraformaldehyde 용액에 담거나 RNA Storage solution (ThermoFisher)에 보관하였다. 혈구분석은 혈구분석장비(Beckman coulter)를 이용하였으며 혈구분석을 마친 검체는 원심분리 후 혈장을 이용하여 분석을 수행하였다. 4% PFA 용액에 담긴 지방조직은 파라핀 블록 제조에 이용하였다.
통계 분석
이 실험의 모든 데이터는 3회 이상의 독립적인 실험의 평균±표준 편차(SD)로 표현되었다. 달리 명시하지 않는 한, MDI 처리된 시료 군을 대조군으로 하여, 대조군에 비해 변화가 어느 정도 이루어졌는지를 확인하였다. 대조군과 다른 처리군들 간의 유의한 차이는 스튜던트 t-검정(Student 's t-test)를 사용하여 계산하였다. *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. 0.05 미만의 P 값을 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
[실험예 1]
비피도박테리움 롱검 HN001 균주 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주의 선별
[1-1] 트리글리세리드 축적량 확인을 통한 선별
55종의 서로 다른 다양한 유산균들 중에서 항비만 활성, 특히 백색 지방세포를 갈색 지방세포나 베이지색 지방세포로 변환시킬 수 있는 활성이 있는 유산균 균주를 선발하였다. 3T3-L1 지방세포를 대상으로, 55종의 유산균 배양액을 처리한 후, 트리글리세리드(triglyceride)의 축적량의 확인과 세포의 관찰을 통해, 베이지색 지방세포 또는 갈색 지방세포로의 전환을 유도하는 활성이 우수할 것으로 예상되는 유산균 균주를 선발하였다.
3T3-L1 세포는 지방전구세포라고도 불리며 인슐린에 의해 지질 성분을 생산하는 활성을 나타낼 수 있으며 백색 지방세포만으로 분화가 결정되어 있다. 따라서 분화 초기 단계에 관한 연구가 아닌, 이미 분화가 완료된 지방세포를 대상으로 수행되는 연구에 3T3-L1 지방세포가 유용하게 사용될 수 있다. 이러한 3T3-L1 지방세포가 갈색 또는 베이지색 지방세포로 전환 분화되는 과정에서, 처리된 유산균 배양액이 미치는 영향을 확인하기 위해 트리글리세리드의 축적량을 확인하였다. 이는, 유산균 균주들 중에서, 지방세포에서 anti-adipogenesis 활성을 나타내도록 하는 균주를 배제하기 위한 것으로, 지방세포의 분화, 증식을 억제하여 트리글리세리드를 감소시키는 활성을 보이는 유산균은 배제하고, 지방세포의 활발한 분화를 촉진하는 활성이 있는 후보 유산균 균주를 선발하기 위한 것이다.
구체적으로, 먼저 3T3-L1 세포를 다음과 같은 방법으로 배양하였다. 3T3-L1 세포를 DMEM 글루타맥스에 10% NBCS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 섞어 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건으로 배양하였다. 3T3-L1 세포의 세포 농도가 70-80%가 될 때 48 웰 플레이트에 접종하고, 세포의 농도가 100%가 되는 날을 Day 0이라고 지정하여 MDI(Insulin, Dexamethasone, Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)) 지방세포 분화배지로 바꿔주었다. 이 때, MDI만 처리한 음성 대조군, MDI와 Rosi를 처리한 양성 대조군, 그리고 MDI와 유산균 배양액을 처리한 실험군으로 나누어 실험을 수행하였다. MDI는 이틀에 한번씩 바꾸어 주는 방식으로 실험을 진행하였다. Day 2에는 각 군에 인슐린, 인슐린과 Rosi, 인슐린과 유산균 배양액을 각각 처리하였고, Day 4에는 모두 인슐린만 처리하였다. Day 6에는 유산균 배양액의 처리 없이 세포를 고정하였다.
상기와 같이 배양된 3T3-L1 세포를 24 웰 플레이트에 6일 동안 배양한 후 고정시키고, Oil Red O(ORO) 염색 시약을 이용하여 염색을 진행하였다. 1X PBS로 세포를 한번 세척한 후, 10% 포르말린으로 1시간 동안 세포를 상온에서 고정시켜 주었다. 그리고 0.3% ORO 용액을 사용하여 상온에서 20분 동안 염색하고 증류수로 4번 세척하였다. 세척 후 Axiovert-25 microscope을 통해 변화된 표현형을 현미경으로 관찰하고 사진을 찍었다. 이 후, 염색된 세포를 100% 이소프로판올에 녹여 VictorTMX3에서 520 ㎚의 흡광도로 ORO 염색된 양을 측정하였다.
또한, 상기와 같이 배양된 3T3-L1 세포를 TEM(Transmission Electrinic Microscope)을 통해 관찰하여 세포 형태를 확인하였다.
그 결과, 55종의 다양한 유산균 균주들 중, 13번 균주 및 28번 균주의 배양액을 처리한 3T3-L1에서, 로지글리타존(Rosi)을 처리한 양성대조군과 마찬가지로 트리글리세리드의 축적량이 유의하게 높아진 것을 확인할 수 있었다(도 1). 상기와 같은 결과를 통해, 13번 균주 및 28번 균주는, 백색 지방세포의 전환을 통한 항비만 활성이 우수할 것으로 예상되는 후보 균주로 선발할 수 있었다.
그리고, 상기와 같이 선발된 13번 균주 및 28번 균주의 동정을 수행한 결과, 28번 균주는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 13번 균주는 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum)에 속하는 것으로 규명되어 이들을 각각 비피도박테리움 롱검 HN001 및 비피도박테리움 비피둠 HN002로 명명하였다.
[1-2] 갈색 지방세포 특이적 마커 발현량 증가 활성 확인을 통한 선별
상기 실험예 1-1에서 트리글리세리드의 축적량 확인을 통해, 3T3-L1 세포가 다시 분화될 수 있도록 유도하는 활성을 확인한 것에 더하여, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주를 비롯하여 다양한 유산균 균주들을 대상으로 갈색 지방세포의 마커로 이용되는 Ucp1 유전자의 발현량을 측정, 비교하여 항비만 활성이 있는 유산균 균주를 최종적으로 선발하였다.
구체적으로, 비피도박테리움 롱검 HN001 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주를 비롯한 55종의 유산균 배양액을 3T3-L1 지방세포에 처리한 다음, qRT-PCR을 통해 Ucp1 유전자의 mRNA 발현량을 측정하였다. 실험의 음성대조군으로는 MDI 배지만을 3T3-L1에 처리하여 Ucp1 유전자의 mRNA 발현량을 측정하여 이용하였고, 이를 기준으로 하여 상대적인 mRNA 발현량을 측정, 비교하였다. 양성대조군으로는 상기 MDI 배지에 더하여 로지글리타존(Rosiglitazone)을 처리한 3T3-L1을 이용하였다.
그 결과, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주 배양액을 처리한 3T3-L1 세포에서는 MDI만을 처리한 대조군이나, 다른 유산균 균주의 배양액을 처리한 경우보다 Ucp1 유전자의 mRNA 양이 현저하게 높은 것으로 측정되었다. 특히, 비피도박테리움 롱검이나 비피도박테리움 비피둠으로 분류되는 유산균 균주들을 처리한 경우보다도 본 발명의 HN001 균주 및 HN002 균주 배양액을 처리하였을 때 Ucp1 유전자 발현량이 현저히 높게 나타났다. 일부 비피도박테리움 롱검 또는 비피도박테리움 비피둠 균주는 Ucp1 유전자 발현량이 크게 증가하지 않거나 MDI만을 처리한 대조군에서의 Ucp1 유전자 발현량보다도 더 낮게 측정되어, 비피도박테리움 롱검 또는 비피도박테리움 비피둠으로 분류되는 유산균 균주라고 하더라도 모두 Ucp1 유전자의 발현량을 증가시키는 활성을 가지는 것은 아님을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과를 통해, 3T3-L1 세포의 분화를 유도하였을 때 트리글리세리드의 축적량을 높게 형성시키고 갈색 지방세포 마커 유전자인 Ucp1 유전자의 발현을 촉진시키는 활성이 우수한, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주를 최종적으로 선발하여, 이후의 실험을 통해 이의 활성을 추가적으로 확인하였다.
[실험예 2]
본 발명의 유산균 균주의 베이지색/갈색 지방세포 분화 촉진 효과 확인
실험예 1을 통해 선발한 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 균주 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주는 항비만 효과가 있을 것으로 예상되며, 특히 분화된 지방세포를 베이지색 지방세포나 갈색 지방세포로 전환하는 활성이 우수할 것으로 예상되었다. 이에, 분화가 완료된 지방세포 연구에 주로 이용되는 3T3-L1 지방세포와 지방세포로 분화될 수 있는 중간엽 줄기세포인 10T1/2 세포에 상기 유산균 균주들의 배양액을 처리하고 베이지색 지방세포, 갈색 지방세포 관련 마커 유전자의 발현량을 측정하여 본 발명 균주들의 효과를 확인하였다.
[2-1] 갈색 지방세포 마커 및 열발생 관련 유전자 발현 촉진 효과 확인
상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양된 3T3-L1 지방세포에, 본 발명의 유산균 배양액을 5 ㎕/㎖의 농도로 처리한 후 갈색 지방세포의 마커 유전자, 열발생 관련 유전자들의 mRNA 발현량과 단백질 발현량이 증가하는지 여부를 확인하였다.
또한, 지방세포로 분화될 수 있는 중간엽 줄기세포인 C3H10T1/2 세포를 대상으로도 동일한 실험을 수행하여 갈색 지방세포 마커 유전자 및 열발생 관련 유전자의 발현을 측정하였다. C3H10T1/2 세포는 MDI의 처리를 통해 지방세포로 분화되며 MDI 처리 후 6일 정도의 분화 과정 동안 대부분 백색 지방세포로 분화되는 특징이 있다. 상기와 같은 C3H10T1/2 마우스 중간엽 줄기세포의 배양과 분화는 다음과 같이 수행하였다. C3H10T1/2 세포는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)(KCLB-10226)으로부터 구입하였고, 10% NBCS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 고농도 글루코스 DMEM 배지에서 5% CO2 배양기, 37 ℃ 조건으로 배양하였다. 20~30% 세포 농도의 C3H10T1/2 세포를 접종하고, 분화 유도(commitment)를 위하여, 세포의 농도가 100% 될 때까지 50 ng/㎖의 인간 재조합 BMP4를 세포에 처리한 다음, 2~3일 경과 시 새로운 배지로 교환하였다. 구체적으로, 세포의 농도가 100%가 된 시점의 48시간 후를 Day 0이라 하고 10% FBS, 0.5mM IBMX, 1μM 덱사메타손(Dexamethasone) 및 10㎍/㎖ 인슐린(MDI)을 포함하는 DMEM 배지로 변경하여 분화를 유도하였다. 양성 대조군에는 로시글리타존(Rosi)을 처리하였고 실험군에는 본 발명의 유산균 배양액을 처리한 후 분화를 유도하였다.
열발생 관련 유전자의 발현을 확인하기 위해, 분화된 세포들을 4시간 동안 500μM dibutyryl-cAMP에 노출시켜 열 발생 프로그램을 자극하였다.
열발생 관련 유전자이자 갈색 지방세포 마커 유전자인 Ucp1, Pgc1a 및 Prdm16 유전자의 mRNA 발현량을 qRT-PCR을 통해 측정하였고, 상기 유전자들로부터 발현된 UCP1, PGC1α, PRDM16 및 지질 생성(adipogenensis) 마커인 PPARγ의 단백질량을 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다.
그 결과, 유산균 배양액을 처리하지 않고 MDI만을 처리하여 분화를 유도한 대조군과 비교할 때, 본 발명의 HN001 균주 및 HN002 균주의 배양액을 처리한 경우 3T3-L1 지방세포 및 CH310T1/2 세포에서 Ucp1, Pgc1a 및 Prdm16 유전자의 발현량 및 UCP1, PGC1α, PRDM16 및 PPARγ 단백질의 발현량이 유의하게 증가되어 나타나는 것을 확인할 수 있었으며 이는 양성 대조군에서의 발현량 변화 양상과도 유사하였다(도 2).
상기와 같은 실험 결과를 통해, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 균주 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주의 배양액을 처리할 경우 지방세포나 중간엽 줄기세포가 분화될 때, 갈색 지방세포로의 분화가 유도되는 특징이 있음을 알 수 있었으며, 따라서 백색 지방세포로의 분화가 저해될 수 있어 비만에 대한 예방이나 치료 효과가 있는 것임을 확인할 수 있었다.
[2-2] 베이지색 및 백색 지방세포 마커 유전자 발현 촉진 효과 확인
상기 실험예 1 및 실험예 2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 각각 배양된 3T3-L1 지방세포 및 중간엽 줄기세포 C3H10T1/2 세포에, 본 발명의 유산균 배양액을 5 ㎕/㎖의 농도로 처리한 후 베이지색 지방세포의 마커 유전자 및 백색 지방세포 마커 유전자들의 mRNA 발현량을 비교, 확인하였다.
상기 베이지색 지방세포의 마커 유전자로는 CD137, Cox2, Fgr21, P2RX5 및 Tbx1을 대상으로, 백색 지방세포의 마커 유전자로는 Ap2, Pparg, Psat1, Resistin 및 Sarpina3k를 대상으로 하여 이들의 mRNA 발현량을 qRT-PCR을 통해 측정하였다.
그 결과, 유산균 배양액을 처리하지 않고 MDI 배지로 분화만을 유도한 대조군에서의 베이색 지방세포 마커 유전자 발현량과 비교할 때, 본 발명의 HN001 균주 및 HN002 균주의 배양액을 처리한 경우 3T3-L1 지방세포 및 CH310T1/2 세포에서는 베이지색 지방세포 마커 유전자인 CD137, Cox2, Fgr21, P2RX5 및 Tbx1 유전자의 발현량이 유의하게 증가되어 나타나는 것을 확인할 수 있었으며 이는 양성 대조군에서의 발현량 변화 양상과도 유사하였다(도 3). 따라서, HN001 균주 및 HN002 균주는 베이지색 지방세포의 형성을 촉진시키는 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 HN001 균주 및 HN002 균주의 배양액을 처리하였을 때, Psat1, Resistin 및 Sarpina3k 유전자의 발현량은 유의적으로 증가하지 않았고, aP2 및 Pparg 유전자의 발현량은 증가하여 나타나는 것으로 측정되었다(도 3). PPAGγ는 백색 지방세포뿐만 아니라 갈색 지방세포에서도 중요한 전사 조절인자로 기능하는 단백질이므로 그 유전자의 발현량이 증가되어 나타난 것으로 예상된다. aP2 유전자의 경우, 통상적인 백색 지방세포에서는 대조군에 비해 발현량이 수백 배 이상 증가되는 것으로 나타나므로, 본 발명의 HN002 균주 배양액 처리군에서 대조군에 비해 수 배 정도 증가한 실험 결과는, 백색 지방세포 특이 유전자의 발현을 촉진시키지 않은 것이라고 해석할 수 있다.
상기와 같은 실험 결과로 볼 때, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 균주 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주의 배양액은 3T3-L1 지방세포나 중간엽 줄기세포가 분화되는 과정에서 베이지색 지방세포로의 분화 유도를 촉진하는 특성이 있다는 것을 알 수 있었으며, 따라서 백색 지방세포를 베이지색 지방세포화시킬 수 있는 효능이 있는바 비만에 대한 예방이나 치료 효과가 있는 것임을 확인할 수 있었다.
[2-3] 지방분해(lipolysis) 관련 마커의 증가 효과 확인
상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양된 3T3-L1 지방세포에, 본 발명의 유산균 배양액을 5 ㎕/㎖의 농도로 처리한 후 지방분해(lipolysis) 관련 유전자의 mRNA 발현량을 측정하고, 지방분해와 관련된 마커 단백질의 양을 측정하여 이들의 증가 여부를 확인하였다.
구체적으로, 지방분해 관련 유전자로는 Atgl, Hsl, Plin1 및 Plin5를 대상으로 하여 이들의 mRNA 발현량을 qRT-PCR 통해 측정하였고, 지방분해와 관련된 마커인 PLIN1 및 ATGL 단백질의 양, 그리고 Ser660 과 Ser563이 인산화된 p-HSLSer660 및 p-HSLSer563의 양을 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다.
그 결과, 유산균 배양액을 처리하지 않고 MDI만을 처리하여 분화를 유도한 대조군과 비교할 때, 본 발명의 HN001 균주의 배양액을 처리한 경우 3T3-L1 지방세포에서 Plin5 유전자의 발현량이 유의적으로 증가하였고, HN001 균주 및 HN002 균주 배양액을 처리한 3T3-L1 세포에서 모두 p-HSLSer660, p-HSLSer563, PLIN1, 및 ATGL 단백질의 양이 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 4).
지방의 분해는 지방세포 표면의 단백질로부터 순차적인 단백질의 인산화를 통해 이루어집니다. 말씀하신것처럼 유산균 처리에 의한 유전자 발현에서는 Plin5의 발현 만 증가하는 것으로 나타나지만 단백질 발현의 경우 지방분해에 필요한 Plin, ATGL 그리고 특히 HSL의 인산화의 활성화를 통해 복합적으로 이루어지는데 유산균의 처리가 지방산화 관련 단백질의 인산화 및 발현을 증가시키는것으로 보아 유산균의 처리가 지방의 분해를 유도할 수 있다고 제시한 것으로 생각하시면 될 것 같습니다.
지방의 분해 과정은, 지방세포 표면의 단백질로부터 순차적인 단백질의 인산화를 통해 진행될 수 있으며, 지방의 분해에 필요한 Plin, ATGL, 특히 HSL의 인산화의 활성화를 통해 복합적으로 지방분해가 진행될 수 있다. 따라서 상기와 같은 실험 결과를 통해, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 균주 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주의 배양액을 처리할 경우 분화된 지방세포에서 지방분해와 관련된 유전자 및 단백질의 발현과 활성화가 증가되면서 지방분해가 촉진되는 것을 알 수 있었고, 지방분해가 증가함에 따라 실제로 지방이 감소될 수 있는바 본 발명 균주들의 비만에 대한 예방 및 치료 효과를 확인할 수 있었다.
[실험예 3]
고지방식이 유도 비만 마우스에 대한, 본 발명 유산균의 항비만 효과 확인
앞서 설명한 것처럼 고지방식이를 섭취시켜 비만 모델을 유도한 마우스를 대상으로, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 균주 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주의 배양액 또는 균체를 고지방식이와 함께 급이시켰다. 상기 표 1과 같이, 일반 식이(NFD)를 급이시킨 G1, 고지방식이(HFD)를 급이시킨 대조군 G2, 그리고 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 HN002의 배양액(배양 상층액) 1 ㎖ 및 비피도박테리움 롱검 HN001의 배양액(배양 상층액) 1 ㎖을 HFD와 함께 각각 급이시킨 G3 및 G4, 본 발명의 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주의 균체(원심분리하여 얻은 pellet)와 비피도박테리움 롱검 HN001의 균체(원심분리하여 얻은 pellet)를 각각 109 cells/㎏으로 HFD와 함께 급이시킨 G5 및 G6, 그리고 로지글리타존 10 ㎎/㎏을 HFD와 함께 급이시킨 양성 대조군 G7의 마우스로부터 시료를 채취하여 비만과 관련된 다양한 요소들을 측정하여 본 발명 유산균의 항비만 효과를 확인하였다. 4주 동안 HFD 또는 NFD를 급이시킨 마우스를 선별하여 G1 내지 G7으로 그룹화하고 각 그룹에 따른 식이를 7주간 급이시켰다(도 5).
[3-1] 체중 증가의 저감 효과 및 지방세포 크기 감소 효과 확인
먼저, G1 내지 G7의 마우스의 체중을 측정하여 7주간 각 주차의 마우스 체중을 비교하였다. 또한, epididymal 백색 지방을 대상으로 H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 수행하여 조직 내 지질 방울(lipid droplet) 영역을 측정하고 정량화함으로써 지방세포의 크기를 측정하였다. 나아가, G1 내지 G7 마우스로부터 채취한 각 기관의 지방(Epididymal fat, Visceral fat, Subcutaneous fat, Liver) 무게를 측정하여 비교하였다.
그 결과, 일반 식이를 섭취시킨 G1의 마우스의 체중 증가가 가장 적게 나타났으며, 고지방식이를 섭취시킨 G2의 마우스에서는 체중의 증가가 가장 뚜렷하게 나타났다. 그런데, 고지방식이와 함께 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주의 균체나 배양액을 투여시킨 G3 내지 G6의 마우스의 경우, 고지방식이를 함께 급이시켰음에도 불구하고, 로지글리타존을 급이시킨 양성대조군(G7)과 유사하게, G2와 비교하여 체중의 증가 정도가 크지 않은 것을 확인하였다(도 6). G1 내지 G7의 마우스가 섭취한 식이량은 그룹 간에 차이를 나타내지 않았으므로, 상기와 같은 체중의 차이는 마우스 군 별 음식 섭취량의 차이에 의한 것이 아니며, 급이시킨 음식의 조성에 따른 차이이다. 따라서, 본 발명의 유산균 균주의 균체 및 이의 배양액은 고지방식이에 따른 체중 증가를 억제하거나 체중의 감소를 유도할 수 있는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
또한, H&E 염색을 통해 지방세포의 크기를 측정한 결과에서도, G2에 비해 G3 내지 G6의 마우스에서 지방의 염색 정도가 현저하게 낮게 측정되어 지방세포의 크기 감소 효과가 우수한 것으로 확인되었으며(도 7), 각 기관의 무게를 측정한 결과에서도 실험군마다 차이는 있었지만 HN001 균주 및 HN002 균주를 투여하였을 때 G2에 비해 간의 무게가 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 8).
[3-2] 열발생 관련 마커 유전자의 발현 촉진 효과 확인
G1 내지 G7의 마우스로부터 채취된 내장(visceral) 지방세포에서, 갈색 지방세포 또는 베이지색 지방세포의 활성과 관련이 있는 열발생 관련 마커(thermogenic marker) 유전자와 단백질의 발현량을 측정하여, 본 발명의 유산균 균주에 의한 갈색지방화 촉진 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 마커 유전자로 Ucp1, Prdm16, Pparg 및 aP2 유전자를 대상으로 하여 이들의 mRNA 발현량을 qRT-PCR을 통해 측정하여 비교하였고, PRDM16, PPARγ, PGC1α, AP2 및 UCP1 단백질의 양을 웨스턴 블랏을 통해 측정하여 비교하였다. mRNA 양은 Tbp, 단백질 양은 β-actin을 이용하여 정규화시켰다.
그 결과, 고지방식이를 섭취시킨 G2 마우스에서의 Ucp1, Prdm16, Pparg 및 aP2 유전자 마커의 발현량과 비교할 때, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주의 균체나 배양액을 투여시킨 G3 내지 G6의 마우스의 경우, 고지방식이를 함께 급이시켰음에도 불구하고, 상기 Ucp1, Prdm16 유전자 마커의 발현량이 증가하여 나타났다(도 9a). Ucp1, Prdm16 유전자는 갈색 지방세포 관련 마커 유전자로 이의 발현을 촉진시키는 활성이 있음을 확인할 수 있었고, Pparg 및 aP2 유전자의 경우 본 발명의 HN001 균주 및 HN002 균주가 크게 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 또한 단백질 발현량 측정 결과에서도, HN001 균주의 배양액을 처리하였을 때 PRDM16, PGC1α 및 UCP1 단백질의 발현량이 증가되었고 HN002 균체를 처리한 G5에서 PGC1α 및 UCP1 단백질의 발현이 증가되었다(도 9b). 그에 반해, 대조군에 비해 PPARγ이나 AP2의 발현은 억제하거나 영향을 미치지 않았다.
상기와 같은 실험 결과를 종합하여 볼 때, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 HN001 및 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주는, 지방세포의 분화 과정에서 갈색 지방세포로의 분화를 촉진하거나 백색 지방세포의 갈색지방화를 촉진하는 특성이 있으며, 실제로 비만을 유도한 마우스를 대상으로 상기 균주들의 배양액이나 균체를 함께 급이시켰을 때 체중 증가의 억제, 지방 성분의 감소, 갈색 지방세포 또는 베이지색 지방세포 특이적 마커 유전자의 발현량 증가 등의 효과를 나타내는바, 비만의 예방, 치료, 개선에 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.
상기에서는 본 발명의 대표적인 실험예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실험예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
Claims (12)
- 수탁번호 KCTC13936BP로 기탁된 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HN001 균주.
- 청구항 1에 있어서,
상기 비피도박테리움 롱검 HN001 균주는 항비만 활성을 가지는 것인, 균주.
- 수탁번호 KCTC13935BP로 기탁된 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) HN002 균주.
- 청구항 3에 있어서,
상기 비피도박테리움 비피둠 HN002 균주는 항비만 활성을 가지는 것인, 균주.
- 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HN001 균주 또는 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) HN002 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 5에 있어서,
상기 비만의 예방 또는 치료는, 갈색 지방세포 또는 베이지색 지방세포(beige adipocyte)의 형성을 촉진하는 것인, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 6에 있어서,
상기 비만의 예방 또는 치료는, 지방세포에서 Ucp1(uncoupling protein 1), Pgc1a(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha), Prdm16(PR/SET domain 16), Pparg(peroxisome proliferator activated receptor gamma), PRDM16, CD137, Cox2, Fgf21(fibroblast growth factor 21), P2RX5(purinergic receptor P2X 5) 및 Tbx1(T-box 1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시켜 갈색 지방세포 또는 베이지색 지방세포(beige adipocyte)의 형성을 촉진하는 것인, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 5에 있어서,
상기 비만의 예방 또는 치료는, 지방세포에서 지질의 분해를 촉진하는 것인, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 8에 있어서,
상기 상기 비만의 예방 또는 치료는, 지방세포에서 Atgl, Hsl, Plin1, 및 Plin5로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키거나, HSL의 인산화를 촉진시켜 지질의 분해를 촉진하는 것인, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 5 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물은 동결보호제를 더 포함하는 것인, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HN001 균주 또는 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) HN002 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) HN001 균주 또는 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) HN002 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
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Legal Events
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Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20210712 Patent event code: PE09021S01D |
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