KR20210038637A - 면역 요법의 안정한 유전적 변형을 위한 귀소 수용체 또는 사이토카인, 및 키메라 항원 수용체를 포함하는 4 시스트론 시스템 (a quadricistronic system comprising a homing receptor or a cytokine, and chimeric antigen receptor for genetic modification of immunotherapies) - Google Patents

면역 요법의 안정한 유전적 변형을 위한 귀소 수용체 또는 사이토카인, 및 키메라 항원 수용체를 포함하는 4 시스트론 시스템 (a quadricistronic system comprising a homing receptor or a cytokine, and chimeric antigen receptor for genetic modification of immunotherapies) Download PDF

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로랑 에이치. 보이셀
존 에이치. 리
나단 티. 슈머
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Abstract

i) 귀소 수용체, ii) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(ABP) 또는 키메라 항원 수용체(CAR), iii) CD16 또는 CD16-158V와 같은 Fc 수용체, 및/또는 iv) 사이토카인을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 변형된 NK-92® 세포가 본원에서 제공되며, 여기서 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. i) IL-12 및/또는 TGF-베타 트랩, ii) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(ABP) 또는 키메라 항원 수용체(CAR), iii) CD16 또는 CD16-158V와 같은 Fc 수용체, 및/또는 iv) 사이토카인을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 변형된 NK-92® 세포가 본원에서 추가로 제공되며, 여기서 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 변형된 NK-92® 세포를 포함하는 조성물 및 키트뿐만 아니라 변형된 세포를 사용하여 암을 치료하는 방법이 또한 제공된다.

Description

면역 요법의 안정한 유전적 변형을 위한 귀소 수용체 또는 사이토카인, 및 키메라 항원 수용체를 포함하는 4 시스트론 시스템 (A QUADRICISTRONIC SYSTEM COMPRISING A HOMING RECEPTOR OR A CYTOKINE, AND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR FOR GENETIC MODIFICATION OF IMMUNOTHERAPIES)
본 출원은 2018 년 8 월 1 일에 출원된 출원 번호 62/713,264; 2018 년 8 월 1 일에 출원된 62/713,278, 2018 년 8 월 1 일에 출원된 62/713,310; 및 2018 년 8 월 1 일에 출원된 62/713,323을 갖는, 본 발명자들의 동시-계류 중인 미국 가출원에 대해 우선권을 주장한다. 이들 출원 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
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발명의 분야
본 발명의 분야는 암 및 종양에 대한 면역 요법을 개선하기 위한 기반으로서 세포 독성 활성화된 자연 살해 세포주(NK-92)를 사용하여 조작된 세포이다.
배경기술은 본 발명을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나 현재 청구된 발명과 관련이 있거나, 구체적으로 또는 암시적으로 언급된 임의의 간행물이 선행 기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다.
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입양 이식된(adoptively transferred) 종양-특이적 세포 독성 림프구에 기초한 암 면역 요법은 종양 악성(tumor malignancy)을 갖는 환자의 치료에 대한 가능성을 보유한다. 일정 암에서의 이러한 초기 성공에도 불구하고, 종양의 치료는 주로 종양 미세 환경의 면역 억제 특성으로 인해 난제로 남아 있다. 문헌[Swarts et al. "Tumor Microenvironment Complexity: Emerging Roles in Cancer Therapy," Cancer Res, vol., 72, pages 2473-2480, 2012] 참고. 변형된 T-세포에 부가하여, NK 세포에 기초한 면역 요법이 탐구되고 있다. 자연 살해(NK) 세포는 선천성 면역계의 주요 구성 요소를 이루는 세포 독성 림프구이다. 일반적으로 순환 림프구의 약 10 내지 15%에 해당하는 자연 살해(NK) 세포는, 항원에 대해 비특이적으로 그리고 사전 면역 감작 없이, 바이러스-감염된 세포 및 다수의 악성 세포를 포함하는 표적화된 세포에 결합하고 이를 사멸시킨다. Herberman et al., Science 214:24 (1981). NK-92®는 비-호지킨 림프종을 앓는 대상체의 혈액에서 발견된 다음 생체외에서 불멸화되는 세포 용해성 암 세포주이다. NK-92® 세포는 NK 세포로부터 유래되나, 정상 NK 세포에 의해 표시되는 주요 저해 수용체는 결여하는 한편, 활성화 수용체의 대부분을 보유한다. 그러나, NK-92® 세포는 정상 세포를 공격하지도 않고 인간에게 달갑지 않은 면역 거부 반응을 유도하지도 않는다.
림프절 전이의 통상적인 동인은, 나이브(
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) T-세포 및 수지상 세포에서 주로 발견되는 케모카인 수용체인 CCR7의 저산소증에 의해 추진되는 상향 조절이다. 혈액 NK 세포 상 CCR7 수용체의 상향 조절은 NK 세포의 림프절로의 귀소를 개선하여, 그로 하여금 전이성 확산의 통상적 경로인 림프절 구획에 이르는 동일한 경로를 따라갈 수 있도록 하는 것으로 이전에 입증되었으나, 임상적으로 관련된 세포주에서는 아직 입증되지 않았다.
따라서, 특히 종양 미세 환경으로의 NK 세포 귀소 및 이의 조절의 맥락에서, NK 세포 및 NK 세포 기반 요법을 개선할 필요가 여전히 존재한다.
다수의 기능 요소를 인코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 NK-92® 세포가 본원에서 제공된다. 기능적 요소는 전형적으로 면역 요법을 위한 세포주로서의 세포의 효과를 개선하는 특정 기능을 제공하는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 일 양태에서, NK-92® 세포는 4 개의 기능적 요소를 인코딩하는 핵산 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 4 개의 기능적 요소를 인코딩하는 서열을 포함한다("4 시스트론(Quadricistronic) 작제물"로 지칭됨).
일부 구현예에서, 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 제1 요소는 IL-2 또는 IL-15와 같은 사이토카인을 발현하는 NK-92® 세포에 대해 선택을 제공하는 사이토카인이다. 따라서, 일부 구현예에서, 핵산은 IL-2 또는 IL-15와 같은 사이토카인을 인코딩한다. 일 구현예에서, IL-2는 IL-2를 소포체 IL-2("erIL-2")로 안내하는 신호 서열과 함께 발현된다. 또 다른 구현예에서, IL-15는 IL-15를 소포체 IL-15("erIL-15")로 안내하는 신호 서열과 함께 발현된다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 제2 요소는 Fc 수용체이다. 일부 구현예에서, Fc 수용체는 Fc-감마 수용체(FCγR)이다. 일부 구현예에서, Fc-감마 수용체는, IgG 항체에 결합하고 ADCC를 활성화하는 저친화성 Fc 수용체인 FCγRIII-A(CD16이라고도 함)이다. 일부 구현예에서, CD16 수용체는 폴리펩티드의 성숙한 형태의 아미노산 위치 158에서, 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F158V)을 포함한다(SEQ ID NO: 12)(신호 서열을 포함하는 폴리펩티드의 전장 형태의 위치 176에 대응함). 일 구현예에서, Fc 수용체는 SEQ ID NO: 13의 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 요소는 핵산 작제물에 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 Fc 수용체(CD16 등) 및 erIL-2를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 제3 요소는 귀소 수용체이다. 일부 구현예에서, 귀소 수용체는 사이토카인 수용체, G 단백질-결합 수용체, 케모카인 수용체, 세포 접착 분자, 셀렉틴, 또는 인테그린이다. 일부 구현예에서, 귀소 수용체는 핵산의 전사를 가능하게 하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 변형된 NK-92® 세포는 수용체에 대한 리간드인 케모카인의 공급원을 향하여 이동할 수 있다. 정상 혈액-유래 NK 세포와 달리, 변형된 NK-92® 세포는 인간 임상 시험을 위해 관련된 세포주로 개발될 수 있으며, 이는 면역 요법에 분명한 이점을 제공한다. 귀소 수용체의 예로는, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7, CX3CR1, XCR1, CCXCKR, D6, DARC, 또는 CXCL14에 대한 수용체를 포함하나 이에 한정되지 않는 케모카인 수용체와 같은 G 단백질-결합 수용체; 사이토카인 수용체; L-셀렉틴(CD62L)을 포함하는 셀렉틴과 같은 세포 접착 분자; α4β7 인테그린, LPAM-1, 및 LFA-1과 같은 인테그린이 포함된다. 일부 구현예에서, 귀소 수용체는 LFA-1과 같은 세포 접착 분자이다. 일부 구현예에서, 귀소 수용체는 L-셀렉틴(CD62L)과 같은 셀렉틴이다. 일부 구현예에서, 귀소 수용체는 α4β7 인테그린, LPAM-1, 또는 VLA-4와 같은 인테그린이다. 일부 구현예에서, 귀소 수용체는 C-C 또는 C-X-C 케모카인 수용체이다. 따라서, 일부 구현예에서, 핵산에 의해 인코딩되는 제3 요소는 본원에 기재된 귀소 수용체이다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 제3 요소는 분비되는 사이토카인이며, 이에 의해 사이토카인은 면역 치료제로서의 NK-92® 세포의 기능을 증가시키거나 개선한다. 사이토카인은 또한 종양 미세 환경을 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 미세 환경을 조절하는 분비되는 사이토카인은 IL-12 또는 IFN-알파이다. 따라서, 일부 구현예에서, 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 제3 요소는 IL-12 또는 IFN-알파와 같은 사이토카인이다.
따라서, 일부 구현예에서, 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 제3 요소는 XCL1, CCL5, CCL21 또는 CCL16과 같은 케모카인이다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 제3 요소는 톨-유사 수용체(Toll-like Receptor, TLR) 작용제이다.
일 양태에서, 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 제3 요소는 IL-12이다.
종양 내 TGF-β 발현은 종양 미세 환경에서 백혈구의 항종양 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 제3 요소는 TGF-베타 저해제, 예를 들어 TGF-β를 저해하는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 제3 요소는 TGF-베타 트랩이다. 일부 구현예에서, TGF-베타 트랩은 TGFβRII 분자의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TGF-베타 트랩은 TGFβRII 분자의 세포외 도메인의 단일 사슬 이량체를 포함하고, 가장 바람직하게는 TGF-베타 수용체 II 엑토도메인의 단일 사슬 이량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 NK 세포는 TGF-β 저해제와 함께 투여되어 TGF-β를 차단하고 면역 억제 제거를 돕는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 NK 세포는 다른 면역 요법과 함께 투여되어 종양 감소 또는 제거를 돕는다. 예를 들어, TGF-β는 폴리(I:C) 및 α-CD40 항체의 종양 내 주사와 조합된 저해 펩티드의 종양 내 주사에 의해 저해될 수 있다. 일부 구현예에서, TGF-β 저해제는 IL-2와 조합된다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 제4 요소는 항원 결합 단백질("ABP")이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 종양 관련 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, ABP는 scFv와 같은 항체의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하거나 그 일부이다. 일부 구현예에서, 핵산은 CD19, CD20, NKG2D 리간드, CS1, GD2, CD138, EpCAM, HER-2, EBNA3C, GPA7, CD244, CA-125, MUC-1, ETA, MAGE, CEA, CD52, CD30, MUC5AC, c-Met, EGFR, FAP, WT-1, PSMA, NY-ESO1, CSPG-4, IGF1-R, Flt-3, CD276, CD123, PD-L1, BCMA, CD33, B7-H4, 또는 41BB에 특이적으로 결합하는 ABP 또는 CAR을 인코딩한다.
또 다른 양태에서, 변형된 NK-92® 세포는 IL-12를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 또 다른 양태에서, 변형된 NK-92® 세포는 TGF-베타 트랩을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, TGF-베타 트랩은 TGFβRII 분자의 세포외 도메인의 단일 사슬 이량체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 변형된 NK-92® 세포는, 사이토카인을 발현하는 NK-92® 세포의 선택을 제공하거나 이의 생존을 가능하게 하는 사이토카인을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 IL-2 또는 IL-15와 같은 사이토카인을 인코딩한다. 일 구현예에서, IL-2는 IL-2를 소포체 IL-2("erIL-2")로 안내하는 신호 서열과 함께 발현된다. 일 구현예에서, IL-15는 IL-15를 소포체 IL-2("erIL-15")로 안내하는 신호 서열과 함께 발현된다.
일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 Fc 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 수용체는 Fc-감마 수용체(FCγR)이다. 일부 구현예에서, Fc-감마 수용체는, IgG 항체에 결합하고 ADCC를 활성화하는 저친화성 Fc 수용체인 FCγRIII-A(CD16이라고도 함)이다. 일부 구현예에서, CD16 수용체는 폴리펩티드의 성숙한 형태의 아미노산 위치 158에서, 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F158V)을 포함한다(SEQ ID NO: 12)(신호 서열을 포함하는 폴리펩티드의 전장 형태의 위치 176에 대응함). 일 구현예에서, Fc 수용체는 SEQ ID NO: 13의 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 항원 결합 단백질("ABP")을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 종양 관련 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, ABP는 scFv와 같은 항체의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하거나 그 일부이다. 일부 구현예에서, 핵산은 CD19, CD20, NKG2D 리간드, CS1, GD2, CD138, EpCAM, HER-2, EBNA3C, GPA7, CD244, CA-125, MUC-1, ETA, MAGE, CEA, CD52, CD30, MUC5AC, c-Met, EGFR, FAP, WT-1, PSMA, NY-ESO1, CSPG-4, IGF1-R, Flt-3, CD276, CD123, PD-L1, BCMA, CD33, B7-H4, 또는 41BB에 특이적으로 결합하는 ABP 또는 CAR을 인코딩한다.
또 다른 양태에서, 변형된 NK-92® 세포는 종양 미세 환경을 조절하는 분비되는 사이토카인을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 종양 미세 환경을 조절하는 사이토카인은 XCL1, CCL5, CCL21 또는 CCL16과 같은 케모카인이다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 톨-유사 수용체(TLR) 작용제를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 IL-12 또는 IFN-알파를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 TGF-베타 저해제, 예를 들어 TGF-β를 저해하는 펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 TGF-베타 트랩을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, TGF-베타 트랩은 TGFβRII 분자의 세포외 도메인, 또는 TGFβRII 분자의 세포외 도메인의 단일 찬(single chan) 이량체를 포함한다.
일 양태에서, 변형된 NK-92® 세포는, 귀소 수용체, ABP 또는 CAR, Fc 수용체, 및/또는 사이토카인을 발현하는 NK-92® 세포의 선택을 제공하거나 이의 생존을 가능하게 하는 사이토카인을 인코딩하는 핵산 분자 중 하나 이상 또는 복수를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 케모카인 수용체, CAR, CD16, 및 erIL-2를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 CCR7 또는 CXCR2, CAR, CD16, 및 erIL-2를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 IL-12 또는 TGF-베타 트랩, CAR, CD16, 및 erIL-2를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 Fc 엡실론 수용체 감마(FcεRIγ)로부터의 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, CAR은 NK-92® 세포에 의해 일시적으로 발현된다. 일 구현예에서, CAR은 NK-92® 세포에 의해 안정적으로 발현된다.
현재까지, 다른 신호 전달 도메인(예를 들어, CD3ζ)이 특히 추가의 신호 전달 도메인과 조합될 때(2 세대 및 3 세대 CAR) 더 효율적인 것으로 결정되었기 때문에 FcεRIγ-함유 CAR은 NK-92® 세포, 다른 NK 세포주, 또는 내인성 NK 세포에서 사용되지 않았다. FcεRIγ로부터의 세포내 도메인을 포함하는 "1-세대" CAR을 발현하는 NK-92® 세포가, CD3ζ 신호 전달 도메인 단독을 갖거나 다른 신호 전달 도메인과 조합된 CAR(즉, 2 세대 또는 3 세대 CAR)을 발현하는 NK-92® 세포보다 CAR에 의해 인식되는 항원을 발현하는 암 세포에 대해 동일하거나 더 높은 세포 독성 활성을 갖는다는 예상치 못한 놀라운 발견이 본원에 기재되어 있다. 일 구현예에서, 본원에서 고려되는 CD3ζ 신호 전달 도메인은 SEQ ID NO: 40과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
일 양태에서, NK-92® 세포의 표면 상에 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 NK-92® 세포 또는 세포주가 기재되며, 여기서 상기 CAR은 FcεRIγ의 세포질 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, FcεRIγ의 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 31과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, FcεRIγ의 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 32와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, CAR은 CD8로부터의 힌지 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD28로부터의 막 관통 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, NK-92® 세포 또는 세포주는 SEQ ID NO: 31(FcεRIγ 세포내 세포질 도메인), SEQ ID NO: 32(FcεRIγ 세포내 신호 전달 도메인에서 막 관통 도메인을 뺀 것), SEQ ID NO: 33(CD8 힌지 영역), SEQ ID NO: 34(CD8 힌지 영역 DNA), SEQ ID NO: 35(CD28 막 관통 도메인) 및/또는 SEQ ID NO: 36(CD28 막 관통 도메인에서, ITAM 또는 세포내 서열을 뺀 것)을 포함하는 핵산 작제물을 이용하여 유전적으로 변형된다. 일 구현예에서, CD8 힌지 영역, CD28 막 관통, 및 FceRI감마 신호 전달 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 37 또는 SEQ ID NO: 38과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 핵산 서열의 전사를 촉진하는 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 핵산 서열로부터 전사된 mRNA의 내부 영역으로부터의 번역 개시를 가능하게 하기 위한 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는 다중-시스트론 벡터이다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 동일한 mRNA에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 등몰 수준을 생산하기 위해, T2A, P2A, E2A, 또는 F2A 펩티드와 같은 2A 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 항원 결합 단백질(ABP)을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, ABP는 scFv 또는 코돈 최적화된 scFv이다. 일부 구현예에서, ABP는 종양 세포에 의해 발현되는 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, ABP는 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부이다. 일부 구현예에서, 작제물은, IL-2와 같은 사이토카인을 발현하는 NK-92® 세포의 선택을 제공하거나 이의 생존을 가능하게 하는 사이토카인을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 사이토카인은 소포체로 표적화된다. 일 구현예에서, CAR scFv는 SEQ ID NO: 39와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 작제물은 도 10에 나타낸 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포 또는 세포주는 세포 표면 상에 CD16을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 일 구현예에서, NK-92® 세포 또는 세포주는 세포 표면 상에 고친화성 CD16(F158V)을 발현하도록 유전적으로 변형된다.
일 구현예에서, ABP 또는 CAR은 종양-관련 항원을 표적화하거나 이에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 종양-관련 항원은 CD19, CD20, NKG2D 리간드, CS1, GD2, CD138, EpCAM, HER-2, EBNA3C, GPA7, CD244, CA-125, MUC-1, ETA, MAGE, CEA, CD52, CD30, MUC5AC, c-Met, EGFR, FAP, WT-1, PSMA, NY-ESO1, CSPG-4, IGF1-R, Flt-3, CD276, CD123, PD-L1, BCMA, CD33 B7-H4, 및 41BB로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 종양-관련 항원은 CD19이다. 또 다른 구현예에서, 종양-관련 항원은 CD33이다.
일 양태에서, 본 개시 내용은 FcεRIγ의 세포질 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산에 의해 형질 전환된 NK-92® 세포주에 관한 것이며, 여기서 CAR은 NK-92® 세포의 표면 상에서 발현된다. 일 구현예에서, 핵산은 RNA이다. 일 구현예에서, 핵산은 DNA이다.
일부 구현예에서, NK-92® 세포는, 사이토카인을 발현하는 NK-92® 세포의 선택을 제공하거나 이의 생존을 가능하게 하는 적어도 하나의 사이토카인 또는 이의 변이체를 발현하도록 추가로 변형된다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 사이토카인은 NK-92® 세포에 의해 일시적으로 발현된다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 사이토카인은 NK-92® 세포에 의해 안정적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 본원에 기재된 핵산 분자 중 하나 이상 또는 복수를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 핵산 분자의 전사를 개시할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 복수의 핵산 분자의 각 핵산 분자는 분리된 별개의 및/또는 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자 중 하나 이상은 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일 구현예에서, 귀소 수용체, CAR, Fc 수용체 및 사이토카인을 인코딩하는 핵산 분자는 동일한 프로모터 또는 단일 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일 구현예에서, 사이토카인을 인코딩하는 핵산 분자는 귀소 수용체, CAR, 및 Fc 수용체(예를 들어, CD16 또는 고친화성 CD16)를 인코딩하는 핵산 분자의 다운스트림 또는 3'에 위치한다.
일부 구현예에서, NK-92® 세포는 세포 표면 상에 본원에 기재된 핵산 분자에 의해 인코딩되는 단백질을 발현한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 세포 표면 상에 귀소 수용체, ABP 또는 CAR, 및 Fc 수용체(예를 들어, CD16 또는 고친화성 CD16)를 발현한다.
변형된 NK-92® 세포를 포함하는 조성물 및 키트가 또한 제공된다. 변형된 세포를 제조하는 방법 및 세포를 이용하여 암을 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, 암을 치료하거나 종양의 크기를 저감하는 방법이 기재된다. 일부 구현예에서, 암을 치료하거나 종양의 크기를 저감하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 변형된 NK-92® 세포의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 투여는 대상체에서 암을 치료하거나 종양의 크기를 저감한다. 일부 구현예에서, 방법은 귀소 수용체, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 ABP 또는 CAR, CD16 또는 CD16-158V와 같은 Fc 수용체, 및/또는 erIL-2 또는 erIL-15와 같은 사이토카인을 인코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 NK-92® 세포의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 분비되는 사이토카인, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 ABP 또는 CAR, CD16 또는 CD16-158V와 같은 Fc 수용체, 및/또는 erIL-2 또는 erIL-15와 같은 사이토카인을 인코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 NK-92® 세포의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 NK 세포는 TGF-β 저해제와 함께 투여되어 TGF-β를 차단하고 면역 억제 제거를 돕는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 NK 세포는 다른 면역 요법과 함께 투여되어 종양 감소 또는 제거를 돕는다. 예를 들어, TGF-β는 폴리(I:C) 및 α-CD40 항체의 종양 내 주사와 조합된 저해 펩티드의 종양 내 주사에 의해 저해될 수 있다. 일부 구현예에서, TGF-β 저해제는 IL-2와 조합된다.
또 다른 양태에서, 질병을 치료하기 위한, 본원에 기재된 조성물의 용도가 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 NK-92® 세포는 질병 치료를 위한 약제로서의 사용을 위해 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 NK-92® 세포는 질병 치료에서의 사용을 위해 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 귀소 수용체, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 ABP 또는 CAR, CD16 또는 CD16-158V와 같은 Fc 수용체, 및/또는 erIL-2 또는 erIL-15와 같은 사이토카인을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 분비되는 사이토카인, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 ABP 또는 CAR, CD16 또는 CD16-158V와 같은 Fc 수용체, 및/또는 erIL-2 또는 erIL-15와 같은 사이토카인을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 질병은 암이다.
하나 이상의 구현예의 상세 사항은 첨부된 도면 및 하기의 설명에서 제시된다. 다른 특징, 목적, 및 이점은 설명 및 도면으로부터, 및 청구 범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 NK-92® 세포에서 AAVS1 유전자좌에서의 삽입을 위한 CCR7 수용체를 함유하는 플라스미드 pNKAT-CCR7-LP3을 나타내는 개략도이다.
도 2는 NFAT-반응성 CCL21 유전자를 함유하는 플라스미드 pCRENFAT-CCL21을 나타내는 개략도이다.
도 3은 야생형 NK-92® 세포 및 CCR7을 발현하는 변형된 NK-92® 세포에서 NK-92® 세포와 관련된 표현형 마커의 발현을 나타내는 그래프이다. (레인 1: aNK(야생형); 레인 2: 변형된 NK-92® 세포(MA3); 레인 3: 변형된 NK-92® 세포(MB4); 레인 4: 변형된 NK-92® 세포(MB6); 레인 5: 변형된 NK-92® 세포(ME6); 레인 6: 변형된 NK-92® 세포(MH3); A: 이소형(APC); B: CD54(ICAM-1); C: NKp30; D: NKG2D
도 4는 K562 세포에 대한 CCR7을 발현하는 변형된 NK-92® 세포의 사이톡식(cytoxic) 활성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 HL-60 세포에 대한 CCR7을 발현하는 변형된 NK-92® 세포의 사이톡식 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 (NK-92 세포를 CD19-CAR에 대한 mRNA로 전기 천공하였을 때) K562 및 SUP-B15 세포에 대한 결합의 맥락에서 입증된 NK-92 세포에서의 NFAT-루시페라제 리포터 유전자의 활성화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 케모카인 CCL19 및 CCL21을 향해 이동되는 CCR7(Mi-aNK)을 발현하는 변형된 NK-92® 세포를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본원에 기재된 변형된 NK-92® 세포의 시험관내 테스트를 위한 예시적인 방법을 나타내는 다이어그램을 나타낸다. 활성화된 NK-92® 세포(aNK)는 케모카인 수용체(예를 들어, CCR7)를 발현하도록 변형하였고, 표적 세포는 수용체(예를 들어, CCL19 또는 CCL21)에 결합하는 케모카인을 발현하도록 변형하였다. 변형된 NK-92® 세포는 나타난 바와 같이 변형된 보이덴 챔버 트랜스웰 분석(Modified Boyden Chamber Transwell Assay)에서 테스트하였다.
도 9는 본원에 기재된 변형된 NK-92® 세포를 사용한 대표적인 세포 독성 분석을 나타낸다. 도 8로부터의 변형된 NK-92® 세포는, 하나 또는 둘 모두의 케모카인 리간드를 발현하고 분비하는 K562 표적 세포에 대한 세포 독성에 대해 테스트하였다. ML4 클론이 가장 높은 표적 세포의 용해 백분율을 나타냈고, K562 표적 세포가 CCL19 및 CCL21 둘 모두를 발현할 때 백분율이 증가하였다.
도 10은 단일 삽입 위치에서 세포를 안정적으로 형질 감염시키는 데 사용될 수 있는, "4 시스트론 벡터"로 지칭되는 플라스미드 pNKAT-CCR7-CD19CAR-CD16-ERIL2를 나타내는 개략도이다.
도 11은 도 10으로부터의 선형화된 플라스미드를 나타내는 개략도이다.
도 12a 및 도 12b는 NK-92® 세포에 의한 CCR7, CD16, 및 CD19 CAR의 세포 표면 발현을 나타낸다. "aNK"는 야생형 NK-92® 세포주이다. "ML4"는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 CCR7을 인코딩하는 핵산 작제물로 형질 감염된 aNK 세포주이다(즉, Mi-aNK). "P2"는 CCR7, CD16, ER-IL2 및 CD19 CAR을 인코딩하는 핵산 작제물로 형질 감염된 aNK 세포주이다(즉, Mi- T-haNK).
도 13. NK 세포 투여 후 표시된 시간에 비-CR 대 Mi-T-haNK 세포의 모 종양 또는 CCL19-발현 종양으로의 귀소. 데이터는 평균 ± SEM이다. - 및 + 기호는 CCR7 수용체(제1 기호) 및 CCL19 리간드(제2 기호)의 발현 상태를 표시한다. *, 일원 분산분석(ANOVA) 후 투키 테스트(Tukey's test)에 의한 다중 비교에 의해, P<0.05. 마지막 패널은 시간 경과 곡선을 나타낸다.
도 14. 투약 후 24 시간째에 단일 동물에서 모 종양 또는 CCL19-발현 종양으로의 비-CR 및 Mi-T-haNK 세포 침윤의 일대일 비교. Mi-T-haNK 세포를 제공받은 4 마리 동물 중 3 마리는 CCL19+ 종양으로의 더 높은 침윤을 나타낸 반면, 비-CR CD19 t-haNK 세포를 제공받은 4 마리 동물 중 3 마리는 K562 및 K-19 종양 둘 모두로의 유사한 수준의 침윤을 나타낸다. 각각의 그룹에서 하나의 "이상치(outlier)" 동물은 점선으로 표시된다.
도 15는 IV 라지(Raji)-19.5 종양-보유 동물의 생존 곡선을 도해한다. 비히클, CD19 t-haNK 세포, 또는 R7-19.1 세포로 처리된 라지-19.5 IV 종양-보유 NSG 마우스에 대한 생존 곡선. 통계 분석은 로그-순위(Log-rank)(만텔-콕스(Mantel-Cox)) 테스트로 수행하였다. ***, P=0.0002; ****, P<0.0001.
도 16은 IV 라지-19.5 종양 모델에서의 체중 변화를 도해한다. 비히클, CD19 t-haNK 세포, 또는 R7-19.1 세포로 처리된 IV 라지-19.5 종양 보유 동물에 대한 체중 변화 곡선(0 일차 체중에 대한 변화%). 데이터는 평균 ± SEM이다. 빨간색 화살표는 투약일을 나타낸다. 투약일에 행해진 중량 측정은 용량 투여 전에 수행하였다. 20 일차 전의 모든 시점에 대해, NK 세포 처리된 그룹에 대한 곡선은 이원 분산분석 후 투키 테스트에 의한 다중 비교에 의해 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이(P<0.05)에 도달하였다.
도 17은 무작위화 시 SC 라지-19.5 종양의 크기를 도해한다. 무작위화 시 개별 종양 크기가 나타난다. 검은색 박스는 크기가 200 mm3 초과인 큰 종양을 에워싸고, 파란색 박스는 200 mm3 미만의 작은 종양을 에워싸고 있다. 그룹 평균 ± SEM 또한 표시된다.
도 18은 SC 라지-19.5 종양-보유 마우스의 큰-종양 하위-집단에 대한 종양 성장을 도해한다. (A) 그룹 분석. 데이터는 평균 ± SEM이다. 통계 분석은 이원 혼합-효과 분석 후 투키 테스트에 의한 다중 비교를 사용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 달성되지 않았다. (B) 개별 곡선. 빨간색 화살표는 투약일을 나타낸다. Tx: 치료.
도 19는 SC 라지-19.5 종양-보유 마우스의 작은-종양 하위-집단에 대한 종양 성장을 도해한다. (A) 그룹 분석. 데이터는 평균 ± SEM이다. 통계 분석은 이원 혼합-효과 분석 후 투키 테스트에 의한 다중 비교를 사용하여 수행하였다. 어느 시점에서도 임의의 두 그룹 간의 통계적 유의성은 발견되지 않았다. (B) 개별 곡선. 빨간색 화살표는 투약일을 나타낸다. Tx: 치료.
도 20은 SC 라지-19.5 종양 모델에서의 체중 변화를 도해한다. 비히클, CD19 t-haNK 세포, 또는 R7-19.1 세포로 처리된 SC 라지-19.5 종양 보유 동물에 대한 체중 변화 곡선(1 일차 체중에 대한 변화%). 데이터는 평균 ± SEM이다. 빨간색 화살표는 투약일을 나타낸다. 투약일에 행해진 체중 측정은 용량 투여 전에 수행하였다. 16 일차 전의 모든 시점에 대해, NK 세포 처리된 그룹에 대한 곡선은 이원 혼합-효과 분석 후 투키 테스트에 의한 다중 비교에 의해 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이에 도달하였다.
도 21은 4-시스트론 TGFβ-트랩 아머링된(armored) PD-L1 CAR 작제물의 일 구현예를 도해한다.
도 22는 PD-L1(TGFβ-트랩) t-haNK 클론에서의 PD-L1 CAR 및 CD16의 발현 분석을 도해한다.
도 23은 TGFb 트랩이 TGFβ트랩/PD-L1 t-haNK 클론의 배양 상청액으로 분비되는 것을 도해한다.
도 24는 K562 표적 세포에 대한 4-시스트론 TGFβ-트랩 작제물의 세포 독성을 도해한다.
도 25는 PD-L1을 발현하는 SUP-B15 표적 세포에 대한 4-시스트론 TGFβ-트랩 작제물의 CAR 살해를 도해한다.
도 26은 MDA-MB 231 표적 세포에 대한 4-시스트론 TGFβ-트랩 작제물의 CAR 살해를 도해한다.
도 27은 SUP-B15 CD19-CD20+에 대한 4-시스트론 TGFβ-트랩 작제물의 ADCC를 도해한다.
도 28은 TGFβ에 의해 유도되는 TGFβ/SMAD 루시페라제 리포터 HEK293 세포를 도해한다.
도 29는 HEK293T 리포터 분석에서 분비되는 TGFβ-트랩 격리된 TGFβ 및 저해된 루시페라제 발현을 도해한다.
도 30은 IL-12 바이러스로 형질 도입된 NK-92® 세포주로부터의 IL-12 분비를 도해한다.
도 31은 4-시스트론 IL-12/PD-L1 t-haNK 작제물의 일 구현예를 도해한다.
도 32는 CCR7 CD19 t-haNK 세포에 대한 세포 독성 데이터를 도해한다.
도 33은 IL-12/PD-L1 t-haNKTM 세포주로부터의 IL-12 분비를 도해한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 면역학 및 면역 요법 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 이어지는 청구범위에서, 다음 의미를 갖도록 정의되어야 하는 다수의 용어가 언급될 것이다:
본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 기술하기 위한 목적을 가질 뿐이며 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 분명하게 지시하지 않는 한, 복수 형태 또한 포함하는 것으로 의도된다.
범위를 포함하여, 모든 숫자 명시, 예를 들어 pH, 온도, 시간, 농도, 양, 및 분자량은 당업자가 보통 접하는 변동을 포함한다. 따라서, 수치는 관련 유효 자릿수에 따라, 적절한 경우 0.1 또는 1.0의 (+) 또는 (-) 증분의 변동을 포함할 수 있다. 항상 명시적으로 언급된 것은 아니지만, 용어 "약(about)"이 모든 숫자 명시 앞에 올 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 용어 "약"은 또한 값이 ±1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 변할 수 있음을 의미할 수 있다.
또한, 항상 명시적으로 언급된 것은 아니지만, 본원에 기재된 시약은 단지 예시일 뿐이며 이의 등가물이 당업계에 알려져 있음이 이해되어야 한다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 후속하여 기재되는 사건 또는 환경이 발생할 수 있거나 발생할 수 없음을 의미하며, 이러한 기재는 사건 또는 환경이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
용어 "포함하는(comprising)"은 조성물 및 방법이 열거된 요소를 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용될 때, "본질적으로 구성되는"은 조합에 대해 임의의 본질적 의미의 다른 요소를 배제하는 것을 의미해야 한다. 예를 들어, 본원에 정의된 요소들로 본질적으로 구성된 조성물은 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 요소를 배제하지 않을 것이다. "구성되는"은 열거된 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량보다 많은 것을 배제하는 것을 의미해야 한다. 이들 전환어 각각에 의해 정의되는 구현예는 본 개시의 범위 내에 있다.
용어 "귀소 수용체"는 직접 또는 간접적으로 세포가 표적 세포 또는 조직을 향하여 이동하는 것을 초래하는 세포 경로를 활성화하는 수용체를 지칭한다. 예를 들어, 백혈구에 의해 발현되는 귀소 수용체는 백혈구 및 림프구가 고 내피 세정맥을 통해 2 차 림프 조직으로 들어가는 데 사용된다. 귀소 수용체는 또한 세포가 케모카인 구배와 같은 화학적 구배의 공급원을 향하여 이동하는 데 사용될 수 있다. 귀소 수용체의 예로는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7, CX3CR1, XCR1, CCXCKR, D6, 및 DARC를 포함하나 이에 한정되지 않는 케모카인 수용체와 같은 G-단백질 결합 수용체; 사이토카인 수용체; L-셀렉틴(CD62L)을 포함하는 셀렉틴, α4β7 인테그린, LPAM-1, 및 LFA-1과 같은 인테그린과 같은 세포 접착 분자가 포함된다. 귀소 수용체는 일반적으로 표적 조직 또는 세포 상의 동족 리간드에 결합한다. 일부 구현예에서, 귀소 수용체는 점막 혈관 어드레신 세포 접착 분자 1(MAdCAM-1)과 같은 세정맥 내피 상의 어드레신에 결합한다.
본원에 사용된 "면역 요법"은, 단독 또는 조합 여부에 관계없이, NK-92® 세포, 변형된 또는 변형되지 않은, 자연 발생된 또는 변형된 NK 세포 또는 T-세포의 사용을 지칭하며, 이는 표적 세포 접촉 시 세포 독성을 유도할 수 있다.
본원에 사용된 "자연 살해(NK) 세포"는 특정 항원 자극의 부재 하에, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스에 따른 제한 없이 표적 세포를 살해하는 면역계의 세포이다. NK 세포는 CD56의 존재 및 CD3 표면 마커의 부재를 특징으로 한다.
용어 "내인성 NK 세포"는 NK-92® 세포주와 구별되는, 공여자(또는 환자)로부터 유래된 NK 세포를 지칭하기 위해 사용된다. 내인성 NK 세포는 일반적으로 NK 세포가 강화된 이질적인 세포 집단이다. 내인성 NK 세포는 환자의 자가 또는 동종 이계 치료를 위해 의도될 수 있다.
용어 "NK-92"는 문헌[Gong et al.(1994)]에 기재된 매우 강력하고 고유한 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이에 대한 권리는 난퀘스트(NantKwest)®가 소유하고 있다(이하, "NK-92® 세포"). 불멸의 NK 세포주는 원래 비-호지킨 림프종 환자로부터 수득한 것이다. 달리 표시되지 않는 한, 용어 "NK-92®"는 원래의 NK-92® 세포주뿐만 아니라 변형된(예를 들어, 외인성 유전자의 도입에 의해) NK-92® 세포주도 지칭하는 것으로 의도된다. NK-92® 세포 및 이의 예시적이고 비-제한적인 변형은 미국 특허 번호 7,618,817; 8,034,332; 8,313,943; 9,181,322; 9,150,636; 및 공개된 미국 출원 번호 10/008,955에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로서 포함되고, 야생형 NK-92®, NK-92®-CD16, NK-92®-CD16-γ, NK-92®-CD16-ζ, NK-92®-CD16(F176V), NK-92®MI, 및 NK-92®CI를 포함한다. NK-92® 세포는 당업자에게 알려져 있으며, 이들에게 이러한 세포는 난퀘스트, 인크로부터 용이하게 입수 가능하다.
용어 "aNK"는 문헌[Gong et al.(1994)]에 기재된 매우 강력하고 고유한 세포주로부터 유래된 변형되지 않은 자연 살해 세포를 지칭하며, 이에 대한 권리는 난퀘스트가 소유하고 있다(이하, "aNK® 세포"). 용어 "haNK"는 문헌[Gong et al.(1994)]에 기재된 매우 강력하고 고유한 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이에 대한 권리는 난퀘스트가 소유하고 있고, 세포 표면 상에 CD16을 발현하도록 변형되었다(이하 "CD16+ NK-92® 세포" 또는 "haNK® 세포"). 일부 구현예에서, CD16+ NK-92® 세포는 세포 표면 상에 고친화성 CD16 수용체를 포함한다. 용어 "taNK"는 문헌[Gong et al.(1994)]에 기재된 매우 강력하고 고유한 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이에 대한 권리는 난퀘스트가 소유하고 있고, 키메라 항원 수용체를 발현하도록 변형되었다(이하 "CAR-변형된 NK-92® 세포" 또는 "taNK® 세포"). 용어 "t-haNK"는 문헌[Gong et al.(1994)]에 기재된 매우 강력하고 고유한 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이에 대한 권리는 난퀘스트가 소유하고 있고, 세포 표면 상에 CD16을 발현하고 키메라 항원 수용체를 발현하도록 변형되었다(이하 "CAR-변형된 CD16+ NK-92® 세포" 또는 "t-haNK 세포"). 일부 구현예에서, t-haNK 세포는 세포 표면 상에 고친화성 CD16 수용체를 발현한다.
용어 "케모카인 표적화된 t-haNK" 및 "Mi-T-haNK"는 세포 표면 상에 케모카인 수용체를 발현하도록 변형된 t-haNK 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "세포 독성" 및 "세포 용해성"은, NK-92® 세포와 같은 이펙터 세포의 활성을 기술하기 위해 사용될 때, 동의어인 것으로 의도된다. 일반적으로, 세포 독성 활성은 다양한 생물학적, 생화학적, 또는 생물 물리학적 메커니즘 중 임의의 것에 의한 표적 세포의 살해에 관한 것이다. 세포 용해는 이펙터가 표적 세포의 원형질막을 용해함으로써 그의 물리적 무결성을 파괴하는 활성을 더 구체적으로 지칭한다. 이는 표적 세포의 살해를 초래한다. 이론에 얽매이기 원하지 않지만, NK-92® 세포의 세포 독성 효과는 세포 용해에 기인한다고 여겨진다.
세포/세포 집단에 관해 용어 "살해하다"는 그 세포/세포 집단의 사멸을 야기할 임의의 유형의 조작을 포함하는 것과 관련이 있다.
용어 "Fc 수용체"는 Fc 영역으로 알려진 항체의 일부에 결합함으로써 면역 세포의 방어 기능에 기여하는 일정 세포(예를 들어, 자연 살해 세포)의 표면 상에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 항체의 Fc 영역과 세포의 Fc 수용체(FcR)의 결합은 항체-매개 식세포 작용 또는 항체-의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC)을 통해 세포의 식세포 또는 세포 독성 활성을 자극한다. FcR은 그들이 인식하는 항체 유형에 기초하여 분류된다. 예를 들어, Fc-감마 수용체(FCγR)는 항체의 IgG 클래스에 결합한다. FCγRIII-A(CD16이라고도 함)는, IgG 항체에 결합하고 ADCC를 활성화하는 저친화성 Fc 수용체이다. FCγRIII-A는 전형적으로 NK 세포 상에서 발견된다. NK-92® 세포는 FCγRIII-A를 발현하지 않는다. Fc-엡실론 수용체(FcεR)는 IgE 항체의 Fc 영역에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체"(CAR)는 세포내 신호 전달 도메인에 융합된 세포외 항원-결합 도메인을 지칭한다. CAR은 T 세포 또는 NK 세포에서 발현되어 세포 독성을 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 세포외 항원-결합 도메인은 관심 세포 상에서 발견되는 항원에 특이적인 scFv이다. CAR-발현 NK-92® 세포는 scFv 도메인의 특이성에 기초하여, 세포 표면 상에 일정 항원을 발현하는 세포에 표적화된다. scFv 도메인은 종양-특이적 항원을 포함하는 임의의 항원을 인식하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, CD19CAR은 일부 암에 의해 발현되는 세포 표면 마커인 CD19를 인식한다.
본원에 사용된 용어 "종양-특이적 항원"은 암 또는 신생물 세포 상에 존재하지만 암 세포와 동일한 조직 또는 계통으로부터 유래된 정상 세포 상에서는 검출 가능하지 않은 항원을 지칭한다. 본원에 사용된 종양-특이적 항원은 또한 종양-관련 항원, 즉, 암 세포와 동일한 조직 또는 계통으로부터 유래된 정상 세포와 비교하여 암 세포 상에서 더 높은 수준으로 발현되는 항원을 지칭한다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 교환적으로 사용되며 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이의 유사체인, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3-차원 구조를 가질 수 있고, 알려지거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오티드의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 가로막힐 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 표지 성분과의 접합 등에 의해 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 용어는 또한 이중- 및 단일-가닥 분자 둘 모두를 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본 발명의 임의의 구현예는 이중-가닥 형태, 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 알려져 있거나 예측되는 2 개의 상보적인 단일-가닥 형태 각각 둘 모두를 포괄한다.
폴리뉴클레오티드는 4 개의 뉴클레오티드 염기의 특정 서열로 구성된다: 아데닌(A); 시토신(C); 구아닌(G); 티민(T); 및 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우 티민에 대한 우라실(U). 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드 서열"은 폴리뉴클레오티드 분자의 알파벳 표현이다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2 개의 펩티드 사이 또는 2 개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 서열 유사성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교되는 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되면, 분자는 그 위치에서 상동이다. 서열 간 서열 유사성 퍼센트는 주어진 비교 창에 대해 서열에 의해 공유되는 매칭된 또는 상동인 위치의 개수의 함수이다. 서열은 본원에 기재된 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 동일한 또는 동일성 퍼센트는, 하기 기재된 디폴트 파라미터를 갖는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사로(예를 들어, NCBI 웹 사이트 등 참고) 측정될 때 동일하거나 특정 백분율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는(즉, 비교 창 또는 지정된 영역에 대한 최대 상응성을 위해 비교 및 정렬되는 경우, 특정 영역에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 동일성) 2 개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 그때 이러한 서열은 실질적으로 동일하다고 일컬어진다. 이 정의는 또한 테스트 서열의 칭찬을 지칭하거나, 그에 적용될 수 있다. 정의는 또한 결실 및/또는 부가가 있는 서열뿐만 아니라, 치환이 있는 것들도 포함한다. 하기 기재되는 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 갭(gap) 등을 설명할 수 있다. 일부 구현예에서, 동일성은 길이가 적어도 약 25 개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역, 또는 길이가 50 내지 100 개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 대해 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 테스트 서열과 비교되는 참조 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 테스트 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고; 필요에 따라 하위서열 좌표를 지정하고; 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 바람직하게는, 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 비한 테스트 서열에 대한 서열 동일성 퍼센트를 계산한다.
본원에 사용된 비교 창은 20 내지 600 개, 통상적으로 약 50 내지 약 200 개, 보다 통상적으로 약 100 내지 약 150 개로 구성된 군으로부터 선택되는 인접 위치 개수 중 임의의 하나의 세그먼트에 대한 참조를 포함하며, 여기서 서열은 두 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해; 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해; 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)]의 유사성 검색 방법에 의해; 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현에 의해(위스콘신, 매디슨, 사이언스 드라이브 575, 유전학 컴퓨터 그룹, 위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA); 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)] 참고) 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트를 결정하는 데 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 각각 문헌[Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)] 및 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기재되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 핵산 또는 단백질에 대한 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 본원에 기재된 파라미터를 이용하여 사용된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는, 당업계에 알려진 바와 같이, 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 이 알고리즘은 먼저 질의 서열에서 선택된 길이 (W)의 짧은 단어들을 식별함으로써 고득점 서열 쌍(high scoring sequence pair, HSP)을 식별하는 것을 포함하며, 이는 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 단어와 정렬된 경우 어떤 양의(positive) 임계값 점수 T와 일치하거나 이를 충족한다. T는 이웃 단어 점수 임계값(상기 Altschul et al.)으로 지칭된다. 이러한 초기 이웃 단어 히트(hit)는 이를 포함하는 더 긴 HSP를 찾기 위해 검색을 개시하기 위한 시드(seed) 역할을 한다. 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양방향 모두로 확장된다. 뉴클레오티드 서열의 경우, 파라미터 M(일치하는 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 0보다 큼) 및 N(불일치 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 0보다 작음)을 사용하여 누적 점수가 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 누적 점수를 계산하기 위해 평점 매트릭스(scoring matrix)이 사용된다. 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값으로부터 수량 X만큼 하락하거나; 하나 이상의 음의 점수를 내는 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하로 되거나; 어느 한쪽의 서열의 단부에 도달한 경우, 각 방향에서의 단어 히트의 확장이 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정한다. 기대값(E)은 우연히 데이터베이스 검색에서 발생할 것으로 기대되는 것과 동등하거나 이보다 더 양호한 점수를 갖는 상이한 정렬의 수를 나타낸다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 단어 길이(W) 11, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4, 및 두 가닥 모두의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로 단어 길이 3, 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 평점 매트릭스(문헌[Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)] 참고), 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4를 사용한다.
본원에 사용된 용어 형질 전환은 외인성 또는 이종성 핵산 분자(예를 들어, 벡터 또는 재조합 핵산 분자)가 수용 세포 내로 도입되는 과정을 지칭한다. 외인성 또는 이종성 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA 내로 통합(즉, 이에 공유 연결)되거나 통합되지 않을 수 있다. 예를 들어, 외인성 또는 이종성 폴리뉴클레오티드는 플라스미드와 같은 에피솜 요소 상에 유지될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 외인성 또는 이종성 폴리뉴클레오티드는 염색체 내로 통합되고, 그에 따라 염색체 복제를 통해 딸 세포에 의해 유전될 수 있다. 형질 전환 방법으로는 칼슘 포스페이트 침전; 재조합 핵산을 함유하는 박테리아 원형질체와 수용 세포의 융합; 재조합 핵산을 함유하는 리포솜을 이용한 수용 세포의 처리; DEAE 덱스트란; 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용한 융합; 전기 천공; 자전 천공(magnetoporation); 유전자총법 전달(biolistic delivery); 레트로바이러스 감염; 리포펙션; 및 세포 내로의 DNA 직접 미세-주입이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
세포와 관련하여 사용된 용어 형질 전환된은, 세포가 외인성 또는 이종성 유전 물질(예를 들어, 재조합 핵산)을 갖도록 본원에 기재된 형질 전환을 거친 세포를 지칭한다. 또한 또는 대안적으로, 용어 형질 전환된은 외인성 또는 이종성 유전 물질을 함유하는 세포, 세포 유형, 조직, 생물 등을 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
핵산의 세포 또는 생물 내로의 도입과 관련하여 본원에서 사용된 용어 도입하다는, 가장 넓은 의미를 가지며, 예를 들어 형질 전환 방법(예를 들어, 칼슘-클로라이드-매개 형질 전환, 전기 천공, 유전자총(particle bombardment))에 의한 도입, 및 형질 도입, 접합, 및 짝짓기를 포함하는 다른 방법에 의한 도입을 또한 포함하는 것으로 의도된다. 선택적으로, 작제물은 핵산을 세포 또는 생물 내로 도입하는 데 사용된다.
세포, 핵산, 폴리펩티드, 벡터 등과 관련하여 사용될 때 용어 변형된 및 재조합은 세포, 핵산, 폴리펩티드, 벡터 등이 실험실 방법에 의해 변형되었거나 그의 결과물이며 비-자연적으로 발생함을 나타낸다. 따라서, 예를 들어 변형된 세포는 실험실 방법, 예를 들어 핵산을 세포 내로 도입하는 형질 전환 방법에 의해 생산되거나 변형된 세포를 포함한다. 변형된 세포는 세포의 천연(비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 핵산 서열을 포함할 수 있거나 변경된, 예를 들어 비-천연 프로모터에 연결된 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 외인성은, 세포 또는 생물 내로 인공적으로 도입되고/되거나 그것이 존재하는 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 핵산(예를 들어, 조절 서열 및/또는 유전자를 포함하는 핵산) 또는 폴리펩티드와 같은 물질을 지칭한다. 즉, 핵산 또는 폴리펩티드와 같은 물질은 그것이 도입되는 세포 또는 생물의 외부로부터 기원한다. 외인성 핵산은 세포에 자연적으로 존재하는 핵산과 동일한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, NK-92® 세포는 NK-92® 서열, 예를 들어 헤파라나제를 갖는 핵산을 포함하도록 조작될 수 있다. 선택적으로, 내인성 NK-92® 헤파라나제 서열은 자연 조건 하에서는 조절 서열이 관여되지 않는 유전자에 작동 가능하게 연결된다. NK-92® 헤파라나제 서열은 숙주 세포에서 자연적으로 발생할 수 있지만, 도입된 핵산은 본 개시 내용에 따라 외인성이다. 외인성 핵산은 세포에 자연적으로 존재하는 임의의 핵산과는 상이한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 이종성 핵산, 즉 상이한 종 또는 생물로부터의 핵산일 수 있다. 따라서 외인성 핵산은, 공급원 생물에서 자연적으로 발견되는 핵산과 동일하지만 외인성 핵산이 도입되는 세포와는 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다. 본원에 사용된 용어 내인성은, 세포에 고유한 핵산 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 이종성은 세포에 고유하지 않은, 즉 세포와는 상이한 생물로부터의 핵산 서열을 지칭한다. 용어 외인성 및 내인성 또는 이종성은 상호 배타적이지 않다. 따라서, 핵산 서열은 외인성 및 내인성일 수 있으며, 이는 핵산 서열이 세포 내로 도입될 수 있으나 세포에 자연적으로 존재하는 핵산의 서열과 동일하거나 유사한 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 유사하게, 핵산 서열은 외인성 및 이종성일 수 있으며 이는 핵산 서열이 세포 내로 도입될 수 있으나 세포에 고유하지 않은 서열, 예를 들어 상이한 생물로부터의 서열을 갖는다는 것을 의미한다.
본원에 기재된 대조군 또는 표준 대조군은 테스트 샘플, 측정치, 또는 값과의 비교를 위한 참조, 통상적으로 알려진 참조로서의 역할을 하는 샘플, 측정치, 또는 값을 지칭한다. 예를 들어, 테스트 세포, 예를 들어 Fc 수용체에 대한 유전자를 인코딩하는 핵산 서열로 형질 전환된 세포는 알려진 정상(야생형) 세포(예를 들어, 표준 대조군 세포)와 비교될 수 있다. 표준 대조군은, Fc 수용체를 발현하지 않거나 Fc 수용체 활성을 갖지 않거나 그의 최소 수준을 갖는 세포 집단(예를 들어, 표준 대조군 세포)으로부터 수집된 평균 측정치 또는 값도 나타낼 수 있다. 당업자는 임의의 수의 파라미터(예를 들어, RNA 수준, 폴리펩티드 수준, 특정 세포 유형 등)의 평가를 위해 표준 대조군이 설계될 수 있음을 인식할 것이다.
용어 "발현하다"는 유전자 산물(예를 들어, 단백질)의 생산을 지칭한다. 발현을 언급할 때 용어 "일시적"은 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈 내로 편입되지 않음을 의미한다. 발현을 언급할 경우, 용어 "안정한"은 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈 내로 편입되거나, 양성 선택 마커(즉, 일정 성장 조건 하에서 이점을 제공하는 세포에 의해 발현되는 외인성 유전자)가 전이 유전자의 발현을 유지하기 위해 사용됨을 의미한다.
용어 "사이토카인" 또는 "사이토카인들"은 면역계의 세포에 영향을 미치는 일반적인 클래스의 생물학적 분자를 지칭한다. 예시적인 사이토카인에는 인터페론 및 인터루킨(IL)(구체적으로 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21)이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 사이토카인은 IL-2이다.
용어 "종양 미세 환경을 조절하는 사이토카인"은, NK-92® 세포에 의해 발현되고 항-종양 반응을 증가시키는 기능을 하는 분자를 지칭한다. 일정 사이토카인은 종양에 대한 내인성 면역계의 반응을 저해함으로써, 암 치료에 있어서의 면역 요법의 효과를 감소시킬 수 있다. 따라서, 용어는 또한, 예를 들어 리간드 트랩과 같이 종양 성장을 촉진하는 사이토카인에 결합하는 펩티드 저해제 및/또는 리간드 또는 수용체와 같은, 종양 성장을 촉진하는 사이토카인의 저해제를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 벡터가, 예를 들어 형질 전환 과정에 의해, 허용 세포 내에 배치될 때 복제될 수 있도록 온전한 레플리콘을 포함하는 비-염색체 핵산을 지칭한다. 벡터는 박테리아와 같은 일 세포 유형에서 복제될 수 있으나, 포유류 세포와 같은 또 다른 세포에서는 복제 능력이 제한적이거나 전혀 없다. 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스일 수 있다. 핵산 전달을 위한 예시적인 비-바이러스 벡터에는 네이키드 DNA; 양이온성 지질과 복합체화된 DNA(단독이거나 양이온성 중합체와 조합됨); 음이온성 및 양이온성 리포솜; 일부 경우에 리포솜에 함유된, 이종 폴리리신, 한정된-길이 올리고펩티드, 및 폴리에틸렌 이민과 같은 양이온성 중합체와 축합된 DNA를 포함하는 DNA-단백질 복합체 및 입자; 및 바이러스 및 폴리리신-DNA를 포함하는 삼원 복합체의 사용이 포함된다. 일 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스이다. 바이러스 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다.
단백질 발현을 언급할 때, 본원에 사용된 용어 "표적화된"은 단백질 또는 폴리펩티드를 세포 내 또는 그의 외부의 적절한 목적지로 안내하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것으로 의도된다. 표적화는 전형적으로, 폴리펩티드 사슬 내의 아미노산 잔기의 스트레치인 신호 펩티드 또는 표적화 펩티드를 통해 달성된다. 이들 신호 펩티드는 폴리펩티드 서열 내 어느 곳에나 위치될 수 있으나, 종종 N-말단에 위치한다. 폴리펩티드는 또한 C-말단에 신호 펩티드를 갖도록 조작될 수 있다. 신호 펩티드는 세포외 부분, 원형질막, 골지, 엔도솜, 소포체, 및 기타 세포 구획으로의 위치를 향해 폴리펩티드를 안내할 수 있다. 예를 들어, 그의 C-말단에 특정 아미노산 서열(예를 들어, KDEL)을 갖는 폴리펩티드는 ER 루멘 내에 보유되거나 ER 루멘으로 다시 운반된다.
종양의 표적화를 언급할 때, 본원에 사용된, 용어 "표적"은 종양 세포(즉, 표적 세포)를 인식하고 살해하는 NK-92® 세포의 능력을 지칭한다. 이 문맥에서 용어 "표적화된"은, 예를 들어 NK-92® 세포에 의해 발현된 CAR이 종양에 의해 발현된 세포 표면 항원을 인식하고 그에 결합하는 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "형질 감염"은 세포 내로의 핵산의 삽입을 지칭한다. 형질 감염은 핵산이 세포로 들어갈 수 있도록 하는 임의의 수단을 사용하여 수행될 수 있다. DNA 및/또는 mRNA는 세포로 형질 감염될 수 있다. 바람직하게는, 형질 감염된 세포는 핵산에 의해 인코딩되는 유전자 산물(즉, 단백질)을 발현한다.
독자의 편의를 위해 제목 또는 부제가 본 명세서에서 사용될 수 있으며, 이는 본 발명의 범위에 영향을 주는 것으로 의도되지 않는다. 추가로, 본 명세서에서 사용되는 일부 용어는 하기에 보다 구체적으로 정의된다.
상세한 설명
암 및 종양에 대한 면역 요법을 개선하고/하거나, 관심 표적을 향한 귀소(이동)를 증가시키기 위한 기반으로서 세포 독성 활성화된 자연 살해 세포주(NK-92)를 사용하여 조작된 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 발현될 때 림프구를 림프절로 안내하는 것으로 알려진 귀소 수용체를 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 종양 미세 환경을 조절하는 분비되는 사이토카인, 또는 종양 미세 환경을 조절하는 사이토카인을 차단하는 저해제를 발현하도록 조작된다.
본 개시 내용은 임상 면역 요법에서의 사용을 위한 안정한 면역 치료 세포주를 생성하기 위해 단일 고 활성 프로모터에 의해 구동되는 다수의 유전자를 삽입하기 위한 4 시스트론 벡터를 사용하는 이점을 제공한다. 4 시스트론 벡터는 P2A 펩티드 및 IRES 요소를 포함하는 하나 이상의 접근법을 사용하여 단일 프로모터의 제어 하에, 그리고 최종 요소(이 경우, 세포 생존 및/또는 확장을 위해 발현을 필요로 하는 선택적 제제)의 발현과 결부된 4 개의 유전자를 연결한다.
개념 증명 구현에서, 치료 세포주에서 변형된 유전자 발현 프로파일을 생성하는 데 사용되는 4 개의 유전자는 CCR7, CD19 키메라 항원 수용체, CD16의 고-친화성 변이체, 및 소포체 결합 IL-2이다. ER-결합 IL-2는, 그것이 통합되는 NK-92® 기반 세포주의 세포 독성 능력을 자극하는 데 있어서의 역할에 부가하여, 선택 제제로서 작용한다. IL-2 생산 유전자는 프로모터로부터 가장 먼, 4 시스트론 벡터에서 마지막으로 배치되므로 유전자 작제물 단편은 손실될 가능성이 가장 높은 요소일 것이다(세포는 지속적인 생존을 위해 IL-2를 필요로 하기 때문에, 풀(pool)로부터 음성 선택 및 자가-절제를 야기함). 그러나, 모든 요소가 게놈 내로 성공적으로 통합되면, 자체적인 IL-2 공급원을 통합한 세포만 생존하므로 배지로부터의 IL-2 제거를 통해 세포가 선택될 것이다. IL-2 요소는 프로모터로부터 가장 멀기 때문에, 이는 4 개 요소의 전체 카세트의 완전한 통합에 유리하다(이는 다른 구성 요소의 유세포 분석 염색 분석을 통해 추가로 입증될 수 있다(실시예 참고)).
본원에 기재된 작제물은 새로운 치료 세포주 생성에 있어서 개발 시간을 저감할 뿐만 아니라, 다수의 라운드의 게놈 조작 및 후속 선택으로부터의 세포에 대한 스트레스 및 유해 효과를 저감하는 이점을 제공한다. 추가로, 작제물의 끝에 선택적 제제(이 경우 ER-IL-2)를 넣음으로써, RNA 전사 및 가공의 특성으로 인해, 세포가 IL-2 결핍을 초래하지 않으면서 작제물의 주어진 임의의 구성 요소를 침묵시키는 것은 어려울 것으로 예상된다. 따라서 이 방식으로 구축된 안정한 세포주는 자체적인 IL-2를 계속해서 생산하는 한, 벡터에 포함된 모든 구성 요소의 발현을 보유할 것이다.
개념-증명을 입증하기 위해, 4 개의 특정한 목표는 이 4 시스트론 작제물의 일부인 4 개의 구성 요소에 의해 해결된다. IL-2는 선택적 제제로서 기능하고 NK-92® 세포의 세포 독성 효과의 알려진 작용제이며 이는 그들을 효과적인 암 치료제로 만든다. CCR7 요소(C-C 케모카인 수용체 유형 7)는, 이를 발현하는 면역 세포가, 통상적으로 림프절에서 발현되는 리간드 CCL19 및 CCL21의 케모카인 구배 방향으로 이동하도록 하는 데 관여하는 케모카인 수용체이다. 일 구현예에서, 본원에서 고려되는 CCR7 요소는 SEQ ID NO: 1(CCR7 서열)과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본원에서 고려되는 CCL21은 SEQ ID NO: 2(CCL21 서열)와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본원에서 고려되는 CCL19는 SEQ ID NO: 16(CCL19 서열)과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
CD19 CAR(키메라 항원 수용체)은 세포들의 세포 독성을 증가시키는 데 사용되는 작제물이며(그들이 마주치는 세포의 표면 상에서 CD19 분화 클러스터(이것은 B-세포, 정상 및 악성 둘 모두에서 통상적으로 발현되는 분화 클러스터임)와 마주칠 때), B 세포 림프종에 대한 지시된 면역 요법 시험에서 효능을 나타냈다. 고-친화성 CD16 수용체는 변형된 NK-92® 세포가, 리툭수맙 및 허셉틴과 같이 암 치료 요법에서 단일클론 항체로 사용되는 것과 같은, IgG 항체에 의해 인식된 세포를 인식하고 이에 반응하는 것을 가능하게 한다. CD16 수용체로 무장된(armed) 면역 세포가 이들 항체 중 하나로 코팅된 세포와 마주치면, ADCC(항체 의존적 세포 독성)를 유발하고, 세포를 파괴하려 한다. 실제적 용어로, 이는 무장된 세포가 암 신생 항원 등에 대한 단일클론 항체와 함께 조합 치료 요법에 사용되는 것을 가능하게 한다. 이들 구성 요소 각각은 그 자체로 유용성을 가지고 있지만, 이 특정 조합을 조합하는 것은 B-세포 림프종에 대한 강력한 요법을 생성할 것으로 제안되며, 종양 과성장(outgrowth)의 통상적 부위(림프절)로 이동하고, 거기서 B-세포 항원 CD19를 인식하고 CAR-매개 세포 독성을 개시하거나, 항원 탈출 가능성을 피하기 위해 리툭수맙과 같은 단일클론 항체와 함께 작용할 수 있다. 이 개념 증명 실시예는 비-제한적이며, NK-92® 세포는 효과적인 면역 치료 세포주를 생산하기 위해 다른 관심 항원을 표적화하는 다른 귀소 수용체 및/또는 CAR을 발현하도록 본원에 기재된 방법을 사용하여 변형될 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 기재된 바와 같이, 선택 가능 마커를 포함하는 제거 가능한 선택 카세트와 함께 CCR7 발현 카세트를 함유하는 선형화된 유전자 작제물을 사용한 전기 천공 후 신장 인자 1a(EF1a) 프로모터에 의해 구동되는 CCR7 림프절 귀소 수용체의 안정한 장기 발현으로, 변형된 NK-92® 세포가 생성되었다. 푸로마이신 선택 1 주 후, 연속 희석 클로닝이 뒤따랐고, 높은 수준의 CCR7 발현을 보유하는 단일클론 세포주가 확립되었다. 이들 CCR7 과발현 NK 세포는 이동/침입 분석에서 림프절 관련 케모카인 CCL21 및 CCL19에 대한 기능적 반응을 갖는다. 일 구현예에서, 본원에서 고려되는 EF1a 프로모터는 SEQ ID NO: 3(EF1a 프로모터 서열)과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 본원에서 고려되는 케모카인 및 귀소 수용체는 SEQ ID NO: 44(CCR7 a.a. 서열), 또는 SEQ ID NO: 45(CCL19 a.a. 서열), 또는 SEQ ID NO: 46(CCL21 a.a. 서열), 또는 SEQ ID NO: 47(CXCR2 n.t. 서열), 또는 SEQ ID NO: 48(CXCR2 a.a. 서열), 또는 SEQ ID NO: 49(CXCL14 n.t. 서열), 또는 SEQ ID NO: 50(CXCL14 a.a. 서열), 또는 SEQ ID NO: 51(CD62L n.t. 서열), 또는 SEQ ID NO: 52(CD62L a.a. 서열), 또는 SEQ ID NO: 53(IL-8 n.t. 서열), 또는 SEQ ID NO: 54(IL-8 a.a. 서열), 또는 SEQ ID NO: 55(CXCL1 n.t. 서열), 또는 SEQ ID NO: 56(CXCL1 a.a. 서열)과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
감수성 세포주의 표적 연결은 NFAT 전사 인자의 활성화 및 이의 핵 전위에 의해 NK-92® 세포에서 인식되는 것으로 나타난다. FceRIg 또는 CD3제타 경로를 수반하는 표적 결합(ADCC 또는 CAR 매개 표적 인식 포함)은 NK-92® 세포에서 NFAT 활성화를 유도하기에 충분하다. 이는 3 개의 NFAT 결합 도메인에 측접하는 중지 영역, 및 최소의 프로모터 구동 반딧불이 루시페라제를 함유하는 리포터 카세트를 삽입함으로써 입증되었다. 이 리포터 세포주 내로의 CD19 CAR mRNA의 전기 천공 후, SUP-B15(CD19+, 그러나 비-특이적 세포 독성에 저항성)와의 공동-배양을 통한 CD3제타 경로에 의한 NFAT 활성화는 루시페라제 발현을 초래하였다.
일 구현예에서, 본원에서 고려되는 NFAT 반응 요소 서열(활성화된 NFAT에 대한 결합 부위)은 SEQ ID NO: 4와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에서 고려되는 최소의 프로모터(3 개의 NFAT 반응 요소의 다운스트림)는 SEQ ID NO: 5와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에서 고려되는 전체 NFAT 반응 카세트(폴리-A + 휴지 부위에 이은 3 개의 NFAT R.E.에 이은 최소의 프로모터)는 SEQ ID NO: 6과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에서 고려되는 전체 초기 삽입 서열(EF1a 프로모터, 폴리-A를 갖는 CCR7 유전자, 및 유비퀴틴 프로모터에 의해 구동되는 LoxP 측접된 푸로마이신 저항성 유전자 모두는 AAVS1 유전자좌를 표적화하는 상동성 아암(arm)에 둘러싸임)은 SEQ ID NO: 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에서 고려되는 제2 삽입용 전체 서열(NFAT 반응 카세트 구동 CCL21+폴리-A, 및 CMV에 의해 구동되는 FRT-끼워넣어진 블라스티시딘 저항성 유전자를 함유함)은 SEQ ID NO: 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. SEQ ID NO: 8 서열은 제1 삽입으로부터 LoxP 측접된 푸로마이신 저항성 카세트를 대체할 수 있으며, 이 서열에서 블라스티시딘 유전자를 둘러싸는 FRT 서열은 유사한 Flp-FRT 재조합을 사용하여 이후 그 카세트의 제거 또는 대체를 가능하게 한다.
NK-92® 세포주는 비-호지킨 림프종으로 진단된 50 세 남성의 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)로부터 확립된 인간, IL-2-의존성 NK 세포주이다(Gong, et al., Leukemia. 8:652-8(1994)). NK-92® 세포는, CD3, CD8, 및 CD16의 부재 하에서, CD56선명한(bright) 및 CD2의 발현을 특징으로 한다. CD56선명한/CD16neg/낮은 표현형은 말초 혈액 내 NK 세포의 작은 서브세트(minor subset)에 대해 전형적이며, 이는 사이토카인 생산자로서 면역 조절 기능을 갖는다. 정상적인 NK 세포와 달리, NK-92®는 대부분의 살해 세포 저해제 수용체(KIR)의 발현을 결여한다(Maki, et al., J Hematother Stem Cell Res. 10:369-83(2001)). 모든 NK 세포에 의해 발현되는 활성화 기능 및 저해 가능성을 갖는 KIR 수용체인 KIR2DL4 만이, NK-92 표면 상에서 검출되었다. KIR2DL4는 HLA 대립 유전자 G와의 결합을 통해 저해 효과를 매개하는 것으로 여겨진다(Suck, Cancer Immunol. Immunother. 65(4):485-92(2015)). NK-92® 세포의 세포 독성 살해의 지배적 경로는 퍼포린/에스테라제 경로를 통한 것이며; NK-92®는 높은 수준의 퍼포린 및 그랜자임 B를 발현한다(Maki, et al., J Hematother Stem Cell Res. 10:369-83(2001)).
NK-92® 세포는 매우 광범위한 세포 독성 범위를 가지며 혈액 악성 종양 및 고형 종양으로부터 유래된 세포주에 대해 활성이다(Klingemann, Blood, 87(11):4913-4(1996); Swift, Haematologica. 97(7):1020-8(2012); Yan, et al., Clin Cancer Res. 4:2859-68(1998)). 중증 복합 면역 결핍(SCID) 마우스에서의 안전성 평가는 급성 독성 또는 장기 발암성과 같은 NK-92® 치료-관련 효과를 나타내지 않았다(Tam, et al., J Hematother. 8:281-90(1999), Yan et al., Clin Cancer Res. 4:2859-68(1998)). 인간 백혈병 세포로 공격된 마우스 또는 인간 흑색종의 마우스 모델로의 NK-92® 세포 투여는, 일부 마우스 종양에서의 완전한 관해를 포함하여, 개선된 생존 및 종양 성장의 억제를 초래하였다(Tam, et al., J Hematother. 8:281-90(1999), Yan, et al., Clin Cancer Res. 4:2859-68(1998)). 임상 1 상 시험에서 안전성 프로파일을 확인하였다. NK-92® 세포주의 특징 확인은 WO 1998/49268 및 미국 특허 출원 공개 번호 2002-0068044에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 또한 Fc 수용체 CD16을 발현할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "Fc 수용체"는 Fc 영역으로 알려진 항체의 일부에 결합함으로써 면역 세포의 방어 기능에 기여하는 일정 세포(예를 들어, 자연 살해 세포)의 표면 상에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 항체의 Fc 영역과 세포의 Fc 수용체(FcR)의 결합은 항체-매개 식세포 작용 또는 항체-의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC)을 통해 세포의 식세포 또는 세포 독성 활성을 자극한다. FcR은 그들이 인식하는 항체 유형에 의해 분류된다. 예를 들어, Fc-감마 수용체(FCγR)는 항체의 IgG 클래스에 결합한다. FCγRIII-A(CD16이라고도 함)는, IgG 항체에 결합하고 ADCC를 활성화하는 저친화성 Fc 수용체이다. FCγRIII-A는 전형적으로 NK 세포 상에서 발견된다. CD16을 인코딩하는 대표적인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12에 나타나 있다. CD16을 인코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 13에 나타나 있다. CD16의 전체 서열은 스위스프로트(SwissProt) 데이터베이스에서 항목 P08637로 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, CD16 수용체는 성숙한 CD16 수용체의 IgG 결합 도메인의 아미노산 위치 158에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F158V)을 포함하며(전장 단백질의 위치 176에서의 Val에 상응함), 이는 NK 세포의 항체-의존적 세포 독성(ADCC) 기능을 달성한다. CD16 158V 변이체는 158F 변이체보다 인간 IgG1 및 IgG3에 더 높은 친화도로 결합한다.
선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 SEQ ID NO: 13과 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 SEQ ID NO: 13과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 SEQ ID NO: 12(전장 폴리펩티드의 위치 176에 발린을 가짐)와 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 SEQ ID NO: 12와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
NK-92® 세포의 세포 독성은 사이토카인(예를 들어, 인터루킨-2(IL-2))의 존재에 의해 좌우된다. 따라서, 선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 적어도 하나의 사이토카인을 발현하도록 추가로 변형된다. 선택적으로, 적어도 하나의 사이토카인은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 또는 이의 변이체이다. 선택적으로, 적어도 하나의 사이토카인은 IL-2, IL-15 또는 이의 조합이다. 선택적으로, IL-2 및/또는 IL-15는 사이토카인을 소포체로 안내하는 신호 서열과 함께 발현된다. IL-2를 소포체로 안내하는 것은 자가 분비 활성화에 충분한 수준으로 그리고 상당한 양의 IL-2를 세포외로 방출하지 않으면서, IL-2의 발현을 허용한다. 문헌[Konstantinidis et al "Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92® cells" Exp Hematol. 2005 Feb;33(2):159-64] 참고. IL-2를 인코딩하는 대표적인 핵산은 SEQ ID NO: 14에 나타나 있고 IL-2의 대표적인 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 15에 나타나 있다.
선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 SEQ ID NO: 14와 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는, IL-2를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 SEQ ID NO: 14와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 SEQ ID NO: 15와 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 IL-2 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 SEQ ID NO: 15와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 IL-2 폴리펩티드를 포함한다. 제공된 변형된 NK-92® 세포는 유리하게는 임상적 유해 효과를 유발하는 양으로 IL-2를 분비하지 않으면서, IL-2의 부재 하에 유지될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 대상은 종양 미세 환경을 조절할 수 있는 변형된 NK-92® 세포를 포함한다. 변형된 NK-92® 세포는 바람직하게는 i) IL-12 또는 TGF-베타 트랩, ii) 특이적으로 표적 항원에 결합하는 항원 결합 단백질(ABP) 또는 키메라 항원 수용체(CAR), iii) CD16 또는 CD16-158V와 같은 Fc 수용체, 및/또는 iv) erIL-2 또는 erIL-15와 같은 사이토카인을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 4 시스트론 벡터를 포함하며, 여기서 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일 구현예에서, 본원에서 고려되는 4 시스트론 벡터는 각각 도 21, 도 30, 및 도 31에 도해되어 있다. 본원에서 고려되는 IL-12는 SEQ ID NO: 57(p35 n.t. 서열), 또는 SEQ ID NO: 59(p40 n.t. 서열)와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 IL-12는 또한 SEQ ID NO: 58(p35 a.a. 서열, 이소형 1 전구체), 또는 SEQ ID NO: 60(p40 a.a. 서열, 전구체)과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
하나의 예시적 구현예에서, IL-2/PD-L1 4 시스트론 벡터 내 IL-12 단일 사슬 p40_p35 서열은 SEQ ID NO: 61과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있거나, SEQ ID NO: 62와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 고려되는 TGF-베타 트랩은 SEQ ID NO: 63(TGFBRII 세포외 도메인), 또는 SEQ ID NO: 65(TGFb 트랩 서열)와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 TGF-베타 트랩은 또한 SEQ ID NO: 64(TGFBRII 세포외 도메인), 또는 SEQ ID NO: 66(TGFb 트랩 서열)과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 적합한 TGF-베타 트랩은 문헌[Mol. Canc. THer. 2012, Vol 11(7), 1477-1487]에 기재된 것들을 포함한다.
또한, 본 발명의 대상의 핵산 작제물은 동일한 mRNA에 의해 인코딩되는 등몰 수준의 폴리펩티드를 생산하기 위해, T2A, P2A, E2A, 또는 F2A 펩티드와 같은 2A 펩티드를 인코딩하는 서열도 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 E2A 펩티드는 SEQ ID NO: 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 T2A 펩티드는 SEQ ID NO: 18과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
하나의 비-제한적인 예시적 실시예에서, 본원에 개시된 플라스미드는 SEQ ID NO: 19(AAVS1의 5' 상동성 아암), SEQ ID NO: 20(EF1a 프로모터), SEQ ID NO: 21(T7 프로모터), SEQ ID NO: 22(CCR7 cDNA), SEQ ID NO: 23(P2A 요소), SEQ ID NO: 24(IgHC 리더), SEQ ID NO: 25(CD19 CAR에서 신호 펩티드를 뺀 것), SEQ ID NO: 26(고친화성 CD16), SEQ ID NO: 27(IRES), SEQ ID NO: 28(SC40 폴리-A), SEQ ID NO: 29(AAVS1의 3' 상동성 아암), 및/또는 SEQ ID NO: 30(AAVS1의 상동성 아암)과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
키메라 항원 수용체
선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 세포 표면 상에 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 추가로 조작된다. 선택적으로 CAR은 종양-특이적 항원에 특이적이다. 종양-특이적 항원은 비-제한적인 예로서, US 2013/0189268; WO 1999024566 A1; US 7098008; 및 WO 2000020460 A1에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 종양-특이적 항원으로는, 제한 없이, NKG2D, CS1, GD2, CD138, EpCAM, EBNA3C, GPA7, CD244, CA-125, ETA, MAGE, CAGE, BAGE, HAGE, LAGE, PAGE, NY-SEO-1, GAGE, CEA, CD52, CD30, MUC5AC, c-Met, EGFR, FAP, WT-1, PSMA, NY-ESO1, AFP, CEA, CTAG1B, CD19, CD33, B7-H4, CD20 및 41BB가 포함된다. CAR은, 예를 들어 특허 공개 번호 WO 2014039523; US 20140242701; US 20140274909; US 20130280285; 및 WO 2014099671에 기재된 바와 같이 조작될 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 선택적으로 CAR은 CD19 CAR, CD33 CAR 또는 CSPG-4 CAR이다. 하나의 비-제한적인 예시적 실시예에서, CD19CAR_CD3a는 SEQ ID NO: 41과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
귀소 수용체
귀소 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 NK-92® 세포가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 귀소 수용체는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 부 구현예에서, 귀소 수용체는 G 단백질-결합 수용체이다. 일부 구현예에서, 귀소 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7, CX3CR1, XCR1, CCXCKR, D6, DARC, 또는 CXCL14에 대한 수용체로부터 선택되는 케모카인 수용체이다. 일부 구현예에서, CCR7을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 선택적으로, 귀소 수용체는 변형된 NK-92® 세포의 세포 표면 상에 발현된다. 선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 CAR을 추가로 포함한다. 선택적으로 CAR은 CD19이다. 선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 Fc 수용체를 추가로 포함한다. 선택적으로 Fc 수용체는 CD16이다. 선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 IL-2와 같은 사이토카인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 42와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, IL-2 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 43과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
발현 벡터
프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산을 포함하는 발현 벡터가 본원에서 제공된다. 벡터의 상이한 요소를 인코딩하는 핵산은 각각 동일하거나 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예시적인 프로모터로는 CMV 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, PGK 프로모터, 및 EF1 또한 프로모터가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 선택적으로, SEQ ID NO: 1을 갖는 핵산 또는 SEQ ID NO: 1과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 발현 벡터가 본원에서 제공된다. 선택적으로, 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 선택적으로, 프로모터는 SEQ ID NO: 3, 9, 10 또는 11로 구성된 군으로부터 선택되거나 SEQ ID NO: 3, 9, 10 또는 11과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 프로모터이다. 선택적으로, 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 선택적으로, 프로모터는 SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5를 포함한다. 선택적으로, 프로모터는 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 6과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 발현 벡터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 1과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산; SEQ ID NO: 25(CD19 CAR) 또는 SEQ ID NO: 13(CD16 158V)과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 14(erIL-2 n.t. 서열)와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 또는 폴리펩티드 서열; 및/또는 SEQ ID NO: 15(erIL-2 a.a. 서열), 또는 SEQ ID NO: 14와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 발현 벡터는 SEQ ID NO: 47(CXCR2) 또는 SEQ ID NO: 47과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산; SEQ ID NO: 25(CD19 CAR) 또는 SEQ ID NO: 12와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산; 및 SEQ ID NO: 13(CD16 158V), 및/또는 SEQ ID NO: 14와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산; 및/또는 SEQ ID NO: 15(erIL-2), 또는 SEQ ID NO: 14와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 적합한 발현 벡터가 당업계에 알려져 있으며 사용될 수 있다. 추가 양태에서, 재조합 핵산은 erIL-15를 인코딩하는 세그먼트를 포함하고, erIL-15를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 67과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 선택적으로, 발현 벡터는 플라스미드이다.
PD-L1(TGFβ-트랩) t-haNK 세포에서 PD-L1 CAR 및 CD-16의 발현 분석은 도 22에 도해되어 있다. 더욱이 도 23에 도해된 바와 같이, TGFβ-트랩은 TGFβ-트랩/PD-L1 t-haNK 세포의 배양 상청액 내로 분비된다. 유사하게, IL-12 바이러스로 형질 도입된 NK-92® 세포주로부터의 IL-12 분비는 도 30의 오른쪽 컬럼에 나타난다.
변형된 NK-92® 세포 제조 방법
본원에 기재된 핵산 분자를 포함하는 변형된 NK-92® 세포를 제조하는 방법이 본원에서 제공된다. 방법은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본원에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터로 NK-92® 세포를 형질 전환하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 프로모터, 프로모터 요소, 및 조절 서열은, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하고 세포 내에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 달성하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 프로모터 요소는 코딩 서열의 5' 위치에 있는 번역되지 않는 영역(UTR)이거나 이를 포함한다. 5' UTR은 mRNA 전사체의 일부를 형성하며, 그에 따라 진핵 생물에서 단백질 발현의 필수적인 부분이다. 전사 후 5'UTR은 전사 및 번역 수준 둘 모두에서 단백질 발현을 조절할 수 있다. 포유류 숙주 세포에서 벡터로부터의 전사를 제어하는 프로모터는 다양한 공급원, 예를 들어 폴리오마, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, B 형 간염 바이러스 및 거대세포 바이러스와 같은 바이러스 게놈(예를 들어, SEQ ID NO: 11)으로부터, 또는 이종성 포유류 프로모터, 예를 들어 베타 액틴 프로모터, 진핵 번역 신장 인자 1 알파 1(EF1α) 프로모터(예를 들어, SEQ ID NO: 3), 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터(예를 들어, SEQ ID NO: 10) 및 유비퀴틴 프로모터(예를 들어, SEQ ID NO: 9)로부터 획득될 수 있다. SEQ ID NO: 3, 9, 10 또는 11과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 프로모터가 본원에서 제공된다.
본원에 사용된 어구 선택 가능 마커는 선택을 가능하게 하는 산물(폴리펩티드)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 유전자, 또는 유전자 산물(예를 들어, 폴리펩티드) 자체를 지칭한다. 용어 선택 가능 마커는 당업계에서 일반적으로 이해되는 바와 같이 본원에서 사용되며, 세포 또는 생물 내에서의 이의 존재가 일정 정의된 배양 조건(선택 조건) 하에서 세포 또는 생물에 대해 유의한 성장 또는 생존 이점 또는 단점을 부여하는 마커를 지칭한다. 본원에 사용된 어구 선택 제제는 선택 가능 마커를 보유하는 세포 또는 세포 집단에 유리하거나 불리하게 세포 또는 세포 집단에 대해 선택 압력을 도입하는 제제를 지칭한다. 예를 들어, 선택 제제는 항생제이고 선택 가능 마커는 항생제 저항성 유전자이다. 포유류 세포에 적합한 선택 가능 마커의 예는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 티미딘 키나제, 네오마이신, 네오마이신 유사체 G418, 하이드로마이신, 및 푸로마이신이다.
본원에 사용된 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 중합체 및 이의 상보체를 지칭한다. 용어는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함한다. 용어는, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 합성, 자연 발생, 및 비-자연 발생된 알려진 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예로는, 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)이 포함된다. 달리 지시되지 않는 한, 보존적으로 변형된 핵산 서열 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적 서열이, 본원에 열거된 특정 핵산 서열 대신 사용될 수 있다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환체는 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; 문헌[Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)]; 문헌[Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]). 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드와 상호 교환적으로 사용된다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 리더를 인코딩하는 DNA는 그것이 폴리펩티드의 분비에 관여하는 단백원으로서 발현되는 경우 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA와 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 그것이 번역을 용이하게 하도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로 작동 가능하게 연결되는 것은 연결된 DNA 서열이 서로의 근처에 있고, 분비 리더의 경우, 인접하며 판독 위상(reading phase)에 있음을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 제2 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열은 이러한 제2 서열에 직접 또는 간접적으로 공유 연결되지만, 임의의 효과적인 3-차원 회합이 허용된다. 단일 핵산 서열은 다수의 다른 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 단일 프로모터는 다수의 RNA 종의 전사를 지시할 수 있다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션(ligation)에 의해 달성될 수 있다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 종래의 관행에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 사용된다.
치료 방법
대상체에서 암 또는 종양을 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 본원에 사용된 용어 "암"은, 백혈병, 암종 및 육종을 포함하여 포유 동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물, 또는 악성 종양을 지칭한다. 예시적인 암으로는 뇌암, 유방암, 자궁 경부암, 결장암, 두경부암, 간암, 신장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 육종, 위암, 자궁암 및 수모세포종이 포함된다. 추가 예로는 호지킨 병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판 증가증, 원발성 거대글로불린혈증, 원발성 뇌종양, 암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 암양종, 방광암, 전암성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신 피질암, 내분비 및 외분비 췌장 신생물, 및 전립선암이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "전이", "전이성", 및 "전이성 암"은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 하나의 기관 또는 또 다른 비-인접한 기관 또는 신체 부위로부터의 증식성 질병 또는 장애, 예를 들어 암의 확산을 지칭한다. 암은 기원 부위, 예를 들어, 원발성 종양, 예를 들어 원발성 유방암으로 지칭되는 부위인 유방에서 발생한다. 원발성 종양 또는 기원 부위의 일부 암 세포는 국소 영역의 주변 정상 조직에 침투 및 침윤하는 능력 및/또는 계를 통해 신체의 다른 부위 및 조직으로 순환하는 림프계 또는 혈관계의 벽을 관통하는 능력을 획득한다. 원발성 종양의 암 세포로부터 형성된 제2의 임상적으로 검출 가능한 종양은 전이성 또는 이차 종양으로 지칭된다. 암 세포가 전이되면, 전이성 종양 및 그 세포는 원래의 종양과 유사한 것으로 상정된다. 따라서, 폐암이 유방으로 전이되는 경우, 유방 부위의 이차 종양은 비정상적 유방 세포가 아니라 비정상적 폐 세포로 구성된다. 유방의 이차 종양은 전이성 폐암으로 지칭된다. 따라서, 어구 전이성 암은 대상체가 원발성 종양을 갖거나 가졌고 하나 이상의 이차 종양을 갖는 질병을 지칭한다. 어구 비-전이성 암, 또는 전이성이 아닌 암을 갖는 대상체는 대상체가 원발성 종양을 갖지만 하나 이상의 이차 종양은 갖지 않는 질병을 지칭한다. 예를 들어 전이성 폐암은, 원발성 폐 종양을 갖거나 그 병력을 가지며 제2 위치 또는 다수의 위치, 예를 들어 유방에 하나 이상의 이차 종양을 갖는 대상체에서의 질병을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환, 질병 또는 장애, 또는 질환, 질병 또는 장애와 관련된 증상을 "치료하는" 또는 이의 "치료"는, 임상 결과를 포함하여, 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법을 지칭한다. 유익하거나 원하는 임상 결과로는 하나 이상의 증상 또는 질환의 완화 또는 개선, 질환, 장애 또는 질병의 정도 감소, 질환, 장애 또는 질병의 상태 안정화, 질환, 장애 또는 질병의 발생 방지, 질환, 장애 또는 질병의 확산 방지, 질환, 장애 또는 질병 진행의 지연 또는 감속, 질환, 장애 또는 질병 발병의 지연 또는 감속, 질환, 장애 또는 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 부분적이든 전체적이든 관해가 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. "치료하는"은 또한 치료 부재 시 예상되는 바를 능가하여, 대상체의 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. "치료하는"은 또한 질환, 장애 또는 질병의 진행을 저해하는 것, 질환, 장애 또는 질병의 진행을 일시적으로 감속시키는 것을 의미할 수 있으나, 일부 경우에는, 질환, 장애 또는 질병의 진행을 영구적으로 중지시키는 것을 수반한다. 본원에 사용된 용어 치료, 치료하다, 또는 치료하는은 프로테아제의 발현을 특징으로 하는 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 프로테아제의 발현을 특징으로 하는 질병 또는 질환의 증상의 영향을 저감하는 방법을 지칭한다. 따라서 개시된 방법에서, 치료는 확립된 질병, 질환, 또는 질병 또는 질환의 증상의 중증도의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 저감을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 질병을 치료하는 방법은 대조군과 비교하여 대상체에서 질병의 하나 이상의 증상의 10% 저감이 있는 경우 치료인 것으로 여겨진다. 따라서 저감은 본래 또는 대조군 수준과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 10%와 100% 사이의 임의의 저감 퍼센트일 수 있다. 치료는 반드시 질병, 질환, 또는 질병 또는 질환의 증상의 완치 또는 완전한 제거를 지칭하는 것은 아님이 이해된다. 추가로, 본원에 사용된 바와 같이, 감소, 저감, 또는 저해에 대한 언급은 대조군 수준과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 변화를 포함하며 이러한 용어는 완전한 제거를 포함할 수 있지만 반드시 포함하는 것은 아니다.
용어 대상체, 환자, 개체 등은 제한하는 것으로 의도되지 않으며 일반적으로 상호 교환될 수 있다. 즉, 환자로 기재된 개체가 반드시 주어진 질병을 갖는 것은 아니며, 단지 의학적 조언을 구하는 것일 수 있다. 전체적으로 사용된 바와 같이, 대상체는 척추 동물, 보다 구체적으로 포유 동물(예를 들어, 인간, 말, 고양이, 개, 소, 돼지, 양, 염소, 마우스, 토끼, 래트, 및 기니피그), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 및 임의의 기타 동물일 수 있다. 용어는 특정 연령 또는 성별을 의미하지 않는다. 따라서, 수컷이든 암컷이든, 성체 및 신생아 대상체가 포함되는 것으로 의도된다. 본원에 사용된, 환자, 개체 및 대상체는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 이들 용어는 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 즉, 환자로 기재된 개체가 반드시 주어진 질병을 갖는 것은 아니며, 단지 의학적 조언을 구하는 것일 수 있다. 용어 환자 또는 대상체는 인간 및 수의학적 대상체를 포함한다.
본원에 사용된 "투여" 또는 "투여하는"은 원하는 효과를 달성하기 위해 임의의 적절한 경로에 의해 화합물 또는 화합물들을 제공하고/하거나 접촉시키고/시키거나 전달하는 것을 지칭한다. 투여는 경구, 설하, 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활액내, 흉골내, 척추강내, 병변내 또는 두개내 주사), 경피, 국소, 버컬(buccal), 직장, 질, 코, 눈, 흡입을 통해, 및 임플란트를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 선택적으로, NK-92® 세포는 비경구로 투여된다. 선택적으로, NK-92® 세포는 정맥내로 투여된다. 선택적으로, NK-92® 세포는 종양 주위로 투여된다.
따라서, 본원에 기재된 변형된 NK-92® 세포의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 암 전이를 저감하는 것을 포함하는, 대상체에서 암 전이를 저감하는 방법이 본원에서 제공된다. 또한 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공되며, 이는 암을 갖는 대상체를 선택하는 단계 및 대상체에게 본원에 기재된 변형된 NK-92® 세포의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 투여는 대상체에서 암을 치료한다. 선택적으로, 방법은 추가 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 변형된 NK-92® 세포의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 투여는 대상체에서 암을 치료하거나 종양 크기를 저감한다. 일부 구현예에서, 방법은 i) IL-12 또는 TGFb 트랩, ii) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 ABP 또는 CAR, iii) CD16 또는 CD16-158V와 같은 Fc 수용체, 및/또는 iv) erIL-2 또는 erIL-15와 같은 사이토카인을 인코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 NK-92® 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 i) 귀소 수용체, ii) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 ABP 또는 CAR, iii) CD16 또는 CD16-158V와 같은 Fc 수용체, 및/또는 iv) erIL-2 또는 erIL-15와 같은 사이토카인을 인코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 NK-92® 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
K562 표적 세포에 대한 TGFβ-트랩/PD-L1의 세포 독성은 도 24에 도해되어 있다. 또한, SUP-B15PD-L1+ 표적 세포에 대한 CAR 살해는 도 25에 나타나 있고, MDA-MB 231표적 세포에 대한 CAR 살해는 도 26에 나타나 있다. SUP-B15CD19-CD20+에 대한 TGFβ-트랩/PD-L1의 ADCC는 도 27에 도해되어 있다. 도 28은 TGFβ/SMAD 루시페라제 리포터 HEK293 세포가 TGFβ에 의해 유도됨을 도해한다. 분비되는 TGFβ-트랩은 TGFβ를 격리하였고 도 29에 나타난 바와 같이 HEK293T 리포터 분석에서 루시페라제 발현을 저해하였다. 리포터 세포는 19 시간 동안 1 ng/mL TGFβ1로 처리되었다. 다른 선택지 중에서, 바람직한 CAR 분자는 PD-L1에 특이적으로 결합하고, SEQ ID NO: 69와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다(이는 SEQ ID NO: 68과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있음.
NK-92® 세포는 다양한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, NK-92® 세포는 일정 기간에 걸쳐 주입(예를 들어, 정맥내 주입)에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 전형적으로, 단회 용량의 NK-92® 세포의 경우, 기간은 5 분 내지 130 분이다. 선택적으로, 기간은 90 분 내지 120 분이다. 선택적으로, 기간은 15 분 내지 30 분이다.
NK-92® 세포, 및 선택적으로 다른 항암제는 암 환자에게 1 회 투여될 수 있고 다회, 예를 들어 요법 동안 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23 시간마다 1 회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일마다 1 회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 주 이상마다 1 회, 또는 종점을 포함하여, 숫자들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, NK-92® 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 일 또는 그 이상 동안 매일 1 회 대상체에게 투여될 수 있다. 선택적으로, NK-92® 세포는 2 일 동안 매일 1 회의 주기로 투여된다. 그 다음, 그 주기에 이어, 1 시간 이상, 1 일 이상, 또는 1 주 이상의, NK-92® 세포를 이용한 치료의 부재가 뒤따른다. 본원에 사용된 용어 "주기"는, 사이에 휴식 기간(예를 들어, 치료 또는 다른 제제를 이용한 치료가 없음)을 가지면서 정기적인 일정으로 반복되는 치료를 지칭한다. 예를 들어, 1 주 동안의 주어진 치료에 이은 2 주의 휴식이 일 치료 주기이다. 이러한 치료 주기는 1 회 이상 반복될 수 있다. 따라서, NK-92® 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 주기 또는 그 이상으로 투여될 수 있다.
NK-92® 세포는 세포의 절대 수만큼 대상체에게 투여될 수 있고, 예를 들어, 상기 대상체는 약 1000 개 세포/주사 내지 최대 약 100 억 개 세포/주사, 예를 들어 주사 당 약, 적어도 약, 또는 많아도 약 1×1010, 1×109, 1×108, 1×107, 5×107, 1×106, 5×106, 1×105, 5×105, 1×104, 5×104, 1×103, 5×103(등등) 개 NK-92® 세포, 또는, 종점을 포함하여, 숫자들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다. 선택적으로, 1×108 내지 1×1010 개 세포가 대상체에게 투여된다. 선택적으로, 세포는 1 주 이상 동안 매주 1 회 이상 투여된다. 선택적으로, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 주 또는 그 이상 동안 매주 1 회 또는 2 회 투여된다.
선택적으로, 대상체는 약 1000 개 세포/주사/m2 내지 최대 약 100 억 개 세포/주사/m2, 예를 들어 주사 당 약, 적어도 약, 또는 많아도 약, 1×1010/m2, 1×109/m2, 1×108/m2, 1×107/m2, 5×107/m2, 1×106/m2, 5×106/m2, 1×105/m2, 5×105/m2, 1×104/m2, 5×104/m2, 1×103/m2, 5×103/m2(등등) 개 NK-92® 세포, 또는 종점을 포함하여, 숫자들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위로 투여된다. 선택적으로, m2 당, 1×103 내지 1×1010 개 NK-92® 세포가 대상체에게 투여된다. 선택적으로, m2 당 2×109 개의 NK-92® 세포가 대상체에게 투여된다.
선택적으로, NK-92® 세포는 세포의 상대적 수로 그와 같은 개체에게 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 개체는 개체의 킬로그램 당 약 1000 개 내지 최대 약 100억 개의 세포, 예를 들어 개체의 킬로그램 당 약, 적어도 약, 또는 많아도 약 1×1010, 1×109, 1×108, 1×107, 5×107, 1×106, 5×106, 1×105, 5×105, 1×104, 5×104, 1×103, 5×103(등등) 개의 NK-92® 세포, 또는 종점을 포함하여, 숫자들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
선택적으로, 총 용량은 m2 당, 약 1×1011, 1×1010, 1×109, 1×108, 1×107, 또는 종점을 포함하여 숫자들 중 임의의 둘 사이의 임의의 범위를 포함하는, 신체 표면적의 m2에 의해 계산될 수 있다. 선택적으로, 약 10억 개 내지 약 30억 개 NK-92® 세포가 환자에게 투여된다. 선택적으로, 용량 당 주사되는 NK-92® 세포의 양은, m2 당 1×1011, 1×1010, 1×109, 1×108, 1×107, 1×106, 1×105, 1×104, 1×103을 포함하는, 신체 표면적의 m2에 의해 계산될 수 있다.
선택적으로, NK-92® 세포는 NK-92® 세포, 및 인간 혈청 또는 이의 등가물과 같은 배지를 포함하는 조성물로 투여된다. 선택적으로, 배지는 인간 혈청 알부민을 포함한다. 선택적으로, 배지는 인간 혈장을 포함한다. 선택적으로, 배지는 약 1% 내지 약 15% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 선택적으로, 배지는 약 1% 내지 약 10% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 선택적으로, 배지는 약 1% 내지 약 5% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 선택적으로, 배지는 약 2.5% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 선택적으로, 혈청은 인간 AB 혈청이다. 선택적으로, 인간 치료제에 사용하는 데 허용되는 혈청 대체물이 인간 혈청 대신 사용된다. 이러한 혈청 대체물은 당업계에 알려져 있을 수 있다. 선택적으로, NK-92® 세포는 NK-92® 세포 및 세포 생존력을 지원하는 등장성 액체 용액을 포함하는 조성물로 투여된다. 선택적으로, NK-92® 세포는 동결 보존된 샘플로부터 재구성된 조성물로 투여된다.
본원에 제공된 방법에 따르면, 대상체는 본원에 제공된 제제 중 하나 이상의 유효량을 투여받는다. 용어 유효량 및 유효 투여량은 상호 교환적으로 사용된다. 용어 유효량은 원하는 생리적 반응(예를 들어, 염증의 저감)을 생산하는 데 필요한 임의의 양으로 정의된다. 유효량 및 제제를 투여하기 위한 일정은 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 투여를 위한 투여량 범위는 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상이 영향을 받는(예를 들어, 저감 또는 지연되는) 원하는 효과를 생산하기에 충분히 큰 것이다. 투여량은 원하지 않는 교차-반응, 아나필락시스 반응 등과 같은 실질적인 유해 부작용을 유발할 정도로 커서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 연령, 질환, 성별, 질병 유형, 질병 또는 장애의 정도, 투여 경로, 또는 다른 약물이 요법에 포함되는지 여부에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 임의의 사용 금지 사유가 있는 경우 개별 의사에 의해 투여량이 조정될 수 있다. 투여량은 달라질 수 있으며 1 일 또는 수일 동안, 하나 이상의 용량의 투여로 투여될 수 있다. 지침은 주어진 종류의 제약품에 대한 적절한 투여량에 대한 문헌에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 주어진 파라미터에 대해, 유효량은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 또는 적어도 100%의 증가 또는 감소를 나타낼 것이다. 효능은 또한 "-배" 증가 또는 감소로 표현될 수 있다. 예를 들어, 치료적 유효량은 대조군 대비 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 5-배, 또는 그 이상의 효과를 가질 수 있다. 정확한 용량 및 제형은 치료 목적에 의해 좌우될 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인 가능할 것이다(예를 들어, 문헌[Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Gennaro, Editor(2012) 및 Pickar, Dosage Calculations(1999)] 참고).
약학적으로 허용되는 조성물은 다양한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 완충 식염수 등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균이며, 이들에는 일반적으로 바람직하지 않은 물질이 없다. 적합한 담체 및 이들의 제형은 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Loyd V. Allen et al., editors, Pharmaceutical Press(2012)]에 기재되어 있다. 약학적으로 허용되는 담체란 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지 않은 물질을 의미하며, 즉, 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 그것이 함유된 약학적 조성물의 다른 성분과 해로운 방식으로 상호 작용하지 않으면서 대상체에게 투여된다. 대상체에게 투여되는 경우, 담체는 활성 성분의 분해를 최소화하고 대상체에서의 유해 부작용을 최소화하기 위해 선택적으로 선택된다. 본원에 사용된 용어 약학적으로 허용되는은 생리적으로 허용되는 및 약리학적으로 허용되는과 동의어로 사용된다. 약학적 조성물은 일반적으로 완충 및 저장 시 보존을 위한 제제를 포함할 것이며 투여 경로에 따라, 적절한 전달을 위한 완충제 및 담체를 포함할 수 있다.
조성물은 pH 조정 및 완충제, 독성 조정 제제 등과 같이 생리적 조건에 근접하기 위해 필요한 허용되는 보조 물질, 예를 들어 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 락테이트 등을 함유할 수 있다. 이들 제형 내 세포 및/또는 다른 제제의 농도는 달라질 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 대상체의 필요에 따라 주로 유체 부피, 점도, 체중 등에 기반하여 선택될 것이다.
조합 요법
선택적으로, NK-92® 세포는 치료되는 암에 대한 하나 이상의 다른 치료와 함께 대상체에게 투여된다. 이론에 얽매이지 않고, NK-92® 세포, 및 암에 대한 또 다른 요법을 이용한 대상체의 공동-치료는 NK-92® 세포 및 대안적 요법이 지금까지는 이러한 내인성 작용을 제압하였던 암을 없앨 기회를 내인성 면역계에 부여하는 것을 가능하게 할 것으로 여겨진다. 선택적으로, 치료되는 암에 대한 둘 이상의 다른 치료는, 예를 들어 항체, 이중-특이적 인게이저(engager), 방사선, 화학 요법제, 줄기 세포 이식, 또는 호르몬 요법을 포함한다.
선택적으로, 항체는 NK-92® 세포와 함께 환자에게 투여된다. 선택적으로, NK-92® 세포 및 항체는, 예를 들어 동일 제형으로, 함께; 예를 들어 별도 제형으로, 개별적으로, 동시에 대상체에게 투여되거나; 예를 들어 상이한 투약 일정으로 또는 하루 중 상이한 시간에, 개별적으로 투여될 수 있다. 개별적으로 투여되는 경우, 항체는, 정맥내 또는 경구 투여와 같은 임의의 적합한 경로로 투여될 수 있다.
선택적으로, 항체는 암-관련 마커를 발현하는 암성 세포 또는 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 단독으로, 암 치료를 위한 많은 항체가 승인되었다.
제공된 방법은 방사선 요법, 수술, 호르몬 요법 및/또는 면역 요법과 같은 다른 종양 요법과 추가로 조합될 수 있다. 따라서, 제공된 방법은 대상체에게 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 추가 치료제로는 진통제, 마취제, 소생제, 코르티코스테로이드, 항콜린제, 항콜린에스테라제, 항경련제, 항신생물제, 알로스테릭 저해제, 동화작용 스테로이드, 항류마티즘제, 심리치료제, 신경 차단제, 항-염증제, 구충제, 항생제, 항응고제, 항진균제, 항히스타민제, 항무스카린제, 항미코박테리아제, 항원충제, 항바이러스제, 도파민제, 혈액 제제, 면역학적 제제, 무스카린제, 프로테아제 저해제, 비타민, 성장 인자, 및 호르몬이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 제제 및 투여량의 선택은 치료되는 주어진 질병에 기반하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 선택적으로, 추가 치료제는 옥트레오타이드 아세테이트, 인터페론, 펨브롤리주맙, 글루코피라노실 지질 A, 카르보플라틴, 에토포사이드, 또는 이들의 임의의 조합이다.
선택적으로, 추가 치료제는 화학 요법 제제이다. 화학 요법 치료 요법은 하나의 화학요법 제제 또는 화학 요법 제제의 조합의 대상체로의 투여를 포함할 수 있다. 화학 요법 제제로는 알킬화제, 안트라사이클린, 탁산, 에포틸론, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 토포이소메라제 I 저해제, 토포이소메라제 II 저해제, 키나제 저해제, 단일클론 항체, 뉴클레오티드 유사체 및 전구체 유사체, 펩티드 항생제, 백금-기반 화합물, 레티노이드, 및 빈카 알칼로이드 및 유도체가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 선택적으로, 화학 요법 제제는 카르보플라틴이다.
제제 또는 조성물의 조합은 수반하여(예를 들어, 혼합물로서), 개별적으로 그러나 동시에(예를 들어, 별도의 정맥내 라인을 통해) 또는 순차적으로(예를 들어, 하나의 제제가 먼저 투여된 후 제2 제제가 투여됨) 투여될 수 있다. 따라서, 용어 조합은 둘 이상의 제제 또는 조성물의 수반하는, 동시의, 또는 순차적인 투여를 지칭하기 위해 사용된다. 치료 과정은 대상체의 특정 특성 및 선택된 치료 유형에 따라 개체별로 가장 잘 결정된다. 본원에 개시된 것과 같은 치료는 매일, 매일 2 회, 격주, 매월, 또는 치료적으로 유효한 임의의 적용 가능한 기준으로 대상체에게 시행될 수 있다. 치료는 단독으로 또는 본원에 개시되거나 당업계에 알려진 임의의 다른 치료와 조합되어 시행될 수 있다. 추가 치료는 제1 치료와 동시에, 상이한 시간에, 또는 완전히 상이한 치료 일정으로(예를 들어, 제1 치료는 매일일 수 있고, 추가 치료는 매주일 수 있음) 시행될 수 있다.
키트
본원에 기재된 변형된 NK-92® 세포를 포함하는 키트가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 키트는 i) 귀소 수용체, ii) 표적 항원에 특이적으로 결합하는 ABP 또는 CAR, iii) CD16 또는 CD16-158V와 같은 Fc 수용체, 및/또는 iv) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 erIL-2와 같은 사이토카인을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 변형된 NK-92® 세포를 포함한다. 선택적으로, 핵산 서열에 의해 인코딩되는 하나 이상의 단백질은 변형된 NK-92® 세포의 세포 표면 상에 발현된다. 일부 구현예에서, 키트는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 C-C 케모카인 수용체 유형 7(CCR7), CXCR2, 또는 CXCL14에 대한 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 NK-92® 세포를 포함한다. 선택적으로, CCR7을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 선택적으로, 귀소 수용체는 변형된 NK-92® 세포의 세포 표면 상에 발현된다. 선택적으로, 프로모터는 하나 이상의 NFAT 결합 요소 및 최소의 프로모터를 포함한다. 선택적으로, 프로모터는 SEQ ID NO: 6과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 선택적으로, 핵산 서열에 의해 인코딩되는 하나 이상의 단백질은 변형된 NK-92® 세포의 세포 표면 상에 발현된다.
선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로 제공된다. 선택적으로, 키트는 변형된 NK-92® 세포의 투여 전에, 동시에 또는 후에 투여될 치료적 활성 화합물 또는 약물과 같은 추가 화합물을 함유할 수 있다. 선택적으로 키트의 사용 설명서에는 암 치료에서 키트 구성 요소를 사용하기 위한 안내가 포함될 것이다. 설명서에는 항체 및 NK-92® 세포(예를 들어, 해동 및/또는 배양)를 준비(예를 들어, 동결 건조된 단백질의 경우, 희석 또는 재구성)하는 방법에 관한 정보가 추가로 포함될 수 있다. 설명서에는 투여량 및 투여 빈도에 관한 지침이 추가로 포함될 수 있다.
개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있거나, 이와 함께 사용될 수 있거나, 이의 제조에 사용될 수 있거나, 이의 산물인 물질, 조성물, 및 성분이 개시된다. 이들 및 다른 물질이 본원에 개시되고, 이들 물질의 조합, 서브세트, 상호 작용, 그룹 등이 개시되나, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적 및 집합적 조합 및 순열에 대한 특정 언급이 명시적으로 개시되지 않을 수 있는 경우, 각각은 본원에서 구체적으로 고려되고 기재되어 있음이 이해된다. 예를 들어, 방법이 개시되고 논의되는 경우, 및 방법을 포함하여 다수의 분자에 가해질 수 있는 다수의 변형이 논의되는 경우, 방법의 모든 각각의 조합 및 순열, 및 가능한 변형은 명확하게 반대로 지시되지 않는 한 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 서브세트 또는 조합 또한 구체적으로 고려되고 개시된다. 이 개념은 개시된 조성물을 사용하는 방법의 단계를 포함하나 이에 한정되지 않는 본 개시 내용의 모든 양태에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가 단계가 있는 경우, 이들 추가 단계 각각은 개시된 방법의 임의의 특정 방법 단계 또는 방법 단계의 조합을 이용하여 수행될 수 있으며, 각각의 이러한 조합 또는 조합의 서브세트는 구체적으로 고려되고, 개시된 것으로 여겨져야 함이 이해된다.
본원에 인용된 간행물 및 이들이 인용된 자료는 그 전체가 참조로서 본원에 구체적으로 포함된다.
하기 실시예는 본원에 기재된 방법 및 조성물의 일정 양태를 추가로 도해하는 것으로 의도되며, 청구 범위의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1. 종양 미세 환경을 조절하는 사이토카인, CCR7을 발현하는 변형된 NK 세포주.
변형된 NK-92® 세포는 NK-92® 세포 상에서 NEON 형질 감염 시스템(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 선형화된 pNKAT-CCR7-LP3 플라스미드(도 1)를 이용한 전기 천공으로 제조하였다. 푸로마이신 선택 1 주 후, 생성된 다클론 집단을 CCR7 발현에 대해 테스트하고, 단일클론 세포주는 5% 인간 혈청 및 IL-2가 보충된 성장 배지에서 연속 희석함으로써 유도하였다. 변형된 NK-92® 세포는 EF1α 프로모터, 폴리-A 꼬리를 갖는 CCR7 유전자, 및 유비퀴틴 프로모터에 의해 구동되는 LoxP 측접된 푸로마이신 저항성 유전자를 함유하였으며, 모두 AAVS1 유전자좌를 표적화하는 상동성 아암에 둘러싸였다(SEQ ID NO: 7).
CCR7의 발현이 NK-92® 세포에 영향을 미치지 않음을 확인하기 위해, NK-92® 세포의 마커의 발현을 결정하였다. 결과는 도 3에 나타나 있다. 도 3의 모든 데이터는 인텔리사이트 아이큐 스크리너 플러스(Intellicyt iQue screener plus)를 사용하여 생성하였다. 세포를 기재된 표현형 마커에 대한 APC 접합된 항체, 또는 음성 대조군으로서 적절한 이소형과 함께 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 PBS+1% BSA에서 헹구고, 펠렛화하고, 30 uL의 PBS +1% BSA에 재-현탁시켰다. 이어서 판독값으로부터 세포 잔해를 제거하기 위해 판독을 좌측 상단 사분면에 나타난 바와 같이 게이팅하였으며, 우측 상단 사분면에 나타난 형광 임계값보다 큰 세포 백분율은 두 개의 개별 히트맵(heatmap)으로 표시하여, 각각 좌측 하단 및 우측 하단 사분면에 "양성" 임계값, 및 "매우 양성" 임계값보다 큰 백분율을 나타냈다. 도 3은 CCR7의 발현 추진이 본 발명자들의 세포주와 관련된 일차 표현형 마커에 의미 있는 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 구체적으로, CCR7 발현은 CD54, NKp30 또는 NKG2D 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
변형된 NK-92® 세포의 세포 독성을 결정하기 위해, 이펙터 세포(NK-92® 세포 및 변형된 NK-92® 세포 클론)를 96-웰 V-바닥 플레이트에서 연속 희석하고, 100 k 이펙터는 가장 높은 농도 웰에 남기고, 플레이트의 8 개 열에 걸쳐 7 회의 추가 2-배 희석을 하였다. 그 후 염색된 표적 세포(K562(도 4), HL-60(도 5)를, 배경 사멸을 측정하기 위해 단지 표적만 있는 대조군 웰과 함께, 이펙터를 함유하고 있는 모든 웰에 10 k/웰로 시딩하였다. 그 후 플레이트를 잠시 스핀 다운시키고 37℃ 및 5% CO2에서 4 시간 동안 인큐베이션 하였다. 그 후 플레이트를 스핀 다운시키고, 상청액을 흡입해내고, 세포 사멸을 측정하기 위해 프로피듐 요오다이드가 함유된 PBS에 세포를 재-현탁하였다. 그 후 세포를 인텔리사이트 아이큐 스크리너 플러스에 통과시키고, PI 염색에 대해 또한 양성인 표적 세포의 비율(염색에 의해 이펙터와 구별됨)을 측정하였다. 그 후 사멸된 세포의 백분율을 대조군 웰에서 자연적으로 사멸하는 세포의 수와 비교하고, 이펙터에 의해 특이적으로 살해되는 세포의 백분율을 계산하였다. 결과는 도 4 및 도 5에 나타나 있다. 도 4는 모세포주 대 K562 세포와 비교하여 CCR7 상향 조절된 클론에서의 비슷한 세포 독성을 나타내고 도 5는 모세포주 대 HL-60 세포와 비교하여 CCR7 상향 조절된 클론에서의 비슷한 세포 독성을 나타낸다.
시험관내 테스트는 이동을 차단하기 위한 보이덴 챔버 분석 및 마트리겔(Matrigel) 층을 사용하는 것으로 구성하였다. CCR7을 발현하는 변형된 세포는 이들 분석에서 CCL21 및 CCL19(교대의 CCR7 리간드)를 향한 이동을 나타냈다. 세포를 상부 웰에 배치하고, 8 uM 공극 상에 코팅된 마트리겔 박층(ECM-유사 기질)에 의해 하부 챔버로부터 분리하였다. 세포(25 k/웰)를 상부 챔버에, 저감된-혈청 배지(1% 인간 혈청 및 500 U/mL IL-2로 보충됨) 중에 배치하고, 동일한 저감된 혈청 배지를 하부 챔버(단독, 또는 관심 케모카인을 함유함)에서 사용하였다. 이 경우, CCL21은 15 ng/mL로 사용하였고, CCL19는 15 ng/mL로 사용하였고, SDF-1a는 20 ng/mL로 사용하였다. 각각의 테스트는 NK-92® 세포 또는 CCR7을 발현하는 변형된 NK-92® 세포에 대해 3 벌로 수행하였다. 그 후 플레이트를 하룻밤 동안 인큐베이터에 배치하여 18 시간 침입 분석을 하고, 그 후 상부 챔버를 제거하고, 철저한 혼합 후 하부 웰로부터 150 μL(총 부피 750 μL 중)를 샘플링하고 맥스퀀트(MacsQuant) FACS 분석 기계에서 판독하였다. 하부 챔버 내의 살아있는 세포를 계수한 후, 세포 수를 케모카인을 함유하지 않는 웰과 비교하고, 침입성 지수(invasiveness index number)를 생성하였다. 이들 수를 평균 내고 양측 t-검정을 사용하여 통계적 관련성을 계산하였다. 하부 웰은 하부 막으로부터의 어떠한 세포 분리도 없이 샘플링되었으므로, ECM의 하부에 여전히 부착된 세포는 이들 수로 대표되지 않아, CCL19와 CCL21 사이의 차이가 초래될 가능성이 있을 것이다. 결과는 도 7에 나타나 있다. 구체적으로, 도 7은 CCR7 케모카인인 CCL19를 향한 CCR7을 발현하는 변형된 NK-92® 세포의 침입성의 통계적으로 유의한 증가를 나타낸다. CCL21에 대한 통계적으로 유의한 반응이 결여된 것은 수행된 분석의 특성에 기인할 가능성이 있다. 분석은 CCL19 구배 이동과 일치하는 거동인 침입 및 ECM으로부터의 후속 분리 둘 모두를 측정한다. CCL21은, 이동을 유도하는 반면, 매트릭스로부터의 분리는 유도하지 않아, 통계적으로 유의한 침입 가능성을 입증하기 위한 추가 단계를 필요로 한다.
실시예 2. CCL21의 제어된 발현을 위한 NFAT 반응성 작제물의 생성.
NFAT 반응성 요소를 식별하기 위해, 선형화된 작제물을 중지 영역, 이어서 3 개의 NFAT 반응 요소(SEQ ID NO: 4), 및 최소의 프로모터(SEQ ID NO: 5)를 함유하는 NK-92® 세포 내로 전기 천공함으로써 NFAT-기반 루시페라제 발현 카세트(NR2.2)를 안정적으로 발현하는 세포주를 생성하였으며, 따라서 이는 활성화된 NFAT의 존재 하에 반딧불이 루시페라제의 생산을 지시할 것이다. 그 다음 이들 세포의 서브세트를 또한 항-CD19 CAR(Sup-B15 세포 상에 존재하는 항원, 그렇지 않으면 NK-92® 세포에 의한 살해에 저항성이 있음)을 함유하는 mRNA로 전기 천공하였다. 이들 세포는 좌측 그래프에서 ENR2.2로 표시된다. 그 후 세포를 표적 세포의 부재 또는 존재 하에 3 벌로 플레이팅하고, 2.5 시간 내지 24 시간 범위의 기간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간의 끝에서, 프로메가 듀얼글로(Promega DualGlo) 시스템으로부터의 1 단계 시약을 웰에 추가하여 루시페라제를 활성화하였다(그의 기질인 루시페린을 제공함으로써). 그 후 결과를 스펙트라맥스(SpectraMax) i3x 플레이트 리더에서 판독하고, 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)에서 계산한 표준 편차를 포함하는 평균으로 나타냈다. 결과는 도 6a 및 도 6b에 나타나 있다. NFAT 활성화는 K562에 대한 표적 결합의 맥락에서 시간-의존적 방식으로 입증하였고, Sup-B15에 대해서는 CD19-CAR에 대한 mRNA로 전기 천공된 경우에만 입증하였다.
실시예 3. CCR7 및 CCL21을 발현하는 변형된 NK 세포주.
pCRENFAT-CCL21 플라스미드는 리콤비나제 매개 카세트 교환으로 pNKAT-CCR7-LP3 작제물에 끼워넣어진 LoxP 부위를 사용하여 CCR7을 함유하는 NK-92® 세포 내로 통합된다. 원형 플라스미드(pCRENFAT-CCL21)의 전기 천공 후, Cre 리콤비나제는 일시적으로 발현되어 이전의 선택 카세트에 대한 새로운 LoxP-측접된 카세트의 교환을 매개한다. 블라스티시딘에서의 선택은 새로운 카세트의 통합을 지지하는 데 사용되며, 단일클론 세포주는 실시예 1에서 이전에 기재된 것과 동일한 방식으로 생성된 집단으로부터 서브-클로닝되어 CCR7 및 CCL21을 발현하는 변형된 NK-92® 세포를 수득한다.
CCR7 및 CCL21을 발현하는 변형된 NK-92® 세포를 평가하기 위해, 염색되지 않은 변형된 NK-92® 세포는 NFAT 활성화를 유발하는 것으로 알려진 세포(K562 또는 다른 세포주)와 함께 보이덴 챔버의 하부 웰에서 공동-배양되고 염색된 변형된 NK-92® 세포는 상부 챔버에 배치된다. 민감한 세포주와의 공동 배양에 의해 이동이 유도되는 것으로 입증되면, 이 시스템은 작동하는 것이다.
실시예 4: CCR7을 발현하는 변형된 NK 세포주를 사용하는 시험관내 세포 독성 분석
도 9는 CCR7을 발현하도록 변형된 NK-92® 세포가 실시예 1에 기재된 변형된 보이덴 챔버 트랜스웰 분석에서 이동 후 표적 세포에 대한 세포 독성을 유지함을 나타낸다.
실시예 5: 핵산 작제물로 형질 전환된 NK-92® 세포에서의 CCR7, CD16, 및 CD19 CAR의 세포 표면 발현
도 12a 및 도 12b는 CCR7, CD16, 및 CD19 CAR을 인코딩하는 핵산 작제물로 형질 감염된 변형된 NK-92® 세포가 세포 표면 상에 각각의 단백질을 높은 수준으로 발현함을 나타낸다.
실시예 6: CCL19 양성 피하 K562 종양을 보유하는 NSG 마우스에서의 CCR7-발현 케모카인 반응성 NK 세포의 생물학적 분포
이 연구는 케모카인 반응성 aNK 세포가 정맥내 투여 후 케모카인-발현 표적 조직으로 귀소함을 입증한다. 마우스 및 인간 케모카인은 교차 반응하지 않기 때문에, 본 발명자들은 대리 모델로서 국소화된 리간드-발현 종양 모델을 개발하였다.
실험 방법(표 1):
a. 동물:
i. 동물 유형: NSG 마우스(JAX), 암컷, 7 내지 8 주령
ii. 동물 수: 30 마리(NK 세포 주사를 제공받은 28 마리의 동물 [24 + 4 마리 추가]; 2 마리의 추가 마우스는 NK 처리를 제공받지 않았으며 유세포 분석을 위한 음성 대조군으로 사용됨)
b. 종양 모델:
i. 세포주: K562, 모 및 CCL19-발현 서브라인, K-19
ii. 접종 경로: 피하; 좌측 옆구리에 모 K562, 우측 옆구리에 K-19
iii. 접종물: 100 μL 무 혈청 배지 중 1E6 세포/마트리겔(v/v 1:1)
iv. 치료 개시 시 종양 부담: K-19의 경우 평균 107 mm3; 모 K562의 경우 평균 135 mm3
v. 무작위화: 일차적으로 K-19 종양의 부피를 기준으로 동물을 무작위화하였다.
c. 테스트 품목:
i. NK 세포:
1. CD19 t-haNK(비-CR)(난트퀘스트 토레이 파인스(NantKwest Torrey Pines))
2. 4 시스트론 Mi-aNK R7-19.1(난트퀘스트 워번(NantKwest Woburn))
ii. 형광 표지:
1. 두 유형의 NK 세포 모두를 생체내 투여 직전에 제조업체의 매뉴얼에 따라 CFSE로 표지하였다.
2. 각각의 시점에 대해, 배양된 CFSE 표지된 세포를 수확하여 유세포 분석을 위한 양성 대조군으로 사용하였다.
iii. 투여 방법: 정맥내
iv. 투여량:
1. 1E7 세포/마우스
v. 투약 빈도: 단회 용량
d. 종양 수집:
i. 시점: 투약 후 3, 24 및 48 시간(± 2 시간)
ii. N=4 마리 마우스/그룹/시점
iii. 종양 처리: 수집된 종양을 인-하우스 프로토콜(첨부됨)에 따라 단일 세포 현탁액으로 분리하고, CFSE-양성 NK 세포의 유세포 분석 계산을 하였다.
e. 공식 및 통계 분석:
i. 종양 부피=길이×폭2/2(길이 및 폭은 각각 종양의 가장 긴 직경 및 가장 짧은 직경임)
ii. 통계 분석은 일원 분산분석 후 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 7.0을 사용하여 투키 테스트에 의한 다중 비교로 수행하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 여겨진다.
[표 1]
실험 설정
Figure pct00002
결과:
a. 안전성:
iii. 두 유형 모두의 NK 세포를 제공받은 동물은 세포 주입 직후 경증 내지 중등도 정도의 급성 반응을 보였다(G1-G2, 경미한 내지 현저한 우울증, 무기력함, 느리거나 반응하지 않음).
iv. R7-19.1 그룹의 2 마리(14 마리 중)의 동물은 주사 후 24 시간 내에 죽은 것으로 발견되었으며, CD19 t-haNK 그룹에서는 사망이 없었다.
v. 24h 후, CD19 t-haNK 그룹의 동물은 회복될 수 있었던 반면, R7-19.1 그룹의 동물은 계속해서 경미하게 우울하고 자극에 덜 반응하는 것으로 보였다(G1). 그들은 48 시간째에 더 즉각 반응하게 됐으나(G0), 여전히 거친 털 및 빠른 호흡을 갖는 것으로 보였다.
b. NK 세포 귀소:
vi. 각각의 시점에서의 종양 침윤 NK 세포의 수는 표 2에 표로 작성되고 도 13에 그래프로 표시된다.
1. 4 개의 CCR7 수용체-CCL19 리간드 조합은 다음과 같다:
a. CD19 t-haNK®, K562 종양: 수용체 없음-리간드 없음[- -];
b. CD19 t-haNK®, K-19 종양: 수용체 없음-리간드 있음[- +];
c. R7-19.1 세포, K562 종양: 수용체 있음-리간드 없음[+ -]; 및
d. R7-19.1 세포, K-19 종양: 수용체 있음-리간드 있음[+ +]
vii. 3 시간째에, R7-19.1 세포의 K-19 종양으로의[+ +] 귀소는 비-CR CD19 t-haNK 세포의 CCL19- 또는 CCL19+ 종양으로의 그것보다 유의하게 더 컸다(각각 [- -] 및 [- +]; P<0.05). 그러나 본 발명자들은 B 그룹의 4 개 K562 종양 중 2 개로부터 많은 세포를 회수할 수 없었기 때문에, 동일한 동물에서의 R7-19.1 세포의 CCL19 음성 대 양성 종양으로의 귀소의 직접 비교를 달성할 수 없었다.
viii. 24 시간째에, 4 개의 CCR7 수용체-CCL19 리간드 조합 중 어느 것 사이에서도 NK 세포 귀소에 있어 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 그러나, 동일한 동물 내에서 각 NK 세포주의 CCL19 + 및 - 종양으로의 귀소를 비교할 때, R7-19.1 세포를 제공받은 4 마리 동물 중 3 마리는 CCL19+ 종양으로의 개선된 침윤을 나타낸 반면, CD19 t-haNK®를 제공받은 동물 대부분은 그들의 CCL19 발현에 관계없이 두 종양 모두로의 유사한 수준의 NK 침윤을 나타냈다(도 14).
ix. 48 시간째에, 모든 조합에서 종양 침윤 NK 세포의 전체 수가 감소하였으며, 어떤 그룹 간에도 차이가 없었다.
[표 2]
표시된 시점에서 비-CR 대 R7-19.1 세포의 모 또는 CCL19-발현 종양으로의 귀소. 결과는 평균 ± SEM이다. 달리 표시되지 않는 한 N=4.
Figure pct00003
*, N=2.
본 실시예는, 투약 후 3 시간째에 CCR7 수용체 및 CCL19 리간드의 공존이, 보다 효율적인 NK 세포 침윤을 초래함을 입증한다. 투약 후 24 시간째에, 비-CR aNK 세포를 제공받은 동물에서, NK 세포는 4 마리 동물 중 3 마리에서 CCL19 발현 상태에 관계없이 유사한 수준의 종양 귀소를 나타냈다. 대조적으로, R7-19.1 세포를 제공받은 동물에서, NK 세포는 4 마리 동물 중 3 마리에서 모 리간드 발현하지 않는 대조군에 비해 CCL19 양성 종양으로 더 효율적으로 귀소할 수 있었다. 종양 침윤 NK 세포의 수는, 수용체 또는 리간드 발현에 관계없이, 48 시간째에 감소하였다. 특히 초기 시간(투약 후 48 시간 미만) 동안 R7-19.1 세포의 CCL19 종양으로의 귀소가 더 많은 가시적인 경향이 있으며, 이는 세포가 치료 환경에서 사용되는 경우 더 높은 노출 및 잠재적으로 더 강한 세포 독성을 시사한다.
실시예 7: 정맥내 CCL19-양성 라지 종양을 보유하는 NSG 마우스에서 CCR7-발현 R7-19.1 세포의 비교 효능 평가
CCR7은, B-세포 림프종에 대한 질병 징후의 주요 부위인 림프절 및 기타 림프 기관에서 전형적으로 발현되는, 케모카인 CCL19 및 CCL21의 구배를 향한 세포의 이동을 유도하는 케모카인 수용체이다. 본 발명자들은, t-haNK 플랫폼을 기반으로, CD19-CAR, CCR7, CD16.158V 및 ERIL-2를 발현하는 케모카인 반응성 NK-92® 세포(즉, R7-19.1 세포)를 생성하였다. 이들 세포는 CCR7 발현에 부가하여, CD19 암 항원에 대한 암-표적화 키메라 항원 수용체(CAR), CD16 변이체, 및 ER-IL-2를 보유한다. 이전의 분포 연구는 모 대응물과 비교하여 R7-19.1 세포의 CCL19-발현 피하(SC) 종양으로의 우선적 귀소를 입증하였다.
본 연구에서는, 라지-19.5의 IV 이종 이식 모델에서 R7-19.1 세포(NSG 마우스에서, CCL19를 발현하도록 조작된 라지 인간 버키트(Burkitt) 림프종 세포임)의 반복 정맥내(IV) 투여의 항-종양 효과를 평가하였다. 비-CCR7-발현 CD19 t-haNK 세포(NK-92®[항-CD19-CAR, CD16.158V, ERIL-2])를 대조군 NK 세포주로 사용하였다. 비히클 대조군도 포함시켰다.
두 NK 세포주 모두가 비히클 대조군과 비교할 때 IV 라지-19.5 종양-보유 동물의 생존을 연장하는 데 있어서 유의한 치료 효능을 보였지만, R7-19.1 세포를 사용한 치료는 CD19 t-haNK 세포보다 유의하게 더 큰 생존 이점을 시사하였다. 두 NK 세포주 모두에서 명백한 치료-관련 반응을 관찰하였지만, 이들 반응은 상대적으로 높은 용량의 인간 유래 세포의 투여와 연관된 마우스-특이적인 문제로 추측된다.
연구 근거 및 목적: 생체내 분포 데이터는 IV 투여된 R7-19.1 세포가 CCL19-발현 SC 종양으로의 증가된 귀소를 나타냄을 보여주었다. 본 연구에서, NSG 마우스의 라지-19.5(라지의 CCL19-발현 서브라인) IV 이종 이식 모델에서 R7-19.1 세포의 반복 IV 투여의 항-종양 효과를 평가하였다. 원래의 연구 프로토콜은 본 보고에 포함되지 않은 추가 동물 그룹(그룹 A 내지 C)을 포함하였음에 주의한다. 그들은 이 종양 모델에서 R7-19.1 세포의 효능 결정과는 관련이 없다(약식 실험 설계에 대해서는 표 3을 참고).
연구 재료:
테스트 품목(들). 테스트 품목은 R7-19.1 세포 및 CD19 t-haNK 세포(비-CCR7-발현 대조군 NK 세포; 클론 6)였다. R7-19.1 세포는 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청 및 0.05% 플루로닉 F68로 보충된 성장 배지에서 배양하였다. CD19 t-haNK 세포(비-CCR7-발현 대조군 NK 세포; 클론 6)와 관련하여, CD19 t-haNK 세포는 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청 및 0.05% 플루로닉 F68로 보충된 성장 배지에서 배양하였다. 무-혈청 성장 배지를 비히클 대조군으로 사용하였다.
테스트 시스템: 테스트 동물: 연구 개시 시(검역 및 순응 후) 10 내지 11 주령, 및 무작위화 시 20 내지 27 그램 체중의 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ (NSG) 암컷 마우스를 사용하였다. 연구에 사용된 동물의 수는 30 마리였고, 공급자는 더 잭슨 래보라토리(The Jackson Laboratory, 610 Main Street Bar Harbor, ME 04609 US)였다. 귀 태그, 케이지 번호, 및 꼬리 표시 번호로 동물을 식별하였다.
라지-19.5 종양 모델(암 세포주)
세포 배양 배지: 라지-19.5 암 세포를 10% 소 태아 혈청으로 보충되어 변형된 ATCC-조제된 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다.
세포 수확: 난트퀘스트의 SOP_생체내 연구를 위한 현탁액 암 세포 수집을 따라 원심 분리로 지수기의 라지-19.5 세포(계대 16)를 수집하였다. 그 후 세포를 세척하고 5 × 105 개 세포/mL의 농도로 무-혈청 배지에 재-현탁시키고, 동물 접종 전 얼음에 보관하였다. 생체내 연구에 사용된 세포는 97%의 생존력을 가졌다.
접종: 30 마리의 마우스를 0.2 mL 부피의 1 × 105 개 세포로 측면 꼬리 정맥을 통해 접종하였다. 이것을 0 일차로 정의하였다.
실험 절차
체중: 등록 전(검역/순응 후), 무작위화 전, 각각의 투약일에(그러나 투약 전), 각각의 투약 다음 날, 및 안락사 전에 동물의 중량을 측정하였다. 기준선(0 일차) 체중과 비교하였을 때 20% 초과의 체중 손실을 보이는 동물을 기관 IACUC 정책에 따라 안락사시켰고, 후속하여 연구 책임자의 재량으로 부검하였다.
임상 관찰: 사망/병적 상태에 대해 동물을 매일 관찰하였다(G0 내지 G4; 부록 1의 연구 프로토콜의 표 2 참고). 빈사상태이고 마비된 동물은 안락사시켰고, 후속하여 연구 책임자의 재량으로 부검하였다.
무작위화: 3 일차에(종양 세포 접종 3 일 후), 30 마리의 종양-보유 마우스를 동물 체중에 기초하여 10 마리로 된 3 개의 연구 그룹으로 의사(pseudo)-무작위화하였다.
테스트 품목 투여: 연속하여 4 주 동안 매주 2 회(3, 6, 10, 13, 17, 20, 24, 및 27 일차에), 지수기에서 성장한 R7-19.1 및 대조군 CD19 t-haNK 세포를 원심 분리로 수확하고, 200 μL의 주사 부피로 마우스 당 1 × 107 개 세포의 용량으로 IV 투여하기 위해 5 × 107 개 세포/mL의 농도로 무-혈청 성장 배지 중에 제형화하였다. 모든 세포 처리 및 제형 절차는 실온에서 수행하였다. 세포 생존력은 모든 용량 조제물에 대해 80%보다 컸다. 표 3에 나타난 바와 같이, 그룹 D는 비히클 대조군을 제공받았으며, 그룹 E 및 F는 각각 CD19 t-haNK 및 R7-19.1 세포를 제공받았다.
종점: 동물이 마비되거나, 빈사 상태가 되거나, 기관 IACUC에 의해 정의된 임의의 다른 종점 기준을 만족하였을 때 안락사시켰다. 실험은 마지막 생존 동물이 질병으로 사망하는 때인 30 일차에 종료하였다. 안락사는 CO2 흡입 후 경부 탈구를 통해 수행하였다. 연구 책임자의 재량 내에서, 일부 안락사된 동물을 부검하여 장기(internal organ) 상의 가시적인 종양 결절을 확인하였다. 사망율 및 사망 사건뿐만 아니라 부검 결과의 전체 기록은 부록 5에서 찾을 수 있다.
[표 3]
연구 설계(약식)
Figure pct00004
BIW: 매주 2 회; IACUC: 동물실험윤리위원회(Institutional animal care and use committee); IV: 정맥내.
데이터 분석:
체중 곡선: 체중 곡선은 이원 분산분석(또는 결측값이 있는 경우 혼합-효과 분석; 부록 1의 수정안 2 참고) 후, 투키 테스트에 의한 다중 비교로 분석하였다.
생존 곡선: 생존 곡선은 로그-순위(만텔-콕스) 테스트에 의해 분석하였다.
통계 분석: 모든 통계 분석은 그래프패드 프리즘 버전 8을 사용하여 수행하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 여겨진다.
결과
효능: 효능에 대한 주요 판독값은 동물 생존이었다. 동물을 병적 상태, 마비, 또는 20% 초과의 체중 손실로 인해 안락사시켰을 때 사망 사건을 카운트하였다. 사망한 동물은 발견되지 않았다. 도 15 및 표 4에 나타난 바와 같이, R7-19.1 및 대조군 CD19 t-haNK 세포를 사용한 치료 둘 모두는 비히클 대조군과 비교할 때 라지-19.5 IV 종양 보유 동물의 생존을 유의하게 연장시킬 수 있었으며(로그-순위 테스트에 의해, R7-19.1의 경우 P<0.0001; CD19 t-haNK의 경우 P=0.0002), 생존율 중간값은 각각 6.5 일 및 2.5 일 증가하였다. 이는 비히클 대조군 대비 각각 30% 및 12% 증가에 해당한다. 보다 중요하게는, R7-19.1 세포에서 CCR7 케모카인-반응성 수용체의 발현은 CD19 t-haNK 세포와 비교할 때 생존율 중간값의 추가 4 일 증가(17% 개선)를 나타냈다(P<0.0001).
[표 4]
비히클, CD19 t-haNK 세포, 또는 R7-19.1 세포로 치료된 라지-19.5 IV 종양-보유 NSG 마우스의 생존율 중간값 개요.
Figure pct00005
NA: 해당 사항 없음.
안전성
도 16에 나타난 바와 같이, NK 세포 치료된 동물은 일관되게 각각의 치료 시행 후 5 내지 10% 체중 손실을 보였다. 대부분의 경우, 동물은 세포 주사로부터 회복할 수 있었고 체중 회복을 나타냈으며, 이는 용량 간 체중 변화 곡선의 진동을 초래하였다. 그러나, 초기 용량은 가장 심각한 반응을 유발한 것처럼 보였으며, 체중 변화뿐만 아니라 임상 증상 둘 모두에서 가장 긴 회복 시간과 관련이 있었다. 이러한 반응은 IV NK 주입을 제공받은 동물에서 드물지 않으며, 분명히 R7-19.1 세포에 특이적인 것은 아니다. 체중 회복은 체중 손실이 일시적이고 가역적이었음을 시사한다.
중요한 점은, 연구가 끝날 무렵 동물의 체중이 급격히 감소하였다는 것이며, 이는 아마도 질병 진행 때문일 것이다(도 16). 부검은, 조사된 동물 거의 모두에서, 간, 난소, 때때로 비장의 종양 결절을 드러냈다. 하나의 예외는 CD19 t-haNK 세포 그룹에서 안락사된 첫 번째 마우스였으며, 이는 6 차 투약 다음 날 20% 초과의 체중 손실에 도달하였다. 이 동물에 대한 부검 중에 가시적인 종양 결절은 확인되지 않았다. 따라서, 안락사를 정당화하는 체중 손실에 대한 정확한 원인을 결정할 수 없었다.
결론
4 주 동안 주 2 회 1 × 107 개 세포/용량의 투약 수준으로 새롭게 제조된 R7-19.1 세포의 IV 투약은, IV 라지-19.5 이종 이식 모델에서, 현저하고 통계적으로 유의한 항-종양 효능을 나타냈다. 치료는 비히클 대조군 대비 생존율 중간값의 6.5 일 또는 30% 증가, 및 CD19 t-haNK 치료 그룹 대비 4 일 또는 17%의 증가를 제공하였다.
명백한 치료-관련 반응을 관찰하였지만, 이들 반응은 일시적이었고, 생존한 동물은 회복의 징후를 나타냈다. 이들 반응은 상대적으로 높은 용량의 인간 유래 NK 세포의 투여와 연관된 마우스-특이적인 문제로 추측되므로, 인간으로 번역될 것 같지는 않다.
전체적으로, CCR7-발현 R7-19.1 세포는 이 라지-19.5의 IV 모델에서 비히클 및 비-케모카인-반응성 대응물과 비교하여 유의한 치료 효능을 나타냈다.
실시예 8: 피하 CCL19-양성 라지 종양을 보유하는 NSG 마우스에서 CCR7-발현 R7-19.1 세포의 비교 효능 평가
CCR7은, B-세포 림프종에 대한 질병 징후의 주요 부위인 림프절 및 기타 림프 기관에서 전형적으로 발현되는, 케모카인 CCL19 및 CCL21의 구배를 향한 세포의 이동을 유도하는 케모카인 수용체이다. 본 발명자들은, t-haNK 플랫폼을 기반으로, CD19-CAR, CCR7, CD16.158V 및 ERIL-2를 발현하는 케모카인 반응성 NK-92® 세포(즉, R7-19.1 세포)를 생성하였다. 이들 세포는 CCR7 발현에 부가하여, CD19 암 항원에 대한 암-표적화 키메라 항원 수용체(CAR), CD16 변이체, 및 ER-IL-2를 보유한다. 이전의 분포 연구는 모 대응물과 비교하여 R7-19.1 세포의 CCL19-발현 피하(SC) 종양으로의 우선적 귀소를 입증하였다.
본 연구에서는, 라지-19.5의 SC 이종 이식 모델에서 R7-19.1 세포(NSG 마우스에서, CCL19를 발현하도록 조작된 라지 인간 버키트(Burkitt) 림프종 세포임)의 반복 정맥내(IV) 투여의 항-종양 효과를 평가하였다. 비-CCR7-발현 CD19 t-haNK 세포(NK-92®[항-CD19-CAR, CD16.158V, ERIL-2])를 대조군 NK 세포주로 사용하였다. 비히클 대조군도 포함시켰다.
종양-보유 동물의 하위-집단에서, 두 NK 세포 치료 모두 종양 성장을 억제하는 데 주목할 만한 효과를 나타낼 수 있었으며, R7-19.1 치료는 대조군 CD19 t-haNK 세포보다 더 강한 저해를 보였다. 두 NK 세포주 모두에서 명백한 치료-관련 반응을 관찰하였지만, 이들 반응은 상대적으로 높은 용량의 인간 유래 세포의 투여와 연관된 마우스-특이적인 문제로 추측된다.
연구 근거 및 목적: 생체내 분포 데이터는 IV 투여된 R7-19.1 세포가 CCL19-발현 SC 종양으로의 증가된 귀소를 나타냄을 보여주었다. 본 연구에서, NSG 마우스의 라지-19.5(라지의 CCL19-발현 서브라인) IV 및 SC 이종 이식 모델에서 R7-19.1 세포의 반복 IV 투여의 항-종양 효과를 평가하였다.
연구 재료
테스트 품목(들): R7-19.1 세포(클론: 및 CD19 t-haNK 세포(비-CCR7-발현 대조군 NK 세포; 클론 6)를 테스트 품목으로 사용하였고 성장 배지를 비히클 대조군으로 사용하였다.
R7-19.1 세포는 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청 및 0.05% 플루로닉 F68로 보충된 성장 배지에서 배양하였다.
CD19 t-haNK 세포는 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청 및 0.05% 플루로닉 F68로 보충된 성장 배지에서 배양하였다.
테스트 시스템: 연구 개시 시(검역 및 순응 후) 10 내지 11 주령, 및 종양 이식 일에 19 내지 28 그램 체중의 30 마리의 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ (NSG) 암컷 마우스를 연구에 사용하였다. 공급자는 더 잭슨 래보라토리(610 Main Street Bar Harbor, ME 04609 US)였다. 귀 태그; 케이지 번호; 및 꼬리 표시 번호를 사용하여 동물을 식별하였다.
라지-19.5 종양 모델(암 세포주)
세포 배양 배지: 라지-19.5 암 세포를 10% 소 태아 혈청으로 보충되어 변형된 ATCC-조제된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.
세포 수확: 난트퀘스트의 SOP_생체내 연구를 위한 현탁액 암 세포 수집을 따라 원심 분리로 지수기의 라지-19.5 세포(계대 16)를 수집하였다. 그 후 세포를 세척하고 무 혈청 배지에 재-현탁시킨 후 동일 파트(part)의 마트리겔과 혼합하여 2.5 × 106 개 세포/mL의 최종 농도에 도달하였다. 동물 접종 전에 세포를 얼음에 보관하였다. 생체내 연구에 사용된 세포는 97%의 생존력을 가졌다.
접종: 30 마리의 동물에게 100 μL 부피의 2.5 × 105 개 암 세포를 우측 옆구리 상에서 한쪽으로 치우치게 접종하였다. 주사 전에 피부를 면도하였다.
실험 절차
종양 부피 측정: SC 종양 이식 후, 종양 확립을 위해 동물을 적어도 주 2 회 검사하였다. 종양을 측정할 수 있게 되었을 때, 디지털 휴대용 캘리퍼로 매주 2 회 종양 부피(TV)를 측정하고 이 공식을 사용하여 계산하였다: TV = 길이 × 폭2/2 [길이는 종양의 가장 큰 직경이고 폭은 가장 짧은 직경임]. 2000 mm3을 넘는 종양 부피 또는 궤양성 종양을 갖는 동물을 기관 IACUC 정책에 따라 안락사시켰고, 후속하여 부검하였다. 종양 성장 저해(TGI)는 다음과 같이 계산하였다: TGI =(TC-Tt)/ΔTC×100%[여기서 TC 및 Tt는 각각 특정 시점에서의 대조군 및 치료 그룹에 대한 평균 종양 부피이고; ΔTC는 대조군에서의 평균 종양 부피의 변화임].
체중: 등록 전(검역/순응 후), 무작위화 전, 각각의 투약일에(그러나 투약 전), 각각의 투약 다음 날, 및 안락사 전에 동물의 중량을 측정하였다. 기준선(1 일차) 체중과 비교하였을 때 20% 초과의 체중 손실을 보이는 동물을 기관 IACUC 정책에 따라 안락사시켰고, 후속하여 부검하였다.
임상 관찰: 사망/병적 상태에 대해 동물을 매일 관찰하였다(G0 내지 G4; 표 5 참고). 빈사상태이거나 마비된 동물은 안락사시켰고, 후속하여 부검하였다.
무작위화: 평균 종양 부피가 190 mm3에 도달하였을 때, 30 마리의 마우스를 그룹 당 10 마리 마우스로 된 3 개의 연구 그룹으로 의사-무작위화하여 그룹 간 유사한 종양 부피를 달성하였다. 이것을 1 일차로 정의하였다. 중요한 점은, 무작위화 시 종양 크기의 큰 가변성으로 인해, 각 그룹은 2 개의 하위-집단을 포함하였다는 것이다: 4 내지 5 마리 동물은 큰(>200mm3) 종양을 가졌고, 5 내지 6 마리는 작은(<200 mm3) 종양을 가졌다(도 17 참고).
테스트 품목 투여: 연속하여 4 주 동안 매주 2 회(1, 4, 9, 12, 및 15 일차에), 지수기에서 성장한 R7-19.1 및 대조군 CD19 t-haNK 세포를 원심 분리로 수확하고, 200 μL의 주사 부피로 마우스 당 1 × 107 개 세포의 용량으로 IV 투여하기 위해 5 × 107 개 세포/mL의 농도로 무-혈청 성장 배지 중에 제형화하였다. 모든 세포 처리 및 제형 절차는 실온에서 수행하였다. 세포 생존력은 모든 용량 조제물에 대해 80%보다 컸다. 표 5에 나타난 바와 같이, 그룹 A는 비히클 대조군을 제공받았으며, 그룹 B 및 C는 각각 CD19 t-haNK 및 R7-19.1 세포를 제공받았다.
종점: 동물이 기관 IACUC에 의해 정의된 상기-언급된 종점 중 임의의 것에 도달하였을 때 안락사시켰다. 안락사는 CO2 흡입 후 경부 탈구를 통해 수행하였다. 연구 책임자의 판단에 기초하여, 일부 안락사된 동물을 부검하여 내부 장기 상의 가시적인 종양 결절을 확인하였다.
[표 5]
연구 설계(약식)
Figure pct00006
BIW: 매주 2 회; IACUC: 동물실험윤리위원회; IV: 정맥내; TGI: 종양 성장 저해.
1, IACUC에 의해 정의된 종양 부담 종점: 2000 mm3를 초과하는 종양 부피; 궤양성 종양; 정상 보행을 방해하는 종양.
데이터 분석
종양 부피 계산: 종양 부피=길이×폭2/2(길이 및 폭은 각각 종양의 가장 긴 직경 및 가장 짧은 직경임)
종양 성장 저해(TGI) 계산: TGI=(TC-Tt)/ΔTC×100%[여기서 TC 및 Tt는 각각 특정 시점에서의 대조군 및 치료 그룹에 대한 평균 종양 부피이고, ΔTC는 대조군에서 평균 종양 부피의 변화임].
종양 성장 및 체중 곡선의 통계 분석: 종양 성장 및 체중 곡선은 이원 분산분석(또는 결측값이 있는 경우 혼합-효과 분석; 부록 1의 수정안 2 참고) 후, 투키 테스트에 의한 다중 비교로 분석하였다. 모든 통계 분석은 그래프패드 프리즘 버전 8을 사용하여 수행하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 여겨진다.
결과
효능: 본 연구에서 일차 판독값은 종양 성장 저해이다. 상이한 초기 종양 부피를 갖는 SC 종양은 혈관 구조 및 CCL19 구배를 상이하게 발달시켰을 수 있으며, 이는 종양에 대한 테스트 품목의 분포에 영향을 미칠 수 있다. 추가로, 작은 및 큰 종양은 상이한 방식으로 NK 세포 치료에 반응할 수 있다. 이들 이유로, 2 개의 하위-집단(즉, 큰 및 종양)을 개별적으로 분석한다.
도 18에 나타난 바와 같이, 큰 초기 종양을 보유하는 동물의 하위-집단에서, 두 NK 세포주 모두를 사용한 치료는 비히클 대조군과 비교할 때 주목할 만한 종양 성장 저해를 나타냈으며, 여기서 4 마리 동물 중 3 마리는 2000 mm3를 초과하는 종양 부피 또는 궤양화된 종양의 존재로 인해 9 일차에 안락사해야만 하였다. 대조적으로, NK 세포-처리된 그룹에서는, 대부분의 동물이 12 일차 또는 15 일차까지 생존하였다. 보다 중요하게는, 15 일차에, 이의 비-CCR7-발현 대응물과 비교하였을 때 R7-19.1 그룹에서 종양 성장 저해의 표면적 향상이 있었고, 35%의 TGI를 달성하였다. 이 차이는, 아마도 작은 코호트 크기(CD19 t-haNK 및 R7-19.1 그룹에 대해 각각 2 및 4의 N)로 인해, 통계적 유의성에 도달하지 못하였다.
그러나, 치료 개시 시 작은 종양을 보유하였던 동물의 경우, NK 세포 요법 중 어느 것도 비히클 대조군과 비교하였을 때, 또는 서로에 대해, 종양 성장을 억제하는 데 있어서 효과적이지 않았다(도 19). 이는 다음의 세 가지 요인 때문일 개연성이 있다: 1) 작은 종양은 혈관 구조가 충분히 발달되지 않았을 수 있고, 그에 따라 테스트 품목에 대한 노출/접근성이 더 낮아, 두 NK 세포 요법 모두의 실패를 유발했을 수 있다. 2) 단순한 케모카인의 존재에 반응하기보다는, CCR7-매개 주화성은 케모카인 구배를 필요로 한다. 작은 종양에서는 CCL19의 이러한 구배가 부적절하게 확립되어, R7-19.1 세포 대 CD19 t-haNK 대조군 사이의 차별화 가능성의 결여를 야기하였을 수 있다. 그리고 3) 이미 소규모인 이들 코호트에서 종양 성장에 몇몇 "이상치"가 있어, 추가로 통계 분석을 하지 못하게 하였다.
도 20에 나타난 바와 같이, NK 세포 치료된 동물은 전형적으로 각각의 치료 시행 후 5 내지 10% 체중 손실을 보였다. 대부분의 경우, 동물은 세포 주사로부터 회복할 수 있었고 체중 회복을 나타냈으며, 이는 용량 간 체중 변화 곡선의 진동을 초래하였다. 그러나 초기 용량은, 가장 급성이고 심각한 반응을 유발한 것처럼 보였으며, 체중 변화뿐만 아니라 임상 증상 둘 모두에 대한 가장 긴 회복 시간과 관련이 있었다. 이러한 반응은 IV NK 주입을 제공받은 동물에서 드물지 않으며, 분명히 R7-19.1 세포에 특이적인 것은 아니다. 체중 회복은 체중 손실이 일시적이고 가역적이었음을 시사한다.
결론
4 주 동안 주 2 회, 1 × 107 개 세포/용량의 투약 수준으로 새롭게 제조된 케모카인-반응성 R7-19.1 세포의 IV 투약은, 큰 SC 라지-19.5 종양을 보유한 동물에서 주목할 만한 종양 성장 저해를 야기하였으나, 아마도 작은 코호트 크기로 인해, 이러한 효과는 통계적 유의성에 도달하지 못하였다. 이 치료 요법은 작은 초기 종양 부피를 갖는 동물에서는 치료 효능을 나타내지 않았다. 이것은 종양 혈관 구조의 저발달 및/또는 작은 종양에서 부적절하게 확립된 케모카인 구배 때문일 수 있다. 명백한 치료-관련 반응을 관찰하였다. 그러나, 이들 반응은 일시적이었고, 동물은 회복의 징후를 나타냈다. 이들 반응은 상대적으로 높은 용량의 인간 유래 NK 세포의 투여와 연관된 마우스-특이적인 문제로 추측되므로, 인간으로 번역될 것 같지는 않다.
실시예 9: aTGFβ/PD-L1 CAR 변형된 NK-92® 세포를 생산
TGFβRII의 세포외 도메인의 단일 사슬 이량체로 구성된 TGFβ 트랩을 PD-L1 CAR, CD16 및 erIL-2 전이 유전자도 함유하는 4 시스트론 플라스미드 벡터 내로 클로닝하였다(도 21). 4 시스트론 플라스미드를 aNK 세포 내로 전기 천공하여 변형된 NK-92 세포를 생성하였다. IL-2 의존성인 비형질전환 aNK 세포는 IL-2 고갈 배지에서 생존할 수 없었기 때문에, 변형된 NK-92® 세포를 IL-2 고갈 배지에 의해 선택하였다. 도 22는 aTGFβ/PD-L1 CAR 변형된 NK-92® 세포가 높은 수준의 PD-L1 CAR 및 CD16을 공동-발현함을 나타낸다.
한계 희석 클로닝
다클론 aTGFβ/PD-L1 t-haNK™ 풀 배양물의 부분 표본을 IL-2 보충 없는 성장 배지에 3 개 세포/ml의 밀도로 희석하였다. 이 세포 현탁액을, 평균적으로 웰당 0.6 개 세포에 해당하는, 웰당 200 μl의 부피로 96-웰 플레이트에 분취하였다. 플레이트를 37oC에서 10 일 동안 인큐베이션 한 다음, 세포 성장을 시각적으로 체크하였다. 클론을 고르고 확장 및 특징 확인을 위해 더 큰 용기로 옮겼다.
바이오분석 방법
세포 배양:
다클론 및 클론 aTGFβ/PD-L1 t-haNK™ 세포는 IL-2 없이 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청으로 보충된 성장 배지에서 배양하였다.
aNK 세포는 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청 및 500 IU/ml 재조합 인간 IL-2로 보충된 성장 배지에서 배양하였다.
haNK 세포는 IL-2 없이 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청으로 보충된 성장 배지에서 배양하였다.
K562 및 MDA-MB-231 세포는 10% 열 불활성화된 소 태아 혈청 및 항생제/항진균제 칵테일로 보충된 RPMI-1640에서 배양하였다. K562 세포는 2 내지 5 일마다, 또는 배양 배지가 노란색으로 보일 때마다 계대하였다.
SUP-B15PD-L1+ 및 SUP-B15CD19KO/CD20+ 세포는 20% 열 불활성화된 소 태아 혈청, 55 uM의 베타-메르캅토에탄올, 및 항생제/항진균제 칵테일로 보충된 RPMI-1640에서 배양하였다. 그 외에는 세포를 상기 K562 세포와 같이 계대하였다.
유세포 분석을 위한 항체 염색:
세포를 원심 분리로 수확하고, FACS 완충액(1X D-PBS 중 5% FBS)에서 2 회 세척하고, 1 ml FACS 완충액에 재현탁시켰다. 표면 단백질의 직접 형광단-접합된 항체 염색을 위해, 세포를 4℃에서 20 분 동안 암소에서 적절한 접합된 항체(또는 이소형 대조군)와 함께 인큐베이션한 다음, FACS 완충액으로 2 회 세척하였다. CAR 단백질의 검출을 위해, 세포를 비오틴화된 항 F(ab')2 단편 항체와 함께 인큐베이션한 후, 스트렙타비딘-APC 항체와 함께 인큐베이션하였다. 샘플은 MACSQuant 유세포 분석기에서 분석하였다.
세포 독성:
세포 배양물을 아래위로 피펫팅함으로써 현탁-성장하는 세포주를 재현탁하였다. 세포 생존력은 자동화된 계수(트리판 블루 제외 방법)로 결정하였다. 표적 세포를 CFSE 염료로 표지하고, 10% 열-불활성화된 FBS 및 항생제/항진균제로 보충된 RPMI-1640에서 표적 및 이펙터 세포를, 필요로 하는 세포 농도로 희석하였다. 이펙터와 표적 세포를 상이한 이펙터 대 표적(20:1, 10:1, 5:1, 2.5:1, 1.25:1, 0.62:1, 0.31:1, 및 0.15:1의 E:T) 비율로 96-웰 플레이트에서 혼합하고 5% CO2 분위기 37oC 인큐베이터에서 4h 동안 공동-인큐베이션하였다. 그 후 사멸된 세포의 형광 표지를 위해 PI를 추가하고 분석은 MACSquant 유세포 분석 장치에서 분석하였다.
ADCC:
세포 배양물을 아래위로 피펫팅함으로써 현탁-성장하는 세포주를 재현탁하였다. 세포 생존력은 자동화된 계수(트리판 블루 제외 방법)로 결정하였다. 표적 세포를 PKH67-GL 염료로 표지하고, 10% 열-불활성화된 FBS 및 항생제/항진균제로 보충된 RPMI-1640에서 표적 및 이펙터 세포를, 필요로 하는 세포 농도로 희석하였다. 표적 세포를 R.T.에서 30 분 동안 단일클론 항체 트라스투주맙, 리툭시맙과 함께, 또는 항체 없이 사전-인큐베이션하였다. 그 후 항체-표지된 표적 세포(및 항체가 없는 대조군)를 이펙터 세포와 상이한 이펙터 대 표적 비율(20:1, 10:1, 5:1, 2.5:1, 1.25:1, 0.62:1, 0.31:1, 및 0.15:1의 E:T)로 96-웰 플레이트에서 혼합하고 5% CO2 분위기 37℃ 인큐베이터에서 4 시간 동안 공동-인큐베이션하였다. 그 후 사멸된 세포의 형광 표지를 위해 PI를 추가하고 분석은 MACSquant 유세포 분석 장치에서 분석하였다.
aTGFβ/PD-L1t-haNK 세포에 의해 분비되는 TGFβ 트랩의 정량화
세포를 제거하기 위한 500 x g에서 5 분 동안의 제1 원심 분리 단계 후, 세포 잔해를 제거하기 위한 2000 x g에서 5 분 동안의 제2 원심 분리로 분석을 위한 샘플 상청액을 제조하였다. 샘플 상청액은 분석 전까지 -80℃에서 동결하였다. 500 x g 원심 분리 단계로부터의 세포 펠렛을 재현탁하고, 3 벌을 풀링하고 세포 밀도를 기록하였다. 제조업체의 설명서에 따라 인간 TGFβRII ELISA 검출 키트를 사용하여 샘플 상청액 내 TGFβ 트랩의 농도를 측정하였으며, 제공된 표준과 비교하였다. TGFβ 트랩 농도를 세포 수에 대해 정규화하였고 pg/ml/106 개 세포로 표현하였다. 도 23은 모든 aTGFβ PD-L1 t-haNK 클론이 다량의 TGFβ 트랩(약 6 내지 약 13 ng/ml/10 6 개 세포)을 분비하였음을 나타낸다.
표적 세포주에 대한 aTGFβ/PD-L1 t-haNK™ 세포의 세포 독성
aTGFβ/PD-L1 t-haNK™ 세포의 세포 독성은 표적 세포 K562 세포, SUP-B15PD-L1+ 세포, 및 MDA-MB-231 세포와 함께 인큐베이션함으로써 분석하였다. 도 24는 aTGFβ/PD-L1 t-haNK™ 세포가 K562 세포(표적 세포)를 살해하는데 있어서 모 aNK 세포와 필적하는 세포 독성을 유지하였음을 나타낸다.
도 25는 aTGFβ/PD-L1 t-haNK™ 세포가 aNK™-저항성, PD-L1-양성 SUP-B15 세포주의 향상된 특이적 살해를 보였음을 나타내며, 8의 이펙터 대 표적 비율에서 세포의 약 10%만이 aNK 세포에 의해 살해된 것에 비해, 세포의 약 70%가 aTGFβ/PD-L1 t-haNK™ 세포에 의해 살해되었다.
도 26은 aTGFβ/PD-L1 t-haNK™ 세포가 MDA-MB-231 세포주의 향상된 특이적 살해를 보였음을 나타내며, 8의 이펙터 대 표적 비율에서 세포의 약 40%만이 aNK 세포에 의해 살해된 것에 비해, 세포의 약 90%가 aTGFβ/PD-L1 t-haNK™ 세포에 의해 살해되었다.
도 27은 항-CD20 리툭시맙 단일클론 항체와 또는 항-Her2-neu 트라스투주맙 단일클론 항체와 조합하여 aTGFβ/PD-L1 t-haNK™ 세포의 SUP-B15CD19KO/CD20+ 세포(CD19-, CD20+, Her2-neu-, NK-저항성)에 대한 ADCC 활성을 나타낸다. 4h 세포 독성 분석에서 aTGFβ/PD-L1 t-haNK 세포는 항-CD20 항체 리툭시맙과 조합하였을 때 저항성 SUP-B15CD19KO/CD20+를 효율적으로 표적화하고 살해할 수 있었다. haNK®와 aTGFβ/PD-L1 t-haNK™ 클론 중 어떤 것도 항-Her2/neu 대조군 항체 트라스투주맙과 조합하였을 때 표적 SUP-B15CD19KO/CD20+ 세포를 살해할 수 없었다.
실시예 10: 변형된 NK-92® 세포에 의해 분비되는 TGFβ 트랩은 TGFβ 활성을 저해한다
TGFβ-반응성 요소(SMAD-결합 프로모터), 곧이어 루시페라제 리포테 유전자 발현으로 조작된 HEK293 세포는 TGFβ로 처리될 때 루시페라제 활성에 있어서 용량-의존적 증가를 나타낸다(도 28).
도 29는 HEK293 리포터 세포에서의 루시페라제 활성의 TGFβ 유도가 aTGFβ/PD-L1 t-haNK 세포의 배양 상청액과의 공동-인큐베이션에 의해 저해될 수 있는 반면, haNK 대조군 세포로부터의 배양 상청액이 루시페라제 활성에 제한적인 영향을 미침을 나타낸다.
실시예 11: 변형된 NK-92® 세포에 의한 IL-12의 생산
NK-92 세포는, p35-p40 방향 또는 p40-p35 방향으로(도 30), 단일 사슬 폴리펩티드로서 기능성 IL-12 p70 이량체를 인코딩하는 렌티바이러스 작제물을 이용하여 형질 도입하였다. 네오마이신 선택 후, 형질 도입된 NK-92 세포는 검출 가능한 수준의 p70 IL-12를 분비할 수 있었다. IL-12 이량체의 C-말단 단부에서 2A 펩티드를 추가하는 것은 단백질 분비에 영향을 미치지 않았다.
IL-12/PD-L1 CAR 변형된 NK-92® 세포의 생산
IL-12의 단일 사슬 이량체(scIL-12 p70)를 PD-L1 CAR, CD16 및 erIL-2 전이 유전자도 함유하는 4 시스트론 플라스미드 벡터 내로 클로닝하였다. 4 시스트론 플라스미드(도 31)를 aNK 세포 내로 전기 천공하여 변형된 NK-92 세포를 생성하였다. IL-2 의존성인 비형질전환 aNK 세포는 IL-2 고갈 배지에서 생존할 수 없기 때문에, 변형된 NK-92® 세포를 IL-2 고갈 배지에 의해 선택하였다. 도 33은 IL-12/PD-L1 CAR 변형된 NK-92® 세포가 유의한 양의 scIL-12 p70 사이토카인을 분비할 수 있음을 나타낸다.
본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시적 목적을 위한 것이며 이를 고려하여 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이고, 본 출원 및 첨부된 청구항의 범위의 사상 및 영역 내에 포함되어야 함이 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 서열 수탁 번호, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
본원에서 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않으면서, 이미 기재된 것 외에 더욱 많은 변형이 가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 대상은 첨부된 청구항의 범위를 제외하고는, 제한되지 않아야 한다. 더욱이, 명세서 및 청구항 둘 모두를 해석함에 있어서 모든 용어는 문맥과 일치하는 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 구체적으로, 용어 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"은 비-배타적인 방식으로 요소, 구성 요소, 또는 단계를 언급하는 것으로 해석되어야 하며, 언급된 요소, 구성 요소, 또는 단계가, 명확히 언급되지 않은 다른 요소, 구성 요소, 또는 단계와 함께 존재하거나, 사용되거나, 조합될 수 있음을 나타낸다. 명세서 청구항이 A, B, C .... 및 N으로 구성된 군으로부터 선택되는 무언가 중 적어도 하나를 언급하는 경우, 본문은, A + N, 또는 B + N 등이 아니라, 군으로부터의 오직 하나의 요소를 요하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (23)

  1. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 귀소 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하고 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하며, 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하고, CAR은 CD19에 특이적으로 결합하거나, SEQ ID NO: 25와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 변형된 NK-92 세포.
  2. 제1항에 있어서, 귀소 수용체는 G 단백질-결합 수용체(GPCR), 케모카인 수용체, 사이토카인 수용체, 세포 접착 분자, 셀렉틴, 또는 인테그린인, 변형된 NK-92 세포.
  3. 제2항에 있어서, 케모카인 수용체는 CCR7, CXCR2, 또는 CXCL14에 대한 수용체로부터 선택되고, 세포 접착 분자는 L-셀렉틴(CD62L), α4β7 인테그린, LPAM-1, 및 LFA-1로부터 선택되는, 변형된 NK-92 세포.
  4. 제3항에 있어서, CCR7을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는, 변형된 NK-92 세포.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 NK-92 세포는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 사이토카인을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 변형된 NK-92 세포.
  6. 제5항에 있어서, 사이토카인은 IL-2, erIL-2, IL-15, erIL-15 또는 이의 조합인, 변형된 NK-92 세포.
  7. 제5항에 있어서, 사이토카인은 erIL-2이고, erIL-2를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 14와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는, 변형된 NK-92 세포.
  8. 제8항에 있어서, 사이토카인은 erIL-15이고, erIL-15를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 67과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는, 변형된 NK-92 세포.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 NK-92 세포는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Fc 수용체를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 변형된 NK-92 세포.
  10. 제9항에 있어서, Fc 수용체는 CD16 또는 고친화성 CD16(SEQ ID NO: 12)이거나, SEQ ID NO: 13과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산인, 변형된 NK-92 세포.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 귀소 수용체, 항원 결합 단백질, CAR, 또는 Fc 수용체 중 적어도 하나는 변형된 NK-92 세포의 세포 표면 상에 발현되는, 변형된 NK-92 세포.
  12. 특정 유전자좌에서의 표적화된 상동 재조합을 포함하며, 유전자좌는 AAVS1이고, AAVS1 유전자좌는 SEQ ID NO: 7과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는, 변형된 NK92 세포주를 생성하는 방법.
  13. 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 전환 성장 인자(TGF)-베타 트랩 및 세포 예정사 1 리간드 1(PD-L1)에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 NK-92 세포.
  14. 제13항에 있어서, 변형된 NK-92 세포는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 C-X-C 케모카인 수용체 유형 4(CXCR4) 또는 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하며, 항원 결합 단백질은 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는, 변형된 NK-92 세포.
  15. 제14항에 있어서, 종양 관련 항원은 CD19, CD20, NKG2D 리간드, CS1, GD2, CD138, EpCAM, HER-2, EBNA3C, GPA7, CD244, CA-125, MUC-1, ETA, MAGE, CEA, CD52, CD30, MUC5AC, c-Met, EGFR, FAP, WT-1, PSMA, NY-ESO1, CSPG-4, IGF1-R, Flt-3, CD276, CD123, BCMA, CD33, B7-H4, 또는 4-1BB로부터 선택되는, 변형된 NK-92 세포.
  16. 제14항에 있어서, 항원 결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부인, 변형된 NK-92 세포.
  17. 제13항에 있어서, 변형된 NK-92 세포는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 사이토카인을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 변형된 NK-92 세포.
  18. 제17항에 있어서, 사이토카인은 IL-2, erIL-2, IL-15, erIL-15, IL-12, 또는 이의 조합인, 변형된 NK-92 세포.
  19. 제17항에 있어서, 사이토카인은 erIL-2인, 변형된 NK-92 세포.
  20. 제13항에 있어서, 변형된 NK-92 세포는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Fc 수용체를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 변형된 NK-92 세포.
  21. 제20항에 있어서, Fc 수용체는 CD16 또는 SEQ ID NO: 12의 서열을 갖는 고친화성 CD16이거나, SEQ ID NO: 13과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산인, 변형된 NK-92 세포.
  22. 제13항에 있어서, TGF-베타 트랩은 TGF-베타 수용체 II 엑토도메인의 단일 사슬 이량체를 포함하는, 변형된 NK-92 세포.
  23. 제13항에 있어서, PD-L1에 특이적으로 결합하는 CAR은 SEQ ID NO: 68과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산에 의해 인코딩되는, 변형된 NK-92 세포.
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