KR20210037611A

KR20210037611A - 코돈 최적화

Info

Publication number: KR20210037611A
Application number: KR1020207035094A
Authority: KR
Inventors: 롱 판
Original assignee: 난징 진스크립트 바이오테크 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2018-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2021-04-06
Also published as: CN112513989A; TWI802728B; SG11202011455SA; TW202008379A; JP2021532439A; US20210366574A1; EP3830830A1; WO2020024917A1; EP3830830A4; CN112513989B

Abstract

숙주에서 단백질 발현을 위한 핵산 서열을 최적화하기 위한 예시적인 컴퓨터-구현 방법은 하기를 포함한다: a) 초기 모집단 세트를 수신하는 단계로서, 여기서 상기 초기 모집단 세트는 단백질을 발현할 수 있는 복수의 초기 후보 핵산 서열을 포함하는, 단계 (106); 및 b) 상기 초기 모집단 세트에 기초하여 컴퓨터-지원된 NSGA-III 알고리즘 또는 이들의 변형을 사용하여 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하고, 이에 의해 단백질을 발현할 수 있는 복수의 최적화된 핵산 서열을 수득하는 단계 (108).

Description

코돈 최적화

ASCII 텍스트 파일 상의 서열 목록 제출

ASCII 텍스트 파일 상의 다음 제출의 내용은 그 전체로 본 명세서에 참조로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형식 (CRF) (파일 이름: 759892000440SEQLIST.TXT, 기록 날짜: 2018년 7월 25일, 크기: 4 KB).

발명의 분야

본 개시내용은 일반적으로 최적화 기술에 관한 것이고, 보다 구체적으로 숙주에서 단백질 발현을 위한 서열(예를 들어, 핵산 서열)을 최적화하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.

코돈 축중은 아미노산이 상이한 동의어 코돈에 의해 특정될 수 있는 현상으로 나타나는 유전적 코드의 중복성을 지칭한다. 특히, 이들 동의어 코돈은 대부분의 서열화된 게놈에서 동등하지 않은 빈도로 사용된다는 것이 발견되었다. 이 현상은 코돈-사용빈도 편향이라 불린다.

생물의학 및 생명공학 연구와 산업적 생산을 위해서는 올바른 폴딩 및 변형을 갖는 고-품질 단백질이 요구되기 때문에, 단백질의 발현 수준을 개선하기 위해서는 고도로-발현된 유전자의 코돈-사용빈도 편향을 반영하는 잠재적으로 유익한 규칙 및 패턴을 탐색하고 요약하는 방법이 필수적이다. 그러나, 단백질 발현은 전사, mRNA 전환, 번역 및 안정된 산물을 형성할 수 있는 후 번역 변형의 수준에서 조절을 포함하는 다단계 과정이다. 단일 동의어 코돈 치환조차도 이식유전자의 발현을 1,000-배 초과로 증가시킬 수 있다. 따라서, 코돈 최적화는 재조합 숙주에서 합성적 유전자의 최적 발현을 위해 준비된다.

간략한 개요

다중-목표 최적화 알고리즘을 사용하여 복수의 인자들을 고려할 뿐만 아니라 균형을 이루는 향상된 코돈 최적화를 위한 시스템 및 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에 따르면, 코돈 최적화는 무엇보다도 세 가지 목표인: (i) 처음에 특정 아미노산의 동의어 코돈의 계수를 할당하는 방법, (ii) 동의어 코돈의 가장 적합한 위치에 동의어 코돈을 배치하는 방법, 및 (iii) 불리하지만 우발적으로 생성된 하위서열 및/또는 모티프를 감소시키는 방법을 기반으로 한다. 일부 실시형태에서, 이들 세 가지의 목표는 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수로서 정량화된다. 최적화 동안에 목표는 비우점 분류 유전적 알고리즘 III (NSGA-III) 또는 이들의 변형과 같은 다중-목표 알고리즘을 사용하여 고려된다. 구체적으로, 고도로-발현된 유전자의 알려진 특성을 참조하여 주어진 후보 핵산 서열에 대한 목표가 계산될 수 있다. 일부 실시형태에서, 다양한 공지된 불리한 모티프 및/또는 특징 (예를 들어, 문헌에서 확인된 바와 같음)은 유전자 합성 및 단백질 발현 전에 하나 이상의 최적화된 서열로부터 제거된다.

따라서, 본 발명은 바람직하게는 이에 의해 코돈 조화, 코돈 사용빈도 (예를 들어, 동의어 코돈 분포), 코돈 문맥 지수, cis-작용 mRNA 불안정화 모티프, RNase 스플라이싱 부위, GC-함량, 리보솜 결합 부위 (RBS), 유전자의 mRNA 이차 구조 (예를 들어, mRNA 자유 에너지) 및 반복 요소를 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질 발현에 영향을 미치는 모든 또는 대부분의 매개변수 및 인자가 포유동물, 곤충, 효모, 박테리아, 조류와 같은 진핵 세포 및 원핵 세포 둘 모두를 포함하는 발현 숙주 세포에서, 그리고 무-세포 발현 시스템에서와 같은, 발현 시스템에서 유전자의 단백질 발현을 끌어올리기 위해 핵산 서열을 개선하고 최적화하기 위한 고려에 취해지는 체계적인 방법을 제공한다.

일부 실시형태에서, a) 초기 모집단 세트를 수신하는 단계로서, 여기서 상기 초기 모집단 세트는 단백질을 발현할 수 있는 복수의 초기 후보 핵산 서열을 포함하는, 단계; 및 b) 상기 초기 모집단 세트에 기초하여 컴퓨터-지원된 NSGA-III 알고리즘 또는 이들의 변형을 사용하여 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하고, 이에 의해 단백질을 발현할 수 있는 복수의 최적화된 핵산 서열을 수득하는 단계로, 여기서 상기 후보 핵산 서열의 조화 지수는 복수의 고도로 발현된 유전자와 후보 핵산 서열 사이의 동의어 코돈의 사용 빈도 분포의 일관성을 나타내며, 여기서 후보 핵산 서열의 코돈 문맥 지수는 동의어 코돈을 적절한 위치에 배치하기 위한 척도이고, 여기서 후보 핵산 서열의 이상치 지수는 후보 핵산 서열에 대한 복수의 미리결정된 서열 특징의 부정적 효과의 척도인, 단계를 포함하는, 숙주에서 단백질의 발현을 위해 핵산 서열을 최적화하기 위한 컴퓨터 구현-방법이 제공된다.

일부 실시형태에서, 본 방법은 복수의 최적화된 핵산 서열 중 적어도 하나의 최적화된 핵산 서열을 나타내는 출력을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 초기 모집단 세트를 수신하는 단계는 단백질 서열을 수신하는 단계; 수신된 단백질 서열을 기반으로 초기 모집단 세트를 생성하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 초기 모집단 세트를 수신하는 단계는 핵산 서열을 수신하는 단계; 수신된 핵산 서열을 단백질 서열로 번역하는 단계; 단백질 서열을 기반으로 초기 모집단 세트를 생성하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 초기 모집단 세트는 미리결정된 크기의 것이다.

일부 실시형태에서, 초기 모집단 세트는 복수의 초기 후보 핵산 서열의 이진수 표현을 포함한다.

일부 실시형태에서, 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하는 단계는 조화 지수를 최대화하는 단계; 코돈 문맥 지수를 최대화하는 단계; 및 이상치 지수를 최소화하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하는 단계는 초기 모집단 세트의 각각의 초기 후보 핵산 서열에 대해, 각각의 초기 후보 핵산 서열에 대한 각각의 조화 지수 값, 각각의 코돈 문맥 지수 값, 및 각각의 이상치 지수 값을 계산하는 단계; 상기 계산하는 단계에 기초하여, 복수의 초기 후보 핵산 서열에 상응하는 복수의 적합성 값을 할당하는 단계; 상기 복수의 적합성 값에 기초하여, 복수의 초기 후보 핵산 서열을 분류하는 단계; 및 후속하는 모집단 세트에 상기 분류된 복수의 초기 후보 핵산 서열의 서브세트를 포함시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 복수의 적합성 값은 후보 핵산 서열에 대한 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 방법은 초기 모집단에 기초하여 자손 모집단을 생성하는 단계; 및 후속 모집단 세트에 자손 모집단을 포함시키는 단계를 더 포함한다.

일부 실시형태에서, 자손 모집단은 이진수 토너먼트 선택, 교차/재조합, 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 통해 생성된다.

일부 실시형태에서, 초기 모집단 세트와 후속 모집단 세트는 동일한 크기이다.

일부 실시형태에서, 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하는 단계는 복수의 반복을 포함하며, 여기서 복수의 반복의 i-번째 반복은: (i-1)번째 반복에 상응하는 핵산 서열의 모집단 세트를 수신하는 단계; (i-1)번째 반복에 상응하는 모집단 세트의 각 핵산 서열을 비-우점 수준과 연관시키는 단계; 연관된 비-우점 수준에 기초하여 (i-1)번째 반복에 상응하는 모집단 세트에서 핵산 서열을 분류하는 단계; i-번째 반복에 상응하는 모집단 집합을 생성하는 단계로, 여기서 i-번째 반복에 상응하는 모집단 집합은 (i-1)번째 반복에 상응하는 분류된 핵산 서열의 서브세트 및 (i-1)번째 반복에 상응하는 분류된 핵산 서열에 기초하여 생성된 자손 모집단을 포함하는, 단계; 및 하나 이상의 종료 조건에 기초하여, i-번째 반복에 상응하는 모집단 세트를 사용하여 (i+1)번째 반복으로 진행할지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 각 핵산 서열을 비-우점 수준과 연관시키는 단계는 (i-1)번째 반복에 상응하는 모집단 세트의 각 핵산 서열에 대해, 각각의 조화 지수 값, 각각의 코돈 문맥 지수 값 및 각각의 이상치 지수 값을 계산하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, i-번째 반복에 상응하는 모집단 세트를 생성하는 단계는 (i-1)번째 반복에 상응하는 분류된 핵산 서열의 적어도 하나의 핵산 서열을 복수의 미리결정된 기준점 중 하나와 연관시키는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 종료 조건은 고정된 횟수의 반복에 도달하고 최상의 적합성에 도달하고 더 나은 결과가 생성되지 않음, 최적에 근접한 솔루션의 최소 기준이 일부 솔루션에 의해 만족됨, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 실시형태에서, 후보 핵산 서열의 조화 지수는 식: H = 1-D(F _hs ,F _ts )에 기초하여 계산되며, 상기 식에서 D()는 거리 함수를 나타내고; 여기서 F_hs는 복수의 고도로 발현된 유전자 내의 복수의 아미노산의 동의어 코돈의 빈도를 포함하는 벡터를 포함하고; F_ts는 후보 핵산 서열의 코딩 유전자 내에 복수의 아미노산의 동의어 코돈의 빈도를 포함하는 벡터를 포함한다.

일부 실시형태에서, D()는 두 벡터 사이의 거리를 측정하는 함수를 나타낸다. 일부 실시형태에서, D()는 두 벡터의 유클리드 거리, 코사인 거리, 맨하탄 거리, 또는 민코프스키 거리를 포함하지만 이에 제한되지 않는 거리 함수이다.

일부 실시형태에서, 복수의 고도로 발현된 유전자 또는 후보 핵산 서열의 동의어 코돈의 빈도는 다음과 같이 정의된다:

일부 실시형태에서, 후보 핵산 서열의 코돈 문맥 지수는 식: CC = 1 - D(F _hcc ,F _tcc )에 기초하여 계산되며, 상기 식에서 D()는 거리 함수를 나타내고; 여기서 F_hcc는 복수의 고도로 발현된 유전자 내의 2개의 연속 아미노산의 동의어 코돈 쌍의 빈도를 포함하는 벡터를 포함하고; F_tcc는 후보 핵산 서열의 코딩 유전자 내에 2개의 연속 아미노산의 동의어 코돈 쌍의 빈도를 포함하는 벡터를 포함한다.

일부 실시형태에서, D()는 두 벡터 사이의 거리를 측정하는 함수를 나타낸다. 일부 실시형태에서, D()는 두 벡터의 유클리드 거리, 코사인 거리, 맨하탄 거리, 또는 민코프스키 거리를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 거리 함수이다.

일부 실시형태에서, 복수의 고도로 발현된 유전자 또는 후보 핵산 서열의 동의어 코돈 쌍의 빈도는 다음과 같이 정의된다:

일부 실시형태에서, 이상치 지수는 식

에 기초하여 계산되며, 상기에서 N은 복수의 미리결정된 서열 특징의 수이고; 여기서 fi(x)는 복수의 미리결정된 서열 특징 중 i번째 서열 특징의 페널티 스코어링 함수를 나타내고; wi는 fi(x)와 연관된 상대적 가중치를 나타낸다.

일부 실시형태에서, 복수의 미리결정된 특징은 GC-함량 값, CIS 요소, 반복 요소, RNA 스플라이싱 부위, 리보솜 결합 서열, mRNA의 최소 자유 에너지, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 실시형태에서, 복수의 미리결정된 특징은 선택된 발현 시스템에 기초하여 확인된다.

일부 실시형태에서, NSGA-III 알고리즘의 변형은 EliteNSGA-III 알고리즘 또는 NSGA-II 기반 면역 알고리즘을 포함한다.

일부 실시형태에서, 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하는 단계는 조화 지수의 내림 차순, 그 다음 코돈 문맥 지수의 내림 차순, 그리고 그 다음 이상치 지수의 오름 차순에 의해 복수의 최적화된 핵산 서열을 순위 매김하는 단계; 합성을 위한 하나 이상의 최상위의 최적화된 핵산 서열을 선택하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 방법은 c) 복수의 최적화된 핵산 서열의 최적화된 핵산 서열로부터 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프는 복수의 텍스트 부분의 분석에 기초하여 확인된다.

일부 실시형태에서, 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프를 제거하는 단계는 최적화된 핵산 서열에서 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프를 확인하는 단계; 확인된 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프에 기초하여 복수의 동의어 코돈을 확인하는 단계; 최적화된 핵산 서열에서 확인된 미리결정된 불리한 하위서열로 치환하기 위해 복수의 동의어 코돈으로부터 동의어 코돈을 선택하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수 중 적어도 하나는 하나 이상의 데이터베이스로부터 복수의 고도로-발현된 유전자의 하나 이상의 특성에 기초하여 계산된다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 특성은 코돈 빈도, 동의어 코돈 빈도, 코돈 쌍 빈도 또는 이들의 조합을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 방법은 하나 이상의 매개변수를 설정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 하나 이상의 매개변수는 모집단 세트의 크기, 분할의 수, 시뮬레이션된 이진수 교차에 대한 분포 지수, 시뮬레이션된 이진수 교차에 대한 교차 비율, 비트 플립 돌연변이에 대한 돌연변이 비율, 비트 플립 돌연변이에 대한 분포 지수, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 프로그램을 저장하는 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체가 제공되며, 상기 하나 이상의 프로그램은 전자 장치의 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때 전자 장치가 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 수행하는 것을 야기하는 명령을 포함한다.

일부 실시형태에서, 숙주에서 단백질 발현을 위해 핵산 서열을 최적화하기 위한 시스템이 제공되며, 상기 시스템은 하나 이상의 프로세서; 메모리; 및 하나 이상의 프로그램을 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 프로그램은 메모리에 저장되고 하나 이상의 프로세서에 의해 실행되도록 구성되며, 상기 하나 이상의 프로그램은 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 명령을 포함한다.

일부 실시형태에서, 숙주에서 단백질의 발현을 위해 핵산 서열을 최적화하기 위한 전자 장치가 제공되며, 상기 장치는 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 수단을 포함한다.

일부 실시형태에서, 숙주에서 단백질의 발현을 위해 핵산 서열을 최적화하기 위해 기록가능한 매체에 저장된 프로그램 제품이 제공되며, 상기 프로그램 제품은 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 컴퓨터 소프트웨어를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 방법으로부터 수득된 최적화된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 제공된다.

일부 실시형태에서, 상기-언급된 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다.

일부 실시형태에서, 상기-언급된 단리된 핵산 분자 또는 상기-언급된 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포가 제공된다.

일부 실시형태에서, 숙주 세포에서 단백질을 발현시키기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은: (a) 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여 숙주 세포에서 단백질의 발현을 위한 최적화된 핵산 서열을 수득하는 단계, (b) 상기 최적화된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 합성하는 단계; (c) 상기 핵산 분자를 숙주 세포에 도입하여 재조합 숙주 세포를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 재조합 숙주 세포를 상기 최적화된 핵산 서열로부터 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함한다.

도 1은 일부 실시형태에 따른, 코돈 최적화를 위한 예시적인 프로세스의 블록도를 도시한다.
도 2a는 일부 실시형태에 따른, 숙주에서 단백질의 발현을 위한 서열 (예를 들어, 핵산 서열)을 최적화하기 위한 알고리즘을 구축하고 실행하기 위한 예시적인 파이프라인을 도시한다.
도 2b는 일부 실시형태에 따른, 유전적 알고리즘의 예시적인 일반적인 워크플로우를 도시한다.
도 3은 일부 실시형태에 따른, 그 야생형에 비해 최적화된 GFP 및 JNK3A1의 웨스턴 블랏 결과를 도시한다.
도 4는 일부 실시형태에 따른, 예시적인 전자 장치를 도시한다.

본 발명은 대장균, CHO, HEK293, 효모, 곤충, 무-세포 발현 시스템 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 숙주에서 유전자의 재조합 발현을 개선하기 위한 향상된 코돈 최적화를 제공한다. 본 발명에 따른 예시적인 시스템은 발현 시스템을 위한 고도로-발현된 유전자를 수집하고, 기본 서열 특징을 추출하고, 관심 있는 서열 (예를 들어, 핵산 서열)에서 유익한 포괄적 패턴을 복제하고, 발현 시스템에서 표적 유전자의 발현을 개선하기 위해 불리한 특징을 제거한다.

현재, 다수의 코돈 최적화의 도구가 개발되었으며 아래 표 1에 요약되어 있다. 코돈 사용 (예를 들어, 코돈 적응 지수 [CAI], 유효한 코돈 수 [ENc], 상대적 동의어 코돈 사용 [RSCU] 및 동의어 코돈 사용 순서 [SCUO]), 코돈 쌍, tRNA 사용 (예를 들어, tRNA 적응 지수 [tAI]), GC-함량, 리보솜 결합 부위 (RBS), 숨겨진 정지 코돈, 모티프 회피, 제한 부위 제거, 유전자의 mRNA 2차 구조 (예를 들어, mRNA 자유 에너지) 및 수치료법 지수 최적화를 포함하는 매개변수 및 인자들 중 다수, 바람직하게는 대부분 또는 모두가 박테리아, 효모, 곤충 및 포유동물 세포의 코돈 최적화 동안 발현을 끌어올리기 위해 이들 도구들이 고려되어 졌다.

표 1

그러나, 너무 많은 인자들이 요점에 대해 고려될 수 있기 때문에, 이들을 균형있게 하는 방법은 다수의 목표 최적화 문제이지만 상기 목표는 서로 충돌할 수 있기 때문에 어려움이 있다. 다른 한편, 고려사항으로부터 하나 이상의 인자 또는 매개변수를 생략하는 것은 발현 시스템에서 표적 유전자의 낮은 또는 무 발현을 초래할 수 있다.

따라서, 일 양태에서 본 발명은 다수의 (예를 들어, 2개 초과) 목표를 최적화하기 위해 NSGA-III 알고리즘 또는 이들의 변형을 사용하여 개선된 재조합 단백질 발현을 위한 서열 최적화를 위한 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 유전자 합성 및 단백질 발현 전에 (예를 들어, NSGA-III 알고리즘의 반복이 완료된 후) 핵산 서열로부터 불리한 모티프 및 특징을 제거하는 방법이 제공된다. 또한 최적화 알고리즘에서 다수의 목표를 정량화하고 계산하는 방법뿐만 아니라 감소시키거나 제거할 불리한 모티프 및 특징을 확인하는 방법이 제공된다.

또한 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나 이상의 단계를 수행하기 위한 하나 이상의 프로그램을 저장하기 위한 시스템, 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체, 전자 장치 및 프로그램 제품이 제공된다. 본 명세서에 기재된 방법으로부터 수득된 최적화된 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자; 상기 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터; 상기 분리된 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포가 또한 제공된다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 포함하는 숙주 세포에서 단백질을 발현하는 방법이 또한 제공된다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태는 실시형태로 "구성된" 및/또는 "본질적으로 구성된"을 포함하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서 값 또는 매개변수에 대한 "약"에 대한 언급은 그 값 또는 매개변수 자체에 대한 변형을 포함 (및 기술)한다. 예를 들어, "약 X"에 대해 언급하는 기술은 "X"의 기술을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 값 또는 매개변수에 대한 "아님"에 대한 언급은 일반적으로 값 또는 매개변수 "이외"를 의미하고 기술한다. 예를 들어, 본 방법이 X 유형의 암을 치료하는 데 사용되지 않는다는 것은 본 방법이 X 이외 유형의 암을 치료하는 데 사용된다는 것을 의미한다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "또는" 및 "the"는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, "세트"는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 하나 또는 복수의 대상을 지칭한다.

코돈 최적화의 방법

일 양태에서 본 발명은 숙주에서 단백질의 발현을 위해 핵산 서열을 최적화하는 방법 (예를 들어, 컴퓨터-구현 또는 컴퓨터-보조 방법)을 제공한다. 유전자 합성 및 단백질 발현 전에 (예를 들어, NSGA-III 알고리즘의 반복이 완료된 후) 핵산 서열로부터 불리한 모티프 및 특징을 제거하는 방법이 이들 방법에 대해 관련된다. 또한 최적화 알고리즘에서 다수의 목표를 정량화하고 계산하는 방법뿐만 아니라 감소시키거나 제거할 불리한 모티프 및 특징을 확인하는 방법도 이들 방법에 관련된다.

도 1은 선택적 단계를 나타내는 대시 블록을 갖는 코돈 최적화를 위한 예시적인 프로세스 (100)를 예시한다. 프로세스 (100)의 일부는 특정 장치에 의해 수행되는 것으로 본 명세서에서 기재되어 있지만, 프로세스 (100)는 그렇게 제한되지 않음이 이해될 것이다. 다른 예들에서, 프로세스 (100)는 단지 단일 전자 장치 (예를 들어, 전자 장치 (400)) 또는 다수의 전자 장치를 사용하여 수행된다. 프로세스 (100)에서, 일부 블록은 선택적으로 결합되고, 일부 블록의 순서는 선택적으로 변경되고, 일부 블록은 선택적으로 생략된다. 일부 예에서, 부가의 단계가 프로세스 (100)와 결합하여 수행될 수 있다.

블록 (106)에서, 전자 장치는 초기 모집단 세트를 수신하며, 여기서 초기 모집단 세트는 단백질을 발현할 수 있는 복수의 초기 후보 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 초기 모집단 세트는 무작위로 생성된다. 일부 실시형태에서, 초기 모집단 세트는 미리결정된 크기 (예를 들어, 사용자에 의해 결정됨)의 것이다.

일부 실시형태에서, 블록 (106)에 도시된 바와 같이, 초기 모집단 세트를 수신하는 단계는 단백질 서열에 기초하여 초기 모집단 세트를 생성하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 초기 모집단 세트를 수신하는 단계는 단백질 서열을 수신하는 단계 (예를 들어, 사용자로부터의 입력으로); 및 수신된 단백질 서열에 기초하여 초기 모집단 세트를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 초기 모집단 세트를 수신하는 단계는 핵산 서열을 수신하는 단계 (예를 들어, 사용자로부터의 입력으로); 수신된 핵산 서열을 단백질 서열로 번역하는 단계; 단백질 서열에 기초하여 초기 모집단 세트를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 초기 모집단 세트는 복수의 초기 후보 핵산 서열의 이진수 표현 (예를 들어, 이진수 문자열)을 포함한다. 일반적으로, 코돈 목록/배열/벡터가 아닌 이진수 문자열은 코딩 유전자를 나타내는 데이터 구조로 선택되고, 모집단 초기화, 교차/재조합, 돌연변이, 선택을 포함한 유전적 알고리즘의 모든 조작 대상은 선택 전에 유전자의 적합성 평가를 제외한 이진수 문자열이다. 아래에 추가로 설명되는 바와 같이, 일부 실시형태에서, 적합성 함수 (즉, 3개의 지수 함수)가 선택 전에 전체 모집단의 각각의 개체에 대해 평가될 것이 필요할 때, 이진수 표현은 일시적으로 코돈 문자열로 다시 변환되어야 한다.

블록 (108)에서, 전자 장치는 초기 모집단 세트에 기초하여 컴퓨터-지원 NSGA-III 알고리즘 또는 이들의 변형을 사용하여 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하며, 이에 의해 단백질을 발현할 수 있는 복수의 최적화된 핵산 서열을 수득한다.

항상 또는 일부 실시형태에서, 후보 핵산 서열의 조화 지수는 복수의 고도로 발현된 유전자와 후보 핵산 서열 (즉, 최적화 동안 후보 단백질을 인코딩하는 유전자) 사이의 동의어 코돈의 사용 빈도 분포의 일관성을 나타내며, 이는 특정 아미노산의 동의어 코돈의 계수를 할당하는 방법을 해결하는 데 도움이 된다. 후보 핵산 서열의 코돈 문맥 지수는 동의어 코돈을 적절한 위치에 배치하기 위한 척도이다. 후보 핵산 서열의 이상치 지수는 후보 핵산 서열에 대한 복수의 미리결정된 서열 특징의 부정적 효과의 척도이다.

일부 실시형태에서, 블록 (106)에 도시된 바와 같이, 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하는 단계는 상기 조화 지수를 최대화하는 단계; 상기 코돈 문맥 지수 최대화하는 단계; 및 상기 이상치 지수를 최소화하는 단계를 포함한다.

최적화는 다중-목표 유전적 알고리즘을 사용함에 의해 수행될 수 있으며, 3가지 목표는 조화 지수를 최대화하는 것; 코돈 문맥 지수를 최대화하는 것; 및 이상치 지수를 최소화하는 것이다. 일부 실시형태에서, NSGA-III 알고리즘 또는 변형이 사용된다. 전통적인 유전적 알고리즘과 달리, NSGA-III의 모집단 구성원 간의 다양성의 유지는 다수의 잘-분산된 소정의 기준점을 제공하고 적응적으로 업데이트함에 의해 지원되며, 따라서 NSGA-III는 그 선택 조작자에 상당한 변화가 있다. 추가로 NSGA-III는 NSGA-II와 같은 다른 유전적 알고리즘에 비해 세 가지-목표에서 15가지-목표 최적화 문제를 해결하는 데 있어 그 효능을 입증한다. NSGA-III 알고리즘의 변형은 EliteNSGA-III 알고리즘, NSGA-II 기반 면역 알고리즘, MAM-MOIA 또는 MOLA를 포함한다. EliteNSGA-III 알고리즘은 2016년에 Amin Ibrahim 등에 의해 공표된 "ELITENSGA-III: AN IMPROVED EVOLUTIONARY MANY-OBJECTIVE OPTIMIZATION ALGORITHM" 표제의 출판물에 기술되어 있으며, 이는 그 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다. 다양한 면역 알고리즘이 예를 들어 2010년 9월에 Guan-Chun Luh 등에 의해 공표된 "MOIA: MULTI-OBJECTIVE IMMUNE ALGORITHM" 표제의 출판물, 2007년에 Felipe Campelo 등에 의해 공표된 "OVERVIEW OF ARTIFICIAL IMMUNE SYSTEMS FOR MULTI-OBJECTIVE OPTIMIZATION" 표제의 출판물, 2010년 4월에 Zhi-Hua Hu에 의한 "A MULTIOBJECTIVE IMMUNE ALGORITHM BASED ON A MULTIPLE-AFFINITY MODEL" 표제의 출판물 및 2017년 7월 25일에 출원된 중국 특허 출원 번호 201710611752.5에 기술되어 있으며, 이는 그 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.

NSGA-III 알고리즘 (또는 유사한 유전적 알고리즘)의 작동에 따라, 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하는 단계는 초기 모집단 세트의 각각의 초기 후보 핵산 서열에 대하여, 각각의 초기 후보 핵산 서열에 대한 각각의 조화 지수 값, 각각의 코돈 문맥 지수 값, 및 각각의 이상치 지수 값을 계산하는 단계; 상기 계산하는 단계에 기초하여, 복수의 초기 후보 핵산 서열에 상응하는 복수의 적합성 값을 할당하는 단계; 복수의 적합성 값에 기초하여, 복수의 초기 후보 핵산 서열을 분류하는 단계; 및 정렬된 복수의 초기 후보 핵산 서열의 서브세트를 후속하는 모집단 세트 (즉, 2차 반복에서 사용됨)에 포함시키는 단계를 포함한다.

NSGA-III 알고리즘 (또는 유사한 유전적 알고리즘)의 작동에 따라, 본 방법은 초기 모집단에 기초하여 자손 모집단을 생성하는 단계; 및 후속하는 모집단 세트 (즉, 2차 반복에서 사용됨)에 자손 모집단을 포함시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 자손 모집단은 이진수 토너먼트 선택, 교차/재조합, 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 통해 생성된다.

일부 실시형태에서, 초기 모집단 세트와 후속하는 모집단 세트 (즉, 2차 반복에서 사용됨)는 동일한 크기의 것이다.

NSGA-III 알고리즘 (또는 유사한 유전적 알고리즘)의 작동에 따라, 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하는 단계는 복수의 반복을 포함한다. 복수의 반복의 i-번째 반복 (여기서 i는 2, 3, 4, 5, 6... n일 수 있음)은: (i-1)번째 반복에 상응하는 핵산 서열의 모집단 세트를 수신하는 단계; (i-1)번째 반복에 상응하는 모집단 세트의 각 핵산 서열을 비-우점 수준과 연관시키는 단계; 연관된 비-우점 수준에 기초하여 (i-1)번째 반복에 상응하는 모집단 세트에서 핵산 서열을 분류하는 단계; i-번째 반복에 상응하는 모집단 집합을 생성하는 단계로, 여기서 i-번째 반복에 상응하는 모집단 집합은 (i-1)번째 반복에 상응하는 분류된 핵산 서열의 서브세트 및 (i-1)번째 반복에 상응하는 분류된 핵산 서열에 기초하여 생성된 자손 모집단을 포함하는, 단계; 및 하나 이상의 종료 조건에 기초하여, i-번째 반복에 상응하는 모집단 세트를 사용하여 (i+1)번째 반복으로 진행할지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 각 핵산 서열을 비-우점 수준과 연관시키는 단계는 (i-1)번째 반복에 상응하는 모집단 세트의 각 핵산 서열에 대해, 각각의 조화 지수 값, 각각의 코돈 문맥 지수 값 및 각각의 이상치 지수 값을 포함한다.

NSGA-III 알고리즘의 작동에 따라, 일부 실시형태에서, i-번째 반복에 상응하는 모집단 세트를 생성하는 단계는 (i-1)번째 반복에 상응하는 분류된 핵산 서열의 적어도 하나의 핵산 서열을 복수의 미리결정된 기준점 중 하나와 연관시키는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 방법은 최적화 알고리즘에 대한 하나 이상의 매개변수를 설정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 하나 이상의 매개변수는 모집단 세트의 크기, 분할의 수, 시뮬레이션된 이진수 교차에 대한 분포 지수, 시뮬레이션된 이진수 교차에 대한 교차 비율, 비트 플립 돌연변이에 대한 돌연변이 비율, 비트 플립 돌연변이에 대한 분포 지수, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 실시형태에서, 최적화 동안에 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수 중 적어도 하나는 하나 이상의 데이터베이스로부터의 복수의 고도로-발현된 유전자의 하나 이상의 특성에 기초하여 계산된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 특성은 코돈 빈도, 동의어 코돈 빈도, 코돈 쌍 빈도 또는 이들의 조합을 포함한다. 고도로-발현된 유전자의 이들 특성을 사용하여 아래 식에 나타난 바와 같은 주어진 후보 핵산 서열에 대한, 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수를 계산할 수 있다.

일부 실시형태에서, 블록 (102)에 표시된 바와 같이, 고도로-발현된 유전자의 이들 특성은 개인 또는 공용 데이터베이스를 기반으로 확인된다. 예를 들어, 데이터베이스(들)는 회사의 오더 시스템에서 수집된 이전에 성공적으로 최적화된 오더를 포함하는 독점 데이터베이스일 수 있다. 다른 예로, 데이터는 다양한 배양 조건 하에서 RNA-seq 데이터의 데이터 마이닝의 방식에 의해 수득될 수 있으며, 이는 공개 정보일 수 있다. 데이터 처리는 코돈 빈도, 동의어 코돈 빈도, 코돈 쌍 빈도를 포함한 고도로-발현된 유전자의 기본 정보를 얻기 위한 목적으로 수행된다.

일부 실시형태에서, 후보 핵산 서열의 조화 지수는 식: H = 1-D(F _hs ,F _ts )에 기초하여 계산되며, 상기에서 D()는 거리 함수를 나타내고; 여기서 F_hs는 복수의 고도로 발현된 유전자 내의 복수의 아미노산의 동의어 코돈의 빈도를 포함하는 벡터를 포함하고; F_ts는 후보 핵산 서열의 코딩 유전자 내에 복수의 아미노산의 동의어 코돈의 빈도를 포함하는 벡터를 포함한다.

일부 실시형태에서, 이상치 지수는 식

일부 실시형태에서, 복수의 미리결정된 특징은 선택된 발현 시스템에 기초하여 확인된다. 다양한 발현 시스템의 경우, 불리한 인자의 목록이 변경될 수 있으며, 그 영향이나 가중치도 또한 동등하지 않다.

블록 (110)에서, 본 방법은 c) 복수의 최적화된 핵산 서열의 최적화된 핵산 서열로부터 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프를 제거하는 단계는 최적화된 핵산 서열에서 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프를 확인하는 단계; 확인된 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프에 기초하여 복수의 동의어 코돈을 확인하는 단계; 최적화된 핵산 서열에서 확인된 미리결정된 불리한 하위서열로 치환하기 위해 복수의 동의어 코돈으로부터 동의어 코돈을 선택하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 블록 (104)에 표시된 바와 같이, 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프는 복수의 텍스트 부분의 분석 (예를 들어, 문헌의 자동 텍스트 마이닝 또는 수동 검사)에 기초하여 확인된다.

일부 실시형태에서, 본 방법은 복수의 최적화된 핵산 서열 중 하나 이상의 최적화된 핵산 서열을 나타내는 출력을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 숙주에서 단백질의 발현을 위해 핵산 서열을 최적화하기 위한 시스템이 제공되며, 상기 시스템은 하나 이상의 프로세서; 메모리; 및 하나 이상의 프로그램을 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 프로그램은 메모리에 저장되고 하나 이상의 프로세서에 의해 실행되도록 구성되며, 상기 하나 이상의 프로그램은 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 명령을 포함한다.

일부 실시형태에서, 숙주 세포에서 단백질을 발현시키기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여 숙주 세포에서 단백질의 발현을 위한 최적화된 핵산 서열을 수득하는 단계, (b) 상기 최적화된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 합성하는 단계; (c) 상기 핵산 분자를 숙주 세포에 도입하여 재조합 숙주 세포를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 재조합 숙주 세포를 상기 최적화된 핵산 서열로부터 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함한다.

도 2a는 본 발명의 일부 실시형태에 따라 숙주에서 단백질의 발현을 위한 서열 (예를 들어, 핵산 서열)을 최적화하기 위한 알고리즘을 구축하고 실행하기 위한 예시적인 파이프라인 (200)을 예시한다. 프로세스 (200)는, 예를 들어, 도 4에 도시된 하나 이상의 전자 장치를 사용하여 수행된다. 일부 예들에서, 프로세스 (200)는 클라이언트-서버 시스템을 사용하여 수행되고, 프로세스 (200)의 블록은 서버와 클라이언트 장치 사이에서 임의의 방식으로 분할된다. 다른 예에서, 프로세스 (200)의 블록은 서버 및/또는 다수의 클라이언트 장치 사이에서 분할된다. 따라서, 프로세스 (200)의 일부는 특정 장치에 의해 수행되는 것으로 본 명세서에서 기술되지만, 프로세스 (200)는 그렇게 제한되지 않음을 인식될 것이다. 다른 예들에서, 프로세스 (200)는 단지 단일 전자 장치 (예를 들어, 전자 장치 (400)) 또는 다수의 전자 장치를 사용하여 수행된다. 프로세스 (200)에서, 일부 블록은 선택적으로 조합되고, 일부 블록의 순서는 선택적으로 변경되고, 일부 블록은 선택적으로 생략된다. 일부 예에서, 추가 단계가 프로세스 (200)와 조합하여 수행될 수 있다.

데이터 수집 및 문헌 검토

도 2a를 참조하면, 블록 (202)에서, 복수의 고도로-발현된 유전자가 하나 이상의 데이터베이스로부터 확인될 수 있다. 데이터베이스는 공개 또는 비공개일 수 있다. 예를 들어, 데이터베이스(들)는 회사의 오더 시스템에서 수집된 이전에 성공적으로 최적화된 오더를 포함하는 독점 데이터베이스일 수 있다. 다른 예로, 데이터는 다양한 배양 조건 하에서 RNA-seq 데이터의 데이터 마이닝의 방식에 의해 수득될 수 있으며, 이는 공개 정보일 수 있다.

블록 (204)에서, 고도로-발현된 유전자의 기본적 특성이 확인된다. 예시적인 실시형태에서 mRNA-seq 실험 및 데이터 분석은 표준 샘플에 대한 Illumina의 권장 mRNA-Seq 작업흐름에 따라 수행된다. 과정 중에 TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit가 라이브러리 준비를 위해 사용될 수 있고, NextSeq의 PE300이 서열화를 위해 이용될 수 있다. 연속적으로, 코돈 빈도, 동의어 코돈 빈도, 코돈 쌍 빈도를 포함한 고도로-발현된 유전자의 기본적인 정보를 얻기 위해 TopHat, Cufflinks 및 홈-메이드 스크립트를 통한 데이터 처리가 적용될 수 있다.

블록 (206 및 208)에서, 예시적인 시스템은 또한 확립된 이점을 유지하기 위해 회피할 임의의 보고되고 검증된 불리한 특징들을 확인할 수 있다. 단백질 발현의 감소를 초래할 수 있는 부정적인 인자를 발견하기 위해, 시스템은 문헌 검토를 수행할 수 있다. 예를 들어, 자동 텍스트 마이닝 및/또는 수동 검사의 방식에 의해 보고된 발현-관련된 불리한 모티프 및 mRNA 특징이 다양한 숙주에 대해 확인될 수 있다.

최적화 알고리즘을 위한 주요 인자/적합성 함수

코딩 유전자의 발현은 전사, mRNA 전환, 번역 (개시, 프로모터 탈출, 연장 및 종결을 포함함) 및 후 번역 변형의 수준에 의존하는 다수의 단계를 갖는다. 그럼에도 불구하고 코돈 최적화는 조합의 문제로 단순화되고 3가지 직관적인 조작: (i) 처음에 특정 아미노산의 동의어 코돈 계수를 할당하는 방법, (ii) 동의어 코돈의 가장 적합한 위치에 동의어 코돈을 배치하는 방법, 및 (iii) 불리하지만 우발적으로 생성된 하위서열 및/또는 모티프를 감소시키는 방법으로 그룹화될 수 있다.

본 발명의 일부 실시형태에 따르면, 3가지 상기-언급된 조작에 각각 일치하고 단백질 발현과 높은 상관관계가 있는 3가지 핵심 인자인: 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수가 아래에 제공된다. 아래에서 논의된 바와 같이, 이들 3가지 지표는 다양한 데이터 공급원으로부터 수집된 상기-언급된 기초 데이터를 기반으로 계산된다.

도 2a를 참조하면, 블록 (210)에서, 두 단계 (212 및 214)를 포함하는 최적화 절차가 수행된다. 블록 (212)에 도시된 단계 1에서, 시스템은 NSGA-III 알고리즘 또는 그 변형에 기초하여 다중-목표 코돈 최적화를 수행하며, 이는 조화 지수를 최대화하는 단계, 코돈 문맥 지수를 최대화하는 단계 및 이상치 지수를 최소화하는 단계를 포함한다.

1. 조화 지수

조화 지수는 고도로 발현된 유전자와 후보 핵산 서열 사이의 동의어 코돈의 사용 빈도 분포의 일관성을 나타낸다. 후보 핵산 서열은 "다중-목표 최적화 알고리즘"이라는 제목하에 자세히 기술되어 있는 최적화 알고리즘의 적어도 1회 반복에서 평가된 후보 단백질을 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조화 지수는 다음과 같이 정의된다:

상기 식에서, H는 조화 지수이고, D()는 유클리드 거리, 코사인 거리, 맨하탄 거리 또는 민코프스키 거리일 수 있으나 이에 제한되지는 않는 두 벡터 간의 거리 함수이다. F_hs는 고도로 발현된 유전자 내 18개 아미노산 (Met/M 및 Trp/W 제외)의 동의어 코돈의 빈도를 포함한 벡터이고, 64개 코돈으로부터 3개의 정지 코돈 (즉, TAA, TAG 및 TGA), 아미노산 Met/M의 코돈 (즉, ATG) 및 아미노산 Trp/W의 코돈 (즉, TGG)의 제거에 기인하여 59개 요소를 포함한다. F_ts는 코돈 최적화를 대기하는 후보 단백질의 코딩 유전자 (즉, 후보 핵산 서열) 내의 18개 아미노산의 동의어 코돈의 빈도를 포함하는 벡터이다.

코돈 적응 지수 (CAI)와 비교하여, 조화 지수는 동의어 코돈의 분포 (즉, 사용 균형/장입 균형)에 집중하지만 가장 빈번하게 발생하는 최상 1개 동의어 코돈을 유일하게 선택하는 단계를 통해 항상 최대 CAI를 목표로 하는 것은 아니다.

일부 실시형태에서, 조화 지수의 계산 동안 사용되는 고도로 발현된 유전자 또는 후보 핵산 서열의 특정 동의어 코돈의 빈도는 다음과 같이 정의된다:

조화 지수는 코돈 사용을 고려하지만, 동의어 코돈의 빈도 분포에만 관심이 있는 반면, 18개 아미노산 중 하나의 상이한 유전자좌에 이들의 할당은 여전히 문제이다 (즉, 동일한 아미노산의 동의어 코돈의 순서 설정). 따라서, 동의어 코돈에 대한 대략적으로 최적의 순위화를 선택하기 위해 동의어 코돈 짝짓기를 통해 이 병목현상을 해결하기 위해서는 아래 기술된 코돈 문맥 지수가 요구된다.

2. 코돈 문맥 지수

후보 핵산 서열의 코돈 문맥 지수는 동의어 코돈을 적절한 위치에 배치하기 위한 척도이다. 일부 실시형태에서, 코돈 문맥 지수는 다음과 같이 정의된다:

상기 식에서, CC는 코돈 문맥 지수를 나타내고, D()는 유클리드 거리, 코사인 거리, 맨하탄 거리 또는 민코프스키 거리일 수 있지만 이에 제한되지는 않는 두 벡터 사이의 거리 함수이다. F_hcc는 고도로 발현된 유전자 내에서 모든 종류의 두 연속 아미노산의 동의어 코돈 쌍의 빈도를 포함하는 벡터이다. 예를 들어, 아미노산 Phe/F는 두 개의 동의어 코돈, 즉 TTT와 TTC를 가지고; 아미노산 Lys/K는 또한 코돈으로서 AAA 및 AAG를 가지고; 그들의 동의어 코돈 쌍은 TTTAAA, TTTAAG, TTCAAA 및 TTCAAG를 포함하여 2 x 2 조합이어야 한다. 두 개의 아미노산 메티오닌/M 및 트립토판/W의 순열 (즉, MM, MW, WW 및 WM)에 대해 동의어 코돈 쌍이 존재하지 않기 때문에, CC의 길이는 61 x 61 마이너스 4이고 최종적으로는 3717이다. F_tcc는 후보 단백질의 코딩 유전자 (즉, 후보 핵산 서열) 내의 모든 종류의 두 개의 연속 아미노산의 동의어 코돈 쌍의 빈도를 포함하는 벡터이며, 이것의 길이는 또한 3717이다.

코돈 문맥 지수의 계산 중에 사용되는 고도로 발현된 유전자 또는 후보 핵산 서열의 특정 동의어 코돈 쌍의 빈도는 다음과 같이 정의된다:

3. 이상치 지수

이상치 지수는 단백질 발현에 대한 확인된 복수의 서열 특징의 부정적인 영향을 평가하기 위해 가중 함수에 의해 계산된 척도이다. 일부 실시형태에서, 이상치 지수는 다음과 같이 정의된다:

상기 식에서 N은 확인된 복수의 서열 인자의 수이고 N>1이다. f_i(x)는 확인된 N 서열 특징의 i-번째 서열 인자의 페널티 스코어링 함수를 나타내고; 그리고 wi는 f_i(x)에 주어진 상대적 가중치를 나타낸다. 따라서, 최적화된 유전자는 최대로 낮은 이상치 지수를 가져야 한다.

일부 실시형태에서, 복수의 서열 인자는 도 2a에 도시된 단계들 (202, 204 및 208) 중 하나 이상을 통해 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 서열 인자는 하기에 상세히 설명된 GC-함량, CIS 요소, 반복적 요소, RNA 스플라이싱 부위, 리보솜 결합 서열, mRNA의 최소 자유 에너지를 함유하지만, 이에 제한되지는 않는다.

3(a). mRNA의 최소 자유 에너지 ( MFE )

개시 코돈의 하류에 위치하는 mRNA의 잠재적인 강력한 스템-루프 2차 구조는 리보솜 복합체의 이동을 방해할 수 있고, 따라서 번역을 늦추고 번역 효율을 감소시킬 수 있다. mRNA의 안정된 2차 구조는 리보솜 복합체를 mRNA에서 떨어지게 하고 번역의 조기 종료를 초래하게 할 수도 있다. Mfold, RNAfold 및 RNAstructure를 포함하여 자유 에너지 계산 및 2차 구조 예측을 위한 몇 가지 방법이 있다. 본 발명의 실시형태에 따르면, 낮은 자유 에너지 (△G < -18 Kcal/mol) 또는 긴 상보적 스템 (> 10 bp)를 갖는 mRNA의 국소 2차 구조는 효율적인 번역을 위해 너무 안정한 것으로 정의된다. 유전자 서열은 바람직하게는 국소 구조가 그렇게 안정적이지 않도록 최적화된다. mRNA의 5'-UTR 및 3'-UTR의 둘 모두는 바람직하게는 mRNA 구조 자유 에너지 계산 및 2차 구조 예측을 위해 고려된다.

일부 실시형태에서, 너무 안정적인 것으로 고려되는 2차 구조는 더 높은 페널티와 연관된다. 더 높은 페널티 점수를 제공하는 데 사용된 가중치는 유연하다.

3(b). GC -함량

mRNA의 GC 함량이 또한 바람직하게 고려된다. GC%에 대한 이상적인 범위는 대략 30-70%이다. 높은 GC-함량은 mRNA가 강한 줄기-루프 2차 구조를 형성하도록 할 것이다. 또한 PCR 증폭 및 유전자 클로닝에 문제를 일으킬 것이다. 표적 서열의 높은 GC-함량은 바람직하게는 약 50-60%가 되도록 코돈 축중을 사용하여 (예를 들어, 이진수 문자열의 교차 및 돌연변이를 포함하는, NSGA-III 알고리즘의 동작 동안) 돌연변이된다.

GC%에 대한 두 가지 상이한 측정이 있다. 하나는 전체 시퀀스를 따라 평균화되는 글로벌 GC%이며; 다른 하나는 더 유용하며 이는 고정된 크기 (예를 들어, 60 bp)의 이동된 "윈도우" 내에서 계산된 국소 GC%이다. 본 발명의 실시형태에 따르면, 국소 GC%는 약 35-65%로 최적화된다.

3(c). 불안정한 인자 (예를 들어, Cis -작용 mRNA 불안정화 모티프, RNase 스플라이싱 사이트 및 반복 요소, 등)

mRNA 분해를 감소 또는 최소화하거나 mRNA의 안정성을 증가시키고 따라서 mRNA의 전환 시간을 감소시키기 위해, AU-풍부 요소 (ARE) 및 RNase 인식 및 절단 부위를 포함하지만 이에 제한되지 않는 시스-작용 mRNA 불안정화 모티프는 바람직하게는 유전자 서열로부터 돌연변이되거나 결실된다. AUUUA (서열 번호: 1)의 코어 모티프를 갖는 AU-풍부 요소 (ARE)는 일반적으로 mRNA의 3' 비번역된 영역에서 발견된다. mRNA cis-요소의 또 다른 예는 서열 모티프 TGYYGATGYYYYY (서열 번호: 2)로 구성되며, 여기서 Y는 T 또는 C를 나타낸다. RNase 인식 서열은 RNase E 인식 서열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 부족한 RNase를 갖는 숙주 균주가 또한 단백질 발현에 사용될 수 있다.

RNase 스플라이싱 부위는 RNA 스플라이싱이 다른 mRNA를 생성하도록 하고 따라서 원래의 mRNA 수준을 감소시킬 수 있다. RNase 스플라이싱 부위는 또한 바람직하게는 mRNA 수준을 유지하기 위해 비-기능적으로 돌연변이된다.

높은 수준의 mRNA를 생성하기 위해, 최적의 전사 프로모터 서열이 바람직하게는 유전자 서열에 사용된다. 대장균과 같은 원핵 숙주의 경우 강한 프로모터 중 하나는 T7 RNA 중합효소 (T7 RNAP)에 대한 T7 프로모터이다. 길거나 짧은 탠덤 단순 서열 반복 (SSR)의 일부 염기는 바람직하게는 반복을 파괴하여 중합효소 슬리피지를 감소시켜 조기 단백질 또는 단백질 돌연변이를 감소시키도록 코돈 축중을 사용하여 돌연변이된다.

mRNA 번역 및 결과적인 단백질 발현 수준에 영향을 미치는 추가 인자 및 매개변수가 있다. 이들 인자는 번역 개시부터 번역 종료를 통해 번역에 영향을 미친다. 리보솜은 리보솜 결합 부위 (RBS)에서 mRNA를 결합하여 번역을 개시한다. 리보솜은 이중-가닥 RNA에 결합하지 않기 때문에, 이 영역 주변의 국소 mRNA 구조는 바람직하게는 단일 가닥이고 어떤 안정한 2차 구조도 형성하지 않는다. Shine-Dalgarnon 서열이라고도 불리는 이 콜리와 같은 원핵 세포에 대한 컨센서스 RBS 서열인 AGGAGG (서열 번호: 3)는 바람직하게는 발현되어 지는 유전자의 번역 개시 부위 바로 전 몇 개의 염기에 위치된다. 그러나, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)는 바람직하게는 비-특이적 번역 개시를 피하기 위해 리보솜 결합을 방지하도록 돌연변이된다.

상기-언급된 인자들의 상세한 설명은, 예를 들어, 2018년 5월에 공표된 Saeid Kadkhodaei 등의 "CIS/TRANSGENE OPTIMIZATION: SYSTEMATIC DISCOVERY OF NOVEL GENE EXPRESSION USING BIOINFORMATICS AND COMPUTATIONAL BIOLOGY APPROACHES" 표제의 출판물, 2014년 7월에 공표된 Timothy J Gingerich 등의 "AU-RICH ELEMENTS AND THE CONTROL OF GENE EXPRESSION THROUGH MRNA STABILITY" 표제의 출판물, 2017년 10월에 공표된 Tala Bakheet의 "ARED-PLUS: AN UPDATED AND EXPANDED DATABASE OF AU-RICH ELEMENT-CONTAINING MRNAS AND PRE-MRNAS" 표제의 출판물, 1995년에 공표된 Shuang Zhang 등의 "IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A SEQUENCE MOTIF INVOLVED IN NONSENSE-MEDIATED MRNA DECAY" 표제의 출판물, 2002년에 공표된 Jiong Ma 등의 "CORRELATIONS BETWEEN SHINE-DALGARNO SEQUENCES AND GENE FEATURES SUCH AS PREDICTED EXPRESSION LEVELS AND OPERON STRUCTURES"" 표제의 출판물, 2013년 12월에 공표된 Esther Y.C. Koh 등의 "AN INTERNAL RIBOSOME ENTRY SITE (IRES) MUTANT LIBRARY FOR TUNING EXPRESSION LEVEL OF MULTIPLE GENES IN MAMMALIAN CELLS" 표제의 출판물에서 찾아 볼 수 있으며, 이는 그 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.

다양한 발현 시스템의 경우, 불리한 인자의 목록이 변경될 수 있으며, 그 영향 또는 가중치 또한 동일하지 않다. 따라서 f_i(x)와 그 가중치는 다양한 발현 시스템에 대해 동적으로 변형될 수 있다. 예를 들어 GC-함량 및 MFE의 허용 범위의 설정 후, '범위를 벗어남'의 정도는 비율로 페널티를 야기할 것이다. 마찬가지로, 불안정한 인자의 발생 횟수는 페널티 점수로 직접적으로 기록될 수 있다.

후보 핵산 서열에 대한 이상치 지수가 높더라도, 후보 서열은 전체 모집단의 다양성을 유지하기 위해 반복이 생존할 가능성이 여전히 있을 수 있음이 인식되어야 한다. 환언하면, 더 높은 이상치 지수 (즉, 페널티)는 단지 더 낮은 생존율을 초래할 수 있기 때문에 이상치 지수를 통한 불리한 모티프/특징 여과가 필수적인 것은 아니다. 대조적으로, NSGA-III 알고리즘의 반복이 완료된 후 (즉, 도 1의 단계 110 또는 도 2의 단계 214에서) 불리한 모티프/특징의 제거는 필수적이다.

결론적으로, 본 발명은 조화 지수와 코돈 문맥 지수의 값을 최대화함에 의해 긍정적인 효과를 증진하는 것을 시도할 뿐만 아니라 이상치 지수를 최소화함에 의해 불리한 영향을 피하기 위해 최선을 다한다.

다중-목표 (예를 들어, 2 초과의 목표) 최적화 알고리즘

본 발명은 3개의 포괄적인 목표의 최적화 작업이므로, 다중-목표 유전적 알고리즘이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, NSGA-III 알고리즘 또는 그의 변형 예컨대 EliteNSGA-III (또한 K. Deb에 의해 제시됨)가 유전적 알고리즘의 고전적 프레임워크의 선택 조작 동안 모집단 다양성을 유지함에 의해 다중-목표 최적화 문제를 해결하는 데 있어 이들의 이점에 기인하여 사용될 수 있다.

NSGA-III는 2014년 Kalyanmoy Deb과 Himanshu Jain에 의해 제안되었다. 그것은 비-우점적이지만 제공된 기준점의 세트에 가까운 모집단 구성원을 강조하는 NSGA-II 프레임워크를 따르는 기준-점-기반 다중-목표 진화 알고리즘이다. NSGA-III는 NSGA-II와 같은 다른 유전적 알고리즘에 비해 3-목표에서 15-목표 최적화 문제를 해결하는 데 있어 그 효능을 입증한다. 기존의 유전적 알고리즘과 달리, NSGA-III에서 모집단 구성원 간의 다양성의 유지는 다수의 잘-확산된 미리정의된 기준점을 제공하고 적응적으로 업데이트함에 의해 지원되고 따라서 NSGA-III는 그 선택 작동자에 상당한 변화가 있다.

NSGA-III 알고리즘은 2014년 8월에 공표된 Kalyanmoy Deb 등의 "An Evolutionary Many-Objective Optimization Algorithm Using Reference-Point-Based Nondominated Sorting Approach, Part I: Solving Problems With Box Constraints" 표제의 출판물에 기술되어 있으며, 이는 그 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 관련된 NSGA-II 알고리즘은 2002년 8월에 공표된 Kalyanmoy Deb 등의 "A FAST AND ELITIST MULTIOBJECTIVE GENETIC ALGORITHM: NSGA-II" 표제의 출판물에 기술되어 있으며, 이는 그 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

NSGA-III의 구현 동안, 코돈 목록/배열/벡터가 아닌, 이진수 문자열이 핵산 서열을 나타내는 데이터 구조로 선택되고, 모집단 초기화, 교차/재조합, 돌연변이를 포함한 일반 유전적 알고리즘의 모든 일반 조작 대상은, 이진수 문자열이 데이터 구조로서 코돈 목록/배열/벡터에 비해 더 작은 컴퓨터 메모리를 필요로 하고 더 빠른 조작 속도를 가능하게 하기 때문에, 이진수 문자열이다. 일부 실시형태에서, 3 비트의 모든 조합의 수가 특정 아미노산의 동의어 코돈의 가능한 모든 후보와 일치하기에 충분하기 때문에 3 연속 비트가 하나의 위치에서 코돈을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, 3 비트는 8 종류의 조합, 예를 들어, 000, 001, 010, 011, 100, 101, 110, 111을 가지며, 그의 계수는 임의의 아미노산, 심지어 각각 6개 동의어 코돈을 갖는 아미노산 L, R 및 S의 동의어 코돈 수보다 더 크다.

따라서, 3 비트 문자열 중 각 하나는 주어진 아미노산의 동의어 코돈을 나타낸다. 적합성 계산 (예를 들어, 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 계산) 동안, 모집단의 개별 후보를 나타내는 이진수 문자열이 코딩 서열화 (즉, DNA)로 다시 변환된다. 한편, 상기에서 논의한 바와 같이 유전적 알고리즘의 조작 (교차, 돌연변이, 선택을 포함함)의 대상은 모두 이진수 문자열이고 따라서 변환은 일시적이다. 따라서 적합성 계산은 서열을 기반으로 하는 반면 다른 모든 조작은 효율성과 속도를 위해 이진수 문자열을 기반으로 한다.

NSGA-III의 시작 전에, 모집단의 크기, 분할의 수, 시뮬레이션된 이진수 교차에 대한 분포 지수, 시뮬레이션된 이진수 교차에 대한 교차 비율, 비트 플립 돌연변이에 대한 돌연변이 비율, 비트 플립 돌연변이에 대한 분포 지수를 포함하여 복수의 매개변수가 설정되어질 필요가 있다. NSGA-III의 저자는 외부 및 내부 분할 수가 지정된 다수-목표 문제에 대한 분할에 대해 2-층 접근방식을 제안한다. 2-층 접근방식을 사용하기 위해, 본 발명자들은 분할의 수를 외부 분할의 수와 내부 분할의 수로 대체할 수 있었다. 모든 개체의 초기화 프로세스는 무작위이고 교차 및 돌연변이 조작은 도 2b에 도시된 고전적인 유전적 알고리즘과 큰 차이가 없다.

도 2b는 교차, 돌연변이 및 모집단 진화의 선택과 같은 생물-영감된 조작자를 포함하는 유전적 알고리즘의 예시적인 일반 작업흐름을 묘사한다. 본 발명의 구현 동안, 이진수 문자열은 서열을 나타내고 따라서 상기의 모든 조작자의 대상은 이진수 문자열이다.

선택 전에 전체 모집단의 각 개체에 대해 적합성 함수 (즉, 이전에 도시된 3개의 지수 함수)가 평가되어야 할 때, 이진수 문자열은 일시적으로 코돈 문자열로 다시 전이된다. 다수의 진화 생성과 진화 종료 후, 최종적으로 생성된 코돈 문자열은 재조합 발현을 위해 사용되는 최적의 유전자로 사슬로 연결되고 출력될 것이다.

일부 실시형태에서, 종료 조건은 고정된 횟수의 반복에 도달하고 최상의 적합성에 도달하고 더 나은 결과가 생성되지 않음, 최적에 근접한 솔루션의 최소 기준이 일부 솔루션에 의해 만족됨, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

NSGA-III 알고리즘의 교시에 따르면, 이들 최적의 유전자는 3차원 공간의 파레토 표면에 위치한 솔루션이어야 하고 동일하게 처리되어야 한다. 실질적인 목적을 위해, 유전자 합성 및 발현 테스트에 사용되는 제한된 원천에 기인하여, 본 발명자들은 이를 처음에 조화 지수의 내림 차순, 그 다음 코돈 문맥 지수의 내림 차순 및 마지막으로 이상치 지수의 오름 차순에 의해 서열화한다. 최상 1개는 합성을 위해 선택될 수 있고 할당량이 주어진 이종성 발현은 단지 하나의 서열이다. 엄격한 비용 제어가 없다고 가정하면, 파레토 표면에서 충분한 간격을 가지는 여러 가지, 예를 들어 조화 지수가 가장 높은 일 후보, 코돈 문맥 지수가 가장 높은 일 후보, 이상치 지수가 가장 낮은 일 후보를 시험하도록 권고된다. 본 발명에서, 예비 최적 유전자는 정지 코돈이 없고, 따라서 2 연속 정지 코돈이 코딩 서열의 3' 말단에 부착될 수 있다.

분자 클로닝을 위한 특정 하위서열 제거

도 2a를 참조하면, 블록 (214)에서, 최적화 절차는 모티프 회피 및 제한 부위 제거의 단계를 포함한다. 분자 클로닝의 편의성을 끌어올리는 목적으로, 유전자 합성 및 단백질 발현 전에 하나 이상의 최적화된 서열로부터 일부 불리한 모티프 및 제한 부위 (예를 들어, 고객이 싫어하는 부분)를 제거한다. 이 과정은 다음을 함유한다:

단계 1: 회피되어야 하는 모든 하위서열 자리 찾기.

단계 2: 하위서열 내에서 치환에 사용될 수 있는 모든 동의어 코돈을 열거한다.

단계 3: 고도로 발현된 유전자 내에서 더 빈번하게 사용된 동의어 코돈은 본 발명자들이 동시에 새로운 하위서열이 나타나지 않도록 해야 하는 조건에서 선택에 대해 더 높은 우선순위를 갖는다.

단계 4: 단계 2 - 3을 사용하여 발견된 모든 하위서열을 반복적으로 처리한다.

일부 실시형태에서, 블록 (206 및 208)에 표시된 바와 같이, 불리한 모티프 및 특징은 텍스트 마이닝 및 문헌 검토에 의해 다양한 숙주에 대해 별도로 확인된다.

예시적인 실현

본 명세서에 기재된 예시적인 실현은 CHO 3E7 세포주에서 두 유전자 (JNK3A1 및 GFP)의 최적화 및 발현을 통한 코돈 최적화에 대한 본 발명의 효율성을 예시하며, 그 기본 정보는 아래에 요약되어있다. 발현 수준을 평가하기 위해 Flag tag의 항체를 적용하여 웨스턴 블랏을 수행하였으므로 두 단백질의 C 말단에 Flag tag를 붙이고, 장입 대조군으로 베타-액틴(beta-actin)을 사용하였다. 각 발현 실험은 두 번 반복되었다.

FreeStyle CHO 발현 배지 및 CD CHO 배지 (Thermofish)를 포함한 여러 배지에서 배양된 CHO 3E7의 mRNA-seq는 Illumina에 의해 권장된 고전적 mRNA-seq 제안에 따라 실행되었다. 당사의 성공적으로 최적화된 부분적 차순과 통합한, 총 500개 서열이 CHO 3E7 세포주의 고도로 발현된 유전자로 정의되었다. 문헌 검토 후, 다음 하위서열은 불리한 모티프로 그룹화되었으며, 이들의 출현은 페널티를 초래했다 (즉, 이상치 지수의 증가). 적절한 국소 (60 bp 슬라이딩-윈도우) 및 글로벌 GC-함량은 약 35-65%이고, mRNA 2차 구조의 허용가능한 최소 MFE △G는 -18 Kcal/mol이며, 이들 매개변수의 이상치는 페널티를 야기했다.

1) 스플라이스 부위: GGTAAG, GGTGAT

2) AT-풍부 요소: ATTTTA, ATTTTTA, ATTTTTTA

3) 리보솜 결합 부위: ACCACCATGG (서열 번호: 4), GCCACCATGG (서열 번호: 5)

4) 항바이러스 모티프: TGTGT, AACGTT, CGTTCG, AGCGCT, GACGTC, GACGTT

5) CpG 섬: CGCGCGCG

6) 중합효소 슬리피지 부위: GGGGGG, CCCCCC

7) 아밀로이드 전구체 단백질 3 프라임 안정성 요소: TCTCTTTACATTTTGGTCTCTATACTACA (서열 번호: 6)

8) K-박스: CTGTGATA

9) Brd-박스: AGCTTTA

NSGA-III를 통한 코돈 최적화 동안, 모집단 크기는 100으로 설정되었고 개체는 이진수 인코딩되고 무작위로 생성되었으며, 그 길이는 단백질의 아미노산 수의 3배와 같았고, 진화 생성의 수는 200,000과 같았고, 분할의 수는 적합성 함수의 수에 따라 달라졌고, 시뮬레이션된 이진수 교차에 대한 분포 지수는 15.0이었고, 시뮬레이션된 이진수 교차에 대한 단일-점 교차 비율은 0.9였고, 비트 플립 돌연변이에 대한 돌연변이 비율은 1.0/L였고, 비트 플립 돌연변이에 대한 분포 지수는 20.0이었다.

이상치 지수를 최소화하면서 조화 지수 및 코돈 문맥 지수를 최대화한 후, 각 단백질은 여러 출력 최적 코딩 유전자를 가지며, 그 중에서 최대 조화 지수를 갖는 단지 하나의 유전자가 다음 발현 테스트를 위해 선택되었다. EcoRI 및 HindIII 효소가 벡터 구축 및 클로닝에 사용되었으므로, GAATTC 및 AAGCTT는 코돈 치환에 의해 회피되었다.

본 명세서에서 ASCII 텍스트 파일로 제출된 서열 목록은 두 단백질 GFP_플래그(Flag) (서열 번호: 7) 및 JNK3_플래그 (서열 번호: 8)의 최적화된 서열을 포함한다.

동일한 유전자의 야생형에 비해 최적화된 유전자의 성능을 평가하기 위해 사용된 실험의 상세한 단계는 아래에 설명되어 있다.

단계 1: 일시적 형질감염 및 세포 배양

1. 합성된 유전자는 EcoRI 및 HindIII 효소를 사용하여 pTT5 벡터로 클로닝되었다. CHO 3E7 세포는 FreeStyle CHO 발현 배지에서 배양되었고 벡터의 일시적 형질 감염은 적절한 세포-벡터 비율 (즉, 벡터 농도 1 ug/ml에 대해 mL당 세포 밀도 1-1.2×10⁶)을 갖는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수행되었다.

2. 일시적 형질감염 후, CHO 3E7 세포는 37℃에서 5% CO₂로 48시간 지속하여 현탁 배양해야 했다.

2 단계 : 세포 파괴

1. 업스트림으로부터 배양된 세포를 취하고, 4℃에서 2분 동안 원심분리 (10,000 x g)한다. 상등액을 버린다.

2. 1 mL 1*PBS를 부가하여 Eppendorf 튜브의 바닥에 세포를 재현탁한다. 그런 다음 4℃에서 2분 동안 원심분리 (10,000 x g)하고 상등액을 버린다.

3. 200 μL 용해 완충액 (저장성 완충액 [10mM Tris, 1.5mM MgCl₂, 10mM KCl, pH 7.9] + 0.5% DDM, PMSF [최종 농도 1mM], 뉴클레아제, 칵테일)을 1*10⁶세포당 Eppendorf 튜브에 부가한다. 피펫으로 세포를 재현탁한다.

4. 세포 파괴를 위해 컵형 초음파 세포 파괴기에 세포를 넣는다 (4℃, 3초 초음파, 1초 간격, 총 10분).

5. 파괴 후, 4℃에서 20분 동안 원심분리 (12,000 x g)한다. 상등액을 회수한다.

단계 3: 샘플 처리

1. BCA 방법을 사용하여 상등액의 농도를 측정한다.

2. 상등액의 일부는 장입 완충액으로 처리되었다.

단계 4: 전기영동 및 웨스턴 블랏

1. SOP에 따라 SDS-PAGE를 위해 처리된 샘플을 장입한다. (샘플당 8μg)

2. 전기영동 후, 웨스턴 블랏 실험은 SOP에 따라 수행되었다.

1) 이송: SDS-PAGE 후 겔을 제거하고 겔에서 PVDF 멤브레인으로 단백질을 이송한다 (이송 완충액: 150mL의 무수 에탄올에 200mL 5x 이송 용액을 부가하고 1L로 희석하고, 1시간 동안 이송한다).

2) 차단: 이송 후, PVDF는 10분 동안 빠른 차단 용액으로 차단되었다.

3) 인큐베이션: 차단 후, 5% 밀크 및 상응하는 표지된 항체로 45분 동안 인큐베이션한다.(플래그 태그: 1시간 동안 1:1000 희석에서 THETM 베타 액틴 항체, mAb, 마우스 GenScript, 카탈로그 번호 A00702의 부가로, 1:5000의 희석에서 마우스-항-플래그 mAb GenScript, 카탈로그 번호 A00187, 그 다음 1:2500 희석된 표지된 2차 항체 염소 항-마우스 IgG-HRP GenScript, 카탈로그 번호 A00160 부가)

4) 노출: 노출 이미징은 항체 배양 후 ChemiDoc™ Touch Imaging Systems를 사용하여 수행되었고 이미지는 편집을 위해 지정된 위치에 저장된다.

5) Image Lab이 단백질 정량적 분석을 위해 사용되었다.

도 3은 본 개시내용의 실시형태에 따른 CHO 3E7 세포주에서 최적화된 서열과 야생형의 2개 유전자 (즉, GFP 및 JNK3A1) 사이의 발현의 비교를 예시하는 웨스턴 블랏 결과이며, 여기서 단지 각 유전자의 가장 높은 조화 지수를 갖는 최적화된 용액 만이 발현 비교를 위해 시험되었다. 본 발명이 코돈 최적화에 효과적이고 거의 변하지 않은 내부 대조군 베타-액틴에 비해 발현을 끌어올린다는 것이 명백히 입증되었다. 좌측 레인은 항상 래더 마커였고, 단일 플라스미드의 모든 발현은 두 번 반복되었다. 대략적인 정량적 분석에 따르면, GFP의 발현은 대략적으로 6.2배 개선된 것으로 추정되었고, JNK3의 발현은 본 발명의 코돈 최적화 후에 대략적으로 약 2.4배 촉진되었다.

예시적인 전자 장치

도 4는 일 실시형태에 따른 컴퓨팅 장치의 예를 예시한다. 장치 (400)는 네트워크에 연결된 호스트 컴퓨터일 수 있다. 장치 (400)는 클라이언트 컴퓨터 또는 서버일 수 있다. 도 4에 도시된 바와 같이, 장치 (400)는 개인용 컴퓨터, 워크스테이션, 서버 또는 전화나 태블릿과 같은 핸드헬드 컴퓨팅 장치 (휴대용 전자 장치)와 같은 임의의 적절한 유형의 마이크로프로세서-기반 장치일 수 있다. 상기 장치는, 예를 들어, 프로세서 (410), 입력 장치 (420), 출력 장치 (430), 저장 장치 (440) 및 통신 장치 (460) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 입력 장치 (420) 및 출력 장치 (430)는 일반적으로 상기에서 기술된 것들에 대응할 수 있고, 컴퓨터와 연결가능하거나 또는 통합될 수 있다.

입력 장치 (420)는 터치 스크린, 키보드 또는 키패드, 마우스 또는 음성-인식 장치와 같은 입력을 제공하는 임의의 적절한 장치일 수 있다. 출력 장치 (430)는 터치 스크린, 햅틱 장치 또는 스피커와 같은 출력을 제공하는 임의의 적절한 장치일 수 있다.

저장 장치 (440)는 RAM, 캐시, 하드 드라이브 또는 이동식 저장 디스크를 포함하는 전기, 자기 또는 광학 메모리와 같은 저장을 제공하는 임의의 적절한 장치일 수 있다. 통신 장치 (460)는 네트워크 인터페이스 칩 또는 장치와 같은 네트워크를 통해 신호를 송수신할 수 있는 임의의 적절한 장치를 포함할 수 있다. 컴퓨터의 구성요소는 임의의 적절한 방식으로 예컨대 물리적 버스를 통하거나 또는 무선으로 연결될 수 있다.

저장 장치 (440)에 저장될 수 있고 프로세서 (410)에 의해 실행될 수 있는 소프트웨어 (450)는, 예를 들어, 본 개시의 기능을 구현하는 프로그래밍 (예를 들어, 상술한 바와 같은 장치에서 구현됨)을 포함할 수 있다.

소프트웨어 (450)는 또한 명령어 실행 시스템, 장비 또는 장치로부터의 소프트웨어와 연계된 명령어를 인출하고, 본 명령어를 실행할 수 있는, 상기 기술된 것과 같은 명령어 실행 시스템, 장비 또는 장치에 의해 또는 이와 관련하여 사용하기 위해 임의의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체 내에 저장 및/또는 전송될 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서, 컴퓨터-판독가능 저장 매체는 명령어 실행 시스템, 장비 또는 장치에 의해 또는 이와 관련하여 사용하기 위한 프로그래밍을 함유하거나 저장할 수 있는 저장 장치 (440)와 같은 임의의 매체일 수 있다.

소프트웨어 (450)는 또한 명령어 실행 시스템, 장비 또는 장치로부터의 소프트웨어와 연계된 명령어를 인출하고, 본 명령어를 실행할 수 있는, 상기 기술된 것과 같은 명령어 실행 시스템, 장비 또는 장치에 의해 또는 이와 관련하여 사용하기 위해 임의의 전송 매체 내에서 전파될 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서, 전송 매체는 명령어 실행 시스템, 장비 또는 장치에 의해 또는 이와 관련하여 사용하기 위한 프로그래밍을 통신, 전파 또는 전송할 수 있는 임의의 매체일 수 있다. 전송 판독가능 매체는 전자, 자기, 광학, 전자기 또는 적외선 유선 또는 무선 전파 매체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.

장치 (400)는 임의의 적합한 유형의 상호연결된 통신 시스템일 수 있는 네트워크에 연결될 수 있다. 네트워크는 임의의 적절한 통신 프로토콜을 구현할 수 있고 임의의 적절한 보안 프로토콜에 의해 보호될 수 있다. 네트워크는 무선 네트워크 연결, T1 또는 T3 라인, 케이블 네트워크, DSL 또는 전화선과 같은 네트워크 신호의 전송 및 수신을 구현할 수 있는 임의의 적절한 배열의 네트워크 링크를 포함할 수 있다.

장치 (400)는 네트워크 상에서 동작하기에 적합한 임의의 운영 시스템을 구현할 수 있다. 소프트웨어 (450)는 C, C++, Java 또는 Python과 같은 적절한 프로그래밍 언어로 작성될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 본 개시내용의 기능을 구현하는 애플리케이션 소프트웨어는 예를 들어 클라이언트/서버 배열에서 또는 웹-기반 애플리케이션 또는 웹 서비스로서 웹 브라우저를 통해 다른 구성으로 배치될 수 있다.

본 개시내용 및 예가 첨부하는 도면을 참조하여 완전하게 기술되었지만, 다양한 변경 및 변형이 당업자에게 명백할 것이라는 것에 유의해야 한다. 이러한 변경 및 변형은 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 개시내용 및 예의 범주 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

설명의 목적을 위해, 전술한 상세한 설명은 특정 실시형태를 참조하여 기술되었다. 그러나, 상기 예시적인 논의는 완전한 것이거나 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하려는 것으로 의도되지 않는다. 상기 교시의 관점에서 많은 변형 및 변경이 가능하다. 실시형태는 기술의 원리 및 실제 적용을 가장 잘 설명하기 위해 선택되고 기술되었다. 당업자는 이로써 고려되는 특정 사용에 적합한 다양한 변형과 함께 기술 및 다양한 실시형태를 가장 잘 활용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Nanjingjinsirui Science &Technology Biology Corp. <120> CODON OPTIMIZATION <130> 75989-20004.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 auuua 5 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 tgyygatgyy yyy 13 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 aggagg 6 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 accaccatgg 10 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 gccaccatgg 10 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 tctctttaca ttttggtctc tatactaca 29 <210> 7 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 atgtctaagg gagaagagct gtttaccggc gtggtcccta tcctggtgga gctggacggc 60 gatgtgaacg gccagaaatt cagcgtgtcc ggcgagggcg aaggcgacgc cacctacggc 120 aagctgacac tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ctgtcccttg gccaacactg 180 gtgaccacct tcagctacgg agtgcaatgc ttctccagat accctgacca catgaagcag 240 cacgatttct ttaaatctgc catgcccgag ggctacgtgc aggaacggac catcttctac 300 aaggacgacg gaaattacaa gaccagagcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360 aaccggatcg agctgaaggg catcgacttc aaagaggatg gcaacatcct gggccacaag 420 atggaataca actacaactc ccacaacgtg tacatcatgg ccgacaagcc taagaacggc 480 atcaaggtga acttcaagat cagacacaac atcaaggacg gctctgtgca gctggccgac 540 cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccctgtgc tgctgcctga taaccactat 600 ctgtctacac agtccgctct gtccaaagat cctaacgaga agcgggacca catgatcctg 660 ctggagttcg tgaccgccgc tggcatcacc catggcatgg acgagctgta caaggactac 720 aaggacgatg acgacaag 738 <210> 8 <211> 1290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 atgtccctgc actttctgta ctactgctct gagcctaccc tggacgtgaa gatcgccttc 60 tgtcagggct tcgataagca ggtggacgtc tcctatatcg ctaagcacta caacatgagc 120 aaatccaagg tggacaacca gttctactct gtcgaggtgg gcgactctac cttcaccgtg 180 ctgaagagat accagaacct gaaacccatc ggctccggcg ctcagggcat cgtgtgcgcc 240 gcttacgacg ccgtgctgga tagaaacgtg gccatcaaga agctgagccg gcctttccag 300 aaccagacac acgctaagcg ggcctacaga gagctggtcc tgatgaagtg cgtgaaccac 360 aagaacatca tctccctgct gaatgtgttc acccctcaga aaaccctgga agagttccag 420 gatgtgtacc tggtgatgga actgatggac gccaacctgt gccaggtgat ccagatggaa 480 ctggaccacg agcggatgtc ctacctgctg taccagatgc tgtgtggcat caagcacttg 540 catagcgctg gcatcatcca cagagatctg aaaccttcta acatcgtggt gaagtccgac 600 tgcaccctga agatcctgga cttcggcctg gccagaaccg ctggcacctc tttcatgatg 660 acaccctacg tggtgaccag atactaccgg gcccctgaag tgatcctggg catgggctac 720 aaggagaacg tggacatctg gtccgtggga tgcatcatgg gcgagatggt cagacacaag 780 atcctgttcc ccggaagaga ttacatcgac cagtggaaca aggtgatcga gcagctgggc 840 accccttgtc ctgagttcat gaagaaactg cagcctaccg tgcggaacta cgtggaaaac 900 cggcctaagt acgccggcct gacctttcca aagctgttcc ctgactctct gttccccgct 960 gacagcgagc acaacaagct gaaagcctct caggccagag atctgctgtc caagatgctg 1020 gtgatcgacc ctgctaagag aatctccgtg gacgatgccc tgcagcaccc ctacatcaac 1080 gtgtggtacg accctgctga ggtggaagcc cctccacctc agatctacga caagcagctg 1140 gacgaaagag agcacaccat cgaggagtgg aaggagctga tctataaaga agtgatgaac 1200 tccgaggaaa agaccaagaa cggcgtggtc aagggccagc cttccccctc tgctcaggtg 1260 cagcaagact acaaggacga tgatgacaag 1290

Claims

숙주에서 단백질 발현을 위한 핵산 서열을 최적화하기 위한 컴퓨터-구현 방법으로서, 상기 방법은:
a) 초기 모집단 세트를 수신하는 단계로서, 여기서 상기 초기 모집단 세트는 단백질을 발현할 수 있는 복수의 초기 후보 핵산 서열을 포함하는, 상기 단계; 및
b) 상기 초기 모집단 세트에 기초하여 컴퓨터-지원된 NSGA-III 알고리즘 또는 이들의 변형을 사용하여 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수(outlier index)의 최적화를 수행하고, 이에 의해 단백질을 발현할 수 있는 복수의 최적화된 핵산 서열을 수득하는 단계로,
여기서 상기 후보 핵산 서열의 조화 지수는 복수의 고도로 발현된 유전자와 후보 핵산 서열 사이의 동의어 코돈의 사용 빈도 분포의 일관성을 나타내고,
여기서 상기 후보 핵산 서열의 코돈 문맥 지수는 동의어 코돈을 적절한 위치에 배치하기 위한 척도이고, 그리고
여기서 상기 후보 핵산 서열의 이상치 지수는 후보 핵산 서열에 대한 복수의 미리결정된 서열 특징의 부정적 효과의 척도인, 상기 단계를 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 복수의 최적화된 핵산 서열 중 적어도 하나의 최적화된 핵산 서열을 나타내는 출력을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 초기 모집단 세트를 수신하는 단계는 하기를 포함하는 방법:
단백질 서열을 수신하는 단계;
수신된 단백질 서열에 기초하여 초기 모집단 세트를 생성하는 단계.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 초기 모집단 세트를 수신하는 단계는 하기를 포함하는 방법:
핵산 서열을 수신하는 단계;
수신된 핵산 서열을 단백질 서열로 번역하는 단계;
상기 단백질 서열에 기초하여 초기 모집단 세트를 생성하는 단계.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 모집단 세트는 미리결정된 크기의 것인, 방법.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 모집단 세트는 복수의 초기 후보 핵산 서열의 이진수 표현을 포함하는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하는 단계는 하기를 포함하는 방법:
상기 조화 지수를 최대화하는 단계;
상기 코돈 문맥 지수 최대화하는 단계; 및
상기 이상치 지수 최소화하는 단계.
청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하는 단계는 하기를 포함하는 방법:
초기 모집단 세트의 각각의 초기 후보 핵산 서열에 대해, 각각의 초기 후보 핵산 서열에 대한 각각의 조화 지수 값, 각각의 코돈 문맥 지수 값, 및 각각의 이상치 지수 값을 계산하는 단계;
상기 계산에 기초하여, 복수의 초기 후보 핵산 서열에 상응하는 복수의 적합성 값을 할당하는 단계;
상기 복수의 적합성 값에 기초하여, 복수의 초기 후보 핵산 서열을 분류(sorting)하는 단계; 및
분류된 복수의 초기 후보 핵산 서열의 서브세트를 후속하는 모집단 세트에 포함시키는 단계.
청구항 8에 있어서, 하기 단계를 더 포함하는 방법:
초기 모집단에 기초하여 자손 모집단(offspring population)을 생성하는 단계; 및
상기 자손 모집단을 후속하는 모집단 세트에 포함시키는 단계.
청구항 9에 있어서, 상기 자손 모집단은 이진수 토너먼트 선택, 교차/재조합, 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 통해 생성되는, 방법.
청구항 8 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 모집단 세트와 상기 후속하는 모집단 세트가 동일한 크기의 것인, 방법.
청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서,
조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하는 단계는 복수의 반복을 포함하고,
상기 복수의 반복의 i-번째 반복은:
(i-1)번째 반복에 상응하는 핵산 서열의 모집단 세트를 수신하는 단계;
(i-1)번째 반복에 상응하는 모집단 세트의 각 핵산 서열을 비-우점 수준(non-domination level)과 연관시키는 단계;
연관된 비-우점 수준에 기초하여 (i-1)번째 반복에 상응하는 모집단 세트에서 핵산 서열을 분류하는 단계;
i-번째 반복에 상응하는 모집단 집합을 생성하는 단계로, 여기서 i-번째 반복에 상응하는 모집단 집합은 (i-1)번째 반복에 상응하는 분류된 핵산 서열의 서브세트 및 (i-1)번째 반복에 상응하는 분류된 핵산 서열에 기초하여 생성된 자손 모집단을 포함하는, 단계; 및
하나 이상의 종료 조건에 기초하여, i-번째 반복에 상응하는 모집단 세트를 사용하여 (i+1)번째 반복으로 진행할지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 12에 있어서, 각 핵산 서열을 비-우점 수준과 연관시키는 단계는 (i-1)번째 반복에 상응하는 모집단 세트의 각 핵산 서열에 대해, 각각의 조화 지수 값, 각각의 코돈 문맥 지수 값 및 각각의 이상치 지수 값을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 10 또는 청구항 11에 있어서, i-번째 반복에 상응하는 모집단 세트를 생성하는 단계는 하기를 포함하는 방법:
(i-1)번째 반복에 상응하는 분류된 핵산 서열 중 적어도 하나의 핵산 서열을 복수의 미리결정된 기준점 중 하나와 연관시키는 단계.
청구항 10 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 종료 조건은 고정된 횟수의 반복에 도달하고 최상의 적합성에 도달하고 더 나은 결과가 생성되지 않음, 최적에 근접한 솔루션의 최소 기준이 일부 솔루션에 의해 만족됨, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 후보 핵산 서열의 조화 지수는 식: H = 1-D(F _hs ,F _ts )에 기초하여 계산되며,
상기에서 D()는 거리 함수를 나타내고;
F_hs는 복수의 고도로 발현된 유전자 내의 복수의 아미노산의 동의어 코돈의 빈도를 포함하는 벡터를 포함하고; 그리고
F_ts는 상기 후보 핵산 서열의 코딩 유전자 내에 복수의 아미노산의 동의어 코돈의 빈도를 포함하는 벡터를 포함하는, 방법.
청구항 16에 있어서, D()는 두 벡터 사이의 거리를 측정하는 함수를 나타내는, 방법.
청구항 17에 있어서, D()는 두 벡터의 유클리드(Euclidean) 거리, 코사인 거리, 맨하탄 거리 또는 민코프스키 거리를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 거리 함수인, 방법.
청구항 18에 있어서, 복수의 고도로 발현된 유전자 또는 후보 핵산 서열의 동의어 코돈의 빈도는 다음과 같이 정의되는, 방법:
청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, 후보 핵산 서열의 코돈 문맥 지수는 식: CC = 1 - D(F _hcc ,F _tcc )에 기초하여 계산되며,
상기 식에서 D()는 거리 함수를 나타내고;
F_hcc는 복수의 고도로 발현된 유전자 내의 2개의 연속 아미노산의 동의어 코돈 쌍의 빈도를 포함하는 벡터를 포함하고; 그리고
F_tcc는 후보 핵산 서열의 코딩 유전자 내에 2개의 연속 아미노산의 동의어 코돈 쌍의 빈도를 포함하는 벡터를 포함하는, 방법.
청구항 20에 있어서, D()는 두 벡터 사이의 거리를 측정하는 함수를 나타내는, 방법.
청구항 21에 있어서, D()는 두 벡터의 유클리드 거리, 코사인 거리, 맨하탄 거리 또는 민코프스키 거리를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 거리 함수인, 방법.
청구항 20 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 고도로 발현된 유전자 또는 후보 핵산 서열의 동의어 코돈 쌍의 빈도는 다음과 같이 정의되는, 방법:
청구항 1 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이상치 지수는 식
에 기초하여 계산되며,
상기에서 N은 복수의 미리결정된 서열 특징의 수이고;
fi(x)는 복수의 미리결정된 서열 특징 중 i번째 서열 특징의 페널티 스코어링 함수를 나타내고; 그리고
wi는 fi(x)와 연관된 상대적 가중치를 나타내는, 방법.
청구항 24에 있어서, 복수의 미리결정된 특징은 하기를 포함하는 방법:
GC-함량 값,
CIS 요소,
반복 요소,
RNA 스플라이싱 부위,
리보솜 결합 서열,
mRNA의 최소 자유 에너지, 또는
이들의 임의의 조합.
청구항 24에 있어서, 상기 복수의 미리결정된 특징은 선택된 발현 시스템에 기초하여 확인되는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NSGA-III 알고리즘의 변형은 EliteNSGA-III 알고리즘 또는 NSGA-II 기반 면역 알고리즘을 포함하는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서, 조화 지수, 코돈 문맥 지수 및 이상치 지수의 최적화를 수행하는 단계는 하기를 포함하는 방법:
조화 지수의 내림 차순, 그 다음 코돈 문맥 지수의 내림 차순, 그리고 그 다음 이상치 지수의 오름 차순에 의해 복수의 최적화된 핵산 서열을 순위 매김(ranking)하는 단계;
합성을 위한 하나 이상의 최상위의 최적화된 핵산 서열을 선택하는 단계.
청구항 1 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
c) 복수의 최적화된 핵산 서열의 최적화된 핵산 서열로부터 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프를 제거하는 단계.
청구항 29에 있어서, 상기 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프는 복수의 텍스트 부분의 분석에 기초하여 확인되는, 방법.
청구항 29 항에 있어서, 상기 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프를 제거하는 단계는 하기를 포함하는 방법:
최적화된 핵산 서열에서 상기 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프를 확인하는 단계;
확인된 미리결정된 불리한 하위서열 또는 모티프에 기초하여 복수의 동의어 코돈을 확인하는 단계;
최적화된 핵산 서열에서 상기 확인된 미리결정된 불리한 하위서열로 치환하기 위해 복수의 동의어 코돈으로부터 동의어 코돈을 선택하는 단계.
청구항 1 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조화 지수, 상기 코돈 문맥 지수 및 상기 이상치 지수 중 적어도 하나는 하나 이상의 데이터베이스로부터의 복수의 고도로-발현된 유전자의 하나 이상의 특성에 기초하여 계산되는, 방법.
청구항 32에 있어서, 상기 하나 이상의 특성은 코돈 빈도, 동의어 코돈 빈도, 코돈 쌍 빈도 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 매개변수를 설정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 매개변수는 모집단 세트의 크기, 분할의 수, 시뮬레이션된 이진수 교차에 대한 분포 지수, 시뮬레이션된 이진수 교차에 대한 교차 비율, 비트 플립 돌연변이에 대한 돌연변이 비율, 비트 플립 돌연변이에 대한 분포 지수, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
하나 이상의 프로그램을 저장하는 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체로서, 상기 하나 이상의 프로그램은 전자 장치의 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때 상기 전자 장치가 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 야기하는 명령을 포함하는, 저장 매체.
숙주에서 단백질 발현을 위한 핵산 서열을 최적화하는 시스템으로서, 상기 시스템은
하나 이상의 프로세서;
메모리; 및
하나 이상의 프로그램을 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 프로그램은 상기 메모리에 저장되고 상기 하나 이상의 프로세서에 의해 실행되도록 구성되며, 상기 하나 이상의 프로그램은 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 명령을 포함하는, 시스템.
숙주에서 단백질 발현을 위한 핵산 서열을 최적화하기 위한 전자 장치로서, 상기 장치는 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 수단을 포함하는, 방법.
숙주에서 단백질 발현을 위한 핵산 서열을 최적화하는 기록가능한 매체에 저장된 프로그램 제품으로서, 상기 프로그램 제품은 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 컴퓨터 소프트웨어를 포함하는 프로그램 제품.
청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항의 방법으로부터 수득된 최적화된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
청구항 39의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
청구항 39의 단리된 핵산 분자 또는 청구항 40의 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
숙주 세포에서 단백질을 발현하는 방법으로서, 상기 방법은 하기를 포함하는 방법:
(a) 청구항 1 내지 34 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 숙주 세포에서 단백질 발현을 위한 최적화된 핵산 서열을 수득하는 단계;
(b) 상기 최적화된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 합성하는 단계;
(c) 상기 핵산 분자를 상기 숙주 세포에 도입하여 재조합 숙주 세포를 수득하는 단계; 및
(d) 상기 최적화된 핵산 서열로부터 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계.