JP2020534794A - 免疫アルゴリズムに基づくコドン最適化方法 - Google Patents
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Abstract
免疫アルゴリズムに基づくコドン最適化方法は、免疫アルゴリズム及び遺伝的アルゴリズムを連続して使用し、それぞれ、局所的多目的最適化及び大域的多目的最適化をタンパク質コード配列で行い、次いで、配列の微調整及び最適化を行うために網羅的な方法を用いて最適な発現配列を最大の程度まで探索することを特徴とする。本発明は、遺伝的アルゴリズムの無作為大域的並行探索の特性を保持するだけでなく、比較的大幅に早熟収束を回避して、大域的最適解への迅速な収束を確保する。本発明は、免疫アルゴリズムと遺伝的アルゴリズムの精度及び効率における利点を組み合わせ、段階的なプロセス（配列においてそれぞれ、局所的最適化、大域的最適化、ならびに微調整及び最適化）を介してコドン最適化を行う最初のものであり、試験例を介してコドン最適化におけるこのアルゴリズムの高効率を証明する。【選択図】なし
Description
本発明は、タンパク質工学技術に関し、具体的には、タンパク質工学におけるコドン最適化方法に関し、特に、免疫アルゴリズムに基づくコドン最適化方法に関する。
コドン縮退とは、タンパク質翻訳の過程で、複数の異なるコドンによってアミノ酸がコードされ得る現象を指す。同じアミノ酸をコードする異なるコドンは同義コドンと呼ばれる。２００アミノ酸長からなるタンパク質は、一般に１０２０超の異なるＤＮＡ配列によってコードされ得る。異なる種では、同義コドンの発生頻度は異なり、かかる現象はコドン選択と呼ばれる。コドン最適化は、主に、宿主の発現系のコドン選択等の因子に基づく。タンパク質のアミノ酸配列を変更しないことを前提として、コンピューターアルゴリズムは、宿主の発現系で最も効率的にタンパク質を発現することができるＤＮＡ配列を、多数のＤＮＡコード配列から選別するために使用される。
現在のところ、コドン最適化のプロセスでしばしばタンパク質発現に影響を与えると考えられる主な因子としては、宿主細胞のコドン選択（一般に使用されるその特性化のパラメータとしては、コドン適応指数［ＣＡＩ］、宿主細胞の二重コドン選択［コドン文脈］、ＣＢＩ［コドンバイアス指数］、ＥＮＣ［コドンの有効数］、ＦＯＰ［最適コドンの頻度］、ＣＰＰ［コドン選択パラメータ］、及びｔＡＩ［ｔＲＮＡ適応指数］が挙げられる）、隠れた終止コドンの数、ＧＣ含量、レアコドン含量、ｍＲＮＡ抑制性調節性モチーフの数、ｍＲＮＡ二次構造（主にヘアピン構造及び最小自由エネルギーを含む）、機械学習におけるキーコドン及び数学モデルの得点、マイクロＲＮＡ結合部位、Ｇ４含量、ならびにタンパク質二次構造のコドン選択が挙げられる（Ｊｏｓｈｕａ Ｂ．Ｐｌｏｔｋｉｎ＆Ｇｒｚｅｇｏｒｚ Ｋｕｄｌａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１１）。現在コドン最適化に利用可能なソフトウェア及びアルゴリズムとしては、ＤＮＡＷｏｒｋｓ、Ｊｃａｔ、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎｅｒ、ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ ２．０、ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ、Ｅｕｇｅｎｅ、ｍＲＮＡ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ、ＣＯＯＬ、Ｄ−Ｔａｉｌｏｒ、ＵｐＧｅｎｅ、ＧＡＳＣＯ、Ｃｏｄｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＱＰＳＯ、ＧｅＭＳ及びＡＴＧＭＥが挙げられる（Ｅｖｅｌｉｎａ Ａｎｇｏｖ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１１、Ｎａｔｈａｎ Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４）。
コドン最適化アルゴリズムに使用されている発見的アルゴリズム（例えば、パーティクル・スウォーム及び遺伝的アルゴリズム）と比較して、免疫アルゴリズムは、独自の利点を有する。免疫アルゴリズムは、生物学的免疫機構に基づく改良された遺伝的アルゴリズムである。これは、解決されるべき実際の問題の目的関数を、抗原に対応させ、問題の解決を抗体に対応させることができる。生物学的免疫の原理によれば、生物学的免疫系は、細胞分裂及び分化を介して、対応する抗体を自動的に生成し、生物を侵す抗原に抵抗することが分かる。かかるプロセスは、免疫応答と呼ばれる。免疫応答のプロセスでは、いくつかの抗体は記憶細胞として保存され、同じタイプの抗原が再度侵入した場合、これらの記憶細胞が活性化され、多数の抗体を迅速に産生し、これが最初の応答より早くかつ強い再応答をさせ、これが、免疫系の記憶機能に反映する。抗原と結合した後、抗体は、一連の反応を介して抗原を破壊する。同時に、異なる抗体もまた、抗体の多様性及び免疫バランスを維持するために互いに促進及び阻害する。かかるバランスは、濃度機構に従って達成される。すなわち、抗体濃度が高いほど、抗体はより多く阻害され、濃度が低いほど、抗体はより多く促進され、免疫系の自動調節機能を反映する。
本発明の目的は、既存のコドン最適化方法の長い周期及び不十分な発現精度の問題を解決すること、ならびに免疫アルゴリズムに基づくコドン最適化方法を考案することであり、これにより、限られた時間内にコドン最適化スペースの大規模な探索を効果的に完了することができる。すなわち、最も効果的な発現を有するＤＮＡ配列を、タンパク質コード配列のセットから選別することである。
本発明の技術的解決法は以下の通りである。
免疫アルゴリズムに基づくコドン最適化方法は、免疫アルゴリズム及び遺伝的アルゴリズムを連続して使用し、それぞれ、局所的多目的最適化及び大域的多目的最適化をタンパク質コード配列で行い、次いで、配列の微調整及び最適化を行うために網羅的な方法を用い、最適な発現配列を最大の程度まで探索することを含む。
特に、本発明の方法は、以下の３つのステップを含む：第一のステップの局所的最適化、すなわち、タンパク質配列を非重複配列断片Ａ１、Ａ２…Ａｎに切断し、次いで、免疫アルゴリズムを用いて各配列断片に対してコドン最適化を完了させ、ほぼ最適なＤＮＡ配列のセットＢ１、Ｂ２…Ｂｎを生成する。第二のステップの大域的最適化、すなわち、遺伝的アルゴリズムを使用してＢ１、Ｂ２…Ｂｎに基づくタンパク質の完全長のＤＮＡコード配列を初期化し、該タンパク質配列の最適なＤＮＡ配列Ｃ１を選別する。第三のステップの微調整及び最適化。これは、コードされたタンパク質のＮ末端領域に対応するＤＮＡ配列の５’末端における網羅的な最適化を行い、ＤＮＡ配列Ｃ２を生成すること、及び発現抑制性モチーフを除去して、最終的に最適な発現配列Ｄを生成することを含む。
タンパク質とは、２０個超のアミノ酸からなる化合物を指す。タンパク質としては、配置の観点から分泌タンパク質、膜タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質等が挙げられ、機能の観点からは、抗体タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質等が挙げられ、起源の観点からは、相同的発現タンパク質及び異種発現タンパク質が挙げられ、配列の観点からは、天然タンパク質及び人工的に改変されたタンパク質、完全タンパク質／抗体、短縮部分タンパク質／抗体、ならびに２つ以上のタンパク質ならびにタンパク質及びペプチド鎖から形成される融合タンパク質が挙げられる。本発明で定義される抗体としては、無傷の抗体、ならびにＦａｂ、ＳｃＦＶ、ＳｄＡｂ、キメラ抗体、二重特異性抗体、Ｆｃ融合タンパク質等が挙げられるがこれらに限定されない。
免疫遺伝的アルゴリズムは、多目的最適化方法を採用し、タンパク質断片において局所的最適化を行い、集団の初期化は、高度に発現したタンパク質をコードする配列の二重コドン表に基づき、各遺伝子は、同義コドンによって直接コードされ、最適化プロセスにおいて、抗体多様性が確保され、集団の変性の現象は、抗体の情報エントロピー、抗体集団の類似性、抗体濃度、ならびに免疫遺伝的アルゴリズム及び更新記憶細胞の重合適応度を計算することによって防止され、該アルゴリズムの大域的探索能力を高める。
遺伝的アルゴリズムは、多目的最適化方法を採用し、タンパク質の全配列において大域的最適化を行い、初期化集団は、局所的最適化に供された最適化断片に基づき、無作為に生成され、各遺伝子は、各タンパク質断片の最適化された配列のセットによって直接コードされる。
微調整及び最適化は、網羅的な方法を用いて最小自由エネルギーＭＦＥ、コドン文脈、及びＣＡＩをＤＮＡ配列の５’末端で計算及び分類し、その分類結果に従って、タンパク質配列のＮ末端に最適なコード配列を選択する。
このコドン最適化方法は、少なくとも以下の宿主発現系に適用可能である：１）哺乳類発現系、２）昆虫発現系、３）酵母発現系、４）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ発現系、５）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現系、６）植物発現系、及び７）無細胞発現系。
このコドン最適化方法は、少なくとも以下の発現ベクターに適用可能である：一過性発現ベクター及び安定発現ベクター、ウイルス発現ベクター及び非ウイルス発現ベクター、誘導及び非誘導発現ベクター。
本発明の有益な効果は、以下の通りである。
免疫アルゴリズムは、遺伝的アルゴリズムから改善されたアルゴリズムである。最適化における早熟局所的収束の防止における免疫アルゴリズムの利点を考慮して、本発明は、局所的最適化についてコドン最適化を行うために免疫アルゴリズムを導入した最初のものであり、その後の遺伝的アルゴリズムを介して大域的最適化を行い、最後に微調整及び最適化を行い、ひいては、異なるアルゴリズムの利点を兼ね備える最新の３段階ハイブリッド最適化アルゴリズムを発展させる。このアルゴリズムのコドン最適化における高効率は、以下の実施例でさらにもたらされる。
遺伝的アルゴリズムと比較して、本発明の免疫アルゴリズムは、以下の特性を有する：第一に、この免疫アルゴリズムは、遺伝的アルゴリズムの探索速度を上げ、探索能力全体を改善することができる免疫記憶機能を有する。第二に、それは、抗体の多様性を維持する機能を有し、これを利用して、遺伝的アルゴリズムの局所探索能力を改善することができる。最後に、それは、自動調節機能を有し、これを用いて、遺伝的アルゴリズムの大域的探索能力を改善することができ、局所解の状態になることを回避することができる。従って、この免疫遺伝的アルゴリズムは、遺伝的アルゴリズムの無作為大域的並行探索の特性を保持するだけでなく、比較的大幅に早熟収束を回避して、大域的最適解への迅速な収束を確保する。本発明は、免疫アルゴリズムと遺伝的アルゴリズムの精度及び効率における利点を組み合わせ、段階的なプロセス（配列においてそれぞれ、局所的最適化、大域的最適化、ならびに微調整及び最適化）を介してコドン最適化を行う最初のものであり、試験例を介してコドン最適化におけるこのアルゴリズムの高効率を証明する。
本発明は、高速及び高効率の利点を有する。
以下、添付の図面及び具体的な実施例を参照して本発明をさらに説明する。
それは図１〜７に示す通りである。
図１に示すように、免疫アルゴリズムに基づくコドン最適化方法は、免疫アルゴリズム及び遺伝的アルゴリズムを連続して使用し、それぞれ、局所的多目的最適化及び大域的多目的最適化をタンパク質コード配列（配列番号３及び配列番号４）で行い、次いで、配列の微調整及び最適化を行うために網羅的な方法を用い、最適な発現配列（配列番号５及び配列番号６）を最大の程度まで探索することを含む。
Ｉ．免疫アルゴリズム（すなわち、局所的最適化、流れについては図２参照）。
最適化変数Ｌの数は、このステップでは２であり、すなわち、２つの特徴、コドン文脈及びＣＡＩが各断片について最適化され（詳細な説明については下記参照）、これは多目的最適化に属する。ある免疫系がＮ個の抗体からなる（すなわち、集団の大きさがＮ）と仮定して、各抗体遺伝子は長さＭを有し（このタンパク質配列のアミノ酸数がＭであることと等しい）、各遺伝子は同義コドンで直接コードされる。
（１）異なる宿主発現系の基本データセット（すなわち、高度に発現したタンパク質のコード配列）に従って、コドン頻度表及び二重コドン頻度表は、配列の生成ならびにコドン文脈及びＣＡＩの計算のために計算される。
（２）最初の応答では、最初の抗体は二重コドン頻度に従って生成される。タンパク質配列ａ１ａ２…ａｍを例にとると、ａ１に対する同義コドンはｃ１１及びｃ１２であり、ａ２に対する同義コドンはｃ２１、ｃ２２及びｃ２３であると仮定される。最初のアミノ酸ａ１に対するコドンは、コドン頻度表におけるｃ１１及びｃ１２の頻度に応じて選択される。二重アミノ酸ａ１ａ２に対応する二重コドンは、ｃ１１ｃ２１、ｃ１１ｃ２２、ｃ１１ｃ２３、ｃ１２ｃ２１、ｃ１２ｃ２２及びｃ１２ｃ２３であり、ここでは、［ｃ１１ｃ２１、ｃ１１ｃ２２、ｃ１１ｃ２３］及び［ｃ１２ｃ２１、ｃ１２ｃ２２、ｃ１２ｃ２３］を含む２つのセットの二重同義コドンが存在する。ａ１に対して選択されたコドンがＣ１１であると仮定すると、アミノ酸ａ２に対するコドンは、ｃ１１ｃ２１、ｃ１１ｃ２２及びｃ１１ｃ２３の頻度に応じてｃ２１、ｃ２２及びｃ２３のうちの１つから選択される。ａ１に対して選択されたコドンがＣ１２であれば、アミノ酸ａ２に対するコドンは、ｃ１２ｃ２１、ｃ１２ｃ２２及びｃ１２ｃ２３の頻度に応じてｃ２１、ｃ２２及びｃ２３のうちの１つから選択される。簡潔には、最初のアミノ酸に対するコドンがコドン頻度表に従って直接選択されることを除いて、他のアミノ酸に対するコドンの選択は、その前のアミノ酸に対するコドンの選択に関連しており、それらの二重同義コドンの頻度によって決まる。
（３）最初ではない応答では、集団は、親の個物及び記憶細胞に保存されたＫ個の抗体からなる。記憶細胞の抗体は、最適化の履歴に載ったＫ個の最適抗体を記録しており、ここでは、適応度の低い抗体は、最適化のプロセスで適応度がより高い個物で徐々に置き換えられる。
（４）抗体の適応度Ｆ（Ｆ［コドン文脈］及びＦ［ＣＡＩ］を含む）が計算され、Ｎ個の子孫の個物が、多目的最適化に従って選択され、クロスオーバー及びバリエーション操作が新たな集団について完了される。ここでの変動は、コドンのランダム変異である。
（５）抗体集団の類似性Ｓの計算
本発明は、シャノンの平均情報エントロピーＨ（Ｎ）を用いて集団の類似性Ｓを測定する。
第一に、Ｐｉｊは、同義コドンｉがアミノ酸ｊに現れる確率であり、すなわち、
ここで、Ｎｉｊは、集団のすべての個物のｊ番目のアミノ酸位置で現れる同義コドンｉの総数である。次に、Ｈｊ（Ｎ）は、ｊ番目の遺伝子（すなわち、タンパク質配列のｊ番目のアミノ酸）の情報エントロピーであり、
と定義される。
集団全体の平均情報エントロピーは、
である。
集団の類似性Ｓは、
と定義される。
（６）最適化の進展に伴い、集団における抗体の類似性は連続的に改善される。抗体の均一性を回避し、抗体の多様性を改善するため、ひいては大域的探索能力を改善し、早熟収束を防ぐため、集団の類似性Ｓが閾値Ｓ０より大きい場合、免疫系細胞の代謝機能は、Ｐ個の新たな抗体を生成するようにシミュレートされ、その生成プロセスは上記（２）と同じであり、その結果、抗体の総数はＰ＋Ｎに達する。集団の類似性Ｓが閾値Ｓ０より小さい場合、その集団は次の進化の世代に継続して直接入り、記憶細胞が更新される。
（７）Ｓ＞Ｓ０の場合、抗体濃度及び重合適応度は、抗体集団Ｐ＋Ｎについて計算される。この抗体濃度は、集団における各々の抗体と同様、抗体のパーセンテージを指す。すなわち、
ここで、Ａｉは、抗体ｉに対する類似性が類似性定数λより大きい抗体数を指す。λは、２つの個物を比較した場合に、Ｍ個のコドンの中の同一のコドンの数を指す。
重合適応度Ｆ’は、抗体適応度Ｆが抗体濃度に従って補正された後に得られる値である。すなわち、
重合適応度に従って、子孫集団が選択され、記憶細胞が更新され、次回の最適化が行われる。我々は、２つの配列の特徴、コドン文脈及びＣＡＩを同時に考慮するため、Ｆ’［コドン文脈］は、Ｆ［コドン文脈］に基づいて計算され、Ｆ’［ＣＡＩ］は、Ｆ［ＣＡＩ］に基づいて計算される。終了代数に達した場合、進化が停止され、単一のタンパク質断片の最適化された配列のセットが出力される。
ＩＩ．遺伝的アルゴリズム（すなわち、大域的最適化、流れについては図３参照）。
免疫アルゴリズムを介した最適化によって生成されたすべてのタンパク質断片の最適化された配列のセットに基づいて、初期化された集団Ｎが無作為に生成される。遺伝的アルゴリズムの流れに従って、適応度の計算、子孫集団の選択、クロスオーバー、バリエーション、及び記憶の更新が完了される。終了代数に達した場合、進化が停止され、タンパク質の全配列に関する最適なＤＮＡコード配列が出力される。この流れ全体が多目的最適化に属する。この最適化プロセスでは、我々は、各タンパク質断片の最適化された配列のセットを直接用いて各遺伝子をコードする。
ＩＩＩ．微調整及び最適化
微調整及び最適化は、２つのステップからなる。すなわち、第一に、ＤＮＡの５’末端を最適化し、次に発現抑制性モチーフを除去する。ＤＮＡの５’末端の最適化プロセスは、図４に示される。網羅的な方法を用いて、タンパク質のＮ末端アミノ酸配列（８〜１５アミノ酸）のすべての可能なＤＮＡコード配列のリストを作り、それらのコドン文脈及びＣＡＩを計算する。その後、タンパク質配列の開始コドンの上流に配置されるベクター配列の５０ｂｐ（デフォルト値５０ｂｐ、選択可能な長さの範囲０〜５０ｂｐ）が連続してＤＮＡコード配列に接続され、接続された配列の最小自由エネルギー（ＭＦＥ）がソフトウェアｍｆｏｌｄによって計算される。最小自由エネルギー（値が高いほどよい）、コドン文脈（値が高いほどよい）及びＣＡＩ（値が高いほどよい）に従って、最良の５’末端配列を選択するようにシグナルペプチドのコード配列が分類される。
ＩＶ．上記の流れの詳細
（１）基本データセット及び二重コドン表の生成
基本データセットは、異なる宿主発現系で高度に発現されるタンパク質及びそれらの関連するＤＮＡコード配列を指す。二重コドン表とは、基本データセットにおけるすべての二重コドンの相対適応度を指す（計算方法に関しては下記参照）。
（２）コドン文脈及びＣＡＩの計算の流れ
ａ）コドン相対適応度ｗｉｊ：
ここで、ｘｉｊは、基本データセットに現れるｉ番目のタイプのアミノ酸のｊ番目の同義コドンの数を表し、ｘｉｍａｘは、基本データセットに現れるｉ番目のタイプのアミノ酸に対する最も高い使用頻度の同義コドンの数を表す。
ｂ）標的配列のコドン適応指数（ＣＡＩ）：
ここで、Ｌは標的配列（すなわち、タンパク質配列または断片）のアミノ酸数を指し、ｗｋは、各アミノ酸コドンによって使用されるコドンに対応する基本データセットのコドン相対適応度である。ＣＡＩは、０〜１の値を有する。この最適化プロセスでは、我々は、コードＤＮＡのＣＡＩ値を高めるために最善を尽くす。
ｃ）二重コドンの相対適応度ｐｋ：
ここでは、３，７２１種類の二重コドン（６１×６１＝３７２１、終止コドンは考慮しない）が存在し、
は、タンパク質配列の基本データセットまたは標的配列（すなわち、タンパク質配列またはその断片）に現れる二重コドンのｋ番目のタイプの数を表し、
は、現れる二重コドンに対応する二重アミノ酸の数を表す。
ｄ）標的配列のコドン文脈（ＣＣ）：
ここで、
は、標的配列の二重コドンのｋ番目のタイプの相対適応度を表し、
は、基本データセットの二重コドンのｋ番目のタイプの相対適応度を表す。ＣＣは、０〜１の値を有する。この最適化プロセスでは、我々は、コードＤＮＡのＣＣ値を高めるために最善を尽くす。
（３）免疫アルゴリズム及び遺伝的アルゴリズムの多目的最適化プロセスにおける子孫集団の選択のため、ＮＳＧＡ２及びＳＰＥＡ２アルゴリズム（ＮＳＧＡ２はデフォルトで使用される）を用いることができ、クロスオーバーには２点クロスオーバーを用いる。
以下、本発明の利点をさらに実例を挙げて説明する。
この試験で用いる宿主発現系はＣＨＯ細胞株であり、合計で２つのタンパク質を最適化及び配列決定する（関連情報に関しては表１参照）。ＪＮＫ３タンパク質の配列は、配列番号１に示す通りであり、ＧＦＰタンパク質の配列は、配列番号２に示す通りである。最適化前のＪＮＫ３タンパク質及びＧＦＰタンパク質のコード配列はそれぞれ、配列番号３及び配列番号４に示す通りであり、最適化後のＪＮＫ３タンパク質及びＧＦＰタンパク質のコード配列はそれぞれ、配列番号５及び配列番号６に示す通りである。
図５に示すように、試験タンパク質をコードする遺伝子断片を合成し、ｐＴＴ５発現ベクター（ＮＲＣより購入、プラスミドマップは図６に示す通りである）に、それぞれ、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ切断部位を介してクローニングする。
ＣＨＯ ３Ｅ７細胞の一過性発現ステップ：
１．対数増殖期にあるＣＨＯ ３Ｅ７懸濁細胞を新鮮ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＣＨＯ培地で５×１０５細胞／ｍＬに希釈し、３０ｍＬの細胞懸濁液を各１２５ｍＬの三角フラスコに接種する。
２．この細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２の条件下、懸濁培養に供する。
３．細胞密度が１〜１．２×１０６細胞／ｍＬに達したら、クローニングされた標的遺伝子を有するプラスミドベクターをそれぞれＣＨＯ ３Ｅ７細胞に、ＰＥＩトランスフェクション試薬で、投与量１ｕｇ／ｍｌに従ってトランスフェクトする。
４．トランスフェクションの４８時間後、この培地を１５００回転／分で遠心し、細胞を収集する。これらの試料は、−８０℃の冷却装置で保存することができる。
ウェスタンブロット実験ステップ：
抗Ｆｌａｇタグ抗体を用いて、細胞溶解物中の標的タンパク質の発現量をウェスタンブロッティングで検出した。ベータ−アクチンタンパク質を内部参照として用いる。各プラスミドの発現実験を３回反復する。ウェスタンブロッティングの結果を図７に示す。
詳細なステップは以下の通りである。
１．ＣＨＯ細胞を、細胞溶解緩衝液を用いて溶解し、そのタンパク質濃度を測定する。
２．そのタンパク質溶液に５Ｘ ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ローディング緩衝液を加え、これを沸騰水浴で１０分間加熱する。
３．このタンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの試料ローディングウェルにマイクロピペットで加え、各ウェルに、この試料を２０ｕｌロードする。
４．１４０Ｖでの定電圧電気泳動を６０分間使用し、ゲルの底部近くにブロモフェノールブルーが達した際に電気泳動を止める。
５．膜転写電圧は１００Ｖであり、低温での膜転写時間は６０分である。
６．膜転写の終了後、そのタンパク質膜を予め調製した洗浄液に入れ、１〜２分間すすいで膜上の膜転写液を除去する。
７．これを室温で４５分間、振盪器上でゆっくりと振盪させることによってブロックする。
８．これに希釈した一次抗体を加え、それをゆっくりと振盪しながら１時間、室温でインキュベートする。
９．これに洗浄液を加え、洗浄のため、合計３回、それを振盪器上で５分間ゆっくりと振盪させる。
１０．これに希釈した二次抗体を加え、それをゆっくりと振盪しながら１時間、室温でインキュベートする。
１１．これに洗浄液を加え、洗浄のため、合計３回、それを振盪器上で５分間ゆっくりと振盪させる。
１２．化学発光検出。
１３．このウェスタンブロッティングの結果の写真を、ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊで定量的に分析する。
表２から分かるように、本特許の３ステップハイブリッドコドン最適化に供した後のＪＮＫ３タンパク質及びＧＦＰタンパク質の発現量は、野生型配列のものと比較して、それぞれ、７．４２±０．５８倍及び１８．３７±２．９０倍増加しており、この新たなアルゴリズムの高効率を十分に証明している。企業の実際の生産において、我々は同様に、複数のタンパク質でこのアルゴリズムと他のアルゴリズムの最適化の影響を比較及び試験し、これもまた、このアルゴリズムがより安定で効率的であることを証明している。
本発明に関与していない部分は、先行技術のものと全く同じであるか、または、先行技術を使用することにより実現され得る。
Claims (8)
- 免疫アルゴリズムに基づくコドン最適化方法であって、免疫アルゴリズム及び遺伝的アルゴリズムを連続して使用し、それぞれ、局所的多目的最適化及び大域的多目的最適化をタンパク質コード配列で行い、次いで、前記配列の微調整及び最適化を行うために網羅的な方法を用い、最適な発現配列を最大の程度まで探索する、前記最適化方法。
- 以下の３つのステップを含む、請求項１に記載の最適化方法：
第一のステップの局所的最適化、すなわち、前記タンパク質配列を非重複配列断片Ａ１、Ａ２…Ａｎに切断し、次いで、前記免疫アルゴリズムを用いて各配列断片に対して前記コドン最適化を完了させ、ほぼ最適なＤＮＡ配列のセットＢ１、Ｂ２…Ｂｎを生成する；
第二のステップの大域的最適化、すなわち、前記遺伝的アルゴリズムを使用してＢ１、Ｂ２…Ｂｎに基づくタンパク質の完全長のＤＮＡコード配列を初期化し、前記タンパク質配列の最適なＤＮＡ配列Ｃ１を選別する；ならびに
第三のステップの微調整及び最適化（これは、前記コードされたタンパク質のＮ末端領域に対応するＤＮＡ配列の５’末端における網羅的な最適化を行い、ＤＮＡ配列Ｃ２を生成すること、及び発現抑制性モチーフを除去して、最終的に最適な発現配列Ｄを生成することを含む）。 - 請求項１または２に記載の最適化方法であって、前記タンパク質が、２０個超のアミノ酸からなる化合物を指し、前記タンパク質が、配置の観点から分泌タンパク質、膜タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質等を含み、機能の観点からは、抗体タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質等を含み、起源の観点からは、相同的発現タンパク質及び異種発現タンパク質を含み、配列の観点からは、天然タンパク質及び人工的に改変されたタンパク質、完全タンパク質／抗体、短縮部分タンパク質／抗体、ならびに２つ以上のタンパク質ならびにタンパク質及びペプチド鎖から形成される融合タンパク質を含み、本発明で定義される抗体が、無傷の抗体、ならびにＦａｂ、ＳｃＦＶ、ＳｄＡｂ、キメラ抗体、二重特異性抗体、Ｆｃ融合タンパク質等を含むがこれらに限定されない、前記最適化方法。
- 請求項１または２に記載の最適化方法であって、前記免疫遺伝的アルゴリズムが、多目的最適化方法を採用して前記タンパク質断片において局所的最適化を行い、前記集団の初期化が、高度に発現したタンパク質をコードする配列の二重コドン表に基づき、各遺伝子が、同義コドンによって直接コードされ、前記最適化プロセスにおいて、抗体多様性が確保され、集団の変性の現象は、抗体の情報エントロピー、抗体集団の類似性、抗体濃度、ならびに前記免疫遺伝的アルゴリズム及び更新記憶細胞の重合適応度を計算することによって防止され、前記アルゴリズムの大域的探索能力を高める、前記最適化方法。
- 請求項１または２に記載の最適化方法であって、前記遺伝的アルゴリズムが、前記多目的最適化方法を採用して前記タンパク質の全配列において大域的最適化を行い、初期化集団が、局所的最適化に供された最適化断片に基づいて無作為に生成され、各遺伝子は、各タンパク質断片の最適化された配列のセットによって直接コードされる、前記最適化方法。
- 請求項１または２に記載の最適化方法であって、前記微調整及び最適化が、前記網羅的な方法を用いて最小自由エネルギーＭＦＥ、コドン文脈、及びＣＡＩを前記ＤＮＡ配列の５’末端で計算及び分類し、前記分類結果に従って、前記タンパク質配列のＮ末端に最適なコード配列を選択する、前記最適化方法。
- 少なくとも以下の宿主発現系に適用可能である、請求項１または２に記載のコドン最適化方法：
１）哺乳類発現系、
２）昆虫発現系、
３）酵母発現系、
４）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ発現系、
５）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現系、
６）植物発現系、及び
７）無細胞発現系。 - 少なくとも以下の発現ベクターに適用可能である、請求項１または２に記載のコドン最適化方法：
一過性発現ベクター及び安定発現ベクター、
ウイルス発現ベクター及び非ウイルス発現ベクター、
誘導及び非誘導発現ベクター。
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