KR20210037499A - 단일 라멜라 리포좀에 포집된 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 세포외막단백질 용액을 이용한 효과적인 피부 침투 및 미용 효과 증대 방법 - Google Patents

단일 라멜라 리포좀에 포집된 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 세포외막단백질 용액을 이용한 효과적인 피부 침투 및 미용 효과 증대 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단일 라멜라 리포좀에 포집된 세포외막단백질 용액을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물 및 이를 이용한 피부 노화 방지 또는 주름 개선방법에 관한 것이다. 본 발명은 세포외막단백질 용액을 단일 라멜라 리포좀으로 포집하여 사용함으로써, 피부 흡수율을 높이고 생체 내 피부 진피에서 세포외막단백질 원섬유의 생성을 조절할 수 있는바, 피부 노화 방지 또는 주름 개선 용도를 위하여 효과적으로 사용될 수 있는 장점이 있다.

Description

단일 라멜라 리포좀에 포집된 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 세포외막단백질 용액을 이용한 효과적인 피부 침투 및 미용 효과 증대 방법{Effective Method for increasing skin penetration and beauty effect by using Extracellular Matrix Protein for Anti-Aging or Anti-wrinkle Stabilized with Small Unilamella Liposome}
본 발명은 단일 라멜라 리포좀에 포집된 세포외막단백질 용액을 이용한 효과적인 피부 노화 방지 또는 주름 개선 방법에 관한 것이다.
콜라겐은 대부분 동물에서 발견되는 단백질로 특히 포유동물의 살과 결합조직을 구성하는 몸의 구조적 지지체로 가장 일반적인 단백질이다. 콜라겐의 기본 성분 단위는 트로포콜라겐(tropocollagen) 단백질이다.
트로포콜라겐은 동일한 크기의 세 가지 폴리펩티드 사슬로 구성되어있다. 이 같은 사슬들은 각각 서로 주위로 감겨서 초나선형(superhelical) 케이블이나 삼중 나선형(triple-helix) 구조를 형성한다. 트로포콜라겐에서 세 가지 사슬 각각이 약 1,000 개의 아미노산의 결합체로 이루어져 있다. 콜라겐 섬유상의 기본 단위인, 트로포콜라겐을 이루는 폴리펩타이드 사슬의 종류에 따라 각각 다른 종류의 콜라겐으로 구분된다.
가장 많이 발견되는 콜라겐의 종류로는 지금까지 알려진 약 20여 가지의 다양한 종류 중에서 콜라겐 타입 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 등 이런 몇 가지 타입의 콜라겐이 가장 일반적인 규칙적인 원섬유(fibril)의 형태를 갖게 되며, 우리 몸의 조직과 피부, 뼈, 힘줄, 인대 등의 구조를 이루는데 콜라겐 단백질의 90% 이상이 인체 내에서 사용하고 있다.
콜라겐 중에서 인체 내에서 가장 많이 존재하는 콜라겐 I 타입의 경우, 1935년 Wyckoff에 의하여 X-ray에 의하여 구조가 처음 알려졌다(Wyckoff R, Corey R, Biscoe J (1935), Science 82, 2121). 이후, 콜라겐을 구성하는 트로포콜라겐의 삼중 나선형의 구조가 육각형(hexagonal)형태로 모여서 구성된 구체적인 분자구조형태의 전자밀도 지도가 2001년 Orgel(Orgel J. Miller A, Irving TC, Fischetti RF, Hammersely A, Wess TJ (2001) Structure, 9, 1061)에 의하여 확인되었으며, 조직에 따른 섬유상의 분자구조와 기계적인 특성의 상관관계는 1988년 Parry에 의하여 확인 된 바 있다.
이러한 콜라겐에 대한 논문들의 대부분은 동물이나 인체 조직에서 주어지는 각각의 다른 환경조건을 갖도록 하여 최종적인 콜라겐의 섬유구조로서 성장을 확인하거나, 결합되는 섬유구조체 내부의 단백질의 미세한 변화들을 관찰하는 미시적인 연구에 한정되어 있으며, 실제 산업화에 활용될 수 있는 결정적인 변화 조건인 섬유 콜라겐 원섬유 혹은 원섬유가 패킹된 섬유의 결합 두께의 조절, 특히 균일한 크기로 제어 할 수 있는 방법은 제시하지 못하고 있다.
이에, 본 발명자들은 생물체의 다양한 조직에서 자기조립되어 고유한 구조를 갖는 세포외막단백질(Extracellular Matrix Protein)의 원섬유를 균일하게 제조하고자 노력한 결과, 세포외막단백질 용액에 전기장(electric field)을 인가하여 세포외막단백질 원섬유를 제조하는 경우 종래에 보고되지 않은 가장 미세한 원섬유를 제조할 수 있음을 규명하고 이에 대해 국내 특허 등록(제10-1570858호)을 받은 바 있다.
한편, 피부는 다층구조를 가지며 크게 표피, 진피 및 피하지방층으로 나눌 수 있다. 이 중 표피의 가장 바깥쪽에는 각질층(Stratum Corneum)으로 알려진 피부 장벽이 존재하는데, 이러한 각질층은 세포들이 지질 이중층(세포 간 지질)의 고차원적인 배열로 이루어짐으로써, 피부로부터 수분이 증발하는 것을 막을 뿐 아니라 외부의 자극으로부터 피부 및 신체를 보호하는 중요한 역할을 한다.
하지만, 이러한 각질층(피부 장벽)은 피부에 적용되는 활성 성분들의 피부 흡수율을 감소시키고, 활성 성분들이 면역세포가 있는 진피층까지 도달하지 못하도록 하기 때문에, 활성 성분들을 실제 피부 치료제로 사용하였을 때, 그 효능이 제대로 발휘되지 못하는 문제가 있다.
이에, 피부 흡수율을 증가 시키기 위해서 나노사이즈 입자를 통한 피부 침투 및 흡수율을 증대시키는 노력이 많이 이뤄지고 있다. 구체적으로, 피부의 진피는 대부분의 무기 물질로 이루어진 나노사이즈 입자들을 효과적으로 차단하는 피부 장벽으로 작용하기 때문에 무기 물질로 이루어진 나노파티클로는 피부 침투율을 높일 수 없는데, 40 nm의 직경을 가지는 나노파티클이나 그보다 작은 나노파티클의 경우는 피부 침투가 가능했다는 논문 결과들이 보고되고 있다.
2006년 Annika는 피부를 통과 후 세포실험에서의 검출 실험을 통해서 40 nm 사이즈의 나노파티클은 피부 투과하여 확인되었으나 750 nm 또는 1500 nm 사이즈의 나노파티클은 투과하지 못했다고 보고하였다. 또한, 2008년 Kimiko 그룹은 골드 나노파티클(GoldNP)을 통한 피부 투과성 실험을 통하여, Jessica 그룹은 퀀텀 닷(Quantum Dots)을 통한 피부투과성 실험을 통하여 금속/무기 물질의 나노파티클을 통한 피부투과성 정도를 확인하였는데, 골드 나노파티클의 경우는 15 nm 사이즈의 경우는 쉽게 피부를 투과하였으나 대략 200 nm 사이즈의 경우는 현저히 투과율이 떨어졌다. 퀀텀 닷의 경우도 40 nm 사이즈 이하의 경우에서만 피부 투과를 보여주었다.
국내공개특허 제10-2019-0048202호
본 발명자들은 세포외막단백질이 갖는 낮은 흡수율을 개선할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 세포외막단백질 용액을 단일 라멜라(Unilamella) 리포좀에 포집하여 사용하는 경우, 보다 간편하고 용이하게 생체 내로 흡수시킬 수 있을 뿐만 아니라, 산성을 가지는 세포외막단백질 용액으로부터 피부를 보호하며, 생체 내 피부 진피에서 피부 노화 방지 또는 주름 개선 활성을 갖는 세포외막단백질 (원)섬유의 생성을 촉진시킬 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 단일 라멜라(Unilamella) 리포좀에 포집된 세포외막단백질(extracellular matrix protein) 용액을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포외막단백질 용액이 포집된 단일 라멜라 리포좀을 이용한 피부 노화 방지 또는 주름 개선 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 세포외막단백질이 갖는 낮은 흡수율을 개선할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 세포외막단백질 용액을 단일 라멜라(Unilamella) 리포좀에 포집하여 사용하는 경우, 보다 간편하고 용이하게 생체 내로 흡수시킬 수 있을 뿐만 아니라, 산성을 가지는 세포외막단백질 용액으로부터 피부를 보호하며, 생체 내 피부 진피에서 피부 노화 방지 또는 주름 개선 활성을 갖는 세포외막단백질 (원)섬유의 생성을 촉진시킬 수 있음을 규명하였다.
본 발명은 단일 라멜라(Unilamella) 리포좀에 포집된 세포외막단백질(extracellular matrix protein) 용액을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물 및 이를 이용한 피부 노화 방지 또는 주름 개선 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 단일 라멜라(Unilamellar) 리포좀에 포집된 세포외막단백질(extracellular matrix protein) 용액을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 "리포좀"은 제약, 화장품 및 식품 분야에서 생리활성 성분을 안정하게 전달하고, 침투 효과를 극대화하는 데에 사용되는 리포좀의 형태를 갖는 것을 의미하며, 용어 "라멜라(Lamella)"는 2 매의 단위막에 의해 만들어진 이중막구조를 갖는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "단일 라멜라 리포좀"은 단일막구조의 리포좀 형태를 갖는 것을 의미한다.
상기 단일 라멜라 리포좀은 사이즈(직경)에 따라, 10-100 nm의 직경을 갖는 소형 단일 라멜라 리포좀(small unilamellar liposomes; SUVs), 100-1,000 nm의 직경을 갖는 대형 단일 라멜라 리포좀(large unilamellar liposomes; LUVs), 1-200 μm의 직경을 갖는 거대 단일 라멜라 리포좀(giant unilamellar liposomes; GUVs)으로 분류 될 수 있다.
본 발명의 단일 라멜라 리포좀은 하기에서 설명할 세포외막단백질 용액을 포집한 것일 수 있다.
한편, 상기 단일 라멜라 리포좀의 직경은 피부 투과 및 피부 노화 방지/주름 개선에 효과적으로 작용할 수 있는 적정량의 세포외막단백질 용액을 포집할 수 있는 정도의 크기여야 할 것이다.
따라서, 본 발명의 상기 단일 라멜라 리포좀은 10-500 nm, 10-400 nm, 10-300 nm, 10-200 nm, 10-100 nm, 20-500 nm, 20-400 nm, 20-300 nm, 20-200 nm, 20-100 nm, 30-500 nm, 30-400 nm, 30-300 nm, 30-200 nm, 30-100 nm, 40-500 nm, 40-400 nm, 40-300 nm, 40-200 nm 또는 40-100 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 단일 라멜라 리포좀은 인지질 및 콜레스테롤을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.
상기 세포외막단백질 용액은 세포외막단백질을 용해하여 제조될 수 있다.
구체적으로는, 상기 세포외막단백질 용액은 산성 용액(예컨대, 염산 또는 아세트산)에 세포외막단백질을 용해하고, 알칼리 용액(예컨대, 수산화 나트륨 수용액)을 첨가함으로써 pH를 조절하여 제조될 수 있다. 상기 알칼리 용액의 첨가에 따라 세포외막단백질은 반응 가능한 상태가 되며, 이는 부분적으로 단백질 간의 자기조립(self-assembly) 반응이 상태가 된 것을 의미한다.
상기 세포외막단백질은 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 헤파린(heparin), 케라틴(keratin) 및/또는 피브린(fibrin)일 수 있고, 바람직하게는 콜라겐일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포외막단백질은 다양한 포유동물의 조직으로부터 실험적으로 또는 상업적으로 수득할 수 있다.
상기 포유동물은 인간, 소, 말, 양, 돼지, 토끼, 염소, 마우스, 햄스터 또는 랫트일 수 있고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 포유동물은 소(bovine) 또는 랫트의 콜라겐이다.
상기 세포외막단백질은 상기 포유동물의 다양한 조직으로부터 수득할 수 있다.
상기 조직은 힘줄, 인대, 피부(또는 진피), 각막, 연골, 뼈, 혈관, 내장 또는 추간판일 수 있고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 조직은 피부내부의 진피이다.
상기 세포외막단백질 용액은 pH 1 내지 pH 4의 pH 값을 갖는 것일 수 있다.
한편, 세포외막단백질(예를 들어, 콜라겐)의 경우 일반적으로 높은 pH(pH 6-8)에서 수백 ㎚ 크기 이상의 원섬유(fibril)/섬유(fiber)를 생성하기 때문에 피부 흡수율이 낮을 수 밖에 없다. 피부 흡수율을 높이기 위하여 산성화 된 세포외막단백질 용액을 사용하는 경우라도 표피 혹은 표피 통과 시에 중화되어 쉽게 원섬유/섬유가 형성되기 때문에 피부 깊숙이 침투할 수 없고, 또한 강산성 용액은 피부를 손상시키는 위험적인 요인도 가지고 있다.
그러나, 본 발명의 상기 pH 1 내지 pH 4의 세포외막단백질 용액은 상기 단일 라멜라 리포좀에 포집되어 있기 때문에 산성을 나타냄에도 불구하고 침투 시 피부를 보호할 수 있고, 상기 리포좀을 구성하는 인지질은 피부 내부에서 원섬유 생성 시 중화 역할을 할 수 있는 장점이 있다.
상기 세포외막단백질 용액은 앞서 기술한 방법으로 수득하며, 과량 투여하여도 부작용이 없으므로, 그 중량비는 효능 또는 활성을 달성하기 위해 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
바람직하게는 세포외막단백질 용액이 포집된 상기 단일 라멜라 리포좀의 직경(사이즈)에 맞게 중량이 결정될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "포집(encapsulation)"은 전달물질을 둘러싸서 효율적으로 생체 내로 함입시키기 위해 캡슐화하는 것을 말한다.
따라서, 상기 단일 라멜라 리포좀은 여러 종류의 난용성 물질을 녹임과 동시에 불안정한 물질을 안정화시켜 피부 침투 효과를 극대화하는 장점을 가지고 있는바, 본 발명의 단일 라멜라 리포좀에 포집된 세포외막단백질 용액은 단일 라멜라 리포좀에 세포외막단백질 용액이 포함되어 세포외막단백질 용액의 피부 침투 효과를 보다 개선시킴으로써, 피부 노화 방지 또는 주름 개선 용도를 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 금속이온봉쇄제, 활성성분(예를 들면, Sodium Hyaluronate 및 Tocopheryl Acetate 등), 방부제, 점증제 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 당 업계에서 일반적인 제형, 예를 들어 유화 제형이나 가용화 제형 등의 형태로 제조될 수 있다. 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등을 예로 들 수 있으며, 가용화 제형으로는 유연화장수를 예로 들 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.
적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 다음의 단계를 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선 방법에 관한 것이다.
세포외막단백질(extracellular matrix protein) 용액이 포집된 단일 라멜라(Unilamellar) 리포좀을 대상의 피부에 도포하는 단계;
전기장(electric field)을 인가하여 세포외막단백질(extracellular matrix protein) 원섬유(fibril) 또는 섬유(fiber)의 생성을 촉진시키는 단계.
본 발명의 세포외막단백질 용액이 포집된 단일 라멜라 리포좀의 제조는 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 인지질 및 콜레스테롤을 포함하는 혼합물을 함께 교반하고, 건조 후 압출(extrusion)하여 제조할 수 있다.
상기 단일 라멜라 리포좀의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있는 이점이 있다.
본 발명을 각 단계별로 구체적으로 설명하도록 한다.
세포외막단백질 용액이 포집된 단일 라멜라 리포좀을 대상의 피부에 도포하는 단계
본 단계는 대상의 피부에 세포외막단백질 용액이 포집된 단일 라멜라 리포좀을 도포하는 과정이다. 본 과정에 의해 대상의 피부 깊숙이 세포외막단백질 용액이 포집된 단일 라멜라 리포좀이 흡수(침투)될 수 있다.
전기장을 인가하여 세포외막단백질 원섬유 또는 섬유의 생성을 촉진시키는 단계
본 단계는 피하로 흡수된 단일 라멜라 리포좀에 포집된 세포외막단백질 용액에 전기장(electric field)을 인가하여 세포외막단백질 원섬유(fibril) 또는 섬유(fiber)의 생성을 촉진시키는 과정이다. 본 과정에 의해 효율성 높은 피부 노화 방지 또는 주름 개선 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "전기장"은 전기적으로 전하된 입자가 둘러싸여 있는 시가변적(time-varying) 자기장을 의미한다. 상기 전기장은 전기적으로 전하된 물체에 전기적으로 전하된 입자를 둘러싼 힘(force)이 가해지는 것이다. 이의 정성적(qualitative) 정의는 쿨룸(coulomb, NC-1) 당 뉴턴의 SI 유닛을 갖는 벡터장(vector field), 또는 미터(metre) 당 볼트(volts)(Vm-1)이다. 상기 전기장에서의 SI 유닛은 ㎏ms-3A-1이다. 기지점에서의 장(field)의 세기(strength) 또는 규모(magnitude)는 힘(force)의 방향에 의해 주어지는 장의 방향에 대한 1 쿨룸의 양성 시험전하(test charge)에 가해지는 값이다.
즉, 상기 전기장은 본 발명의 세포외막단백질 용액에 가해지는 전기적인 전하를 갖는 힘을 모두 포함한다.
상기 전기장은 직류 전기장, 교류 전기장 또는 이의 혼합 전기장일 수 있다.
상기 전기장 인가에 의해 생성이 촉진되는 세포외막단백질 원섬유는 트로포콜라겐(tropocollagen)일 수 있다.
상기 트로포콜라겐은 콜라겐 섬유구조체(fibrous structure)의 기본 단위이며, 왼쪽-나선형 구조의 3개 폴리펩타이드 가닥이 3중 오른쪽-나선형 구조(triple-helix)를 갖거나, 초나선형(superhelical) 케이블 구조를 갖는다.
상기 세포외막단백질 원섬유는 다양한 조직에서 다른 조합 및 농도로 배열되어(arranged) 다른 조직적 특성을 제공하며, 원섬유 간의 번들(bundle)을 구성하여 수백 나노미터에서 수 마이크로미터의 두께인 파이버(fiber)로 만들어진다.
상기 원섬유 또는 섬유는 1 내지 10 ㎚의 직경을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 피부 노화 방지 또는 주름 개선 방법은 상술한 화장료 조성물과 구성성분을 공통으로 하기 때문에, 상기 조성물의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 단일 라멜라 리포좀에 포집된 세포외막단백질 용액을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물 및 이를 이용한 피부 노화 방지 또는 주름 개선방법에 관한 것이다. 본 발명은 세포외막단백질 용액을 단일 라멜라 리포좀으로 포집하여 사용함으로써, 피부 흡수율을 높이고 생체 내 피부 진피에서 세포외막단백질 원섬유의 생성을 조절할 수 있는바, 피부 노화 방지 또는 주름 개선 용도를 위하여 효과적으로 사용될 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기장에 의한 콜라겐 원섬유(fibril)의 생성 촉진 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포외막단백질 용액에 대하여, pH 조건에 따른 콜라겐 원섬유 생성 여부를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 단일 라멜라 리포좀을 제조하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포외막단백질 용액이 포집된 단일 라멜라 리포좀에 대하여, 전기장 인가 시 pH 조건에 따른 콜라겐 원섬유/섬유 생성 촉진 효과를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 단일 라멜라 리포좀에 대하여, 조직 내부 침투성을 확인한 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
제조예 1. 세포외막단백질 용액의 제조
0.02M 아세트산(Acetic Acid)에 용해하여 추출한 콜라겐 타입 I(FisherScientific, Rat Tail 유래, 8-11mg/ml) 용액을 0.01M 염산(HCl)에 용해하여 원하는 농도(1mg/ml)로 조절하고, 0.1M NaOH를 첨가하여 pH 1에서 pH 8까지 올려주었다.
실험예 1. pH 조건에 따른 원섬유(fibril)/섬유(fiber) 생성 여부 확인
상기 제조예 1에서 제조된 pH 1에서 pH 8까지의 세포외막단백질 용액에 대하여, 투과 전자현미경(TEM; Transmission Electron Microscope)을 이용하여 원섬유(fibril) 및 섬유(fiber)의 생성여부를 확인하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, pH 1에서 pH 4 범위에서는 원섬유(fibril)/섬유(fiber)가 생성되지 않는 것을 알 수 있었다. 즉, 상기 pH 조건에서 세포외막단백질(콜라겐)이 반응 가능한(대기) 상태가 되는 것으로, 부분적으로 단백질 간에 자기조립(self-assembly) 반응이 진행된 것을 의미한다.
제조예 2. 세포외막단백질 용액이 포집된 단일 라멜라(Unilamellar) 리포좀의 제조
상기 실험예 1의 결과를 기초로, 상기 제조예 1에서 제조된 원섬유가 생성되지 않는 pH 1 내지 pH 4 의 세포외막단백질 용액을 버퍼용액으로 사용하여 미니-사출기(Mini-Extruder, Avanti)를 이용한 압출법(Extrusion)으로 단일 라멜라 리포좀을 제조하였다(구체적인 방법은 도 3 참조). 구체적인 조성은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
성분 함량(중량%)
인지질 (Phospholipid) 85.88
콜레스테롤 (Cholesterol) 14.12
제조예 3: 전기장 제어 장치
ITO(Indium Tin Oxide)가 코팅된 2장의 유리판을 2 ㎝Х2 ㎝로 절단한 후, 구리테이프를 이용하여 각각의 ITO 유리판 끝에 전원을 연결시킬 부분을 제작하였다. ITO가 코팅된 부분을 마주보게 하여 리포좀을 담지할 공간을 제공할 스페이서(spacer)를 삽입하였다. 이때, 스페이서는 절연소재를 이용하였다.
실험예 2. pH 조건에 따른 콜라겐 원섬유(fibril)/섬유(fiber) 생성 촉진 효과 확인
상기 제조예 2에서 준비된 라멜라 리포좀(각 pH 1, 2, 3 및 4)을 상기 실시예의 스페이서 내부 공간에 채워 넣고, 마주 본 전극에 2.5 V/㎝ AC를 1시간(2.5 V/㎝ DC 5분) 동안 인가해주었다. 콜라겐의 상태를 확인하기 위해 투과 전자현미경(TEM)을 이용해 이미지를 확인하였다.
도 4a 및 4b에서 확인할 수 있듯이, pH 3 조건에서 전기장이 인가되지 않은 세포외막단백질 용액이 포집된 단일 라멜라 리포좀(Control)에서는 콜라겐 원섬유가 여전히 생성되지 않고 단일 라멜라 리포좀만 존재함을 알 수 있으나, pH 1-3 조건에서 전기장이 인가된 세포외막단백질 용액이 포집된 단일 라멜라 리포좀(본 발명의 방법)에서는 리포좀은 사라지고 콜라겐 원섬유(fibril)/섬유(fiber) 구조를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 세포외막단백질 용액이 포집된 단일 라멜라 리포좀을 사용하는 경우 세포외막단백질 원섬유가 생성되지 않은 pH 조건의 세포외막단백질 용액이 포집된 단일 라멜라 리포좀을 피부에 도포, 피부 침투 효율을 더욱 증대시킬 수 있을 뿐만 아니라 피부 침투 후 전기장 인가(AC, DC, 이의 혼합 전기장)를 통하여 세포외막단백질 원섬유/섬유의 생성을 조절할 수 있으므로, 이를 피부 노화 방지 또는 주름 개선 용도로 효과적으로 사용할 수 있음을 의미한다.
실험예 3. 본 발명의 단일 라멜라 리포좀의 조직 내부 침투성 확인
본 발명의 단일 라멜라 리포좀에 대하여, 내피세포(endothelial cell) 투과를 통한 바닥 조직(Tissue)으로의 내부 침투 여부를 관찰(트랜스웰 분석; transwell assay)함으로써 단일 라멜라 리포좀의 피부 침투 가능 여부를 확인하였다.
구체적으로, 트랜스웰 배양 플레이트(Corning 사)의 내부 및 외부 용기에 내피세포 및 프라이머리 조직 셀(Primary tissue cell, 마우스와 같은 동물 혹은 사람 조직으로부터 얻어진 cell을 배양)을 배양하고, 하기에서 별도로 제조된 형광 발현된 ECM이 부착된 단일 라멜라 리포좀을 내부 용기에 첨가하여 촘촘히 배양된 내피세포에 대한 투과 여부를 확인하였다(도 5a 참조).
형광 발현된 ECM이 부착된 단일 라멜라 리포좀은 상기 제조예 2의 세포외막단백질 용액을 포함하는 버퍼용액 대신 세포외막단백질 용액을 포함하지 않는 일반 버퍼용액(MES 버퍼 혹은 트리스 버퍼)을 사용하고, 제조예 2의 인지질 (DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine))대신 단일 라멜라 리포좀 외부에 마이너스(-) 전하를 가지게 하는 인지질(DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)(sodium salt))을 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 2와 동일한 방법으로 제조하였다.
제조된 라멜라 리포좀은 와이드-보오 피펫 팁(wide-bore pipette tip)으로 수집하여 버퍼용액에 재 분산시켰다. 이때, 재 분산용 버퍼용액의 종류는 하기와 같으며, 콜라겐-리포좀(COL-vesicles)의 경우 MES 버퍼에 분산된 마이너스(-) 전하를 가지는 단일 라멜라 리포좀 분산액에 콜라겐 원섬유/섬유 형광 발현 염료를 포함하는 collagen-type I 용액을 추가하였고, 각 리포좀은 형광 발현 ECM이 잘 부착될 수 있도록 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다(pH는 4.2에서 7.5로 증가시킴):
- 콜라켄(collagen)-리포좀(COL-vesicles): MES 버퍼(0.3 M glucose, 2mM MES, pH 4.2)
- 라미닌(laminin)-리포좀(LN-vesicles) 및 피브로넥틴(fibronectin)-리포좀(FN-vesicles): 트리스 버퍼(0.3 M glucose, 2mM Trsi-HCl, pH 7.4)
도 5b에서 확인할 수 있듯이, 특히 콜라켄(collagen)-리포좀(COL-vesicles)의 경우 높은 형광 발현을 나타내었으며, 피브로넥틴(fibronectin)-리포좀(FN-vesicles) 및 라미닌(laminin)-리포좀(LN-vesicles) 순으로 형광 세기가 약해지는 것을 알 수 있었다.
이러한 결과는 단일 라멜라 리포좀이 내피세포를 투과함으로써 효과적으로 내부 침투할 수 있음을 의미하며, 이에 따라, 본 발명의 세포외막단백질 용액이 포집된 단일 라멜라 리포좀 또한 효과적으로 피부 내부로 침투할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. 단일 라멜라(Unilamellar) 리포좀에 포집된 세포외막단백질(extracellular matrix protein) 용액을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외막단백질은 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 헤파린(heparin), 케라틴(keratin) 또는 피브린(fibrin)인, 화장료 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 세포외막단백질은 콜라겐인, 화장료 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외막단백질 용액은 pH 1 내지 pH 4의 pH 값을 갖는 것인, 화장료 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단일 라멜라 리포좀은 10-400 nm의 직경을 갖는 것인, 화장료 조성물.
  6. 다음의 단계를 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선 방법:
    세포외막단백질(extracellular matrix protein) 용액이 포집된 단일 라멜라(Unilamellar) 리포좀을 대상의 피부에 도포하는 단계;
    전기장(electric field)을 인가하여 세포외막단백질(extracellular matrix protein) 원섬유(fibril) 또는 섬유(fiber)의 생성을 촉진시키는 단계.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 전기장은 직류 전기장, 교류 전기장 또는 이의 혼합 전기장인, 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 세포외막단백질은 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 헤파린(heparin), 케라틴(keratin) 또는 피브린(fibrin)인, 방법.
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 세포외막단백질 용액은 pH 1 내지 pH 4의 pH 값을 갖는 것인, 방법.
  10. 제 6 항에 있어서, 상기 원섬유 또는 섬유는 1 내지 10 ㎚의 직경을 갖는 것인, 방법.
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