KR20210036652A

KR20210036652A - 지용성 노화방지 성분을 로딩한 리포솜 나노입자 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20210036652A
Application number: KR1020190118910A
Authority: KR
Inventors: 신병철; 권혁일; 권무길; 김혜민; 김보연
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2019-09-26
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2021-04-05
Also published as: KR102296341B1

Abstract

본 발명은 지용성 성분을 로딩할 수 있는 리포솜 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 리포솜 나노입자를 형성하는 지질 중에서 인지질과 콜레스테롤을 일정량 포함하고, 수상에서 난용성 물질의 용해성을 증가시키고, 봉입효율을 증가시키므로서, 피부세포와 융합되어 피부에 흡수를 촉진하고 미용 성분의 전달을 향상시킬 수 있는 생체 친화성이 우수한 리포솜 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

지용성 노화방지 성분을 로딩한 리포솜 나노입자 및 이의 제조방법{liposome nanosphere containing lipophilic antiaging ingredints and preparation method of the same}

본 발명은 리포솜 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 리포솜 나노입자를 형성하는 지질 중에서 인지질을 일정량 포함하고, 콜레스테롤을 도입하여 수상에서 난용성 성분의 봉입효율을 증가시키고, 수상에서 난용성 물질의 용해성을 증가시키고, 봉입효율을 증가시키므로서, 피부세포와 융합되어 피부에 흡수를 촉진하고 미용 성분의 전달을 향상시킬 수 있는 생체 친화성이 우수한 리포솜 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

피부노화는 크게 두 가지 과정을 통해 발생하는데, 특별한 환경적 요인 없이 누구에게나 세월과 함께 일어나는 변화를 내인성 노화라 하고, 자외선 조사와 같은 환경요인에 장기간 노출되어 얼굴, 목, 손 등에 나타나는 변화를 광 노화(Photo aging) 혹은 외인성 노화라고 한다.

내인성 노화의 주원인은 우리 몸의 신진대사과정에서 만들어진 반응성 활성 산소 라디칼에 의하여 우리 몸의 구성 성분에 생기는 손상이 누적되기 때문이다. 일단 활성산소가 만들어진 후 몸속에 있는 여러 가지 보호 장치에 의하여 효과적으로 제거되지 못하게 되면 일련의 염증반응이 일어나 피부 손상이 초래되며, 상기 피부 손상 중 대표적인 손상으로는 피부 주름형성이 있다.

피부 주름형성과 관련된 주요 기작은 피부가 대기오염, 자외선 노출, 스트레스 또는 질병 등의 유해환경으로부터 산화적 스트레스(oxidative stress)에 계속적으로 노출되어 체내의 라디칼이 증가되고, 진피의 결합조직인 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 히아루론산(hyaluronic aicd) 등을 파괴하여 피부의 일정 부위 침하현상(주름)을 일으킬 수 있는 것으로 설명된다. 이외에도 라디칼은 멜라닌 형성과정에 관여하여 기미, 주근깨 및 주름생성의 원인이 된다.

또한, 상기 피부 주름형성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐의 생성량 및 콜라겐의 함량을 감소시키는 콜라겐 분해 효소인 콜라게네이즈의 발현량과 활성이다. 특히, 자연노화보다는 자외선에 의한 광 노화시 상기 콜라게네이즈가 과량 발현된다.

콜라겐은 피부 진피층에 존재하는 고분자 물질로서 피부에 탄력을 부여하는 주요 성분 중 하나로 알려져 있다. 그러므로 피부 주름을 개선시키는 방법으로 콜라겐 생합성을 촉진시키고, 동시에 콜라게네이즈 활성을 억제할 수 있는 물질을 찾고자 하는 노력이 시도되고 있다. 콜라게네이즈는 주름 발생과정에서 주된 인자이므로, 지금까지 콜라게네이즈의 활성을 저해하는 천연추출물을 주름개선 유효물질로 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되어오고 있다.

이로 인한 성과로, 특허문헌 1에서는 콜라겐 분해를 억제하여 탁월한 주름개선 효과를 갖는 콜라게네이즈 유전자의 mRNA에 대한 안티 센스 올리고뉴클레오타이드 및 c-Jun 유전자의 mRNA에 대한 안티 센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 주름개선 유효물질에 관한 내용을 개시하고 있다.

또한, 상기 피부 주름 개선을 위해서 아스코르브산, α-토코페롤, 레티놀 및 그 유도체, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(Super Oxide Dismutase, SOD) 등이 자유 라디칼 소거 기능 또는 피부 주름 개선을 위한 물질로 화장료 또는 의약품에 배합되어 주름 및 기타 피부 질환을 방지하기 위하여 사용되어 왔으나, 이들은 장기 안정성이 좋지 못하여 실질적인 효과를 기대하기 어려운 문제점이 있다. 이러한 이유로 보다 안전하면서 피부 주름 개선에 효과가 높은 물질을 개발하는 것이 의약품이나 식품 분야뿐만 아니라 화장료 산업 분야에서도 중요한 과제로 대두되어 많은 연구가 진행되고 있다.

여기서, 상기 레티놀은 지용성 비타민 A의 대표적인 화합물로서 피부의 표피세포가 원래의 기능을 유지하는 데에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 레티놀은 피부에 빠르게 침투되어 피부세포의 세포핵 DNA로부터 세포의 성장과 분화에 관여하는 유전자를 활성화시킨다. 또한, 단백질(콜라겐 등) 합성에 관여하는 mRNA를 활성화함으로써 콜라겐의 생합성을 촉진시켜 피부의 결합조직을 증가시킨다. 이에 피부 탄력이 향상되는 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

하지만, 레티놀은 효과가 뛰어난 반면 빛, 온도, 산소 등에 매우 불안정하여 쉽게 산화되어 변색이 발생하므로 피부에 도포한다 하더라도 피부의 내부에 도달할 때까지 레티놀의 안정성과 효과를 장담할 수 없기 때문에 외부 환경요인에 대해 장기안정성을 가지고 효과적인 레티놀을 위한 다양한 연구들이 진행되고 있는 실정이다.

또한, 누에의 애벌레, 번데기 및 누에고치 유래 천연물질 또한 상기 아스코르브산, α-토코페롤, 레티놀 등과 같이 주름 개선에 효과적인 것으로 알려져 있다. 일례로, 특허문헌 2에서는 황금 누에 유래 물질의 분말, 추출물 또는 가수분해물을 유효물질로 포함하는 화장료 조성물에 관한 내용을 개시하고 있으며 상기 누에 유래 물질은 주름개선, 미백 및 보습 효과가 탁월하고, 다른 화장품 소재와의 결합력도 우수하여 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패취, 마스크 시트, 분무제, 세정제 등의 제형화가 용이한 효과가 있음을 확인하고 있다.

이와 유사한 리포솜 나노입자는 미합중국 특허 제5,059,591호는 암포테리신 B와 콜레스테롤-폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용하여 암포테리신 B의 독성을 감소시켰다. 상기 특허에서는 암포테리신 B를 콜레스테롤-PEG와 염의 형태로 결합시켰으며 이때 콜레스테롤과 결합된 PEG의 특성을 이용하여 체내 순환시간을 증가시켰다.

미합중국 특허 제5,965,156호는 암포테리신 B를 봉입한 리포솜의 제조방법에 관한 것이다. 상기의 특허는 암포테리신 B를 리포솜에 봉입하였으며 산성 유기용매에서 암포테리신 B와 음이온성인 포스파티딜글리세롤을 이온결합시켜 제형으로 형성시에 봉입율을 증가시키고 체내 독성을 감소시켰다.

따라서, 암포테리신 B의 수상 용해도를 향상시키고 약물의 독성을 감소시키고 체내 순환시간이 증가되며 더불어 대량 생산이 가능한 새로운 방법이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 10-2006-0065813 대한민국 공개특허 10-2013-0108805

이에, 본 발명자들은 주름개선 유효물질, 일례로 주름개선 활성성분으로 잘 알려져 있는 누에오일이 봉입되어 장기 안정성이 우수한 나노입자를 개발하기 위하여 연구를 진행하던 중, 본 발명에 따른 주름개선 유효물질이 봉입된 나노입자는 피부투과촉진제를 포함함으로써 주름개선 유효물질의 물에 대한 낮은 용해성 문제를 해결하여 장기 안정성이 우수하며, 장기 안정성이 우수한 주름개선용 화장료 조성물로 유용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 인지질과 콜레스테롤로 형성된 입자에 누에오일, 레티올과 같은 지용성 성분이 봉입된 리포솜 나노입자를 그 특징으로 한다.

즉, 그림 1에서 보는바와 같이 지용성 성분을 소수성이 강한 콜레스테롤이 감싸게 되고 콜레스테롤과 친화성이 좋은 인지질이 계면활성 역할을 하게 되어 안정한 리포솜 나노입자가 제조 된다. 나노입자 표면에 인지질의 친수성 인산기가 배열하게 되어 수용성 용액에 잘 분산되어 안정화 되는 특징이 있다.

또한, 본 발명은

(A-1) 포스파티딜콜린, 이온성 인지질 및 스테롤류를 40 ~ 70 : 5 ~ 20 : 10 ~ 40의 중량비로 혼합하여 제조된 지질 100 중량부에 대하여 유기용매에 용해시켜 지질 용액을 제조하는 단계;

(A-2) 노화방지 성분을 탄소수 1 ~ 6의 직쇄형 또는 분지형 알코올에 용해시켜 약물 용액을 제조하는 단계;

(A-3) 상기 (A-1)의 지질 용액 및 (A-2)의 약물 용액을 1:1 ~ 1:9의 부피비로 혼합하여 지질-약물 혼합용액을 제조하는 단계;

(A-4) 상기 (A-3)의 혼합용액을 수상에서 2:1 ~ 1:10의 부피비로 분산시켜 지질나노입자를 형성시키는 단계;

(A-5) 상기 (4)의 지질나노입자 용액을 20 ~ 50 ℃에서 감압 증류하여 유기용매를 제거하고, 여과하여 균일한 크기의 미용성분이 봉입한 리포솜 나노입자를 제조하는 단계;

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 리포솜 나노입자를 형성하는 지질 중에서 지용성 미용성분을 소수성이 강한 콜레스테롤이 감싸게 되고 콜레스테롤과 친화성이 좋은 인지질이 계면활성 역할을 하게 되어 안정한 리포솜 나노입자가 제조 된다. 나노입자 표면에 인지질의 친수성 인산기가 배열하게 되어 수용성 용액에 잘 분산되어 안정화 되는 특징이 있다.

특히, 본 발명의 미용성분을 봉입한 리포솜 나노입자 제조를 위해서는 나노입자의 형성 지질로 이온성 인지질을 사용하는 것에 그 특징이 있다. 상기 이온성 인지질은 소수성 기 탄소수 16 ~ 18의 알킬사슬을 갖는 포스파티딜산이 바람직하다. 더욱 바람직하기로는 디미리스틸글리세로포스페이트(DMPA),디팔미토일글리세로포스페이트(DPPA), 디미리스틸글리세로포스페이트(DMPG), 디스테로일글리세로포스페이트(DSPA), 디스테로일글리세로포스포글리세롤(DSPG), 디팔미토일글리세로포스포라글리세롤(DPPG), 디미리스틸글리세로포스포세린(DMPS),디팔미토일글리세로포스포세린(DPPS) 그리고 디스테로일글리세로포스포세린(DSPS), 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 포함한다. 음이온성 인지질의 탄소수가 14 미만일 경우 상전이온도가 체온 이하로 떨어져 지질나노입자의 체내 안정성이 저하되고, 탄소수가 18을 초과하는 경우에는 약물과의 결합력이 약해져 약물의 봉입효율이 감소하고, 지질나노입자 입자의 크기가 증가하기 때문에 바람직하지 못하다.

상기 이온성 지질은 지질나노입자를 형성하는 전체 지질 조성에 대하여 5 ~ 20 중량% 함유하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서 지질나노입자를 형성하기 위한 지질로서 수소화포스파티딜콜린이나 포스파티딜콜린을 사용하는 것이 바람직하며, 대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린 또는 보바인 인지질을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 소수성기의 탄소수가 16 ~ 18인 알킬사슬을 가지는 것이고, 예를 들어 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 디스테아로일포스파티딜콜린 등을 사용할 수 있다. 탄소수가 16 미만인 경우에도 누에오일과 강한 결합을 이루나, 상전이온도가 체온 이하로 떨어져 지질나노입자의 체내 안정성이 저하되고, 탄소수가 18을 초과하는 경우에는 약물과의 결합력이 약해져 지질나노입자에 약물의 봉입효율이 감소하고, 지질나노입자의 크기가 증가하기 때문에 바람직하지 못하다. 상기 포스파티딜콜린은 지질나노입자를 형성하는 전체 지질 조성에 대하여 40 ~ 70 중량% 함유하는 것이 바람직하다.

또한, 지질나노입자를 형성하기 위해 사용되는 지질로서 스테롤류를 사용하는데, 바람직한 스테롤류로는, 콜레스테롤, 콜레스테롤헥사숙시네이트, 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤, 에르고스테롤, 스티그마스테롤 또는 라노스테롤 등을 들 수 있다. 상기 스테롤류는 지질나노입자를 형성하는 전체 지질 조성에 대하여 10 ~ 40 중량% 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 미용성분을 콜레스테롤로 봉입하고 인지질인 수소화포스파티딜콜린이나 포스파티딜콜린이 수상에서 계면활성 역할로 안정화된 리포솜 나노입자의 평균 입경은 20 ~ 100 nm, 바람직하게는 20 ~ 30 nm인 것이다. 지질나노입자의 평균 입경이 상기 범위를 초과하는 경우 입자가 너무 커서 피부에 흡수가 어려우며, 수용액에서 안정성이 급격히 저하된다. 상기 범위 미만이 경우에는 나노입자 내에 미용성분의 로딩양(drug payload)이 불충분하다.

이하, 미용성분을 봉입하고 표면이 리포솜 나노입자의 제조방법을 단계별로 설명한다.

(A-1) 단계에서는 포스파티딜콜린, 이온성 인지질 및 스테롤류을 40 ~ 70 : 5 ~ 20 : 10 ~ 40의 중량비로 혼합하여 지질을 제조한다. 이때 사용되는 포스파티딜콜린이 상기 범위 미만일 경우 지질나노입자의 형성이 용이하지 않고, 초과할 경우에는 지질나노입자의 안정성이 감소한다. 음이온성 인지질의 함량이 상기 하한을 벗어나는 경우에는 지질나노입자에 지질나노입자 자체 크기 증가, 지질나노입자 간의 뭉침 현상 등의 문제가 있고, 상기 상한을 벗어나는 경우에는 지질나노입자와 간의 뭉침 현상으로 인한 입자크기의 증가 문제가 있다. 또한, 콜레스테롤의 함량이 상기 하한을 벗어나는 경우에는 약물의 봉입효율이 감소하는 문제가 있고, 상기 상한을 벗어나는 경우에는 지질나노입자의 안정성이 감소되는 문제가 있다. 또한, 스테롤류는 중량비가 증가할수록 약물의 봉입율은 증가하나 상기 범위 이상에서는 입자의 크기가 증가하여 상기 범위에서 제조하는 것이 바람직하다.

(A-2) 단계에서는 약물을 탄소수 1 ~ 6의 직쇄형 또는 분지형 알코올에 용해시켜 약물 용액을 제조한다. 상기 탄소수 1 ~ 6의 직쇄형 또는 분지형 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소부탄올, 이소프로판올 등이 있다. 상기 알코올에 약물을 0.1 ~ 1 ㎎/㎖로 용해시키는 것이 바람직하다. 암포테리신 B의 농도가 상기 하한을 벗어나는 경우에는 약물 봉입농도가 저하되고, 상기 상한을 벗어나는 경우에는 약물이 알코올에 완전히 용해되지 않는 문제가 있다. 또한, 약물을 상기 알코올이 아닌 디메틸술폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF) 등과 같은 다른 유기용매를 사용하는 경우에는 용매의 제거가 용이하지 않고 생체적합성이 감소되는 문제점이 있다.

(A-3) 단계에서는 상기 (A-1)의 지질 혼합용액 및 (A-2)의 약물 용액을 1:1 ~ 1:9의 부피비로 혼합하여 지질-약물 혼합용액을 제조한다. 상기 (A-1) 용액의 비율이 50 (v/v)%를 초과할 경우 약물의 농도가 감소하는 문제가 있고, 10 (v/v)% 미만일 경우에는 인지질의 양이 지나치게 감소하여 제형 형성에 어려움이 있다.

(A-4) 단계에서는 상기 (A-3)의 혼합용액을 수상에서 2:1 ~ 1:10의 부피비가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1:1 ~ 1:3의 부피비로 분산시켜 지질나노입자를 형성시킨다. 상기 수상으로는 증류수, 인산염 완충용액, 살린 용액, 슈크로스 용액, 말토즈 용액 및 마니톨 용액 등의 당용액, 완충용액 또는 등장액을 사용할 수 있다. 상기 수상이 상기 부피 비 범위보다 적을 경우 분산되었던 지질나노입자 입자가 응집하여 최종 지질나노입자의 입자크기가 증가하며, 수상이 상기 부피 비를 초과할 경우에는 용액이 희석되어 불필요한 농축과정이 추가되어야 할 경우가 있다. 또한, 지질나노입자의 형성을 위하여 팁 소니케이션(tip sonication)에서 1 ~ 5 ㎖/min 속도로 주사기를 이용하여 (A-3) 단계의 지질-약물 혼합용액을 물에 분산시키는 것이 바람직하다. 분산속도가 상기 범위를 초과하는 경우에는 입자의 크기가 증가되고 상기범위 미만이라 하더라도 일정 크기 이하의 입자형성에는 어려움이 있기 때문에 상기 범위의 분산속도가 바람직하다.

(A-5) 단계에서는 상기 (A-4)의 지질나노입자 용액을 20 ~ 50 ℃에서 감압 증류하여 유기용매를 제거하고, 여과하여 균일한 크기의 약물을 봉입한 PEG 작용기를 갖는 지질나노입자를 제조한다. 상기 감압 증류할 때의 온도가 20 ℃ 미만일 경우 제거시간이 증가하고 유기용매의 완벽한 제거가 어려우며, 50 ℃를 초과하는 경우에는 형성된 지질나노입자의 파괴 및 약물이 변성될 수 있기 때문에 상기의 온도를 유지하는 것이 바람직하다. 또한, 유기용매의 완벽한 제거를 위하여 상기 감압 증류 시 상기 유기용매와 함께 유기용매 부피의 0.5 ~ 5배의 물을 제거하는 것이 바람직하다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 지용성 성분을 소수성이 강한 콜레스테롤이 감싸게 하고 콜레스테롤과 친화성이 좋은 인지질이 계면활성 역할을 하게 되어 안정한 리포솜 나노입자가 제조 된다. 나노입자 표면에 인지질의 친수성 인산기가 배열하게 되어 수용성 용액에 잘 분산되어 안정화 되는 특징을 갖는 기술로서 화장품의 난용성 물질 가용화로 피부 노화 방지에 효과가 있는 누에오일, 레티올, 등을 생체 친화성이 우수한 리포솜 나노입자에 봉입하여 수상에서 난용성 물질의 용해성을 증가시키고, 봉입효율을 증가시키므로서, 피부에 흡수를 촉진하고 미용 성분의 전달을 향상시킬 수 있는 생체 친화성이 우수한 리포솜 나노입자 및 이의 제조방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

도 1은 실시예7에서 산출되어진 Cryo-TEM 사진 및 개념도를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예1과 실시예7에서 산출되어진 피부투과도에 대한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1-6

수소화디스테아로일포스파티딜콜린(HSPC),디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 및 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 중에서 선택되는 어느 하나의 포스파티딜콜린(PC) 60 ㎎과 콜레스테롤(CHOL) 20 ㎎을 2 ㎖의 클로로포름에 용해하여 지질 혼합용액으로 제조하였다.

누에오일 또는 레티올은 메탄올에 0.5 mg/㎖ 농도로 용해하고 상기 지질 혼합용액 2 ㎖와 누에오일 용액 8 ㎖를 혼합하여, 누에오일-지질 혼합용액 용액 10 ㎖를 제조하였다.

상기 누에오일 또는 레티올-지질 혼합용액 10 ㎖을 주사기를 이용하여 팁 소니케이션하면서 2 ㎖/min의 속도로 20 ㎖의 증류수에 분산시켜 지질나노입자를 형성한 후, 갑압증류기를 이용하여 35 ℃에서 용액의 총량이 10 ㎖가 될 때까지 유기용매 10 ㎖와 증류수 10 ㎖을 제거하고, 압출기를 이용하여 0.2 ㎛ 반투막을 통과시켜 입자의 크기분포를 균일화한다.

상기 과정으로 제조한 지질나노입자의 입자크기 및 표면전하는 입자분석기(Electrophoretic light scattering spectrophotometer, ELS-8000, Osuka Electronics, Japan)로 측정하여 다음 표 1에 나타내었다.

또한, 봉입효율은 HPLC를 이용하여 최대 흡수파장 260 nm에서 측정하여, 하기 수학식 1에 의하여 계산하였다. 봉입 효율은 하기 표 2에 함께 나타내었다.

상기 화학식 1에서, 여기서 C _f 는 클로로포름 : 메탄올 (8 : 2)(부피비)로 리포솜을 용해시킨 후의 약물 농도이고 C _i 는 초기에 첨가한 약물의 농도이다.

	성분	인지질	입자크기 (nm)	표면전하 (mV)	봉입효율 (%)
실시예1	누에오일	HSPC	55	4.5	75
실시예2	누에오일	DPPC	62	11.2	78
실시예3	누에오일	DSPC	88	8.3	66
실시예4	레티올	HSPC	65	3.8	71
실시예5	레티올	DPPC	77	8.7	76
실시예6	레티올	DSPC	84	6.9	69

한편, 유효성분으로 상기 누에오일 및 레티놀 대신에 비교약물인 멜라토닌(비교예 1) 및 베타히스틴(비교예 2)을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 제조하여 실험한 결과 봉입효율이 실시예 1~6에는 미치지 못하는 것으로 확인되었다(비교예 1: 32%, 비교예 2: 37%).

제조예 7-10: 음이온성 인지질이 함유된 지질나노입자의 제조

상기 제조예 1과 같은 방법으로 지질나노입자를 제조함에 있어 지질나노입자 입자의 크기가 보다 바람직하게 50 nm 이하이면서 시료 3의 봉입율을 90% 이상으로 증가시키기 위하여 음이온성 인지질인 디팔미토일글리세로포스페이트(DPPA)과 디스테로일글리세로포스포글리세롤(DSPG)을 각각 첨가하여 음이온성 지질나노입자를 제조하였다.

DPPA와 DSPG의 함량 변화에 따른 지질나노입자의 입자 크기의 변화와 제타 포텐셜(zeta potential) 및 봉입효율을 측정하여 다음 표 2에 각각 나타내었다.

	성분	인지질	입자크기 (nm)	표면전하 (mV)	봉입효율 (%)
실시예7	누에오일	HSPC/DPPA	35	- 42	91
실시예8	누에오일	HSPC/DPPG	42	- 55	94
실시예9	레티올	HSPC/DPPA	43	- 38	91
실시예10	레티올	HSPC/DPPG	53	- 61	95

시험예 1: 나노입자 안정성 실험

장기안정성 평가를 위한 입자사이즈 측정하기 위하여 본 발명에 따른 실시예 7 및 9에서 제조한 리포솜 나노입자의 시간에 따라 침전, 뭉침으로 인한 입자크기의 변화

평가하기 위하여, 제조한 나노입자를 각각 실온(25℃) 및 40℃에 두고 시간에 따른 입자사이즈를 입자분석기(Electrophoretic light scattering spectrophotometer, ELS-8000, Osuka Electronics, Japan)로 측정하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

실온(25℃)	성분	1개월	2개월	3개월	4개월	5개월	6개월
실시예1	누에오일	57	61	65	71	침전
실시예4	레티올	63	68	82	88	침전/변색
실시예7	누에오일	35	36	41	38	43	46
실시예9	레티올	43	48	45	49	51	55
실온(40℃)	성분	1개월	2개월	3개월	4개월	5개월	6개월
실시예1	누에오일	55	64	69	침전
실시예4	레티올	64	77	침전/변색
실시예7	누에오일	39	36	44	45	48	51
실시예9	레티올	46	49	55	53	58	59

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 항산화제를 포함하지 않는 실시예 1과 실시예 4의 경우 외부 조건에 의해 입자 사이즈가 변화하며 변색되는 것으로 나타나 장기안정성이 우수하지 못한 것으로 나타났으나, 음이온성 리포솜를 포함하는 실시예 7과 실시예 9의 경우 외부 조건에 의한 입자사이즈 변화가 거의 발생하지 않고 변색이 일어나지 않은 것으로 나타나 장기안정성이 매우 우수한 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 주름개선 유효물질이 봉입된 나노입자는 음이온성 인지질를 포함하는 것이 바람직함을 알 수 있다.

시험예 2: 경피투과 시험

경피투과실험을 위해 프렌치 셀을 사용하였으며 리셉터셀에 투과 액으로 1% SDS PBS를 사용했으며 피부투과장치 수용 칸(receptor chamber)에 투과 액 12.5ml을 채운 뒤 수용 칸과 공여 칸(donor chamber) 사이에 Strat-Mⓡ Membrane (Size 25mm)를 각질층(stratum corneum)이 위로 위치하도록 하여 피부투과장치에 고정한다.

생체 외 피부흡수시험 가이드라인에 고시된 바와 같이 장치 중 투과 액의 온도는 32±1℃ , RPM은 600으로 일정하게 유지했다.

준비가 끝난 피부투과장치 공여 칸에 투과를 목적으로 하는 물질인 실시예1과 실시예7을 각각 1ml넣어 Strat-Mⓡ Membrane이 흥건하게 젖을 수 있도록 한다.

투과 후 2h, 6h, 12h, 24h 후 1ml 주사기를 이용하여 샘플링 후 GC 분석을 통해 시간 별 투과 액 속의 Alpha-Linolenic Acid의 함량을 분석하였다.

결과로서 실시예7의 경우 실시예1보다 투과량이 높았는데 이는 입자의 크기, 표면전하와 입자의 안정성에 기인한 결과로 평가된다.

Claims

인지질 및 스테롤류 지질을 포함하고, 피부 노화방지 성분이 봉입된 것을 특징으로 하는 음이온성 지질나노입자.
제1항에 있어서, 상기 인지질은 (i) 지질나노입자를 형성하기 위한 인지질 및 (ii) 음이온성 인지질을 포함하고,
상기 (i) 지질나노입자를 형성하기 위한 인지질은 소수성기의 탄소수가 16 ~ 18인 알킬사슬을 가지는 인지질이고, 상기 (ii) 음이온성 인지질은 소수성기의 탄소수 14 ~ 18의 알킬사슬을 갖는 포스파티딜산인 것을 특징으로 하는 음이온성 지질나노입자.
제2항에 있어서, 상기 소수성기의 탄소수 14 ~ 18의 알킬사슬을 갖는 포스파티딜산은 디미리스틸글리세로포스페이트(DMPA), 디팔미토일글리세로포스페이트(DPPA), 디미리스틸글리세로포스페이트(DMPG), 디스테로일글리세로포스페이트(DSPA), 디스테로일글리세로포스포글리세롤(DSPG), 디팔미토일글리세로포스포라글리세롤(DPPG), 디미리스틸글리세로포스포세린(DMPS), 디팔미토일글리세로포스포세린(DPPS) 및 디스테로일글리세로포스포세린(DSPS) 중에서 선택된 1종 이상이고,
상기 탄소수가 16 ~ 18인 알킬사슬을 가지는 인지질은 수소화포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린 및 보바인 인지질 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 음이온성 지질나노입자.
제2항에 있어서, 상기 음이온성 인지질은 지질나노입자를 형성하는 전체 지질 조성에 대하여 5 ~ 20 중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 음이온성 지질나노입자.
제1항에 있어서, 상기 피부 노화방지 성분은 누에오일, α-리포산(α-lipoic acid), α-토코페롤(α-Tocopherol), 레티놀(Retinol), 글루타치온(Glutathione), 부틸화 히드록시 톨루엔(Butylatedhydroxy toluene), 제니스테인(Genistein), 쿼세틴(Quercetin), 프로필 갈레이트(Propyl gallate), 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate), 갈로카테킨 갈레이트(Gallocatechin gallate), 실리빈(Silybin), 디오스메틴(Diosmetin), 32-20캠퍼롤(Kaempferol), 에피카테킨(Epicatechin) 및 갈란긴(Galangin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 음이온성 지질나노입자.
(1) 포스파티딜콜린, 음이온성 인지질 및 스테롤류를 40 ~ 70 : 5 ~ 20 : 10 ~ 40의 중량비로 혼합하여 제조된 지질 100 중량부 혼합용액을 제조하는 단계;
(2) 피부 노화방지 성분인 약물을 탄소수 1 ~ 6의 직쇄형 또는 분지형 알코올에 용해시켜 약물 용액을 제조하는 단계;
(3) 상기 (1)의 지질 혼합용액 및 (2)의 약물 용액을 1:1 ~ 1:9의 부피비로 혼합하여 지질-약물 혼합용액을 제조하는 단계;
(4) 상기 (3)의 혼합용액을 수상에서 2:1 ~ 1:10의 부피비로 분산시켜 지질나노입자를 형성시키는 단계; 및
(5) 상기 (4)의 지질나노입자 용액을 20 ~ 50 ℃에서 감압 증류하여 유기용매를 제거하고, 여과하여 균일한 크기의 약물을 봉입한 음이온성 지질나노입자를 제조하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물이 봉입된 음이온성 지질나노입자의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 (2) 단계에서 피부 노화방지 성분을 탄소수 1 ~ 6의 직쇄형 또는 분지형 알코올에 0.1 ~ 1 ㎎/㎖ 농도로 용해시키는 것을 특징으로 하는 음이온성 지질나노입자의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 (4) 단계에서 팁 소니케이션(tip sonication)을 사용하여 1 ~ 5 ㎖/min 속도로 주사기를 이용하여 (3) 단계의 혼합용액을 분산시키는 것을 특징으로 하는 음이온성 지질나노입자의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 (5) 단계에서 상기 유기용매와 함께 유기용매 부피의 0.5 ~ 5배의 물을 제거하는 것을 특징으로 하는 음이온성 지질나노입자의 제조방법.