KR20210033994A - 신규한 인터루킨-15 (ｉｌ-15) 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 인터루킨-15 (ｉｌ-15) 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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KR20210033994A
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큐진 인크.
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Abstract

본 개시는 암 및 다른 장애의 처치에 사용하기 위한 신규한 및 개선된 IL-15 융합 단백질을 제공한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 2개의 기능성 도메인: IL-15/IL-15RαSushi 도메인(또한 본원에서 "IL-15/IL-15RαSushi 복합체"로서 지칭됨) 및 Fc 도메인을 가지며, 이들 각각은 상이한 형태를 취하고, IL-15가 Fc 도메인의 C-말단에 융합되고 IL-15RαSushi와 공-발현 및 비-공유적으로 복합체화되도록 구성된다. 중요하게는, 본 발명의 융합 단백질은 현재까지 평가되는 IL-15 치료제로 관측되는 수 개의 제한을 처리하며; 구체적으로, 융합 단백질은 생체내에서 IL-15의 연장된 반감기를 입증하고, IL-15 또는 관련된 사이토카인 치료제와 비교하여 우월한 전임상 활성을 입증한다.

Description

신규한 인터루킨-15 (ＩＬ-15) 융합 단백질 및 이의 용도
관련된 특허 출원
본 출원은 본원에 전체적으로 참조로 통합되는 2018년 6월 22일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/689,051호의 이익을 주장한다.
암은 전통적으로 화학요법, 방사선, 표적 요법 및 수술에 의해 치료되어 온 반면에, 암 치료의 제5 기둥(pillar)인 면역요법은 지난 10년에 걸쳐 부상하였고 암에 대한 전쟁에서 혁신을 일으켰다. 면역요법 약물에 대한 벤치마크(benchmark)는 T 세포 관문(CTLA-4 및 PD-1/PD-L1) 억제제의 개발에 의해 확립되었다. 이러한 요법은 특정 암을 갖는 환자에서 최대 50%의 객관적 반응률을 초래하는 종양-특이적 T 세포의 폴을 효과적으로 확장 및 재활성화시키는 것으로 입증되었다.
최근에, 사이토카인의 4개의 α-나선 다발 계열의 멤버인 인터루킨-15 (IL-15)는 암의 치료를 위한 후보 면역조절제로서 부상하였다. IL-15는 항원-제시 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포 상에서 발현되는, IL-15Rα인, 그것의 특이적 수용체에 결합하고, 신호전달을 개시하기 위해, T 및 NK(natural killer) 세포를 포함하는, 응답 세포 상에서 IL-15Rβ 및 공통 사이토카인 수용체
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사슬
Figure pct00002
로 구성되는 헤테로이량체성 수용체 복합체를 트랜스-활성화시킨다. IL-15는 광범위한 활성을 나타내고 T, B 및 NK(natural killer) 세포의 분화 및 증식을 유도한다. 그것은 또한 CD8+ T 세포의 세포용해 활성을 향상시키고 장기-지속되는 항원-경험 CD8+CD44hi 기억 T 세포를 유도한다. IL-15는 B 세포에 의해 분화 및 면역글로불린 합성을 자극하고 수지상 세포의 성숙을 유도한다. 그것은 면역억제 T 조절 세포(Treg)를 자극하지 않는다. 이와 같이, L-15 활성을 신장시키는 것은 선천적 및 적응적 면역성을 향상시키고 종양과 싸울 수 있어서, 그것을 항암 치료를 위한 유망한 제제로 만들 수 있다는 가설이 제기되었다(Steel 등의, Trends in Pharmacological Sciences, 33(1):35-41, 2012).
전이성 악성 흑색종을 갖는 환자에서 재조합 인간 IL-15의 정맥내 주입의 인간 최초 I 단계 임상시험에서, IL-15는 전이성 악성종양을 갖는 환자에 안전하게 투여될 수 있었고 IL-15 투여는 NK 세포 및
Figure pct00003
세포가 가장 극적으로 영향을 받은 다음에, CD8 기억 T 세포가 이어진 채, 혈액에서 림프구 서브세트의 항상성을 현저하게 변경시켰다고 보고되었다(Conlon 등, J Clin Oncol., 33(1), 74-82).
면역 반응을 증강시키는 암 면역요법으로서 IL-15를 사용하는 이러한 새로운 진전에도 불구하고, 치료법으로서 IL-15의 효과적인 사용에 대한 제한들이 여전히 잔존한다. 예를 들어, IL-15는 1) 그것의 생체내 항종양 효과를 방해하는 낮은 생체이용율 및 2) 독성을 야기하는, 치료 관련 노출을 달성하기 위한 고용량의 투여를 위한 요건을 야기하는 짧은 반감기(<40분)를 갖는다. 게다가, IL-15는 표준 포유동물 세포 시스템에서 불량한 발현 수준을 갖는 것으로 이해된다.
암의 치료를 위한 매우 효과적이고 안전한 신규한 치료법을 제공하기 위한 중요한 필요성이 남아 있다.
일 양태에서, 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 신규하고 개선된 IL-15 융합 단백질을 제공한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 2개의 기능성 도메인: IL-15/IL-15수용체α(IL-15Rα) 구성요소(또한 본원에서 "IL-15/IL-15Rα 복합체로서 지칭됨") 및 Fc 도메인을 가지며, 이들 각각은 상이한 형태를 취할 수 있다. 다양한 구현예에서, 융합 단백질은 IL-15가 Fc 도메인의 C-말단 또는 Fc 도메인의 N-말단에 융합되고 IL-15Rα 도메인과 공-발현되고 비-공유적으로 복합체화되도록 구성된다(도 1b 및 1c 참조).
다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15 융합 단백질은 IL-15/IL-15Rα 복합체를 포함하며 여기서 IL-15 도메인은 서열번호: 2에 제시되는 바와 같은 성숙한 인간 IL-15 폴리펩타이드(또한 본원에서 huIL-15 또는 IL-15 야생형(wt)으로 언급됨)의 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, IL-15 도메인은 서열번호: 2에 제시되는 바와 같은 성숙한 인간 IL-15 폴리펩타이드의 서열로부터 유도되는 서열을 포함하는 IL-15 변이체(또는 돌연변이체)일 것이다. IL-15의 변이체(또는 돌연변이체)는 본원에서 고유(native) 아미노산, 성숙한 서열 내의 그것의 위치 및 변이체 아미노산을 사용하여 지칭된다. 예를 들어, huIL-15 "S58D"는 서열번호: 2의 위치 58에서 S의 D로의 치환을 포함하는 인간 IL-15를 지칭한다. 다양한 구현예에서, IL-15 변이체는 예를 들어, 고유 IL-15 폴리펩타이드와 비교하여 IL-15Rβ에 대한 증가된 결합 활성 및 증가된 기능적 활성에 의해 입증되는 바와 같이 IL-15 슈퍼-작용제로서 기능한다. 다양한 구현예에서, IL-15 변이체는 예를 들어, 고유 IL-15 폴리펩타이드와 비교하여 기능적 활성은 없지만 IL-15Rβ에 대한 결합 활성에 의해 입증되는 바와 같이 IL-15 길항제로서 기능한다. 다양한 구현예에서, IL-15 변이체는 고유 IL-15 폴리펩타이드와 비교하여
Figure pct00004
수용체에 대한 증가된 결합 친화도 또는 감소된 결합 활성을 갖는다. 다양한 구현예에서, IL-15 변이체의 서열은 고유 IL-15 서열과 비교하여 적어도 하나의(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의) 아미노산 변화를 갖는다. 아미노산 변화는 IL-15Rβ 및/또는
Figure pct00005
및/또는
Figure pct00006
와 상호작용하는 IL-15의 도메인에서 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 아미노산 변화는 서열번호: 2의 위치 30, 31, 32, 58, 62, 63, 67, 68, 또는 108에서 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실이다. 다양한 구현예에서, 아미노산 변화는 성숙한 인간 IL-15 서열의 위치 30에서 D의 T로의 치환, 위치 31에서 V의 Y로의 치환, 위치 32에서 H의 E로의 치환, 위치 58에서 S의 D로의 치환, 위치 62에서 T의 D로의 치환, 위치 63에서 V의 F로의 치환, 위치 67에서 I의 V로의 치환, 위치 68에서 I의 F 또는 H 또는 D 또는 K로의 치환, 또는 위치 108에서 Q의 A 또는 M 또는 S로의 치환이거나, 이들 치환의 임의의 조합이다. 다양한 구현예에서, 아미노산 변화는 성숙한 인간 IL-15 서열의 위치 58에서 S의 D로의 치환이다. 다양한 구현예에서, IL-15 폴리펩타이드는 서열번호: 2의 S58D 돌연변이를 포함하는 IL-15 변이체를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15 융합 단백질은 IL-15/IL-15Rα 복합체를 포함하며 여기서 IL-15Rα는 IL-15RαSushi 도메인(서열번호: 5) 또는 IL-15Rα 세포외 도메인(서열번호: 4) 또는 IL-15Rα의 임의의 결합 기능성 도메인을 포함한다. 다양한 구현예에서, IL-15Rα 도메인은 서열번호: 4에 제시되는 서열에 대해 적어도 90%인 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, IL-15Rα 도메인은 서열번호: 4에 제시되는 서열에 대해 적어도 95%인 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, IL-15Rα 도메인은 서열번호: 5에 제시되는 서열에 대해 적어도 90%인 서열을 포함하는 IL-15RαSushi 도메인이다. 다양한 구현예에서, IL-15RαSushi 도메인은 서열번호: 5에 제시되는 서열에 대해 적어도 95%인 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15 융합 단백질은 IL-15/IL-15RαSushi 복합체 및 적어도 하나의 이종성 단백질을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15 융합 단백질은 IL-15/IL-15Rα 복합체를 포함하며 여기서 IL-15는 이종성 단백질의 C-말단, 또는 N-말단에 융합된다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15 융합 단백질은 IL-15/IL-15Rα-이종성 단백질 복합체를 이량체성 또는 단량체성 형식으로 함유한다.
다양한 구현예에서, 이종성 단백질은 Fc 도메인(또는 그 기능성 단편)이다. 다양한 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인, 인간 IgG2 Fc 도메인, 인간 IgG3 Fc 도메인, 인간 IgG4 Fc 도메인, IgA Fc 도메인, IgD Fc 도메인, IgE Fc 도메인, IgG Fc 도메인 및 IgM Fc 도메인; 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예에서, Fc 도메인은 변경된 보체 또는 Fc 수용체 결합 특성을 갖는 Fc 도메인을 야기하는 아미노산 변화를 포함한다. 변경된 보체 또는 Fc 수용체 결합 특성을 갖는 Fc 도메인을 생성하는 아미노산 변화는 당해 기술에 알려져 있다. 다양한 구현예에서, 이량체성 IL-15/IL-15Ra 복합체-Fc 융합 단백질을 제조하기 위해 사용되는 Fc 도메인 서열은 서열번호: 6에 제시되는 인간 IgG1-Fc 도메인 서열이다. 서열번호: 6은
Figure pct00007
및
Figure pct00008
결합을 제거하는 아미노산 치환을 함유한다. 다양한 구현예에서, 1가 IL-15/IL-15Ra 복합체-Fc 융합 단백질을 제조하기 위해 사용되는 헤테로이량체성 Fc 도메인 서열은 서열번호: 7에 제시되는 Knob-Fc 도메인 서열이다. 서열번호: 7은
Figure pct00009
및
Figure pct00010
결합을 제거하는 아미노산 치환을 함유한다. 다양한 구현예에서, 1가 IL-15/IL-15Ra 복합체-Fc 융합 단백질을 제조하기 위해 사용되는 헤테로이량체성 Fc 도메인 서열은 서열번호: 8에 제시되는 Hole-Fc 도메인 서열이다. 서열번호: 8은
Figure pct00011
및
Figure pct00012
결합을 제거하는 아미노산 치환을 함유한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15 융합 단백질은 IL-15/IL-15Rα 복합체를 포함하고 이종성 단백질은 반감기 연장을 위한 전장 비-결합 Ab이거나 표적화, 다기능, 및 반감기 연장을 위해 사용되는 특이적 항체 또는 단편이다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15 융합 단백질은 IL-15/IL-15Rα 복합체를 포함하고 이종성 단백질은 전장 IgG 또는 항체 단편 형식(단일특이적 또는 이중특이적)의 Ab이고 IL-15/IL-15RαSushi 복합체와 함께 부가 또는 상승 효과를 제공한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15 융합 단백질은 IL-15/IL-15Rα 복합체를 포함하고 이종성 단백질은 조직- 또는 종양-특이적 표적화를 제공하여 IL-15 국소 농도 및 침투를 종양 미세환경으로 증가시키고 종양 세포-사멸 효능을 증가시키고 전신 독성을 감소시킨다.
다양한 구현예에서, 이종성 단백질은 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 IL-15/IL-15RαSushi 복합체의 IL-15 폴리펩타이드(또는 그 기능성 단편)에 공유적으로 링크된다. 다양한 구현예에서, 링커는 상대적으로 이차 구조가 없는 5, 10, 15, 20, 30, 40 이상의 아미노산 사이의 인공 서열일 수 있다. 다양한 구현예에서, 링커는 G/S 함량이 풍부하다(예를 들어, 링커 내의 아미노산의 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 G 또는 S임). 다양한 구현예에서, 링커는 서열번호: 9-12에 제시되는 서열의 그룹으로부터 선택된다. 각각의 펩타이드 링커 서열은 독립적으로 선택될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 약제학적으로 허용가능한 담체를 갖는 혼합물에 본 발명의 단리된 IL-15 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 암 또는 암 전이를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 본 발명의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다. 다양한 구현예에서, 암은 췌장 암, 위암, 간암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 흑색종, 백혈병, 골수이형성 증후군, 폐암, 전립선암, 뇌암, 방광암, 두경부 암, 또는 횡문근육종으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 암 또는 암 전이를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 본 발명의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 제2 요법과 결합하여 투여하는 단계를 포함한다: 세포독성 화학요법, 면역요법, 소분자 키나제 억제제 표적 요법, 수술, 방사선 요법, 줄기 세포 이식, CAR-T 세포, CAR-NK 세포, iPS-유도 NK 세포, iPS-유도 CAR-NK 세포, iPS-유도 T 세포, iPS-유도 CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포를 포함하는 세포 요법, 및 백신 예컨대 바실리 칼메트-구에린(Bacille Calmette-Guerine; BCG). 다양한 구현예에서, 병용 요법은, 비제한적으로, 특이적 종양 항원에 대한 고갈성(depleting) 항체를 사용하는 치료; 항체-약물 콘주게이트를 사용하는 치료; 공-자극 또는 공-억제 분자(면역 관문) 예컨대 CD276, CD272, CTLA-4, PD-1, PD-L1, CD40, SIRPa, CD47, OX-40, CD137, GITR, LAG3, ICOS, CD27, 4-1BB, TIM-3, B7-H4, Siglec 7, Siglec 8, Siglec 9, Siglec 15 및 VISTA에 대한 작용적, 길항적, 또는 차단적 항체를 사용하는 치료; 이중특이적 T 세포 결합 항체(BiTE®) 예컨대 블리나투모맙을 사용하는 치료: 생물학적 반응 조절제 예컨대 IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-21, G-CSF, GM-CSF, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ의 투여를 수반하는 치료; 치료적 백신 예컨대 시푸류셀-T를 사용하는 치료; 수지상 세포 백신, 또는 종양 항원 펩타이드 백신를 사용하는 치료; 키메라 항원 수용체 (CAR)-T 세포를 사용하는 치료; CAR-NK 세포를 사용하는 치료; 종양 침윤성 림프구(tumor infiltrating lymphocytes; TILs)를 사용하는 치료; 입양 전달 항종양 T 세포(생체외 확장 및/또는 TCR 형질전환 T-세포)를 사용하는 치료; TALL-104 세포를 사용하는 치료; 면역자극 제제 예컨대 톨-유사 수용체(Toll-like receptor; TLR) 제제 예컨대 TLR4, TLR7, TLR8, TLR9 작용제 CpG 및 이미퀴모드를 사용하는 치료; 및 백신 예컨대 바실리 칼메트-구에린(Bacille Calmette-Guerine; BCG)을 사용하는 치료를 포함하는 면역요법의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있으며; 여기서 병용 요법은 종양 세포의 증가된 효과기 세포 사멸을 제공하며, 즉, 동반상승효과는 공-투여될 때 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질과 면역요법 사이에 존재한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 세포 생존 및 반감기를 지속시키기 위해 시험관내 및 생체내에서 그리고 임의의 입양 전달 NK 및 T 세포 요법 또는 CAR-NK 및 CAR-T 요법과 조합으로 NK 세포 및 T 세포를 확장 및 재개시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 바이러스성 감염을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 본 발명의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 암의 치료를 위한 약제의 조제를 위해 IL-15 융합 단백질의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 바이러스성 감염의 치료를 위한 약제의 조제를 위해 IL-15 융합 단백질의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 IL-15 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 다양한 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 본원에 설명되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 본원에 설명되는 적어도 하나의 이종성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다. 다양한 구현예에서, 핵산 분자는 본원에 설명되는 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다. 다양한 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호: 56-63에 제시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 설명되는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 다양한 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 핵산을 포함하는 단리된 세포를 제공한다. 다양한 구현예에서, 세포는 본 개시의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 또 다른 양태에서, IL-15 융합 단백질을 제조하는 방법은 단백질 또는 폴리펩타이드의 발현을 촉진시키는 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써 제공된다.
본 개시는 암 및 다른 장애의 치료에 사용하기 위한 신규하고 개선된 IL-15 융합 단백질을 제공한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 2개의 기능성 도메인: IL-15/IL-15RαSushi 도메인(또한 본원에서 "IL-15/IL-15RαSushi 복합체"로서 언급됨) 및 Fc 도메인을 가지며, 이 각각은 상이한 형태를 취하고, IL-15가 Fc 도메인의 C-말단 또는 N-말단에 융합되고, IL-15Rα, IL-15RαSushi 또는 IL-15RαECD와 공-발현 및 비-공유적으로 복합체화되도록 구성될 수 있다(도 1 참조).
본 개시는 암 및 다른 장애의 치료에서 사용하기 위한 IL-15 슈퍼-작용제 또는 길항제로서 기능하기 위해 아미노산 치환, 결실, 삽입을 갖는 IL-15 변이체를 제공한다.
본 발명자들은 IL-15 또는 IL-15 융합 단백질의 순환 반감기를 연장시키고/시키거나 그것의 생물학적 활성을 증가시키기 위해, IL-15를 N-말단 또는 C-말단에서 인간 IgG의 Fc 부분에 공유적으로 링크시켜 그것의 신호전달 수용체에 대한 IL-15의 제시(presentation)를 향상시키고 융합 단백질로부터 IL-15의 분해를 방지하고 자유 인간 IL-15의 부작용과 통상적으로 연관되는 자유 IL-15의 피크 혈청 농도를 제한하는 것이 매우 바람직하다는 것을 이해하였다. 본 발명자들은 IL-15에 비-공유결합되는 IL-15Rα 도메인을 함유하는 융합 단백질 복합체를 생성하여 IL-15를 그것의 신호전달 수용체에 보다 자연적으로 제시하는 것이 매우 바람직하다고 더 믿었다. 본 발명의 형식을 사용하여, 본 발명자들은 단백질 발현을 증가시키고, 면역원성을 감소시키고 IL-15 분해를 보호할 수 있다는 것을 입증한다. 본 발명에서 개시되거나 설명되는 다양한 구현예에서, IL-15-IL-15Rα 복합체를 C-말단에 이량체성 형식으로 배치하여 향상된 생물학적 활성, 및 현상성 예컨대 증가된 발현 및 낮은 응집을 달성하는 것이 바람직하다. 중요하게는, 본 발명의 융합 단백질은 현재까지 평가되는 L-15 치료법으로 관측되는 수 개의 제한을 다루며; 구체적으로, 융합 단백질은 생체내에서 IL-15의 연장된 반감기를 입증하고, rIL-15 또는 관련된 사이토카인 치료법과 비교하여 우월한 전임상 활성을 입증한다.
정의
용어들 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 다양한 구현예에서, "펩타이드", "폴리펩타이드", 및 "단백질"은 알파 탄소가 펩타이드 결합을 통해 링크되는 아미노산의 사슬이다. 따라서, 사슬의 일 단부에서의 말단 아미노산(아미노 말단)은 자유 아미노기를 갖는 반면, 사슬의 다른 단부에서의 말단 아미노산(카복시 말단)은 자유 카복시기를 갖는다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노 말단" (약칭 N-말단)은 펩타이드의 아미노 말단에서 아미노산 상의 자유 α-아미노기 또는 펩타이드 내의 임의의 다른 위치에서 아미노산의 α-아미노기(펩타이드 결합에 참여할 때의 아미노기)를 지칭한다. 유사하게, 용어 "카복시 말단"은 펩타이드의 카복시 말단 상의 자유 카복시기 또는 펩타이드 내의 임의의 다른 위치에서 아미노산의 카복시기를 지칭한다. 펩타이드는 또한 아미드 결합과 대조적으로 에테르에 의해 결합되는 아미노산과 같은 펩타이드 모방체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 본질적으로 임의의 폴리아미노산을 포함한다.
본 개시의 폴리펩타이드는 예를 들어, :(1) 단백질분해에 대한 민감성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 민감성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화력을 변경시키고, (4) 결합 친화도를 변경시키고, (5) 다른 물리화학 또는 기능성 특성을 부여하거나 개질시키기 위해 임의의 방식으로 그리고 임의의 이유로 개질된 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환)은 자연 발생 서열에서(예를 들어, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의폴리펩타이드의 일부에서) 이루어질 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 기능적으로 유사한 아미노산을 갖는 아미노산의 폴리펩타이드에서의 치환을 지칭한다. 다음의 6개의 그룹 각각은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌(A), 세린(S), 및 트레오닌(T)
2) 아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)
3) 아스파라긴(N) 및 글루타민(Q)
4) 아르기닌(R) 및 라이신(K)
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 및 발린(V)
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 및 트립토판(W)
"비-보존적　아미노산 치환"은 다른 부류로부터의 멤버에 대해 이러한 부류 중 하나의 멤버의 치환을 지칭한다. 그러한 변화를 일으키는 데 있어서, 다양한 구현예에 따르면, 아미노산의 소수성 인덱스가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 그것의 소수성 및 전하 특성에 기초하여 소수성 인덱스를 할당 받았다. 그들은 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
상호작용의 생물학적 기능을 단백질 상에 수여할 시에 수치요법 아미노산 인덱스의 중요성은 당업계에서 이해되고 있다(예를 들어, Kyte 등의, 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131을 참조). 특정 아미노산은 유사한 소수성 인덱스 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환되고 여전히 유사한 생물학적 활성을 유지할 수 있다는 것이 알려져 있다. 소수성 인덱스에 기초하여 변경할 시에, 다양한 구현예에서, 수치요법 인덱스가 ± 2 내에 있는 아미노산의 치환이 포함된다. 다양한 구현예에서, ±1 내에 있는 것들이 포함되고, 다양한 구현예에서, ± 0.5 내의 것들이 포함된다.
또한, 본원에 개시되는 바와 같이, 이와 같은 아미노산의 치환은 특히 이것에 의해 창작되는 생물학적 기능성 단백질 또는 펩타이드가 면역학적 구현예에서 사용하기 위해 의도되는 경우, 친수성에 기초하여 효과적으로 이루어질 수 있다는 것이 당업계에서 이해되고 있다. 다양한 구현예에서, 단백질의 최대 국소 평균 친수성은, 그것의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배됨에 따라, 그것의 면역원성 및 항원성, 즉, 단백질의 생물학적 특성과 상관된다.
다음의 친수성 값은 이들 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0.+-.1); 글루타메이트(+3.0.+-.1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5.+-.1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5) 및 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성 값에 기초하여 변경할 시에, 다양한 구현예에서, 친수성 값이 ±2 내에 있는 아미노산의 치환이 포함되고, 다양한 구현예에서, ±1 내에 있는 것들이 포함되고, 다양한 구현예에서, ±0.5 내의 것들이 포함된다.
예시적인 아미노산 치환이 표 1에 제시되는다.
Figure pct00013
당업자는 잘-알려진 기술을 사용하여 본원에 제시되는 바와 같은 폴리펩타이드의 적합한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 다양한 구현예에서, 당업자는 활성에 대해 중요하다고 여겨지지 않는 영역을 표적화함으로써 활성을 파괴시키는 것 없이 변화될 수 있는 분자의 적합한 영역을 식별할 수 있다. 다른 구현예에서, 당업자는 유사한 폴리펩타이드 사이에서 보존되는 분자의 잔기 및 일부를 식별할 수 있다. 추가 구현예에서, 생물학적 활성 또는 구조에 대해 중요할 수 있는 영역들도 생물학적 활성을 파괴하는 것 없이 또는 폴리펩타이드 구조에 부정적으로 영향을 미치는 것 없이 보존적 아미노산 치환의 대상일 수 있다.
추가적으로, 당업자는 활성 또는 구조에 대해 중요한 유사한 폴리펩타이드에서 잔기를 식별하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 그러한 비교의 관점에서, 당업자는 유사한 폴리펩타이드의 활성 또는 구조에 대해 중요한 아미노산 잔기에 대응하는 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 당업자는 그러한 예상된 중요한 아미노산 잔기에 대해 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.
당업자는 또한 유사한 폴리펩타이드에서 그러한 구조와 관련하여 3차원 구조 및 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 그러한 정보의 관점에서, 당업자는 그것의 3차원 구조에 대하여 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수 있다. 다양한 구현예에서, 당업자는 그러한 잔기가 다른 분자와의 중요한 상호작용에 수반될 수 있으므로, 폴리펩타이드의 표면 상에 있을 것으로 예상되는 아미노산 잔기에 대한 라디칼 변화를 일으키지 않도록 선택할 수 있다. 또한, 당업자는 각각의 원하는 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험 변이체를 생성할 수 있다. 그 다음, 변이체는 당업자에게 공지된 활성 검정을 사용하여 선별될 수 있다. 그러한 변이체는 적합한 변이체에 대한 정보를 수집하기 위해 사용될 수 있을 것이다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기에 대한 변화가 파괴된, 바람직하지 않게 감소된, 또는 부적합한 활성을 야기한다는 것을 발견하면, 그러한 변화를 갖는 변이체는 회피될 수 있다. 환언하면, 그러한 일상적인 실험으로부터 수집되는 정보에 기초하여, 당업자는 추가적인 치환이 단독으로 또는 다른 돌연변이와 결합하여 회피되어야하는 경우 아미노산을 쉽게 결정할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "폴리펩타이드 단편" 및 "절단된 폴리펩타이드"는 대응하는 전장 단백질과 비교하여 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 결실을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 특정 구현예에서, 단편은 예를 들어, 길이에서 적어도 5, 적어도 10, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900 또는 적어도 1000개의 아미노산일 수 있다. 특정 구현예에서, 단편은 또한 예를 들어, 길이에서 최대 1000, 최대 900, 최대 800, 최대 700, 최대 600, 최대 500, 최대 450, 최대 400, 최대 350, 최대 300, 최대 250, 최대 200, 최대 150, 최대 100, 최대 50, 최대 25, 최대 10, 또는 최대 5개의 아미노산일 수 있다. 단편은 그것의 단부의 둘 중 하나 또는 모두에서, 하나 이상의 추가적인 아미노산, 예를 들어, 상이한 자연 발생 단백질로부터의 아미노산의 서열(예를 들어, Fc 또는 류신 지퍼 도메인) 또는 인공 아미노산 서열(예를 들어, 인공 링커 서열)을 더 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어들 "폴리펩타이드 변이체", "하이브리드 폴리펩타이드" 및 "폴리펩타이드 돌연변이체"는 아미노산 서열을 포험하는 폴리펩타이드를 지칭하며 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기는 다른 폴리펩타이드 서열에 대해 아미노산 서열로 삽입되고/되거나, 이로부터 삭제되고/되거나 이로 치한된다. 특정 구현예에서, 삽입되거나, 삭제되거나, 치환될 아미노산 잔기의 수는 예를 들어, 길이에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 125, 적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 적어도 225, 적어도 250, 적어도 275, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450 또는 적어도 500개의 아미노산일 수 있다. 본 개시의 하이브리드는 융합 단백질을 포함한다.
폴리펩타이드의 "유도체"는 화학적으로 개질된, 예를 들어, 다른 화학적 모이어티(moiety) 예컨대, 예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜, 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민), 인산화, 및 당화에 대한 컨쥬게이션(conjugation)인 폴리펩타이드이다.
용어 "% 서열 동일성"은 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬될 때, 용어 "% 동일성"과 본원에서 교환가능하게 사용되고 2개 이상의 펩타이드 서열 사이의 아미노산 서열 동일성의 수준 또는 2개 이상의 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 서열 동일성의 수준을 지칭한다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 바와 같이, 80% 동일성은 정의된 알고리즘에 의해 결정되는 80% 서열 동일성과 동일한 것을 의미하고 주어진 서열이 또 다른 서열의 또 다른 길이와 적어도 80% 동일하다는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, % 동일성은 예를 들어, 주어진 서열에 대한 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 이상의 서열 동일성으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, % 동일성은 예를 들어, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 95% 내지 약 99%의 범위에 있다.
용어 "% 서열 상동성"은 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬될 때, 용어 "% 상동성"과 본원에서 교환가능하게 사용되고 2 이상의 펩타이드 서열 사이의 아미노산 서열 상동성의 수준 또는 2 이상의 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 서열 상동성의 수준을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 사용되는 바와 같이, 80% 상동성은 정의된 알고리즘에 의해 결정되는 80% 서열 상동성과 동일한 것을 의미하고, 따라서 주어진 서열의 동족체는 주어진 서열의 길이에 대해 80%보다 더 큰 서열 상동성을 갖는다. 특정 구현예에서, % 상동성은 예를 들어, 주어진 서열에 대한 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 이상의 서열 상동성으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, % 상동성은 예를 들어, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 95% 내지 약 99%의 범위에 있다.
2개의 서열 사이의 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 컴퓨터 프로그램은 BLAST 프로그램의 세트, 예를 들어, NCBI 웹사이트의 인터넷 상에서 공공연하게 이용가능한 BLASTN, BLASTX, 및 TBLASTX, BLASTP 및 TBLASTN을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, Altschul 등의 J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990(공개된 디폴트 설정, 즉, 파라미터 w=4, t=17를 특별히 참조함) 및 Altschul 등의 Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997을 참조한다. 서열 검색은 전형적으로 유전자은행 단백질 서열(GenBank Protein Sequence) 및 다른 공공 데이터베이스의 아미노산 서열에 관하여 주어진 아미노산 서열을 평가할 때 BLASTP 프로그램을 사용하여 전형적으로 수행된다. BLASTX 프로그램은 유전자은행 단백질 서열 및 다른 공공 데이터베이스 내의 아미노산 서열에 대해 모든 해독툴에서 번역된 핵산 서열을 검색하기 위해 선호된다. BLASTP 및 BLASTX 둘 다는 11.0의 개방 갭 페널티, 및 1.0의 확장 갭 페널티의 디폴트 파라미터를 사용하여 실행되고, BLOSUM-62 매트릭스를 사용한다. Id 참조.
퍼센트 서열 동일성을 계산하는 것에 더하여, BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성의 통계적인 분석을 수행한다(예를 들어, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787, 1993을 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 척도(measure)는 최소 합계 확률(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생할 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 테스트 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 예를 들어, 약 0.1 미만, 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만인 경우 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "이종성"은 고유(naive)하지 않거나 자연적으로 발견되지 않는, 예를 들어, 기존 자연 조성물 또는 상태를 다른 공급원으로부터 유도되는 것으로 대체함으로써 달성될 수 있는 조성물 또는 상태를 지칭한다. 유사하게, 단백질이 자연적으로 발현되는 유기체 이외의 유기체에서 단백질의 발현은 이종성 발현 시스템 및 이종성 단백질을 구성한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 실질적으로 또는 부분적으로 인코딩되고 종양 항원에 대한 특이성 또는 병리적 상태에서 과발현되는 분자에 대한 특이성을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤(mu) 불변 영역 유전자 뿐만 아니라, 이들 유전자의 아형 및 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄 (Light chains; LC)는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄(Heavy chains; HC)는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로서 분류되며, 이는 결과적으로 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 각각을 정의한다. 전형적인 면역글로불린(예를 들어, 항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 사슬로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "가벼운" 사슬(약 25 kD) 및 하나의 "무거운" 사슬(약 50-70 kD)을 갖는다. 각각의 사슬의 N-말단은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 경쇄의 C-말단 영역을 정의하며, 이는 온전한 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있다. Fc 영역은 나이브 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 선택적으로 CH4 도메인을 포함한다. 항체의 Fc 부분은 수 개의 중요한 효과기 기능 예를 들어 사이토카인 유도, ADCC, 식균작용, 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항원 및 항원-항체 복합체의 반감기/제거율을 매개한다(예를 들어, 신생아 FcR(FcRn)은 엔도좀의 산성 pH에서 IgG의 Fc 영역에 결합하고 IgG를 분해로부터 보호하며, 이것에 의해 IgG의 긴 혈청 반감기에 기여한다). 항체 효과기 기능을 변경시키기 위한 Fc 부분에서의 아미노산 잔기의 대체는 당해 기술에 공지되어 있다(예를 들어, Winter 등의, 미국 특허 번호 제5,648,260호 및 제5,624,821호를 참조).
"폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 단위로 구성되는 중합체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 자연 발생 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산("DNA") 및 리보핵산("RNA") 뿐만 아니라 핵산 유사체를 포함한다. 핵산 유사체는 비-자연 발생 베이스, 자연 발생 포스포디에스테르 결합 이외의 다른 뉴클레오타이드와의 연결기 (linkage)에 관여하는 뉴클레오타이드를 포함하거나 포스포디에스테르 결합 이외의 연결기를 통해 부착되는 베이스를 포함하는 것들을 포함한다. 따라서, 뉴클레오타이드 유사체는 예를 들어 그리고 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로트리에스테르, 포스포르아미데이트, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 펩타이드-핵산(PNA) 등을 포함한다. 그러한 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 자동화 DNA 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 용어 "핵산"은 전형적으로 큰 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 전형적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드를 지칭하며, 일반적으로 약 50 뉴클레오타이드보다 더 크지 않다. 뉴클레오타이드 서열이 DNA 서열(즉, A, T, G, C)에 의해 표현될 때, 이것은 또한 "U"가 "T"를 대체하는 RNA 서열(즉, A, U, G, C)을 포함한다는 것이 이해될 것이다.
종래의 표기법은 폴리뉴클레오타이드 서열을 설명하기 위해 본원에 사용된다: 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 단부는 5'-단부이며; 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 방향은 5'-방향으로 지칭된다. 발생기 RNA 전사체에 대한 뉴클레오타이드의 5' 내지 3' 첨가의 방향은 전사 방향으로 지칭된다. mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥은 "코딩 가닥"으로 지칭되며; 그러한 DNA로부터 전사되는 mRNA와 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 5' 내지 5'-단부에 위치되는 DNA 가닥에 대한 서열은 "업스트림 서열"로 지칭되며; RNA와 동일한 서열을 갖고 코딩 RNA 전사체의 3' 내지 3' 단부인 DNA 가닥에 대한 서열은 "다운스트림 서열"로 지칭된다.
"상보적"은 2개의 폴리뉴클레오타이드의 상호작용 표면과 함께 위상적 상용성 또는 일치성(matching)을 지칭한다. 따라서, 2개의 분자는 상보적으로서 설명될 수 있고, 더욱이, 접촉 표면 특성은 서로에 대해 상보적이다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 제1 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 제2 폴리뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드 결합 파트너의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 동일하거나, 제1 폴리뉴클레오타이드가 엄격한 혼성화 조건 하에서 제2 폴리뉴클레오타이드에 혼성화될 수 있는 경우 제2 폴리뉴클레오타이드에 상보적이다.
"벡터"는 그것에 링크되는 또 다른 핵산을 세포 안으로 도입하기 위해 사용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드이다. 벡터의 하나의 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가적인 핵산 세그먼트가 결찰될 수 있는 선형 또는 원형 이중가닥 DNA 분자를 지칭한다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)이며, 여기서 추가적인 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈 안으로 도입될 수 있다. 특정 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포 (예를 들어, 복제의 박테리아 기원을 포함하는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)에서 자율적 복제를 할 수 있다. 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로 도입 시에 숙주 세포의 게놈안으로 통합되고, 이것에 의해 호스트 게놈과 함께 복제된다. "발현 벡터"는 선택된 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시할 수 있는 벡터의 유형이다.
"조절 서열"은 그것이 작동가능하게 링크되는 핵산의 발현(예를 들어, 발현의 수준, 타이밍, 또는 위치)에 영향을 미치는 핵산이다. 조절 서열은 예를 들어, 조절된 핵산 상에 직접적으로, 또는 하나 이상의 다른 분자(예를 들어, 조절 서열 및/또는 핵산에 결합하는 폴리펩타이드)의 작용을 통해 그것의 효과를 가할 수 있다. 조절 서열의 예는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 조절 서열의 추가 예는 예를 들어, Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. 및 Baron 등의, 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06에서 설명된다. 뉴클레오타이드 서열은 조절 서열이 뉴클레오타이드 서열의 발현(예를 들어, 발현의 수준, 타이밍, 또는 위치)에 영향을 미치는 경우 조절 서열에 "작동가능하게 링크된다".
"숙주 세포"는 본 개시의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위해 사용될 수 있는 세포이다. 숙주 세포는 원핵생물, 예를 들어, 대장균(E. coli)일 수 있거나, 그것은 진핵생물, 예를 들어, 단세포 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 다른 진균), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 랫트 세포, 마우스 세포, 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마일 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 폴리펩타이드-인코딩 핵산으로 형질전환되거나 형질감염될 수 있는 배양 세포이며, 이는 그 다음 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 어구 "재조합 숙주 세포"는 발현될 핵산으로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 숙주 세포는 또한 핵산을 포함하지만 그것이 핵산과 작동가능하게 링크되도록 조절 서열이 숙주 세포 안으로 도입되지 않는 한 원하는 수준에서 그것을 발현시키지 않는 세포일 수 있다. 용어 숙주 세포는 특정 대상 세포를 지칭할 뿐만 아니라 그러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 특정 변형이 예를 들어, 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 다음 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손은 사실상, 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용되는 바와 같은 용어의 범위 내에 포함된다.
용어 "단리된 분자"(여기서 분자는 예를 들어, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드임)는 그것의 기원 또는 유도의 공급원에 의해 (1) 그것의 원상태에서 그것을 동반하는 자연적으로 연관된 구성요소와 연관되지 않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 분자가 실질적으로 없거나 (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연적으로 발생하지 않는 분자이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나, 그것이 자연적으로 기원하는 세포와 상이한 세포 시스템에서 발현되는 분자는 그것의 자연적으로 연관된 구성요소로부터 "단리"될 것이다. 분자는 또한 당해 분야에서 잘 알려진 정제 기술을 사용하는, 단리에 의해 자연적으로 연관된 구성요소가 실질적으로 없도록 렌더링될 수 있다. 분자 순도 또는 균질성은 당해 분야에서 잘 알려진 다수의 수단에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 샘플의 순도는 당해 분야에서 잘 알려진 기술을 사용하여 폴리펩타이드를 시각화하기 위해 겔의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 염색을 사용하여 분석될 수 있다. 특정 목적을 위해, 더 높은 해상도는 정제를 위해 당해 분야에 잘 알려진 HPLC 또는 다른 수단을 사용하여 제공될 수 있다.
단백질 또는 폴리펩타이드는 샘플의 적어도 약 60% 내지 75%가 폴리펩타이드의 단일 종을 나타낼 때 "실질적으로 순수한", "실질적으로 균질한", 또는 "실질적으로 정제된" 것이다. 폴리펩타이드 또는 단백질은 단량체 또는 다량체일 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩타이드 또는 단백질은 전형적으로 단백질 샘플의 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% W/W, 보다 일반적으로 약 95%를 포함할 것이고, 바람직하게는 99% 초과 순도일 것이다. 단백질 순도 또는 균질성은 당해 분야에서 잘 알려진 얼룩으로 겔을 염색 시에 단일 폴리펩타이드 밴드를 시각화하기 전에, 당해 분야에서 잘 알려진 다수의 수단, 예컨대 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 표시될 수 있다. 특정 목적을 위해, 더 높은 해상도는 정제를 위해 당해 분야에 잘 알려진 HPLC 또는 다른 수단을 사용함으로써 제공될 수 있다.
"링커"는 2개의 다른 분자를, 공유적으로, 또는 이온성, 반데르발스 또는 수소 결합을 통해 연결하는 분자, 예를 들어, 5' 단부에서 하나의 상보적 서열 및 3' 단부에서 또 다른 상보적 서열에 혼성화되어, 따라서 2개의 비-상보적 서열을 연결하는 핵산 분자를 지칭한다. "절단가능 링커"는 절단가능 링커에 의해 연결되는 2개의 구성요소를 분리하기 위해 분리되거나 달리 절단될 수 있는 링커를 지칭한다. 절단가능 링커는 일반적으로 효소, 전형적으로 펩티다아제, 프로테아제, 뉴클레아제, 리파제 등에 의해 절단된다. 절단가능 링커는 또한 환경 신호, 예컨대, 예를 들어, 온도, pH, 염 농도 등에서의 변화에 의해 절단될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어들 "표지" 또는 "표지된"은 항체에 또 다른 분자의 편입을 지칭한다. 일 구현예에서, 표지는 검출가능한 마커, 예를 들어, 마킹된 아비딘(예를 들어, 광학 또는 열량측정 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소적 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 바이오티닐 모이어티의 폴리펩타이드에 대한 방사선표지된 아미노산의 편입 또는 부착이다. 다른 구현예에서, 표지 또는 마커는 치료제, 예를 들어, 약물 콘주게이트(conjugate) 또는 독소일 수 있다. 폴리펩타이드 및 당단백질를 표지하는 다양한 방법은 당해 기술에 공지되어 있고 사용될 수 있다. 폴리펩타이드에 대한 표지의 예는, 비제한적으로, 다음을 포함한다: 방사성 동위원소 또는 방사선핵종(예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란탄족 형광체), 효소적 표지(예를 들어, 홀스래디쉬 페록시다아제, β-갈락토시다아제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광 마커, 바이오티닐기, 이차 리포터에 의해 인식되는 예정된 폴리펩타이드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체용 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그), 자기 제제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트, 독소 예컨대 백일해 독소, 탁솔, 사이코칼라신 B, 그라마이시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 그 유사체 또는 동족체. 일부 구현예에서, 표지는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암에 의해 부착된다.
용어 "면역요법"은 특이적 종양 항원에 대한 고갈 항체를 사용하는 치료; 항체-약물 콘주게이트를 사용하는 치료; 공-자극 또는 공-억제 분자(면역 관문) 예컨대 CD276, CD272, CTLA-4, PD-1, PD-L1, CD40, SIRPa, CD47, OX-40, CD137, GITR, LAG3, ICOS, CD27, 4-1BB, TIM-3, B7-H4, Siglec 7, Siglec 8, Siglec 9, Siglec 15, 및 VISTA에 대한 작용적, 길항적, 또는 차단적 항체를 사용하는 치료; 이중특이적 T 세포 결합 항체(BiTE®) 예컨대 블리나투모맙을 사용하는 치료: 생물학적 반응 조절제 예컨대 IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, GM-CSF, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ의 투여를 수반하는 치료; 치료적 백신 예컨대 시푸류셀-T를 사용하는 치료; 수지상 세포 백신, 또는 종양 항원 펩타이드 백신을 사용하는 치료; 키메라 항원 수용체 (CAR)-T 세포를 사용하는 치료; CAR-NK 세포를 사용하는 치료; 종양 침윤 림프구(TIL)를 사용하는 치료; 입양 전달 항종양 T 세포(생체외 확장된 및/또는 TCR 형질전환)를 사용하는 치료; TALL-104 세포를 사용하는 치료; 및 면역자극 제제 예컨대 톨-유사 수용체(Toll-like receptor; TLR) 작용제 CpG 및 이미퀴모드를 사용하는 치료, 그리고 백신 예컨대 BCG를 사용하는 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 암 치료를 지칭하는 반면에, 병용 요법은 종양 세포의 증가된 효과기 세포 사멸을 제공하며, 즉, 동반상승효과는 공-투여될 때 IL-15 작제물과 면역요법 사이에 존재한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 특정 장애, 상태 또는 질환을 치료하기에 충분한 예컨대 그것의 증상 중 하나 이상을 개선하고/하거나, 완화하고/하거나, 줄이고/줄이거나 지연시키기에 충분한 화합물 또는 조성물의 양을 지칭한다. NHL 및 다른 암 또는 다른 원치않는 세포 증식에 관하여, 유효량은: (i) 암 세포의 수를 감소시키고/시키거나; (ii) 종양 크기를 감소시키고/시키거나; (iii) 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 어느 정도까지 억제시키고, 지연시키고, 느리게하고 바람직하게는 정지시키고/시키거나; (iv) 종양 전이를 억제(즉, 어느 정도까지 느리게하고 바람직하게는 정지)시키고/시키거나; (v) 종양 성장을 억제시키거나; (vi) 종양의 발생 및/또는 재발을 방지 또는 지연시키고/시키거나; (vii) 암과 연관되는 증상 중 하나 이상을 어느 정도까지 완화시키기에 충분한 양을 포함한다. 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다.
용어들 "환자," "개인," 및 "대상체"는 교환가능하게 사용되고 포유동물, 바람직하게는 인간 또는 비-인간 영장류 뿐만 아니라, 사육된 포유동물(예를 들어, 갯과 또는 고양이), 실험실 포유동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터, 기니아 피그), 및 농업용 포유동물(예를 들어, 말과, 소과, 돼지, 양)을 지칭할 수 있다. 다양한 구현예에서, 환자는 외래환자, 또는 다른 임상 맥락으로서 병원, 정신과 치료 설비 내의 의사 또는 다른 건강 작업자의 보호 하에 있는 인간(예를 들어, 성인 남성, 성인 여성, 청소년 남성, 청소년 여성, 남성 아동, 여성 아동)일 수 있다. 다양한 구현예에서, 환자는 일차 면역 결핍, AIDS를 갖는 환자; 특정 면역억제 약물을 복용하고 있는 암 및 이식 환자; 및 면역계에 영향을 미치는 선천적 질환(예를 들어, 선천성 무감마글로불린혈증, 선천성 IgA 결핍)을 갖는 환자들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 면역저하된 환자 또는 약화된 면역 시스템을 갖는 환자일 수 있다. 다양한 구현예에서, 환자는 높은 비율의 돌연변이를 갖는 것으로 보고되는 방광암, 폐암, 흑색종, 및 다른 암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 면역원성 암을 갖는다(Lawrence 등의, Nature, 499(7457): 214-218, 2013).
"약제학적 조성물"은 포유동물의 약제학적 용도에 적합한 조성물을 지칭한다. 약제학적 조성물은 약리학적으로 유효한 양의 활성제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. "약리학적으로 유효한 양"은 의도된 약리학적 결과를 생산하기에 효과적인 제제의 그러한 양을 지칭한다. "약제학적으로 허용가능한 담체"는 표준 약제학적 담체, 비히클, 완충액, 및 부형제, 예컨대 포스페이트 완충 식염수 용액, 덱스트로스의 5% 수용액, 및 에멀젼, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제 및/또는 아쥬반트(adjuvant) 중 임의의 것을 지칭한다. 적합한 약제학적 담체 및 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Ed. 2005, Mack Publishing Co, Easton에 설명된다. "약제학적으로 허용가능한 염"은 예를 들어, 금속 염(나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 포함하는 약제학적 용도를 위한 화합물로 제형화될 수 있는 염이다.
어구 "투여하는" 또는 "투여 원인"은 환자에게 문제가 되고 있는 제제(들)/화합물(들)의 투여를 제어하고/하거나 허용하는 의료 전문가(예를 들어, 의사), 또는 환자의 의료 보호를 제어하는 사람에 의해 취해지는 행동을 지칭한다. 투여 원인은 적절한 치료 요법(regimen)의 진단 및/또는 결정, 및/또는 환자에 대한 특정 제제(들)/화합물을 처방하는 것을 수반할 수 있다. 그러한 처방은 예를 들어, 처방전 양식을 기안하고, 의료 기록을 주석화하는 등을 포함할 수 있다. 투여가 본원에 설명되는 경우, "투여 원인"이 또한 고려된다.
"저항성 또는 난치성 암"은 예를 들어, 화학요법, 수술, 방사선 요법, 줄기 세포 이식, 및 면역요법을 포함하는 이전의 항-암 요법에 반응하지 않는 종양 세포 또는 암을 지칭한다. 종양 세포는 치료의 시작에서 저항성 또는 불응성일 수 있거나, 그들은 치료 동안 저항성 또는 불응성이 될 수 있다. 불응성 종양 세포는 치료의 개시에서 반응하지 않거나 짧은 기간 동안 초기에 반응하지만 치료에 반응할 수 없는 종양을 포함한다. 불응성 종양 세포는 또한 항암 요법에 의한 치료에 반응하지만 요법의 후속 라운드에 반응할 수 없는 종양을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 불응성 종양 세포는 또한 항암 요법에 의한 치료에 의해 억제되는 것으로 보이지만 치료가 중단된 후 5년까지, 때때로 10년 이상까지 재발하는 종양을 포함한다. 항암 요법은 화학치료제 단독, 방사선 단독, 표적 요법 단독, 수술 단독, 또는 이들의 조합을 이용할 수 있다. 용이한 설명을 위해 그리고 비제한적으로, 불응성 종양 세포는 저항성 종양과 교환가능하다는 것이 이해될 것이다.
용어들 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 장애 및/또는 그것의 동반 증상 중 적어도 하나를 완화시키거나 폐기시키기 위한 방법을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 질환, 장애 또는 병태를 "경감시키다"는 것은 질환, 장애, 또는 병태의 증상의 중증도 및/또는 발생 빈도를 감소시키는 것을 의미한다. 또한, "치료"에 대한 본원의 언급은 치료적, 완화적 및 예방적 치료에 대한 언급을 포함한다.
본원에 설명되는 본 개시의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예로 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"을 포함한다는 것이 이해된다.
"약"에 대한 언급은 본원의 값 또는 파라미터가 그러한 값 또는 파라미터 자체에 관한 변동을 포함(설명)한다. 예를 들어, "약 X"에 관한 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본원 및 첨부된 청구항들에 설명되는 바와 같이, 단수 형태("a", "or", 및 "the")는 맥락이 달리 명확히 명시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 본원에 설명되는 본 개시의 양태 및 변동은 양태 및 변동으로 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"을 포함한다는 것이 이해된다.
IL-15/IL-15RαSushi 복합체
인터루킨-15(IL-15)는 중화 항-IL-2 항체의 존재에서 IL-2-의존적 CTLL-2 T-세포주의 증식을 자극하는 그것의 능력에 기초하여 2개의 독립적인 그룹에 의해 식별되는 사이토카인이다(Steel 등의, Trends in Pharmacological Sciences, 33(1):35-41, 2012). IL-15 및 인터루킨-2(IL-2)는 그들의 공유 수용체(R) 신호전달 구성요소(
Figure pct00014
)와 일치하는, 시험관내에서 유사한 생물학적 특성을 갖는다. 그러나, IL-15 대 IL-2에 대한 특이성은
Figure pct00015
및
Figure pct00016
이종삼합성 고-친화도 수용체 복합체를 완성하고 그것에 의해 리간드 및 고-친화도 수용체가 발현되는 것에 따라 차별적인 반응성을 허용하는 독특한 개별(private) α-사슬 수용체에 의해 제공된다. 흥미롭게도, IL-15 및 IL-15Rα 전사체 둘 다는 IL-2/IL-2Rα보다 훨씬 더 넓은 조직 분포를 갖는다. 또한, 다중 복합체 전사후 조절 기전은 IL-15 발현을 엄격하게 제어한다. 따라서, IL-15 및 IL-15Rα 발현의 차별적인 패턴뿐만 아니라, 복합체 조절에 기초하여, 이러한 수용체/리간드 쌍의 중요한 생체내 기능은 IL-2 및 IL-2Rα의 그것들과 다를 수 있을 것이다. IL-15의 생물학을 조사하는 현재까지의 연구는 수 개의 주요 비중복 규칙, 예컨대 자연 살해(NK) 세포, NK-T 세포, 및 장 상피내 림프구 발달 및 기능 동안 IL-15의 중요성을 식별하였다. 자가면역 과정 예컨대 류마티스성 관절염 및 악성종양 예컨대 성인 T-세포 백혈병 동안 IL-15에 대한 역할은 IL-15의 조절장애가 숙주에 대해 유해한 효과를 야기할 수 있다는 것을 시사한다(Fehniger 등의, Blood, 97:14-32, 2001).
본원에 사용되는 바와 같이, 용어들 "고유 IL-15" 및 "고유 인터루킨-15"는 단백질 또는 폴리펩타이드의 맥락에서 미성숙한 또는 전구체 및 성숙한 형태를 포함하는 임의의 자연 발생 포유동물 인터루킨-15 아미노산 서열을 지칭한다. 고유 포유동물 인터루킨-15의 다양한 종의 아미노산 서열에 대한 유전자은행 수탁 번호는 NP_000576(인간, 미성숙한 형태), CAA62616(인간, 미성숙한 형태), NP_001009207(펠리스 카투스, 미성숙한 형태), AAB94536(래투스, 미성숙한 형태), AAB41697(래투스, 미성숙한 형태), NP_032383(무스 무스큘러스, 미성숙한 형태), AAR19080(갯과), AAB60398(붉은털원숭이, 미성숙한 형태), AAI00964(인간, 미성숙한 형태), AAH23698(무스 무스큘러스, 미성숙한 형태), 및 AAH18149(인간)을 포함한다. 본 발명의 다양한 구현예에서, 고유 IL-15는 자연 발생 포유동물 IL-15의 미성숙한 또는 전구체 형태이다. 다른 구현예에서, 고유 IL-15는 자연 발생 포유동물 IL-15의 성숙한 형태이다. 다양한 구현예에서, 고유 IL-15는 자연 발생 인간 IL-15의 전구체 형태이다. 다양한 구현예에서, 고유 IL-15는 자연 발생 인간 IL-15의 성숙한 형태이다. 다양한 구현예에서, 고유 IL-15 단백질/폴리펩타이드는 단리되거나 정제된다. 다양한 구현예에서, IL-15 도메인은 서열번호: 1에 제시되는 인간 IL-15 전구체 서열의 아미노산 서열로부터 유래된다:
Figure pct00017
IL-15 수용체는 그것이 IL-2 수용체와 공유하는 베타(β) 및 감마(
Figure pct00018
) 서브유닛, 및 IL-15를 고친화도로 결합시키는 알파(α) 서브유닛으로 구성되는 유형 I 사이토카인 수용체이다. 전장 인간 IL-15Rα는 32 AAs의 신호 펩타이드, 173 AAs의 세포외 도메인, 21 AAs의 막관통 도메인, 37-AA 세포질 테일(tail), 및 다중 N- 또는 O-링크된 당화 부위를 갖는 유형-1 막관통 단백질이다(Anderson 등의, J. Biol Chem, 270:29862- 29869, 1995). IL-15R 알파의 전체 세포외 도메인에 대응하는 IL-15R 알파 사슬의 천연(natural) 가용성 형태는 고친화도 IL-15 길항제로서 작용한다는 것이 이전에 입증되었다. 그러나, 그러한 발견과 첨예하게 대조적으로, IL-15에 대한 결합 친화력의 대부분을 갖는, IL-15R 알파의 재조합, 가용성 스시(sushi) 도메인은 IL-15R 베타/감마 이종이량체를 통해 그것의 결합 및 생물학적 효과(아폽토시스로부터의 증식 및 보호)를 향상시킴으로써 강력한 IL-15 작용제로서 작용하는 반면에, 그것은 IL-15 결합 및 3분체 IL-15R 알파/베타/감마 멤브레인 수용체의 기능에 영향을 미치지 않는다는 것이 입증되었다. 이들 결과는, 자연적으로 생산되는 경우, 그러한 가용성 스시 도메인이 IL-15 트랜스-제시 기전에 수반될 수도 있다는 것을 시사하였다(Mortier 등의, J. Biol Chem, 281(3):1612-1619, 2006).
본원에 사용되는 바와 같이, 용어들 "고유 IL-15Rα" 및 "고유 인터루킨-15 수용체 알파"는 단백질 또는 폴리펩타이드의 맥락에서 미성숙한 또는 전구체 형태와 성숙한 형태 및 자연 발생 동형체를 포함하는 임의의 자연 발생 포유동물 인터루킨-15 수용체 알파("IL-15Rα") 아미노산 서열을 지칭한다. 다양한 고유 포유동물 IL-15Rα의 아미노산 서열에 대한 유전자은행 수탁 번호의 비-제한적인 예는 NP_002180(인간), ABK41438(붉은털원숭이), NP_032384(무스 무스큘러스), Q60819 (무스 무스큘러스), Q13261(인간)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 고유 IL-15Rα는 자연 발생 포유동물 IL-15Rα 폴리펩타이드의 미성숙한 형태이다. 다양한 구현예에서, 고유 IL-15Rα는 자연 발생 포유동물 IL-15Rα 폴리펩타이드의 성숙한 형태이다. 다양한 구현예에서, 고유 IL-15Rα는 자연 발생 포유동물 IL-15Rα 폴리펩타이드의 형태이다. 다양한 구현예에서, 고유 IL-15Rα는 자연 발생 포유동물 IL-15Rα 폴리펩타이드의 전장 형태이다. 다양한 구현예에서, 고유 IL-15Rα는 자연 발생 인간 IL-15Rα 폴리펩타이드의 미성숙한 형태이다. 다양한 구현예에서, 고유 IL-15Rα는 자연 발생 인간 IL-15Rα 폴리펩타이드의 성숙한 형태이다. 다양한 구현예에서, 고유 IL-15Rα는 자연 발생 인간 IL-15Rα 폴리펩타이드의 형태이다. 다양한 구현예에서, 고유 IL-15Rα는 자연 발생 인간 IL-15Rα 폴리펩타이드의 전장 형태이다. 다양한 구현예에서, 고유 IL-15Rα 단백질 또는 폴리펩타이드는 단리되거나 정제된다. 다양한 구현예에서, IL-15Rα 도메인은 서열번호: 3에 제시되는 인간 IL-15Rα 서열의 아미노산 서열로부터 유도된다:
Figure pct00019
다양한 구현예에서, 고유 IL-15Rα는 자연 발생 인간 IL-15Rα 폴리펩타이드의 전장 세포외 형태이다. 다양한 구현예에서, 고유 IL-15Rα 단백질 또는 폴리펩타이드는 단리되거나 정제된다. 다양한 구현예에서, IL-15Rα 세포외 도메인은 서열번호: 4에 제시되는 인간 IL-15Rα 서열의 아미노산 서열로부터 유도된다:
Figure pct00020
다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15 융합 단백질은 IL-15/IL-15RαSushi 복합체를 포함하며 여기서 IL-15 도메인은 서열번호: 2에 제시되는 바와 같은 성숙한 인간 IL-15 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하고:
Figure pct00021
여기서 IL-15RαSushi 도메인은 서열번호: 5에 제시되는 바와 같은 성숙한 인간 IL-15Rα 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00022
다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi 복합체의 IL-15 도메인은 서열번호: 2에 제시되는 바와 같은 성숙한 인간 IL-15 폴리펩타이드의 서열로부터 유도되는 서열을 포함하는 IL-15 변이체(또는 돌연변이체)일 것이다. IL-15의 변이체(또는 돌연변이체)는 고유 아미노산, 성숙한 서열 내의 그것의 위치 및 변이체 아미노산을 사용하여 본원에 지칭된다. 예를 들어, "huIL-15S58D"는 서열번호: 2의 위치 58에서 S의 D로의 치환을 포함하는 인간 IL-15를 지칭한다. 다양한 구현예에서, IL-15 변이체는 IL-15Rα 폴리펩타이드를 결합시키고 IL-15 작용제 또는 길항제로서 기능한다. 다양한 구현예에서, 작용제 활성을 갖는 IL-15 변이체는 슈퍼 작용제 활성을 갖는다. 다양한 구현예에서, IL-15 변이체는 IL-15Rα와 그것의 연관과 독립적으로 IL-15 작용제 또는 길항제로서 기능할 수 있다. IL-15 작용제는 야생형 IL-15와 비교하여 비교가능하거나 증가된 생물학적 활성에 의해 예시화된다. IL-15 길항제는 야생형 IL-15와 비교하여 감소된 생물학적 활성에 의해 또는 IL-15-매개된 반응을 억제하는 능력에 의해 예시화된다. 다양한 구현예에서, IL-15 변이체는 증가된 또는 감소된 활성으로
Figure pct00023
수용체에 결합한다. 다양한 구현예에서, IL-15 변이체의 서열은 고유 IL-15 서열과 비교하여, 적어도 하나의 아미노산 변화, 예를 들어 치환 또는 결실을 가지며, 그러한 변화는 IL-15 작용제 또는 길항제 활성을 야기한다. 다양한 구현예에서, 아미노산 치환/결실은 IL-15Rβ 및/또는
Figure pct00024
와 상호작용하는 IL-15의 도메인에 있다. 다양한 구현예에서, 아미노산 치환/결실은 IL-15Rα 폴리펩타이드에 대한 결합 또는 IL-15 변이체를 생산하는 능력에 영향을 미치지 않는다. IL-15 변이체를 생성하는 적합한 아미노산 치환/결실은 본원에 제공되는 바와 같은, 합리적인 또는 무작위 돌연변이유발 및 기능성 검정을 통한, 알려진 IL-15 구조, IL-15와 상동성 분자 예컨대 알려진 구조를 갖는 IL-2와의 비교, 또는 다른 실증적 방법에 기초하여 식별될 수 있다. 추가적으로, 적합한 아미노산 치환은 보존적 또는 비-보존적 변화 및 추가적인 아미노산의 삽입일 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15 변이체는 서열번호: 2에 제시되는 성숙한 인간 IL-15 서열의 위치 30, 31, 32, 62, 63, 67, 68, 또는 108에서 하나 또는 하나보다 많은 아미노산 치환/결실을 함유한다. 다양한 구현예에서, D30T("D30"은 고유 성숙한 인간 IL-15 서열에서 아미노산 "D" 및 잔기 위치 "30"을 지칭하고 "T"는 IL-15 변이체 내의 그러한 위치에서 치환된 아미노산 잔기를 지칭함), V31Y, H32E, T62D, I68F 또는 Q108M 치환은 길항제 활성을 갖는 IL-15 변이체를 야기하고 S58D 치환은 작용제 활성을 갖는 IL-15 변이체를 야기한다.
다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi 복합체의 IL-15 도메인은 위치 111-114에서 결실을 갖는 인간 IL-15 변이체 폴리펩타이드일 것이다(서열번호: 39). 다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi 복합체의 IL-15 도메인은 위치 109-114에서 결실을 갖는 인간 IL-15 변이체 폴리펩타이드일 것이다(서열번호: 40). 다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi 복합체의 IL-15 도메인은 위치 108-114에서 결실을 갖는 인간 IL-15 변이체 폴리펩타이드일 것이다(서열번호: 41). 다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi 복합체의 IL-15 도메인은 위치 105-114에서 결실을 갖는 인간 IL-15 변이체 폴리펩타이드일 것이다(서열번호: 42). 다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi 복합체의 IL-15 도메인은 위치 N95 후에 'GS' 삽입을 갖는 인간 IL-15 변이체 폴리펩타이드일 것이다(서열번호: 43). 다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi 복합체의 IL-15 도메인은 위치 N95 후에 'GGSGG' 삽입을 갖는 인간 IL-15 변이체 폴리펩타이드일 것이다(서열번호: 44). 다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi 복합체의 IL-15 도메인은 위치 N95 후에 'GSSGGSGGS' 삽입을 갖는 인간 IL-15 변이체 폴리펩타이드일 것이다(서열번호: 45).
Fc 도메인
IgG 부류의 면역글로불린은 인간 혈액에서 가장 풍부한 단백질 중 하나이다. 그것의 순환 반감기는 21일 정도 도달할 수 있다. 융합 단백질은 IgG의 Fc 영역과 또 다른 단백질의 도메인, 예컨대 다양한 사이토카인 및 수용체를 결합시키는 것으로 보고되었다(예를 들어, Capon 등의, Nature, 337:525-531, 1989; Chamow 등의, Trends Biotechnol., 14:52-60, 1996); 미국 특허 번호 제5,116,964호 및 제5,541,087호를 참조). 원형(prototype) 융합 단백질은 IgG Fc의 힌지 영역에서 시스테인 잔기를 통해 링크되는 동종이량체성 단백질이며, 중쇄 가변성 및 CH1 도메인 및 경쇄 없는 IgG 분자와 유사한 분자를 야기한다. Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질의 이량체 성질(nature)은 다른 분자와의 고차 상호작용(즉 2가 또는 이중특이적 결합)을 제공할 시에 유리할 수 있다. 구조적 상동성으로 인해, Fc 융합 단백질은 유사한 동형을 갖는 인간 IgG와 비교할만한 생체내 약동학적 프로파일을 나타낸다.
용어 "Fc"는 단량체성 형태든 다량체성 형태든, 전체 항체의 비-항원-결합 단편의 서열을 포함하는 분자 또는 서열을 지칭한다. 고유 Fc의 원래 면역글로불린 공급원은 바람직하게는 인간 기원이고 임의의 면역글로불린일 수 있다. 고유 Fc's는 공유(즉, 디설파이드 결합) 및 비-공유 연관에 의해 이량체성 또는 다량체 형태로 링크될 수 있는 단량체성 폴리펩타이드로 구성된다. 고유 Fc 분자의 단량체성 서브유닛 사이의 분자간 디설파이드 결합의 수는 부류(예를 들어, IgG, IgA, IgE) 또는 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2)에 따라 범위가 1 내지 4에 이른다. 고유 Fc의 일 예는 IgG의 파파인 소화에서 기인하는 디설파이드-결합된 이량체이다(Ellison 등의 (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9 참조). 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "고유 Fc"는 단량체 형태, 이량체 형태, 및 다량체 형태에 일반적이다. Fc 도메인은 단백질 A, 단백질 G, 다양한 Fc 수용체 및 보체 단백질을 위한 결합 부위를 함유한다.
다양한 구현예에서, 용어 "Fc 변이체"는 고유 Fc로부터 개질되지만 여전히 회수 수용체, FcRn에 대한 결합 부위를 포함하는 분자 또는 서열을 지칭한다. 국제 출원 WO 97/34631(1997년 9월 25일에 공개됨) 및 WO 96/32478은 예시적인 Fc 변이체 뿐만 아니라, 회수 수용체와의 상호작용을 설명하고, 이로써 참고로 통합된다. 더욱이, 고유 Fc는 그들이 본 발명의 융합 분자에 대해 요구되지 않는 구조적 특징 또는 생물학적 활성을 제공하기 때문에 제거될 수 있는 부위를 포함한다. 따라서, 다양한 구현예에서, 용어 "Fc 변이체"는 (1) 디설파이드 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와의 비상용성 (3) 선택된 숙주 세포에서 발현 시의 N-말단 이질성, (4) 당화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 회수 수용체 이외의 Fc 수용체에 대한 결합, 또는 (7) 항체-의존적 세포 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC)에 영향을 미치거나 이에 수반되는 하나 이상의 고유 Fc 부위 또는 잔기가 결여된 분자 또는 서열을 포함한다.
용어 "Fc 도메인"은 위에 정의된 바와 같은 고유 Fc 및 Fc 변이체 분자 및 서열을 포함한다. Fc 변이체 및 고유 Fc's와 같이, 용어 "Fc 도메인"은 전체 항체로부터 소화되든 재조합 유전자 발현에 의해 또는 다른 수단에 의해 생산되든, 단량체성 또는 다량체성 형태의 분자를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명의 IL-15 융합 단백질은 IL-15 융합 단백질을 형성하기 위해 IL-15/IL-15RαSushi 복합체 및 직접적으로 또는 펩타이드 링커 서열을 통해 IL-15/IL-15RαSushi 복합체에 부착되는 적어도 하나의 이종성 단백질을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "융합 단백질"은 재조합 DNA 기술을 통해 부착되는 이종성 폴리펩타이드를 갖는 단백질을 지칭한다. 다양한 구현예에서, 이종성 단백질은 Fc 도메인(또는 그것의 기능성 단편)이고 결과 융합 단백질은 IL-15/IL-15RαSushi 복합체-Fc 융합 단백질이다. 다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi 복합체는 융합 분자에 대해 연장된 반감기를 수여하는 적어도 하나의 폴리펩타이드에 융합된다. 그러한 폴리펩타이드는 신생아
Figure pct00025
/수용체, 인간 혈청 알부민에 결합하는 IgG Fc 또는 다른 폴리펩타이드, 또는 IgG 불변 도메인의 존재로 인해 생체내 반감기를 증가시킨, IgGs, 비-IgG 면역글로불린, 단백질 및 비-단백질 제제를 포함하는, 연장된 혈청 반감기를 갖는 단백질에 결합하는 폴리펩타이드, 또는 FcRn에 대한 불변 도메인 또는 단편의 친화도를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는, FcRn을 결합시키는 이의 일부를 포함한다. 증가된 반감기를 갖는 그러한 단백질 및 분자는 더 작은 양 및 또는 덜 빈번한 투약이 그러한 분자의 치료적, 예방적 또는 진단적 사용에 요구된다는 이점을 갖는다(예를 들어, 미국 특허 번호 제7,658,921호 참조). 다양한 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인, 인간 IgG2 Fc 도메인, 인간 IgG3 Fc 도메인, 인간 IgG4 Fc 도메인, IgA Fc 도메인, IgD Fc 도메인, IgE Fc 도메인, IgG Fc 도메인 및 IgM Fc 도메인; 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예에서, Fc 도메인은 변경된 보체 또는 Fc 수용체 결합 특성을 갖는 Fc 도메인을 야기하는 아미노산 변화를 포함한다. 변경된 보체 또는 Fc 수용체 결합 특성을 갖는 Fc 도메인을 생산하기 위한 아미노산 변화는 당해 기술에 알려져 있다.
다양한 구현예에서, 이량체성 IL-15/IL-15Ra 복합체-Fc 융합 단백질을 만들기 위해 사용되는 Fc 도메인 서열은 서열번호: 6에 제시되는 인간 IgG1-Fc 도메인 서열이며:
Figure pct00026
여기서 서열번호: 6은
Figure pct00027
및
Figure pct00028
결합을 제거하는 (언더라인된) 아미노산 치환을 포함한다.
다양한 구현예에서, 1가 IL-15/IL-15Ra 복합체-Fc 융합 단백질을 만들기 위해 사용되는 헤테로이량체성 Fc 도메인은 서열번호: 7에 제시되는 Knob-Fc 도메인 서열이며:
Figure pct00029
여기서 서열번호: 7은
Figure pct00030
및
Figure pct00031
결합을 제거하는 (언더라인된) 아미노산 치환을 포함한다.
다양한 구현예에서, 1가 IL-15/IL-15Ra 복합체-Fc 융합 단백질을 만들기 위해 사용되는 헤테로이량체성 Fc 도메인은 서열번호: 8에 제시되는 Hole-Fc 도메인이며:
Figure pct00032
여기서 서열번호: 8은
Figure pct00033
및
Figure pct00034
결합을 제거하는 (언더라인된) 아미노산 치환을 포함한다.
링커
다양한 구현예에서, 이종성 단백질(예를 들어, Fc 도메인)은 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 IL-15/IL-15RαSushi 복합체의 IL-15 폴리펩타이드(또는 그 기능성 단편)에 공유적으로 링크된다. 다양한 구현예에서, 링커는 상대적으로 이차 구조가 없는 5, 10, 15, 20, 30, 40 이상의 아미노산 사이의 인공 서열일 수 있다. 다양한 구현예에서, 링커는 G/S 함량이 풍부하다(예를 들어, 링커 내의 아미노산의 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 G 또는 S임). 다양한 구현예에서, 링커는 서열번호: 9-12 및 서열번호: 47에 제시되는 서열의 그룹으로부터 선택된다. 각각의 펩타이드 링커 서열은 독립적으로 선택될 수 있다.
신규한 IL-15/IL-15RαSushi 복합체-Fc 융합 단백질의 예
다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15/IL-15RαSushi 헤테로이량체성 Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0153"로서 지칭됨)은 서열번호: 13에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Hole-Fc-Linker-IL-15)을 포함하며:
Figure pct00035
여기서 IL-15 도메인 서열은 언더라인되고, 펩타이드 링커 서열은 볼드체이고; 사슬 2(Knob-Fc-Linker-IL-15Rα-Sushi+)는 서열번호: 14에 제시되는 아미노산 서열을 가지며:
Figure pct00036
여기서 IL-15Rα-Sushi+ 도메인 서열은 언더라인되고, 펩타이드 링커 서열은 볼드체이다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15/IL-15RαSushi 헤테로이량체성 Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0156"로서 지칭됨)은 서열번호: 15에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(IL-15-Linker-Hole-Fc)을 포함하며:
Figure pct00037
여기서 IL-15 도메인 서열은 언더라인되고, 펩타이드 링커 서열은 볼드체이고;
사슬 2(IL-15Rα-Sushi+-링커-Knob-Fc)는 서열번호: 16에 제시되는 아미노산 서열을 가지며:
Figure pct00038
여기서 IL-15Rα-Sushi+ 도메인 서열은 언더라인되고, 펩타이드 링커 서열은 볼트체이다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15/IL-15RαSushi 헤테로이량체성 Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0155"로서 지칭됨)은 서열번호: 18에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Hole Fc-Linker-IL-15)을 포함하며:
Figure pct00039
여기서 IL-15 도메인 서열은 언더라인되고, 펩타이드 링커 서열은 볼드체이고; 사슬 2(Knob-Fc-Linker-IL-15Rα-Sushi+)는 서열번호: 17에 제시되는 아미노산 서열을 가지며:
Figure pct00040
여기서 IL-15Rα-Sushi+ 도메인 서열은 언더라인되고, 펩타이드 링커 서열은 볼트체이다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15Fc 융합 단백질(또한 "P-0162"로서 이하에 지칭됨)은 서열번호: 13에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Hole Fc-Linker-IL-15) 및 서열번호: 7에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2 (Knob-Fc)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 2가 IL-15 Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0167"로서 지칭됨)은 서열번호: 13에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Hole Fc-Linker-IL-15) 및 서열번호: 55에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(Knob-Fc-Linker-IL-15Rα-Sushi+)를 포함하며:
Figure pct00041
여기서 IL-15 도메인 서열은 언더라인되고, 펩타이드 링커 서열은 볼드체이다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15/IL-15RαSushi (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0197"로서 지칭됨)은 서열번호: 13에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Hole-Fc-Linker-IL-15), 서열번호: 5에 제시되는 아미노산을 갖는 사슬 2(IL-15Rα-Sushi+), 및 서열번호: 7에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 3(Knob-Fc)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 2가 IL-15/IL-15RαSushi (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0198"로서 지칭됨)은 서열번호: 13에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Hole-Fc-Linker-IL-15), 서열번호: 5에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(IL-15Rα-Sushi+), 및 서열번호: 55에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 3(Knob-Fc-Linker-IL-15)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15/IL-15RαSushi (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0201"로서 지칭됨)은 서열번호: 15에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(IL-15-Linker-Hole-Fc), 서열번호: 5에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(IL-15Rα-Sushi+), 및 서열번호: 7에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 3(Knob-Fc)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15/IL-15RαSushi (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0207"로서 지칭됨)은 서열번호: 18에서 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Hole-Fc-Linker-IL-15), 서열번호: 5에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(IL-15Rα-Sushi+), 및 서열번호: 7에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 3(Knob-Fc)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15/IL-15RαSushi (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0217"로서 지칭됨)은 서열번호: 54에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Hole-Fc-Linker-IL-15)을 포함하며:
Figure pct00042
여기서 IL-15 도메인 서열은 언더라인되고 펩타이드 링커 서열은 볼드체이고; 사슬 2(IL-15Rα-Sushi+)는 서열번호: 5에 제시되는 아미노산 서열을 갖고, 사슬 3(Knob-Fc)은 서열번호: 7에 제시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) 복합체-Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0219"로서 지칭됨)은 서열번호: 54에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Hole-Fc-Linker-IL-15), 서열번호: 4에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(IL-15Rα-ECD), 및 서열번호: 7에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 3(Knob-Fc)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15/IL-15RαSushi (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0221"로서 지칭됨)은 서열번호: 19에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(IL-15-Linker-Hole-Fc)을 포함하며:
Figure pct00043
여기서 IL-15 도메인 서열은 언더라인되고 펩타이드 링커 서열은 볼드체이고; 사슬 2(IL-15Rα-Sushi+)는 서열번호: 5에 제시되는 아미노산 서열을 갖고, 사슬 3(Knob-Fc)은 서열번호: 7에 제시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0222"로서 지칭됨)은 서열번호: 19에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(IL-15-Linker-Hole-Fc), 서열번호: 4에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(IL-15Rα-ECD), 및 서열번호: 7에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 3 (Knob-Fc)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 2가 IL-15/IL-15RαSushi (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0234"로서 지칭됨)은 서열번호: 20에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Fc-Linker-IL-15)을 포함하며:
Figure pct00044
여기서 IL-15 도메인 서열은 언더라인되고, 펩타이드 링커 서열은 볼드체이고; 사슬 2(IL-15Rα-Sushi+)는 서열번호: 5에 제시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 2가 IL-15/IL-15RαSushi (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0223"로서 지칭됨)은 서열번호: 21에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(IL-15-Linker-Fc)을 포함하며:
Figure pct00045
여기서 IL-15 도메인 서열은 언더라인되고, 펩타이드 링커 서열은 볼트체이고; 사슬 2(IL-15Rα-Sushi+)는 서열번호: 5에 제시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 2가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0220"로서 지칭됨)은 서열번호: 20에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Fc-Linker-IL-15), 및 서열번호: 4에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(IL-15Rα-ECD)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 2가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0224"로서 지칭됨)은 서열번호: 21에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(IL-15-링커-Fc), 및 서열번호: 4에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(IL-15Rα-ECD)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15 (비-공유)/IL-15RαSushi Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0165"로서 지칭됨)은 서열번호: 2에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(IL-15), 서열번호: 14에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(Knob-Fc-Linker-IL-15Rα-Sushi+), 및 서열번호: 8에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 3 (Hole-Fc)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15 (비-공유)/IL-15RαSushi Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0166"으로서 지칭됨)은 서열번호: 2에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(IL-15), 서열번호: 22에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(Knob-Fc-Linker-IL-15Rα-Sushi+)를 포함하며:
Figure pct00046
여기서 IL-15RαSushi 도메인 서열은 언더라인되고 펩타이드 링커 서열은 볼트체이고; 사슬 3(Hole-Fc)은 서열번호: 8에 제시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 2가 IL-15 (비-공유)/IL-15RαSushi Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0218" 로서 지칭됨)은 서열번호: 2에 제시되는 아미노산 서열을갖는 사슬 1(IL-15), 서열번호: 23에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(Fc-Linker-IL-15Rα-Sushi+)를 포함하며:
Figure pct00047
여기서 IL-15RαSushi 도메인 서열은 언더라인되고 펩타이드 링커 서열은 볼드체이다.
다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi 복합체는 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 41, 서열번호: 42, 서열번호: 43, 서열번호: 44, 및 서열번호: 45에 제시되는 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 IL-15 변이체를 포함할 것이다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 2가 IL-15/IL-15RαSushi (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0313"으로서 지칭됨)은 서열번호: 46에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Fc-Linker-IL-15-S58D)을 포함하며:
Figure pct00048
여기서 IL-15 S58D 변이체 서열은 언더라인되고 펩타이드 링커 서열은 볼드체이고; 사슬 2(IL-15 RαSushi)는 서열번호: 5에 제시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 IL-15/IL-15RαSushi 복합체-Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0314"로서 지칭됨)은 서열번호: 23에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Fc-Linker-IL-15Rα-Sushi+), 및 서열번호: 24에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(IL-15 S58D)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15/IL-15RαSushi (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0666"으로서 지칭됨)은 서열번호: 48에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(Hole-Fc-Linker-IL-15-S58D)을 포함하며:
Figure pct00049
여기서 IL-15 도메인 서열은 언더라인되고 펩타이드 링커 서열은 볼드체이고; 사슬 2(IL-15Rα-Sushi+)는 서열번호: 5에 제시되는 아미노산 서열을 갖고, 사슬 3(Knob-Fc)은 서열번호: 7에 제시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15/IL-15RαSushi (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0667"로서 지칭됨)은 서열번호: 49에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(IL-15-S58D-Linker-Hole-Fc)을 포함하며:
Figure pct00050
여기서 IL-15 도메인 서열은 언더라인되고 펩타이드 링커 서열은 볼드체이고; 사슬 2(IL-15Rα-Sushi+)는 서열번호: 5에 제시되는 아미노산 서열을 갖고, 사슬 3(Knob-Fc)은 서열번호: 7에 제시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 2가 IL-15/IL-15RαSushi (비-공유) Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0668"로서 지칭됨)은 서열번호: 50에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(IL-15-Linker-Fc)을 포함하며:
Figure pct00051
여기서 IL-15 도메인 서열은 언더라인되고, 펩타이드 링커 서열은 볼드체이고; 사슬 2(IL-15Rα-Sushi+)는 서열번호: 5에 제시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15 (비-공유)/IL-15RαSushi Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0669"로서 지칭됨)은 서열번호: 24에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(IL-15 S58D), 서열번호: 22에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(Knob-Fc-Linker-IL-15Rα-Sushi+); 및 서열번호: 8에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 3(Hole-Fc)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 1가 IL-15 (비-공유)/IL-15RαSushi Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0670"으로서 지칭됨)은 서열번호: 24에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(IL-15 S58D), 서열번호: 51에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(IL-15Rα-Sushi+-링커-Knob-Fc)를 포함하며:
Figure pct00052
여기서 IL-15RαSushi 도메인 서열은 언더라인되고 펩타이드 링커 서열은 볼트체이고; 사슬 3(Hole-Fc)은 서열번호: 8에 제시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 2가 IL-15 (비-공유)/IL-15RαSushi Fc 융합 단백질(또한 이하에서 "P-0671"로서 지칭됨)은 서열번호: 24에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 1(IL-15 S58D), 서열번호: 52에 제시되는 아미노산 서열을 갖는 사슬 2(IL-15Rα-Sushi+-Linker-Fc)를 포함하며:
Figure pct00053
여기서 IL-15RαSushi 도메인 서열은 언더라인되고 펩타이드 링커 서열은 볼드체이다.
폴리뉴클레오타이드
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 IL-15, IL-15 변이체, IL-15Rα, IL-15Rα 변이체, Fc, Fc 변이체, IL-15-Fc 융합 단백질, IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질, 또는 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 대상(subject) 핵산은 단일-가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 그러한 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. DNA는 예를 들어, PCR에 의해 증폭되는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, DNA, 및 이들의 조합을 포함한다. IL-15/IL-15RαSushi 복합체를 인코딩하는 게놈 DNA는 다수의 종에 대해 이용가능한 게놈 라이브러리로부터 수득된다. 합성 DNA는 코딩 영역 및 측접 (flanking) 서열의 일부 또는 전부를 재구성하는 단편의 어셈블리 전에 중첩 올리고뉴클레오타이드 단편의 화학적 합성으로부터 이용가능하다. RNA는 T7 프로모터 및 RNA 중합효소를 사용하는 벡터와 같은, mRNA의 고-수준 합성을 지시하는 원핵 발현 벡터로부터 수득될 수 있다. cDNA는 IL-15를 발현시키는 다양한 조직으로부터 단리되는 mRNA로부터 제조되는 라이브러리로부터 수득된다. 본 개시의 DNA 분자는 전장 유전자 뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드 및 그것의 단편을 포함한다. 전장 유전자는 또한 N-말단 신호 서열을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 그러한 핵산은 예를 들어, 신규한 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질을 만들기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호: 56-63에 제시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 본원에 설명되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 본원에 설명되는 적어도 하나의 이종성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다. 다양한 구현예에서, 핵산 분자는 본원에 설명되는 링커 또는 힌지 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 개시의 재조합 핵산은 발현 작제물(construct)에서 하나 이상의 조절 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 링크될 수 있다. 조절 서열은 기술적으로 인식되고 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질의 발현을 지시하도록 선택된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현 조절 요소를 포함한다. 예시적인 조절 서열은 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 설명된다. 전형적으로, 상기 하나 이상의 조절 뉴클레오타이드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 시작 및 종결 서열, 번역 시작 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성제 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 당해 분야에 알려진 바와 같은 구성적 또는 유도가능 프로모터는 본 개시에 의해 고려된다. 프로모터는 자연 발생 프로모터, 또는 하나보다 많은 프로모터의 요소를 결합시키는 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 작제물은 에피솜, 예컨대 플라스미드 상의 세포에 존재할 수 있거나, 발현 작제물은 염색체에 삽입될 수 있다. 다양한 구현예에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 허용하기 위해 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 선택가능한 마커 유전자는 당해 분야에서 잘 알려져 있고 사용되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.
본 개시의 또 다른 양태에서, 대상 핵산은 IL-15/IL-15RαSushi 복합체를 인코딩하고 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 링크되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터에 제공된다. 용어 "발현 벡터"는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 플라스미드, 파아지, 바이러스 또는 벡터를 지칭한다. 숙주 세포에서의 발현에 적합한 벡터는 쉽게 이용가능하고 핵산 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 벡터로 삽입된다. 그러한 벡터는 DNA 서열의 발현을 조절하는 매우 다양한 발현 조절 서열을 포함할 수 있으며 그것에 작동가능하게 링크될 때 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위해 이들 벡터에 사용될 수 있다. 그러한 유용한 발현 조절 서열은 예를 들어, SV40의 초기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 급초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, 발현이 T7 RNA 중합효소에 의해 지시되는 T7 프로모터, 파아지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질을 위한 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소를 위한 프로모터, 산 포스파타제, 예를 들어, PhoS의 프로모터, 효모 α-메이팅(a-mating) 인자의 프로모터, 배큘로바이러스 시스템의 다면체 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그것의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 서열, 및 다양한 이들의 조합을 포함한다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주 세포의 선택 및/또는 발현되도록 요구되는 단백질의 유형과 같은 그러한 인자에 의존할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 벡터의 복제수, 그러한 복제수를 조절하는 능력 및 벡터, 예컨대 항생제 마커에 의해 인코딩되는 임의의 다른 단백질의 발현이 또한 고려되어야 한다.
본 개시의 재조합 핵산은 클로닝된 유전자, 또는 이것의 일부를 원핵 세포, 진핵 세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유동물), 또는 둘 다에서 발현에 적합한 벡터에 결찰시킴으로써 생산될 수 있다. 재조합 IL-15/IL-15RαSushi 복합체의 생산을 위한 발현 비히클은 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들어, 적합한 벡터는 다음 유형의 플라스미드를 포함한다: pBR322-유도 플라스미드, pEMBL-유도 플라스미드, pEX-유도 플라스미드, pBTac-유도 플라스미드 및 원핵 세포, 예컨대 대장균(E. coli)에서 발현을 위한 pUC-유도 플라스미드.
일부 포유동물 발현 벡터는 박테리아에서 벡터의 번식을 용이하게 하기 위한 원핵 서열, 및 진핵 세포에서 발현되는 하나 이상의 진핵 전사 단위 둘 다를 함유한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유도 벡터는 진핵 세포의 형질감염에 적합한 포유동물 발현 벡터의 예이다. 이들 벡터 중 일부는 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 복제 및 약물 내성 선택을 용이하게 하기 위해, pBR322와 같은, 박테리아 플라스미드로부터의 서열로 개질된다. 대안적으로, 바이러스 예컨대 소과 유두종 바이러스(BPV-1), 또는 엡슈타인-바르 바이러스(pHEBo, pREP-유도 및 p205)의 유도체는 진핵 세포에서 단백질의 일시적인 발현을 위해 사용될 수 있다. 다른 바이러스(레트로바이러스 포함) 발현 시스템의 예는 유전자 요법 전달 시스템의 설명에서 이하 발견될 수 있다. 플라스미드의 조제 및 숙주 유기체의 형질 전환에 이용되는 다양한 방법은 당해 기술에 잘 알려져 있다. 원핵 및 진핵 세포 둘 다에 대한 다른 적합한 발현 뿐만 아니라, 일반적인 재조합 절차에 대해, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Chapters 16 and 17을 참조한다. 일부 사례에서, 배큘로바이러스 발현 시스템의 사용에 의해 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 배큘로바이러스 발현 시스템의 예는 pVL-유도 벡터(예컨대 pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유도 벡터(예컨대 pAcUW1), 및 pBlueBac-유도 벡터(예컨대 pBlueBac III를 함유하는 B-gal)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 벡터는 Pcmv-Script 벡터(Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 벡터(Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 및 pCI-neo 벡터(Promega, Madison, Wis.)와 같은, CHO 세포에서 대상체 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질의 생산을 위해 설계될 것이다. 명백한 바와 같이, 대상체 유전자 작제물은 예를 들어, 정제를 위한, 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 포함하는, 단백질을 생산하기 위해, 배양에서 번식되는 세포에서 대상체 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질의 발현을 야기하도록 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 대상체 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 중 하나 이상에 대한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 유전자로 형질감염되는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 IL-15/IL-15RαSushi 복합체는 박테리아 세포 예컨대 대장균(E. coli), 곤충 세포(예를 들어, 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용함), 효모, 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 알려져 있다.
따라서, 본 개시는 추가로 대상체 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, IL-15/IL-15RαSushi 복합체를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염되는 숙주 세포는 IL-15/IL-15RαSushi 복합체의 발현이 발생하도록 허용하는 적절한 조건 하에서 배향될 수 있다. IL-15/IL-15RαSushi 복합체는 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질을 함유하는 배지 및 세포의 혼합물로부터 분비 및 단리될 수 있다. 대안적으로, IL-15/IL-15RαSushi 복합체는 세포질적으로 또는 멤브레인 분획에 유지되고 세포 채취되고, 용해되고 단백질 단리될 수 있다. 세포 배양물은 숙주 세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 세포 배양물에 대한 적합한 배지는 당해 기술에 잘 알려져 있다.
본 개시의 폴리펩타이드 및 단백질은 당업자에게 잘 알려진 단백질 정제 기술에 따라 정제될 수 있다. 이들 기술은 한 수준에서, 단백질성 및 비-단백질성 분획의 조분류(crude fractionation)를 수반한다. 펩타이드 폴리펩타이드를 다른 단백질로부터 분리한 경우, 관심 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 부분적인 또는 완전한 정제(또는 균질성에 대한 정제)를 달성하기 위해 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 더 정제될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "단리된 폴리펩타이드" 또는 "정제된 폴리펩타이드"는 다른 구성요소로부터 단리가능한 조성물을 지칭하도록 의도되며, 여기서 폴리펩타이드는 그것의 자연적으로-수득가능한 상태에 대해 어느 정도로 정제된다. 따라서, 정제된 폴리펩타이드는 또한 그것이 자연적으로 발생할 수 있는 환경으로부터 자유로운 폴리펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, "정제된"은 다양한 다른 구성요소를 제거하기 위해 분별화를 거친 폴리펩타이드 조성물을 지칭할 것이고, 이 조성물은 실질적으로 그것의 발현된 생물학적 활성을 유지한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이러한 지정은 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 조성물 내의 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 이상을 구성하는, 조성물의 주요 구성요소를 형성하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 조성물을 지칭할 것이다.
정제에 사용하기에 적합한 다양한 기술이 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다. 이들은 예를 들어, 원심 분리 전에, 암모늄 설페이트, PEG, 항체(면역침강) 등을 사용하여 또는 열 변성에 의한 침전; 크로마토그래피 예컨대 친화성 크로마토그래피(단백질-A 칼럼), 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite), 소수성 상호작용 크로마토그래피; 등전점 포커싱; 겔 전기영동; 이들 기술의 조합을 포함한다. 일반적으로 당업계에서 알려진 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서가 변화될 수 있거나, 특정 단계들이 생략될 수 있고, 실질적으로 정제된 폴리펩타이드의 적합한 제조 방법을 여전히 야기하는 것으로 여겨진다.
약제학적 조성물
또 다른 양태에서, 본 개시는 약제학적으로 허용가능한 담체를 갖는 혼합물에 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 그러한 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업자에 의해 잘 알려지고 이해되었으며 광범위하게 설명되었다(예를 들어,Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990을 참조). 약제학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어, 조성물의 pH, 삼투질농도, 점도, 명료성, 색상, 등장성, 악취, 멸균, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 개질, 유지 또는 보존하기 위한 목적을 위해 포함될 수 있다. 그러한 약제학적 조성물은 포리펩타이드의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 청소능의 속도에 영향을 미칠 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체는 아미노산(예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신); 항미생물제; 항산화제(예컨대 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 나트륨 수소-설파이트); 완충액(예컨대 보레이트, 바이카보네이트, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트, 다른 유기 산); 증량제(예컨대 만니톨 또는 글리신), 킬레이트제(예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제(예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린); 충전제; 단당류; 이당류 및 다른 탄수화물(예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린); 단백질(예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제; 풍미제 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체(예컨대 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩타이드; 염 형성 반대 이온(예컨대 나트륨); 보존제(예컨대 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매(예컨대 글리세린, 프로필렌 글라이콜 또는 폴리에틸렌 글라이콜); 당 알코올(예컨대 만니톨 또는 소르비톨); 현탁화제; 계면활성제 또는 습윤제(예컨대 플루로닉스, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 증진제(수크로스 또는 소르비톨); 등장성 증진제(예컨대 알칼리 할로겐화금속(바람직하게는 나트륨 또는 칼륨 클로라이드, 만니톨 소르비톨)); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 약제학적 아쥬반트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
약제학적 조성물의 일차 비히클 또는 담체는 사실상 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어, 적합한 비히클 또는 담체는 가능하게는 비경구 투여를 위한 조성물에 공통인 다른 물질로 보충되는, 주사용 물, 생리학적 식염수 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 혈청 알부민과 혼합되는 중성 완충 식염수 또는 염수는 더 예시적인 비히클이다. 다른 예시적인 약제학적 조성물은 약 pH 7.0 내지 8.5의 트리스(Tris) 완충액, 또는 약 pH 4.0 내지 5.5의 아세테이트 완충액을 포함하며, 이는 소르비톨 또는 그것의 적합한 대체제를 더 포함할 수 있다. 본 개시의 일 구현예에서, 조성물은 동결건조된 케이크 또는 수용액의 형태로 원하는 정도의 순도를 갖는 선택된 조성물과 선택적인 제형 제제(Remington's Pharmaceutical Sciences, supra)를 혼합함으로써 보관용으로 제조될 수 있다. 또한, 치료적 조성물은 적절한 부형제 예컨대 수크로스를 사용하여 리오필리제이트로서 제형화될 수 있다. 최적의 약제학적 조성물은 예를 들어, 의도된 투여 경로, 전달 형식, 및 원하는 투약량에 따라 당업자에 의해 결정될 것이다.
비경구 투여가 고려될 때, 치료적인 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 비히클에서 원하는 IL-15/IL-15RαSushi 복합체를 포함하는 무발열원, 비경구로 허용가능한 수용액의 형태일 수 있다. 비경구 주사에 대해 특히 적합한 비히클은 폴리펩타이드가 적절하게 보존된, 멸균, 등장성 용액으로서 제형화되는 멸균 증류수이다. 다양한 구현예에서, 주사가능 투여에 적합한 약제학적 제형은 수용액으로, 바람직하게는 생리학적으로 양립가능한 완충액 예컨대 행크스(Hanks) 용액, 링거액, 또는 생리학적 완충 식염수로 제형화될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란과 같은, 현탁액의 점도를 증가시키는 서브스턴스를 함유할 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 화합물의 용해도를 증가시키고 고농축 용액의 제조를 허용하기 위해 적합한 안정화제 또는 제제를 함유할 수 있다.
다양한 구현예에서, 치료적인 약제학적 조성물은 콜로이드성 분산 시스템을 사용하여 표적화된 전달을 위해 제형화될 수 있다. 콜로이드성 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구형체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 교질입자, 혼합된 교질입자, 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 리포좀 생산에 유용한 지질의 예는 포스파티딜 화합물, 예컨대 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로시드, 및 강글리오사이드를 포함한다. 예시적인 인지질은 에그(egg) 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 및 디스테아로일포스파티딜콜린을 포함한다. 리포좀의 표적화는 예를 들어, 기관-특이성, 세포 특이성, 및 소기관-특이성에 기초하여 또한 가능하고 당해 기술에 알려져 있다.
다양한 구현예에서, 약제학적 조성물의 경구 투여가 고려된다. 이러한 방식으로 투여되는 약제학적 조성물은 그러한 담체가 정제 및 캡슐과 같은 고형 투약 형태의 배합에서 관례상 사용되거나 그렇지 않은 채 제형화될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 투약 형태(캡슐, 정제, 환제, 당의정, 파우더, 과립, 등)에서, 본 개시의 하나 이상의 치료적 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 나트륨 시트레이트 또는 인산제이칼슘, 및/또는 다음 중 임의의 것과 혼합될 수 있다: (1) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 및/또는 규산; (2) 결합제, 예컨대, 예를 들어, 카복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스, 및/또는 아카시아; (3) 습윤제, 예컨대 글리세롤; (4) 붕해제, 예컨대 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 탄산나트륨; (5) 용액 지연제, 예컨대 파라핀; (6) 흡수 가속제, 예컨대 사차 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 예컨대, 예를 들어, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예컨대 탈크, 칼슘 스테아레이트, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글라이콜, 나트륨 라우릴 설페이트, 및 이들의 혼합물; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 약제학적 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 또한 고분자량 폴리에틸렌 글라이콜 등 뿐만 아니라, 락토스 또는 유당과 같은 그러한 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 이용될 수 있다.　경구 투여를 위한 액체 투약 형태는 약제학적으로 허용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽, 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 성분에 더하여, 액체 투약 형태는 당업계에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글라이콜, 1,3-부틸렌 글라이콜, 오일(특히, 면종자, 땅콩, 옥수수, 세균, 올리브, 캐스터, 및 참께 오일), 글리세롤, 테트라하이드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글라이콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 그리고 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 불활성 희석제를 제외하고, 경구 조성물은 또한 아쥬반트 예컨대 습윤제, 유화 및 현탁화 제제, 감미제, 풍미제, 착색제, 방향제, 및 보존제를 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 피부 또는 점막 멤브레인에 대한 약제학적 조성물의 국소 투여가 고려된다. 국소 제형은 피부 또는 각질층 침투 증진제로서 효과적인 것으로 알려진 광범위한 제제 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 이들의 예들은 2-피롤리돈, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 프로필렌 글라이콜, 메틸 또는 이소프로필 알코올, 디메틸 설폭사이드, 및 아존(azone)이다. 추가적인 제제는 제형를 화장용으로 허용가능하게 만들기 위해 더 포함될 수 있다. 이들의 예들은 지방, 왁스, 오일, 염료, 항료, 보존제, 안정화제, 및 표면-활성제이다. 각질용해성 제제 예컨대 당해 분야에서 알려진 것들이 또한 포함될 수 있다. 예들은 살리실산 및 황이다.　국소 또는 경피 투여를 위한 투약 형태는 파우더, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치, 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 및 요구될 수 있는 임의의 보존제, 완충액, 또는 추진제와 멸균 조건 하에서 혼합될 수 있다. 연고, 페이스트, 크림 및 겔은, 본 개시의 당해 화합물(예를 들어, IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질)에 더하여, 부형제, 예컨대 동물 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸쓰, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글라이콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크 및 산화아연, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본원에 사용하기 위해 고려되는 추가적인 약제학적 조성물은 지속- 또는 조절-전달 제형에 폴리펩타이드를 수반하는 제형을 포함한다. 다양한 구현예에서, 약제학적 조성물은 나노 입자, 서방형 하이드로 겔로서 제형화되거나, 종양용해 바이러스에 통합될 수 있다. 다양한 다른 지속- 또는 조절-전달 수단, 예컨대 리포좀 담체, 생체붕괴성 극미립자 또는 다공성 비드 및 데포 주사를 제형화하기 위한 기술이 또한 당업자에게 알려져 있다.
치료적으로 이용될 약제학적 조성물의 유효량은 예를 들어, 치료적 맥락 및 목적에 의존할 것이다. 따라서, 당업자는 치료를 위한 적절한 투약량 수준이 부분적으로, 전달되는 분자, 폴리펩타이드가 사용되고 있는 증상(indication), 투여 경로, 및 환자의 크기(체중, 체표면 또는 장기 크기) 및 조건(나이 및 일반적인 건강)에 의존하여 변할 것이라는 것을 인식할 것이다. 따라서, 임상의는 최적의 치료 효과를 획득하기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 수정할 수 있다. 전형적인 투약량은 위에 언급된 인자에 따라, 범위가 약 0.0001 mg/kg에서 약 100 mg/kg까지일 수 있다. 폴리펩타이드 조성물은 바람직하게는 피하로 또는 정맥내로 주사되거나 투여될 수 있다. 지속 작용성 약제학적 조성물은 특정 제형의 반감기 및 제거율에 따라 매 3일 내지 4일, 매주, 격주로, 또는 매월 투여될 수 있다. 투약의 빈도는 사용되는 제형에서 폴리펩타이드의 약동학적 파라미터에 의존할 것이다. 전형적으로, 조성물은 원하는 효과를 달성하는 투약량이 도달될 때까지 투여된다. 따라서, 조성물은 경시적으로 단일 용량으로서, 또는 (동일 또는 상이한 농도/투약량에서) 다중 용량으로서, 또는 연속적 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 투약량의 추가적인 개량은 일상적으로 이루어진다. 적절한 투약량은 적절한 용량-반응 데이터의 사용을 통해 확인될 수 있다.
약제학적 조성물의 투여 경로는 정맥내, 복강내, 종양내, 뇌내(실질내), 뇌심실내, 근육내, 안구내, 동맥내, 문내, 병소내 경로, 수질내, 척추강내, 방광내, 심실내, 경피, 피하, 또는 복강내 뿐만 아니라; 비강내, 장관, 국소, 설하, 요도, 질, 또는 직장 수단에 의한, 지속 방출 시스템에 의한 또는 이식 디바이스에 의한 주사를 통한, 예를 들어 경구인, 알려진 방법과 일치한다. 원하는 경우, 조성물은 볼러스 주사에 의해 또는 계속해서 주입에 의해, 또는 이식 디바이스에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 조성물은 멤브레인, 스펀지, 또는 원하는 분자가 흡수되거나 캡슐화된 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 디바이스가 사용되는 경우, 디바이스는 임의의 적합한 조직 또는 장기로 이식될 수 있고, 원하는 분자의 전달은 확산, 적기-방출 볼러스, 또는 연속 투여를 통해서 일 수 있다.
치료 용도
본 개시는 대상체에서 암 세포를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 대상체에게 약제학적으로 허용가능한 담체로 본 개시의 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질의 치료 유효량을 (단일요법으로서 또는 병용 치료 요법으로) 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 그러한 투여는 암 세포의 성장 및/또는 증식을 억제한다. 구체적으로, 본 개시의 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질은 암으로서 특징화되는 장애를 치료할 시에 유용한다. 그러한 장애는 고형 종양, 예컨대 유방, 기도, 뇌, 생식 기관, 소화관, 요로, 눈, 간, 피부, 두경부, 갑상선, 부갑상선의 암 및 그것의 원격 전이, 림프종, 육종, 다발성 골수종 및 백혈병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 유방암의 예는 침습성 관상 암종, 침습성 소엽 암종, 관상피내 암종, 및 상피내 소엽 암종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 기도의 암의 예는 소세포 및 비-소세포 폐 암종 뿐만 아니라, 기관지 선종 및 흉막폐 모세포종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 뇌암의 예는 뇌간 및 시상하부 신경아교종, 소뇌 및 뇌 별아교세포종, 신경교세포종, 수모세포종, 뇌실막세포종 뿐만 아니라, 신경외배엽 및 송과체 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 남성 생식 기관의 종양은 전립선 및 고환암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 여성 생식 기관의 종양은 자궁내막, 자궁경부, 난소, 질, 및 외음부 암 뿐만 아니라, 자궁의 육종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 소화관의 종양은 항문, 결장, 결장직장, 식도, 담낭, 위, 간, 유방, 췌장, 직장, 작은-장, 및 타액샘 암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 요로의 종양은 방광, 음경, 신장, 신우, 요관, 및 요도 암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 안암은 안구내 흑색종 및 망막모세포종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 간 암의 예는 간세포 암종(섬유층판 변이체를 갖거나 그렇지 않은 간 세포 암종), 담관암종(간내 담관 암종), 및 혼합된 간세포 담관암종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 피부암은 편평 세포 암종, 카포시 육종, 악성 흑색종, 머켈 세포 피부암, 및 비-흑색종 피부암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 헤드-및-목 암은 비인두 암, 및 입술 및 구강 암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 림프종은 AIDS-관련 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 질환, 및 중추신경계의 림프종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 육종은 연조직, 골육종, 악성 섬유질 조직구종, 림프육종, 및 횡문근육종의 육종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 백혈병은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수형성 백혈병, 및 모발 세포 백혈병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 암은 액티빈 A, 마이오스타틴, TGF-β 및 GDF15와 같은 TGF-β 패밀리 일원의 높은 발현을 갖는 암, 예를 들어, 췌장 암, 위암, 난소암, 결장직장암, 흑색종 백혈병, 폐암, 전립선암, 뇌암, 방광암, 및 두경부 암일 것이다.
본 개시는 아쥬반트로서 기존 암 치료제의 치료 효과를 향상시키는 것을 통해 불응성 또는 저항 액체 또는 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시는 또한 대상체에서 간염 A, 간염 B, 간염 C, HIV 감염 AIDS, 인간 파필로마바이러스(HPV) 감염, 생식기 사마귀 등을 포함하는 바이러스성 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 약제학적으로 허용가능한 담체로 본 개시의 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질을 필요로 하는 인간 환자에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 그러한 투여는 바이러스의 성장 및/또는 복제를 억제한다.
"치료 유효량" 또는 "치료적으로 효과적인 용량"은 치료되고 있는 장애의 증상 중 하나 이상을 어느 정도까지 완화시킬 투여되는 치료제의 그러한 양을 지칭한다.
치료적으로 효과적인 용량은 IC50을 결정함으로써 세포 배양물 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 그 다음, 용량은 세포 배양물에서 결정되는 바와 같은 IC50을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 그러한 정보는 인간의 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장의 수준은 예를 들어, HPLC에 의해 측정될 수 있다. 정확한 조성물, 투여 경로 및 투약량은 대상체의 상태를 고려하여 개별 의사에 의해 선택될 수 있다.
투약 요법은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼러스가 투여될 수 있고, 수 개의 분할 용량(다중 또는 반복 또는 유지)이 경시적으로 투여될 수 있고 용량이 치료적 상황의 긴급에 의해 표시되는 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 그것은 투여의 용이성 및 투약량의 균일성을 위해 투약량 단위 형태로 비경구 조성물을 조제하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 바와 같은 투약량 단위 형태는 치료될 포유동물 대상체에 대한 일원화된 투약량으로서 적합화되는 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요구된 약제학적 담체와 연관하여 원하는 치료 효과를 생산하기 위해 계산되는 활성 화합물의 미리결정된 양을 포함한다. 본 개시의 투약량 단위 형태의 명세는 항체의 고유 특성 및 달성될 특정 치료적 또는 예방적 효과에 의해 주로 구술될 것이다.
따라서, 당업자는, 본원에 제공되는 본 개시에 기초하여, 용량 및 투약 요법이 치료적 분야에 잘-알려진 방법에 따라 조정된다는 것을 인식할 것이다. 즉, 최대 내성있는 용량은 쉽게 확립될 수 있고, 검출가능한 치료적 이점을 대상체에게 제공하는 유효량은 또한 결정될 수 있으며, 검출가능한 치료적 이점을 대상체에게 제공하는 각각의 제제를 투여하기 위한 시간적 요건도 마찬가지이다. 따라서, 특정 용량 및 투여 요법이 본원에 예시되지만, 이들 예는 본 개시를 실시할 시에 대상체에게 제공될 수 있는 용량 및 투여 요법을 결코 제한하지 않는다.
투약량 값은 완화될 조건의 유형 및 중증도에 따라 다를 수 있고 단일 또는 다중 용량을 포함할 수 있다는 점이 주목되어야 한다. 임의의 특정 대상체의 경우, 특이적 투약 요법은 개인적인 필요 및 조성물의 투여를 관리 또는 감독하는 사람의 전문 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하고, 본원에 제시되는 투약 범위는 단지 예시적인 것이고 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하도록 의도되지 않는다는 것이 더 이해되어야 한다. 또한, 본 개시의 조성물을 갖는 투약 요법은 질환의 유형, 대상체의 연령, 체중, 성별, 의료 병태, 상태의 중증도, 투여 경로, 및 이용되는 특정 항체을 포함하는, 다양한 인자에 기초할 수 있다. 따라서, 투약 요법은 상당히 다를 수 있지만, 표준 방법을 사용하여 일상적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 약동학적 또는 약력학적 파라미터에 기초하여 조정될 수 있으며, 이는 임상 효과 예컨대 독성 효과 및/또는 실험실 값을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시는 당업자에 의해 결정된 바와 같은 대상체 내(intra-subject) 용량-단계적 확대(dose-escalation)를 망라한다. 적절한 투약량 및 요법을 결정하는 것은 관련된 기술에 잘-알려져 있고 일단 본원에 개시되는 교시가 주어지는 경우 당업자에 의해 망라되는 것으로 이해될 것이다.
본 개시의 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질의 치료적 또는 예방적 유효량에 대한 예시적, 비제한적 일일 투약 범위(dosing range)는 0.0001 내지 100 mg/kg, 0.0001 내지 90 mg/kg, 0.0001 내지 80 mg/kg, 0.0001 내지 70 mg/kg, 0.0001 내지 60 mg/kg, 0.0001 내지 50 mg/kg, 0.0001 내지 40 mg/kg, 0.0001 내지 30 mg/kg, 0.0001 내지 20 mg/kg, 0.0001 내지 10 mg/kg, 0.0001 내지 5 mg/kg, 0.0001 내지 4 mg/kg, 0.0001 내지 3 mg/kg, 0.0001 내지 2 mg/kg, 0.0001 내지 1 mg/kg, 0.0010 내지 50 mg/kg, 0.0010 내지 40 mg/kg, 0.0010 내지 30 mg/kg, 0.0010 내지 20 mg/kg, 0.0010 내지 10 mg/kg, 0.0010 내지 5 mg/kg, 0.0010 내지 4 mg/kg, 0.0010 내지 3 mg/kg, 0.0010 내지 2 mg/kg, 0.0010 내지 1 mg/kg, 0.01 내지 50 mg/kg, 0.01 내지 40 mg/kg, 0.01 내지 30 mg/kg, 0.01 내지 20 mg/kg, 0.01 내지 10 mg/kg, 0.01 내지 5 mg/kg, 0.01 내지 4 mg/kg, 0.01 내지 3 mg/kg, 0.01 내지 2 mg/kg, 0.01 내지 1 mg/kg, 0.1 내지 50 mg/kg, 0.1 내지 40 mg/kg, 0.1 내지 30 mg/kg, 0.1 내지 20 mg/kg, 0.1 내지 10 mg/kg, 0.1 내지 5 mg/kg, 0.1 내지 4 mg/kg, 0.1 내지 3 mg/kg, 0.1 내지 2 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg, 1 내지 50 mg/kg, 1 내지 40 mg/kg, 1 내지 30 mg/kg, 1 내지 20 mg/kg, 1 내지 10 mg/kg, 1 내지 5 mg/kg, 1 내지 4 mg/kg, 1 내지 3 mg/kg, 1 내지 2 mg/kg, 또는 1 내지 1 mg/kg 체중일 수 있다. 투약량 값은 완화될 조건의 유형 및 중증도에 따라 다를 수 있다는 점이 주목되어야 한다. 임의의 특정 대상체의 경우, 특이적 투약 요법은 개인적인 필요 및 조성물의 투여를 관리 또는 감독하는 사람의 전문 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하고, 본원에 제시되는 투약 범위는 단지 예시적인 것이고 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하도록 의도되지 않는다는 것이 더 이해되어야 한다.
본 개시의 약제학적 조성물의 독성 및 치료 인덱스는 예를 들어, LD50(모집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(모집단의 50%에 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과적인 용량 사이의 용량 비는 치료 인덱스이고 그것은 비 LD50/ED50로서 표현될 수 있다. 큰 치료 인덱스를 나타내는 조성물이 일반적으로 선호된다.
IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 약제학적 조성물의 투여의 투약 빈도는 요법의 특성 및 치료되는 특정 질환에 의존한다. 대상체는 원하는 치료 결과가 달성될 때까지, 규칙적 간격, 예컨대 매주 또는 매월 치료될 수 있다. 예시적인 투약 빈도는: 중단 없이 1주에 1회 또는 2회; 1주에 1회 또는 2회; 격주로; 2주에 1회; 3주에 1회; 그 다음 매월, 2주 동안 중단 없이 약하게; 그 다음 매월, 3주 동안 중단 없이 약하게; 매월; 격월로 1회; 3개월마다 1회; 4개월마다 1회; 5개월마다 1회; 또는 6개월마다 1회, 또는 매년을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
병용 요법
본원에 사용되는 바와 같이, 본 개시의 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 및 하나 이상의 다른 치료적 제제를 지칭하는 용어들 "공-투여", "공-투여된" 및 "~와 결합하여"는 다음을 의미하고, 지칭하고 포함하도록 의도된다: 그러한 구성요소가 상기 대상체에게 실질적으로 동일한 시간에서 상기 구성요소를 방출하는 단일 투약 형태로 함께 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 대상체에 대한 본 개시의 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 및 치료제(들)의 그러한 조합의 동시 투여; 그러한 구성요소가 상기 대상체에 의해 실질적으로 동일한 시간에서 복용되는 별개의 투약 형태로 서로 떨어져서 제형화되어, 그 결과 상기 구성요소가 상기 대상체에게 실질적으로 동일한 시간에서 방출될 때, 치료를 필요로 하는 대상체에 대한 본 개시의 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 및 치료제(들)의 그러한 조합의 실질적 동시 투여; 그러한 구성요소가 각각의 투여 사이에서 상당한 시간 간격으로 상기 대상체에 의해 연속적인 시간에서 복용되는 별개의 투약 형태로 서로 떨어져서 제형화되어, 그 결과 상기 구성요소가 상기 대상체에 실질적으로 상이한 시간에서 방출될 때, 치료를 필요로 하는 대상체에 대한 본 개시의 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 및 치료제(들)의 그러한 조합의 순차적인 투여; 및 그러한 구성요소가 제어된 방식으로 상기 구성요소를 방출하는 단일 투약 형태로 함께 제형화되어 그 결과 그들이 상기 대상체에 동일한 및/또는 상이한 시간에서 동시에, 연속적으로, 및/또는 중첩적으로 방출될 때, 치료를 필요로 하는 대상체에 대한 본 개시의 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 및 치료제(들)의 그러한 조합의 순차적인 투여, 여기서 각각의 부분은 동일 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 암 또는 암 전이를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 면역요법, 세포독성 화학요법, 소분자 키나제 억제제 표적 요법, 수술, 방사선 요법, 및 줄기 세포 이식을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 제2 요법과 조합으로 본 발명의 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 그러한 방법은 예방적 암 예방, 수술 후 암 재발 및 전이의 예방에서, 그리고 다른 종래의 암 요법의 아쥬반트로서 사용될 수 있다. 본 개시는 종래의 암 요법(예를 들어, 화학요법, 방사선 요법, 광선요법, 면역요법, 및 수술)의 유효성이 본원에 설명되는 조합 방법의 사용을 통해 향상될 수 있다는 것을 인식한다.
다수의 종래의 화합물이 항-신생물성 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 화합물은 고형 종양을 수축시키거나, 전이 및 추가 성장을 방지하거나, 백혈병성 또는 골수 악성종양에서 악성 T-세포의 수를 감소시키기 위해 화학요법에서 약제학적 제제로서 사용되어 왔다. 화학요법이 다양한 유형의 악성종양을 치료할 시에 효과적이었지만, 많은 항-신생물성 화합물은 바람직하지 않은 부작용을 유도한다. 2개 이상의 상이한 치료가 조합될 때, 치료는 상승작용으로 작용하고 각각의 치료의 투약량의 감소를 허용할 수 있어서, 이것에 의해 더 높은 투약량에서 각각의 화합물에 의해 가해지는 해로운 부작용을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 다른 사례에서, 치료에 불응성인 악성종양은 2개 이상의 상이한 치료의 병용 요법에 반응할 수 있다.
다양한 구현예에서, 제2 항암제, 예컨대 화학치료제가 환자에게 투여될 것이다. 예시적인 화학치료제의 목록은, 비제한적으로, 다우노루비신, 닥티노마이신, 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신, 질소 머스타드, 클로르암부실, 멜팔란, 사이클로포스파마이드, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 벤다무스틴, 사이타라빈(CA), 5-플루오로우라실(5-FU), 플록수리딘(5-FUdR), 메토트렉세이트(MTX), 콜히친, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 테니포시드, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 펜토스타틴, 클라드리빈, 사이타라빈, 젬시타빈, 프랄라트렉세이트, 미톡산트론, 디에틸스틸베스트롤(DES), 플루라다빈(fluradabine), 이포스파마이드, 하이드록시우레아탁산(예컨대 파클리탁셀 및 독세탁셀) 및/또는 안트라사이클린 항생제 뿐만 아니라, 비제한적으로, DA-EPOCH, CHOP, CVP 또는 FOLFOX와 같은 제제의 조합을 포함한다. 다양한 구현예에서, 그러한 화학치료제의 투약량은, 비제한적으로, 약 10 mg/m2, 20 mg/m2, 30 mg/m2, 40 mg/m2, 50 mg/m2, 60 mg/m2, 75 mg/m2, 80 mg/m2, 90 mg/m2, 100 mg/m2, 120 mg/m2, 150 mg/m2, 175 mg/m2, 200 mg/m2, 210 mg/m2, 220 mg/m2, 230 mg/m2, 240 mg/m2, 250 mg/m2, 260 mg/m2, 및 300 mg/m2 중 임의의 것을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 개시의 병용 요법은, 비제한적으로, 특이적 종양 항원에 대한 고갈 항체를 이용하는 치료; 항체-약물 콘주게이트를 사용하는 치료; 공-자극 또는 공-억제 분자(면역 관문) 예컨대 CD276, CD272, CTLA-4, PD-1, PD-L1, CD40, SIRPa, CD47, OX-40, CD137, GITR, LAG3, ICOS, CD27, 4-1BB, TIM-3, B7-H4, Siglec 7, Siglec 8, Siglec 9, Siglec 15 및 VISTA에 대한 작용적, 길항적, 또는 차단적 항체를 사용하는 치료; 이중특이적 T 세포 결합 항체(BiTE®) 예컨대 블리나투모맙을 사용하는 치료: 생물학적 반응 조절제 예컨대 IL-2, IL-7, IL-12, IL-21, GM-CSF, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ의 투여를 수반하는 치료; 치료적 백신 예컨대 시푸류셀-T를 사용하는 치료; 수지상 세포 백신, 또는 종양 항원 펩타이드 백신을 사용하는 치료; NK 세포를 사용하는 치료; TCR-T 세포를 사용하는 치료; 키메라 항원 수용체 (CAR)-T 세포를 사용하는 치료; CAR-NK 세포를 사용하는 치료; iPS 유도-NK 세포, iPS 유도 TCR-T 세포, iPS 유도 CAR-T 세포 또는 iPS 유도 CAR-NK 세포를 사용하는 치료; 수지상 돌기 세포를 사용하는 치료; 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocytes; TILs)를 사용하는 치료; 입양 전달된 항종양 T 세포(생체외 확장된 및/또는 TCR 형질전환)를 사용하는 치료; 백신 예컨대 바실리 칼메트-구에린(BCG)을 사용하는 치료; TALL-104 세포를 사용하는 치료; 면역자극 제제 예컨대 톨-유사 수용체(Toll-like receptor; TLR) 작용제 CpG를 사용하는 치료, 및 이미퀴모드를 포함하는 면역요법의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함할 수 있으며; 여기서 병용 요법은 종양 세포의 증가된 효과기 세포 사멸을 제공하며, 즉, 동반상승효과는 공-투여될 때 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질과 면역요법 사이에 존재한다.
다양한 구현예에서, 병용 요법은 동일한 약제학적 조성물 또는 별도의 약제학적 조성물로, IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 및 제2 제제 조성물을 동시에 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 조성물 및 제2 제제 조성물은 순차적으로 투여되며, 즉, IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 조성물은 제2 제제 조성물의 투여 전후에 투여된다. 다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 조성물 및 제2 제제 조성물의 투여는 동반하며, 즉, IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 조성물 및 제2 제제 조성물의 투여 기간은 서로 중첩한다. 다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 조성물 및 제2 제제 조성물의 투여는 비-동반이다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 조성물의 투여는 제2 제제 조성물이 투여되기 전에 종결된다. 다양한 구현예에서, 제2 제제 조성물의 투여는 IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질 조성물이 투여되기 전에 종결된다.
도 1은　본 발명의 IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질에 대한 수 개의 형식 (format)을 도시한다. (A) IL-15/IL-15Rα 헤테로이량체성 Fc 융합 형식. (B) 1가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 형식. (C) 2가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 형식; (D) 1가 IL-15 (비-공유)/IL-15Rα Fc 융합 단백질 형식. (E) 2가 IL-15 (비-공유)/IL-15Rα Fc 융합 단백질 형식. 각각의 융합 단백질 형식에 대해, IL-15/IL-15Rα 복합체는 Fc 도메인의 C-말단 또는 N-말단에 있을 수 있고; IL-15Rα는 IL-15RαSushi 도메인 또는 IL-15RαECD 일 수 있다.
도 2는 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 각각에 의해 결정되는 바와 같은, 예시적인 IL-15/IL-15Rα (비-공유)-Fc 융합 단백질, P-0217, P-0234, 및 P-0313의 A) 순도 및 B) 단량체 백분율을 도시한다. 3개의 융합 단백질 모두는 C-말단에서 IL-15/IL-15Rα 복합체를 포함한다. P-0217은 1가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합이고, P-0234는 P-0217의 이량체성 대응물이고, P-0313은 P-0234와 동일한 융합 구성을 공유하지만 IL-15 도메인에서 S58D 치환과만 다르다.
도 3은 상이한 구성의 수 개의 IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질의 SEC 크로마토그램을 도시한다. 이들 예시적인 융합 단백질은 모두 달리 언급되지 않는 한 C-말단에서 IL-15/IL-15Rα 복합체를 포함한다. P-0162는 단량체성 IL-15 단독 Fc 융합 단백질이다. P-0197은 그것의 개략도가 도 1b에 도시된 1가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합이다. P-0153은 헤테로이량체성 Fc 융합 형식을 갖는 단량체성 IL-15/IL-15Rα 융합이다(도 1a). P-0167은 및 P-0198은 P-0162 및 P-0197 각각의 이량체성 대응물이다. P-0234, 및 P-0220, 및 P-0223은 모두 2가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질이다(도 1c). P-0220은 IL-15RαECD를 함유하고, P-0234는 IL-15RαSushi+ 도메인을 함유하고; P-0223은 그것의 IL-15/IL-15Rα 복합체가 Fc의 N-말단에 부착되는 P-0234와 다르다.
도 4는 ELISA 검정에서 IL-15R에 대한 결합 활성 상의 상이한 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 형식의 효과를 도시한다. IL-15Rα는 IL-15 Fc 융합 단백질의
Figure pct00054
결합 활성을 증가시키는 것으로 입증된다. P-0157(개방된 원)은 N-말단 2가 IL-15 (비-공유)/IL-15RαSushi Fc 융합 단백질이고; P-0153(폐쇄된 원)은 C-말단 IL-15/IL-15RαSushi 헤테로이량체성 Fc 융합 단백질이고; P-0162(폐쇄된 삼각형)는 IL-15RαSushi가 복합체화되지 않은 C-말단 1가 IL-15 Fc 융합 단백질이다.
도 5는　IL-15 Fc 융합 단백질의 생물학적 활성에 대한 IL-15Rα의 효과를 도시한다. IL-15Rα는 IL-15 Fc 융합 단백질의 생물학적 활성을 향상시키는 것으로 입증된다. CD69 양성 NK(도 5a) 및 CD8 T(도 5b) 세포의 유도는 생체외(ex vivo) 인간 PBMC FACS 기초 검정에서 측정되었다. P-0197(개방된 원)은 C-말단 1가 IL-15/IL-15RαSushi (비-공유) Fc 융합 단백질이고; P-0162(폐쇄된 원)는 IL-15RαSushi가 복합체화되지 않는 P-0197과 동일한 구조를 갖는 융합 단백질이다.
도 6은　IL-15 Fc 융합 단백질의 생물학적 활성에 대한 IL-15/IL-15Rα 착화 (complexation)의 상이한 구성의 효과를 도시한다. CD69 양성 NK(도 6a) 및 CD8+ T (도 6b) 세포의 유도는 생체외 인간 PBMC FACS 기초 검정에서 측정되었다. P-0165 (폐쇄된 원)는 C-말단 1가 IL-15 (비-공유)/IL-15Rα Fc 융합 단백질이고; P-0197 (개방된 원)은 C-말단 1가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질이고; P-0153 (개방 삼각형)은 C-말단 IL-15/IL-15Rα 헤테로이량체성 Fc 융합 단백질이다.
도 7은 상이한 형식에서 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 생물학적 활성에 대한 링커의 효과를 도시한다. CD69 양성 NK(도 7a) 및 CD8 T(도 7b) 세포의 유도는 생체외 인간 PBMC FACS 기초 검정에서 측정되었다. P-0165(폐쇄된 원) 및 P-0166(개방된 원)은 15-아미노산 강성(rigid) 링커 및 10-아미노산 가요성 (flexible) 링커 각각을 갖는 1가 IL-15 (비-공유)/IL-15Rα Fc 융합이다. P-0197 (폐쇄된 삼각형), P-0207(개방 삼각형), 및 P-0217(스타)은 각각 강성의, 10-aa 및 15-aa GS 풍부 가요성 링커를 갖는 1가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질이다.
도 8은 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 활성에 대한 N- 또는 C-말단 융합의 효과를 도시한다. 퍼센트 Ki67 양성 CD8 T 세포는 치료 후 생체외 인간 PBMC FACS 기초 검정에서 측정되었다. (A) P-0218(폐쇄된 원) 및 벤치마크(개방된 원)는 각각 C-말단 및 N-말단 2가 IL-15(비-공유)/IL-15Rα Fc 융합 단백질이다. (B) P-0234(폐쇄된 삼각형) 및 P-0223(개방 삼각형)은 각각 C-말단 및 N-말단 2가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질이다.
도 9는 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 생물학적 활성에 대한 IL-15Rα 전체 ECD 또는 Sushi 도메인의 효과를 도시한다. CD69 양성 NK 세포의 유도는 생체외 인간 PBMC FACS 기초 검정에서 측정되었다. (A) P-0234(폐쇄된 원) 및 P-0220(개방된 원)은 각각 IL-15Rα Sushi 및 전체 ECD를 갖는 C-말단 2가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질이다. (B) P-0223(폐쇄된 원) 및 P-0224(개방된 원)는 각각 IL-15Rα Sushi 및 전체 ECD를 갖는 N-말단 2가 IL-15/IL-15Rα(비-공유) Fc 융합 단백질이다. (C) P-0221(폐쇄된 원) 및 P-0222(개방된 원)는 각각 IL-15Rα Sushi 및 전체 ECD를 갖는 N-말단 1가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질이다.
도 10은　IL-15 폴리펩타이드의 S58D 치환이 CD8+ T 세포 (A), CD4+ T 세포 (B), 및 NK 세포 (C)에 대해 STAT5 인산화를 유도하기 위해 IL-15 융합 단백질의 능력을 향상시켰다는 것을 도시한다. P-0218(개방된 원) 및 P-0314(폐쇄된 원)는 각각 IL-15 야생형 및 S58D 변이체를 포함하는 2가 IL-15 (비-공유)/IL-15Rα Fc 융합 단백질이다. P-0234(개방 삼각형) 및 P-0313(폐쇄된 삼각형)은 각각 IL-15 야생형 및 S58D 변이체를 포함하는 2가 IL-15/IL-15Rα(비-공유) Fc 융합 단백질이다.
도 11은　IL-15 (S58D) 변이체-함유 융합 단백질이 CD8+ T 세포 (A), CD4+ T 세포 (B) 및 NK 세포 (C)에 대해 Ki67 발현을 유도하기 위해 향상된 능력을 나타냈다는 것들 도시한다. P-0218(개방된 원) 및 P-0314(폐쇄된 원)는 각각 IL-15 야생형 및 S58D 변이체를 포함하는 2가 IL-15(비-공유)/IL-15Rα Fc 융합 단백질이다. P-0234(개방 삼각형) 및 P-0313(폐쇄된 삼각형)은 각각 IL-15 야생형 및 S58D 변이체를 포함하는 2가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질이다.
도 12는 4일간의 반복된 투약 연구에서 rhIL-15, 벤치마크 및 P-0234로 처치된 마우스에서 IL-15의 혈청 농도를 도시한다. 암컷 B Balb/C 마우스는 비히클, rhIL-15(0.03 mg/kg), 벤치마크(0.1 및 0.5mg/kg), 또는 P-0234(0.1 및 0.5 mg/kg)로 매일 복강내 주사되었다. 말단 혈액은 4일째 되는 마지막 주사 후 1시간에 수집되었고 혈청 IL-15 수준은 ELISA 검정을 사용하여 측정되었다.
도 13은　4일간의 반복된 투약 연구 동안 rhIL-15, the 벤치마크 및 P-0234으로 처치된 Balb/C 마우스에서 체중 (A) 및 0 일부터 체중의 % 변화 (B)를 도시한다. 데이터는 평균±SEM으로 표현된다. 통계적인 분석은 Tukey의 사후 검증 전에 일원분산분석(one-way anova)에 의해 수행되었다. 0 일째 대비 *** p<0.001이며; PBS 그룹 대비 # p<0.05이다.
도 14는　4일간의 반복된 투약 연구에서 Balb/C 마우스의 말초 혈액 내의 NK 세포 증식 및 확장에 대한 IL-15 화합물의 효과를 도시한다. 4일간의 투여 후, 혈액은 FACS에 의해 Ki67 측정 및 NK 세포 표현형을 위해 수집되었다. (A) 증식 마커 Ki67 양성 NK 세포의 백분율; (B) CD3 음성 림프구 모집단 내의 NK 세포의 백분율. 데이터는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적인 분석은 Tukey의 사후 검증 전에 일원분산분석에 의해 수행되었다. 비히클 그룹 대비 **** p<0.0001이며, 벤치마크의 등가 용량 대비 # p<0.001 및 ## p<0.01이다.
도 15는 4일간의 반복된 투약 연구에서 Balb/C 마우스의 비장 NK 세포의 증식, 확장 및 활성화에 대한 IL-15 화합물의 효과를 도시한다. (A) 증식 마커 Ki67 양성 비장 NK 세포의 백분율; (B) 비장 내의 총 NK 세포; (C) CD69 양성 비장 NK 세포의 백분율. 데이터는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적인 분석은 Tukey의 사후 검증 전에 일원분산분석에 의해 수행되었다. 비히클 그룹 대비 **** p<0.0001, ** p<0.01, * p<0.05이다.
도 16은 Balb/C 마우스에서 단일 복강내 주사 후 P-0313 및 벤치마크의 혈청 농도를 도시한다. 혈액은 -24시간(투여전) 및 투여 후 1, 4, 24, 72, 144 및 192 시간에서 0.3 mg/kg P-0313 또는 벤치마크로 처치된 마우스로부터 수집되었다. (A) 인간 Fc-IL-15 복합체를 검출하는 인-하우스 ELISA 검정; (B) 인간 IL-15를 검출하는 상업적 ELISA 검정.
도 17은　8일의 기간에서 P-0313 및 벤치마크의 단일 주사 후 Balb/C 마우스의 체중을 도시한다.
도 18은　Balb/C 마우스에서 단일 주사 후 NK (A) 및 CD8+ T 세포 (B) 상의 Ki67 발현에 대한 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 용량- 및 시간-의존적 효과를 도시한다. 혈액은 FACS 분석에 의한 림프구 표현형 및 Ki67 측정을 위해 -24시간(투여전), 및 1, 4, 24, 72, 144 및 192 시간에서 수집되었다. 데이터는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적인 분석은 Tukey의 사후 검증 전에 이원분산분석(two-way anova)에 의해 수행되었다. 각각의 시점에서 PBS 그룹 대비 **** p<0.0001, ** p<0.01, * p<0.05이다.
도 19는　Balb/C 마우스에서 단일 주사 후 말초 혈액에서 NK (A) 및 CD8+ T 세포 (B)의 확장에 대한 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 용량- 및 시간-의존적 효과를 도시한다. 혈액은 FACS 분석에 의한 림프구 표현형을 위해 -24시간(투여전), 및 1, 4, 24, 72, 144 및 192 시간에서 수집되었다. 데이터는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적인 분석은 Tukey의 사후 검증 전에 이원분산분석에 의해 수행되었다. 각각의 시점에서 PBS 그룹 대비 **** p<0.0001, *** p<0.001, * p<0.05이다.
도 20은 마우스 CT26 폐 전이 모델에서 P-0313 및 벤치마크에 의한 폐 전이의 억제를 도시한다. 비히클, 벤치마크(0.3mg/kg) 또는 P-0313(0.03 및 0.1 mg/kg)은 CT26 세포의 주사 후 1일에 개시된 3×Q5D 용량이 주어졌다. 마우스는 폐 전이성 결절의 현미경적 계수를 위해 16일째 되는 날 희생되었다. (A) 각각의 처치 그룹으로부터의 전이성 결절을 예시하는 대표적인 폐 사진. (B) 광학 현미경 하에서 수득되는 폐 결절 카운트들. 데이터는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적인 분석은 Tukey의 사후 검증 전에 일원분산분석에 의해 수행되었다. PBS 그룹 대비 **** p<0.0001, * p<0.05이다.
도 21은 P-0313 또는 벤치마크으로의 처치 후 CT26 폐 전이 모델에서의 면역-약력학적 프로파일링을 도시한다. CT26 전이 마우스에서
Figure pct00055
전혈 당 순환하는 A) NK 세포, 및 B) CD8+ T 세포수의 증가는 P-0313, 벤치마크, 또는 PBS의 3회의 Q5D 복강내 주사 후 3일에 유세포측정에 의해 결정되었다. 데이터는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적인 분석은 Tukey의 사후 검증 전에 일원분산분석에 의해 수행되었다. PBS 그룹 대비 **** p<0.0001, *** p<0.001, ** p<0.01이다.
도 22는 CT26 폐 전이 모델에서 P-0313 또는 벤치마크으로 처치되는 마우스의 비장 무게를 도시한다. 비장은 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 3회의 Q5D 복강내 주사 후 3일에 수집되었다. 데이터는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적인 분석은 Tukey의 사후 검증 전에 일원분산분석에 의해 수행되었다. PBS 그룹 대비 **** p<0.0001이다.
도 23은 P-0313 또는 벤치마크으로 처치된 CT26 폐 전이 마우스의 간독성 평가를 도시한다. 간은 3회의 Q5D 처치 후 3일에 수집되었다. A) 간 중량; B) 혈청 ALT 수준; 및 C) 혈청 AST 수준. 혈청 내의 ALT 및 AST 수준은 상업적 ELISA 키트를 사용하여 결정되었다. 데이터는 평균±SEM으로 표현되었다.
도 24는 피하로 확립된 CT26 쥣과 결장직장 종양 모델에서 P-0313의 항종양 효능을 도시한다. 1×105 CT26 세포는 0 일째 되는 날 피하로 주사되었다. 비히클(PBS) 또는 P-0313(0.1 또는 0.05 mg/kg)은 평균 종양 부피가 약 70 mm3(11일)일 때 개시되는 2회 주사를 위해 Q5D를 제공하고 있었다. (A) CT26 피하(s. c.) 종양의 성장 곡선. (B) 기준선으로부터의 체중 변화. 데이터는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적인 분석은 Tukey의 사후 검증 전에 이원분산분석에 의해 수행되었다. PBS 그룹 대비 ** p<0.0001이다.
도 25는 (A) 비히클 PBS, (B) 0.05 mg/kg P-0313, 또는 (C) 0.01 mg/kg P-0313을 받은 개별 마우스의 피하 CT26 종양 성장 곡선을 도시한다. n = 10/그룹이다.
도 26은 CT26 쥣과 결장직장 암종 종양 모델에서 P-0313으로 처치되는 마우스의 NK 및 CD8 T 세포 증식 및 확장을 도시한다. 종양 이식 후 11일에 개시되는 2회의 Q5D 처치 후, NK 세포 및 CD8+ T 세포에 대한 Ki67 발현 (A-B) 및 (㎕ 전혈 당) 순환 세포 수 (C-D)의 증가는 유세포측정에 의해 19일째 되는 날 결정되었다. 데이터는 평균±SEM으로 표현되었으며; 통계적인 분석은 Tukey의 사후 검증 전에 일원분산분석에 의해 수행되었다. PBS 그룹 대비 **** p<0.0001, * P<0.05이다.
도 27은 P-0313으로 처치되는 CT26 결장직장 종양을 가진 마우스에서 비장 NK 및 CD8 T 세포의 면역-표현형을 도시한다. 종양 이식 후 11일에 개시되는 2회의 Q5D 처치 후, 21일째 되는 날 비장 NK 세포 (A) 및 CD8+ T 세포 (B) 수의 증가는 유세포측정에 의해 결정되었다. 데이터는 평균±SEM으로 표현되었으며; 통계적인 분석은 Tukey의 사후 검증 전에 일원분산분석에 의해 수행되었다. PBS 그룹 대비 **** p<0.0001이다.
도 28은 비-확립된 CT26 결장직장 종양 모델에서 P-0313의 항종양 효능을 도시한다. 1×105 CT26 세포의 피하 이식 3일 후, 마우스는 5회의 주사 동안 비히클 (PBS) 또는 P-0313(0.1 mg/kg) Q5D가 주어졌다. (A) 0일째 되는 날 종양 세포 이식 후 CT26 피하 종양의 성장 곡선. (B) 25일째 되는 날 종양 중량. 데이터는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적인 분석은 Tukey의 사후 검증 전에 일원분산분석에 의해 수행되었다. PBS 그룹 대비 *** p<0.001, * p<0.05이다.
도 29는 P-0313으로 처치되는 CT26 종양을 가진 마우스의 비장 무게 및 체중 퍼센트 변화를 도시한다. 마우스는 CT26 종양 세포 이식 3일 후 5회의 주사 동안 비히클(PBS) 또는 P-0313(0.1 mg/kg) Q5D가 주어졌다. (A) 25일째 되는 날 비장 무게. (B) 25일 동안 체중 퍼센트 변화. 데이터는 평균±SEM으로 표현되었다. 통계적인 분석은 Tukey의 사후 검증 전에 일원분산분석에 의해 수행되었다. PBS 그룹 대비 ** p<0.01이다.
다음 실시예는 본 개시를 보다 완전히 예시하기 위해 제공되지만 그 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1
IL-15/IL-15RαSushi-Fc 융합 단백질의 구조, 발현, 및 정제
모든 유전자는 포유동물 세포에서 발현에 최적화된 코돈이었으며, 이는 수령체 포유동물 발현 벡터(GenScript)로 합성 및 서브클로닝되었다. 단백질 발현은 CMV 프로모터에 의해 유도되고 합성 SV40 폴리A(polyA) 신호 서열은 CDS의 3' 단부에 존재한다. 선도 서열은 분비를 위한 적절한 신호전달 및 처치를 보장하기 위해 작제물의 N-말단에서 설계되었다. 융합 단백질은 폴리에틸렌이민을 사용하여 포유동물 발현 벡터와 현탁액에서 성장하는 HEK293-F 세포를 공-형질감염시킴으로써 생산되었다(PEI, 25,000 MW linear, Polysciences). 2개 이상의 발현 벡터가 있는 경우, 벡터는 1:1 비로 형질감염될 것이다. 형질감염을 위해, HEK293 세포는 무혈청 FreeStyleTM 293 발현 배지(ThermoFisher)에서 배양되었다. 1000 ml 진탕 플라스크(최대 작업 용적 330 mL)에서의 생산을 위해, 0.8×106 세포/ml의 밀도에서의 HEK293 세포는 형질감염 전에 24시간 씨딩되었다. 330 ㎍ DNA의 총량에 대한 발현 벡터는 16.7 ml Opti-mem 배지(ThermoFisher)와 혼합되었다. 16.7 ml Opti-mem 배치에 희석된 0.33 mg PEI의 첨가 후, 혼합물은 15초 동안 와동되었고 후속으로 10분 동안 실온에서 인큐베이션되었다. 그 다음, DNA/PEI 용액이 세포에 첨가되었고 8%의 CO2　분위기를 갖는 인큐베이터의 37℃에서 인큐베이션되었다. 2 mg/L의 최종 농도의 나트륨 부티레이트(Millipore Sigma)는 단백질 발현을 유지시키는 것을 돕기 위해 4일째에 세포 배양물에 첨가되었다. 6일의 배양 후, 상청액은 2200 rpm에서 20분 동안 원심분리에 의해 정제를 위해 수집되었다. 용액은 멸균 여과되었다 (0.22 ㎛ 필터, Corning). 분비된 단백질은 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 세포 배양물 상청액으로부터 정제되었다.
분비된 단백질은 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 세포 배양물 상청액으로부터 정제되었다. 세포 배양물 상청액은 포스페이트 완충 식염수, pH 7.2(ThermoFisher)의 5 칼럼 부피(column volume; CV)로 평형화된 HiTrap MabSelect SuRe 5 ml 칼럼(GE Healthcare) 상으로 장입되었다. 미결합된 단백질은 5 CV PBS pH 7.2로 세척함으로써 제거되었고, 표적 단백질은 25 mM 나트륨 시트레이트, 25 mM 염화나트륨, pH 3.2로 용출되었다. 단백질 용액은 3%의 1 M Tris pH 10.2를 첨가함으로써 중화되었다. 표적 단백질은 Amicon® Ultra-15 Ultracel 10K (Merck Millipore)를 사용하여 PBS, pH 7.2로 농축 및 완충 교환되었다.
정제된 분자의 순도 및 분자량은 환원제 및 쿠마씨(ImperialTM protein stain, ThermoFisher)로의 염색의 존재 및 부재에서 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. NuPAGE® Pre-Cast 겔 시스템(4-12% Bis-Tris, ThermoFisher)은 제조자의 지침에 따라 사용되었다. 분자의 응집 함량은 Agilent 1200 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템 상에서 분석되었다. 샘플은 25℃에서 이동상으로서 150 mM 인산나트륨, pH 7.0을 사용하여 AdvanceBio 크기-배제 칼럼(300Å, 4.6 x 150 mm, 2.7 ㎛, LC 칼럼, Agilent) 상으로 주사되었다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는 아미노산 서열에 기초하여 계산되는 몰 소광 계수에 의해 분할되는 나노드롭(Nanodrop) 분광측정기(ThermoFisher)를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정되었다. 정제된 단백질 샘플의 내독소 수준은 제조자의 지침에 따라 Endosafe nexgen-PTS(Charles River)를 사용하여 측정되었다.
단리된 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 작제물의 단백질 프로파일을 입증하는 예로서, P-0217, P-0234, 및 P-0313의 SDS-PAGE 분석이 도 2a에 도시된다. P-0217, P-0234, 및 P-0313은 모두 C-말단에서 IL-15/IL-15Rα 복합체를 포함하는 IL-15/IL-15Rα (비-공유)-Fc 융합 단백질이다. P-0217은 1가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합이고, P-0234는 P-0217의 이량체성 대응물이고, P-0313은 P-0234와 동일한 융합 구성을 공유하지만 IL-15 도메인에서 S58D 치환과만 다르다.
8.6 kDa의 계산된 분자량을 갖는 IL-15Rαsushi+ 도메인은 1가 및 2가 Fc 융합 둘 다를 위해 Fc 도메인에 융합되는 IL-15 또는 IL-15 변이체와 비-공유적으로 연관되었고, 그것은 변성 조건 하에서 해리되었고 첨예한(sharp) 밴드로서 예상된 위치로 이동되었다(도 2a). 겔 상의 IL-15Rα-sushi+ 밴드의 존재는 세포 배양물 성장 동안 IL-15와 IL-15Rα 사이의 비-공유 결합을 확인하였고; 그러한 연관은 저-pH 용출 조건 하에서 단백질 A 정제 동안 유지되었다.
도 2b의 크기 배제 크로마토그램은 1-2% 응집만이 연마 단계 없이 초기 단백질 A 포획 단계 후에 모든 3개의 융합 단백질에 대해 존재하였음에 따라 2개의 융합 형식에 대해 낮은 응집 성향을 나타냈다. 첨예한 주요 피크는 고유 완충 조건 하에서 IL-15 및 IL-15Rα의 긴밀한 연관을 더 시사한다.
또한, 융합 단백질의 발현 수준은 동일한 벡터 및 배양 조건 하에서 Fc-전용 단백질의 그것과 (2 배수 차이 내에서) 비교가능할 수 있었다. 높은 수율 및 낮은 응집 성향은 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질의 두 1가 및 2가의 양호한 현상성 프로파일을 입증하였다. 추가적으로, P-0313에 의해 예시화되는, IL-15에서의 아미노산 치환은 융합 단백질의 발현 프로파일에 영향을 미치지 않았으며; P-0313은 그것의 야생형 등가 P-0234와 거의 동일한 순도 및 응집 성향을 나타냈다(도 2).
실시예 2
상이한 융합 단백질 형식의 순도-집중 현상성 평가는 융합 단백질 현상성 프로파일을 향상시킬 시에 적절하게 복합체화된 IL-15Rα 도메인의 역할을 강조하였다.
단백질 A 정제된 샘플의 SEC 분석은 단백질 응집 성향 및 순도에 대한 상이한 융합 형식의 영향을 평가하기 위해 사용되었다. 단백질 발현 수준은 세포 성장 변동으로 인해 상이한 배치(batch) 사이에서 다를 수 있지만, 단백질 응집 성향 및 순도는 P-0234에 대해 도 3f 및 도 3h에 의해 예시된 바와 같이, 로트(lot)마다 거의 변동이 없는 특정 단백질과 연관되는 고유한 특성인 것으로 보였다는 것이 발명자들의 관찰이었다.
첫째, IL-15-Fc 융합 단백질의 단백질 순도에 대한 IL-15Rα의 착화의 영향은 5 분자에 기초하여 평가되었다. P-0162는 Hole-Fc-Linker1-IL-15 사슬(서열번호: 13) 및 빈(empty) Knob-Fc 사슬(서열번호: 7)을 함유하는 C-말단 단량체성 IL-15 단독 Fc 융합 단백질이다. P-0197은 그것의 개략도가 도 1b에 도시된 C-말단 1가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합이다. P-0197은 IL-15와 비-공유적으로 복합체화된 자유 IL-15RαSushi+ 도메인의 존재에 의해서만 P-0162와 다르다. P-0153은 그것의 카툰(cartoon) 다이어그램이 도 1a에 도시된 헤테로이량체성 Fc 융합 형식을 갖는 N-말단 단량체성 IL-15/IL-15Rα 융합이다. P-0167 및 P-0198은 각각 P-0162 및 P-0197의 이량체 대응물이다. 5 분자의 크기 배제 다이어그램이 도 3a 내지 도 3e에 예시된다.
도 3a에 보이는 바와 같이, IL-15Rα가 없는 IL-15-Fc 단량체성 융합은 84.5%의 단량체 함량을 갖고 다수의 불순물은 더 낮은 분자량이다. 대조적으로, P-0197은 98.6% 단량체 함량을 함유하고(도 3b), 단백질의 그러한 상당한 개선은 자유 IL-15RαSushi+ 도메인으로부터 명백하게 기여되었다. IL-15-Fc 융합 단백질의 단백질 품질에 대한 자유 IL-15RαSushi+ 도메인의 효과는 이량체성 형식에 대해 더 강조되었으며, 이는 각각 도 3d 및 도 3e에서 P-0167 및 P-0198 SEC 크로마토그램으로 도시된다. P-0167은 주요 피크의 양면 상에 숄더를 갖는 넓고 불규칙한 피크를 포함한다. 더욱 특히, P-0167은 신선한 인간 PBMC의 NK 및 T 세포를 활성화시킬 시에 임의의 생체외 활성을 도시하지 않았으며, 이는 단백질의 부정확한 폴딩으로 인한 가능성이 있었다. 그러나, 비-공유결합된 IL-15RαSushi+ 도메인을 이량체성 형태로 함유하는 P-0198은 90.5% 단량체 함량을 갖는 첨예한 주요 피크를 입증하였다(도 3e). 어느 정도 흥미로운 점은, IL-15RαSushi+ 도메인이 자유롭지 않지만, P-0153의 경우와 같이 매칭 헤테로이량체성 Fc에 공유적으로 융합되는 경우, IL-15-Fc와의 그것의 착화는 단백질 순도에서 임의의 개선을 산출하지 않았으며; 오히려, 단백질 샘플은 >25% 이량체 및 더 높은 분자량 가용성 응집체를 함유한다(도 3c). Fc 도메인에 대한 IL-15 및 IL-15Rα 둘 다의 융합은 그들이 생리학적 방식으로 상호작용하는 것을 방지하는 공간적 제약을 생성했을 가능성이 있다. 요약하면, IL-15RαSushi+ 도메인은 IL-15-Fc 융합 단백질 순도 및 생체물리학적 특성을 현저히 향상시킬 수 있지만, IL-15Rα 도메인이 호의적이고 구속받지 않은 방식으로 IL-15와 연관될 수 있을 때만이다.
둘째, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질의 현상성에 대한 IL-15RαECD(서열번호: 4) 대 IL-15RαSushi+(서열번호: 5)의 효과는 P-0234과 P-0220을 비교함으로써 평가되었다. 두 작제물은 P-0234에서 IL-15RαSushi+ 도메인, 및 P-0220에서 IL-15RαECD를 갖는 도 1c에 도시된 바와 같은 동일한 구성을 공유하는 C-말단 Fc 융합이다. 그것의 SEC 크로마토그램은 도 3f 및 도 3g에 각각 도시된다. IL-15RαECD 도메인을 포함하는 단백질인 P-0220은 그것의 IL-15RαSushi+-함유 대응물 P-0234보다 더 낮은 순도(88.5% 대 100%)를 가질 뿐만 아니라, 세포의 동일한 배치에서 2.5 배수 더 낮은 수준에서 발현되었다. 요약하면, IL-15RaSushi+ 도메인은 더 개발가능한 IL-15/IL-15Ra-Fc 융합 단백질을 구성할 시에 IL-15RαECD보다 바람직한 파트너라는 것이 분명하다.
또한, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질의 현상성에 대한 융합 말단의 영향이 평가되었다. P-0234 및 P-0223은 각각 Fc의 C-말단 및 N-말단에 부착되는 IL-15/IL-15RαSushi 복합체를 갖는 이량체성 IL-15/IL-15Rα(비-공유) Fc 융합 단백질이다. 그것의 SEC 크로마토그램(도 3h 및 도 3i)은 순도에서 다소 미묘한 차이를 도시한다(98.5% 대 93.9%). 그러나 정제된 P-0223은 일관되게 더 높은 분자량 종의 넓은 피크 및 사실상 P-0234에 사실상 존재하지 않았던, 더 낮은 분자 불순물을 함유하는 작지만 주목할 만한 피크를 포함한다. 작은 차이에도 불구하고, C-말단 융합을 갖는 P-0234은 의론의 여지가 없이 더 양호한 SEC 순도 프로파일을 갖고 두 분자가 비교가능한 수준에서 발현했다는 것을 고려하면 현상성 관점으로부터 바람직한 형식이다.
결론적으로, IL-15Rα 서브유닛을 IL-15-Fc 융합과 복합체화하는 것은 현저하게 발현, 순도를 개선시키고, 응집을 저감시킬 수 있고; 그러한 개선은 최소 공간적 제약으로 IL-15와의 적절한 IL-15Rα 연관을 요구한다. 그리고 IIL-15Rα ECD의 절단된 버전인 L-15RαSushi+는 생산성 및 순도 평가 둘 다에 기초하여 전장 ECD보다 바람직한 것으로 나타났다. 또한, IL-15/IL-15Rα복합체를 Fc의 C-말단에 배치시키는 것은 고순도를 달성하기 위해 N-말단 융합보다 유리하다. 결과적으로, P-0234에 의해 예시화되는 이량체성 IL-15/IL-15Rα (비-공유) C-말단 Fc 융합 형식은 모든 바람직한 구성요소를 통합하고 우월한 형식을 나타낸다.
실시예 3
IL-15Rα의 비-공유 연관은 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 수용체 결합 및 생물학적 활성을 향상시킨다.
IL-15는 고친화도를 갖는 그것의 특이적 수용체 IL-15Rα에 결합하고 둘 다는 항원 제시 세포 상에서 발현된다. IL-15와 IL-15Rα의 연관은 NK, T 및 B 세포를 포함하는, 반응 림프구 상에서
Figure pct00056
및
Figure pct00057
로 구성되는 헤테로이량체성 수용체 복합체로 IL-15를 트랜스-제시한다. 리간드-삼량체 수용체 복합체(IL-15-IL-15Rαbg)의 형성은 다운스트림 생물학적 효과를 초래하는 세포내 신호전달 캐스케이드를 개시한다. IL-15 수용체 생물학의 복잡성은 형태적으로 효과적인 리간드-삼량체 수용체 신호전달 복합체를 가능하게 하는 최적의 IL-15 융합 단백질을 설계하기 위한 도전을 피한다.
우리는 N-말단 또는 C-말단에서 인간 IgG의 Fc 일부에 대한 IL-15의 공유결합이 IL-15RαFc 융합 단백질과의 비-공유 연관에서 IL-15보다 생체내 반감기 연장에 대해 보다 유리할 것이라고 가정하였다. 우리는 IL-15Rα 도메인이 중간 친화도
Figure pct00058
수용체와 그것의 상호작용을 향상시키고 고친화도 리간드-삼량체 수용체 신호전달 복합체의 형성을 용이하게 하기 위해 IL-15 Fc 융합 단백질에 대해 요구된다고 더 상정하였다. 더욱이, 우리는 IL-15 Fc 융합 단백질과 IL-15Rα 도메인의 비-공유 연관이 천연 IL-15와 IL-15Rα 연관 및 IL-15 트랜스-제시를 위한 최적의 형태를 유지시킨다고 믿는다. 또한, 우리는 IL-15와 IL-15Rα 도메인 사이의 극도로 높은 결합 친화도로 인하여 그러한 융합 단백질 복합체를 생산하는 것이 실행가능하다고 가정하였다.
다양한 구성의 IL-15/IL-15Rα 도메인 복합체를 함유하는 IL-15 Fc 융합 단백질의 상이한 형식이 구성되었다.
Figure pct00059
서브유닛에 대한 융합 단백질의 결합 활성이 결정되었고 림프구 활성화를 자극할 시의 그것의 생물학적 활성은 인간 CD8 및 NK 세포 상의 CD69 발현을 측정함으로써 분석되었다. 융합 단백질의 예시적인 구조 다이어그램이 도 1에 도시된다.
결합 활성은 ELISA 검정에서 시험되었다. 간단히, Nunc Maxisorp (ThermoFisher) 플레이트는 바이카보네이트 완충액 pH 9.4(ThermoFisher)의 1 ㎍/웰(100 ㎕/웰)에서 huIL-15Rβ-6His로 4℃에서 밤새 코팅되었다. PBS/0.05% Tween20로 3회 세척한 후, 플레이트는 비특이적 결합을 차단하기 위해 2시간 동안 실온에서 슈퍼블록(SuperBlock)(300 ㎕/웰)으로 인큐베이션되었다. 세척 후, 차단 완충액을 사용한 3 배수 연속 희석에서 각각의 IL-15 화합물은 플레이트(100 ㎕/웰)에 첨가되었고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션되었다. 세척 후, Fc 융합은 차단 완충액(ThermoFisher)(100 ㎕/웰)에서의 1:5000 희석에서 홀스래디쉬 페록시다아제(HRP)와 접합되는 염소 항-인간 IgG Fc 이차 항체로 실온에서 1 시간 인큐베이션에 의해 검출되었다. 세척 후, TMB 기질(ThermoFisher)이 첨가되었다(100 ㎕/웰). 플레이트는 밀봉되었고 어두운 실온에서 5-20분 인큐베이션되었다. 반응은 2N 황산(Ricca Chemical)(50 uL/웰)을 첨가함으로써 중단되었고 흡광도는 450-590 nm에서 판독되었다.
생물학적 활성은 인간 NK 및 CD8 T 세포 상의 CD69 발현의 유도를 측정함으로써 결정되었다. CD69는 림프구 활성화 동안 초기에 유도되는 세포 표면 당단백질이다. 생체외 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 검정은 IL-15 치료 다음에 CD69를 발현시키는 NK 또는 CD8 T 세포의 수/퍼센트를 분석하기 위해 확립되었다. 구체적으로, 인간 PBMC는 오클라호마 혈액 연구소(Blood Oklahoma Institute)로부터 구매되는 버피 코트(buffy coat)로부터 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque) 원심분리에 의해 단리되었다. 정제된 인간 PBMC는 각각의 IL-15 테스트 화합물의 연속 희석으로 처치되었고 48 시간 동안 37℃에서 인큐베이션되었다. 세포는 300G 원심분리에 의해 수집되었고 FACS 완충액에서 재현탁되었다. 인간 TruStain FcX(1:50 희석)을 첨가함으로써 Fc 수용체를 차단한 후, 세포는 항-인간 CD56-FITC, 항-인간 CD69-PE 및 항-인간 CD8-APC 항체(1:50 희석)로 염색되었다. 실온에서 항체와 함께 30분 인큐베이션 후, 세포는 수집 및 세정되었고, FACS 완충액에서 재현탁되었고 유세포측정 분석을 위해 준비되었다. CD69 발현은 CD56+ NK 및 CD8+ T 세포 상에서 결정되었고 데이터는 게이팅된 모집단에서 CD69 양성 세포의 %로서 표현된다.
P-0157은 N-말단 2가 IL-15 (비-공유)/IL-15RαSushi Fc 융합 단백질이며; P-0153은 C-말단 IL-15/IL-15RαSushi 헤테로이량체성 Fc 융합 단백질이며; P-0162는 IL-15RαSushi가 복합체화되지 않은 C-말단 1가 Fc-IL-15 융합 단백질이다. ELISA 결합 검정은 IL-15RαSushi 도메인의 편입이 IL-15Rα가 복합체화되지 않은 융합 단백질(P-0162)(도 4)과 비교하여 IL-15Rβ에 대한 IL-15 Fc 융합 단백질(P-0157 및 P0153)의 결합 강도를 상당히 증가시켰다는 것을 나타냈으며, 수용체와 융합 단백질의 상호작용을 용이하게 할 시에 IL-15Rα의 필수적인 역할을 시사한다. 더욱이, 수용체 결합 활성은 IL-15 및 IL-15Rα 둘 다가 IL-15Rα Fc 융합 단백질 (P-0157)에 비-공유적으로 한정되는 IL-15와 대조적으로 헤테로이량체성 형태(P-0153)로 Fc에 공유적으로 접합되었을 때 감소되었으며(도 4), 형태적으로 구속된 융합 형식이 수용체 결합 활성에 부정적으로 영향을 미친다는 것을 시사한다.
결합 효력과 일치하여, IL-15Rα의 편입은 또한 IL-15Rα를 갖지 않는 융합 단백질과 비교하여 IL-15 융합 단백질의 생물학적 활성을 증가시켰다. P-0197은 C-말단 1가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질이고 P-0162는 IL-15RαSushi가 포함되지 않은 P-0197와 동일한 구조를 공유한다. P-0197은 IL-15Rα의 봉입에 기인하는, P-0162와 비교하여 CD69 양성 NK 세포(도 5a) 및 CD8 T 세포(도 5b) 각각의 유도에서 10 배수 및 6 배수 증가된 효력을 입증하였다.
마지막으로, 3개의 C-말단 1가 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 생물학적 활성이 비교되었다. P-0165는 IL-15Rα가 Fc 도메인에 융합되고 IL-15가 비-공유 결합되는 Fc 융합 단백질이며; P-0197은 Fc 도메인에 융합되는 IL-15 및 비-공유 결합되는 IL-15Rα와 역으로 구성되며; P-0153은 IL-15 및 IL-15Rα 둘 다가 Fc 도메인에 융합되는 헤테로이량체성 구조를 갖는다. 도 6에 도시된 바와 같이, IL-15 또는 IL-15Rα와 비-공유 착화를 갖는 융합 단백질은 두 IL-15/IL-15Rα가 Fc에 공유적으로 및 헤테로이량체성으로 융합되는 융합 단백질보다 CD69 양성 NK(도 6a) 및 CD8 T 세포(도 6b)의 유도에서 더 양호한 효력을 입증하였다. 데이터는 IL-15와 IL-15Rα 사이의 형태적으로 최적의 연관이 IL-15 융합 단백질이 그것의 수용체를 결합시키고 그것의 생물학적 활성을 가하는 데 중요하다는 것을 시사한다. 증가된 형태적 제약, 예를 들어 헤테로이량체성 Fc 융합 형식은 생물학적 활성에 부정적으로 영향을 미친다.
실시예 4
IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 활성에 대한 링커의 효과
단백질 도메인을 결합시키기에 위한 적합한 링커의 선택은 융합 단백질 엔지니어링에서 중요하다. 펩타이드 링커는 융합 단백질 도메인 사이의 공간적 거리를 제공하고 그것의 독립적인 폴딩을 허용할 뿐만 아니라, 융합 단백질의 구조적 안정성 및 기능성 특성에 직접적으로 영향을 미친다. 여기서, 우리는 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 생물학적 활성에 대한 링커의 가요성 및 길이의 효과를 조사한다.
생물학적 활성은 이전에 설명된 바와 같은 생체외 인간 PBMC FACS-기반 검정에서 인간 NK 및 CD8 T 세포 상의 CD69 발현의 유도를 측정함으로써 결정되었다. P-0165 및 P-0166은 각각 10 아미노산 강성 및 가요성 링커를 갖는 단량체성 IL-15 (비-공유)/IL-15Rα Fc 융합이다. P-0197, P-0207 및 P-0217은 각각 강성 링커, 10 및 15 아미노산 길이의 GS 풍부 가요성 링커를 갖는 1가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질이다. 결과는 Fc 및 IL-15(P-0165 및 P-0166) 또는 Fc 및 IL-15Rα (P-0197, P-0207 및 P-0217)를 결합시키는 펩타이드 링커의 강성 또는 길이는 시험되는 융합 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치치 않았다는 것을 나타냈다(도 7a 및 도 7b).
실시예 5
IL-15/IL-15Rα 융합 단백질의 활성에 대한 원자가의 효과
치료 용도를 위한 Fc 융합 단백질은 IgG1 Fc가 힌지 영역에 형성되는 디설파이드 결합으로 인해 자연적으로 동종이량체화되기 때문에 대부분 동종이량체성이다. 이량체성 단백질은 결합능, 안정성, 양, 크기 및 기능에서 이점을 갖는다. 그러나, Fc 엔지니어링은 단량체성 Fc 융합 단백질을 생성할 수 있을 것이다. 변경은 생물학적 활성, 약동학, 부작용에 영향을 미치거나, 조직 침투를 위해 이량체성 단백질의 크기를 감소시킬 수 있을 것이다. IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 생물학적 활성에 대한 원자가의 효과를 평가하기 위해, 상이한 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 구성을 갖는 단량체성 및 동종이량체성 형태 둘 다가 구성되었고 생물학적 활성 시험되었다.
생물학적 활성은 이전에 설명된 바와 같은 생체외 인간 PBMC FACS-기반 검정에서 인간 NK 및 CD8 T 세포 상의 CD69 발현의 유도를 측정함으로써 결정되었다. 결과는 IL-15/IL-15Ra Fc 융합 단백질의 동종이량체성 형태가 시험된 모든 융합 형식에 걸쳐 각각의 단량체성 대응물과 비교하여 생물학적 활성에서 대략 2 배수 향상을 보였다는 것을 나타냈으며(표 2), 이량체성 원자가가 기능성에서 이점을 제공할 수 있다는 것을 시사한다.
[표 2]
IL-15/IL-15Rα 융합 단백질의 생물학적 활성에 대한 IL-15/IL-15RαSushi 복합 원자가의 효과
Figure pct00060
실시예 6
IL-15의 생물학적 활성에 대한 N- 또는 C-말단 Fc 융합의 효과
Fc 융합 단백질은 간격 링커에 의해 연결되는 Fc의 N- 또는 C-말단에 IL-15/IL-15Rα복합체를 배치시킴으로써 구성될 수 있다. 최적의 스캐폴드는 융합 단백질이 정확하게 폴딩되고 발현되는지 여부, 및 생물학적 활성이 유지되는지 여부에 의해 결정된다. IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질은 IL-15/IL-15Rα복합체를 링커에 의해 이격되는 N- 또는 C-말단에 부착시킴으로써 생성되었다. IL-15/IL-15Rα복합체는 또한 C- 및 N-말단 융합의 맥락에서 상이하게 구성되었다. P-0218은 C-말단 2가 IL-15 (비-공유)/IL-15Rα Fc 융합 단백질이고, 벤치마크는 IL-15에 N72D 치환을 추가적으로 잠복시키는 P-0218의 N-말단 대응물이다. P-0234는 C-말단 2가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질이고, P-0223은 P-0234의 N-말단 대응물이다.
융합 단백질의 생물학적 활성은 IL-15 화합물 치료 다음에 NK 및 CD8 T 세포의 핵에서 Ki67 발현을 측정함으로써 결정되었다. IL-15는 NK, T 및 B 세포 증식 및 분화를 자극하는 강력한 림프구 성장 인자이다. Ki67은 세포 주기(G1, S, G2 및 M)의 모든 활성 단계에서 유도되는 핵 단백질이지만, 휴지기 단계(G0)에서 그렇지 않고 따라서 세포 증식을 위한 마커이다.
생체외 인간 PBMC 검정이 확립되었다. 간단히, 정제된 인간 PBMC는 IL-15 테스트 화합물의 연속 희석으로 처치되었고 3일 동안 37℃에서 인큐베이션되었다. 매 2일, 배지의 50%는 신선한 배지 및 테스트 화합물로 보충되었다. 3일째, 세포는 FACS 완충액(1% FBS/PBS)으로 한 번 세정되었고 Fc-차단제 및 항-인간 CD56-FITC, 항-인간 CD8-APC 및 항-인간 CD4-Percp-cy5.5(1:50 희석)를 포함하는 표면 마커 항체로 먼저 염색되었다. 30분 인큐베이션 및 세정 후, 세포 펠릿은 200 ㎕/웰의 1X Foxp3 고정화 및 투과화 작업 용액에 의해 충분히 재현탁되었고 암흑의 실온에서 30분 동안 인큐베이션되었다. 원심분리 후, 200 ㎕의 투과화 완충액이 또 다른 세정을 위해 각각의 웰에 첨가되었다. 세포 펠릿은 항-인간 Ki67-PE(1:10 희석)를 갖는 투과화 완충액에서 재현탁되었다. 실온에서 30분 인큐베이션 후, 세포는 수집 및 세정되었고, FACS 완충액에서 재현탁되었고 유세포측정 분석을 위해 준비되었다. 데이터는 게이팅된 모집단에서 Ki67 양성 세포의 %로서 표현되었다.
도 8에 도시된 바와 같이, C-말단 Fc 융합(P-0218 및 P-0234)은 일관되게 N-말단 Fc 융합 대응물(벤치마크 및 P-0223)보다 Ki67 양성 CD8 T 세포 또는 CD8 T 세포 증식의 더 강한 유도를 입증하였다(도 8a 및 도 8b). 데이터는 Fc의 C-말단이 IL-15/IL-15Rα 복합체의 연결(linkage)을 위한 바람직한 부위이고 생물학적 활성의 보존을 허용한다는 것을 시사한다.
실시예 7
IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 활성에 대한 수용체-알파 도메인 선택의 효과
IL-15는 IL-15Rα의 세포외 도메인(ECD)에 결합하고 결합은 주로 스시-도메인(sushi-domain)으로 칭하여지는 보존된 단백질 결합 모티프에 기여된다. 융합 단백질의 구성을 위해, IL-15Rα의 짧은 및 절단된 버전은 크기 및 구조 복잡성을 감소시키기 위해 바람직할 수 있다. 결합 특이성 및 친화도를 보장하기 위해, IL-15의 결합을 부여하는 ECD 도메인의 전체 또는 일부(추가적인 12 AA를 갖는 스시 도메인)는 융합 단백질로 구성되었고 기능적 활성이 결정되었다.
P-0234 및 P-0220은 C-말단 이량체성 IL-15/IL-15Rα (비-공유) 융합 단백질이며, 여기서 IL-15Rα는 각각 스시(sushi) 및 전체 ECD이다. P-0223 및 P-0224는 N-말단 이량체성 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질이며, 여기서 IL-15Rα는 각각 스시 및 전체 ECD이다. P-0221 및 P-0222는 N-말단 1가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질이며, 여기서 IL-15Rα는 각각 스시(sushi) 및 전체 ECD이다. 결과는 IL-15Rαsushi 도메인과 비-공유적으로 복합체화되는 융합 단백질이 N-말단 또는 C-말단, 이량체성 또는 단량체성으로서의 융합 형식과 관계없이, CD69 양성 NK 세포를 유도할 시에 IL-15Rα 전체 ECD로 복합체화되는 것보다 더 강력하였다는 것을 나타냈다(도 9). 데이터는 IL-15Rαsushi 도메인이 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질을 구성하고 신호전달 수용체와 상호작용하는 IL-15에 대해 최적의 형태를 부여하기 위해 전체 ECD보다 더 바람직하다고 시사한다.
실시예 8
IL-15 돌연변이체 및 IL-15Rβ에 대한 변이체 융합 단백질의 결합 활성
IL-15 작용제, 슈퍼-작용제 또는 길항제를 검색할 시에, 결실, 삽입 또는 점 돌연변이는 IL-15와 수용체 베타 또는 감마 사이의 접촉 간기(interphase)에서 인간 IL-15 펩타이드 서열로 도입되었다. 변이체는 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 상이한 형식으로 도입되었고
Figure pct00061
에 대한 결합 활성은 이전에 설명된 바와 같은 효소-링크된 면역흡착 검정(Enzyme-linked Immunosorbent Assays; ELISAs)에 의해 정량화되었다.
표 3은 C-말단 IL-15 변이체/IL-15Rα 헤테로이량체성 Fc 융합 단백질의
Figure pct00062
결합 활성을 도시한다. IL-15 변이체는 인간 IL-15 펩타이드에 도입되는 아미노산 결실, 삽입 또는 점 돌연변이를 갖는다. IL-15의 C-말단으로부터의 3 아미노산의 절단은 전장 폭 유형 IL-15 융합 단백질과 비교하여
Figure pct00063
에 대한 융합 단백질의 결합 활성을 유지시킨 반면, IL-15의 C-말단으로부터의 6 또는 9 아미노산의 추가적인 절단은 융합 단백질의 결합 활성에서 점진적인 감소를 초래하였다. N95 이후 다양한 길이를 갖는 GS 삽입은 융합 단백질의
Figure pct00064
결합 활성의 감소를 야기하였다. 위치 108에서의 단일 점 돌연변이(Q108S 및 Q108A) 및 조합 돌연변이(Q108S, D30T, V31Y, H31E)는 야생형 융합 단백질의
Figure pct00065
결합 효력을 크게 유지시켰다.
표 4는 단량체성 IL-15 변이체 (비-공유)/IL-15Rα Fc 융합 단백질의
Figure pct00066
결합 활성을 도시하며, 여기서 인간 IL-15 도메인은 위치 58, 62, 63, 67 또는 68에서 단일 아미노산 치환을 함유한다. IL-15 (I67V) 변이체를 함유하는 Fc 융합 단백질인 P-0185는 야생형 융합 단백질과 같은
Figure pct00067
에 대한 유사한 결합 활성을 입증하였다. 세린으로부터 아스파르트산(S58D)으로 위치 58에서의 아미노산 치환을 갖는 IL-15 변이체를 포함하는 융합 단백질인 P-0182는 야생형 융합 단백질과 비교하여
Figure pct00068
에 대한 결합 효력에서 4 배수의 향상을 입증하였다. IL-15 펩타이드의 위치 62, 63 및 68에서의 치환은 융합 단백질의
Figure pct00069
결합 활성에서 상이한 정도의 감소를 야기하였다.
표 5는 이량체성 IL-15 변이체/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질의
Figure pct00070
결합 활성을 도시하며, 여기서 인간 IL-15는 N95 이후 위치 58 또는 68에서 단일 아미노산 치환 또는 아미노산 삽입을 함유한다. 유사하게, P-0182(표 4)에서 보이는 바와 같이, S58D와 동일한 IL-15 변이체를 함유하는 P-0313은 그것의 각각의 야생형 융합 단백질 P-0234와 비교하여
Figure pct00071
에 대한 결합 효력에서 2 배수의 향상을 입증하였다. 데이터는 IL-15 펩타이드에서의 S58D 치환이 IL-15를 증진된 수용체 결합 활성에 기인하는 슈퍼-작용제로 조정할 수 있다는 개념을 강화시켰다.
요약하면, IL-15 변이체 Fc 융합 단백질은 생성되었고 차별적인
Figure pct00072
결합 활성으로 식별되었다. IL-15 변이체 중 일부는 그것의 야생형 대응물과 비교하여
Figure pct00073
에 결합하는 감소된 효력을 나타냈다(표 3-5). 일부 변이체, 예컨대 P-0173, P-0179, P-0180, P-0181, P-0185는 야생형과 유사하게
Figure pct00074
에 대한 결합 활성을 유지하였다(표 3). 인간 IL-15 도메인에서 위치 58에서의 세린의 아스파르트산으로의 치환을 갖는 단일 점 돌연변이는
Figure pct00075
에 대한 융합 단백질(P-0182 및 P-0313)의 증진된 결합 활성을 제공하였다.
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
실시예 9
IL-15 변이체/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 기능적 활성
IL-15 변이체/IL-15Rα 복합체의 Fc 융합 단백질은 림프구 활성화를 자극할 시에 그것의 기능적 활성에 대해 평가되었다. 생체외 인간 PBMC 검정은 이전에 설명된 바와 같이, 림프구 활성화 마커인, CD69를 발현시키는 CD8 T 세포의 수/퍼센트를 분석하기 위해 확립되었다.
P-0234는 Fc에 대한 공유 IL-15 연결, C-말단 융합, 이량체성 원자가 및 비-공유 IL-15Rαsushi 착화를 포함하는, 바람직한 구성의 조합에 의해 최적화되는 C-말단 이량체성 IL-15/IL-15Rαsushi (비-공유) Fc 융합 단백질이다. P-0313은 P-0234의 S58D 대응물이다. 그것은 P-0234와 동일한 융합 구성을 공유하지만 IL-15 폴리펩타이드에서 S58D 치환과만 다르다. P-0313은 이전의 야생형 대응물 P-0234과 비교하여 증가된
Figure pct00079
결합 활성을 입증하였다(표 5).
Figure pct00080
에 대한 증진된 결합 활성과 일치하여, S58D 돌연변이를 잠복시키는 변이체 P-0313은 또한 CD69 양성 T 세포를 유도할 시에 증가된 효력을 입증하였으며(표 6), P-0313이 슈퍼-작용제 활성을 나타낸다는 것을 확인하였다. 흥미롭게도, 야생형 융합 단백질(표 6)로서 비교가능하게
Figure pct00081
에 결합되는 2개의 IL-15 변이체 융합 단백질((P-0179 및 P-0181))은 CD69 양성 CD8 T 세포(표 6)를 유도하는 그것의 능력의 완전한 소실을 보여주었으며(표 3), 이들 2개의 IL-15 변이체는
Figure pct00082
와 상호작용하는 능력을 손상시킬 수 있고 이것은 폐지된 신호전달 활성 및 약화된 생물학적 기능을 초래한다는 것을 시사한다. P-0179 및 P-0181을 포함하는 이러한 변이체는 내인성 IL-15 기능을 차단하기 위해 우세한 음성 길항제의 역할을 할 수 있을 것이다.
IL-15 변이체/IL-15RαSushi 복합체의 추가적인 Fc 융합 단백질은 또한 CD69 검정에서 시험되었고, 그것의 생물학적 활성은 각각의 야생형 융합과 비교하여 유지되거나 감소되었다(표 6 및 표 7).
Figure pct00083
Figure pct00084
실시예 10
IL-15(S58D)/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 신호전달 활성
IL-15(S58D) 변이체는
Figure pct00085
에 대한 증가된 결합 활성 및 CD69 양성 림프구를 자극할 시에 향상된 효력을 입증하였다. 현재 연구는 NK 및 T 세포에서 전사 5(pSTAT5)의 신호 변환체 및 활성제의 세포내 인산화를 자극할 시에 IL-15 (S58D)/IL-15Rα 융합 단백질의 신호전달 활성을 검사하였다.
STAT5 인산화는 IL-15 화합물 치료 다음에 생체외 인간 PBMC 검정에서 세포내 FACS 분석에 의해 결정되었다. 간단히, 정제된 인간 PBMC는 IL-15 테스트 화합물의 연속 희석으로 처치되었고 15분 동안 37℃에서 인큐베이션되었다. 처치의 말에, 세포는 FACS 완충액(1% FBS/PBS)으로 한 번 세정되었고 15분 동안 37℃에서 150 ㎕/웰의 사전-가온된 사이토픽(Cytofix) 고정 완충액에서 인큐베이션되었다. 고정된 세포는 다시 세정되고 30분 동안 4℃에서 150 ㎕/웰의 사전-냉각된 펌 (Perm) 완충액 II에서 재현탁되어야 한다. 인간 TruStain FcX(1:50 희석)를 첨가함으로써 Fc 수용체를 차단한 이후, 세포는 항-인간 CD56-FITC, 항-인간 pSTAT5-PE, 항-인간 CD8-APC 및 항-인간 CD4-Percp-cy5.5(1:50 희석)로 염색되었다. 실온에서 항체와 함께 45분 인큐베이션 이후, 세포는 수집 및 세정되었고, FACS 완충액에서 재현탁되었고 유세포측정 분석을 위해 준비되었다. 데이터는 게이팅된 모집단에서 pSTAT5 양성 세포의 %로서 표현된다.
S58D 돌연변이는 Fc 융합 단백질의 2개의 형식으로 도입되었다: 2가 IL-15 (비-공유)/IL-15Rα Fc 융합 및 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질. P-0218 및 P-0314는 각각 야생형 및 S58D 변이체 IL-15를 포함하는 C-말단 이량체성 IL-15 (비-공유)/IL-15Rα Fc 융합 단백질이다. P-0234 및 P-0313은 각각 야생형 및 S58D 변이체 IL-15를 포함하는 C-말단 이량체성 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질이다. 융합 구성과 관계없이, IL-15(S58D) 변이체 융합 단백질(P-0314 및 P-0313)은 CD8(도 10a), CD4(도 10b) T 세포 뿐만 아니라, NK 세포(도 10c)에서 그것의 각각의 야생형 융합 단백질(P-0218 및 P-0234)과 비교하여 STAT5 인산화를 자극하는 효력에서 약 2 배수 증가를 입증하였다. 데이터는 IL-15 펩타이드에서의 S58D 치환은 다양한 IL-15 단백질의 슈퍼 작용제 활성을 초래한다는 것을 확인하였다.
실시예 11
IL-15(S58D)/IL-15-Rα Fc 융합 단백질의 세포 증식 활성
Figure pct00086
에 결합하고, STAT5 인산화를 자극하고 CD69 발현을 유도하는 능력에서의 증가를 관측한 후, IL-15(S58D) 변이체 Fc 융합 단백질은 NK 및 CD8 T 세포에서 Ki67 발현을 측정함으로써 야생형 융합 단백질과 비교하여 세포 증식을 자극하는 그것의 능력에 대해 시험되었다. 인간 PBMC는 IL-15 융합 분자의 증가하는 용량으로 처치되었고 Ki67 발현은 이전에 설명된 바와 같이 CD56+ NK 및 CD8+ T 세포 모집단에 대해 게이팅되는 세포내 FACS 분석에 의해 결정되었다.
(도 11)에 도시된 바와 같은 STAT5 인산화에 대해 관측된 것과 유사하게, IL-15(S58D) 변이체의 융합 단백질은 또한 CD8+(도 11a) 및 CD4+(도 11b) T 세포 뿐만 아니라, CD56+ NK 세포(도 11c)에서 야생형과 비교하여 Ki67 발현을 자극하는 효력에서 2 배수 증가를 입증하였다. 이들 데이터는 IL-15 도메인에서 S58D 돌연변이의 도입이 수용체 결합, 세포내 신호전달, 세포 표면 마커의 활성화 및 세포 증식을 포함하는 생물학적 활성의 범위에서 향상을 제공한다는 것을 강화시켰다.
실시예 12
마우스에서 rhIL-15 및 벤치마크과 비교하여 P-0234를 사용한 4일 반복된 투약 연구
IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질은
Figure pct00087
에 결합하고, 세포내 신호전달 캐스케이드를 유도하고 생체내 및 생체외에서 NK 및 CD8 T 림프구의 증식을 자극하는 강한 능력을 입증하였다. 여기서, 우리는 마우스에서 NK 세포 증식 및 확장에 대한 다양한 IL-15 화합물의 효과 및 혈청 노출을 검사하였다. 시험된 단백질은 재조합 인간 고유 IL-15(rhIL-15), P-0234(C-말단 2가 IL-15/IL-15Rα (비-공유) Fc 융합 단백질), 및 벤치마크 화합물(IL-15에서 N72D 돌연변이를 포함하는 N-말단 2가 IL-15(비-공유)/IL-15Rα Fc 융합 단백질)을 포함한다.
7-주령 암컷 Balb/c 마우스는 찰스 리버 실험실(Charles River Laboratory)로부터 수령되었고 연구 전에 적어도 7일 동안 집에서 순응되었다. 마우스는 4일 동안 IL-15 화합물의 등가 몰 용량으로 매일 복강내 주사를 받았다. 처치는 비히클, 0.03 mg/kg rhIL-15(40 pmol/kg), 0.1 및 0.5mg/kg 벤치마크(40 및 200 pmol/kg), 및 0.1 및 0.5 mg/kg P-0234(40 및 200 pmol/kg)을 포함한다. 각 그룹은 5마리의 마우스를 가졌다. 체중은 처치 전에 그리고 처치 동안 매일 기록되었다. 마우스는 마지막 주사 1시간 후에 희생되었고 말단 혈액이 심장 천자를 통해 수집되었다.
헤파린처리된 전혈 및 비장은 NK 세포 표현형 및 Ki67 세포내 염색을 위해 수집되었다. 적혈구를 용해시키고 정제된 항-마우스 CD16/CD32(1:50 희석)로 Fc-수용체를 차단한 후, 단일-세포 현탁액의 단핵 혈액 및 비장 세포는 암흑의 실온에서 30분 동안, 항-마우스 CD3-FITC 및 항-마우스 CD49b-APC(1:50 희석)을 포함하는, NK 세포 표면 마커로 염색되었다. 세포내 Ki67 염색을 위해, 세포 펠릿은 200ul/웰의 1X Foxp3 고정/투과화 작업 용액에 의해 충분히 재현탁되었고 암흑의 실온에서 30분 동안 인큐베이션되었다. 세포는 200ul의 1X 투과화 완충액으로 세정되었고 Fc-수용체는 정제된 항-마우스 CD16/CD32(1:50 희석)로 차단되었다. 그 다음, 세포는 NK 세포 모집단에 대해 항-마우스 CD3-FITC 및 항-마우스 CD49b-APC에 더하여 Ki67-PE로 염색되었다(1:50 희석). 30분의 인큐베이션 후, 세포는 수집 및 세정되었고, FACS 완충액에서 재현탁되었고 유세포측정 분석을 위해 준비되었다. 통계적인 분석은 그래프패드(GraphPad) 프리즘 소프트웨어에서 Tukey의 사후 다중 비교와 함께 일원분산분석에 의해 수행되었다.
도 12는 IL-15 화합물의 마지막 주사 후 1 시간에서 IL-15의 혈청 농도를 도시한다. IL-15는 제조자의 지침(R&D 시스템; Cat# DY247)에 따라 IL-15를 검출하는 상업적 ELISA 키트에 의해 측정되었다. 화합물의 4일 투약 후, IL-15의 누적 혈청 농도는 P-0234로 처치된 마우스에서 가장 높았고, 벤치마크으로 처치된 마우스에서 중간이었고 등가 몰 용량에서 주어진 rhIL-15로 처치된 마우스에서 가장 낮았다(도 12). 0,1 및 0.5 mg/kg에서 투여된 벤치마크 및 P-0234를 비교할 때, P-0234는 벤치마크보다 6 배수 및 4 배수 더 높은 혈청 농도를 일관되게 입증하였다. IL-15의 평균 혈청 농도는 rhIL-15(0.03 mg/kg 투약)에 대해 3.2±0.6(ng/ml), 벤치마크 화합물(각각 0.1 및 0.5 mg/kg 투약)에 대해 13±8 및 121±36 (ng/ml), 및 P-0234 (각각 0.1 및 0.5 mg/kg 투약)에 대해 72±14 및 443±57 (ng/ml) 이었다. 우월한 혈청 노출은 P-0234가 벤치마크 및 rhIL-15와 비교하여 더 긴 생체내 반감기 및 혈청 체류를 나타낼 수 있다는 것을 시사한다.
처치 그룹 사이에서 총 체중에 차이는 없지만, 벤치마크의 더 높은 용량으로 처치된 마우스는 4일의 처치 내에서 거의 6% 체중을 감량하였다(도 13a 및 도 13b). 효과는 0 일째의 기준선 값 및 비히클 그룹과 비교하여 통계적으로 유의미하였으며, 벤치마크 화합물로 관찰되지만 P-0234로 그렇지 않은 잠재적인 용량-제한 독성을 시사한다.
모든 시험된 IL-15 화합물은 말초 혈액에서 Ki67 양성 NK 세포의 백분율을 증가시켰으며(도 14a), 증진된 NK 세포 증식을 시사한다. 그러나, CD3 음성 말초 혈액 림프구 내의 NK 세포 수의 백분율의 유의미한 증가는 두 시험된 용량 수준에서 P-0234로 처치된 마우스에서만 관측되었다(도 14b). NK 세포의 백분율의 증가가 또한 rhIL-15 및 더 낮은 용량의 벤치마크로 처치된 마우스에서 관측되었지만, 효과는 통계적 유의도에 도달하지 않았다(도 14b). 흥미롭게도, 말초 혈액 내의 NK 세포 수의 감소는 더 높은 용량 벤치마크로 처치된 마우스에서 관측되었다(도 14b). 그러한 역전된 약력학적 용량-반응은 이러한 그룹에서 체중의 관측된 손실과 일치하는 독성을 시사한다.
림프구 증식 및 확장에 대한 IL-15 화합물의 효과는 또한 비장 내의 림프성 기관에서 검사되었다. 말초 혈액에서 관측된 것과 유사하게, 모든 IL-15 화합물은 비히클과 비교하여 비장 Ki67 양성 NK 세포를 증가시켰다(도 15a). 저용량 벤치마크 및 P-0234만이 비장 내의 NK 세포의 총수를 유의미하게 증가시켰다(도 15B). 마찬가지로, 비장 NK 세포 확장에 대한 역전된 용량-반응은 벤치마크에 대해 관측되었고(도 15b), 이것은 종결 4일 후 측정된 비장 NK 세포에 대한 높은 및 지속적인 CD69 발현과 연관되었다(도 15c). 데이터는 벤치마크 화합물이 NK 세포를 과도하게 자극하여 세포 고갈을 초래할 수 있다는 것을 시사한다. IL-15가 IL-15Rα Fc 융합 단백질에 비-공유적으로 결합된 상태에서, IL-15는 융합 복합체로부터 분리되어 림프구 과자극, 세포 고갈, 독성 및 체중 손실을 초래할 수 있다.
실시예 13
단일 주사 다음의 마우스에서 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 약동학적 및 약력학적 효과
P-0313, C-말단 2가 IL-15(S58D)/IL-15Rα (비공유) Fc 융합 단백질을 이용한 용량-반응 연구는 단일 주사 다음에 Balb/C 마우스에서 수행되었다. 말초 혈액 림프구 증식 및 확장에 대한 효과는 경시적으로 모니터링되었다. 게다가, P-0313의 약동학 및 약력학(PK/PD)은 단일 주사 다음에, 벤치마크, 즉 IL-15에서 N72D 돌연변이를 포함하는 N-말단 2가 IL-15(비공유)/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 그것들과 비교되었다.
7-주령 암컷 balb/c 마우스는 찰스 리버 실험실로부터 수령되었고 연구 전 적어도 7일 동안 집에서 순응되었다. 비히클, 벤치마크(0.3 mg/kg) 또는 P-0313 (0.01, 0.03, 0.1 및 0.3 mg/kg)은 0시에 마우스에 복강내(i.p.) 투여되었다. 혈액 샘플은 -24 시간(투여전), 및 주사 후 1, 4, 24, 72, 120, 및 192 시간에서 회수되었다. 체중은 치료 전 그리고 치료 동안 매일 기록되었다. 각 그룹은 5마리의 마우스를 포함하였다.
헤파린-처리된 전혈은 면역 표현형을 위해 사용되었고 부피는 기록되었다. BD 팜(pharm) 세포용해 완충액(buffer)을 사용한 적혈구 용해 후, 총 생존가능한 단핵 혈구는 트립판 블루 데드 세포 배제에 의해 카운트되었고 Ki67 세포내 염색으로 진행되었다. 세포 펠릿은 200ul/웰의 1X Foxp3 고정/투과화 작업 용액에 의해 완전히 재현탁되었고 암흑의 실온에서 30분 동안 인큐베이션되었다. 원심분리 후, 200ul의 1X 투과화 완충액은 또 다른 세정을 위해 각각의 웰에 첨가되었다. Fc-수용체를 정제된 항-마우스 CD16/CD32(1:50 희석)로 차단한 후, 세포는 항-마우스 CD3-FITC, Ki67-PE, 항-마우스 CD49b-APC 및 항-마우스 CD8-Percpcy5.5(1:50 희석)로 염색되었다. 30분의 인큐베이션 후, 세포는 수집 및 세정되었고, FACS 완충액에서 재현탁되었고 유세포측정에 의해 분석되었다. 통계적인 분석은 그래프패드 프리즘 소프트웨어에서 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 일원분산분석에 의해 수행되었다.
화합물의 혈청 농도는 2개의 상이한 ELISA 검정을 사용하여 측정되었다. 인-하우스 ELISA 검정은 IL-15 및 Fc 복합체를 측정하기 위해 개발되었고, 상업적 ELISA 검정은 인간 IL-15에 활성인 항체를 포획 및 검출하는 것과 함께 IL-15를 측정한다. 인-하우스 ELISA 검정을 위해, 맥시소프(maxisorp) 플레이트는 4℃에서 밤새 항-IL-15 항체(R&D 시스템 MAB647)로 코팅되었다.　플레이트는 슈퍼블록 (SuperBlock)으로 차단되었다.　다양한 희석의 표준 및 샘플은 플레이트에 도포되었고 실온에서 1시간 인큐베이션되었다.　활성 화합물은 항-인간 IgG Fc-HRP와 함께 검출되었고 신호는 울트라 TMB 기재 용액(Ultra TMB Substrate Solution)을 사용하여 검출되었다. 값은 비-선형 회귀 곡선 적합도로부터 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 보간을 사용하여 계산되었다.
두 화합물은 비교할만한 혈청 농도로 처음 24 시간의 혈청에서 검출가능하였다. 피크 농도는 복강내 투여 후 4시간에서 관측되었다. 72 시간에서, P-0313만이 측정가능하게 잔존하였고 벤치마크는 3 마우스 모두에서 검출불가능하게 되었다(도 16a 내지 도 16b). 유사한 결과는 2개의 상이한 ELISA 검정을 사용하여 수득되었으며, P-0313이 벤치마크보다 우월한 약동학적 프로파일을 가지고 있음을 확인하였다. 결과는 P-0234, 즉 IL-15/IL-15Rα (비공유) Fc 융합 단백질이 또한 벤치마크보다 더 높은 혈청 노출을 입증한 실시예 12에 도시된 이전의 관찰로 확증하였다. 이들 데이터는 IL-15/IL-15Rα (비공유) Fc 융합 구성이 IL-15 생체내 반감기의 연장에서 IL-15 (비공유)/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 그것보다 우월하다는 것을 강하게 지지한다.
체중의 유의미한 변화는 임의의 처치 그룹에서 관측되지 않았다(도 17).
Ki67 발현의 용량-의존적 증가는 P-0313로 처치된 마우스의 NK 및 CD8 T 세포에서 관측되었다(도 18a 및 도 18b). 효과는 72 시간에서 절정에 달하였고 벤치마크에 대해 120시간 지속되었고 P-0313에 대해 192 시간으로 더 연장되었으며(도 18a), P-0313가 벤치마크보다 더 길게-작동하고 있다는 것을 시사한다. 게다가, P-0313은 벤치마크의 그것보다 3-10 배수 더 낮은 용량에서 유사한 Ki67 유도를 나타냈으며, P-0313이 벤치마크보다 더 유효하다는 것을 시사한다(도 18a 및 도 18b). NK 세포에 대한 유의미한 반응은 CD8 T 세포에 비해 10 배수 더 낮은 용량에서 관측되었으며, NK 세포가 P-0313 처치에 CD8 T 세포보다 더 민감하다는 것을 시사한다.
세포 증식 마커 Ki67에서 관측된 증가와 일치하여, 혈액 내의 NK 및 CD8+ T 세포의 용량-의존적 확장이 P-0313 처치된 그룹에서 관측되었다(도 19a 및 도 19b). 세포 확장은 72 시간에서 관측되었고 120 시간에서 절정에 달하였다. P-0313은 0.01, 0.03, 0.1 및 0.3 mg/kg 용량 각각에서 기준선으로부터 4-, 15-, 50- 및 163-배수로 NK 세포를 증가시켰고(도 19b), 또한 0.1 및 0.3 mg/kg 용량에서 기준선으로부터 10- 및 50-배수로 CD8 T 세포를 증가시켰다(도 19b). 대조적으로, 0.3mg/kg 용량에서의 벤치마크는 단지 주변 NK 세포를 28 배수로 그리고 CD8 T 세포를 12 배수로 확장시켰다(도 19a 및 도 19b).
요약하면, P-0313은 벤치마크 화합물에 대한 NK 및 CD8 T 세포 증식 및 확장에 대해 우월한 약동학 및 약력학을 입증하였다.
실시예 14
마우스 결장암의 폐 전이의 억제에 대한 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 효과
종양 모델에서 IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질의 항-전이성 효능 및 면역학적 반응을 조사하기 위해, 1x105 마우스 결장 암종 세포, 즉 CT26-WT(ATCC CRL-2638)가 암컷 balb/C 마우스(10-12 주령)에 정맥내로 주사되었다. 다음 날, 0.03 또는 0.1 mg/kg의 P-0313 또는 0.3mg/kg의 벤치마크 화합물이 정맥내 주사에 의해 5일마다 주어졌다(1, 6, 11일 후-세포 이식). 비히클(PBS)은 음성 대조군으로서 포함되었고 모든 그룹은 8마리의 마우스를 함유하였다. 15일째 되는 날, 혈액 샘플은 림프구 표현형 및 간 효소 측정을 위해 수집되었다. 16일째 되는 날, 모든 마우스는 조직 채취를 위해 희생되었다. 폐는 15% 인디아 잉크에 의해 팽창되었고 페케테 (Fekete)의 용액(10% 포름알데하이드, 5% 빙초산 및 60% 에탄올)에서 탈염색되었다. 폐 종양 결절은 광학 현미경 하에서 전체 폐에 대해 카운트되었고, 항-전이성 효과는 처치 그룹과 비히클 대조군 사이의 종양 결절의 상이한 수에 의해 표시되었다.
면역학적 반응을 연구하기 위해, 마우스 말초 혈액은 헤파린-처리된 튜브에서 15일째 되는 날에 수집되었고 마우스 당 검정을 위해 사용되는 혈액의 부피가 기록되었다. 적혈구가 BD 팜(pharm) 세포용해 완충액에 의해 용해된 후, 총 생존가능한 단핵 혈구는 트립판 블루 데스 세포 배제에 의해 카운트되었고 면역 세포 표현형, 및 Ki67 증식 분석을 위해 이전에 설명된 바와 같은 세포내 염색을 위해 사용되었다. 세포 고정, 투과화 및 항체 염색 후, 세포는 수집 및 세정되었고, FACS 완충액에서 재현탁되었고 유세포측정에 의해 분석되었다.
도 20a는 폐 결절을 예시하는 각각의 그룹으로부터의 폐의 대표적인 사진을 도시한다. 폐 전이성 병변은 현미경적으로 카운트 및 정량화되었다(도 20b). 도 20에 도시된 바와 같이, 0.3 mg/kg에서 주어진 벤치마크 분자는 폐 결절 카운트에서 84% 감소로 폐 전이를 억제하였으며, IL-15 경로를 활성화시키는 것이 폐 전이의 형성 및 성장을 방지하는 데 효과적이라는 것을 확인하였다. 현저하게, 3-배수 더 낮은 용량(0.1 mg/kg)에서의 IL-15/IL-15Rα-Fc 복합체 P-0313의 투여는 제로 결절이 처치된 모두 8마리의 마우스에서 관측되는 폐 전이의 발달의 완전한 억제를 야기하였다(도 20a 및 도 20b). 폐 전이의 형성 및 성장을 억제할 시에 벤치마크에 대한 P-0313의 우월성은 이전에 증명된 향상된 약동학적 및 약력학적 효과와 일치한다(실시예 12 및 13). 그것의 IL-15 모이어티가 Fc 도메인에 공유적으로 링크된 상태에서, P-0313은 IL-15RαSushi 도메인(실시예 13)을 통해 Fc 사슬에 비-공유적으로 링크되는 IL-15를 함유하는 벤치마크에 비해 IL-15 혈청 반감기의 뚜렷한 개선을 입증하였다. 0.03 mg/kg 투약에서의 P-0313은 또한 ~35%의 억제 효과로 폐 전이를 감소시켰다(도 20a 및 도 20b). 이러한 관측은 P-0313이 벤치마크보다 훨씬 더 낮은 용량에서 유효하다는 것을 더 강조하였고 생체내의 그것의 항암 효과에 대한 IL-15/IL-15Rα-Fc 복합체의 생체분포 및 생체이용률의 중요성을 강조한다.
3회 반복된 Q5D 투약 후, 말초 혈액에서 NK 및 CD8+ T 세포 둘 다의 확장은 P-0313 처치된 마우스에서 유의미하게 상승되어 남아 있었으며(도 21a 및 도 21b), 이는 이러한 처치 그룹의 비장 중량에서 유의미한 증가와 상관하였다(도 22). 대조적으로, 0.3 mg/kg 벤치마크으로 처치된 그룹의 경우, CD8+ T 세포의 매우 보통의 확장만이 관측되었으며; 대조군 대비 관측된 순환 NK 세포 수에서의 증가는 없었다(도 21a 및 도 21b). 그러나, 비장 중량은 벤치마크 처치된 그룹에서 유의미하게 증가되었다(도 22). 데이터는 반복된 투약 후, 확장된 림프구가 보관을 위해 림프 조직으로 이동할 수 있거나 세포 고갈이 또한 발생할 수 있다는 것을 시사한다. 모든 3개의 처치 그룹이 항종양 효과를 보였음에 따라, 데이터는 CD8+ T 세포 또는 NK 세포가 항종양 효과에 수반되는 효과기 서브세트일 수 있다는 것을 시사하였다. 그러나, 0.1 mg/kg의 P-0313으로 처치된 그룹에서 보이는 폐 전이의 완전한 박멸은 NK 세포 및 CD8+ T 세포 둘 다를 결합시키는 작용이 종양 성장의 가장 강한 억제를 유도했다는 것을 시사하였다.
알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)의 간 중량 및 혈청 농도는 처치와 연관되는 간독성을 평가하기 위해 측정되었다. 도 23a 내지 도 23c에 도시된 바와 같이, 비히클 그룹과 비교하여 임의의 처치 그룹에 대한 간 중량, ALT 또는 AST 수준에서의 증가는 없었다. 데이터는 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 강한 항종양 효과는 간독성과 연관되지 않았다는 것을 시사한다.
실시예 15
마우스에서 확립된 CT26 고형 종양 성장에 대한 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 효과
확립된 종양 모델에서 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 항종양 효능 및 면역학적 반응을 더 조사하기 위해, 암컷 Balb/C 마우스(10-12 주령)는 오른쪽 옆구리에서 피하로 1×105 CT26 세포로 주사되었다. 11일째 되는 날, 평균 종양 부피가 ~70 mm3 이었을 때, 마우스는 3개의 그룹(n = 10/그룹)으로 무작위화 되었고 무작위화의 동일한 날 상에서 비히클 (PBS), 또는 P-0313(0.1 mg/kg 또는 0.05 mg/kg)의 복강내 주사를 받았다. 각각의 시험 제제의 하나의 추가적인 복강내 주사는 16일째에 수행되었다(총 2 용량). 종양은 캘리퍼스를 사용하여 주 3회 측정되었고, 종양 부피는 다음과 같이 계산되었다: 부피 = 0.5 x (폭)2 x (길이). 면역학적 반응을 연구하기 위해, 비-말단 말초 혈액은 19일째 되는 날 헤파린-처리된 튜브에서 수집되었다. 21일째 되는 날, 모든 마우스는 조직 채취를 위해 희생되었다.
도 24a에 도시된 바와 같이, PBS-처치된 마우스는 큰 피하 종양을 빠르게 발달시켰다. 0.1 mg/kg 또는 0.05 mg/kg에서 P-0313으로의 마우스의 처치는 종양 성장을 지연시킬 시에 대략 동등하였다(도 24a). 각각의 개별 마우스에 대한 종양 성장 곡선은 모든 3개의 처치 그룹에 대해 플로팅되었다(도 25a 내지 도 25c). 마우스는 P-0313의 처치에 잘 반응하였고 2개의 시험된 용량 그룹에 대해 특히 초기 단계의 종양 성장에서 지연된 및 동조화된 억제를 보였다는 것이 명백하다(도 25a 내지 도 25c). 종양 접종 후 21일째 되는 날, PBS-처치된 마우스의 평균 종양 부피는 두 용량(도 25a ** P < 0.01; Tukey의 사후 시험을 이용한 일원분산분석)에서 P-0313으로 처치된 마우스의 410 mm3 대비 820 mm3 이었다. 더 높은 용량(0.1 mg/kg)에서의 P-0313이 초기에 저-투약 그룹보다 종양 부하의 더 큰 감소를 보였지만, 차이는 처치가 진행됨에 따라 점점 줄어들었다는 점을 주목할 가치가 있다.
P-0313-처치된 마우스는 21일 연구의 과정에 걸쳐 PBS-처치된 마우스와 유사한 체중 증가를 입증하였으며(도 24b), P-0313가 잘 용인되고 두 시험된 용량에서 유의미한 독성과 연관되지 않는다는 것을 시사한다.
다음으로, 우리는 말초 혈액 및 비장에서 CD8 T 세포 및 NK 세포 모집단에 대한 P-0313의 효과를 검사하였다. 종양을 갖는 마우스에 대한 P-0313의 투여는 강한 NK 세포 및 CD8 T 세포 증식(도 26a 및 도 26b) 및 NK 및 CD8 T 세포의 용량-의존적 확장(도 26c 및 26d), 비-종양을 갖는 마우스(실시예 13)에서 관측된 바와 같은 유사한 정도의 면역 세포 반응을 유도하였다. 이들 두 림프구 모집단 중에서, 더 높은 배수 변화는 NK 세포에서 관측되었다(0.1 mg/kg 투약 그룹에 대해 ~100 배수, 및 0.05 mg/kg 투약 그룹에 대해 ~38 배수). CD8+ T 세포는 0.1 mg/kg 용량에서 ~5.4 배수, 및 0.05 mg/kg 투약 그룹에 대해 ~2.7 배수로 확장되었다.
P-0313은 또한 말초 혈액 내의 것들과 같이 비장에서 NK 및 CD8+T 세포 둘 다의 확장을 증진시켰지만(도 27a 및 도 27b), 비장에서 크기/배수 변화는 덜 심오하였다. 더 높은 배수 변화는 NK 세포에서 관측되었다(0.1 mg/kg 투약 그룹에 대해 ~10 배수, 및 0.05 mg/kg 투약 그룹에 대해 ~8 배수). CD8+ T 세포는 0.1 mg/kg 용량에 대해 ~2.7 배수로 확장하였고, 0.05 mg/kg 투약 그룹에 대해 미미하게만 확장하였다.
종합해 보면, 이들 데이터는 P-0313 처치가 고형 종양 성장을 유의미하게 지연 및 억제시킬 수 있었고 이러한 항종양 효과는 종양을 갖는 마우스에서 세포독성 NK 및 CD8 T 세포의 증식 및 확장과 연관되었다는 것을 입증하였으며, 이는 IL-15의 전체적인 면역조절 특성과 일치한다. P-0313이 효과기 기능이 결여된 Fc 영역을 가지고 있으므로, 생체내 P-0313의 항종향 활성은 종양 세포의 직접적인 살해로 인한 것이 아니라, 오히려 종양 세포에 대한 강력한 면역 반응을 위한 세포독성 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 강력한 활성화로 인한 것이다.
실시예 16
Balb/C 마우스에서 비-확립된 CT26 고체 종양 성장에 대한 IL-15/IL-15Rα Fc 융합 단백질의 효과
유사한 연구는 P-0313의 항종향 효능을 확인하기 위해 비-확립된 CT26 종양 모델에서 수행되었다. 1×105 CT26 세포로 종양 세포 피하 생착 3일 후, 마우스는 총 5회 주사를 위해 5일마다 비히클(PBS) 또는 P-0313(0.1 mg/kg)의 주사를 받았다. 마우스는 25일에 종결되었고 종양은 주 2-3회 측정되었다.
확립된 CT26 종양 모델(실시예 14)에서 볼 수 있는 바와 같이 유사하게, P-0313은 종양 성장의 현저한 억제(도 28a) 및 고형 종양 질량의 유의미한 감소(도 28b)를 입증하였다. 5회 반복된 용량으로, P-0313로 처치된 마우스는 비장 중량에서 증간 정도의 증가(도 29a) 및 체중 증가에서 비 유의미한 감소(도 29b)를 나타냈으며, P-0313이 잘 용인된다는 것을 시사한다.
전반적으로, 이들 데이터는 P-0313이 잘-용인된 안전성 프로파일을 갖는 종양 세포 전이 뿐만 아니라 고체 및 액체 종양에 대해 효과적인 면역치료법이라는 것을 확증하였다.
본원에 개시 및 청구되는 모든 물품 및 방법은 본 개시를 고려하여 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 개시의 물품 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 설명되었지만, 변형이 본 개시의 사상 및 범위로부터 벗어나는 것 없이 물품 및 방법에 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 그러한 변형 및 등가물은, 현재 존재하든 또는 나중에 개발되든, 첨부된 청구항들에 의해 정의되는 바와 같은 본 개시의 사상 및 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 명세서에 언급되는 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물은 본 개시가 관련되는 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물은 모든 목적을 위해 그리고 각각의 개별 공보가 임의의 및 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 편입되도록 지시되는 바와 같은 동일한 정도로 전체적으로 참고로 본원에 편입된다. 본원에 적합하게 실례로 설명되는 본 개시는 본원에 구체적으로 개시되지 않는 임의의 요소(들)의 부재에서 실시될 수 있다. 따라서, 본 개시는 바람직한 구현예 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시되는 개념의 변형 및 변동은 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 그러한 수정 및 변형은 첨부된 청구항들에 의해 정의되는 바와 같은 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것이 이해되어야 한다.
서열목록
첨부된 서열목록에 열거되는 핵산 및 아미노산 서열은 37 C.F.R. 1.822에 정의되는 바와 같이, 뉴클레오타이드 베이스에 대한 표준 문자 약어 및 아미노산에 대한 3개의 문자 코드를 사용하여 표시된다.
서열번호: 1은 인간 IL-15 전구체 아미노산 서열이다.
서열번호: 2는 인간 IL-15 성숙한 형태 아미노산 서열이다.
서열번호: 3은 인간 IL-15Rα 아미노산 서열이다.
서열번호: 4는 인간 IL-15Rα, 세포외 도메인 아미노산 서열이다.
서열번호: 5는 인간 IL-15Rα, 스시 도메인+ 아미노산 서열이다.
서열번호: 6은 인간 IgG1-Fc 아미노산 서열이다.
서열번호: 7은 Knob-Fc 아미노산 서열이다.
서열번호: 8은 Hole-Fc 아미노산 서열이다.
서열번호 : 9 내지 12는 다양한 펩타이드 링커의 아미노산 서열이다.
서열번호: 13은 Hole-Fc-Linker 1-IL-15 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 14는 Knob-Fc -Linker 1-IL-15Rα-Sushi+ 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 15는 IL-15-Linker 4-Hole-Fc 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 16은 IL-15Rα-Sushi+-Linker 4-Knob-Fc 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 17은 Knob-Fc-Linker 2-IL-15Rα-Sushi+ 사슬의 이미노산 서열이다.
서열번호: 18은 Hole-Fc-Linker 2-IL-15 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 19는 IL-15-Linker 3-Hole-Fc 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 20은 Fc-Linker 3-IL-15 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 21은 IL-15-Linker 3-Fc 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 22는 Knob-Fc-Linker 2-IL-15Rα-Sushi+ 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 23은 Fc-Linker 2-IL-15Rα-Sushi+ 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 24 내지 45는 다양한 IL-15 변이체 폴리펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열번호: 46은 Fc-Linker 3-IL-15 S58D 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 47은 펩타이드 링커의 아미노산 서열이다.
서열번호: 48은 Hole-Fc-Linker 3-IL-15-S58D 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 49는 IL-15-S58D-Linker 3-Hole-Fc 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 50은 IL-15-S58D-Linker 3-Fc 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 51은 IL-15Rα-Sushi+Linker 2-Knob-Fc 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 52는 IL-15Rα-Sushi+Linker 2-Fc 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 53은 Hole-Fc-Linker 1-IL-15-S58D 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 54는 Hole-Fc-Linker 3-IL-15 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 55는 Knob-Fc-Linker 1-IL-15 사슬의아미노산 서열이다.
서열번호: 56 내지 63은 다양한 IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 사슬을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호: 64 및 65는 벤치마크의 두 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열이다.
서열목록
인간 IL-15 전구체 서열
Figure pct00088
인간 IL-15 성숙한 형태 서열
Figure pct00089
인간 IL-15Rα 서열
Figure pct00090
인간 IL-15Rα, 세포외 도메인
Figure pct00091
인간 IL-15Rα, 스시 도메인+
Figure pct00092
인간 IgG1-Fc
Figure pct00093
Knob-Fc
Figure pct00094
Hole-Fc
Figure pct00095
펩타이드 링커 서열
Figure pct00096
펩타이드 링커 서열
Figure pct00097
펩타이드 링커 서열
Figure pct00098
펩타이드 링커 서열
Figure pct00099
Hole-Fc-Linker 1-IL-15 사슬
Figure pct00100
Knob-Fc-IL-Linker1-IL-15Rα-Sushi+ 사슬
Figure pct00101
IL-15-Linker 4-Hole-Fc 사슬
Figure pct00102
IL-15Rα-Sushi+-Linker 4-Knob-Fc 사슬
Figure pct00103
Knob-Fc-Linker 2-IL-15Rα-+ 사슬
Figure pct00104
Hole-Fc-Linker 2-IL-15 사슬
Figure pct00105
IL-15-링커 3-Hole-Fc 사슬
Figure pct00106
Fc-Linker 3-IL-15 사슬
Figure pct00107
IL-15-Linker 3-Fc 사슬
Figure pct00108
Knob-Fc-Linker 2-IL-15Rα-Sushi+ 사슬
Figure pct00109
Fc-Linker 2-IL-15Rα-Sushi+ 사슬
Figure pct00110
인간 IL-15 S58D 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00111
인간 IL-15 T62D 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00112
인간 IL-15 V63F 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00113
인간 IL-15 I67V 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00114
인간 IL-15 I68F 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00115
인간 IL-15 I68K 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00116
인간 IL-15 I68D 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00117
인간 IL-15 I68H 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00118
인간 IL-15 Q108A 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00119
인간 IL-15 Q108M 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00120
인간 IL-15 Q108S 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00121
인간 IL-15 Q108S/D30T 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00122
인간 IL-15 Q108S/V31Y 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00123
인간 IL-15 Q108S/H32E 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00124
인간 IL-15 Q108S/D30T/V31Y/H32E 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00125
인간 IL-15 결실 111-114 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00126
인간 IL-15 결실 109-114 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00127
인간 IL-15 결실 108-114 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00128
인간 IL-15 결실 105-114 변이체 폴리펩타이드
Figure pct00129
N95 변이체 폴리펩타이드 후 인간 IL-15 삽입 'GS'
Figure pct00130
N95 변이체 폴리펩타이드 후 인간 IL-15 삽입 'GGSGG'
Figure pct00131
N95 변이체 폴리펩타이드 후 인간 IL-15 삽입 'GSSGGSGGS'
Figure pct00132
Fc-Linker 3-IL-15 S58D 사슬
Figure pct00133
펩타이드 링커 서열
Figure pct00134
Hole-Fc-Linker 3-IL-15 S58D 사슬
Figure pct00135
IL-15 S58D-Linker 3-Hole-Fc 사슬
Figure pct00136
IL-15 S58D-Linker 3-Fc 사슬
Figure pct00137
IL-15Rα-Sushi+Linker 2-Knob-Fc 사슬
Figure pct00138
IL-15Rα-Sushi+Linker 2-Fc 사슬
Figure pct00139
Hole-Fc-Linker 1-IL-15-S58D 사슬
Figure pct00140
Hole-Fc-Linker 3-IL-15 사슬
Figure pct00141
Knob-Fc-Linker 1-IL-15 사슬
Figure pct00142
P-0313 사슬 1의 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00143
IL-15RαSushi+ 도메인의 뉴클레오타이드 서열(융합 단백질 P-0313, P-0234, P-0666, 및 P-0668의 사슬 2)
Figure pct00144
P-0234 사슬 1의 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00145
P-0666 사슬 1의 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00146
P-0666 사슬 3의 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00147
P-0668 사슬 1의 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00148
P-0314 사슬 1의 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00149
P-0314 사슬 2의 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00150
벤치마크 사슬 1
Figure pct00151
벤치마크 사슬 2
Figure pct00152
SEQUENCE LISTING <110> Cugene Inc. <120> NOVEL INTERLEUKIN-15 (IL-15) FUSION PROTEINS AND USES THEREOF <130> CACCG1.0001WO <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 Thr Ser <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 3 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr 20 25 30 Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser 35 40 45 Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala 65 70 75 80 Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp 85 90 95 Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr 100 105 110 Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu 115 120 125 Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala 130 135 140 Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr 145 150 155 160 Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser 165 170 175 Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln 180 185 190 Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile 195 200 205 Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu 210 215 220 Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu 225 230 235 240 Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg 245 250 255 Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu 260 265 <210> 4 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val 65 70 75 80 Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly 85 90 95 Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr 100 105 110 Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro 115 120 125 Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr 130 135 140 Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr 165 170 175 <210> 5 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro 65 70 75 <210> 6 <211> 226 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 7 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Knob-Fc <400> 7 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 8 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Hole-Fc <400> 8 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide Linker Sequence <400> 9 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide Linker Sequence <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide Linker Sequence <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 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agagtccgac gtgcacccat cttgcaaggt gaccgcaatg 180 aagtgtttcc tgctggagct gcaggtcatc agcctggaga gcggcgacgc agatatccac 240 gataccgtgg agaacctgat catcctggca aacaattccc tgagctccaa cggaaatgtg 300 acagagtctg gatgcaagga gtgtgaggag ctggaggaga agaacatcaa ggagttcctg 360 cagtcttttg tgcacatcgt gcagatgttc atcaatacat ccggcggcgg cggctccggc 420 ggcggcggct ctggcggcgg cggcagctgc cccccttgtc cagcccccga ggccgctggg 480 gcaccaagcg tgttcctgtt ccctccaaaa ccaaaagata ctctgatgat tagccgtacg 540 ccagaggtga catgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg accccgaggt gaagtttaac 600 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacaa agcctaggga ggagcagtac 660 aattctacct atcgcgtggt gagcgtgctg acagtgctgc accaggattg gctgaacggc 720 aaggagtata agtgcaaggt gtccaataag gccctgcctg ccccaatcga gaagaccatc 780 tctaaggcca agggccagcc cagagagcct caggtgtaca cactgcctcc aagcagagac 840 gagctgacca agaaccaggt gtccctgaca tgtctggtga agggcttcta tccctctgat 900 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cctgagaaca attacaagac cacaccccct 960 gtgctggaca gcgatggctc cttctttctg tattccaagc tgaccgtgga taagtctcgg 1020 tggcagcagg gcaacgtgtt ttcctgctct gtgatgcacg aagcactgca taaccactac 1080 acccagaaga gcctgagcct gtcccccggg 1110 <210> 62 <211> 1005 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P-0314 Chain 1 <400> 62 atggatatgc gggtgcctgc tcagctgctg ggcctgctgc tgctgtggct gcgaggggct 60 agatgtgata aaactcatac ttgtcctcca tgcccagcac ctgaggcagc aggcgcccca 120 tccgtgttcc tgtttccccc taagcccaag gacacactga tgatctcccg tacgccagag 180 gtgacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt taactggtac 240 gtggacggcg tggaggtgca caatgccaag acaaagccta gggaggagca gtacaattct 300 acctatcgcg tggtgagcgt gctgacagtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaggag 360 tataagtgca aggtgtccaa taaggccctg cctgccccaa tcgagaagac catctctaag 420 gccaagggcc agcccagaga gcctcaggtg tacacactgc ctccaagcag agacgagctg 480 accaagaacc aggtgtccct gacatgtctg gtgaagggct tctatccctc tgatatcgcc 540 gtggagtggg agagcaatgg ccagcctgag aacaattaca agaccacacc ccctgtgctg 600 gacagcgatg gctccttctt tctgtattcc aagctgaccg tggataagtc tcggtggcag 660 cagggcaacg tgttttcctg ctctgtgatg cacgaagcac tgcataacca ctacacccag 720 aagagcctga gcctgtcccc cgggggcggc ggcggcagcg gaggcggcgg ctccatcacc 780 tgtccacccc ctatgagcgt ggagcacgcc gatatctggg tgaagagcta ctccctgtat 840 agccgggaga gatatatctg caattccggc tttaagcgca aggccggcac ctctagcctg 900 acagagtgcg tgctgaacaa ggccaccaat gtggcccact ggacaacccc aagcctgaag 960 tgtattagag accctgccct ggtgcatcag cggcctgctc cccca 1005 <210> 63 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P-0314 Chain 2 <400> 63 atgtaccgga tgcagctgct gtcctgcatc gccctgtctc tggccctggt gaccaactct 60 aattgggtga acgtgatcag cgacctgaag aagatcgagg atctgatcca gtctatgcac 120 atcgacgcca ccctgtatac agagagcgat gtgcacccct cctgcaaggt gacagccatg 180 aagtgtttcc tgctggagct gcaggtcatc agcctggaga gcggcgacgc agacatccac 240 gataccgtgg agaacctgat catcctggcc aataactccc tgagctccaa cggcaatgtg 300 acagagtctg gctgcaagga gtgtgaggag ctggaggaga agaacatcaa ggagttcctg 360 cagagctttg tgcacatcgt gcagatgttt atcaatacct cc 402 <210> 64 <211> 296 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Benchmark Chain1 <400> 64 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 65 70 75 80 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 85 90 95 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 100 105 110 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 115 120 125 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 130 135 140 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 145 150 155 160 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 165 170 175 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 180 185 190 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 195 200 205 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 210 215 220 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 225 230 235 240 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 245 250 255 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 260 265 270 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 275 280 285 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 290 295 <210> 65 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Benchmark Chain 2 <400> 65 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser

Claims (70)

  1. (1) Fc 도메인에 링크되는 IL-15 폴리펩타이드(또는 그것의 변이체); 및 (2) 상기 IL-15 폴리펩타이드에 비공유적으로 링크되어 IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체를 형성하는 IL-15 수용체 알파("IL-15Rα")를 포함하는, 단리된 인터루킨-15(IL-15) 융합 단백질 복합체.
  2. 제1항에 있어서
    상기 IL-15 폴리펩타이드는 상기 Fc 도메인의 C-말단에 링크되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15 폴리펩타이드는 상기 Fc 도메인의 N-말단에 링크되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15 폴리펩타이드는 서열번호: 2에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는 IL-15 폴리펩타이드인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체 .
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15 폴리펩타이드는 서열번호: 2의 위치 30, 31, 32, 58, 62, 63, 67, 68, 또는 108에서 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 IL-15 변이체 폴리펩타이드인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15 폴리펩타이드는 서열번호: 2의 위치 58에서 S의 D로의 치환을 포함하는 IL-15 변이체 폴리펩타이드인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15Rα 도메인은 서열번호: 4에 제시되는 상기 아미노산 서열을 포함하는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15Rα 도메인은 IL-15 수용체 알파 스시("IL-15RαSushi") 도메인이며, 상기 IL-15RαSushi 도메인은 서열번호: 5에 제시되는 상기 서열과 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 IL-15RαSushi 도메인은 서열번호: 5에 제시되는 상기 아미노산 서열을 포함하는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인, 인간 IgG2 Fc 도메인, 인간 IgG3 Fc 도메인, 인간 IgG4 Fc 도메인, IgA Fc 도메인, IgD Fc 도메인, IgE Fc 도메인, IgG Fc 도메인, 및 IgM Fc 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 Fc 도메인은 침묵화된 효과기 기능을 갖고/갖거나 반감기 연장 기능을 갖는 Fc 도메인인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 서열번호: 6, 서열번호: 7 및 서열번호: 8에 제시되는 상기 아미노산 서열로 구성되는 상기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 IL-15 폴리펩타이드는 펩타이드 링커에 의해 Fc 도메인에 공유적으로 부착되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드 링커는 서열번호: 9 내지 12에 제시되는 서열의 상기 그룹으로부터 선택되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  15. (1) Fc 도메인에 링크되는 IL-15Rα 도메인; 및 (2) 상기 IL-15Rα 도메인에 비공유적으로 링크되어 IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체를 형성하는 IL-15 폴리펩타이드(또는 그것의 변이체)를 포함하는 단리된 IL-15 융합 단백질 복합체로서, 상기 IL-15 폴리펩타이드는 서열번호: 2의 위치 58에서 S의 D로의 치환을 포함하는 IL-15 변이체 폴리펩타이드인, 단리된 IL-15 융합 단백질 복합체.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 IL-15Rα 도메인은 상기 Fc 도메인의 C-말단에 링크되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 IL-15Rα 도메인은 상기 Fc 도메인의 N-말단에 링크되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15Rα 도메인은 서열번호: 4에 제시되는 상기 아미노산 서열을 포함하는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  19. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15Rα 도메인은 IL-15 수용체 알파 스시("IL-15RαSushi") 도메인이며, 상기 IL-15RαSushi 도메인은 서열번호: 5에 제시되는 상기 서열과 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 IL-15RαSushi 도메인은 서열번호: 5에 제시되는 상기 아미노산 서열을 포함하는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인, 인간 IgG2 Fc 도메인, 인간 IgG3 Fc 도메인, 인간 IgG4 Fc 도메인, IgA Fc 도메인, IgD Fc 도메인, IgE Fc 도메인, IgG Fc 도메인, 및 IgM Fc 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 Fc 도메인은 침묵화된 효과기 기능을 갖고/갖거나 반감기 연장 기능을 갖는 Fc 도메인인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 서열번호: 6, 서열번호: 7 및 서열번호: 8에 제시되는 상기 아미노산 서열로 구성되는 상기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서
    각각의 IL-15 폴리펩타이드는 펩타이드 링커에 의해 Fc 도메인에 공유적으로 부착되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 펩타이드 링커는 서열번호: 9 내지 12에 제시되는 서열의 상기 그룹으로부터 선택되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  26. (1) 2개의 Fc 도메인에 링크되는 2개의 IL-15 폴리펩타이드(또는 그것의 변이체); 및 (2) 각각의 IL-15 폴리펩타이드에 비공유적으로 링크되어 이량체성 IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체를 형성하는 2개의 IL-15Rα 도메인을 포함하는, 단리된 IL-15 융합 단백질 복합체.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 2개의 IL-15 폴리펩타이드는 상기 2개의 Fc 도메인의 C-말단에 링크되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 2개의 IL-15 폴리펩타이드는 상기 2개의 Fc 도메인의 N-말단에 링크되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 서열번호: 2에 제시되는 상기 아미노산 서열을 포함하는 IL-15 폴리펩타이드인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  30. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 서열번호: 2의 위치 30, 31, 32, 58, 62, 63, 67, 68, 또는 108에서 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 IL-15 변이체 폴리펩타이드인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 서열번호: 2의 위치 58에서 S의 D로의 치환을 포함하는 IL-15 변이체 폴리펩타이드인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체 .
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15Rα 도메인은 서열번호: 4에 제시되는 상기 아미노산 서열을 포함하는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  33. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15Rα 도메인은 IL-15 수용체 알파 스시("IL-15RαSushi") 도메인이며, 상기 IL-15RαSushi 도메인은 서열번호: 5에 제시되는 상기 서열과 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 IL-15RαSushi 도메인은 서열번호: 5에 제시되는 상기 아미노산 서열을 포함하는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인, 인간 IgG2 Fc 도메인, 인간 IgG3 Fc 도메인, 인간 IgG4 Fc 도메인, IgA Fc 도메인, IgD Fc 도메인, IgE Fc 도메인, IgG Fc 도메인, 및 IgM Fc 도메인으로 구성되는 상기 군으로부터 선택되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  36. 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 Fc 도메인은 침묵화된 효과기 기능을 갖고/갖거나 반감기 연장 기능을 갖는 Fc 도메인인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  37. 제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 서열번호: 6, 서열번호: 7 및 서열번호: 8에 제시되는 상기 아미노산 서열로 구성되는 상기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  38. 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 IL-15 폴리펩타이드는 펩타이드 링커에 의해 Fc 도메인에 공유적으로 부착되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 펩타이드 링커는 서열번호: 9 내지 12에 제시되는 서열의 상기 그룹으로부터 선택되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  40. (1) 2개의 Fc 도메인에 링크되는 2개의 IL-15Rα 도메인; 및 (2) 상기 IL-15Rα 도메인에 비공유적으로 링크되어 이량체성 IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체를 형성하는 2개의 폴리펩타이드(또는 그것의 변이체)를 포함하는 단리된 IL-15 융합 단백질 복합체로서, 상기 IL-15 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 서열번호: 2의 위치 58에서 S의 D로의 아미노산 치환을 포함하는 IL-15 변이체 폴리펩타이드인, 단리된 IL-15 융합 단백질 복합체.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 2개의 IL-15Rα 도메인은 상기 2개의 Fc 도메인의 C-말단에 링크되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  42. 제40항에 있어서,
    상기 IL-15Rα 도메인은 상기 2개의 Fc 도메인의 N-말단에 링크되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15Rα 도메인은 서열번호: 4에 제시되는 상기 아미노산 서열을 포함하는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  44. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15Rα 도메인은 IL-15 수용체 알파 스시("IL-15RαSushi") 도메인이며, 상기 IL-15RαSushi 도메인은 서열번호: 5에 제시되는 상기 서열과 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 IL-15RαSushi 도메인은 서열번호: 5에 제시되는 상기 아미노산 서열을 포함하는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인, 인간 IgG2 Fc 도메인, 인간 IgG3 Fc 도메인, 인간 IgG4 Fc 도메인, IgA Fc 도메인, IgD Fc 도메인, IgE Fc 도메인, IgG Fc 도메인, 및 IgM Fc 도메인으로 구성되는 상기 군으로부터 선택되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 Fc 도메인은 침묵화된 효과기 기능을 갖고/갖거나 반감기 연장 기능을 갖는 Fc 도메인인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc 도메인은 서열번호: 6, 서열번호: 7 및 서열번호: 8에 제시되는 상기 아미노산 서열로 구성되는 상기 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인인, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 IL-15 폴리펩타이드는 펩타이드 링커에 의해 Fc 도메인에 공유적으로 부착되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  50. 제49항에 있어서,
    상기 펩타이드 링커는 서열번호: 9 내지 12에서 제시되는 서열의 상기 그룹으로부터 선택되는, IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체.
  51. (1) 이종성 단백질에 링크되는 IL-15 폴리펩타이드(또는 그것의 변이체); 및 상기 IL-15 폴리펩타이드에 비공유적으로 링크되어 IL-15/IL-15Rα-이종성 단백질 융합 단백질을 형성하는 IL-15Rα 도메인을 포함하는, 단리된 IL-15 융합 단백질 복합체.
  52. 이종성 단백질에 링크되는 IL-15Rα 도메인; 및 (2) 상기 IL-15Rα 도메인에 비공유적으로 링크되어 IL-15/IL-15Rα-이종성 단백질 융합 단백질을 형성하는 IL-15 폴리펩타이드(또는 그것의 변이체)를 포함하는, 단리된 IL-15 융합 단백질 복합체.
  53. 제51항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이종성 단백질은 반감기 연장을 제공하는 전장 무효 항체 또는 항체 단편으로 구성되는 상기 군으로부터 선택되는, IL-15/IL-15Rα-이종성 단백질 융합 단백질.
  54. 제51항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이종성 단백질은 하기: 즉, 상기 IL-15/IL-15Rα 복합체와 함께 부가 또는 상승 효과를 제공하는 전장 IgG 또는 이중특이적 디아바디로 구성되는 상기 군으로부터 선택되는, IL-15/IL-15Rα-이종성 단백질 융합 단백질..
  55. 약제학적으로 허용가능한 담체를 갖는 혼합물에서 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 IL-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물.
  56. 대상체에서 암 또는 암 전이를 처치하는 방법으로서,
    상기 대상체에 제55항에 따른 상기 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 암은 췌장 암, 위암, 난소암, 결장직장암, 흑색종, 백혈병, 골수이형성 증후군, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 뇌암, 방광암, 두경부 암, 또는 횡문근육종으로 구성되는 상기 군으로부터 선택되는, 방법.
  58. 제56항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 암 또는 암 전이를 처치할 수 있는 제2 요법을 더 포함하며; 병용 요법은 종양 세포의 증가된 효과기 세포 사멸을 제공하는, 방법.
  59. 대상체에서 바이러스성 감염을 처치하는 방법으로서,
    상기 대상체에 제55항에 따른 상기 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  60. 수지상 돌기 세포, 종양 침윤하는 림프구(TILs), NK 세포, TCR-T 세포; CAR-NK 세포, iPS 유도-NK 세포, iPS 유도 TCR-T 세포, iPS 유도 CAR-T 세포 또는 iPS 유도 CAR-NK 세포를 사용하는 세포 요법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포 생존 및 반감기를 유지시키기 위한 입양 전달 NK 및 T 세포 요법 또는 CAR-NK 및 CAR-T 요법과 조합으로 생체외 및 생체내에서 NK 세포 및 T 세포를 확장 및 갱신하는 방법으로서; 상기 대상체에게 제55항에 따른 상기 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  61. IL-15/IL-15Rα 융합 단백질 복합체를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은: a) 숙주 세포에서 Fc 도메인에 부착되는 IL-15Rα 도메인 및 IL-15 폴리펩타이드를 공-발현시키는 단계; b) 상기 IL-15Rα 도메인 및 상기 IL-15-Fc 융합 단백질을 발현시키기에 충분한 조건 하의 배지에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 c) 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 상기 L-15/IL-15Rα-Fc 융합 단백질 복합체를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  62. 감소된 응집 및 증가된 발현을 초래하는 IL-15Ra 도메인과의 공-발현에 의해 IL-15 융합 단백질 발현을 개선하는 방법.
  63. 제1항 내지 제54항 중 어느 하나에 따른 IL-15-Fc 도메인 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자.
  64. 제1항 내지 제54항 중 어느 하나에 따른 IL-15Rα 도메인을 인코딩하는 핵산 분자.
  65. 제63항의 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  66. 제64항의 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  67. 제63항의 상기 핵산 분자를 더 포함하는 제66항의 발현 벡터.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 하나에 따른 상기 발현 벡터 중 하나 이상을 포함하는 숙주 세포.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 하나에 따른 IL-15/IL-15Rα 융합 단백질 복합체를 생산하는 방법으로서, 상기 IL-15/IL-15Rα 융합 단백질 복합체의 발현을 촉진시키는 조건 하에서 제1항 내지 제68의 상기 숙주 세포를 배양하고 상기 IL-15/IL-15Rα 융합 단백질 복합체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  70. 제69항의 방법에 의해 생산되는 단리된 IL-15/IL-15Rα 융합 단백질 복합체.
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