KR20210031694A - 엑토뉴클레오티다제 억제 및 항체-매개된 표적 사이토시스를 통한 t-세포 고갈을 예방 또는 역전시키는 조성물 및 방법 - Google Patents

엑토뉴클레오티다제 억제 및 항체-매개된 표적 사이토시스를 통한 t-세포 고갈을 예방 또는 역전시키는 조성물 및 방법 Download PDF

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사이먼 씨. 로브슨
얜 우 상
원다 가오
하오하이 장
파올라 드 안드라데 멜로
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베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터 인크
안타젠 인스티튜트 포 바이오메디컬 리서치
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Abstract

통상적인 요법(예를 들어, 표적 요법, 화학요법 및 혈관신생 억제제 등)과 병용시, 체크포인트 분자를 표적으로 하는 면역요법은 고형 또는 액체 종양의 치료에 대한 가능성을 보여주었다. 그러나, 이러한 요법에 의해 유도된 아폽토시스 조절 T 세포(Treg)는 종종 엑토뉴클레오티다제, 즉 CD39 및 CD73에 의해 엄격하게 제어되는 아데노신의 증가된 생성을 통해 종양 미세환경(TME)에서 더 억제된다. 새로운 체크포인트 분자인 CD39/ENTPD1은 종양 혈관계에서 고도로 발현되고 활성화되며, 면역 세포에 침투하고, 종양 성장을 촉진한다. CD39의 결실 또는 차단은 항종양 면역 반응을 증가시키고 종양 혈관신생을 억제함으로써 항종양 활성을 향상시킨다. 본 발명은 T-세포 고갈 마커를 갖는 T-세포와 같은 면역 세포에서 CD39 하향 조절을 매개하는 항-CD39 항체의 개발, 및 전임상 모델에서 부작용을 최소화하면서 종양 성장을 차단함에 있어서 이러한 항체의 입증된 유용성에 적어도 부분적으로 기반한다.

Description

엑토뉴클레오티다제 억제 및 항체-매개된 표적 사이토시스를 통한 T-세포 고갈을 예방 또는 역전시키는 조성물 및 방법
연방 기금 연구에 관한 진술
이 발명은 미국 국립 보건원에서 수여하는 선정 번호 CA221702, CA164970, HL094400 및 HL63972에 따라 정부의 지원을 받아 만들어졌다. 정부는 발명에 대한 일정 권리를 가지고 있다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다. 2019년 6월 13일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 "01948-260WO2_Sequence_Listing_06.13.19_ST25"이며, 크기는 69,641 바이트이다.
종양 관련 항원과 종양 반응성 면역 세포의 발견은 종양 항원-특이적 면역 반응을 기반으로 한 새로운 암 치료법에 대한 가능성으로 이어졌다. 진행암에서 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD1), PD1 리간드 1(PD11) 및 세포독성 T 림프구 항원 4(CTLA4) 요법에 대한 억제 항체를 기반으로 한 진행암에서 면역요법의 성공에도 불구하고, 상당한 비율의 환자가 이러한 치료에 반응하지 않는다(선천적 내성으로 알려짐). 또한, 환자의 1/3이 초기 반응 후 재발한다(적응 내성으로 알려짐). 암의 성공적인 면역요법을 막는 것은 종양 미세환경 내에서 공존하는 여러 비-중복성 면역억제 메커니즘의 발생이다.
세포외 아데노신은 면역 기능의 억제제로 알려져 있었다. 세포내 아데노신은 에너지 대사, 핵산 대사 및 메티오닌 주기에 관여하지만, 세포외 아데노신은 세포간 시그널링에 중요한 역할을 한다. 그 신호는 세포 표면의 G 단백질-결합 아데노신 수용체에 의해 전달되며, 신경계, 심혈관계 및 면역계를 포함한 다양한 생리 기능에 영향을 미친다. 아데노신의 세포외 농도는 대사 변화에 반응하여 증가할 수 있다. 세포에 영양분이나 산소가 부족한 경우, 불충분한 ATP 생합성은 ATP/아데노신 비율을 낮추는 경향이 있다. ATP 소비를 줄이기 위해 세포는 다량의 세포 성분의 생합성을 필요로 하는 세포 증식과 같은 에너지 소비 활동을 유예할 수 있다.
아데노신 A2A 수용체(A2AR)를 통한 면역억제성 아데노신 3'5'-모노포스페이트(cAMP)-매개 경로 시그널링은 저산소성, 염증성 및 암성 미세환경에서 T 림프구 및 자연 살해(NK) 세포를 억제할 수 있다. 또한, 아데노신-생성 경로 CD39/CD73을 차단하면 유방암, 결장직장암 및 흑색종 동물 모델의 퇴행도 유도된다. 그러나 염증 및 염증/자가면역 질병의 악화와 같은 해로운 영향의 가능성으로 인해, A2AR 억제제의 사용은 투약 제한/암 환자에게 약물의 단계적 축소 또는 심지어 중단을 요구하는 유해 사례 조건을 유발하는 원치 않는 전신 효과를 가질 수 있다. 이러한 세포 표면 아데노신 생성 효소("엑토뉴클레오티다제")에 결합하여 아데노신에 대한 ATP 이화작용의 억제에 주로 초점을 맞춘 항-CD39 및 항-CD73 항체 요법의 경우, 전신 부작용의 위험이 있을 뿐만 아니라 항체는 이러한 세포 표면 단백질이 가질 수 있는 모든 다양한 활동을 다루지 않는다. 이는 종양 침윤 림프구(TIL)에서 고갈된 T 세포의 생성에서 상향조절될 때 특히 분명하며, 상당한 비율의 환자에서 면역-종양학 요법(예컨대 항-PD-1)에 대한 내성에 기여할 수 있다. 따라서 새로운 치료 방법이 필요하다.
본 발명은 CD39와 같은 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제에 대한 특정 항체가 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스(제거) 과정을 통해 T-세포 고갈을 예방하거나 역전시키고 면역 반응을 향상시킬 수 있다는 발견을 기반으로 한다.
본 발명의 일 양태는 T-세포 고갈의 감소를 필요로 하는 대상체에서 T-세포 고갈을 감소시키는 방법 및 치료제를 제공하며, 이는 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1("CD39")에 결합하는 항원 결합 도메인 및 FcγRIIIa에 결합하는 FcγRIIIa 결합 모이어티를 포함하는 항-CD39 제제의 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 이 항체를 투여하면 CD45+ 면역 세포에서 검출 가능한 CD39의 수준이 감소된다.
특정 구현예에서, FcγRIIIa 결합 모이어티는 Fc 도메인, FcγRIIIa에 결합하는 항체 또는 이의 단편, 및 FcγRIIIa 결합 펩티드로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv(scFv)이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발한다. 특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 종양에서 고갈된 T-세포(예를 들어, T-세포 고갈에 대한 T-세포 표현형)의 비율을 감소시킨다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 종양 혈관 내피로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발한다. 특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 혈관신생 억제성이거나 그렇지 않으면 종양의 혈관계 네트워크를 파괴하거나 붕괴시킨다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 3, 5, 7, 9 또는 11의 가변 영역과 적어도 60%(예를 들어, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 동일한 중쇄 가변 영역, 및 가변 영역 서열 번호: 4, 6, 8, 10 또는 12와 적어도 60%(예를 들어, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 이 항체는 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 3, 5, 7, 9 또는 11의 CDR과 적어도 60%(예를 들어, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 동일한 CDR을 갖는 중쇄, 및 서열 번호: 4, 6, 8, 10 또는 12의 CDR과 적어도 60%(예를 들어, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 동일한 CDR을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 이 항체는 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 3의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 4의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 5의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 6의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 7의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 8의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 9의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 10의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 11의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 12의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 항종양 요법의 일부로 투여된다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 항바이러스 요법(HIV 및 HBV 감염 치료 포함), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 내장 리슈만편모증 치료와 같은 항-감염 요법의 일부로 투여된다.
본 발명의 또 다른 양태는 종양이 있는 인간 환자에게 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1("CD39")에 결합하는 항-CD39 항체를 투여하는 것을 포함하는 항종양 면역 반응을 촉진하기 위한 방법 및 치료제를 제공하며, 이 항체는 FcγRIIIa에 결합하고, 항체-의존적 세포독성(ADCC)을 유지하고, 인간 환자에게 항체를 투여하면 종양의 면역 세포에서 CD39 발현을 감소시킨다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발한다. 특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 종양에서 고갈된 T-세포(예를 들어, T-세포 고갈에 대한 T-세포 표현형)의 비율을 (예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%까지) 감소시킨다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 종양 혈관 내피로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발한다. 특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 혈관신생 억제성이거나 그렇지 않으면 종양의 혈관계 네트워크를 파괴하거나 붕괴시킨다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소형이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 저푸코실화되거나 비푸코실화된다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체(또는 보다 일반적으로, 항-CD39 제제)는 종양 항원, 면역 체크포인트 또는 공동 자극 수용체에 대한 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체(또는 다중특이적 항-CD39 제제)이며, 여기서 추가 항원 결합 부위가 면역 체크포인트에 대한 것이라면 체크포인트 억제제로 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동 자극 수용체에 대한 것이라면 공동 자극 작용제로 기능한다. 예를 들어, 추가 항원 결합 부위는 PD-1, PD-L1, CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 및 TIGIT로 이루어진 군으로부터 선택된 것과 같은 체크포인트 단백질에 결합하는 것일 수 있으며, 여기서 추가 항원 결합 부위는 체크포인트 억제제이다. 특정 바람직한 구현예에서, 추가 항원 결합 부위는 T-세포에서 상향조절되고 T-세포 고갈과 관련된 체크포인트 단백질에 결합한다. 추가 항원 결합 부위는 또한 MHCI 분자, BTLA 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a / CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 것과 같은 면역 공동 자극 수용체에 결합하는 것일 수 있으며, 여기서 추가 항원 결합 부위는 공동 자극 작용제이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체(또는 보다 일반적으로, 항-CD39 제제)는 고형 또는 액체 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여된다. 본 대상 발명에 의해 치료될 수 있는 예시적인 고형 종양은 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신장암, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 또는 신경교종을 포함한다. 본 대상 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 액체 종양은 골수성 또는 과립구성 백혈병, 림프성, 림프구성, 또는 림프모구성 백혈병과 같은 백혈병, 및 진성 적혈구증가증 또는 적혈병을 포함한다.
항-CD39 항체와 같은 항-CD39 제제는 하나 이상의 화합요법제, 항-혈관신생제, 면역-종양학 제제 및/또는 방사선을 포함하는 요법의 일부로 투여될 수 있다. 체크포인트 분자의 예시적인 억제제(예를 들어, 길항제)는 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG-3 길항제, TIM-3 길항제 및 TIGIT 길항제를 포함한다. 공동 자극 분자의 예시적인 활성화제(예를 들어, 작용제)는 GITR 작용제, CD27 작용제, 4-1BB 작용제, OX40 작용제, CD137 작용제, ICOS 작용제 및 CD28 작용제를 포함한다. 항-CD39 제제를 사용한 요법의 일부로 투여될 수 있는 다른 치료제의 예는 VEGF/VEGFR 길항제(예컨대 사이람자(Cyramza)와 같은 항-VEGF-2 항체), EGF/EGFR 길항제(예컨대 네시투무맙(Necitumumab)과 같은 항-EGFR 항체), IDO 억제제(예컨대 NLG919) 또는 IDO1 억제제(예컨대 에파카도스타트(Epacadostat)), HDAC 억제제(예컨대 엔티오스타트(entiostat)), PI3K 델타 억제제(예컨대 TGR-1202), IL-15 작용제(예컨대 IL15Ra-Fc 융합 단백질 ALT-803), CXCR4 길항제(예컨대 울로쿠플루맙(Ulocuplumab), 플레릭사포르(Plerixafor) 및 BL-8040), CXCL12 길항제(예컨대 스피에겔머(Spiegelmer) NOX-A12), DNMT 억제제(예컨대 아자시티딘), 인터류킨-21, 항-KIR 항체(예컨대 리릴루맙(Lirilumab)), 항-CSF-1R 항체(예컨대 FPA008 또는 RO5509554), 항-CCR4 항체(예컨대 모가물리주맙(Mogamulizumab)), GMCSF(예컨대 사르가모스팀(sargamostim)), 항-PS 항체(예컨대 바비툭시맙(Bavituximab)), 항-CD30 항체-오르스타틴(aurstatin) E 접합체(예컨대 Adcetris), 항-CD19 항체(예컨대 MEDI-551), 항-CEA IL-2 항체(예컨대 RG7813), 항-NY-ESO-1 항체(예컨대 CDX-1401), 항-NKG2A 항체(예컨대 IPH2201), STING 작용제(예컨대 ADU-S100, MK-1454 또는 SB 11285), TRL7/8 작용제(예컨대 MEDI9197), RIG-1 작용제(예컨대 RGT100), 또는 항-CD73 항체(예컨대 MEDI9447)를 포함한다.
본 발명의 대상 방법은 또한 종양 백신, 입양 세포 요법(CAR-T 및 ACTR 요법 포함), 항종양 유전자 요법, 억제 핵산 요법(예컨대 siRNA, shRNA, 안티센스, CRISPR 및 TALEN 요법) 또는 종양 용해 바이러스 요법을 포함하는 요법의 일부로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는
(i) T-세포 고갈의 하나 이상의 마커가 미리 결정된 역치 이상으로 발현되는 종양 침윤 림프구의 정도를 갖는 암 환자를 식별하는 단계; 및
(ii) 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1("CD39") 및 FcγRIIIa에 결합하고, 종양 침윤 림프구에서 검출 가능한 CD39 수준을 감소시켜 T-세포 고갈을 역전시키는 항-CD39 항체를 환자에게 투여하는 단계
를 포함하는 T-세포 고갈을 예방하거나 역전시키고 종양에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발한다. 특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 종양에서 고갈된 T-세포(예를 들어, T-세포 고갈에 대한 T-세포 표현형)의 비율을 감소시킨다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 종양 혈관 내피로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발한다. 특정 구현예에서, the 항-CD39 제제는 혈관신생 억제성이거나 그렇지 않으면 종양의 혈관계 네트워크를 파괴하거나 붕괴시킨다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소형이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 저푸코실화되거나 비푸코실화된다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 종양 항원, 면역 체크포인트 또는 공동 자극 수용체에 대한 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체이며, 여기서 추가 항원 결합 부위가 면역 체크포인트에 대한 것이라면 체크포인트 억제제로 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동 자극 수용체에 대한 것이라면 공동 자극 작용제로 기능한다. 예를 들어, 추가 항원 결합 부위는 PD-1, PD-L1, CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 및 TIGIT로 이루어진 군으로부터 선택된 것과 같은 체크포인트 단백질에 결합하는 것일 수 있으며, 여기서 추가 항원 결합 부위는 체크포인트 억제제이다. 특정 바람직한 구현예에서, 추가 항원 결합 부위는 T-세포에서 상향조절되고 T-세포 고갈과 관련된 체크포인트 단백질에 결합한다. 추가 항원 결합 부위는 또한 MHCI 분자, BTLA 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a / CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 것과 같은 면역 공동 자극 수용체에 결합하는 것일 수 있으며, 여기서 추가 항원 결합 부위는 공동 자극 작용제이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 종양, 예를 들어, 고형 또는 액체 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여된다. 본 대상 발명에 의해 치료될 수 있는 예시적인 고형 종양은 육종, 암종 및 림프종, 예컨대 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신장암, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 및 신경교종, 뿐만 아니라 림프종(호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종 둘 모두)을 포함한다. 본 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 액체 종양은 백혈병 예컨대 골수성 또는 과립구성 백혈병, 림프성, 림프구성, 또는 림프모구성 백혈병, 및 진성 적혈구증가증 또는 적혈병을 포함한다.
항-CD39 항체는 하나 이상의 화합요법제, 항-혈관신생제, 면역-종양학 제제 및/또는 방사선을 포함하는 요법의 일부로 투여될 수 있다. 체크포인트 분자의 예시적인 억제제(예를 들어, 길항제)는 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG-3 길항제, TIM-3 길항제 및 TIGIT 길항제를 포함한다. 공동 자극 분자의 예시적인 활성화제(작용제)는 GITR 작용제, CD27 작용제, 4-1BB 작용제, OX40 작용제, CD137 작용제, ICOS 작용제 및 CD28 작용제를 포함한다. 항-CD39 제제를 사용한 요법의 일부로 투여될 수 있는 다른 치료제의 예는 VEGFR/VEGF 길항제, EGFR/EGF 길항제, IDO 억제제(IDO1 및 IDO2 억제제 포함), HDAC 억제제, PI3K 델타 억제제, IL-15 작용제, CXCR4 길항제, CXCL12 길항제, DNMT 억제제, 인터류킨-21, 항-KIR 항체, 항-CSF-1R 항체, 항-CCR4 항체, GMCSF, 항-PS 항체, 항-CD30 항체-약물(예를 들어, 오르스타틴 E) 접합체, 항-CD19 항체, 항-CEA IL-2 항체, 항-NY-ESO-1 항체, 항-NKG2A 항체, STING 작용제, TRL7/8 작용제, RIG-1 작용제, 항-CD73 항체, P2X7 길항제 및 아데노신 A2a 수용체 길항제를 포함한다.
본 발명의 대상 방법은 또한 종양 백신, 입양 세포 요법(CAR-T 및 ACTR 요법 포함), 항종양 유전자 요법, 억제 핵산 요법(예컨대 siRNA, shRNA, 안티센스, CRISPR 및 TALEN 요법) 또는 종양 용해 바이러스 요법을 포함하는 요법의 일부로 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 단계 (i)은 종양 침윤 림프구에서 CD39, PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, CD160, BTLA, 또는 2B4 중 하나 이상의 상향조절의 정도를 나타내는 세포의 수 또는 백분율 또는 항체 염색 강도를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 구현예에서, T-세포 고갈의 다른 상향조절된 마커의 상태는 항-CD39 항체를 투여받기 위한 환자의 적격성을 결정하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 항체는 T-세포 고갈의 하나 이상의 마커가 미리 결정된 역치 이상으로 발현되는 종양 침윤 림프구의 정도를 갖는 환자에게 투여된다. 이러한 T-세포 고갈 마커는, 예를 들어, 비-소세포 폐 암종(NSCLC), 결장직장암, 진행 흑색종, 신세포 암종(RCC), 유방암(삼중 음성 유방암 포함, 위암, 식도암, 요로상피세포 암종(UC), 또는 간세포 암종(HCC)을 앓고 있는 환자에서 우세할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 T-세포 고갈의 감소를 필요로 하는 대상체에서 T-세포 고갈을 감소시키기 위한 약제학적 제제를 제공하며, 이는 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1("CD39")에 결합하고 FcγRIIIa에 결합하는 항체의 치료적 유효량을 포함하고, 이는 투여될 때 CD45+ 면역 세포에서 검출 가능한 CD39 수준을 감소시키고, T-세포 고갈 또는 T-세포 아네르기(anergy)를 나타내는 T-세포에서 T-세포 기능을 회복하는 데 효과적이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발한다. 특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 종양에서 고갈된 T-세포(예를 들어, T-세포 고갈에 대한 T-세포 표현형)의 비율을 감소시킨다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 종양 혈관 내피로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발한다. 특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 혈관신생 억제성이거나 그렇지 않으면 종양의 혈관계 네트워크를 파괴하거나 붕괴시킨다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소형이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 저푸코실화되거나 비푸코실화된다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 종양 항원, 면역 체크포인트 또는 공동 자극 수용체에 대한 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체이며, 여기서 추가 항원 결합 부위가 면역 체크포인트에 대한 것이라면 체크포인트 억제제로 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동 자극 수용체에 대한 것이라면 공동 자극 작용제로 기능한다. 예를 들어, 추가 항원 결합 부위는 PD-1, PD-L1, CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 및 TIGIT로 이루어진 군으로부터 선택된 것과 같은 체크포인트 단백질에 결합하는 것일 수 있으며, 여기서 추가 항원 결합 부위는 체크포인트 억제제이다. 특정 바람직한 구현예에서, 추가 항원 결합 부위는 T-세포에서 상향조절되고 T-세포 고갈과 관련된 체크포인트 단백질에 결합한다. 추가 항원 결합 부위는 또한 MHCI 분자, BTLA 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a / CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 것과 같은 면역 공동 자극 수용체에 결합하는 것일 수 있으며, 여기서 추가 항원 결합 부위는 공동 자극 작용제이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 고형 또는 액체 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 인간 환자에게 투여하기 위해 제형화된다. 본 대상 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 고형 또는 액체 종양은 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 담낭암, 신장암, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 및 신경교종, 뿐만 아니라 림프종(호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종 둘 모두)을 포함한다. 본 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 액체 종양은 백혈병 예컨대 골수성 또는 과립구성 백혈병, 림프성, 림프구성, 또는 림프모구성 백혈병, 및 진성 적혈구증가증 또는 적혈병을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 하나 이상의 화합요법제, 항-혈관신생제, 면역-종양학 제제 및/또는 방사선과의 공통 투여를 위한 키트로 제형화되거나 키트에 존재할 수 있다. 체크포인트 분자의 예시적인 억제제(길항제)는 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG-3 길항제, TIM-3 길항제 및 TIGIT 길항제를 포함한다. 공동 자극 분자의 예시적인 활성화제(작용제)는 GITR 작용제, CD27 작용제, 4-1BB 작용제, OX40 작용제, CD137 작용제, ICOS 작용제 및 CD28 작용제를 포함한다. 항-CD39 제제를 사용한 요법의 일부로 투여될 수 있는 다른 치료제의 예는 VEGFR/VEGF 길항제, EGFR/EGF 길항제, IDO 억제제(IDO1 및 IDO2 억제제 포함), HDAC 억제제, PI3K 델타 억제제, IL-15 작용제, CXCR4 길항제, CXCL12 길항제, DNMT 억제제, 인터류킨-21, 항-KIR 항체, 항-CSF-1R 항체, 항-CCR4 항체, GMCSF, 항-PS 항체, 항-CD30 항체-약물(예를 들어, 오르스타틴 E) 접합체, 항-CD19 항체, 항-CEA IL-2 항체, 항-NY-ESO-1 항체, 항-NKG2A 항체, STING 작용제, TRL7/8 작용제, RIG-1 작용제, 항-CD73 항체, P2X7 길항제 및 아데노신 A2a 수용체 길항제를 포함한다.
본 발명의 대상 방법은 또한 종양 백신, 입양 세포 요법(CAR-T 및 ACTR 요법 포함), 항종양 유전자 요법, 억제 핵산 요법(예컨대 siRNA, shRNA, 안티센스, CRISPR 및 TALEN 요법) 또는 종양 용해 바이러스 요법을 포함하는 요법의 일부로 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 단계 (i)은 종양 침윤 림프구에서 CD39, PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, CD160, BTLA, 또는 2B4 중 하나 이상의 상향조절의 정도를 나타내는 세포의 수 또는 백분율 또는 항체 염색 강도를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 구현예에서, T-세포 고갈의 다른 상향조절된 마커의 상태는 항-CD39 항체를 투여받기 위한 환자의 적격성을 결정하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 항체는 T-세포 고갈의 하나 이상의 마커가 미리 결정된 역치 이상으로 발현되는 종양 침윤 림프구의 정도를 갖는 환자에게 투여된다. 이러한 T-세포 고갈 마커는, 설명을 위해, 비-소세포 폐 암종(NSCLC), 결장직장암, 진행 흑색종, 신세포 암종(RCC), 유방암(삼중 음성 유방암 포함, 위암, 식도암, 요로상피세포 암종(UC), 또는 간세포 암종(HCC)을 앓고 있는 환자에서 우세할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1("CD39")에 결합하고 FcγRIIIa에 결합하는 항체의 치료적 유효량을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 T-세포 고갈을 감소시키기 위한 약제학적 제제를 제공하며, 이는 투여될 때 CD45+ 면역 세포에서 검출 가능한 CD39 수준을 감소시키고, T-세포 고갈 또는 T-세포 아네르기를 나타내는 T-세포에서 T-세포 기능을 회복하는 데 효과적이다. 항체는 다음을 포함할 수 있다:
a) 서열 번호: 3의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 4의 CDR을 갖는 경쇄,
b) 서열 번호: 5의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 6의 CDR을 갖는 경쇄,
c) 서열 번호: 7의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 8의 CDR을 갖는 경쇄,
d) 서열 번호: 9의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 10의 CDR을 갖는 경쇄, 또는
e) 서열 번호: 11의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 12의 CDR을 갖는 경쇄.
중쇄 및 경쇄는 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 인간 CD39에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부분, 및 종양 항원, 면역 체크포인트 또는 공동 자극 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부분을 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 여기서 추가 항원 결합 부위가 면역 체크포인트에 대한 것이라면 체크포인트 억제제로 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동 자극 수용체에 대한 것이라면 공동 자극 작용제로 기능하고, 여기서 이중특이적 항체는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발한다.
도 1a 및 도 1b는 항-CD39 5F2 항체가 마우스 및 인간 CD39 양성 세포에 대한 ADCC 활성을 나타내는 것을 보여주는 그래프이다. mCD39를 발현시키는 CHO 세포(도 1a) 또는 hCD39를 발현시키는 Raji 세포(도 1b)를 각각 표적 세포로 사용하였다. 루시퍼라제를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염된 Jurkat 세포는 프로메가(Promega)에서 구입하여 pLentiTdT-mFcγRIV로 추가 감염되었다. TdTomato 양성 Jurkat 세포를 FACS로 분류하여 이펙터 세포로 사용하였다. 야생형(WT) 또는 비푸코실화된(Afuc) 5F2-mIgG2c를 연속 희석 농도로 첨가하였다. 항체를 표적 및 이펙터 세포와 6시간 인큐베이션한 후 배경에 대한 루시퍼라제 활성의 배수 증가로의 ADCC가 측정되었다.
도 2a 내지 도 2c는 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 각각의 개별 마우스에서 B16/F10 종양 성장의 동력학을 보여주는 그래프 세트이다. 도 2a는 식염수를 사용한 대조군을 나타내고, 도 2b는 5F2-mIgG2c로 처리되는 경우 종양 성장을 나타내고, 도 2c는 Afuc 5F2-mIgG2c로 처리된 종양 성장을 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 B16/F10-보유 마우스의 평균 종양 용적(도 3a) 및 종양 중량(도 3b)을 보여주는 그래프 세트이다.
도 4a 및 도 4b는 WT 5F2-mIgG1 mAb 처리 후 각각의 개별 마우스에서 B16/F10 종양 성장의 동력학을 보여주는 그래프 세트이다. 도 4a는 식염수를 사용한 대조군을 나타내고, 도 4b는 WT 5F2-mIgG1로 처리되는 경우 종양 성장을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 WT 5F2-mIgG1 mAb 처리 후 B16/F10-보유 마우스의 평균 종양 용적(도 5a) 및 종양 중량(도 5b)을 보여주는 그래프 세트이다.
도 6A 내지 도 6d는 다양한 유형의 5F2 mAb 처리 후 각각의 개별 마우스에서 B16/F10 종양 성장의 동력학을 보여주는 그래프 세트이다. 도 6a는 WT 5F2-mIgG1로 처리되는 경우 종양 성장을 나타내고, 도 6b는 Afuc 5F2-mIgG1로 처리되는 경우 종양 성장을 나타내고, 도 6c는 5F2-mIgG2c로 처리되는 경우 종양 성장을 나타내고, 도 6d는 Afuc 5F2-mIgG2c로 처리되는 경우 종양 성장을 나타낸다.
도 7은 5F2 mAb 처리 후 B16/F10-보유 마우스의 평균 종양 용적을 보여주는 그래프이다.
도 8은 5F2 mAb 처리 후 B16/F10-보유 마우스의 생존률(안락사까지의 시간)을 보여주는 그래프이다.
도 9a 및 도 9b는 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후(도 9b) 또는 식염수로 처리된(도 9a) 각각의 개별 마우스에서 B16/F10 종양 성장의 동력학을 보여주는 그래프 세트이다.
도 10은 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 B16/F10-보유 마우스의 평균 종양 용적을 보여주는 그래프이다.
도 11은 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 B16/F10-보유 마우스의 생존률(안락사까지의 시간)을 보여주는 그래프이다.
도 12a는 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리를 3번 받은 B16/F10-보유 마우스의 평균 종양 용적을 보여주는 그래프이다. 0일에 1.6x105 luc-B16/F10 세포를 야생형 FoxP3-GFP 녹인 리포터 마우스(16주령 내지 18주령의 암컷; 인하우스(in house))의 오른쪽 아래 옆구리에 주사했다(피하). 9일, 13일 및 16일에 종양-보유 마우스에게 Afuc 5F2-mIgG2c mAb(i.p.를 통해 식염수 200 ml 중 200 mg)를 제공했다(마우스는 종양 용적에 기반하여 2개의 그룹으로 무작위 배정되었음). 식염수 200 ml를 투여받은 마우스는 대조군으로 사용되었다. 종양 용적은 상기 기재된 바와 같이 측정되었고 연구는 17일에 종결되었다. 그룹당 n=3.
도 12b는 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리를 2번 받은 B16/F10-보유 마우스의 평균 종양 용적을 보여주는 그래프이다. 0일에 1.0x105 luc-B16/F10 세포를 야생형 FoxP3-GFP 녹인 리포터 마우스(8주령의 암컷; 인하우스)의 오른쪽 아래 옆구리에 주사했다(s.c.). 13일 및 16일에 종양-보유 마우스에게 Afuc 5F2-mIgG2c mAb(i.p.를 통해 식염수 200 ml 중 200 mg)를 제공했다(마우스는 종양 용적에 기반하여 2개의 그룹으로 무작위 배정되었음). 식염수 200 ml를 투여받은 마우스는 대조군으로 사용되었다. 종양 용적은 상기 기재된 바와 같이 측정되었고 연구는 17일에 종결되었다. 그룹당 n=4 내지 5.
도 13a 내지 도 13d는 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 각각의 개별 마우스에서 MC38 종양 성장의 동력학을 보여주는 그래프 세트이다. 마우스는 수컷 또는 암컷이었다(도 13b 및 도 13d). 대조군은 식염수로 처리되었다(도 13a 및 도 13c).
도 14a 및 14b는 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 MC38-보유 수컷(도 14b) 또는 암컷(도 14a)의 평균 종양 용적을 보여주는 그래프 세트이다.
도 15는 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 MC38-보유 마우스의 평균 종양 용적을 보여주는 그래프이다.
도 16은 CD39 발현이 비장과 대조적으로 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 종양 내부에서 급격히 상승됨을 보여주는 그래프이다.
도 17a 내지 도 17c는 종양에서 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리가 식염수 처리된 마우스와 비교하여 T 세포 아형(CD45+CD3+), 골수 유래 세포(CD45+CD11b+/또는 F4/80+)(도 17a 및 도 17b)뿐만 아니라 비-림프구(CD45-)(도 17c)에서 CD39 발현의 현저한 감소를 초래함을 보여주는 그래프 세트이다.
도 18a 및 18b는 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 종양 내에서 Treg 세포(CD4+FoxP3+/CD4+)의 고갈이 없으며(도 18a) F4/80 대식세포(CD11b+F4/80+/CD11b+)의 수준 증가(도 18b)가 주목되었음을 보여주는 그래프 세트이다.
도 19a 및 도 19b는 비장에서 식염수 처리된 마우스와 비교하여 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 T 세포 아형(CD45+CD3+)(도 19a) 및 골수 유래 세포(CD45+CD11b+/또는 F4/80+)(도 19b)에서 CD39 발현이 현저하게 감소되었음을 보여주는 그래프 세트이다.
도 20a 및 도 20b는 배수 림프절에서 식염수 처리된 대조군과 비교할 때 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 Treg(CD45+CD3+CD4+FoxP3+)(도 20a) 및 CD45+CD11b+(도 20b) 세포에서 CD39 발현 감소가 관찰되었음을 보여주는 그래프 세트이다.
도 21a 내지 도 21c는 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리가 식염수 처리된 마우스와 비교하여 종양(도 21a) 및 비장(도 21b)의 T 세포 아형(CD45+CD3+)에서 상당한 CTLA4 발현 감소를 초래하지만, 배수 림프절(도 21c)에서는 아니었음을 보여주는 그래프 세트이다.
도 22a 내지 도 22c는 식염수 처리된 마우스와 비교하여 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리에 의해 종양(도 22a), 비장(도 22b) 또는 배수 림프절(도 22c)의 T 세포 아형(CD45+CD3+)에서 PD-1 발현이 변경되지 않음을 보여주는 그래프 세트이다.
도 23a 내지 도 23c는 식염수 처리된 마우스와 비교하여 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리에 의해 종양(도 23a), 비장(도 23b) 또는 배수 림프절(도 23c)의 골수 유래 세포(CD45+CD11b+)에서 PD-L1 발현이 변경되지 않음을 보여주는 그래프 세트이다.
도 24a 및 도 24b는 비장에서 식염수 처리된 마우스와 대조적으로 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 모든 주요 림프구(CD45+)에서 CD39 발현 감소가 주목됨을 보여주는 그래프 세트이다.
도 25a 및 도 25b는 림프절에서 식염수 처리된 마우스와 비교하여 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 선택된 림프구 집단(CD45+)에서 CD39 발현 감소가 주목됨을 보여주는 그래프 세트이다.
도 26은 간에서 식염수 처리된 마우스와 비교하여 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 대부분의 림프구 집단(CD45+)에서 CD39 발현 감소가 주목됨을 보여주는 그래프이다.
도 27은 대조군 마우스와 비교할 때 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 림프절 또는 비장에서 Treg 세포(CD3+CD4+FoxP3+/CD3+)의 고갈이 나타나지 않음을 보여주는 그래프이다.
도 28은 1000 μg afuc 5F2 IgG2c로 3번 처리된(CTX8-10) 종양이 없는 마우스에서 간(ALT 및 AST) 및 신장(BUN) 기능에 대해 평가되는 경우 상당한 세포독성이 나타나지 않음을 보여주는 표이다. 간 및 신장 기능을 평가하였고, 심각한 독성이 발견되지 않았다.
도 29a 및 도 29b는 비장에서 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리가 식염수-처리된 마우스 또는 임의의 다른 유형의 5F2 mAb-처리된 마우스와 비교할 때 모든 주요 림프구(CD45+)에서 CD39 발현의 최대 감소를 초래함을 보여주는 그래프 세트이다.
도 30a 및 도 30b는 림프절에서 5F2 mAb가 식염수 처리된 마우스와 비교할 때 T 세포 아형(CD45+CD3+)에서 CD39 발현 감소를 초래함을 보여주는 그래프 세트이다.
도 31a 및 도 31b는 혈액에서 5F2 mAb가 식염수 처리된 마우스와 비교하여 선택된 림프구 집단(CD45+)에서 CD39 발현 감소를 초래함을 보여주는 그래프 세트이다.
도 32는 대조군 마우스와 비교할 때 다양한 5F2 mAb 처리 후 비장 및 림프절에서 Treg 세포(CD4+FoxP3+/CD3+)의 고갈이 주목되지 않음을 보여주는 그래프이다.
도 33a 내지 도 33c는 식염수 처리된 마우스와 대조적으로 5F2 mAb 처리에 의해 비장(도 33a), 림프절(도 33b), 또는 혈액(도 33c)의 T 세포 아형(CD45+CD3+)에서 CTLA4 발현이 변경되지 않음을 보여주는 그래프 세트이다.
도 34a 내지 도 34c는 식염수 처리된 마우스와 비교하여 5F2 mAb 처리에 의해 비장(도 34a), 림프절(도 34b), 또는 혈액(도 34c)의 골수 유래 세포 집단(CD11b+)에서 PD-L1 발현이 변경되지 않음을 보여주는 그래프 세트이다.
도 35a 및 도 35b는 Afuc 5F2-mIgG2c mAb(도 35b) 또는 식염수 처리(도 35a) 후 각각의 개별 LysMCre/CD39KO 마우스에서 MC38 종양 성장의 동력학을 보여주는 그래프 세트이다.
도 36은 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리 후 MC38-보유 LysMCre/CD39KO 마우스의 평균 종양 용적을 보여주는 그래프이다.
도 37a 내지 도 37e는 다양한 유형의 5F2 mAb 처리 후 각각의 개별 마우스에서 MC38 종양 성장의 동력학을 보여주는 그래프 세트이다. 도 37a는 식염수로 처리된 대조군 마우스를 나타내고, 도 37b는 WT 5F2-mIgG1로 처리된 마우스에서 종양 성장을 나타내고, 도 37c는 Afuc 5F2-mIgG1로 처리된 마우스에서 종양 성장을 나타내고, 도 37d는 5F2-mIgG2c로 처리된 마우스에서 종양 성장을 나타내고, 도 37e는 Afuc 5F2-mIgG2c로 처리된 마우스에서 종양 성장을 나타낸다.
도 38은 5F2 mAb 처리 후 MC38-보유 마우스의 평균 종양 용적을 보여주는 그래프이다.
도 39a 내지 도 39e는 종양에서 식염수 처리된 마우스와 대조적으로 5F2 mAb 처리 후 모든 T 세포 서브셋(CD45+CD3+)에서 CD39 발현 감소가 주목됨을 보여주는 그래프 세트이다.
도 40a 내지 도 40d는 종양에서 식염수 처리된 마우스와 대조적으로 5F2 mAb 처리 후 Gr1 고 집단을 제외한 모든 골수 유래 하위 집단(CD45+CD11b+)에서 CD39 발현 감소가 주목됨을 보여주는 그래프 세트이다.
도 41a 내지 도 41e는 비장에서 식염수 처리된 마우스와 대조적으로 5F2 mAb 처리 후 모든 T 세포 서브셋(CD45+CD3+)에서 CD39 발현 감소가 주목됨을 보여주는 그래프 세트이다.
도 42a 내지 도 42d는 비장에서 식염수 처리된 마우스와 대조적으로 5F2 mAb 처리 후 모든 골수 유래 세포 하위 집단(CD45+CD11b+)에서 CD39 발현 감소가 주목됨을 보여주는 그래프 세트이다.
도 43a 내지 도 43f는 배수 림프절(DLN)에서 식염수 처리된 마우스와 대조적으로 5F2 mAb 처리 후 모든 T 세포 서브셋(CD45+CD3+)(도 43a 내지 도 43e)뿐만 아니라 골수 유래 하위 집단(CD45+CD11b+)(도 43F)에서 CD39 발현 감소가 주목됨을 보여주는 그래프 세트이다.
도 44a 내지 도 44e는 혈액에서 식염수 처리된 마우스와 대조적으로 5F2 mAb 처리 후 모든 T 세포 서브셋(CD45+CD3+)에서 CD39 발현 감소가 주목됨을 보여주는 그래프 세트이다.
도 45a 내지 도 45d는 혈액에서 식염수 처리된 마우스와 대조적으로 임의의 5F2 mAb 처리에 의해 골수 유래 하위 집단(CD45+CD11b+)에서 CD39 발현이 변경되지 않음을 보여주는 그래프 세트이다.
도 46a 내지 도 46d는 식염수(도 46a 및 도 46b) 또는 비푸코실화된 5F2-mlgG2c(도 46c 및 도 46d)로 처리된 종양 혈관계의 CD39 염색을 보여주는 IHC 이미지 세트이다.
도 47a는 항-PD-1 항체로 처리된 흑색종-보유 wt 마우스의 종양 사진이다.
도 47b는 항-PD-1 항체로 처리된 흑색종-보유 wt 마우스의 종양 용적을 보여주는 그래프이다.
도 47c는 항-PD-1 항체로 처리된 CD39 눌(null) 마우스의 종양 용적을 보여주는 그래프이다.
도 48a 내지 도 48e는 CD39 발현을 보여주는 그래프 세트이다. PB1(도 48a), PB2(도 48b), PB3(도 48c), PB4(도 48d) 및 PB5(도 48e)로 지정된 항-hCD39 항체는 적어도 부분적으로 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 통해 매개된 그 밖에 CD39-양성 인간 B 림프모구 세포에서 CD39를 고갈시킬 수 있다. CD39-발현 HCC1739BL 세포를 인간 Fc(IgG1)(4 μg/ml) 또는 인간 IgG1 이소형 대조군(4 μg/ml)으로 키메라화된 토끼 항-hCD39 항체의 존재 하에 THP-1 단핵 세포(THP-1:HCC1739BL = 3:2)와 함께 또는 없이 43시간 또는 2시간 동안 공동 배양하였다. HCC1739BL 세포에서 CD39 발현은 이 키메라 항체와 다른 에피토프를 인식하는 염색 항체에 의해 검출되었다. THP-1 및 HCC1739BL 세포는 CytoFlexLX 유세포 분석기를 사용하여 CD20 염색에 의해 개별적으로 게이팅되었다. 각 도면의 첫 번째 패널은 인간 IgG1 이소형 대조군으로 처리된 세포와 대조적으로 키메라 항체로 처리된 세포의 상대적 강도로 공동 배양 내에서 표현되는 데이터이다. 각 도면의 두 번째 패널은 HCC1739BL 세포 단독과 비교하여 공동 배양된 세포의 상대적 강도로 표현되는 데이터이다.
도 49a 내지 도 49d는 CD39 고갈을 보여주는 그래프이다. 항-hCD39 항체는 메커니즘을 통해 CD39의 고갈을 유발하고, HCC1739BL 세포에서 쉐딩(shedding) 및/또는 내재화를 또한 포함할 수 있다. CD39-발현 HCC1739BL 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 지정된 시간 동안 인간 Fc(IgG1)(2 μg/ml)로 키메라화된 토끼 항-hCD39 항체와 인큐베이션하였다. 항체 인큐베이션 후, 세포를 2번 세척하고 이차 항체(AF488과 접합된 당나귀 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 항체)로 염색한 다음 CytoFlexLX 기계에서 유세포 분석하였다. 도 49a는 PB1을 도시하고, 도 49b는 PB3을 도시하고, 도 49c는 PB4를 도시하고, 도 49d는 PB5를 도시한다.
I. 개요
아데노신 의존적 면역억제를 비활성화하려면 세포외 아데노신의 대사에 대해 생각하는 것이 유익할 것이다. 세포외 아데노신의 공급원은 세포외 구획에 있는 ATP인 것으로 여겨진다. 세포 표면에는 CD39와 CD73이라는 뉴클레오티다아제가 있다. CD39는 ATP/ADP에서 AMP로의 가수분해를 촉매하고, CD73은 AMP를 아데노신으로 전환시킨다. 조직 저산소증은 아데노신 생산을 증가시키고 아데노신 제거를 감소시킴으로써 세포외 아데노신의 축적을 유도할 수 있다. 저산소증은 CD39 및 CD73의 mRNA 수준과 효소 활성을 유도하여 아데노신 생산을 증가시킨다. 아데노신 제거 속도는 아데노신 키나제의 저산소증 의존적 억제에 의해 감소될 수 있으며, 결과적으로 아데노신이 더 축적된다.
종양을 제거하는 CD8+ T 림프구의 능력은 면역억제 미세환경을 생성하는 상쇄 능력에 의해 제한된다. 최근에는, 종양 침윤 CD8+ T 세포의 서브셋이 높은 CD39 발현 수준을 나타낸다는 증거가 나타났다. CD39highCD8+ T 세포의 빈도는 종양 성장과 함께 증가하지만 림프양기관에는 없었다. CD39 발현이 높은 종양 침윤 CD8+ T 세포는 TNF 및 IL2의 생산 감소 및 동시 억제 수용체의 발현과 같은 고갈의 특징을 나타냈다. 마우스로부터의 고갈된 CD39+CD8+ T 세포는 세포외 ATP를 가수분해하였고, 이는 CD39가 효소적으로 활성이 있음을 입증하였다. 또한, 고갈된 CD39+CD8+ T 세포는 반응자 CD8+ T 세포에 의한 IFNγ 생산을 억제했다. 유방암 및 흑색종 환자의 검체에서 CD39+CD8+ T 세포는 종양 및 침입성 또는 전이성 림프절 내에 존재하지만 비침입성 림프절 내에서는 거의 검출되지 않았고 말초 혈액에는 존재하지 않았다. 이러한 세포는 IFNγ, TNF, IL2의 생산 악화 및 높은 동시 억제 수용체 발현과 함께 고갈된 표현형을 나타냈다. T-세포 수용체 참여는 인간 CD8+ T 세포에서 CD39를 유도하기에 충분했지만, IL6 및 IL27에 대한 노출은 인간 또는 뮤린 공급원으로부터의 자극된 CD8+ T 세포에서 CD39 발현을 촉진했다. 이러한 관찰은 종양 미세환경이 CD8+ T 세포에서 면역 조절 분자로서 CD39의 획득을 어떻게 유도하는지를 나타내며, T-세포 기능장애의 바이오마커와 면역요법 개입의 표적을 정의하는 데 영향을 미친다. 고갈된 T 세포는 기능을 손상시키고 만성 바이러스 감염에 대한 면역을 제한하는 다중 동시 억제 분자를 발현시킨다. CD39는 만성 바이러스 감염 및 미생물 및 기생충 병원균 감염과 관련하여 고갈된 CD8+ T 세포의 마커이다. 만성 감염에서 CD8+ T 세포에 의해 발현된 CD39는 효소적으로 활성이고, PD-1과 함께 공동 발현되며, T 세포 고갈의 전사 서명(transcriptional signature)으로 세포를 표시하고, HIV 및 HCV에서 바이러스 부하와 관련이 있다. 만성 림프구성 맥락수막염 바이러스 감염의 마우스 모델에서, 바이러스-특이적 CD8+ T 세포는 급성 감염에 의해 유도된 기능적 기억 세포에 없는 CD39high CD8+ T 세포 집단을 함유한다. 이 CD39high CD8+ T 세포 집단은 말기 고갈의 표현형 및 기능적 프로파일을 갖는 세포에 대해 농축된다. 이것은 만성 감염과 관련된 T 세포 고갈의 조절에서 퓨린성 경로와 관련이 있다.
본 발명은 CD39와 같은 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제에 대한 특정 항체가 T-세포 고갈을 예방 또는 역전시킬 수 있으며, 트로고사이토시스(trogocytosis), 암의 경우에 종양학적 트로고사이토시스 과정을 통해 면역 반응을 향상시킬 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기반한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1("CD39")에 결합하고, 또한 FcγRIII(예컨대 FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIc)에 결합하고, CD39high CD45+ 면역 세포(예컨대 CD39high CD8+ T 세포)를 갖는 환자에게 투여될 때, 바람직하게는 CD45+ 면역 세포 수의 상당한 감소 없이 CD39high CD45+ 면역 세포의 감소를 초래하는 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 임의의 특정 이론에 결부시키고자 하지 않으면서, CD39high CD8+ T 세포와 같은 CD39high CD45+ 면역 세포의 감소는, 예를 들어, 세포 사멸을 통한 면역 세포 집단의 고갈 없이 면역 세포로부터 CD39의 FcγRIII 결합-의존적 제거(아래에 정의된 바와 같이 CD39 트로고사이토시스로 지칭되는 과정)의 결과임이 분명하다. 그 결과 면역 세포 수는 보존되지만, 고갈된 표현형에서 면역 적격 상태로 역전된다.
특정 구현예에서, 항-CD39 제제는 종양 혈관 내피로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발한다. 특정 구현예에서, the 항-CD39 제제는 혈관신생 억제성이거나 그렇지 않으면 종양의 혈관계 네트워크를 파괴하거나 붕괴시킨다.
II. 정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 구문이 아래에 정의되어 있다.
"분화 클러스터 39", ""엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1" 또는 (유전자) "ENTPD1" 및 (단백질) "NTPDase1"로도 지칭되는 "CD39"는 예컨대 ATP, ADP, UTP 및 UDP와 같은 P2 수용체 리간드를 가수분해하기 위해, 트리포스포뉴클레오시드 및 디포스포뉴클레오시드의 γ-포스페이트 및 β-포스페이트 잔기의 모노포스포뉴클레오시드 유도체(엔자임(ENZYME) 항목: EC 3.6.1.5)로의 가수분해를 촉매하는 세포외로 향하는 촉매 부위를 갖는 세포 표면에 위치한 엑토뉴클레오티다제이다. 대표적인 인간 NTPDase1 단백질 서열은 UniProtKB 항목 "P49961(ENTP1_인간)"에서 제공되고, 효소에 대한 대표적인 인간 코딩 서열은 진뱅크 액세션(GenBank Accession) S73813에서 제공된다.
"CD39 항체"(대안적으로 "항-CD39 항체")는 NTPDase1 단백질의 하나 이상의 에피토프에 선택적으로 결합하는 항체를 지칭하고, 단일 파라토프 항체뿐만 아니라 이중 파라토프 및 기타 다중 파라토프 포맷 항체를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 "항체-매개된 표적 사이토시스" 또는 "AMTC"는 예를 들어 CD45+ 세포 사멸의 유도 이외의 공정을 통해 CD45+ 면역 세포의 수를 실질적으로 감소시키지 않고 CD45+ 면역 세포의 표면으로부터 CD39의 항체-매개된 고갈을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같이, 바람직한 CD39 항체는 NTPDase1의 세포외 에피토프에 결합하고 또한 FcγRIII(예를 들어, 항체 또는 다른 FcγRIII 결합 모이어티의 Fc 도메인을 통해)에 결합하고, 더욱 더 바람직하게는 CD45+ 면역 세포로부터 CD39의 FcγRIII 결합-의존적 항체-매개된 표적 사이토시스를 매개할 수 있다.
a. 항체 및 다른 폴리펩티드
본원에 사용된 용어 "항체"는 적어도 하나의 항원-결합 부위를 통해 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질 또는 전술한 것들 중 어느 것의 조합과 같은 표적을 인식하고 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭하며, 여기서 항원-결합 부위는 일반적으로 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 이 용어는 온전한 폴리클로날 항체, 온전한 모노클로날 항체, 항원-결합 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편), 단일 사슬 Fv(scFv) 항체(이러한 단편이 Fc 또는 다른 FcγRIII 결합 도메인을 포함하도록 포맷되었을 경우), 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 단일특이적 항체, 1가 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 융합 단백질(Fc 또는 다른 FcγRIII 결합 도메인을 포함하도록 포맷됨), 및 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 기타 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분"은 항원(예를 들어, 인간 CD39)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 용어 항체, 예를 들어, 본원에 기재된 항-CD39 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 2개 이상의 분리된 CDR의 조합을 포함한다. 이러한 단일 사슬 항체도 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 및 다른 잠재적인 작제물은 문헌(Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301)에 기재되어 있다. 이러한 항원-결합 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 이 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다.
용어 항체의 "가변 영역"은 항체 경쇄의 가변 영역, 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 단독으로 또는 조합하여 지칭한다. 일반적으로, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 프레임워크 영역(FR)과 "초가변 영역"으로도 알려진 3개의 상보성 결정 영역(CDR)으로 구성된다. 각각의 사슬의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되며, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 두 가지의 기술이 있다: (1) 종간 서열 가변성에 기반한 접근법(예를 들어, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda Md.), 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기반한 접근법(Al Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948). 또한, CDR을 결정하기 위해 이러한 두 가지 접근법의 조합이 때때로 당 업계에서 사용된다.
항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 중쇄 불변 도메인의 정체성에 기반하여, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 부류의 면역글로불린 또는 이의 하위 부류(이소형)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 어느 것일 수 있지만, 바람직한 CD39 항체는 FcγRIII와 가장 효과적으로 결합하기 위해 IgG1 및 IgG3 이소형이다(예를 들어, Kd가 10-7 이하).
특정 구현예에서, 항체는 "저푸코실화"되고 심지어 "비푸코실화"될 수 있다. "저푸코실화" 항체 제제는 올리고당 사슬의 50% 미만이 α-1,6-푸코스를 함유하는 항체 제제를 지칭한다. 전형적으로, "저푸코실화" 항체 제제에서 올리고당 사슬의 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 또는 5% 미만 또는 1% 미만은 α-1,6-푸코스를 함유한다. "비푸코실화" 항체는 IgG 중쇄의 CH2 도메인에 부착된 탄수화물에 α-1,6-푸코스가 없다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체 또는 모든 항체가 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체 조성물을 지칭한다. 전형적으로 이러한 모노클로날 항체는 단일 세포 또는 항체를 인코딩하는 핵산으로부터 유래될 것이며, 임의의 서열 변경을 의도적으로 도입하지 않고 증식될 것이다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 선택적 불변 영역을 갖는 모노클로날 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, 인간 모노클로날 항체는, 예를 들어, 트랜스제닉 또는 트랜스염색체(transchromosomal) 비인간 동물(예를 들어, 인간 중쇄 전이유전자 및 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 마우스)에서 얻은 B 세포를 무한증식 세포에 융합시켜 얻은 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 용어 "인간화된 항체"는 최소 비인간 서열을 함유하는 특이적 면역글로불린 사슬, 키메라 면역글로불린 또는 이의 단편인 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화된 항체는 CDR의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및/또는 결합 능력을 갖는 비인간 종(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼 또는 햄스터)의 CDR의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 잔기는 비인간 종의 항체에서 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화된 항체는 항체 특이성, 친화성 및/또는 결합 능력을 정제하고 최적화하기 위해 Fv 프레임워크 영역 및/또는 대체된 비인간 잔기 내에서 추가 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 인간화된 항체는 비인간 면역글로불린에 상응하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR을 포함하는 가변 도메인을 포함할 수 있지만, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 일부 구현예에서, 가변 도메인은 인간 면역글로불린 서열의 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 도메인은 인간 면역글로불린 공통 서열의 프레임워크 영역을 포함한다. 인간화된 항체는 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인, 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 인간화된 항체는 일반적으로 키메라 항체와 구별되는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체 또는 당 업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 만들어진 인간에 의해 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2가지 이상의 종에서 유래된 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화성 및/또는 결합 능력을 갖는 포유동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼 등) 중 한 종에서 유래된 항체의 가변 영역에 상응하지만, 불변 영역은 또 다른 종(일반적으로 인간)에서 유래된 항체의 서열과 상동하여 해당 종에서 면역 반응을 유발하지 않는다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 면역글로불린의 Fc 영역에 결합하는 수용체이다. IgG 항체에 결합하는 FcR은 대립유전자 변이체 및 이러한 수용체의 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하는 FcγR 패밀리의 수용체를 포함한다. FcγR 패밀리는 3가지 활성화(마우스의 경우 FcγRI, FcγRIII 및 FcγRIV; 인간의 경우 FcγRIA, FcγRIIA 및 FcγRIIIA) 수용체 및 하나의 억제(Fc□RIIB) 수용체로 구성된다.
"FcγRIII 결합 모이어티"는 항-CD39 항체의 항원 결합 부위와 결합될 때, FcγRIII(CD16)에 결합하고 항체-매개된 표적 사이토시스를 매개할 수 있는 펩티드, 단백질, 핵산 또는 기타 모이어티이다.
용어 "에피토프" 및 "항원 결정인자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 특정 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치되는 인접 아미노산과 비인접 아미노산 모두에서 형성될 수 있다. 인접 아미노산에서 형성된 에피토프(선형 에피토프로도 지칭됨)는 전형적으로 단백질 변성시 유지되지만, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프(입체형태적 에피토프로도 지칭됨)는 전형적으로 단백질 변성시 소실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 입체형태로 적어도 1개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상)의 아미노산을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인"은 표적과 항체 사이의 결합과 같은 측정 가능하고 재현 가능한 상호작용을 지칭하며, 이는 생물학적 분자를 포함한 분자의 이종 집단이 있는 데서 표적의 존재를 결정한다. 예를 들어, 표적(에피토프일 수 있음)에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력으로, 더 용이하게 및/또는 더 긴 기간 동안 이 표적에 결합하는 항체이다. 일 구현예에서, 관련되지 않은 표적에 대한 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사면역측정법(RIA)에 의해 측정된 바와 같이 표적에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 1 μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 또는 심지어 0.1 nM 이하의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 상이한 종 유래 단백질 사이에 보존된 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있지만 필수적이지는 않다.
용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 이 중합체는 선형이거나 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 포함)뿐만 아니라 당 업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드도 이 정의 내에 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체 또는 면역글로불린 상과의 다른 구성원에 기반할 수 있기 때문에, 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 연합 사슬로 발생할 수 있음이 이해된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은 서열 동일성의 일부로 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않고 최대 대응을 위해 비교 및 정렬될 때(필요한 경우 갭 도입) 동일하거나 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정 비율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다. 동일성 백분율은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하거나 육안 검사를 통해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 얻기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 당 업계에 잘 알려져 있다. 이에는 BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package 및 이의 변형이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 2개의 핵산 또는 폴리펩티드는 실질적으로 동일하며, 이는 이들이 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 육안 검사를 통해 측정될 때, 최대 대응을 위해 비교 및 정렬되는 경우, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 일부 구현예에서 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 가짐을 의미한다. 일부 구현예에서, 동일성은 적어도 약 10개의 잔기, 적어도 약 20개의 잔기, 적어도 약 40개 내지 60개의 잔기, 적어도 약 60개 내지 80개의 잔기 길이 또는 그 사이의 임의의 정수 값인 아미노산 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 구현예에서, 동일성은 60개 내지 80개의 잔기보다 더 긴 영역, 예컨대 적어도 약 80개 내지 100개의 잔기에 걸쳐 존재하며, 일부 구현예에서 서열은 표적 단백질 또는 항체의 코딩 영역과 같이 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 동일성은 적어도 약 10개의 염기, 적어도 약 20개의 염기, 적어도 약 40개 내지 60개의 염기, 적어도 약 60개 내지 80개의 염기 길이 또는 그 사이의 임의의 정수 값인 뉴클레오티드 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 구현예에서, 동일성은 60개 내지 80개의 염기보다 더 긴 영역, 예컨대 적어도 약 80개 내지 100개의 염기 또는 그 이상에 걸쳐 존재하며, 일부 구현예에서 서열은 관심 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 같이 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하여, 일반적으로 당 업계에 정의되었다. 예를 들어, 티로신을 페닐알라닌으로 치환하는 것은 보존적 치환이다. 일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드, 가용성 단백질 및/또는 항체의 서열에서 보존적 치환은 표적 결합 부위에 대한 폴리펩티드, 가용성 단백질, 또는 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합을 폐지하지 않는다. 결합을 없애지 않는 아미노산 보존적 치환을 식별하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다.
"단리된" 폴리펩티드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리펩티드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리펩티드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한(예를 들어, 오염 물질이 없음), 적어도 90% 순수한, 적어도 95% 순수한, 적어도 98% 순수한, 또는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "융합 단백질" 또는 "융합 폴리펩티드"는 적어도 2개의 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 발현된 하이브리드 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "링커" 또는 "링커 영역"은 제1 폴리펩티드(예를 들어, 항-CD39 항체)와 제2 폴리펩티드(예를 들어, Fc 또는 다른 FcγRIII 결합 모이어티; 다른 단백질에 결합하여 CD39에 대한 이가(bivalency)를 유지하는 이중특이적 항체 포맷을 생성하는 scFV, Vhh 도메인 등) 사이에 삽입된 링커를 지칭한다. 일부 구현예에서, 링커는 펩티드 링커이다. 링커는 폴리펩티드의 발현, 분비 또는 생물활성에 악영향을 주지 않아야 한다. 바람직하게는, 링커는 항원성이 아니며 면역 반응을 유발하지 않는다.
b. 핵산
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산" 및 "핵산 분자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체에 포함될 수 있는 임의의 기질일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인코딩하는 핵산 분자", "인코딩하는 DNA 서열" 및 "인코딩하는 DNA"는 데옥시리보핵산 데옥시리보뉴클레오티드의 가닥을 따라 뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 지칭한다. 이러한 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드(단백질) 사슬을 따라 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서, 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열.
뉴클레오티드 서열과 관련하여 사용되는 경우, 본원에 사용된 "서열", 이 용어 문법 형태 및 기타 형태는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 서열은 돌연변이될 수 있다. 핵산 서열은 임의의 길이, 예를 들어 2개 내지 000,000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드(또는 위 또는 사이의 임의의 정수 값) 핵산, 예를 들어 약 100개 내지 약 10,000개, 또는 약 200개 뉴클레오티드 내지 약 500개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달하고, 일반적으로 발현시킬 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 결합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 리포좀에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "형질감염"은 진핵 세포로의 외인성 핵산을 지칭한다. 형질감염은 인산칼슘 -DNA 공침전, DEAE- 덱스트란-매개된 형질감염, 폴리브렌-매개된 형질감염, 전기천공, 미세주입, 리포좀 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염 및 유전자총 기술(유전자총법)을 포함하는, 당 업계에 공지된 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "캐리어"는 세포 내부로 조성물을 전달하는 데 사용될 수 있는 단리된 핵산을 포함하는 단리된 핵산이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 결합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다수의 캐리어가 당 업계에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포좀 등의 세포로의 용이한 핵산 전달을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "발현 벡터"는 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 작동 가능하게 연결된 발현될 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현에 사용되는 충분한 시스-작용 요소(시스-작용 요소)를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관내 발현 시스템에 의해 공급될 수 있다. 발현 벡터는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 네이키드 또는 리포좀에 포함됨) 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 당 업계에 공지된 모든 것들을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결이 이종 핵산 서열의 발현을 초래하는 연결로 연결됨을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열이 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 관계인 경우, 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 전형적으로 작동 가능하게 연결된 DNA 시퀀싱은 연속적이며, 필요에 따라 동일한 판독 프레임에서 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 세포 특이적 전사의 합성 기구에 필요한 합성 기구에 의해 인식되거나 도입된 프로모터 DNA 서열로 정의된다.
본원에 사용된 용어 "구성적 발현"은 생리학적 조건 하에서 발현되는 모든 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유도성 발현"은 T 세포 항원이 결합할 때 발생하는 것과 같은 조건인, 특정 조건 하에서의 발현을 지칭한다. 일상적으로 숙련가가 "발현을 유도하는" 방법.
용어 "전기천공"은 막 관통 전기장 펄스를 사용하여 생체막에서 미세한 경로(기공)를 유도하는 것을 지칭하며; 이의 존재는 플라스미드 또는 다른 올리고뉴클레오티드와 같은 생체분자가 세포막의 한 쪽에서 다른 쪽으로 통과하도록 한다.
c. 체크포인트 억제제, 공동 자극 작용제 및 화학요법제
"체크포인트 분자"는 조직 및/또는 면역 세포에 의해 발현되고, 체크포인트 분자의 발현 수준에 의존하는 방식으로 면역 반응의 효능을 감소시키는 단백질을 지칭한다. 이러한 단백질이 차단되면, 면역계의 "브레이크"가 해제되고, 예를 들어, T 세포가 암세포를 더 효과적으로 죽일 수 있다. T 세포 또는 암 세포에서 발견되는 체크포인트 단백질의 예는 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 및 TIGIT를 포함한다.
"체크포인트 억제제"는 체크포인트 분자로부터 면역억제 시그널링을 역전시키는 약물 개체를 지칭한다.
"공동 자극 분자"는 공동 자극 리간드에 특이적으로 결합하여 증식과 같으나 이에 제한되지 않는 공동 자극을 매개하는 T 세포 동족 결합 파트너와 같은 면역 세포를 지칭한다. 공동 자극 분자는 효과적인 면역 반응을 촉진하는 항원 수용체 또는 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공동 자극 분자는 MHCI 분자, BTLA 수용체 및 Toll 리간드, 및 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a / CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 공동 자극 분자의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE / RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244,2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG / Cbp, CD19a, 및 CD83 리간드.
"공동 자극 작용제"는 공동 자극 리간드가 하던 바와 같이 공동 자극 분자를 활성화하고(작동시키고) 면역 자극 신호를 생성하거나 그렇지 않으면 면역 반응의 효능 또는 효력을 증가시키는 약물 개체를 지칭한다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화합물이다. 화학요법제의 예에는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 사이클로스포스파미드(사이톡산(CYTOXAN)); 알킬 설포네이트 예컨대 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드(trietylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포라미드(triethiylenethiophosphoramide) 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로칸나비놀(드로나비놀, MARINOL); 베타-라파촌; 라파촐; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸(HYCAMTIN), CPT-11(이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 페메트렉세드; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; TLK-286; CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 사르코딕티인; 스퐁기스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제 예컨대 엔디인 항생제(예를 들어, 칼리키아미신, 특히 칼리키아미신 감마1I 및 칼리키아미신 오메가I1(예를 들어, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994) 참조); 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 엔디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스(chromomycinis), 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(아드리아마이신(ADRIAMYCIN), 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사(DOXIL) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, ??라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 대사 길항 물질 예컨대 메토트렉세이트, 젬시타빈(젬자르(GEMZAR)), 테가푸르(우프토랄(UFTORAL)), 카페시타빈(젤로다(XELODA)), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 및 이마티닙(2-페닐아미노피리미딘 유도체), 뿐만 아니라 다른 c-키트 억제제; 항-부신제(anti-adrenals) 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제 예컨대 프롤린산(frolinic acid); 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트랙세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드 예컨대 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신(엘디신(ELDISINE), 필데신(FILDESIN)); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(탁솔(TAXOL)), 파클리탁셀(아브락산(ABRAXANE))의 알부민-조작된 나노입자 제형, 및 독세탁셀(doxetaxel)(탁소테레(TAXOTERE)); 클로란부실(chloranbucil); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴(벨반(VELBAN)); 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴(온코빈(ONCOVIN)); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈(나벨빈(NAVELBINE)); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(difluoromethylornithine)(DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴(엘록사틴(ELOXATIN))을 사용한 치료 요법의 약어인, 폴폭스(FOLFOX)와 같은 상기 중 둘 이상의 조합이 포함된다.
또한, 이 정의에는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬 제제가 포함되며, 종종 전신성(systemic) 또는 전신(whole-body) 치료의 형태이다. 이는 그 자체로 호르몬일 수 있다. 예에는 예를 들어, 타목시펜(놀바덱스(NOLVADEX) 타목시펜 포함), 랄록시펜(에비스타(EVISTA)), 드로록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(파레스톤(FARESTON))을 포함하는 항-에스토로겐 및 선택적 에스토로겐 수용체 조절제(SERM); 항-프로게스테론; 에스토로겐 수용체 하향-조절인자(ERD); 에스토로겐 수용체 길항제 예컨대 풀베스트란트(파슬로덱스(FASLODEX)); 난소를 억제하거나 차단하는 기능을 하는 제제, 예를 들어, 황체형성 호르몬-방출 호르몬(LHRH) 작용제 예컨대 류프롤라이드 아세테이트(루프론(LUPRON) 및 엘리가드(ELIGARD)), 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 항-안드로겐 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타아제를 억제하는 아로마타아제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트(메가세(MEGASE)), 엑스메스탄(아로마신(AROMASIN)), 포르메스타니(formestanie), 파드로졸, 보로졸(리비소르(RIVISOR)), 레트로졸(페마라(FEMARA)), 및 아나스트로졸(아리미덱스(ARIMIDEX))이 포함된다. 또한, 화학요법제의 이러한 정의에는 비스포스포네이트 예컨대 클로드로네이트(예를 들어, 보네포스(BONEFOS) 또는 오스탁(OSTAC)), 에티드로네이트(디드로칼(DIDROCAL)), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트(조메타(ZOMETA)), 알렌드로네이트(포사맥스(FOSAMAX)), 파미드로네이트(아레디아(AREDIA)), 틸루드로네이트(스켈리드(SKELID)), 또는 리세드로네이트(악토넬(ACTONEL)); 뿐만 아니라 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티-센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식에 연루된 시그널링 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것들, 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체(EGF-R); 백신 예컨대 테라토프(THERATOPE) 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN) 백신, 류벡틴(LEUVECTIN) 백신, 및 박시드(VAXID) 백신; 토포이소머라아제 1 억제제(예를 들어, 루토테칸(LURTOTECAN)); 항-에스토로겐 예컨대 풀베스트란트; 키트 억제제 예컨대 이마티닙 또는 EXEL-0862(티로신 키나제 억제제); EGFR 억제제 예컨대 에를로티닙 또는 세툭시맙; 항-VEGF 억제제 예컨대 베바시주맙; 아리노테칸; rmRH(예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)); 라파티닙 및 라파티닙 디토실레이트(GW572016으로도 알려진 ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); 17AAG(열 충격 단백질(Hsp) 90 독인 겔다나마이신 유도체), 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "사이토카인"은 일반적으로 세포간 매개체로서 또 다른 세포에 작용하거나 단백질을 생산하는 세포에 대해 자가분비 효과를 갖는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질을 지칭한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인; 프로류킨(PROLEUKIN) rIL-2를 포함하는 인터류킨("IL") 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A-F, IL-18 내지 IL-29(예컨대 IL-23), IL-31; 종양 괴사 인자 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β, TGF-β1-3; 및 백혈병 억제 인자("LIF"), 섬모 향신경성 인자("CNTF"), CNTF-유사 사이토카인("CLC"), 카디오트로핀("CT"), 및 키트 리간드("KL")를 포함하는 기타 폴리펩티드 인자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "케모카인"은 백혈구의 주화성 및 활성화를 선택적으로 유도하는 능력을 갖는 가용성 인자(예를 들어, 사이토카인)를 지칭한다. 이는 또한 혈관신생, 염증, 상처 치유 및 종양발생 과정을 촉발시킨다. 케모카인의 예는 뮤린 각질형성세포 화학 유인 물질(KC)의 인간 동족체인, IL-8을 포함한다.
d. 치료
면역 기능장애와 관련하여 용어 "기능장애(dysfunction)"는 항원 자극에 대한 면역 반응성이 감소된 상태를 지칭한다. 이 용어는 항원 인식이 발생할 수 있는 고갈 및/또는 아네르기 둘 모두의 공통 요소를 포함하지만, 뒤이은 면역 반응은 감염 또는 종양 성장을 제어하는 데 효과적이지 않다.
본원에 사용된 용어 "기능장애(dysfunctional)"는 또한 항원 인식에 대해 불응성 또는 무반응성, 특히, 항원 인식을 증식, 사이토카인 생산(예를 들어, IL-2) 및/또는 표적 세포 사멸과 같은 다운스트림 T-세포 이펙터 기능으로 번역하는 능력 손상을 포함한다.
용어 "아네르기"는 T-세포 수용체를 통해 전달되는 불완전하거나 부족한 신호(예를 들어, ras-활성화 부재시 세포내 Ca+2의 증가)로 인한 항원 자극에 대한 무반응 상태를 지칭한다. T 세포 아네르기도 공동 자극이 없는 상태에서 항원으로 자극할 때 발생할 수 있으며, 결과적으로 공동 자극의 맥락에서도 세포가 항원에 의한 후속 활성화에 불응성이 된다. 무반응 상태는 종종 인터류킨-2가 존재하는 경우 중단될 수 있다. 아네르기 T-세포는 클론 확장을 거치지 않고, 그리고/또는 이펙터 기능을 획득하지 않는다.
용어 "고갈"은 많은 만성 감염 및 암 동안 발생하는 지속적인 TCR 시그널링으로부터 발생하는 T 세포 기능장애의 상태로서 T 세포 고갈을 지칭한다. 불완전하거나 부족한 시그널링을 통해 발생하는 것이 아니라 지속적인 시그널링으로 인해 발생한다는 점에서 아네르기와 구별된다. 이는 불량한 이펙터 기능, 억제 수용체의 지속적인 발현 및 기능적 이펙터 또는 기억 T 세포와 구별되는 전사 상태로 정의된다. 고갈은 감염 및 종양을 최적으로 제어하지 못하게 한다.
"T-세포 기능 향상"은 T-세포가 지속되거나 증폭된 생물학적 기능을 갖도록 유도, 유발 또는 자극하거나, 또는 고갈되거나 비활성 T-세포를 재생 또는 재활성화하는 것을 의미한다. T-세포 기능 향상의 예는 CD8+ T-세포로부터의 γ-인터페론 분비 증가, 증식 증가, 개입 전 이러한 수준에 비해 항원 반응성(예를 들어, 바이러스, 병원체 또는 종양 제거) 증가를 포함한다. 일 구현예에서, 향상 수준은 적어도 50%, 대안적으로 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 또는 200%이다. 이러한 향상을 측정하는 방식은 당업자에게 공지되어 있다.
"T 세포 기능부전성 장애"는 항원 자극에 대한 반응성 감소를 특징으로 하는 T-세포의 장애 또는 상태이다. 특정 구현예에서, T-세포 기능부전성 장애는 특히 CD39 수준이 부적절하게 증가하는 것과 관련된 장애이다. 또 다른 구현예에서, T-세포 기능부전성 장애는 T-세포가 아네르기이거나 사이토카인 분비 능력, 증식 능력 또는 세포 용해 활동을 실행하는 능력이 감소된 상태이다. 구체적인 양태에서, 감소된 반응성은 면역원을 발현시키는 병원체 또는 종양의 비효과적인 제어를 초래한다. T-세포 기능장애를 특징으로 하는 T 세포 기능부전성 장애의 예는 미해결 급성 감염, 만성 감염 및 종양 면역을 포함한다.
"종양 면역"은 종양이 면역 인식 및 제거를 회피하는 과정을 지칭한다. 따라서, 치료 개념으로서 종양 면역은 그러한 회피가 약화될 때 "치료"되고, 종양은 면역계에 의해 인식되고 공격된다. 종양 인식의 예로는 종양 결합, 종양 수축 및 종양 제거가 포함된다.
"지속된 반응"은 치료 중단 후 종양 성장 감소에 대한 지속적인 효과를 지칭한다. 예를 들어, 종양 크기는 투여 단계 초기의 크기와 비교하여 동일하거나 더 작게 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 지속된 반응은 치료 기간과 적어도 동일한 기간, 적어도 1.5x, 2.0x, 2.5x 또는 3.0x 길이의 치료 기간을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "암" 및 "암성"은 세포 집단이 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 설명한다. 암의 예는 암종, 모세포종, 육종, 및 혈액암 예컨대 림프종 및 백혈병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "종양" 및 "신생물"은 전암성 병변을 포함하여 양성(비암성) 또는 악성(암성)의 과도한 세포 성장 또는 증식으로 인해 발생하는 임의의 조직 덩어리를 지칭한다. 종양 성장은 일반적으로 제어되지 않고 진행성이며, 정상 세포의 증식을 유도하거나 억제하지 않는다. 종양은 방광, 뼈, 뇌, 유방, 연골, 신경교 세포, 식도, 나팔관, 담낭, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 신경 조직, 난소, 췌장, 전립선, 골격근, 피부, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기관, 요도, 요관, 요도, 자궁, 질 기관 또는 조직 또는 해당 세포로부터 선택된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 세포, 조직 또는 기관에 영향을 미칠 수 있다. 종양에는 암, 예컨대 육종, 암종, 형질세포종 또는 (악성 형질 세포)가 포함된다. 본 발명의 종양에는, 백혈병(예를 들어, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수구 백혈병, 급성 골수성 - 단핵구성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 진성 적혈구증가증), 림프종(호지킨병, 비-호지킨병), 원발성 마크로글로불린혈증 질병, 중쇄병, 및 고형 종양 예컨대 육종 암(예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척삭종, 내피 육종, 림프관육종, 혈관육종, 림프관내피(lymphangioendothelio) 육종, 활막종 비오마(vioma), 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두모양 암종, 유두모양 선암종, 암종, 기관지유래 암종, 수질 암종, 신세포 암종, 간세포암, 나일 덕(Nile duct) 암종, 융모막암종, 정조세포 종양, 배아 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 속귀신경집종, 핍지교종, 신경초종, 뇌수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종), 식도암, 담낭, 신장암, 다발성 골수종을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, "종양"은 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 및 신경교종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "전이"는 새로운 위치에서 유사한 암성 병변이 발달하면서 암이 기원 부위로부터 신체의 다른 부위로 퍼지거나 전이되는 과정을 지칭한다. "전이성" 또는 "전이" 세포는 이웃 세포와의 점착성 접촉을 상실하고 혈류 또는 림프를 통해 질병의 주요 부위로부터 이동하여 이웃 신체 구조를 침범하는 세포이다.
용어 "암 세포" 및 "종양 세포"는 암 세포 집단의 대부분을 구성하는 비-종양원성 세포 및 종양원성 줄기 세포(암 줄기 세포) 둘 다를 포함하는, 암 또는 종양 또는 전암성 병변으로부터 유래된 세포의 총 집단을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "암 세포" 또는 "종양 세포"는 종양 세포를 암 줄기 세포와 구별하기 위해 재생하고 분화할 능력이 없는 세포만을 지칭할 때 "비-종양원성"이라는 용어로 한정될 것이다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 치료적 또는 예방적 이점을 제공하기 위한 양을 지칭한다.
본원에 사용된 "완전한 반응" 또는 "CR"은 모든 표적 병변의 소실을 지칭하며; "부분 반응" 또는 "PR"은 기준선 SLD를 기준으로 하여 표적 병변의 최장 직경의 합(SLD)이 적어도 30% 감소하는 것을 지칭하며; "안정한 질병" 또는 "SD"는 치료 시작 이후 가장 작은 SLD를 기준으로 하여 PR에 적합하도록 표적 병변의 충분한 수축 또는 PD에 적합하도록 충분한 증가를 의미하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "진행성 질병" 또는 "PD"는 치료 시작 이후 기록된 가장 작은 SLD 또는 하나 이상의 새로운 병변의 존재를 기준으로 하여 표적 병변의 SLD에서 적어도 20% 증가를 지칭한다.
본원에 사용된 "무진행 생존"(PFS)은 치료되는 질병(예를 들어, 암)이 악화되지 않는 치료 중 및 치료 후의 시간을 지칭한다. 무진행 생존은 환자가 완전한 반응 또는 부분 반응을 경험한 시간, 뿐만 아니라 환자가 안정한 질병을 경험한 시간을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "전체 반응률"(ORR)은 완전한 반응(CR) 비율과 부분 반응(PR) 비율의 합을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "전체 생존"은 특정 기간 후에 생존할 가능성이 있는 그룹 내 개체의 백분율을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 개체가 세포의 개입에 의해 유발되는 임상 질병의 과정 또는 치료를 변경하려는 것을 지칭하며, 임상 병리의 예방적 개입 과정일 수 있다. 치료에는 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상 완화, 임의의 질병의 직접 또는 간접적 병리학적 결과 감소, 전이 예방, 질병 진행 속도 둔화, 질병 완화의 개선 또는 완화 또는 예후 개선이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "대상체"는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 동물(예를 들어, 포유동물)을 지칭하며, 이는 특정 치료의 수용자이어야 한다. 전형적으로 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체와 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "작용제" 및 "작동성(agonistic)"은 항-CD39 항체가 표적 및/또는 경로의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 실질적으로 유도, 활성화, 촉진, 증가 또는 향상시킬 수 있음을 지칭하거나 설명한다. 용어 "작용제"는 단백질 또는 다른 관심 표적의 활성을 부분적으로 또는 완전히 유도, 활성화, 촉진, 증가 또는 향상시키는 임의의 제제를 포함하는 것으로 본원에서 사용된다.
본원에 사용된 용어 "길항제" 및 "길항성"은 항-CD39 항체가 표적 및/또는 경로의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로, 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제, 감소 또는 중화할 수 있음을 지칭하거나 설명한다. 용어 "길항제"는 단백질 또는 다른 관심 표적의 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제, 감소 또는 중화하는 임의의 제제를 포함하는 것으로 본원에서 사용된다.
본원에 사용된 용어 "조절" 및 "조절하다"는 생물학적 활성의 변화 또는 변경을 지칭한다. 조절은 활동을 자극하거나 활동을 억제하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 조절은 활성의 증가 또는 활성의 감소, 결합 특성의 변화, 또는 단백질, 경로, 시스템 또는 기타 관심있는 생물학적 표적의 활성과 관련된 생물학적, 기능적 또는 면역학적 특성의 임의의 기타 변화일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "면역 반응"은 선천 면역계 및 적응 면역계 모두로부터의 반응을 포함한다. 이는 세포-매개된 및/또는 체액성 면역 반응 모두 포함한다. 이는 T-세포 및 B-세포 반응뿐만 아니라 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 대식세포 등과 같은 면역계의 다른 세포로부터의 반응도 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 승인 가능하거나 미국 약전 또는 인간을 포함한 동물에 사용하기 위해 일반적으로 인정되는 기타 약전에 등재된 물질을 지칭한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 부형제, 캐리어 또는 보조제" 또는 "허용되는 약제학적 캐리어"는 본 개시의 적어도 하나의 제제와 함께 대상체에게 투여될 수 있으며, 이의 약리학적 활성을 파괴하지 않고, 치료 효과를 전달하기에 충분한 용량으로 투여될 때 무독성인 부형제, 캐리어 또는 보조제를 지칭한다. 일반적으로, 당업자 및 미국 FDA는 약제학적으로 허용되는 부형제, 캐리어 또는 보조제를 임의의 제제의 비활성 성분으로 간주한다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량" 또는 "치료 효과"는 포유동물과 같은 대상체에서 질병 또는 장애를 "치료"하는 데 효과적인 본원에 기재된 항-CD39 항체(예를 들어, 융합 단백질, 가용성 수용체, 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 작은 유기 분자 또는 기타 약물)의 양을 지칭한다. 암 또는 종양의 경우에, 항-CD39 항체(예를 들어, 폴리펩티드, 가용성 단백질, 또는 항체)의 치료적 유효량은 치료 효과가 있어서 면역 반응을 증가시킬 수 있거나, 항종양 반응을 증가시키거나, 면역 세포의 세포 용해 활성을 증가시키거나, 면역 세포에 의한 종양 세포의 사멸을 증가시키거나, 종양 세포의 수를 감소시거나, 종양원성, 종양원성 빈도 또는 종양원성 능력을 감소시키거나; 암 줄기 세포의 수 또는 빈도를 감소시키거나; 종양 크기를 감소시키거나; 암 세포 집단을 감소시키거나; 예를 들어, 연조직 및 뼈로의 암 확산을 포함하여 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제 또는 중지시키거나; 종양 또는 암 세포 전이를 억제 및 중지시키거나; 종양 또는 암 세포 성장을 억제 및 중지시키거나; 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시키거나; 이환율 및 사망률을 감소시키거나; 삶의 질을 향상시키거나; 또는 이러한 효과의 조합을 갖는다.
용어 "치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위해" 또는 "완화시키는" 또는 "완화시키기 위해"는 (1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애의 증상을 치료하고, 늦추고, 감소시키고, 그리고/또는 진행을 중단시키는 치료적 조치 및 (2) 표적 병리학적 상태 또는 장애의 발생을 예방하거나 늦추는 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 지칭한다. 따라서 치료가 필요한 이들에는 이미 장애가 있는 이들; 장애에 취약한 이들; 및 장애를 예방해야 하는 이들이 포함된다. 암 또는 종양의 경우에, 환자가 다음 중 하나 이상을 나타내는 경우, 대상체는 본 발명의 방법에 따라 성공적으로 "치료된" 것이다: 면역 반응 증가, 항종양 반응 증가, 면역 세포의 세포 용해 활성 증가, 면역 세포에 의한 종양 세포 사멸 증가, 암 세포의 수 감소 또는 완전한 부재; 종양 크기 감소; 연조직 및 뼈로의 암 확산을 포함하여 말초 기관으로의 암 세포 침윤의 억제 또는 부재; 종양 또는 암 세포 전이 억제 또는 부재; 암 성장 억제 또는 부재; 특정 암과 관련된 하나 이상의 증상 완화; 이환율 및 사망률 감소; 삶의 질 향상; 종양원성 감소; 암 줄기 세포의 수 또는 빈도 감소; 또는 효과의 일부 조합.
e. 기타
"포함하는"이라는 언어와 함께 본원에서 구현예가 설명되는 곳마다 "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"의 관점에서 설명된 달리 유사한 구현예가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 또한, "본질적으로 이루어진"이라는 언어와 함께 본원에서 구현예가 설명되는 곳마다 "이루어진"의 관점에서 설명된 달리 유사한 구현예가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 값 또는 파라미터 앞에 "약" 또는 "대략"에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터에 관한 구현예를 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"를 나타내는 설명에는 "X"에 대한 설명이 포함된다.
본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 A 및 B 둘 다; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 다음 구현예 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
III. 항-CD39 항체
a. 모노클로날 항체
항-CD39 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌(Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975))에 기재된 바와 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 기타 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역화제로 면역화되어 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
면역화제는 전형적으로 CD39 폴리펩티드 또는 이의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원 세포가 필요한 경우 말초 혈액 림프구("PBL")가 사용되거나 비-인간 포유동물 공급원이 필요한 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 무한증식 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). 무한증식 세포주는 일반적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 랫트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 무한증식 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마용 배양 배지에는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 배지")이 포함될 것이며, 이러한 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 무한증식 세포주는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 발현을 지원하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 세포주이다. 보다 바람직한 무한증식 세포주는, 예를 들어, 캘리포니아주 샌디에고의 솔크 연구소 세포 배포 센터(Salk Institute Cell Distribution Center) 및 버지니아주 매너서스의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에서 입수할 수 있는 뮤린 골수종 계통이다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종(heteromyeloma) 세포주도 설명되었다(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63).
이어서 하이브리도마 세포가 배양된 배양 배지는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사면역측정법(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 결정된다. 이러한 기술 및 검정은 당 업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들어, 문헌(Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980))에 의해 결정될 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포를 식별한 후, 한계 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝하고, 표준 방법(Goding, 상기)에 의해 성장시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, 둘베코 수정 이글 배지 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 복수로서 생체내에서 성장할 수 있다.
서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 또는 정제될 수 있다.
모노클로날 항체는 또한 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리 및 시퀀싱될 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터에 넣은 다음 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 얻을 수 있다. DNA는 또한, 예를 들어, 상동성 뮤린 서열(미국 특허 번호 4,816,567; Morrison et al., 상기) 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 대체함으로써 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합함으로써 변형될 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인을 대체할 수 있거나, 키메라 2가 항체를 생성하기 위해 본 발명의 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 대체할 수 있다.
b. 인간 및 인간화된 항체
본 발명의 항-CD39 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화된 형태는 비-인간 면역글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 기타 항체의 항원-결합 하위 서열)이다. 인간화된 항체에는 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여 항체)의 CDR의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용 항체)이 포함된다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 인간화된 항체는 또한 수용 항체나 수입(import) CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 해당하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화된 항체는 최적으로 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)).
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비-인간 공급원으로부터 이에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로 "수입" 가변 도메인에서 얻어진다. 인간화는 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))의 방법에 따라 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 키메라 항체(미국 특허 번호 4,816,567)이며, 여기서 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 것이 비-인간 종의 상응하는 서열로 대체되었다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하면 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위의 잔기로 대체된 인간 항체이다.
인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하여, 당 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). 콜(Cole) 등 및 뵈르너(Boerner) 등의 기술은 인간 모노클로날 항체의 제조에도 사용할 수 있다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)). 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 형질전환 동물, 예를 들어 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 마우스에 도입함으로써 제조될 수 있다. 공격접종(challenge)시 인간 항체 생산이 관찰되는데, 이는 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리를 포함하여, 모든 측면에서 인간에서 볼 수 있는 것과 매우 유사하다. 이 접근법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 다음의 과학 간행물: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)에 설명되어 있다.
항체는 또한 상기 기재된 바와 같이 공지된 선택 및/또는 돌연변이 유발 방법을 사용하여 친화성 성숙될 수 있다. 바람직한 친화성 성숙된 항체는 성숙된 항체가 제조되는 출발 항체(일반적으로 뮤린, 인간화 또는 인간)보다 5배, 보다 바람직하게는 10배, 더욱 더 바람직하게는 20배 또는 30배 더 큰 친화성을 갖는다.
c. 이중특이적 항체
본원에 기재된 항-CD39 항체는 이중특이적 분자를 포함한다. 항-CD39 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 유도체화되거나 또 다른 기능 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)에 연결되어 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본원에 기재된 항체는 실제로 유도체화되거나 하나 초과의 다른 기능성 분자에 연결되어 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있으며; 이러한 다중특이적 분자는 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 포함되는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본원에 기재된 항체는 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 등에 의해) 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항원-결합 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결되어 이중특이적 분자가 생성될 수 있다.
따라서, 본원에서는 CD39에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자가 제공된다. 이중특이적 분자가 다중특이적인 본원에 기재된 구현예에서, 분자는 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 대상 이중특이적(또는 경우에 따라 다중특이적)은, 예를 들어, PD-1, PD-L1, CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 및/또는 TIGIT와 같은 체크포인트 억제제인, 면역 체크포인트에 대한 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 다중특이적은 T-세포 상의 체크포인트 단백질, 특히 LAG-3, TIM-3 또는 TIGIT와 같은 T-세포 고갈과 관련된 체크포인트에 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 다중특이적은 CD39 및 하나 이상의 다른 T-세포 관련 체크포인트에 결합하며, CD39 및 결합하는 다른 체크포인트 단백질 모두의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발한다.
특정 구현예에서, 대상 이중특이적(또는 경우에 따라 다중특이적)은, 예를 들어, MHCI 분자, BTLA 수용체 및 Toll 리간드, 및 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a / CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)의 작용제와 같은 공동 자극 작용제(활성화제)인, 면역 공동 자극 수용체를 위한 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다. 다중특이적에 포함될 수 있는 공동 자극 분자의 예는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE / RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244,2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG / Cbp, CD19a, 및 CD83 리간드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 분자는 결합 특이성으로서 적어도 하나의 항체, 또는 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 사슬 Fv를 포함하는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 Fv 또는 단일 사슬(scFv) 작제물과 같은 이의 임의의 최소 단편일 수 있다.
이중특이적 분자의 이의 특정 표적에 대한 결합은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역측정법(RIA), FACS 분석, 생물검정(예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정과 같은 당 업계에서 인정되는 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 이러한 검정 각각은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지 시약(예를 들어, 항체)을 사용하여 특히 관심있는 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이성 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 기반으로 하며, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이러한 하이브리도마(쿼드로마(quadroma))는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 그 중 하나만 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 올바른 분자의 정제는 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 달성된다. 유사한 절차가 1993년 5월 13일에 공개된 WO 93/08829, 및 문헌(Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991))에 개시되어 있다.
원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 것이다. 적어도 하나의 융합물에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물 및, 원하는 경우, 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA는 별도의 발현 벡터에 삽입되고, 적합한 숙주 유기체로 공동 형질감염된다. 이중특이적 항체 생성에 대한 추가의 세부 사항은, 예를 들어, 문헌(Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986))을 참조한다.
WO 96/27011에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면은 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면에서 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동"은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면에 생성된다. 이것은 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 산물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다. 항원-결합 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 브레난 등(Brennan et al., Science 229:81 (1985))은 F(ab')2 단편을 생성하기 위해 온전한 항체가 단백질 분해로 절단되는 절차를 설명한다. 이러한 단편은 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재 하에 환원되어 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 이황화물 형성을 방지한다. 이어서 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민을 사용한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로 사용될 수 있다.
Fab' 단편은 이. 콜라이(E. coli)로부터 직접 회수되고, 화학적으로 결합되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. 샬라비 등(Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992))은 완전 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 설명한다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되고, 시험관내에서 유도된 화학적 커플링을 거쳐 이중특이적 항체를 형성하였다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현시키는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있을뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 수 있었다.
재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이적 항원-결합 단편을 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다(Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2개의 다른 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음 다시 산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 이 방법은 항체 동종이량체의 생산에도 사용될 수 있다. 홀링거(Hollinger) 등(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993))에 의해 설명된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중특이적 항원-결합 단편을 제조하는 대체 메커니즘을 제공하였다. 단편은 동일한 사슬에 있는 2개의 도메인 사이의 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 형성하게 한다. 단일-사슬 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항원-결합 단편을 제조하는 또 다른 전략도 보고되었다. 문헌(Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994))을 참조한다.
2가 이상의 항체가 고려된다. 하나의 비제한적인 예로서, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991))을 참조한다.
d. 이종접합 항체
이종접합 항체도 본 발명의 범위 내에 있다. 이종접합 항체는 2개의 공유 결합된 항체로 구성된다. 예를 들어, 이러한 항체는 면역계 세포를 원치 않는 세포로 표적화하고(미국 특허 번호 4,676,980), HIV 감염 치료(WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089)를 위해 제안되었다. 항체는 가교제를 수반하는 것을 포함하여, 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있다는 것이 고려된다. 예를 들어, 이황화 교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성함으로써 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적을 위한 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티리미데이트 및, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980에 개시된 것들을 포함한다.
e. 이펙터 기능 조작
예를 들어, 암 치료에서 항-CD39 항체의 효과를 향상시키기 위해 이펙터 기능과 관련하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)가 Fc 영역에 도입되어 이 영역에서 사슬간 이황화 결합이 형성될 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및 항체-의존적 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. 문헌(Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992))을 참조한다. 특정 바람직한 구현예에서, 조작되는 이펙터 기능은, 예를 들어, 세포 사멸을 통해 면역 세포 집단을 고갈시키지 않으면서 면역 세포로부터 CD39의 FcγRIII 결합-의존적 제거(예컨대 항-CD39 항체 매개된 표적 사이토시스에 의한)를 유도하는 항-CD39 항체의 능력이다.
향상된 항종양 활성을 갖는 동종이량체 항체는 또한 문헌(Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993))에 기재된 바와 같이 이종 이기능성 가교제를 사용하여 제조될 수도 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 조작하여 CD39 트로고사이토시스 능력을 향상시킬 수 있다. 문헌(Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989))을 참조한다.
일부 구현예에서, 마우스 항체인 항-CD39 항체가 생성되었다. 예를 들어, 뮤린 모노클로날 5F2는 인간 CD39에 대한 교차-반응성으로 마우스 CD39에 특이적으로 결합한다. 5F2 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 표준 기술을 사용하여 결정되었다. 이 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 다음과 같고:
DIQLTQSPASLSVATGEKVTIRCITSTDVDDDMNWFQQKPGEPPNLLISEGDTLRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIENTLSEDVADYYCLQSDNMPLTFGGGTKLEIK(서열 번호:1)
이 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 다음과 같다:
EVQLEESGPGLVQPSQRLSITCTISGFSLTSYGIHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQVGDTATYYCARNGHGSNIPWFVYWGQGTLVTVST(서열번호:2)
일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린 5F2 항체의 인간화 버전이다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 1과 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 1과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 경쇄 가변을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 2와 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 2와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 중쇄 가변을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 서열 번호: 1 및/또는 2의 CDR, 또는 서열 번호: 1 또는 2와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 CDR, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 인간화된 항체이다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 일 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역), 예컨대 서열 번호: 1 또는 2로부터의 하나 또는 둘 모두의 가변 영역, 및 인간 불변 영역을 포함한다. 본원에서 관심있는 키메라 항체는 비-인간 영장류(예를 들어, 긴꼬리원숭이, 예컨대 개코원숭이, 붉은털원숭이 또는 사이노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다. 추가 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위 부류가 모 항체의 것에서 변경된 "부류 전환" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
다른 구현예에서, 생성된 항-CD39 항체는 토끼 모노클로날 항체였다. 예를 들어, 본원에서 PB1, PB2, PB3, PB4 및 PB5로 지정된 모노클로날 항체는 인간 CD39에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체이다. PB1-PB5 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 표준 기술을 사용하여 결정되었으며, 중쇄 및 경쇄 서열은 다음과 같다:
PB1
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PB2
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PB3
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PB4
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PB5
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일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 PB1, PB2, PB3, PB4 또는 PB5 항체의 인간화된 버전이다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 3의 가변 영역과 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 3의 가변 영역과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 중쇄 가변을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 5의 가변 영역과 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 5의 가변 영역과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 중쇄 가변을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 7의 가변 영역과 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 7의 가변 영역과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 중쇄 가변을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 9의 가변 영역과 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 9의 가변 영역과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 중쇄 가변을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 11의 가변 영역과 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 11의 가변 영역과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 중쇄 가변을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 4의 가변 영역과 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 4의 가변 영역과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 6의 가변 영역과 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 6의 가변 영역과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 48의 가변 영역과 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 8의 가변 영역과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 10의 가변 영역과 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 10의 가변 영역과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 12의 가변 영역과 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 12의 가변 영역과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 중쇄의 Fc 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG3 Fc 이소형이다. 인간 IgG1 Fc를 포함하는 PB1-PB5 키메라의 예시적인 서열은 다음과 같다:
PB1
METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLVESGGDLVQPGASLTLTCTTSGFSFSSNYWICWVRQAPGKGLEWIGCIYTGSDTTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYSCARGGAVYAAYAGVFFGLWGPGSLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSGLNDIFEAQKIEWHE(서열 번호: 13)
PB2
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PB3
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFSFSKNYWMCWVRQAPGKGLEWIGCIYTGSDSRYYASWVNGRFSISKSSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCASDSGAPGSSDSTLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSGLNDIFEAQKIEWHE(서열 번호: 15)
PB4
METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLVESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFSFSSSYYMCWVRQAPGKGLEWIGCIYIGSSTTYYATWAKGRFTISKTSSTAVTLQMTGLTAADTATYFCARDQYDDSGNLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSGLNDIFEAQKIEWHE(서열 번호: 16)
PB5
METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLEESGGGLVQPEGSLTLTCKASGFALSSSYYMCWVRQAPGKGLEWIGCIYIGSGTTYYASWAKGRFTISKTSSTAVTLQMTGLTAADTATYFCARDQYDDSGNLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSGLNDIFEAQKIEWHE(서열 번호: 17)
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 서열 번호: 3의 CDR을 갖는 중쇄 및/또는 서열 번호: 4의 CDR을 갖는 경쇄, 또는 서열 번호: 3 및/또는 4의 것들과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 CDR, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 추가의 인간화된 항체이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 서열 번호: 35의 CDR을 갖는 중쇄 및/또는 서열 번호: 6의 CDR을 갖는 경쇄, 또는 서열 번호: 5 및/또는 6의 것들과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 CDR, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 추가의 인간화된 항체이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 서열 번호: 7의 CDR을 갖는 중쇄 및/또는 서열 번호: 8의 CDR을 갖는 경쇄, 또는 서열 번호: 7 및/또는 8의 것들과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 CDR, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 추가의 인간화된 항체이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 서열 번호: 9의 CDR을 갖는 중쇄 및/또는 서열 번호: 10의 CDR을 갖는 경쇄, 또는 서열 번호: 9 및/또는 10의 것들과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 CDR, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 추가의 인간화된 항체이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 서열 번호: 11의 CDR을 갖는 중쇄 및/또는 서열 번호: 12의 CDR을 갖는 경쇄, 또는 서열 번호: 11 및/또는 12의 것들과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 CDR, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 추가의 인간화된 항체이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 CARGGAVYAAYAGVFFGLW, CVRRVNGYGLW, CASDSGAPGSSDSTLW, CARDQYDDSGNLW 및 CARDQYDDSGNLW로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 중쇄, 및 CQSYFGIGGYGLAF, CQGCYGISSYGDSF, CQSYYALSTYGTAF, CQNWYGISSYGRAF 및 CQNWYGISTYGRAF로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 인간화된 항체이다.
다른 구현예에서, 항-CD39 항체의 중쇄 및 경쇄는 PB1, PB2, PB3, PB4 또는 PB5 모노클로날에 대한 중쇄 및 경쇄(상응하는) 코딩 서열과 동일하거나 엄격한 조건(예컨대 45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC), 및 50℃ 내지 65℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS로 세척) 하에서 이에 혼성화되는 핵산에 의해 인코딩될 수 있다:
PB1
중쇄:
5'ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGGAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCCAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAACTTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAATTACTGGATATGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTTATACTGGTAGTGATACCACTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAGATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTCCTGTGCGAGAGGGGGGGCTGTTTATGCTGCTTATGCTGGTGTCTTCTTTGGCTTGTGGGGCCCAGGCTCCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG-3'(서열 번호: 18)
경쇄:
5'ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGAACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGAGCATTTATAGTGGTTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCGTCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAGCTATTTTGGTATTGGTGGTTATGGTCTTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCTTGGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG-3'(서열 번호: 19)
PB2
중쇄:
5'ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGTACAGCCTCTGGAATCGACTTCAGTGACTATGGCTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGTATTTATGTTGGTAGTAGTGGTAGCACTTATTATGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCGTCTCCAGGCCCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACTTATTTCTGTGTGAGAAGGGTTAATGGTTATGGGTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG-3'(서열 번호: 20)
경쇄:
5'ATGGACACGAGGGTCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGAACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGAACATTTATACTGGTTTGGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGGCAGCCTCCCAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTAGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAGGGCTGCTATGGTATTAGTAGTTATGGTGATTCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAGAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG-3'(서열 번호: 21)
PB3
중쇄:
5'ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCGGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAAGAACTACTGGATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGATCGGATGCATTTATACTGGTAGTGATAGTAGATACTACGCGAGCTGGGTGAATGGCCGATTCTCCATCTCCAAATCCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACTTATTTCTGTGCGAGCGATAGTGGTGCTCCTGGTAGTAGTGATTCAACTTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG-3'(서열 번호: 22)
경쇄:
5'ATGGACACGAGGGTCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGAACATTTATAGTGGTTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAACTCCTGATCTATCTGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTAGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAGCTATTATGCGCTTAGTACTTATGGTACTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG-3'(서열 번호: 23)
PB4
중쇄:
5'ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGGAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGCTTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTTATATTGGTAGTTCTACCACTTACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCGCGGTGACTCTGCAAATGACCGGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATCAATATGATGATAGTGGTAATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG-3'(서열 번호: 24)
경쇄:
5'ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGAACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGTGGTTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAACCTCCTGATCTACAAGGCATCCAATCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTAGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAACTGGTATGGTATTAGTAGTTATGGTCGGGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG-3'(서열 번호: 25)
PB5
중쇄:
5'ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGGAGCAGCTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCAAAGCCTCTGGATTCGCCCTCAGTAGCAGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTTATATTGGTAGTGGTACCACTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCGCGGTGACTCTGCAAATGACCGGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATCAATATGATGATAGTGGTAATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG-3'(서열 번호: 26)
경쇄:
5'ATGGACACGAGGGTCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCGATATTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGAACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGTGGTTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTAATCTACAAGGCATCCAATCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTAGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAACTGGTATGGTATTAGTACTTATGGTCGGGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG-3'(서열 번호: 27)
다른 구현예에서, 항-CD39 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 PB1, PB2, PB3, PB4 또는 PB5 모노클로날(상기)에 대한 중쇄 및 경쇄(상응하는) 코딩 서열의 가변 영역과 동일하거나 엄격한 조건(예컨대 45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC), 및 50℃ 내지 65℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS로 세척) 하에서 이에 혼성화되는 핵산에 의해 인코딩될 수 있다.
다른 구현예에서, 항-CD39 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR은 PB1, PB2, PB3, PB4 또는 PB5 모노클로날(상기)에 대한 중쇄 및 경쇄(상응하는) 코딩 서열의 CDR과 동일하거나 엄격한 조건(예컨대 45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC), 및 50℃ 내지 65℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS로 세척) 하에서 이에 혼성화되는 핵산에 의해 인코딩될 수 있다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시킨다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어, CDR(또는 이의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR(또는 이의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선하기 위해 비-인간 항체(예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화된 항체 및 이를 제조하는 방법은, 예를 들어, 문헌(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))에서 검토되며, 예를 들어, 문헌(Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)(특이성 결정 영역(SDR) 그래프팅을 설명함); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)("리서페이싱(resurfacing)"을 설명함); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)("FR 셔플링(shuffling)"을 설명함); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 접근법을 설명함))에서 추가로 설명된다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역에는 "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(참조: 예를 들어, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위 그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(참조: 예를 들어, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); 인간 성숙(체세포 돌연변이) 프레임워크 영역 또는 인간 생식 계열 프레임워크 영역(참조: 예를 들어, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역(참조: 예를 들어, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항-CD39 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌(van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008))에 기재되어 있다.
예를 들어, 인간 항체는 항원 공격접종에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 형질전환 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나, 또는 염색체외로 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 형질전환 마우스에서 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 비활성화되었다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 얻는 방법에 대한 검토는 문헌(Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005))을 참조한다. 또한, 예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE) 기술을 설명하는 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HuMAB 기술을 설명하는 미국 특허 번호 5,770,429; K-M 마우스 기술을 설명하는 미국 특허 번호 7,041,870, 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE) 기술을 설명하는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900를 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 하이브리도마-기반 방법으로도 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되었다(참조: 예를 들어, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 문헌(Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 103:3557-3562 (2006))에 기재되어 있다. 추가 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,189,826(하이브리도마 세포주로부터 모노클로날 인간 IgM 항체의 생산을 설명함) 및 문헌(Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006))(인간-인간 하이브리도마를 설명함)에 기재된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌(Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005))에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간 유래 파지, 효모 또는 박테리아 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서 이러한 가변 도메인 서열은 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리에서 인간 항체를 선택하는 기술은 아래에 설명되어 있다.
예시를 위해, 본 발명의 항-CD39 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 또는 효모 디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 문헌(Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)에서 검토되며, 예를 들어, 문헌(McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004))에서 추가로 설명된다.
파지 디스플레이 방법의 예로서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 개별적으로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합된 다음 문헌(Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994))에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 단일 사슬 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 항원-결합 단편을 표시한다. 면역화된 공급원의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리는 클로닝(예를 들어, 인간으로부터)되어 문헌(Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993))에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 단일 항체 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 문헌(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992))에 기재된 바와 같이, 줄기 세포에서 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고, 시험관내 재배열을 달성함으로써 나이브 라이브러리를 합성적으로 제조할 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하는 특허 공보는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항원-결합 단편으로 간주된다.
FcyRIII 결합은 또한, 예를 들어, 항체의 Fc 부분의 글리코실화 또는 Fc 부분의 아미노산 서열을 변형시킴으로써 최신 기술에 따른 방법에 의해 증가될 수 있다(예를 들어, EP2235061 참조). 특정 구현예에서, 대상 항체는, 글리코실화될 때, 항체의 올리고당 사슬의 50% 미만이 α-1,6-푸코스를 함유하는 세포에 의해 생산된다. 전형적으로, "저푸코실화" 항체 제제에서는 올리고당 사슬의 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 또는 5% 미만 또는 1% 미만이 α-1,6-푸코스를 함유한다. "비푸코실화" 항체는 IgG 중쇄의 CH2 도메인에 부착된 탄수화물에 α-1,6-푸코스가 없다. 문헌(Mori, K et al., Cytotechnology 55 (2007)109 and Satoh M, et al., Expert Opin Biol Ther. 6 (2006) 1161-1173)은 비푸코실화 항체의 생성을 위한 FUT8(α-1,6-푸코실트랜스퍼라아제) 유전자 녹아웃 CHO 계통에 관한 것이다.
IV. 발현 벡터
특정 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 본원에 기재된 항-CD39 항체를 인코딩하는 DNA를 증폭하고 발현시키는 데 사용된다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 및/또는 번역 조절 요소에 작동적으로 연결된 항-CD39 항체의 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 합성적 또는 cDNA-유래 DNA 단편을 갖는 복제 가능한 DNA 작제물일 수 있다. 전사 단위는 일반적으로 (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 하는 유전자 요소 또는 요소들, 예를 들어, 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 어셈블리를 포함한다. 조절 요소에는 전사를 제어하는 작동 서열이 포함될 수 있다. 일반적으로 복제 기점에 의해 부여되는 숙주에서 복제하는 능력과 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자가 추가로 포함될 수 있다. DNA 영역은 기능적으로 서로 관련될 때 "작동적으로 연결"된다. 예를 들어, 신호 펩티드(분비 리더)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동 적으로 연결되거나; 프로모터는 서열의 전사를 제어하는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 번역을 허용하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 효모 발현 시스템에 사용하기 위한 구조적 요소는 숙주 세포에 의해 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 선택적으로 최종 산물을 제공하기 위해 발현된 재조합 단백질로부터 후속적으로 절단될 수 있다.
발현 조절 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주 세포의 선택에 따라 달라진다. 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 사용될 수 있다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터는, 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 및 거대세포 바이러스로부터의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터는 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대 pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체를 포함하는 이. 콜라이의 플라스미드, 및 M13 및 기타 사상 단일-가닥 DNA 파지와 같은 더 넓은 숙주 범위 플라스미드를 포함한다.
항-CD39 항체의 폴리펩티드 사슬(또는 표적으로 사용되는 단백질)의 발현에 적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터의 제어 하에 원핵생물, 효모 세포, 곤충 세포 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵생물은 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이 또는 바실러스(Bacillus)를 포함한다. 고등 진핵 세포는 아래에 기재된 바와 같이 포유동물 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 무세포 번역 시스템도 사용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있다.
다양한 포유동물 세포 배양 시스템이 재조합 폴리펩티드를 발현하는 데 사용된다. 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 발현은 이러한 단백질이 일반적으로 올바르게 폴딩되고, 적절하게 변형되고, 생물학적으로 기능하기 때문에 선호될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 COS-7(원숭이 신장-유래), L-929(뮤린 섬유아세포-유래), C127(뮤린 유방 종양-유래), 3T3(뮤린 섬유아세포-유래), CHO(차이니즈 햄스터 난소-유래), HeLa(인간 자궁경부암-유래), BHK(햄스터 신장 섬유아세포-유래), 및 HEK-293(인간 배아 신장-유래) 세포주 및 이의 변이체가 포함된다. 포유동물 발현 벡터는 비-전사 요소 예컨대 복제 기점, 발현될 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 기타 5' 또는 3' 측면 비-전사 서열, 및 5' 또는 3' 비-번역 서열, 예컨대 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여 및 수용 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다.
곤충 세포 배양 시스템(예를 들어, 바큘로바이러스)에서 재조합 단백질의 발현은 올바르게 폴딩된 생물학적 기능성 단백질을 생산하는 강력한 방법을 제공한다. 곤충 세포에서 이종 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 1과 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 1과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 가변 영역을 포함하는 항체 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 2와 적어도 60% 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호: 2와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일하고, 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 가변 영역을 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
V. 생체내 전달을 위한 인코딩된 항-CD39 항체
환자에서 발현될 항-CD39 항체에 대한 코딩 서열을 전달하기 위한 치료 벡터는 바이러스성, 비-바이러스성 또는 물리적일 수 있다. 예를 들어, 문헌(Rosenberg et al., Science, 242:1575-1578, 1988, and Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989))을 참조한다. 유전자 요법에 사용하기 위한 방법 및 조성물에 대한 논의는 문헌(Eck et al., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, (1996), Chapter 5, pp. 77-101; Wilson, Clin. Exp. Immunol. 107 (Suppl. 1):31-32, 1997; Wivel et al., Hematology/Oncology Clinics of North America, Gene Therapy, S. L. Eck, ed., 12(3):483-501, 1998; Romano et al., Stem Cells, 18:19-39, 2000), 및 그 안에 인용된 참고 문헌을 포함한다. 미국 특허 번호 6,080,728에서는 또한 다양한 유전자 전달 방법 및 조성물에 대한 논의를 제공한다. 전달 경로는, 예를 들어, 전신 투여 및 제자리(in situ) 투여를 포함한다. 잘 알려진 바이러스 전달 기술에는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 거품형성 바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스 및 아데노-관련 바이러스 벡터의 사용이 포함된다.
a. 바이러스 벡터
바람직한 바이러스 벡터는 비-필수 유전자가 에피토프를 인코딩하는 핵산 서열 및 관심 표적화 서열을 보유하는 핵산 작제물로 대체된 비-세포변성 진핵 바이러스를 기반으로 한다. 본 발명의 특정 구현예에 바람직한 바이러스는 유전자 요법에서 인간 사용을 위해 이미 승인된 이중 가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스 및 아데노-관련(AAV) 바이러스이다. 또한, 내성 유도(tolerizing)를 위한 바람직한 벡터는 면역-자극 서열을 포함하지 않는다.
아데노바이러스 벡터
하나 이상의 핵산 서열의 생체내 전달을 위한 하나의 예시적인 방법은 아데노바이러스 발현 벡터의 사용을 포함한다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 작제물의 패키징을 지원하고 (b) 센스 또는 안티센스 배향으로 그 안에 클로닝된 폴리뉴클레오티드를 발현시키기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 작제물을 포함하는 것을 의미한다. 물론 안티센스 작제물의 맥락에서, 유전자 산물이 합성될 발현은 필요하지 않다. 특정 구현예에서, 전달 벡터는 C 말단 Flag 및 His 태그를 갖는 아데노바이러스 벡터 pAd에서 사이토크롬 b5 리덕타아제 3(CYB5R3), 전사체 변이체 1의 상업적으로 입수 가능한 ORF(바이젠 바이오사이언시즈(Vigene Biosciences) 제품 코드 AH889428)에 관한 것이다. PCT 공보 제WO/2015/050364호는 또한 Cyb5r3 유전자를 포함하는 발현 작제물을 갖는 벡터를 교시한다.
아데노바이러스 벡터는 면역원성이 높기 때문에 항원을 제시함으로써 내성을 유도하는 투여의 경우 또는 자가면역 질병의 경우에 덜 선호된다. 그러나 이러한 벡터는, 예를 들어, 인플루엔자, HBV, HCV 및 HIV를 포함하는 감염성 질병 등의 치료에서 면역을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
아데노 -관련 바이러스 벡터( AAV )
AAV는 안전성, 예를 들어, 유전자 조작된(재조합) 것이 숙주 게놈에 통합되지 않기 때문에 양호한 종류의 전달 수단이다. 마찬가지로 AAV는 병원성이 아니며 어떤 질병과도 관련이 없다. 바이러스 코딩 서열의 제거는 바이러스 유전자 발현에 대한 면역 반응을 최소화하므로 rAAV는 염증 반응을 유발하지 않는다. 특정 구현예에 따르면, 본원에 기재된 핵산 작제물을 함유하는 에피토프 서열을 함유하는 AAV 벡터는 APC를 형질도입하는 데 유용하다.
전형적으로, 핵산 작제물을 함유하는 에피토프를 함유하는 바이러스 벡터는 원하는 에피토프, 적합한 조절 요소 및 세포 형질도입을 매개하는 에피토프 발현에 필요한 요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 조립된다. 일 구현예에서, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터가 사용된다. 보다 구체적인 구현예에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV6, 또는 AAV8이다.
AAV ITR에 의해 결합된 관심 DNA 분자를 보유하는 AAV 발현 벡터는 선택된 서열(들)을 그로부터 절제된 주요 AAV 오픈 리딩 프레임("ORF")을 갖는 AAV 게놈에 직접 삽입함으로써 구축될 수 있다. 본 발명의 AAV에 포함될 수 있는 구성적 프로모터의 예는, 제한 없이, 예시된 CMV 즉각적인 조기(immediate early) 인핸서/닭 β-액틴(CBA) 프로모터를 포함한다.
진핵 세포의 경우, 발현 조절 서열은 전형적으로 프로모터, 인핸서, 예컨대 면역글로불린 유전자, SV40, 거대세포 바이러스 등으로부터 유래된 인핸서, 및 스플라이스 공여 및 수용 부위를 포함할 수 있는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 전이유전자 서열 다음에 3' ITR 서열 앞에 삽입된다. 일 구현예에서, 소 성장 호르몬 polyA가 사용될 수 있다.
이들 및 기타 일반적인 벡터 및 조절 요소의 선택은 관습적이며, 이러한 서열 대부분이 이용 가능하다. 예를 들어, 샘브룩(Sambrook) 등, 및 예를 들어, 페이지 3.18-3.26 및 16.17-16.27에서 그 안에 인용된 참고 문헌 및 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989))을 참조한다. 물론, 모든 벡터 및 발현 조절 서열이 본 발명의 모든 전이유전자를 발현시키기 위해 동등하게 잘 기능할 수 있는 것은 아니다. 그러나, 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이러한 발현 조절 서열 중에서 선택할 수 있다. 적합한 프로모터/인핸서 서열은 본 출원에서 제공하는 지침을 사용하여 당업자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 선택은 일상적인 문제이며 분자 또는 작제물의 제한이 아니다.
레트로바이러스 벡터
특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. "레트로바이러스"는 RNA 게놈을 갖는 바이러스이다. 특정 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 패키징 및 통합에 필요한 모든 시스-작용 서열, 예를 들어, (a) 벡터의 각 말단에서 긴 말단 반복(LTR) 또는 이의 일부; (b) 음성 및 양성 가닥 DNA 합성을 위한 프라이머 결합 부위; 및 (c) 게놈 RNA를 비리온으로 통합하는 데 필요한 패키징 신호를 함유한다. 레트로바이러스 벡터에 관한 보다 자세한 내용은 문헌(Boesen, et al., 1994, Biotherapy 6:291-302; Clowes, et ai, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem, et al., 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141; Miller, et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581- 599; 및 Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-1 14)에서 찾을 수 있다.
"감마레트로바이러스"는 레트로비리다에(retroviridae) 과의 속을 지칭한다. 감마레트로바이러스의 예에는 마우스 줄기 세포 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스, 및 조류 세망내피증 바이러스가 포함된다.
널리 사용되는 레트로바이러스 벡터에는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 이들의 조합을 기반으로 하는 벡터가 포함된다(참조: 예를 들어, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739, 1992; Johann et al., J. Virol. 66: 1635-1640, 1992; Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59, 1990; Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378, 1989; Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224, 1991; 및 PCT/US94/05700).
렌티바이러스 벡터는 분열 및 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고, 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있는 레트로바이러스 속을 지칭한다. 몇몇 렌티바이러스의 예에는 HIV(인간 면역결핍 바이러스: HIV 1형 및 HIV 2형 포함); 말 전염성 빈혈 바이러스; 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)가 포함된다.
특정 구현예에서, 다른 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 이에는, 예를 들어, 인간 거품형성 바이러스(HFV) 또는 스푸마바이러스(Spumavirus) 속의 다른 바이러스에 기반한 벡터가 포함된다. 거품형성 바이러스(FV)는 오늘날 알려진 가장 큰 레트로바이러스이며, 모든 비-인간 영장류 종을 포함한 다양한 포유동물 사이에 널리 퍼져있지만 인간에서는 존재하지 않는다. 이 완전한 무병원성(apathogenicity)은 FV 벡터를 인간의 유전자 치료를 위한 이상적인 유전자 전달 매개체로 규정하고, 유전자 전달 시스템으로서 FV 벡터를 HIV-유래 및 또한 감마레트로바이러스-유래 벡터와 분명히 구별한다.
비-세포변성 바이러스에는 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스)가 포함되며, 그 수명 주기에는 게놈 바이러스 RNA를 DNA로 역전사에 이어서 숙주 세포 DNA로의 프로바이러스 통합이 포함된다. 레트로바이러스는 인간 유전자 요법 시험을 위해 승인되었다. 가장 유용한 것은 복제-결핍(예를 들어, 원하는 단백질의 합성을 지시할 수 있지만, 감염성 입자를 제조할 수 없는) 레트로바이러스이다. 이러한 유전자 변형된 레트로바이러스 발현 벡터는 생체내 유전자의 고효율 형질도입에 일반적으로 유용하다. 복제-결핍 레트로바이러스를 생산하기 위한 표준 프로토콜(외인성 유전 물질을 플라스미드로 통합하는 단계, 플라스미드로 라이닝된 패키징 세포의 형질감염 단계, 패키징 세포주에 의한 재조합 레트로바이러스 생산 단계, 조직 배양 배지에서 바이러스 입자 수집 단계, 및 바이러스 입자에 의한 표적 세포의 감염 단계 포함)은 당업자에게 공지되어 있다.
레트로바이러스 게놈은 캡시드 단백질, 폴리머라제 효소 및 외피 성분을 각각 코딩하는 세 가지 유전자, gag, pol 및 env를 포함한다. gag 유전자의 상류에서 발견된 서열은 게놈을 비리온으로 패키징하기 위한 신호를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 이종 핵산이 2개의 레트로바이러스 LTR 사이에 존재하는 유전자 전달 플라스미드이다. 레트로바이러스 벡터는 전형적으로 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 주형으로 사용하여 전사된 RNA를 적절한 패키징 세포주에서 바이러스 비리온으로 패키징할 수 있도록 하는 적절한 패키징 신호를 포함한다(참조: 예를 들어, 미국 특허 번호 4,650,764). 이 2개의 긴 말단 반복(LTR) 서열은 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단에 존재한다. 이들은 강력한 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하며, 숙주 세포 게놈에서의 통합에도 필요하다(Coffin, 1990). 레트로바이러스 벡터를 구축하기 위해, 하나 이상의 관심 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 핵산을 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈에 삽입하여 복제-결함 바이러스를 생산한다. 또한, 렌티바이러스(예를 들어, 레트로바이러스 유형)에 기반한 레트로바이러스 벡터의 에피솜 또는 비-통합 형태도 포함된다.
렌티바이러스 벡터는 안정한 발현이 필요할 때 유용하지만, 렌티바이러스 벡터는 면역원성일 수 있으며, 다른 바람직하지 않은 효과를 가질 수 있다. 따라서, 렌티바이러스 벡터는 연구에 편리하지만, 인간 투여에 사용할 때, 특히 면역보다는 내성을 유도하는 것이 바람직한 경우 주의해야 한다. 렌티바이러스는 mRNA 전기천공이 더 안전하지만, 생체외에서 암 치료를 위해 T 세포 또는 수지상 세포 또는 기타 항원 제시 세포를 조작하는 데 적합하다. 그러나 최근 두 가지 진보로 렌티바이러스의 사용이 보다 안전하고, 임상적으로 더 잘 번역될 수 있다. 첫째, 약물이 투여될 때 산물이 기능을 발휘하는 항원과 함께 자살 유전자의 공동 발현. 전형적인 예는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(HSV-Tk)이다. 이러한 유전자를 발현시키는 세포는 약물 간시클로비르를 세포 사멸을 유도하는 세포독성 산물로 대사시킬 수 있다. 따라서, 일부 형질도입된 세포가 악성이 되는 경우, 이는 박멸될 수 있다. 이러한 시스템이 약 12개 존재한다(Duarte et al., Cancer Letters, 324:160-170, 2012). 둘째, 현재 비-종양성인 비-통합 렌티바이러스 벡터가 개발중에 있다(Nightingale et al., 2006, Mol. Ther., 13:1121-1132). 이러한 방법은 당업자의 판단에 따라 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
본원에 사용하기에 적합한 레트로바이러스 벡터는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,399,346 및 5,252,479; 및 PCT 공보 번호 WO 92/07573, WO 90/06997, WO 89/05345, WO 92/05266 및 WO 92/14829에 기재되어 있으며, 이는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 핵산을 인간 세포에 효율적으로 도입하기 위한 방법에 관한 설명을 제공한다. 다른 레트로바이러스 벡터에는, 예를 들어, 마우스 유방 종양 바이러스 벡터(예를 들어, Shackleford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:9655-9659, 1998), 렌티바이러스 등이 포함된다. 예시적인 바이러스 벡터는 plentilox-IRES-GFP이다.
항-CD39 항체 제제를 인코딩하는 전이유전자의 전달을 위해 쉽게 조정될 수 있는 추가의 레트로바이러스 바이러스 전달 시스템은 공개된 PCT 출원 WO/2010/045002, WO/2010/148203, WO/2011/126864, WO/2012/058673, WO/2014/066700, WO/2015/021077, WO/2015/148683, 및 WO/2017/040815를 단지 예시하기 위해 포함하며, 이들 각각의 개시는 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, 레트로바이러스는 레트로바이러스 GAG 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 레트로바이러스 POL 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 레트로바이러스 외피를 인코딩하는 핵산 서열; 온코레트로바이러스(oncoretroviral) 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 긴 말단 반복(LTR) 서열을 포함하는 온코레트로바이러스 폴리뉴클레오티드 서열; 항-CD39 항체 제제에 대한 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는 카세트(여기서 카세트는 3' LTR의 U3 영역에 대해 5' 및 레트로바이러스 외피를 인코딩하는 서열에 대해 3'에 위치함); 및 표적 세포에서 역전사, 패키징 및 통합을 위한 시스-작용 서열을 포함하는 재조합 복제 적격 레트로바이러스이다.
특정 구현예에서, 레트로바이러스는 레트로바이러스 GAG 단백질; 레트로바이러스 POL 단백질; 레트로바이러스 외피; 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 긴 말단 반복(LTR) 서열, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 프로모터 서열(프로모터는 포유동물 세포에서의 발현에 적합함), gag 핵산 도메인, pol 핵산 도메인 및 env 핵산 도메인을 포함하는 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드; 이종 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 항-CD39 항체 제제 코딩 서열을 포함하는 카세트(여기서 카세트는 3' LTR에 대해 5'에 위치하고 작동 가능하게 연결되고, 레트로바이러스 외피를 인코딩하는 env 핵산 도메인에 대해 3'에 위치함); 및 표적 세포에서 역전사, 패키징 및 통합에 필요한 시스-작용 서열을 포함하는 재조합 복제 적격 레트로바이러스이다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 특정 바람직한 구현예에서, 외피는 암포트로픽(amphotropic), 폴리트로픽(polytropic), 제노트로픽(xenotropic), 10A1, GALV, 개코원숭이 내생 바이러스, RD114, 라브도바이러스, 알파바이러스, 홍역 또는 인플루엔자 바이러스 외피 중 하나로부터 선택된다. 재조합 복제 적격 레트로바이러스의 특정 바람직한 구현예에서, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드 서열은 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 고양이 백혈병 바이러스(FeLV), 개코원숭이 내생 레트로바이러스(BEV), 돼지 내생 바이러스(PERV), 고양이 유래 레트로바이러스 RD114, 다람쥐 원숭이 레트로바이러스, 제노트로픽 뮤린 백혈병 바이러스-관련 바이러스(XMRV), 조류 세망내피증 바이러스(REV), 또는 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 조작된다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 특정 바람직한 구현예에서, 레트로바이러스는 감마레트로바이러스이다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 특정 바람직한 구현예에서, 제2 치료 단백질, 예컨대 또 다른 체크포인트 억제제 폴리펩티드, 공동 자극 폴리펩티드 및/또는 면역자극 사이토카인(단지 예로서), 예를 들어, 카세트의 하류에 대한 코딩 서열을 포함하는 제2 카세트가 있다. 특정 경우에, 제2 카세트는 제2 치료 단백질에 대한 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 미니프로모터 또는 polIII 프로모터를 포함할 수 있다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 특정 바람직한 구현예에서, 이는 바람직하게는 종양 미세환경의 세포에서 선택적으로 감염 및 복제하는 비용해성, 암포트로픽 레트로바이러스 복제 벡터이다.
발현 작제물로서의 다른 바이러스 벡터
숙주 세포에 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 전달하기 위한 다른 바이러스 벡터가 본 발명에서 발현 작제물로 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스, 폴리오바이러스 및 헤르페스 바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터를 사용할 수 있다. 이는 다양한 포유동물 세포에 몇몇 매력적인 특징을 제공한다. 또한, B형 간염 바이러스도 포함된다.
b. 비-바이러스 벡터
플라스미드 벡터
다른 벡터는 플라스미드 벡터를 포함한다. 플라스미드 벡터는 당 업계에 광범위하게 설명되어 있으며 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상기 인용된 샘브룩 등을 참조한다. 지난 몇 년 동안 플라스미드 벡터는 항원-인코딩 유전자를 생체 내 세포에 전달하기 위한 DNA 백신으로 사용되어 왔다. 이는 많은 바이러스 벡터와 동일한 안전성 문제가 없기 때문에 특히 유리하다. 그러나, 숙주 세포에 적합한 프로모터를 갖는 이러한 플라스미드는 플라스미드 내에서 핵산에 의해 인코딩된 펩티드 에피토프를 발현시킬 수 있다. 다른 플라스미드는 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 플라스미드는 특정 DNA 단편을 제거하고 추가하도록 제한 효소 및 결찰 반응을 사용하여 맞춤 설계될 수 있다. 플라스미드는 다양한 비경구, 점막 및 국소 경로로 전달될 수 있다. 예를 들어, DNA 플라스미드는 근육내, 피내, 피하 또는 기타 경로로 주사될 수 있다. 이는 또한 비강내 스프레이 또는 점적제, 직장 좌약 및 경구로 투여될 수 있다. 이는 또한 유전자총(gene-gun)을 사용하여 표피 또는 점막 표면에 투여될 수 있다. 플라스미드는 수용액으로 제공되거나, 금 입자 상에 건조되거나, 리포좀, 덴드리머, 코클리에이트(cochleate) 및 마이크로캡슐화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 또 다른 DNA 전달 시스템과 공동으로 제공될 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 발현 카세트를 포함하는 핵산 작제물을 함유하는 에피토프의 발현을 위한 플라스미드가 제공되고; 전사 단위로도 지칭된다. 플라스미드가 에피토프 발현에 적합한 환경에 배치될 때, 전사 단위는 에피토프, ETS 및 MHCII 활성화 서열을 인코딩하는 서열, 또는 에피토프 및 분비 신호 서열을 인코딩하는 서열, 및 그 밖의 작제물에 인코딩된 모든 것을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 것이다. 전사 단위는 세포 면역 반응 요소 코딩 서열과 전사적으로 연결된 전사 조절 서열을 포함한다. 전사 조절 서열은 거대세포 바이러스(CMV) 프로모터/인핸서 서열과 같은 프로모터/인핸서 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 당업자는 진핵 세포에서의 발현에 적합한 다양한 다른 프로모터 서열이 공지되어 있으며, 본원에 개시된 작제물에서 유사하게 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 핵산 산물의 발현 수준은 관련 프로모터, 및 관련 인핸서 요소의 존재 및 활성화에 따라 달라질 것이다.
특정 구현예에서, 원하는 에피토프 및 표적화 서열을 인코딩하는 서열은 전사, 번역, RNA 안정성 및 복제를 위한 조절 요소(예를 들어, 전사 조절 서열 포함)를 포함하는 발현 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 이러한 발현 플라스미드는 당 업계에 잘 알려져 있으며, 숙련가는 세포 면역 반응 요소가 발현될 수 있는 방식으로 세포 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 적절한 발현 작제물을 설계할 수 있을 것이다. pCI-neo, pUMVC 또는 pcDNA3과 같이 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 클로닝될 수 있는 적합한 발현 플라스미드의 많은 예가 있다.
세포 면역 반응 요소 또는 이의 단편의 발현을 위한 플라스미드를 보유하는 다량의 박테리아 숙주는 발효될 수 있고 플라스미드는 후속 사용을 위해 정제될 수 있다. 플라스미드를 사용하는 현재 인간 임상 시험은 이 접근법을 이용한다(Recombinant DNA Advisory Committee Data Management Report, Human Gene Therapy 6: 535-548, 1994). 당 업계에 공지된 현재의 DNA 단리 방법은 플라스미드를 증식시키는 데 사용되는 박테리아로부터 오염 물질인 지질다당류(내독소)를 제거하는 것을 포함한다. 이 단계는 내독소가 강력한 보조제로 작용하고 원하지 않는 면역 자극을 생성할 수 있으므로 관용원성(tolerogenic) DNA 백신의 사용을 위해 가장 바람직하게 채택된다.
플라스미드의 목적은 세포 또는 조직에서 핵산 서열을 효과적으로 전달하고 치료적 에피토프를 발현시키는 것이다. 특히, 플라스미드의 목적은 높은 복제수를 달성하고, 플라스미드 불안정성의 잠재적인 원인을 피하고, 플라스미드 선택 수단을 제공하는 것일 수 있다. 발현에 관해 말하면, 핵산 카세트는 카세트 내에 핵산의 발현에 필요한 요소를 포함한다. 발현은 플라스미드로 삽입된 유전자, 핵산 서열 또는 핵산 카세트를 효율적으로 전사하는 것을 포함한다. 발현 산물은 단백질, 폴리펩티드 또는 RNA일 수 있다. 핵산 서열은 핵산 카세트에 포함될 수 있다. 핵산 발현은 연속적이거나 조절될 수 있다.
미니서클( Minicircle )
본원에 기재된 핵산 작제물의 구현예는 미니서클 DNA의 형태로 처리될 수 있다. 미니서클 DNA는 모든 원핵 벡터 부분이 없는 작은(2 kb 내지 4 kb) 원형 플라스미드 유도체에 속한다. 미니서클 DNA 벡터는 박테리아 DNA 서열을 포함하지 않으므로, 이물질로 인식되어 파괴될 가능성이 적다. (전형적인 전이유전자 전달 방법은 외래 DNA를 포함하는 플라스미드를 수반한다.) 그 결과, 이러한 벡터는 통상적인 플라스미드(수 일 내지 수 주)에 비해 더 긴 기간(대략 수 주 또는 수 개월) 동안 발현될 수 있다. 더 작은 크기의 미니서클은 또한 클로닝 능력을 확장시키고, 세포로의 전달을 촉진한다. 미니서클 DNA를 생성하기 위한 키트는 당 업계에 공지되어 있고 상업적으로 입수 가능하다(시스템 바이오사이언시즈 인코포레이티드(System Biosciences, Inc.), 캘리포니아주 팰로앨토 소재). 미니서클 DNA에 관한 정보는 문헌(Dietz et al., Vector Engineering and Delivery Molecular Therapy (2013); 21 8, 1526-1535 및 Hou et al., Molecular Therapy―Methods & Clinical Development, Article number: 14062 (2015) doi:10.1038/mtm.2014.62)에서 제공된다. 미니서클 DNA에 관한 더 많은 정보는 문헌(Chen Z Y, He C Y, Ehrhardt A, Kay M A. Mol Ther. 2003 September; 8(3):495-500)에서 제공되며, 미니서클 DNA 벡터는 활성 염색질 및 전사 수준으로 반영되는 지속적인 발현을 달성한다(Gracey Maniar L E, Maniar J M, Chen Z Y, Lu J, Fire A Z, Kay M A. Mol Ther. 2013 January; 21(1):131-8).
궁극적으로 핵산에 의해 인코딩된 산물의 발현을 얻는 과정의 초기 단계로서, 세포에 의한 핵산의 흡수를 수행하는 것이다. 세포에 의한 핵산의 흡수는 여러 요인에 따라 달라지며, 그중 하나는 핵산이 세포 표면에 근접해 있는 시간이다. 예를 들어, 완충액 중의 플라스미드 DNA를 근육내(i.m.) 투여한 후, 근육을 마사지하면 유전자 발현이 현저하게 감소하는 것이 관찰되었고, 이는 아마도 근육에서 직접 또는 림프관을 통해 DNA가 누출되기 때문일 것이다(Human Gene Therapy 4:151-159; 1993). 따라서, 핵산이 확산되거나 핵산의 세포 흡수가 요구되는 부위로부터 멀리 운반되는 속도를 지연시킬 화합물로 핵산을 제형화하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 이러한 화합물은 핵산의 세포 흡수를 증가시키는 데 필요한 물리적 특성을 유지하거나 회복하면서 주사와 같은 수단에 의해 유기체에 투여하기에 적합할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 수행하기 위해, 발현 작제물이 세포 내로 전달되어야 한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 작제물은 단순히 네이키드 재조합 DNA 또는 플라스미드로 구성될 수 있다.
면역력을 프라이밍하기 위해 모든 유형의 DNA 백신 벡터는 바람직하게는 CpG가 풍부하도록 조작되거나 (면역 세포에서 TLR9를 자극하기 위해) 반대로 CpG를 제거하도록 조작되며, 가능하면, CpG 모티프를 GpG 모티프로 대체한다(Ho et al., J. Immunol. 71(9):4920-6, 2003; Ho et al., J. Immunol. 175(9):6226-34, 2005). DNA 백신은 항원(들)/에피토프(들)를 포함하도록 조작될 수 있으며, 또한 항원과의 공동 발현을 위한 추가 유전자를 포함하여 보조제 또는 면역 조절제 역할을 할 수 있다(다중 프로모터 벡터. 이러한 DNA 백신은, 예를 들어 T1D 환자에서 임상적으로 안전한 것으로 확인되었다(Roep et al., Sci. Transl. Med. 5(191):191ra82, 2013).
기계 전달 시스템
추가의 비-바이러스 전달 방법에는 문헌(Woffendin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24):11581, 1994)에 설명된 접근법과 같이 시험관내에서 사용될 수 있는 기계적 전달 시스템; 광중합된 하이드로겔 물질의 침착 또는 이온화 방사선의 사용(참조: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,206,152 및 WO 92/11033); 휴대용 유전자 전달 입자 총의 사용(참조: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,149,655); 및 전달된 유전자를 활성화하기 위한 이온화 방사선의 사용(참조: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,206,152 및 WO 92/11033)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 전달 장치는 생체 적합성일 수도 있고 생분해성일 수도 있다. 제형은 바람직하게는 비교적 일정한 수준의 활성 성분 방출을 제공한다. 한편, 투여 즉시 보다 빠른 방출 속도가 요구될 수 있다. 이러한 조성물의 제형은 공지된 기술을 사용하는 당업자의 수준 내에 있다.
전달을 향상시키는 물리적 방법에는 전기천공(고전압의 짧은 펄스가 막을 가로 질러 핵산을 운반하는 곳), 유전자총(DNA가 금 입자에 부하되고, DNA가 세포로 침투하도록 하는 곳), 소노포레이션(sonoporation), 마그네토펙션(magnetofection), 유체역학적 전달 등이 포함되며, 이들은 모두 당업자에게 공지되어 있다. DNA는 또한 리포좀, 바람직하게는 양이온성 리포좀, 또는 세포막과 상호작용하고 융합되거나 세포내이입을 통해 DNA를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리머좀(합성 리포좀)에 캡슐화될 수 있다. DNA는 또한 중합체(폴리플렉스(polyplex)) 또는 세포의 세포질 내로 로드를 직접 방출할 수 있는 덴드리머와의 복합체로 형성될 수 있다.
이와 관련하여 유용한 예시적인 캐리어는 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로스, 덱스트란 등의 마이크로입자를 포함한다. 다른 예시적인 지연-방출 캐리어는 비-액체 친수성 코어(예를 들어, 가교된 다당류 또는 올리고당) 및 선택적으로, 인지질과 같은 양친매성 화합물을 포함하는 외부 층을 포함하는 초분자 바이오벡터(biovector)를 포함한다(참조: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,151,254 및 PCT 출원 WO 94/20078, WO/94/23701 및 WO 96/06638). 지속 방출 제형에 함유된 활성제의 양은 이식 부위, 방출 속도 및 예상 방출 기간, 및 치료 또는 예방될 상태의 특성에 따라 달라진다.
생분해성 마이크로스페어(예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)는 조성물의 캐리어로 사용될 수 있다. 적합한 생분해성 마이크로스페어는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344, 5,407,609 및 5,942,252에 개시되어 있다. WO/99 40934 및 그 안에 인용된 참고 문헌에 기재된 바와 같은 변형된 B형 간염 코어 단백질 운반 시스템도 많은 응용에 유용할 것이다. 또 다른 예시적인 운반/전달 시스템은 미국 특허 번호 5,928,647에 기재된 바와 같은 미립자-단백질 복합체를 포함하는 캐리어를 이용하며, 이는 환자의 종양 조직을 표적으로 하는 MHC I-제한된 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 수 있는 항-CD39 항체 제제에 대한 코딩 서열을 전달하기 위해 종양내로 사용될 때 추가적인 이점을 가질 수 있다.
생분해성 중합성 나노입자는 세포로의 비바이러스 핵산 전달을 촉진한다. 작은(대략 200 nm) 양으로 하전된(대략 10 mV) 입자는 양이온성 가수 분해성 폴리(베타-아미노 에스테르) 및 플라스미드 DNA의 자가 조립에 의해 형성된다.
폴리뉴클레오티드는 또한 직접 미세주입, 일시적인 세포 투과화(예를 들어, 억제 인자 및/또는 활성화제와 세포 투과제의 공동-투여), 막 전위 펩티드로의 융합 등에 의해 세포에 투여될 수 있다.
본 개시의 어떤 특정 구현예에서, 유전자 작제물은 전기천공을 통해 표적 세포로 도입된다. 전기천공은 세포(또는 조직)와 DNA(또는 DNA 복합체)를 고전압 방전에 노출시키는 것을 포함한다. 생체내 전기천공은 플라스미드 DNA를 여러 다른 조직으로 효율적으로 전달하기 위해 성공적으로 사용된 유전자 전달 기술이다. 연구에 따르면 플라스미드 DNA를 B16 흑색종 및 기타 종양 조직으로 전달하기 위한 생체내 전기천공 투여가 보고되었다. 플라스미드에 의해 인코딩된 유전자 또는 cDNA의 전신 및 국소 발현은 생체내 전기천공의 투여로 얻을 수 있다. 생체내 전기천공의 사용은 종양 조직에서 플라스미드 DNA 흡수를 향상시켜 종양 내에서 발현을 일으키고, 플라스미드를 근육 조직에 전달하여 분비된 단백질, 예컨대 사이토카인의 전신 발현을 초래한다(참조: 예를 들어, US8026223). 항-CD39 항체 제제 전이유전자를 생체내 세포로 전기천공하기 위한 예시적인 기술, 벡터 및 장치는 PCT 공보 WO/2017/106795, WO/2016/161201, WO/2016/154473, WO/2016/112359 및 WO/2014/066655를 포함한다.
미국 특허 번호 7,245,963에서는 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포에 생체분자의 도입을 용이하게 하기 위한 모듈형 전극 시스템 및 이의 용도를 설명한다. 모듈형 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 주사 바늘; 프로그래밍 가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 바늘 전극으로의 전도성 링크를 제공하는 전기 커넥터; 및 전원을 포함한다. 작업자는 지지 구조물에 장착된 복수의 바늘 전극을 잡고 신체 또는 식물의 선택된 조직에 이를 단단히 삽입할 수 있다. 이어서 피하 주사 바늘을 통해 생체분자를 선택된 조직으로 전달한다. 프로그래밍 가능한 정전류 펄스 컨트롤러가 활성화되고, 정전류 전기 펄스가 복수의 바늘 전극에 인가된다. 인가된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이의 세포 내로 생체분자의 도입을 용이하게 한다. 미국 특허 번호 7,245,963의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
미국 특허 공보 2005/0052630에서는 생체분자를 신체 또는 식물의 선택된 조직의 세포에 효과적인 도입 촉진을 위해 사용될 수 있는 전기천공 장치를 설명한다. 전기천공 장치는 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 작동이 지정된 전기-운동(electro-kinetic) 장치("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 사용자 제어 및 펄스 파라미터 입력을 기반으로 어레이의 전극 간에 일련의 프로그래밍 가능한 정전류 펄스 패턴을 생성하고, 전류 파형 데이터의 저장 및 수집을 허용한다. 전기천공 장치는 또한 바늘 전극의 어레이, 주사 바늘을 위한 중앙 주사 채널, 및 제거 가능한 가이드 디스크를 갖는 교체 가능한 전극 디스크를 포함하며(참조: 예를 들어, 미국 특허 공보 2005/0052630), 본원에 참조로 포함된다.
미국 특허 번호 7,245,963 및 미국 특허 공보 2005/0052630에 기재된 전극 어레이 및 방법은 근육과 같은 조직뿐만 아니라 다른 조직이나 기관으로의 깊은 침투에 적합하다. 전극 어레이의 배열 때문에, 주사 바늘(선택한 생체분자를 전달하기 위해)도 표적 기관에 완전히 삽입되고, 주사는 전극에 의해 미리 정의된 영역에서 표적 조직에 수직으로 투여된다.
전형적으로, 생체내 세포 전기천공에 필요한 전기장은 일반적으로 시험관내 세포에 필요한 전기장과 크기가 유사하다. 일 구현예에서, 전기장의 크기는 대략 10 V/cm 내지 약 1500 V/cm, 바람직하게는 약 300 V/cm 내지 1500 V/cm, 바람직하게는 약 1000 V/cm 내지 1500 V/cm의 범위이다. 대안적으로, 전기장 강도가 낮을수록(약 10 V/cm 내지 100 V/cm, 더 바람직하게는 약 25 V/cm 내지 75 V/cm) 펄스 길이가 길다. 예를 들어, 공칭 전기장이 약 25 V/cm 내지 75 V/cm일 때, 펄스 길이가 약 10 msec인 것이 바람직하다.
펄스 길이는 약 10 s 내지 약 100 ms일 수 있다. 임의의 원하는 수의 펄스가 있을 수 있으며, 전형적으로 초당 1 내지 100 펄스일 수 있다. 펄스 세트 간의 지연은 1초와 같이 임의의 원하는 시간일 수 있다. 파형, 전기장 강도 및 펄스 지속 기간은 또한 전기천공을 통해 세포에 들어가는 세포 유형 및 분자 유형에 따라 달라질 수 있다.
또한, 전기화학적 임피던스 분광법("EIS")을 포함한 전기천공 장치도 포함된다. 이러한 장치는 생체내, 특히 종양내 전기천공 효율에 대한 실시간 정보를 제공하여 조건을 최적화할 수 있다. EIS를 포함한 전기천공 장치의 예는, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 WO2016/161201에서 찾을 수 있다.
본 발명의 비-바이러스 전달 벡터의 흡수는 또한 애벌랜시 형질감염(avalanche transfection)이라고도 하는 플라즈마 전기천공에 의해 향상될 수 있다. 간단히 말해서, 마이크로초 방전은 전극 표면에 캐비테이션 미세기포를 생성한다. 자기장과 조합된 붕괴하는 미세기포에 의해 생성된 기계적 힘은 통상적인 전기천공과 관련된 확산 매개된 수송과 비교하여 세포막을 통한 수송 효율을 증가시키는 역할을 한다. 플라즈마 전기천공 기술은 미국 특허 번호 7,923,251 및 8,283,171에 기재되어 있다. 이 기술은 또한 생체내에서 세포의 형질전환을 위해 사용될 수 있다(Chaiberg, et al (2006) Investigative Ophthalmology & Visual Science 47:4083-4090; Chaiberg, et al 2012년 1월 24일에 발행된 미국 특허 번호 8, 101 169).
다른 대안적인 전기천공 기술도 고려된다. 생체내 플라스미드 전달은 또한 저온 플라즈마를 사용하여 수행될 수 있다. 플라즈마는 물질의 네 가지 기본 상태 중 하나이며, 나머지는 고체, 액체 및 기체이다. 플라즈마는 결합되지 않은 양입자 및 음입자의 전기적으로 중성 매체이다(예를 들어, 플라즈마의 전체 전하는 거의 0임). 플라즈마는 기체를 가열하거나 레이저 또는 마이크로파 발생기로 인가된 강한 전자기장에 노출시켜 생성될 수 있다. 이것은 전자의 수를 감소시키거나 증가시켜 이온이라고 불리는 양전하 또는 음전하 입자를 생성하고(Luo, et al. (1998) Phys. Plasma 5:2868-2870), 존재하는 경우, 분자 결합의 해리를 동반한다.
저온 플라즈마(예를 들어, 비-열 플라즈마)는 펄스 고전압 신호를 적합한 전극에 전달하여 생성된다. 저온 플라즈마 장치는 가스 제트 장치 또는 유전체 장벽 방전(DBD) 장치의 형태를 취할 수 있다. 저온 플라즈마는 상대적으로 낮은 기체 온도에서 플라즈마를 제공하기 때문에 대단한 열의와 관심을 끌었다. 이러한 온도에서 플라즈마를 제공하는 것은 상처 치유, 항균 과정, 다양한 기타 의료 요법 및 멸균을 포함한 다양한 응용 분야에서 중요하다. 앞서 언급된 바와 같이, 저온 플라즈마(예를 들어, 비-열 플라즈마)는 펄스 고전압 신호를 적합한 전극에 전달함으로써 생성된다. 저온 플라즈마 장치는 기체 제트 장치, 유전체 장벽 방전(DBD) 장치 또는 다중-주파수 고조파-풍부 전원 공급 장치의 형태를 취할 수 있다.
유전체 장벽 방전 장치는 저온 플라즈마를 생성하기 위해 다른 프로세스에 의존한다. 유전체 장벽 방전(DBD) 장치는 유전체 층으로 덮인 적어도 하나의 전도성 전극을 포함한다. 전기적 귀환 경로는 저온 플라즈마 처리를 받는 표적 기판에 의해 제공될 수 있는 접지에 의해 또는 전극에 내장 접지를 제공함으로써 형성된다. 유전체 장벽 방전 장치를 위한 에너지는 상기 언급된 것과 같은 고전압 전원 공급 장치에 의해 제공될 수 있다. 보다 일반적으로, 에너지는 플라즈마 방전을 형성하기 위해 펄스 DC 전기 전압의 형태로 유전체 장벽 방전 장치에 입력된다. 유전체 층으로 인해 방전이 전도성 전극에서 분리되고 전극 에칭 및 기체 가열이 감소된다. 펄스 DC 전기 전압은 다양한 작동 체제를 달성하기 위해 진폭과 주파수가 변할 수 있다. 이러한 저온 플라즈마 생성 원리를 포함하는 모든 장치(예를 들어, DBD 전극 장치)는 본 발명의 다양한 구현예의 범위에 속한다.
저온 플라즈마는 외래 핵산으로 세포를 형질감염시키는 데 사용되었다. 특히, 종양 세포의 형질감염(참조: 예를 들어, Connolly, et al. (2012) Human Vaccines & Immune-therapeutics 8: 1729-1733; 및 Connolly et al (2015) Bioelectrochemistry 103: 15-21).
특정 예시적인 구현예에서, 본 발명의 항-CD39 항체 제제를 인코딩하는 전이유전자 작제물은 어플리케이터; 어플리케이터로부터 연장되고 커버 영역과 연합되는 복수의 전극; 전극과 전기적으로 통신하는 전원 공급 장치로서, 커버 영역 내의 세포에 하나 이상의 전기천공 신호를 생성하도록 구성된 전원 공급 장치; 및 전극에 결합된 가이드 부재로서, 전극의 커버 영역을 조절하도록 구성된 가이드 부재를 포함하는 전기천공 장치를 사용하여 전달된다. 전극의 적어도 일부는 원뿔형 배열로 어플리케이터 내에 위치할 수 있다. 하나 이상의 전기천공 신호는 각각 전기장과 관련될 수 있다. 이 장치는 전원 공급 장치 및 전극에 결합된 전위차계를 추가로 포함할 수 있다. 전위차계는 전기장을 실질적으로 미리 결정된 범위 내로 유지하도록 구성될 수 있다.
하나 이상의 전기천공 신호는 각각 전기장과 관련될 수 있다. 이 장치는 전원 공급 장치 및 전극에 결합된 전위차계를 추가로 포함할 수 있다. 전위차계는 커버 영역 내의 세포에서 영구적인 손상을 실질적으로 방지하고/하거나 통증을 실질적으로 최소화하기 위해 미리 결정된 범위 내에서 전기장을 유지하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 전위차계는 전기장을 약 1300 V/cm로 유지하도록 구성될 수 있다.
전원 공급 장치는 제1 전기 신호를 제1 전극에 제공하고 제2 전기 신호를 제2 전극에 제공할 수 있다. 제1 및 제2 전기 신호는 결합하여 비트 주파수를 갖는 파장을 생성할 수 있다. 제1 및 제2 전기 신호는 각각 단극 파형 및 이극 파형 중 적어도 하나를 가질 수 있다. 제1 전기 신호는 제1 주파수 및 제1 진폭을 가질 수 있다. 제2 전기 신호는 제2 주파수 및 제2 진폭을 가질 수 있다. 제1 주파수는 제2 주파수와 상이하거나 동일할 수 있다. 제1 진폭은 제2 진폭과 상이하거나 동일할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 종양이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 항-CD39 항체 제제를 코딩하는 유효량의 플라스미드를 종양에 주입하는 단계; 및 종양에 전기천공 요법을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 전기천공 요법은 약 100 마이크로초 내지 약 20 밀리초의 펄스 폭에 걸쳐 약 200 V/cm 내지 약 1500 V/cm의 적어도 하나의 전압 펄스의 투여를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 플라스미드(또는 제2 전기천공된 플라스미드)는 IL-12, IL-15, 및 IL-12와 IL-15의 조합을 인코딩하는 군으로부터 선택된 것과 같은 적어도 하나의 면역자극 사이토카인을 추가로 인코딩한다.
항-CD39 항체 인코딩 핵 작제물을 전달하기 위한 지질 및 다중 양이온 분자
시험관내 및 생체내에서 지질-매개된 핵산 전달 및 mRNA를 포함한 외래 핵산의 발현은 매우 성공적이었다. 지질 기반 비-바이러스 제형은 아데노바이러스 유전자 요법에 대한 대안을 제공한다. 현재 생체내 지질 전달 방법은 피하, 피내, 종양내 또는 두개내 주사를 사용한다. 지질 제형의 진보는 생체내에서 유전자 전달의 효율을 향상시켰다(참조: PCT 공보 WO 98/07408). 예를 들어, 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸 암모니오)프로판(DOTAP)과 콜레스테롤의 등몰 비로 구성된 지질 제형은 전신 생체내 유전자 전달을 상당히 향상시킬 수 있다. DOTAP:콜레스테롤 지질 제형은 "샌드위치 리포좀"이라는 독특한 구조를 형성한다. 이 제형은 함입된 이중층 또는 '베이스(vase)' 구조 사이에 DNA를 "샌드위치"하는 것으로 보고되어 있다. 이러한 지질 구조의 유익한 특성에는 양성 p, 콜레스테롤에 의한 콜로이드 안정화, 2차원 핵산 패킹 및 혈청 안정성 증가가 포함된다.
양이온성 리포좀 기술은 양으로 하전된 헤드 그룹과 소수성 지질 꼬리를 가진 양친매성 지질이 음으로 하전된 DNA 또는 RNA에 결합하고, 일반적으로 세포내이입에 의해 세포에 들어가는 입자를 형성하는 능력을 기반으로 한다. 일부 양이온성 리포좀은 또한 포유동물 세포에 의한 리포좀 흡수를 향상시키는 것으로 생각되는 중성 코-지질(co-lipid)을 포함한다. 유사하게, 폴리-1-리신 및 폴리에틸렌-이민과 같은 다른 다중 양이온은 전하 상호작용을 통해 핵산과 복합체를 형성하고, DNA 또는 RNA가 나노입자로 축합되는 것을 도우며, 이는 이후 엔도솜-매개된 흡수를 위한 기질이 된다. 플라스미드 DNA(pDNA), 올리고데옥시뉴클레오티드 및 다양한 형태의 합성 RNA와의 복합체를 포함하여, 이러한 양이온성-핵산 복합체 기술 중 몇 가지가 잠재적인 임상 제품으로 개발되었다.
본원에 개시된 핵산 작제물은 세포로의 흡수를 향상시키는 역할을 하는 다중 양이온 분자와 연합될 수 있다. 핵산 작제물이 다중 양이온 분자와 복합체를 형성하는 것은 또한 크기가 감소되도록 작제물을 패키징하는 데 도움이 되며, 이는 세포 흡수를 돕는 것으로 여겨진다. 일단 엔도솜에 들어가면 복합체는 낮은 pH로 인해 해리되고, 다중 양이온 분자는 엔도솜의 막을 파괴하여 DNA가 분해될 수 있기 전에 세포질로 빠져나가는 것을 촉진할 수 있다. 예비 데이터는 핵산 작제물 구현예가 다중 양이온 분자인 폴리리신 또는 폴리에틸렌이민과 복합체를 형성할 때 DC를 통해 SC로의 흡수를 향상시켰음을 보여준다.
핵산 작제물과 복합체를 형성하는 데 유용한 다중 양이온성 분자의 일 예는 세포 침투 펩티드(CPP)를 포함하고, 예로는 폴리리신(상기 설명됨), 폴리아르기닌 및 Tat 펩티드가 포함된다. 세포 침투 펩티드(CPP)는 DNA에 결합할 수 있는 작은 펩티드로, 일단 방출되면, 세포막을 침투하여 DNA가 엔도솜에서 세포질로 빠져나가는 것을 촉진한다. CPP의 또 다른 예는 MPG라고 하는 27개 잔기 키메라 펩티드에 관한 것으로, 얼마 전에 ss- 및 ds-올리고뉴클레오티드에 안정된 방식으로 결합하여 DNase에 의한 분해로부터 핵산을 보호하고, 시험관내에서 세포에 올리고뉴클레오티드를 효과적으로 전달하는 비공유 복합체를 생성하는 것으로 나타났다(Mahapatro A, et al., J Nanobiotechnol, 2011, 9:55). 복합체는 상이한 펩티드:DNA 비율, 및 10:1 및 5:1 비율(각각 150 nm 및 1 um)을 조사했을 때 대략 150 nm 대 1 um의 작은 입자를 형성했다. 또 다른 CPP는 변형된 테트라펩티드(구아니디노카보닐피롤(GCP) 기를 포함하는 테트라리신(TL-GCP))와 관련되며, 이는 6.2 kb 플라스미드 DNA에 높은 친화성으로 결합하여 700 nm 내지 900 nm의 양전하 응집체를 생성하는 것으로 보고되었다 Li et al., Agnew Chem Int Ed Enl 2015; 54(10):2941-4).
본원에 기재된 핵산 작제물과 복합체를 형성할 수 있는 다중 양이온성 분자의 다른 예는 JETPRIME® 및 생체내 JET(폴리푸스-트랜스펙션, 에스.에이.(Polypus-transfection, S.A.), 프랑스 일키르히(Illkirch) 소재)로 상업적으로 입수 가능한 다중 양이온성 중합체를 포함한다.
VI. 사용 방법 및 약제학적 조성물
본 발명의 항-CD39 항체는 암에 대한 면역요법과 같은 치료적 처리 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 응용에 유용하다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD39 항체는 면역 반응을 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상시키고, 종양 성장을 억제하고, 종양 용적을 감소시키고, 종양 퇴행을 유도하고, 종양 세포 아폽토시스를 증가시키고, 그리고/또는 종양의 종양원성을 감소시키는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-CD39 항체는 바이러스와 같은 병원체에 대한 면역요법에도 유용하다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD39 항체는 바이러스 감염 억제, 바이러스 감염 감소, 바이러스-감염된 세포 아폽토시스 증가 및/또는 바이러스-감염된 세포 사멸 증가에 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 방법일 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 항-CD39 항체를 사용하여 대상체에서 면역 반응을 활성화시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-CD39 항체를 사용하여 대상체에서 면역 반응을 촉진하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-CD39 항체를 사용하여 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-CD39 항체를 사용하여 대상체에서 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 세포-매개된 면역 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 Th1-유형 반응의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 T-세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 CD4+ T-세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 CD8+ T-세포 활성의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 CTL 활성의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 NK 세포 활성 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 T-세포 활성 증가 및 NK 세포 활성 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 CU 활성 증가 및 NK 세포 활성 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 Treg 세포의 억제 활성을 억제 또는 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 MDSC의 억제 활성을 억제 또는 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 기억 T-세포의 백분율의 수의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 장기 면역 기억 기능의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 장기 기억의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 실질적인 부작용 및/또는 면역-기반 독성의 증거가 없음을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응의 활성화, 촉진, 증가 및/또는 향상은 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 사이토카인 폭풍의 증거가 없음을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 항원 자극의 결과이다. 일부 구현예에서, 항원 자극은 종양 세포이다. 일부 구현예에서, 항원 자극은 암이다. 일부 구현예에서, 항원 자극은 병원체이다. 일부 구현예에서, 항원 자극은 바이러스-감염된 세포이다.
항-CD39 항체가 면역 반응을 조절, 활성화 또는 억제하는지 여부를 결정하기 위한 생체내 및 시험관내 검정은 당 업계에 공지되어 있거나 개발중에 있다.
본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 종양 재발 또는 종양 재성장을 억제하는 지속성 또는 장기 면역을 유도하는 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 항-CD39 항체를 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 종양은 고형 종양이다. 특정 구현예에서, 종양은 결장직장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 신경내분비계 종양, 위장 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 교모세포종, 림프종 및 두경부 종양으로 구성된 군으로부터 선택된 종양이다. 특정 구현예에서, 종양은 결장직장 종양이다. 특정 구현예에서, 종양은 난소 종양이다. 일부 구현예에서, 종양은 폐 종양이다. 특정 구현예에서, 종양은 췌장 종양이다. 특정 구현예에서, 종양은 흑색종 종양이다. 일부 구현예에서, 종양은 방광 종양이다.
일부 구현예에서, 종양은 액체 종양이다. 특정 구현예에서, 종양은 백혈병, 예컨대 골수성 또는 과립구성 백혈병, 림프성, 림프구성, 또는 림프모구성 백혈병, 및 진성 적혈구증가증 또는 적혈병이다. 일부 구현예에서, 종양은 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 작용제와 같이, 항-CD39 항체에 의해 표적화된 종양 항원을 발현시키거나 과발현시킨다.
본 발명은 치료적 유효량의 본원에 기재된 항-CD39 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체는 암의 성장을 억제하거나 감소시킨다.
본 발명은 치료적 유효량의 본원에 기재된 항-CD39 항체를 대상체(예를 들어, 치료가 필요한 대상체)에게 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 암성 종양이 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 종양이 제거되었다.
특정 구현예에서, 암은 결장직장암, 췌장암, 폐암, 난소암, 간암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위장암, 흑색종, 자궁경부암, 신경내분비계 암, 방광암, 뇌암, 교모세포종, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다. 특정 구현예에서, 암은 췌장암이다. 특정 구현예에서, 암은 난소암이다. 특정 구현예에서, 암은 결장직장암이다. 특정 구현예에서, 암은 유방암이다. 특정 구현예에서, 암은 전립선암이다. 특정 구현예에서, 암은 폐암이다. 특정 구현예에서, 암은 흑색종이다. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
본 발명은 본원에 기재된 항-CD39 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 항-CD39 항체 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 면역요법에서 사용된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 면역-종양학에서 사용된다. 일부 구현예에서, 조성물은 종양 성장을 억제하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 대상체(예를 들어, 인간 환자)에서 종양 성장을 억제하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 조성물은 암을 치료하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 대상체(예를 들어, 인간 환자)에서 암을 치료하는 데 사용된다.
제형은 본 발명의 정제된 제제를 약제학적으로 허용되는 비히클(예를 들어, 캐리어 또는 부형제)과 조합함으로써 저장 및 사용을 위해 제조된다. 당업자는 일반적으로 약제학적으로 허용되는 캐리어, 부형제 및/또는 안정화제를 제형 또는 약제학적 조성물의 비활성 성분으로 간주한다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체는 동결 건조되고 그리고/또는 동결 건조된 형태로 저장된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항-CD39 항체를 포함하는 제형은 동결 건조된다.
적합한 약제학적으로 허용되는 비히클에는 무독성 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 염 예컨대 염화나트륨; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥사놀, 3-펜타놀, 및 m-크레졸; 저분자량 폴리펩티드(예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 탄수화물 예컨대 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 나트륨; 금속 복합체 예컨대 Zn-단백질 복합체; 및 비이온성 계면활성제 예컨대 트윈(TWEEN) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London).
본 발명의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료를 위한 임의의 수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 표피 또는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말에 의한 국소 투여; 분무기, 기관내 및 비강내를 포함하여, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 주입에 의한 폐 투여; 경구 투여; 또는 정맥내, 동맥내, 종양내, 피하, 복강내, 근육내(예를 들어, 주사 또는 주입), 또는 두개내(예를 들어, 경막내 또는 심실내)를 포함하는 비경구 투여일 수 있다.
치료적 제형은 단위 투여 형태일 수 있다. 이러한 제형은 정제, 환약, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 물 또는 비-수성 매질 중의 현탁액, 또는 좌약을 포함한다. 정제와 같은 고체 조성물에서 주요 활성 성분은 약제학적 캐리어와 혼합된다. 통상적인 타정 성분은 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 인산이칼슘 또는 검, 및 희석제(예를 들어, 물)를 포함한다. 이들은 본 발명의 화합물 또는 이의 무독성 약제학적으로 허용되는 염의 균질한 혼합물을 함유하는 고체 예비 제형 조성물을 형성하는 데 사용될 수 있다. 이어서 고체 예비 제형 조성물은 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 제형 또는 조성물의 정제, 환약 등은 코팅되거나 그렇지 않으면 배합되어 장기간 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환약은 외부 성분으로 덮인 내부 조성물을 포함할 수 있다. 또한, 두 성분은 붕해를 막는 역할을 하고, 내부 성분이 위를 온전히 통과하거나 방출이 지연되도록 하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 이러한 장용 층 또는 코팅을 위한 다양한 물질이 사용될 수 있으며, 이러한 물질은 다수의 중합성 산 및 중합성 산과 셸락, 세틸 알코올 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.
항-CD39 항체는 또한 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 마이크로캡슐은, 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합, 예를 들어, 문헌(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London)에 기재된 바와 같이 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스페어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마이크로에멀젼에서 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된다.
특정 구현예에서, 약제학적 제형은 리포좀과 복합된 항-CD39 항체를 포함한다. 리포좀을 생산하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 정의된 기공 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경의 리포좀을 생성할 수 있다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체를 포함하는 지속-방출 제제를 생성할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항-CD39 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 여기서 매트릭스는 성형 물품(예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐) 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 하이드로겔 예컨대 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐 알코올), 폴리락티드, L-글루탐산과 7개의 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 마이크로스페어), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체를 투여하는 것 외에도, 이 방법 또는 치료는 적어도 하나의 추가 면역 반응 자극제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 면역 반응 자극제에는 집락 자극 인자(예를 들어, 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 줄기 세포 인자(SCF)), 인터류킨(예를 들어, IL-1, IL2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18), 체크포인트 억제제, 면역억제 기능을 차단하는 항체(예를 들어, 항-CTLA-4 항체, 항-CD28 항체, 항-CD3 항체), 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR4, TLR7, TLR9), 또는 B7 패밀리의 구성원(예를 들어, CD80, CD86)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 추가 면역 반응 자극제는 항-CD39 항체의 투여 전에, 동시에 및/또는 이후에 투여될 수 있다. 항-CD39 항체 및 면역 반응 자극제(들)를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 면역 반응 자극제는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 면역 반응 자극제를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체를 투여하는 것 외에도, 이 방법 또는 치료는 적어도 하나의 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 치료제는 항-CD39 항체의 투여 전에, 동시에 및/또는 이후에 투여될 수 있다. 항-CD39 항체 및 추가 치료제(들)를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가 치료제는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 추가 치료제를 포함한다.
2개 이상의 치료제와의 조합 요법은 종종 상이한 작용 메커니즘에 의해 작동하는 제제를 사용하지만, 필수는 아니다. 작용 기전이 다른 제제를 사용하는 조합 요법은 부가적 또는 시너지 효과를 초래할 수 있다. 조합 요법은 단일요법에서 사용되는 것보다 더 낮은 용량의 각 제제를 허용할 수 있으며, 이에 따라 독성 부작용을 감소시키고 그리고/또는 항-CD39 항체의 치료 지수를 증가시킬 수 있다. 조합 요법은 내성 암 세포가 발생할 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 조합 요법은 면역 반응에 영향을 주는(예를 들어, 반응을 향상시키거나 활성화하는) 치료제 및 종양/암 세포에 영향을 주는(예를 들어, 억제하거나 사멸시키는) 치료제를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 항-CD39 항체와 적어도 하나의 추가 치료제의 조합은 부가적 또는 시너지 효과를 초래한다. 일부 구현예에서, 조합 요법은 항-CD39 항체의 치료 지수를 증가시킨다. 일부 구현예에서, 조합 요법은 추가 치료제(들)의 치료 지수를 증가시킨다. 일부 구현예에서, 조합 요법은 항-CD39 항체의 독성 및/또는 부작용을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 조합 요법은 추가 치료제(들)의 독성 및/또는 부작용을 감소시킨다.
유용한 부류의 치료제는, 예를 들어, 항-튜불린 제제, 아우리스타틴, DNA 작은 홈 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제(예를 들어, 백금 복합체 예컨대 시스플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 삼핵 백금 복합체 및 카보플라틴), 안트라사이클린, 항생제, 항-폴레이트, 대사 길항 물질, 화학요법 감작제, 듀오카르마이신, 에토포시드, 플루오르화 피리미딘, 이온운반체, 렉시트롭신, 니트로소우레아, 플라티놀, 퓨린 대사 길항 물질, 퓨로마이신, 방사선 감작제, 스테로이드, 탁산, 토포이소머라아제 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 치료제는 알킬화제, 대사 길항 물질, 항유사분열제, 토포이소머라아제 억제제, 또는 혈관신생 억제제이다.
본원에 기재된 항-CD39 항체와 함께 투여될 수 있는 치료제는 화학요법제를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 이 방법 또는 치료는 항-CD39 항체를 화학요법제와 조합하여 또는 화학요법제의 칵테일과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 항-CD39 항체를 사용한 치료는 화학요법의 투여 이전에, 동시에 또는 이후에 발생할 수 있다. 병용 투여는 단일 약제학적 제형으로 또는 별도의 제형을 사용하는 공동-투여, 또는 임의의 순서로 그러나 일반적으로 모든 활성제가 동시에 생물학적 활성을 발휘할 수 있는 기간 내에 연속 투여를 포함할 수 있다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 스케줄은 제조업체의 지침에 따라 또는 숙련된 의사가 경험적으로 결정한 대로 사용될 수 있다. 이러한 화학요법을 위한 제조 및 투여 스케줄은 또한 문헌(The Chemotherapy Source Book, 4.sup.th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa)에 기재되어 있다.
본 발명에 유용한 화학요법제에는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 사이클로스포스파미드(cyclosphosphamide)(사이톡산); 알킬 설포네이트 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드(triethylenethiophosphaoramide) 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리키아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, ??라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 대사 길항 물질 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시토신 아라비노시드, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제 예컨대 폴리닌산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트랙세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드(Ara-C); 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(탁솔) 및 도세탁셀(탁소테레); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈(젤로다); 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 화학요법제는 또한 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타아제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(파레스톤)을 포함하는 항-에스토로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤라이드, 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체와 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 시스플라틴이다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 카보플라틴이다.
본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 화학요법제는 토포이소머라아제 억제제이다. 토포이소머라아제 억제제는 토포이소머라아제 효소(예를 들어, 토포이소머라아제 I 또는 II)의 작용을 방해하는 화학요법 제제이다. 토포이소머라아제 억제제에는 독소루비신 HCl, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCl, 악티노마이신 D, 에토포시드, 토포테칸 HCl, 테니포시드(VM-26), 및 이리노테칸, 뿐만 아니라 이들 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 화학요법제는 대사 길항 물질이다. 대사 길항 물질은 정상적인 생화학적 반응에 필요한 대사 물질과 유사한 구조를 가진 화학 물질이지만, 세포 분열과 같은 세포의 하나 이상의 정상적인 기능을 방해할 만큼 충분히 다르다. 대사 길항 물질에는 젬시타빈, 플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트 나트륨, 랄리트렉세드, 페메트렉세드, 테가푸르, 시토신 아라비노시드, 티오구아닌, 5-아자시티딘, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트, 및 클라드리빈, 뿐만 아니라 이들 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염,산 또는 유도체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 화학요법제는 튜불린에 결합하는 제제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 항유사분열제이다. 일부 구현예에서, 제제는 탁산이다. 특정 구현예에서, 제제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체이다. 특정 구현예에서, 제제는 파클리탁셀(탁솔), 도세탁셀(탁소테레), 알부민-결합된 파클리탁셀(nab-파클리탁셀; 아브락산), DHA-파클리탁셀, 또는 PG-파클리탁셀이다. 특정 대안적인 구현예에서, 항유사분열제는 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 또는 빈데신, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항유사분열제는 키네신 Eg5의 억제제 또는 오로라(Aurora) A 또는 Plk1과 같은 유사분열 키나제의 억제제이다.
본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 대상 항-CD39 제제는 종양에서 ATP의 방출을 유도하고 그리고/또는 종양내에서 CD39 또는 CD73의 상향 조절을 유발하는 화학요법제와 더 큰 조합 효과(아마도 심지어 상승 작용)를 가질 것으로 예상된다. 안트라사이클린(예컨대 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신 및 이다루비신), 백금-기반 약물(예컨대 시스플라틴, 카보플라틴, 및 옥살리플라틴), 및 프로테아좀 억제제(예컨대 보르테조밉)와 같은(이에 제한되지 않음), ATP를 세포외 공간으로 방출시켜 종양 세포 사멸을 유도하는 다양한 화학요법제가 있다. 방사선요법 및 광역학 요법(PDT)도 ATP 방출 및/또는 CD39 및/또는 CD73의 종양내 수준의 상향 조절을 초래할 수 있다.
본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 추가 치료제는 소분자와 같은 제제를 포함한다. 예를 들어, 치료는 EGFR, HER2 (ErbB2) 및/또는 VEGF를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 종양-관련 항원에 대한 억제제로서 작용하는 소분자와 항-CD39 항체의 병용 투여를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체는 게피티닙(이레사(IRESSA)), 에를로티닙(타르세바(TARCEVA)), 수니티닙(수텐트(SUTENT)), 라파타닙, 반데타닙(자크티마(ZACTIMA)), AEE788, CI-1033, 세디라닙(레센틴(RECENTIN)), 소라페닙(넥사바르(NEXAVAR)), 및 파조파닙(GW786034B)으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 키나제 억제제와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 mTOR 억제제를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 추가 치료제는 암 줄기 세포 경로를 억제하는 소분자이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 Notch 경로의 억제제이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 Wnt 경로의 억제제이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 BMP 경로의 억제제이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 Hippo 경로의 억제제이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 mTOR/AKR 경로의 억제제이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 RSPO/LGR 경로의 억제제이다.
본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 추가 치료제는 항체와 같은 생물학적 분자를 포함한다. 예를 들어, 치료는 EGFR, HER2/ErbB2 및/또는 VEGF에 결합하는 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 종양-관련 항원에 대한 항체와 항-CD39 항체의 병용 투여를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 암 줄기 세포 마커에 특이적인 항체이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 Notch 경로의 구성 요소에 결합하는 항체이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 Wnt 경로의 구성 요소에 결합하는 항체이다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 암 줄기 세포 경로를 억제하는 항체이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 Notch 경로의 억제제이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 Wnt 경로의 억제제이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 BMP 경로의 억제제이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 β-카테닌 시그널링을 억제하는 항체이다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 혈관신생 억제제인 항체(예를 들어, 항-VEGF 또는 VEGF 수용체 항체)이다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 베바시주맙(아바스틴(AVASTIN)), 라무시루맙, 트라스투주맙(허셉틴(HERCEPTIN)), 퍼투주맙(옴니타르그(OMNITARG)), 파니투무맙(베크티빅스(VECTIBIX)), 니모투주맙, 잘루투무맙, 또는 세툭시맙(어비툭스(ERBITUX))이다.
I/O 조합 - 대표적인 체크포인트 억제제 및 공동 자극 작용제
본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 추가 치료제는 면역 반응을 조절하는 항체이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 및 항-TIM-3 항체 또는 항-TIGIT 항체이다.
예를 들어, 요법은 면역 체크포인트 분자의 억제제 또는 공동 자극 분자의 활성화제, 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 면역 체크포인트의 예시적인 억제제는 PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, CEACAM, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, NLRP1, NRLP3, STING 또는 TGFR 베타 중 하나 이상의 억제제를 포함한다. 공동 자극 분자의 예시적인 활성화제는 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 또는 CD83 리간드 중 하나 이상의 작용제를 포함한다. 면역 체크포인트의 예시적인 억제제 및 공동 자극 분자의 예시적인 활성화제는 본원에 참조로 포함된 PCT 공보 WO 2016/054555에서 찾을 수 있다.
PD-1 길항제
PD-1 유전자는 Ig 유전자 상과의 일부인 55 kDa 유형 I 막 관통 단백질이다(Agata et al. (1996) Int Immunol 8:765-72). PD-1은 막 근위 면역수용체 티로신 억제 모티프(ITIM) 및 막 원위 티로신-기반 스위치 모티프(ITSM)를 포함한다(Thomas, M.L. (1995) J Exp Med 181 :1953-6; Vivier, E and Daeron, M (1997) Immunol Today 18:286-91). PD-1에 대한 2개의 리간드인, PD-L1 및 PD-L2가 식별되었으며, 이는 PD-1에 결합할 때 T 세포 활성화를 하향 조절하는 것으로 나타났다(Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1과 PD-L2는 둘 다 PD-1에 결합하지만 다른 CD28 계열 구성원에는 결합하지 않는 B7 동족체이다. PD-L1은 다양한 인간 암에서 풍부하다(Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). PD-1과 PD-L1의 상호작용은 종양 침윤 림프구 감소, T-세포 수용체 매개된 증식 감소, 및 암세포에 의한 면역감시 회피를 초래한다(Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307- 314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). 면역 억제는 PD-1과 PD-L1의 국소 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있으며, PD-1과 PD-L2의 상호작용도 차단될 때 효과가 부가적이다(Iwai et al. (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99:12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170: 1257-66).
본원에 사용된 용어 "예정된 사멸 1", "예정된 세포 사멸 1", "단백질 PD-1", "PD-1", PD1", "PDCD1", "hPD-1" 및 "hPD-I"는 상호 교환적으로 사용되며, 인간 PD-1의 변이체, 이소형, 종 동족체(species homologs), 및 인간 PD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 완전한 인간 PD-1 서열은 진뱅크 수탁 번호 U64863에서 찾을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "예정된 세포 사멸 1 리간드 1", "PD-L1", " PD11", "PDCD1L1", "PDCD1LG1", "CD274", "B7 동족체 1", "B7-H1", "B7-H", 및 "B7H1"은 상호 교환적으로 사용되며, 인간 PD1-1의 변이체, 이소형, 종 동족체, 및 인간 PD1-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 완전한 인간 PD-L1 아미노산 서열(이소형 a 전구체)은 진뱅크 수탁 번호 NP_054862.1에서 찾을 수 있다. 완전한 인간 PD-L1 아미노산 서열(이소형 b 전구체)은 진뱅크 수탁 번호 NP_001254635.1에서 찾을 수 있다.
용어 "PD-1 축 결합 길항제"는 PD-1 축 결합 파트너와 이의 결합 파트너 중 하나 이상과의 상호작용을 억제하여 PD-1 시그널링 축 상의 시그널링으로 인한 T-세포 기능 장애를 제거하고, 결과적으로 T-세포 기능(예를 들어, 증식, 사이토카인 생산, 표적 세포 사멸)을 회복 또는 향상시키는 분자이다. 본원에 사용된 바와 같이, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제를 포함한다.
용어 "PD-1 결합 길항제"는 PD-1과 이의 결합 파트너, 예컨대 PD-L1, PD-L2 중 하나 이상과의 상호작용으로 인한 신호 전달을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 분자이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 이의 결합 파트너와 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 PD-1의 결합을 억제한다. 예를 들어, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신(immunoadhesin), 융합 단백질, 올리고펩티드, 및 PD-1과 PD-L1 및/또는 PD-L2의 상호작용으로 인한 신호 전달을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 기타 분자를 포함한다. 일 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1을 통해 시그널링 매개된 T 림프구에서 발현되는 세포 표면 단백질에 의해 또는 이를 통해 매개되는 음성 공동 자극 신호를 감소시켜 기능 장애 T-세포가 덜 기능 장애가 되도록 만든다(예를 들어, 항원 인식에 대한 이펙터 반응 향상). 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체이다. 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 MDX-1106이다. 또 다른 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 머크(Merck) 3745이다. 또 다른 특정 양태에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 CT-011이다.
용어 "PD-L1 결합 길항제"는 PD-L1과 이의 결합 파트너, 예컨대 PD-1, B7-1 중 하나 이상과의 상호작용으로 인한 신호 전달을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 분자이다. 일부 구현예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 이의 결합 파트너와 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-1 및/또는 B7-1에 대한 PD-L1의 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, PD-L1 결합 길항제는 항-PD-L1 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질, 올리고펩티드, 및 PD-L1과 이의 결합 파트너, 예컨대 PD-1, B7-1 중 하나 이상의 상호작용으로 인한 신호 전달을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 기타 분자를 포함한다. 일 구현예에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1을 통해 시그널링 매개된 T 림프구에서 발현되는 세포 표면 단백질에 의해 또는 이를 통해 매개되는 음성 공동 자극 신호를 감소시켜 기능 장애 T-세포가 덜 기능 장애가 되도록 만든다(예를 들어, 항원 인식에 대한 이펙터 반응 향상). 일부 구현예에서, PD-L1 결합 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 특정 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 YW243.55.S70이다. 또 다른 특정 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 MDX-1105이다. 또 다른 특정 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 MPD13280A이다.
용어 "PD-L2 결합 길항제"는 PD-L2와 이의 결합 파트너, 예컨대 PD-1 중 하나 이상의 상호작용으로 인한 신호 전달을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 분자이다. 일부 구현예에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2가 이의 결합 파트너와 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-1에 대한 PD-L2의 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, PD-L2 길항제는 항-PD-L2 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질, 올리고펩티드, 및 PD-L2와 이의 결합 파트너, 예컨대 PD-1 중 하나 이상의 상호작용으로 인한 신호 전달을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 기타 분자를 포함한다. 일 구현예에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2를 통해 시그널링 매개된 T 림프구에서 발현되는 세포 표면 단백질에 의해 또는 이를 통해 매개되는 음성 공동 자극 신호를 감소시켜 기능 장애 T-세포가 덜 기능 장애가 되도록 만든다(예를 들어, 항원 인식에 대한 이펙터 반응 향상). 일부 구현예에서, PD-L2 결합 길항제는 면역어드헤신이다.
PD-1 경로: PD-1 경로의 구성원은 모두 PD-1 시그널링과 관련된 단백질이다. 한편으로 이는, 예를 들어, PD-1, PD-L1 및 PD-L2의 리간드 및 신호 전달 수용체 PD-1과 같이 PD-1의 상류에서 PD-1 시그널링을 유도하는 단백질일 수 있다. 다른 한편, 이는 PD-1 수용체의 하류에 있는 신호 전달 단백질일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 PD-1 경로의 구성원으로서 특히 바람직한 것은 PD-1, PD-L1 및 PD-L2이다.
PD-1 경로 억제제: 본 발명의 맥락에서, PD-1 경로 억제제는 바람직하게는 PD-1 경로 시그널링, 바람직하게는 PD-1 수용체에 의해 매개되는 시그널링을 손상시킬 수 있는 화합물로서 본원에서 정의된다. 따라서, PD-1 경로 억제제는 PD-1 경로 시그널링을 길항할 수 있는 PD-1 경로의 임의의 구성원에 대한 임의의 억제제일 수 있다. 이러한 맥락에서, 억제제는 바람직하게는 PD-1 수용체, PD-L1 또는 PD-L2에 대한 PD-1 경로의 임의의 구성원을 표적화하는 본원에 정의된 길항 항체일 수 있다. 이 길항 항체는 또한 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 이러한 인코딩된 항체는 또한 본원에 정의된 바와 같이 "인트라바디"라고도 불린다. 또한, PD-1 경로 억제제는 PD-1 수용체의 단편이거나 PD1 리간드의 활성을 차단하는 PD1 - 수용체일 수 있다. B7-1 또는 이의 단편은 PD1 - 억제 리간드로도 작용할 수 있다. 또한, PD-1 경로 억제제는 si NA(작은 간섭 RNA) 또는 PD-1 경로의 구성원, 바람직하게는 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2에 대한 안티센스 RNA일 수 있다. 추가로, PD-1 경로 억제제는, 예를 들어, PD-1 및 B7-H1 또는 B7-DL 상호작용을 억제함으로써 PD-1에 결합할 수 있지만 PD-1 시그널링을 방지할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 단백질(또는 이를 코딩하는 핵산)일 수 있다. 추가로, PD-1 경로 억제제는 PD-1 경로 시그널링을 억제할 수 있는 소분자 억제제, 예를 들어, PD-1 결합 펩티드 또는 작은 유기 분자일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 PD-1 길항제는 PD-1의 리간드에 결합하여 PD-1 수용체에 대한 하나 이상의 리간드의 결합을 방해, 감소 또는 억제하거나, PD-1 수용체를 통한 신호 전달에 관여하지 않고 PD-1 수용체에 직접 결합하는 제제를 포함한다. 일 구현예에서, PD-1 길항제는 PD-1에 직접 결합하여 PD-1 억제 신호 전달을 차단한다. 또 다른 구현예에서, PD-1 길항제는 PD-1의 하나 이상의 리간드(예를 들어, PD-L1 및 PD-L2)에 결합하여 리간드(들)가 PD-1을 통한 억제 신호 전달을 유발하는 것을 감소시키거나 억제한다. 일 구현예에서, PD-1 길항제는 PD-L1에 직접 결합하여 PD-L1이 PD-1에 결합하는 것을 억제 또는 방지하여 PD-1 억제 신호 전달을 차단한다.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용된 PD-1 길항제는 PD-1 결합 스캐폴드 단백질을 포함하며, PD-리간드, 항체 및 다가 제제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 길항제는 융합 단백질, 예컨대 AMP-224이다. 또 다른 구현예에서, 길항제는 항-PD-1 항체("PD-1 항체")이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 항-인간-PD-1 항체(또는 이로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)는 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 당 업계에서 인정된 항-PD-1 항체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체 MK-3475 또는 CT-011을 사용할 수 있다. 추가로, WO 2006/121168(이의 교시는 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 모노클로날 항체 5C4, 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3, 및 5F4를 사용할 수 있다. PD-1과의 결합에 대해 임의의 이러한 당 업계에서 인정된 항체와 경쟁하는 항체를 사용할 수도 있다.
또 다른 구현예에서, PD-1 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 항-인간-PD-L1 항체(또는 이로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)는 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 당 업계에서 인정된 항-PD-L1 항체를 사용할 수 있다. 예를 들어, MEDI4736(항-B7-Hl로도 공지됨) 또는 MPD13280A(RG7446으로도 공지됨)를 사용할 수 있다. 추가로, WO 2007/005874 및 미국 특허 번호 7,943,743(이들의 교시는 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 모노클로날 항체 12A4, 3G10, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7, 및 13G4를 사용할 수 있다. PD-L1과의 결합에 대해 임의의 이러한 당 업계에서 인정된 항체와 경쟁하는 항체를 사용할 수도 있다.
예시적인 항-PD-L1 항체는 12A4이다(WO 2007/005874 및 미국 특허 번호 7,943,743). 일 구현예에서, 항체는 12A4의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 항체는 서열 번호: 1로 나타낸 서열을 갖는 12A4의 VH 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인, 및 서열 번호: 3으로 나타낸 서열을 갖는 12A4의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 각각 서열 번호: 5, 6, 및 7에 제시된 서열을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열 번호: 8, 9, 및 10에 제시된 서열을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 각각 서열 번호: 1 및/또는 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 12A4의 VH 및/또는 VL 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 각각 서열 번호: 2 및/또는 서열 번호: 4에 제시된 핵산 서열에 의해 인코딩된 중쇄 가변(VH) 및/또는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기-언급된 항체와 같이 PD-L1 상의 동일한 에피토프와의 결합에 대해 경쟁하고, 그리고/또는 이에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기-언급된 항체와 적어도 약 90% 가변 영역 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 3과 적어도 약 90%, 95% 또는 99% 가변 영역 동일성 12A4)을 갖는다.
항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체는 각각 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M 또는 그 이하의 KD로 PD-1 또는 PD-L1에 결합할 수 있다.
일 구현예에서, PD-1 억제제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 또는 피딜리주맙으로부터 선택된 항-PD-1 항체이다. 바람직한 PD-1 억제제는 니볼루맙이다.
일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙이다. 니볼루맙의 다른 명칭은 MDX- 1106, MDX-1106-04, ONO-4538, 또는 BMS-936558을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙(CAS 등록 번호: 946414-94-4)이다. 니볼루맙은 PD1을 특이적으로 차단하는 완전한 인간 IgG4 모노클로날 항체이다. 니볼루맙(클론 5C4) 및 PD1에 특이적으로 결합하는 다른 인간 모노클로날 항체는 US 8,008,449(참조로 포함됨) 및 WO 2006/121168(참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 다른 구현예에서, 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙이다. 펨브롤리주맙(상표명 키트루다(KEYTRUDA) 이전에는 람브롤리주맙, Merck 3745, MK-3475 또는 SCH- 900475로도 공지되어 있음)은 PD1에 결합하는 인간화된 IgG4 모노클로날 항체이다. 펨브롤리주맙은, 예를 들어, 문헌(Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44), WO 2009/114335(참조로 포함됨), 및 US 8,354,509(참조로 포함됨)에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 피딜리주맙이다. 피딜리주맙(CT-011; 큐어 테크(Cure Tech))은 PD1에 결합하는 인간화된 IgGlk 모노클로날 항체이다. 피딜리주맙 및 다른 인간화된 항-PD-1 모노클로날 항체는 WO2009/101611에 개시되어 있다. 다른 항-PD1 항체는 US 8,609,089, US 2010028330, 및/또는 US 20120114649에 개시되어 있다. 다른 항-PD1 항체는 AMP 514(앰플리뮨(Amplimmune))를 포함한다.
일부 구현예에서, PD-1 억제제는 면역어드헤신(예를 들어, 불변 영역(예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역어드헤신)이다. 일부 구현예에서, PD-1 억제제는 AMP-224이다. 일부 구현예에서, PD-L1 억제제는 항-PD-L1 항체이다. 일부 구현예에서, 항-PD-L1 억제제는 YW243.55.S70, MPD13280A, MEDI-4736, MSB-0010718C, 또는 MDX-1105이다.
일 구현예에서, PD-L1 억제제는 MDX-1105이다. BMS-936559로도 공지된 MDX-1105는 WO 2007/005874에 기재된 항-PD-L1 항체이다. 일 구현예에서, PD-L1 억제제는 YW243.55.S70이다. YW243.55.S70 항체는 WO 2010/077634(참조로 포함됨)에 기재된 항-PD-L1이다(각각 서열 번호 20 및 21로 나타낸 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열).
일 구현예에서, PD-L1 억제제는 MDPL3280A(제넨테크(Genentech)/로슈(Roche))이다. MDPL3280A는 PD-L1에 결합하는 인간 Fc 최적화된 IgGl 모노클로날 항체이다. MDPL3280A 및 PD-L1에 대한 다른 인간 모노클로날 항체는 미국 특허 번호 7,943,743(참조로 포함됨) 및 미국 공개 번호 2012/0039906(참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 다른 구현예에서, PD-L2 억제제는 AMP-224이다. AMP-224는 PD1과 B7-H1 사이의 상호작용을 차단하는 PD-L2 Fc 융합 가용성 수용체이다(B7-DCIg; 앰플리뮨; 예를 들어, WO 2010/027827(참조로 포함됨) 및 WO 2011/066342(참조로 포함됨)에 개시됨).
특정 구현예에서, PD-1 경로 억제제는 PD-1 경로 시그널링의 소분자 길항제이다. 이러한 소분자 길항제는 PD-1, PD-1L 및/또는 PD-1L2 중 하나 이상에 결합하여 PD-1과 PD-1L1 및/또는 PD-1L2의 상호작용을 억제하는 제제를 포함한다.
PD-1 경로 시그널링의 예시적인 소분자 길항제는, 그 중에서도, 공개된 미국 출원 2014/0294898 및 2014/0199334, 및 공개된 PCT 출원 WO 2013/132317 및 WO 2012/168944에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
단지 예시를 위해, 대상 조합 요법은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 소분자 길항제로 실행될 수 있다:
Figure pct00001
다른 구현예에서, 소분자 길항제는 하기 일반식 또는 이의 레트로 유사체 또는 약제학적으로 허용되는 입체 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 표현된다.
Figure pct00002
식 중,
R1은 Ser의 유리 C-말단 또는 아미드화된 C-말단이고;
L은 -NH(CH2)nNH- 또는 -NH(CH2CH2O)nNH-로부터 선택된 링커이고;
R4는 수소, 아미노(C1-C20)알킬, -NHCOCH3 또는 -NHCONH2로부터 선택됨.
또 다른 구현예에서, 소분자 길항제는 하기 일반식 또는 이의 레트로 유사체 또는 약제학적으로 허용되는 입체 이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 표현된다.
Figure pct00003
식 중,
R1은 Ser의 N-말단; 또는 Ser의 하이드록실 기 또는 아미노 기로 치환된 (C1-C20)아실이고;
L은 ―NH(CH2)nNH―, ―NH(CH2)nCH(NH2)CO―, ―OOC(CH2)mCOO―, ―NH(CH2)nCO―, ―NH(CH2CH2O)nNH―, ―NH(CH2CH2O)nCO― 또는 ―CO(CH2CH2O)nCO―로부터 선택된 링커이고;
R2는 Am2의 유리 C-말단, 아미드화된 C-말단 또는 N-말단; 또는 Y―R5이고;
Y는 ―OOC(CH2)mCOO―, ―CO(CH2)nNH―, ―CO(CH2CH2O)nNH― 또는 ―COCH2(OCH2CH2)nNH―로부터 선택된 선택적인 링커이고;
R5는　말레이미도 프로피온산과 같은 알부민 결합 모이어티이고;
R3은 OH 또는 NH2이고;
R4는 Phe의 페닐 기 상의 치환체이고, 수소, 아미노(C1-C20)알킬, ―NHCOCH3 또는 ―NHCONH2로부터 선택되고;
n은 2 이상 10 이하로부터 선택된 값을 갖는 정수이고;
m은 0 이상 8 이하로부터 선택된 값을 갖는 정수이고;
Ser-Asn, Asn-Thr 또는 Thr-Ser의 펩티드 결합(―CONH―) 중 하나는
Figure pct00004
의 변형된 펩티드 결합으로 대체될 수 있고
여기서 Q는 수소, ―CO(C1-C20)알킬 또는 ―COO(C1-C20)알킬 기이고; 여기서 하나 이상의 또는 모든 아미노산은 D-배열일 수 있음.
예를 들어, 소분자 길항제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
CTLA -4 길항제
특정 구현예에서, 본원에 기재된 조합은 또한 CTLA-4 억제제를 포함한다. 예시적인 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맙(화이자(Pfizer)로부터 입수 가능한 IgG2 모노클로날 항체, 이전에는 티실리무맙으로 공지됨, CP-675,206); 및 이필리무맙(CTLA-4 항체, MDX-010로도 공지됨, CAS 번호 477202-00-9)을 포함한다.
본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙(또는 이의 항원-결합 단편)에 관한 정보는 US 6,682,736(참조로 포함됨)(여기서 11.2.1로 지칭됨)에서 찾을 수 있으며, 이의 개시는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 트레멜리무맙(CP-675,206, CP-675, CP-675206 및 티실리무맙으로도 공지됨)은 CTLA-4에 대해 매우 선택적이고, CTLA-4가 CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)에 결합하는 것을 차단하는 인간 IgG2 모노클로날 항체이다. 시험관내에서 면역 활성화를 유발하는 것으로 나타났으며 트레멜리무맙으로 치료받은 일부 환자는 종양 퇴행을 나타냈다.
본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙은 중쇄 및 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 본원에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 상기 본원에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 상기 본원에 나타낸 카밧(Kabat)-정의된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상기 본원에 나타낸 카밧-정의된 DR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함한다. 당업자는 초티아(Chothia)-정의된, Abm-정의된 또는 당업자에게 공지된 다른 CDR 정의를 쉽게 식별할 수 있을 것이다. 특정 양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙 또는 이의 항원-결합 단편은 US 6,682,736(이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같은 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 하기 화학식의 화합물을 포함하는, 문헌(Huxley et al. 2004 Cell Chemical Biology 11:1651-1658)에 기재된 바와 같은 CTLA-4의 소분자 억제제를 이용하는 것을 고려한다:
Figure pct00011
다른 소분자 CTLA-4 길항제는 하기를 포함한다:
Figure pct00012
일 구현예에서, 조합은 면역-DASH 억제제, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항-PD-1 항체 분자, 및 항-CTLA-4 항체, 예를 들어 이필리무맙을 포함한다. 사용될 수 있는 예시적인 용량은 약 1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 예를 들어 3 mg/kg의 항-PD-1 항체 분자 용량, 및 약 3 mg/kg의 항-CTLA-4 항체, 예를 들어, 이필리무맙 용량을 포함한다.
다른 예시적인 항-CTLA-4 항체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,811,097에 개시되어 있다.
본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 추가 치료제는 면역 반응을 조절하는 항체이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 항-PD-1 항체, 항-LAG-3 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM-3 항체, 또는 항-TIGIT 항체이다.　
일부 구현예에서, LAG3 항체는 IMP701, IMP731, BMS-986016, LAG525, 및 GSK2831781이다. 일부 구현예에서, LAG3 길항제는 가용성 LAG3 수용체, 예를 들어, IMP321을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 반응 자극제는 CD28 작용제, 4-1BB 작용제, OX40 작용제, CD27 작용제, CD80 작용제, CD86 작용제, CD40 작용제, 및 GITR 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, OX40 작용제는 OX40 리간드, 또는 이의 OX40-결합 부분을 포함한다. 예를 들어, OX40 작용제는 MEDI6383일 수 있다. 일부 구현예에서, OX40 작용제는 OX40에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 구현예에서, OX40에 결합하는 항체는 MEDI6469, MEDI0562, 또는 MOXR0916(RG7888)이다. 일부 구현예에서, OX40 작용제는 OX40 리간드를 발현시킬 수 있는 벡터(예를 들어, 발현 벡터 또는 바이러스, 예컨대 아데노바이러스)이다. 일부 구현예에서 OX40-발현 벡터는 델타-24-RGDOX 또는 DNX2401이다.
일부 구현예에서, 4-1BB(CD137) 작용제는 결합 분자, 예컨대 안티칼린이다. 일부 구현예에서, 안티칼린은 PRS-343이다. 일부 구현예에서, 4-1BB 작용제는 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 구현예에서, 4-1BB에 결합하는 항체는 PF-2566(PF-05082566) 또는 우렐루맙(BMS-663513)이다.
일부 구현예에서, CD27 작용제는 CD27에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 구현예에서, CD27에 결합하는 항체는 발리루맙(CDX-1127)이다.
일부 구현예에서, GITR 작용제는 GITR 리간드 또는 이의 GITR-결합 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, GITR 작용제는 GITR에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 구현예에서, GITR에 결합하는 항체는 TRX518, MK-4166 또는 INBRX-110이다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 STING 작용제, 바람직하게는 약제학적 조성물의 일부와 조합된다. 사이클릭-디-뉴클레오티드(CDN) 사이클릭-디-AMP(리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 다른 박테리아에 의해 생산됨) 및 이의 유사체 사이클릭-디-GMP 및 사이클릭-GMP-AMP는 숙주 세포에 의해 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)으로 인식되어 인터페론 유전자의 자극 인자(STING)로 알려진 병원체 인식 수용체(PRR)에 결합한다. STING은 숙주 포유동물 세포의 세포질에 있는 어댑터 단백질로, TANK 결합 키나제(TBK1)-IRF3 및 NF-κB 시그널링 축을 활성화하여 IFN-γ 및 선천 면역을 강하게 활성화하는 기타 유전자 산물을 유도한다. 이제 STING은 숙주 세포질 감시 경로의 구성 요소로(Vance et al., 2009), 세포내 병원균에 의한 감염을 감지하고 이에 반응하여 IFN-γ의 생성을 유도하여 두 항원-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포뿐만 아니라 병원체-특이적 항체로 이루어진 적응성 보호 병원체-특이적 면역 반응이 발생하는 것으로 인식된다(미국 특허 번호 7,709,458 및 7,592,326; PCT 공보 번호 WO2007/054279, WO2014/093936, WO2014/179335, WO2014/189805, WO2015/185565, WO2016/096174, WO2016/145102, WO2017/027645, WO2017/027646, 및 WO2017/075477; 및 Yan et al., Bioorg. Med. Chem Lett. 18:5631-4, 2008).
예시적인 조합
바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암 및 림프종으로부터 선택된 암의 치료에서 항-CD39 항체와 항종양 백금 배위 복합체의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트(BBR3464), 사트라플라틴, 테트라플라틴, 오르미플라틴, 이프로플라틴, 네다플라틴 및 로바플라틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암으로부터 선택된 암의 치료에서 특히 바람직한 것은 항-CD39 항체와 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트, 사트라플라틴, 테트라플라틴, 오르미플라틴, 이프로플라틴, 네다플라틴 및 로바플라틴의 조합이며, 더욱 더 바람직한 것은 시스플라틴 및 옥살리플라틴과의 조합이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 악성 흑색종, 방광 암종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 식도암, 뇌암, 항문암, 백혈병 및 림프종으로부터 선택된 암의 치료에서 항-CD39 항체와 대사 길항 물질의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 시타라빈, 카페시타빈, 데시타빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 클라드리빈, 클로파라빈, 머캅토퓨린, 펜토스타틴, 및 티오구아닌을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 것은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암, 백혈병 및 림프종으로부터 선택된 암의 치료에서 항-CD39 항체와 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 시타라빈, 카페시타빈, 데시타빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 클라드리빈, 클로파라빈, 머캅토퓨린, 펜토스타틴, 및 티오구아닌의 조합이고, 더욱 더 바람직한 것은 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 시타라빈 및 메토트렉세이트와의 조합이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 전립선암, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암, 백혈병, 및 림프종으로부터 선택된 암의 치료에서 항-CD39 항체와 유사분열 억제제의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 및 비노렐빈을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 전립선암, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암으로부터 선택된 암의 치료에서 특히 바람직한 것은 항-CD39 항체와 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 및 비노렐빈의 조합이고, 더욱 더 바람직한 것은 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴 및 비노렐빈과의 조합이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 악성 흑색종, 방광 암종, 전립선암, 췌장 암종, 갑상선암, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 신경모세포종, 뇌암, 항문암, 고환암, 백혈병, 다발성 골수종 및 림프종의 치료에서 항-CD39 항체와 항암 항생제의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 픽산트론, 발루비신, 미토마이신 C, 블레오마이신, 악티노마이신 A 및 미트라마이신을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암, 백혈병 및 림프종의 치료에서 특히 바람직한 것은 항-CD39 항체와 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 픽산트론, 발루비신, 미토마이신 C, 블레오마이신, 악티노마이신 D 및 미트라마이신의 조합이고, 더욱 더 바람직한 것은 다우노루비신, 독소루비신, 미토마이신 C 및 악티노마이신 D와의 조합이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 신경모세포종, 뇌암, 자궁경부암, 고환암, 백혈병 및 림프종의 치료에서 항-CD39 항체와 토포이소머라아제 I 및/또는 II 억제제의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 토포테칸, SN- 38, 이리노테칸, 캄프토테신, 루비테칸, 에토포시드, 암사크린 및 테니포시드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 및 뇌암의 치료에서 특히 바람직한 것은 PM00104, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 토포테칸, SN-38, 이리노테칸, 캄프토테신, 루비테칸, 에토포시드, 암사크린 및 테니포시드의 조합이고, 더욱 더 바람직한 것은 토포테칸, 이리노테칸 및 에토포시드와의 조합이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 간세포암, 결장직장암, 뇌암, 다발성 골수종 및 림프종의 치료에서 항-CD39 항체와 프로테아좀 억제제의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 보르테조밉, 디설피람, 에피갈로카테킨 갈레이트, 및 살리노스포라미드 A를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 간세포암, 결장직장암 및 뇌암의 치료에서 특히 바람직한 것은 항-CD39 항체와 보르테조밉, 디설피람, 에피갈로카테킨 갈레이트, 및 살리노스포라미드 A의 조합이고, 보다 더 바람직한 것은 보르테조밉과의 조합이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암 및 림프종의 치료에서 항-CD39 항체와 히스톤 데아세틸라아제의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 로미뎁신, 파노비노스타트, 보리노스타트, 모세티노스타트, 벨리노스타트, 엔티노스타트, 레스미노스타트, PCI-24781, AR-42, CUDC-101, 및 발프로산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암의 치료에서 특히 바람직한 것은 항-CD39 항체와 로미뎁신, 파노비노스타트, 보리노스타트, 모세티노스타트, 벨리노스타트, 엔티노스타트, 레스미노스타트, PCI-24781, AR-42, CUDC-101, 및 발프로산의 조합이고, 보다 더 바람직한 것은 보리노스타트와의 조합이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 방광 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 백혈병, 다발성 골수종 및 림프종의 치료에서 항-CD39 항체와 질소 머스타드 알킬화제의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 멜팔란, 이포스파미드, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 메클로레타민, 우라무스틴, 에스트라무스틴 및 벤다무스틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암 및 신장암의 치료에서 특히 바람직한 것은 항-CD39 항체와 멜팔란, 이포스파미드, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 메클로레타민, 우라무스틴, 에스트라무스틴 및 벤다무스틴의 조합이고, 보다 더 바람직한 것은 사이클로포스파미드와의 조합이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 난소암, 유방암, 뇌암, 다발성 골수종 및 림프종의 치료에서 항-CD39 항체와 니트로소우레아 알킬화제의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 로무스틴, 세무스틴, 카무스틴, 포테무스틴 및 스트렙토조토신을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 난소암 및 유방암의 치료에서 특히 바람직한 것은 항-CD39 항체와 로무스틴, 세무스틴, 카무스틴, 포테무스틴 및 스트렙토조토신의 조합이고, 보다 더 바람직한 것은 카무스틴과의 조합이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 악성 흑색종, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암, 백혈병 및 림프종의 치료에서 항-CD39 항체와 비전형 알킬화제의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 프로카바진, 다카르바진, 테모졸로미드 및 알트레타민을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폐암, 육종, 악성 흑색종, 위 암종, 난소암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암의 치료에서 특히 바람직한 것은 항-CD39 항체와 프로카바진, 다카르바진, 테모졸로미드 및 알트레타민의 조합이고, 보다 더 바람직한 것은 다카르바진 및 테졸로미드와의 조합이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 유방암의 치료에서 항-CD39 항체와 에스토로겐 길항제의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 토레미펜, 풀베스트란트, 타목시펜 및 나폭시딘을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 유방암의 치료에서 특히 바람직한 것은 항-CD39 항체와 토레미펜, 풀베스트란트, 타목시펜 및 나폭시딘의 조합이고, 보다 더 바람직한 것은 타목시펜과의 조합이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 전립선암의 치료에서 항-CD39 항체와 안드로겐 길항체의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 비칼루타미드, 플루타미드, MDV3100 및 닐루타미드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전립선암의 치료에서 특히 바람직한 것은 항-CD39 항체와 비칼루타미드, 플루타미드, MDV3100 및 닐루타미드의 조합이고, 보다 더 바람직한 것은 플루타미드와의 조합이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암의 치료에서 항-CD39 항체와 mTOR 억제제의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 시롤리무스, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 리다포롤리무스, KU-0063794 및 WYE-354를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 유방암, 결장직장암 및 뇌암의 치료에서 특히 바람직한 것은 항-CD39 항체와 시롤리무스, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 리다포롤리무스, KU-0063794 및 WYE-354의 조합이고, 보다 더 바람직한 것은 템시롤리무스와의 조합이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암으로부터 선택된 암의 치료에서 항-CD39 항체와 티로신 키나제 억제제의 조합에 관한 것이다. 이러한 화학요법제 그룹은 에를로티닙, 소라페닙, 악시티닙, 보수티닙, 세디라닙, 크리조티닙, 다사티닙, 게피티닙, 이마티닙, 카네르티닙, 라파티닙, 레스타우르티닙, 네라티닙, 닐로티닙, 세막사닙, 수니티닙, 베타라닙 및 반데타닙을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 암의 치료, 보다 상세하게는 폐암, 육종, 전립선암, 췌장 암종, 위 암종, 난소암, 간세포암, 유방암, 결장직장암, 신장암 및 뇌암으로부터 선택된 암의 치료에서 특히 바람직한 것은 항-CD39 항체와 에를로티닙, 소라페닙, 악시티닙, 보수티닙, 세디라닙, 크리조티닙, 다사티닙, 게피티닙, 이마티닙, 카네르티닙, 라파티닙, 레스타우르티닙, 네라티닙, 닐로티닙, 세막사닙, 수니티닙, 베타라닙 및 반데타닙의 조합이고, 보다 더 바람직한 것은 에를로티닙과의 조합이다.
본 발명의 또 다른 양태는 환자에게 MAP 키나제 경로 억제제 또는 WNT 경로 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 전술한 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
일부 구현예에서, MAP 키나제 경로 억제제는 BRAF 억제제, MEK 억제제, PI3K 억제제 및 c-KIT 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, BRAF 억제제는 GDC-0879, PLX-4720, 소라페닙 토실레이트, 다브라페닙 및 LGX818로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, MEK 억제제는 GSK1120212, 셀루메티닙 및 MEK162로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, WNT 경로 억제제는 β-카테닌 억제제 또는 프리즐드(frizzled) 억제제이다.
일부 구현예에서, β-카테닌 억제제는 니클로사미드, XAV-939, FH 535 및 ICG 001로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태는 환자에게 암 백신을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 전술한 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 암 백신은 수지상 세포 백신이다.
본 발명의 또 다른 양태는 환자에게 입양 세포 이입을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 전술한 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 입양 세포 이입은 CAR-T 세포 요법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 환자에게 항체 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 전술한 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 항-CD39 항체의 투여가 항체 요법의 항체-의존적 세포-매개된 세포독성을 향상시키는 전술한 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 항체 요법은 트라스투자맙, 세툭시맙, 베바시주맙, 및 리툭시맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 항-CD39 항체를 사용한 치료는 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, 림포카인, 인터류킨, 종양 괴사 인자 및/또는 성장 인자)과 같은 다른 생물학적 분자와의 병용 치료를 포함할 수 있거나 종양의 외과적 제거, 암 세포의 제거, 또는 치료 의사가 필요하다고 간주하는 임의의 기타 치료를 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 면역 반응 자극제이다.
본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 항-CD39 항체는 아드레노메둘린(AM), 안지오포이에틴(Ang), BMP, BDNF, EGF, 에리트로포이에틴(EPO), FGF, GDNF, G-CSF, GM-CSF, GDF9, HGF, HDGF, IGF, 이동-자극 인자, 마이오스타틴(GDF-8), NGF, 뉴로트로핀, PDGF, 트롬보포이에틴, TGF-α, TGF-β, TNF-α, VEGF, P1GF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, 및 IL-18로 이루어진 군으로부터 선택된 성장 인자와 조합될 수 있다.
본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 추가 치료제는 면역 반응 자극제이다. 일부 구현예에서, 면역 반응 자극제는 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 인터류킨 3(IL-3), 인터류킨 12(IL-12), 인터류킨 1(IL-1) 또는 인터류킨 2(IL-2)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
투여 스케줄링
본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 치료는 방사선 요법과 함께 항-CD39 항체의 투여를 포함한다. 항-CD39 항체를 사용한 치료는 방사선 요법의 투여 이전에, 동시에 또는 이후에 발생할 수 있다. 이러한 방사선 요법에 대한 투여 스케줄은 숙련된 의사가 결정할 수 있다.
본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 치료는 항-바이러스 요법과 함께 항-CD39 항체의 투여를 포함한다. 항-CD39 항체를 사용한 치료는 항바이러스 요법의 투여 이전에, 동시에 또는 이후에 발생할 수 있다. 조합 요법에 사용된 항-바이러스 약물은 대상체가 감염된 바이러스에 따라 달라질 것이다.
조합 투여는 단일 약제학적 제형으로 또는 별도의 제형을 사용하는 공동-투여, 또는 임의의 순서로 그러나 일반적으로 모든 활성제가 동시에 생물학적 활성을 발휘할 수 있는 기간 내에 연속 투여를 포함할 수 있다.
항-CD39 항체 및 적어도 하나의 추가 치료제의 조합은 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체는 이전에 제2 치료제로 치료 받은 환자에게 투여될 것이다. 특정 다른 구현예에서, 항-CD39 항체 및 제2 치료제는 실질적으로 동시에 또는 동시에 투여될 것이다. 예를 들어, 대상체는 제2 치료제(예를 들어, 화학요법)로 치료 과정을 겪으면서 항-CD39 항체가 제공될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 제2 치료제로의 치료 후 1년 이내에 투여될 것이다. 특정 대안적인 구현예에서, 항-CD39 항체는 제2 치료제로의 임의의 치료 후 10개월, 8개월, 6개월, 4개월, 또는 2개월 이내에 투여될 것이다. 특정 다른 구현예에서, 항-CD39 항체는 제2 치료제로의 임의의 치료 후 4주, 3주, 2주 또는 1주 이내에 투여될 것이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체는 제2 치료제로의 임의의 치료 후 5일, 4일, 3일, 2일, 또는 1일 이내에 투여될 것이다. 2개(또는 그 이상)의 제제 또는 치료제가 몇 시간 또는 몇 분 이내에(예를 들어, 실질적으로 동시에) 대상체에게 투여될 수 있다는 것이 또한 이해될 것이다.
질병의 치료를 위해, 항-CD39 항체의 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 질병의 반응성, 항-CD39 항체가 치료 또는 예방 목적을 위해 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 이력 등에 따라 다르며, 모두 치료 의사의 재량에 따른다. 항-CD39 항체는 1회 또는 수일 내지 수개월 동안 지속되는 일련의 치료에 걸쳐, 또는 치유되거나 질병 상태의 감소가 달성될 때까지(예를 들어, 종양 크기 감소) 투여될 수 있다. 최적의 투여 스케줄은 환자의 신체에 축적된 약물을 측정하여 산출될 수 있으며, 개별 제제의 상대적 효능에 따라 달라질 것이다. 투여 의사는 최적의 투여량, 투여 방법 및 반복률을 결정할 수 있다. 특정 구현예에서, 투여량은 체중 1 kg당 0.01 μg 내지 100 mg, 체중 1 kg당 0.1 μg 내지 100 mg, 체중 1 kg당 1 μg 내지 100 mg, 체중 1 kg당 1 mg 내지 100 mg, 체중 1 kg당 1 mg 내지 80 mg, 체중 1 kg당 10 mg 내지 100 mg, 체중 1 kg당 10 mg 내지 75 mg, 또는 체중 1 kg당 10 mg 내지 50 mg이다. 특정 구현예에서, 항-CD39 항체의 투여량은 체중 1 kg당 약 0.1 mg 내지 약 20 mg이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체의 투여량은 체중 1 kg당 약 0.1 mg이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체의 투여량은 체중 1 kg당 약 0.25 mg이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체의 투여량은 체중 1 kg당 약 0.5 mg이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체의 투여량은 체중 1 kg당 약 1 mg이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체의 투여량은 체중 1 kg당 약 1.5 mg이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체의 투여량은 체중 1 kg당 약 2 mg이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체의 투여량은 체중 1 kg당 약 2.5 mg이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체의 투여량은 체중 1 kg당 약 5 mg이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체의 투여량은 체중 1 kg당 약 7.5 mg이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체의 투여량은 체중 1 kg당 약 10 mg이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체의 투여량은 체중 1 kg당 약 12.5 mg이다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체의 투여량은 체중 1 kg당 약 15 mg이다. 특정 구현예에서, 투여량은 매일, 매주, 매월 또는 매년 한 번 이상 제공될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 4주에 1회 제공된다.
일부 구현예에서, 항-CD39 항체는 초기 더 높은 "부하" 용량으로 투여된 후 하나 이상의 더 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여 빈도도 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여 요법은 초기 용량을 투여한 다음 주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 또는 매달 1회 추가 용량(또는 "유지" 용량)을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 투여 요법은 초기 부하 용량을 투여한 다음, 예를 들어, 초기 용량의 절반의 매주 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는 투여 요법은 초기 부하 용량을 투여한 다음, 예를 들어, 격주로 초기 용량의 절반을 유지 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는 투여 요법은 3주 동안 3번 초기 용량을 투여한 다음, 예를 들어, 격주로 동일한 양의 유지 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 임의의 치료제의 투여는 부작용 및/또는 독성을 유발할 수 있다. 일부 경우에, 부작용 및/또는 독성은 치료적 유효 용량에서 특정 제제의 투여를 배제할 정도로 심각하다. 일부 경우에, 약물 요법을 중단해야 하며 다른 제제를 시도할 수 있다. 그러나, 동일한 치료 클래스의 많은 제제는 종종 유사한 부작용 및/또는 독성을 나타내며, 이는 환자가 치료를 중단해야 하거나, 가능하면, 치료제와 관련된 불쾌한 부작용을 겪는다는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 투여 스케줄은 특정 횟수의 투여 또는 "주기"로 제한될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 이상의 주기 동안 투여된다. 예를 들어, 항-CD39 항체는 6 주기 동안 2주마다 투여되고, 항-CD39 항체는 6 주기 동안 3주마다 투여되고, 항-CD39 항체는 4 주기 동안 2주마다 투여되고, 항-CD39 항체는 4 주기 동안 3주마다 투여된다. 투여 스케줄은 당업자에 의해 결정되고 후속적으로 수정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 항-CD39 항체, 화학요법제, 등의 투여와 관련된 부작용 및/또는 독성을 감소시킬 수 있는 하나 이상의 제제를 투여하기 위한 간헐적 투여 전략을 사용하는 것을 포함하는 본원에 기재된 항-CD39 항체를 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체에게 치료적 유효 용량의 화학요법제와 함께 치료적 유효 용량의 항-CD39 항체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제제 중 하나 또는 둘 모두는 간헐적 투여 전략에 따라 투여된다. 일부 구현예에서, 간헐적 투여 전략은 초기 용량의 항-CD39 항체를 대상체에게 투여하고, 항-CD39 항체의 후속 용량을 2주마다 약 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 간헐적 투여 전략은 초기 용량의 항-CD39 항체를 대상체에게 투여하고, 항-CD39 항체의 후속 용량을 3주마다 약 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 간헐적 투여 전략은 초기 용량의 항-CD39 항체를 대상체에게 투여하고, 항-CD39 항체의 후속 용량을 4주마다 약 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD39 항체는 간헐적 투여 전략을 사용하여 투여되고, 화학요법제는 매주 투여된다.
항-감염 치료 조합
일 구현예에서, 본 발명은 항-CD39 항체를 사용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 바이러스 감염으로 고통받는다. 일 구현예에서, 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 간염 바이러스(A형, B형 또는 C형), 헤르페스 바이러스(예를 들어, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡슈타인 바르 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕삭키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 멈프스 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종바이러스, 연속종 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 또는 아르보바이러스 뇌염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로의 감염이다.
일 구현예에서, 본 발명은 항-CD39 항체를 사용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 박테리아 감염으로 고통받는다. 일 구현예에서, 박테리아 감염은 클라미디아(Chlamydia), 리케치아 박테리아(rickettsial bacteria), 마 이코박테리아(mycobacteria), 스타필로코커스(staphylococci), 스트렙토코커 스(streptococci), 뉴모노코커스(pneumonococci), 메닝고코커스(meningococci) 및 고노코커스(gonococci), 클렙시엘라(klebsiella), 프로테우스(proteus), 세라티아(serratia), 슈도모나스(pseudomonas), 레지오넬라(Legionella), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium 디프테리아e), 살모넬라(Salmonella), 바실러 스(bacilli), 비브리오 콜레라에(Vibrio 콜레라 e), 클로스트리디움 테 탄(Clostridium tetan), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 바실러 스 안트리시스(Bacillus anthricis), 에르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 레프로마토시 스(Mycobacterium lepromatosis), 및 보리엘라(Borriella)로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리움으로의 감염이다.
일 구현예에서, 본 발명은 항-CD39 항체를 사용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 진균 감염으로 고통받는다. 일 구현예에서, 진균 감염은 칸디다(Candida)(알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라 타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis), 등), 크립토코커스 네오포르만 스(Cryptococcus neoformans), 아스퍼길러스(Aspergillus)(푸미가투스(fumigatus), 니게르(niger), 등), 무코랄레스(Mucorales) 속(무코르(mucor), 아브시디 아(absidia), 리조푸스(rhizopus)), 스포로트릭스 스첸키(Sporothrix schenkii), 블 라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라코시디오이데스 브라 실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 코시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 진균으로의 감염이다.
일 구현예에서, 본 발명은 항-CD39 항체를 사용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 기생충 감염으로 고통받는다. 일 구현예에서, 기생충 감염은 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜 리(Balantidium coli), 내글레리아 파울러리(Naegleria fowleri), 아칸타모에 바(Acanthamoeba), 기아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리디 움(Cryptosporidium), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브 루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii) 및 니포스 트롱길루스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)로 이루어진 군으로부터 선택된 기생충으로의 감염이다.
VII. 항-CD39 항체 접합체
본원에 개시된 항-CD39 항체는 또한 화학적 모이어티에 접합될 수 있다. 화학적 모이어티는, 그 중에서도, 중합체, 방사성핵종 또는 세포독성 인자일 수 있다.
예를 들어, 치료 모이어티, 예를 들어, 약물에 접합된 항-CD39 항체가 특징이다. 치료 모이어티는, 예를 들어, 세포독소, 화학요법제, 사이토카인, 면역억제제, 면역 자극제, 용해 펩티드 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 이러한 접합체는 본원에서 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로 지칭된다. 따라서, 일 양태에서, 임의의 상기 기재된 양태 또는 구현예에 따른 항-CD39 항체는 치료 모이어티에 접합된다. 예시적인 치료 모이어티는 세포독성 모이어티, 방사성 동위원소, 사이토카인, 및 용해 펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 세포독성 모이어티에 접합되거나 이와 연합된 항체의 내재화에 의해 CD39-발현 세포에서 세포독성을 유발할 수 있다. 세포독성 모이어티는, 예를 들어, 탁솔; 사이토칼라신 B; 그라미시딘 D; 에티듐 브로마이드; 에메틴; 미토마이신; 에토포시드; 테노포시드; 빈크리스틴; 빈블라스틴; 콜키신; 독소루비신; 다우노루비신; 디하이드록시 안트라신 디온; 튜불린-억제제 예컨대 마이탄신 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항유사분열제 예컨대 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 F 또는 이의 유사체 또는 유도체; 돌라스타틴 10 또는 15 또는 이의 유사체; 이리노테칸 또는 이의 유사체; 미톡산트론; 미트라마이신; 악티노마이신 D; 1-데하이드로테스토스테론; 글루코코르티코이드; 프로카인; 테트라카인; 리도카인; 프로프라놀롤; 퓨로마이신; 칼리키아미신 또는 이의 유사체 또는 유도체; 대사 길항 물질 예컨대 메토트렉세이트, 6 머캅토퓨린, 6 티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5 플루오로우라실, 데카르바진, 하이드록시우레아, 아스파라기나아제, 젬시타빈, 또는 클라드리빈; 알킬화제 예컨대 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU), 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카르바진(DTIC), 프로카바진, 미토마이신 C; 백금 유도체 예컨대 시스플라틴 또는 카보플라틴; 듀오카르마이신 A, 듀오카르마이신 SA, 라첼마이신(CC-1065), 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항생제 예컨대 닥티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신, 안트라마이신(AMC)); 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀(PDB); 디프테리아 독소 및 관련 분자 예컨대 디프테리아 A 사슬 및 이의 활성 단편 및 하이브리드 분자, 리신 독소 예컨대 리신 A 또는 데글리코실화 리신 A 사슬 독소, 콜레라 독소, 시가-유사 독소(Shiga-like toxin) 예컨대 SLT I, SLT II, SLT IIV, LT 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 바우먼-버크(Bowman-Birk) 프로테아제 억제제, 슈도모나스 외독소, 알로린, 사포린, 모데신, 젤라닌, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질 예컨대 PAPI, PAPII, 및 PAP-S, 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신 독소; 리보뉴클레아제(RNase); DNase I, 스타필로코커스(Staphylococcal) 장독소 A; 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질; 디프테린 독소; 및 슈도모나스 내독소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 항-CD39 항체는 아우리스타틴 또는 이의 펩티드 유사체, 유도체 또는 프로드럭에 접합된다. 아우리스타틴은 미세소관 역학, GTP 가수분해, 핵 및 세포 분열을 방해하고(Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584), 항암 활성(미국 특허 번호 5,663,149) 및 항진균 활성((Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965를 갖는 것으로 나타났다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라-아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 다른 전형적인 아우리스타틴 유도체는 AFP, MMAF(모노메틸 아우리스타틴 F), 및 MMAE(모노메틸 아우리스타틴 E)를 포함한다. 적합한 아우리스타틴 및 아우리스타틴 유사체, 유도체 및 프로드럭, 뿐만 아니라 Ab에 아우리스타틴의 접합을 위한 적합한 링커는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,635,483, 5,780,588 및 6,214,345 및 국제 특허 출원 공보 WO02088172, WO2004010957, WO2005081711, WO2005084390, WO2006132670, WO03026577, WO200700860, WO207011968 및 WO205082023에 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, 항-CD39 항체는 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀(PDB) 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드럭에 접합된다. 적합한 PDB 및 PDB 유도체, 및 관련 기술은, 예를 들어, 문헌(Hartley J. A. et al., Cancer Res 2010; 70(17): 6849-6858; Antonow D. et al., Cancer J 2008; 14(3):154-169; Howard P. W. et al., Bioorg Med Chem Lett 2009; 19: 6463-6466 및 Sagnou et al., Bioorg Med Chem Lett 2000; 10(18): 2083-2086)에 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, 항-CD39 항체는 안트라사이클린, 마이탄신, 칼리키아미신, 듀오카르마이신, 라첼마이신(CC-1065), 돌라스타틴 10, 돌라스타틴 15, 이리노테칸, 모노메틸 아우리스타틴 E, 모노메틸 아우리스타틴 F, PDB, 또는 이들 중 어느 것의 유사체, 유도체, 또는 프로드럭으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포독성 모이어티에 접합된다.
특정 구현예에서, 항-CD39 항체는 안트라사이클린 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드럭에 접합된다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 마이탄신 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드럭에 접합된다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 칼리키아미신 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드럭에 접합된다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 듀오카르마이신 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드럭에 접합된다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 라첼마이신 (CC-1065) 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드럭에 접합된다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 돌라스타틴 10 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드럭에 접합된다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 돌라스타틴 15 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드럭에 접합된다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드럭에 접합된다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 모노메틸 아우리스타틴 F 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드럭에 접합된다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드럭에 접합된다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 이리노테칸 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드럭에 접합된다.
일 구현예에서, 본 발명의 항-CD39 항체는 핵산 또는 핵산-관련 분자에 접합된다. 이러한 일 구현예에서, 접합된 핵산은 세포독성 리보뉴클레아제(RNase) 또는 데옥시-리보뉴클레아제(예를 들어, DNase I), 안티센스 핵산, 억제 RNA 분자(예를 들어, siRNA 분자) 또는 면역자극 핵산(예를 들어, 면역자극 CpG 모티프-함유 DNA 분자)이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CD39-특이적 항체는 압타머 또는 리보자임에 접합된다.
일 구현예에서, 본 발명의 항-CD39 항체는, 예를 들어, 용해 펩티드 예컨대 CLIP, 마가이닌 2, 멜리틴, 세크로핀 및 P18에 융합 단백질로서 접합된다.
일 구현예에서, 항-CD39 항체는, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα, IFNβ, IFNγ, GM-CSF, CD40L, Flt3 리간드, 줄기 세포 인자, 안세스팀, 및 TNFα와 같은 사이토카인에 접합된다.
특정 구현예에서, 화학적 모이어티는 대상체의 신체에서 항체 또는 단편의 반감기를 증가시키는 중합체이다. 적합한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예를 들어, 분자량이 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa 또는 40 kDa인 PEG), 덱스트란 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 친수성 중합체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 리 등(Lee, et al., (1999) Bioconj. Chem. 10:973-981)에서는 PEG 접합된 단일-사슬 항체를 개시한다. 웬 등(Wen, et al., (2001) Bioconj. Chem. 12:545-553)에서는 라디오메탈 킬레이터(디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA))에 부착된 PEG와 항체를 접합시키는 것을 개시한다.
항-CD39 항체는 또한 99Tc, 90Y, 111In, 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 18F, 35S, 51Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67CU, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr, 및 56Fe와 같은 표지로 접합될 수 있다.
항-CD39 항체는 또한 발형광단 예컨대 희토류 킬레이트, 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 이소티오시아네이트, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 플루오레사민, 152Eu, 단실, 움벨리페론, 루시페린, 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디미움 염(acridimium salt) 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 에쿠오린 표지, 2,3-디하이드로프탈아진디온, 비오틴/아비딘, 스핀 표지 및 안정한 자유 라디칼을 포함하는 형광 또는 화학발광 표지로 접합될 수 있다.
문헌(Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; 및 Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407)에 기재된 방법을 포함하여, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편을 다양한 모이어티에 접합하기 위한 당 업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 항체 및 단편을 접합하는 방법은 통상적이며 당 업계에 매우 잘 알려져 있다.
VIII. 약제학적 조성물
본 발명의 항-CD39 항체, 항원-결합 단편, 핵산, 또는 벡터는 조성물, 특히 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 항-CD39 항체, 항원-결합 단편, 핵산 또는 벡터를 적합한 캐리어, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 제제와 혼합하여 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 항-CD39 항체, 항원-결합 단편, 핵산, 또는 벡터는 약제학적 조성물로 제형화되기 전에 동물에게 투여하기 위해 충분히 정제된다.
본 약제학적 조성물에 사용하기 위한 약제학적으로 허용되는 제제는 캐리어, 부형제, 희석제, 항산화제, 보존제, 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전제, 증량제, 완충액, 전달 비히클, 등장화제, 공용매, 습윤제, 착화제, 완충제, 항미생물제 및 계면활성제를 포함한다.
중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 예시적인 적절한 캐리어이다. 약제학적 조성물은 항산화제 예컨대 아스코르브산; 저분자량 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌 또는 리신; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 트윈, 플루로닉스(pluronics), 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다. 또한 예로서, 적합한 긴장성 향상제에는 할로겐화 알칼리 금속(바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨), 만니톨, 소르비톨 등이 포함된다. 적합한 보존제에는 벤즈알코늄 클로라이드, 티메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 등이 포함된다. 과산화수소는 보존제로도 사용될 수 있다. 적합한 공용매에는 글리세린, 프로필렌 글리콜, 및 PEG가 포함된다. 적합한 착화제에는 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시-프로필-베타-사이클로덱스트린이 포함된다. 적합한 계면활성제 또는 습윤제에는 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 예컨대 폴리소르베이트 80, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔 등이 포함된다. 완충액은 아세테이트, 보레이트, 시트레이트, 인산염, 중탄산염 또는 Tris-HCl과 같은 통상적인 완충액일 수 있다. 아세테이트 완충액은 약 pH 4 내지 pH 5.5일 수 있으며, Tris 완충액은 약 pH 7 내지 pH 8.5일 수 있다. 추가 약제학적 제제는 문헌(참조: Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990)에 기재되어 있다.
조성물은 액체 형태 또는 동결건조(lyophilized) 또는 냉동-건조(freeze-dried) 형태일 수 있으며, 하나 이상의 동결건조보호제(lyoprotectant), 부형제, 계면활성제, 고분자량 구조 첨가제 및/또는 증량제를 포함할 수 있다(참조: 예를 들어, 미국 특허 번호 6,685,940, 6,566,329, 및 6,372,716). 일 구현예에서, 수크로스, 락토스 또는 트레할로스와 같은 비환원 당인 동결건조보호제가 포함된다. 일반적으로 포함되는 동결건조보호제의 양은, 재구성시, 생성되는 제형이 등장성이 될 수 있도록 하는 양이지만, 고장성 또는 약간 저장성 제형도 적합할 수 있다. 또한, 동결건조보호제의 양은 동결건조시 허용할 수 없는 양의 단백질 분해 및/또는 응집을 방지하기에 충분해야 한다. 사전 동결건조된 제형에서 당(예를 들어, 수크로스, 락토스, 트레할로스)에 대한 예시적인 동결건조보호제 농도는 약 10 mM 내지 약 400 mM이다. 또 다른 구현예에서, 예를 들어, 비이온성 계면활성제 및 이온성 계면활성제 예컨대 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80); 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188); 폴리 (에틸렌 글리콜) 페닐 에테르(예를 들어, 트리톤(Triton)); 나트륨 도데실 설페이트(SDS); 나트륨 라우렐 설페이트; 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴- 설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸- 베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 흐놀레아미도프로필(Hnoleamidopropyl)-, 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아라미도프로필-베타인(예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아라미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 이나트륨 메틸 오페일(ofeyl)-타우레이트; 및 MONAQUAT™ 시리즈(모나 인더스트리즈, 인코포레이티드(Mona Industries, Inc.), 뉴저지주 패터슨 소재), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(예를 들어, 플루로닉스, PF68 등)와 같은 계면활성제가 포함된다. 사전 동결건조된 제형에 존재할 수 있는 계면활성제의 예시적인 양은 약 0.001% 내지 0.5%이다. 고분자량 구조 첨가제(예를 들어, 충전제, 결합제)에는 예를 들어, 아카시아, 알부민, 알긴산, 인산칼슘(이염기성), 셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트린, 덱스트레이트, 수크로스, 타일로스, 전호화 전분, 황산칼슘, 아밀로스, 글리신, 벤토나이트, 말토스, 소르비톨, 에틸셀룰로스, 인산수소이나트륨, 인산이나트륨, 피로아황산이나트륨, 폴리비닐 알코올, 젤라틴, 글루코스, 구아르 검, 액체 글루코스, 압축성 당(compressible sugar), 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 말토덱스트린, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리메타크릴레이트, 포비돈, 알긴산나트륨, 트라가칸트 미정질 셀룰로스, 전분, 및 제인이 포함될 수 있다. 고분자량 구조 첨가제의 예시적인 농도는 0.1 중량% 내지 10중량%이다. 다른 구현예에서, 증량제(예를 들어, 만니톨, 글리신)를 포함할 수 있다.
조성물은 비경구 투여에 적합할 수 있다. 예시적인 조성물은 숙련된 작업자가 이용할 수 있는 임의의 경로, 예컨대 관절내, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 뇌내(뇌실질내), 뇌혈관내(intracerebroventricular), 근육내, 안내, 동맥내 또는 병변내 경로에 의해 동물에 주사 또는 주입하기에 적합하다. 비경구 제형은 전형적으로 멸균되고, 발열원이 없는 등장성 수용액일 것이며, 선택적으로 약제학적으로 허용되는 보존제를 함유한다.
비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르이다. 수성 캐리어는 식염수 및 완충 매질을 포함하여, 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이티드 링거(actated Ringer's) 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스를 기반으로 하는 보충제 등을 포함한다. 예를 들어, 항-미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 또한 존재할 수 있다. 일반적으로, 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 16th Ed., Mack Eds., 1980)을 참조하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 특정 국소 환경에서 생성물의 국소 농도(예를 들어, 볼루스, 데포 효과) 및/또는 증가된 안정성 또는 반감기를 제공하는 방식으로 제어되거나 지속되는 전달을 위해 제형화될 수 있다. 조성물은 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합성 화합물의 미립자 제제뿐만 아니라 생분해성 매트릭스, 주사 가능한 마이크로스페어, 마이크로캡슐 입자, 마이크로캡슐, 생분해성 입자 비드, 리포좀, 및 이후 데포 주사로서 전달될 수 있는 활성제의 제어되거나 지속된 방출을 제공하는 이식 가능한 전달 장치와 같은 제제와 함께 본 발명의 항-CD39 항체, 항원-결합 단편, 핵산 또는 벡터의 제형을 포함할 수 있다. 이러한 지속된- 또는 제어된- 전달 수단을 제형화하는 기술이 공지되어 있으며 약물의 제어 방출 및 전달을 위해 다양한 중합체가 개발되고 사용되었다. 이러한 중합체는 전형적으로 생분해성이며 생체 적합성이다. 거울상 이성질체 중합체 또는 폴리펩티드 세그먼트의 복합체화에 의해 형성된 것들을 포함하는 중합체 하이드로겔, 및 온도 또는 pH에 민감한 특성을 갖는 하이드로겔은 생물 활성 단백질 제제(예를 들어, 항체)를 포획하는 데 관련된 온화한 수성 조건 때문에 약물 데포 효과를 제공하는 데 바람직할 수 있다. 예를 들어, PCT 출원 공보 WO 93/15722에서 약제학적 조성물의 전달을 위한 제어 방출 다공성 중합성 마이크로입자의 설명을 참조한다.
이 목적에 적합한 물질은 폴리락티드(참조: 예를 들어, 미국 특허 3,773,919), 폴리-D-(-)-3- 하이드록시부티르산과 같은 폴리-(a-하이드록시카복실산)의 중합체(EP 133,988A), L-글루탐산과 감마 에틸-L- 글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), 폴리 (2-하이드록시에틸- 메타크릴레이트)(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981), 및 Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), 에틸렌 비닐 아세테이트, 또는 폴리-D(~)~3-하이드록시부티르산을 포함한다. 기타 생분해성 폴리머는 폴리(락톤), 폴리(아세탈), 폴리(오르토에스테르), 및 폴리(오르토카보네이트)를 포함한다. 지속-방출 조성물은 또한 당 업계에 공지된 여러 방법 중 어느 것에 의해 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다(참조: 예를 들어, Eppstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-92 (1985)). 캐리어 자체 또는 이의 분해 산물은 표적 조직에서 무독성이어야 하며 상태를 더 악화시키지 않아야 한다. 이것은 표적 장애의 동물 모델에서 또는 그러한 모델을 사용할 수 없는 경우, 일반 동물에서 일상적인 스크리닝에 의해 결정될 수 있다. 지속 방출을 위한 재조합 단백질의 마이크로캡슐화는 인간 성장 호르몬(rhGH), 인터페론-(rhIFNγ), 인터류킨-2 및 MNrgpl20으로 성공적으로 수행되었다(Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technologv. 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 및 미국 특허 번호 5,654,010). 이러한 단백질의 지속-방출 제형은 이의 생체 적합성과 광범위한 생분해성 특성으로 인해 폴리-락틱-코글리콜산(PLGA) 중합체를 사용하여 개발되었다. PLGA, 락트산 및 글리콜산의 분해 산물은 인체 내에서 빠르게 제거될 수 있다. 또한, 이 중합체의 분해성은 이의 분자량 및 조성에 따라 달라질 수 있다(Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41). 지속 방출 조성물의 추가 예는, 예를 들어, EP 58,48 IA, 미국 특허 번호 3,887,699, EP 158,277A, 캐나다 특허 번호 1176565, 문헌(U. Sidman et al., Biopolymers 22, 547 (1983), R. Langer et al., Chem. Tech. 12, 98 (1982), Sinha et al., J. Control. Release 90, 261 (2003), Zhu et al., Nat. Biotechnol. 18, 24 (2000), 및 Dai et al., Colloids Surf B Biointerfaces 41, 117 (2005))을 포함한다.
생체 접착성 중합체는 또한 본 발명의 조성물에서 또는 이와 함께 사용하기 위해 고려된다. 생체 접착제는 오랜 기간 동안 생물학적 기질에 부착할 수 있는 합성 및 자연 발생 물질이다. 예를 들어, 카보폴 및 폴리카보필은 둘 모두 폴리 (아크릴산)의 합성 가교 유도체이다. 자연 발생 물질에 기반한 생체 접착제 전달 시스템은 예를 들어 히알루로난(hyaluronan)으로도 알려진 히알루론산을 포함한다. 히알루론산은 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민의 잔기로 이루어진 자연 발생 뮤코다당류이다. 히알루론산은 연결 조직을 포함하여 척추동물의 세포외 조직 기질, 뿐만 아니라 활액, 눈의 유리체 및 수양액(aqueous humour)에서 발견된다. 히알루론산의 에스테르화된 유도체는 생체 적합성이고 생분해성인 전달에 사용되는 마이크로스페어를 생성하는 데 사용되었다(참조: 예를 들어, Cortivo et al., Biomaterials (1991) 12:727-730; European Publication No. 517,565; 국제 공보 번호 WO 96/29998; Ilium et al., J. Controlled ReI. (1994) 29:133-141). 본 발명의 예시적인 히알루론산 함유 조성물은 히알루론산 중합체에 대한 IL- 1/3 결합 항체 또는 단편의 대략 0.1% 내지 약 40%(w/w) 양의 히알루론산 에스테르 중합체를 포함한다. 생분해성 및 비-생분해성 중합성 매트릭스는 모두 본 발명의 조성물을 전달하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 중합성 매트릭스는 천연 또는 합성 중합체를 포함할 수 있다. 생분해성 매트릭스가 바람직하다. 방출이 발생하는 기간은 중합체의 선택에 따라 달라진다. 전형적으로, 몇 시간에서 3개월 내지 12개월에 이르는 기간에 걸친 방출이 가장 바람직하다. 생분해성 전달 시스템을 형성하는 데 사용될 수 있는 예시적인 합성 중합체는 다음을 포함한다: 락트산과 글리콜산의 중합체, 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리-비닐 할라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜라이드, 폴리실록산, 폴리안하이드라이드, 폴리우레탄 및 이들의 공중합체, 폴리(부트산(butic acid)), 폴리(발레르산), 알킬 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 에스테르, 니트로 셀룰로스, 아크릴산 및 메타크릴산 에스테르의 중합체, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시- 프로필 메틸 셀룰로스, 하이드록시부틸 메틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 프로피오네이트, 셀룰로스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 카복실에틸 셀룰로스, 셀룰로스 트리아세테이트, 셀룰로스 설페이트 나트륨 염, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리에틸렌 옥사이드), 폴리에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 알코올), 폴리비닐 아세테이트, 폴리 비닐 클로라이드, 폴리스티렌 및 폴리비닐피롤리돈. 예시적인 천연 중합체에는 알기네이트, 및 덱스트란 및 셀룰로스를 포함하는 기타 다당류, 콜라겐, 이의 화학적 유도체(치환, 화학적 기, 예를 들어, 알킬, 알킬렌의 첨가, 하이드록실화, 산화, 및 당업자에 의해 일상적으로 이루어지는 기타 변형), 알부민 및 기타 친수성 단백질, 제인 및 기타 프롤라민 및 소수성 단백질, 이들의 공중합체 및 혼합물이 포함된다. 일반적으로, 이러한 물질은 생체내 효소 가수분해 또는 물에 노출, 표면 또는 대량 침식에 의해 분해된다. 중합체는 선택적으로, 물에서 그 중량의 약 90%까지 흡수할 수 있고, 또한 선택적으로 다가 이온 또는 다른 중합체와 가교되는 하이드로겔의 형태이다(참조: 예를 들어 국제 공개 번호 WO 04/009664, WO 05/087201, 및 Sawhney, et al., Macromolecules, 1993, 26, 581-587).
전달 시스템은 또한 스테롤 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방산 또는 중성 지방 예컨대 모노글리세라이드, 디글리세라이드 및 트리글리세라이드를 포함하는 지질; 하이드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템; 펩티드 기반 시스템; 왁스 코팅; 통상적인 결합제 및 부형제를 사용하는 압축 정제; 부분적으로 융합된 임플란트; 등인 비-중합체 시스템을 포함한다. 구체적인 예에는 (a) 미국 특허 번호 4,452,775, 4,675,189 및 5,736,152에 기재된 바와 같이 생성물이 매트릭스 내에 한 형태로 포함된 침식 시스템 및 (b) 미국 특허 번호 3,854,480, 5,133,974 및 5,407,686에 기재된 바와 같이 생성물이 중합체로부터 제어된 속도로 침투하는 확산 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 생성물을 함유하는 리포좀은 예를 들어 (DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545; 및 EP 102,324)와 같은 방법에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 조성물은 본 발명의 항-CD39 항체, 항원 결합 단편, 핵산 또는 벡터가 흡수되거나 캡슐화된 막, 스펀지, 또는 다른 적절한 재료의 환부로의 이식을 통해 국부적으로 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관에 이식될 수 있으며, 본 발명의 항-CD39 항체, 항원-결합 단편, 핵산 또는 벡터의 전달은 볼루스를 통한 장치를 통해 직접적으로 또는 연속 투여를 통해, 또는 연속 주입을 사용하는 카테터를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 항-CD39 항체, 항원-결합 단편, 핵산, 또는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 예를 들어, 건조 분말과 같이 흡입용으로 제형화될 수 있다. 흡입 용액은 또한 에어로졸 전달을 위해 액화 추진제로 제형화될 수 있다. 또 다른 제형에서, 용액은 분무될 수 있다. 폐 투여를 위한 추가 약제학적 조성물은, 예를 들어, 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 개시하는 PCT 출원 공보 WO 94/20069에 기재된 것들을 포함한다. 폐 전달을 위해, 입자 크기는 원위 폐로 전달하기에 적합해야 한다. 예를 들어, 입자 크기는 1 μm 내지 5 μm일 수 있지만; 예를 들어, 각각의 입자가 상당히 다공성인 경우 더 큰 입자가 사용될 수 있다.
본 발명의 항-CD39 항체, 항원-결합 단편, 핵산 또는 벡터를 함유하는 특정 제형은 경구로 투여될 수 있다. 이러한 방식으로 투여되는 제형은 정제 및 캡슐과 같은 고체 투여 형태의 배합에 통상적으로 사용되는 캐리어와 함께 또는 캐리어 없이 제형화될 수 있다. 예를 들어, 캡슐은 생체 이용률이 최대화되고 전-전신적(pre-systemic) 분해가 최소화될 때 위장관의 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 선택적 결합제의 흡수를 촉진하기 위해 추가 제제가 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제 및 결합제를 사용할 수도 있다.
또 다른 제제는 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제와의 혼합물에 유효량의 본 발명의 항-CD39 항체, 항원-결합 단편, 핵산 또는 벡터를 포함할 수 있다. 정제를 멸균수 또는 또 다른 적절한 비히클에 용해시킴으로써 용액을 단위 용량 형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제는 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
IX. 예시적인 방법
도 1a 및 도 1b
항-CD39 5F2 항체는 마우스 및 인간 CD39 양성 세포에 대한 ADCC 활성을 입증한다. mCD39를 발현시키는 CHO 세포(도 1a) 또는 hCD39를 발현시키는 Raji 세포(도 1b)를 각각 표적 세포로 사용하였다. 루시퍼라제를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염된 Jurkat 세포는 프로메가에서 구매하였고, pLentiTdT-mFcγRIV로 추가로 감염시켰다. TdTomato 양성 Jurkat 세포를 FACS로 분류하고, 이펙터 세포로 사용하였다. 야생형(WT) 또는 비푸코실화(Afuc) 5F2-mIgG2c를 연속 희석된 농도로 첨가하였다. 배경에 대한 루시퍼라제 활성의 배수 증가로의 ADCC는 항체를 표적 및 이펙터 세포와 함께 6시간 인큐베이션한 후 측정되었다.
도 2a 내지 도 12b는 B16/F10 데이터이다.
비푸코실화 항-CD39 모노클로날 항체( mAb ) 5F2- mIgG2c는 생체내 B16/F10 흑색종에 대한 항-종양 활성을 입증한다. 0일에 1.6x105 luc-B16/F10 세포(루시퍼라제를 내인적으로 과발현시키는 B16/F10)를 C57BL/6 마우스(8주령의 수컷; 타코닉(Taconic)에서 입수됨)의 오른쪽 아래 옆구리에 피하로(s.c.) 주사한 후 1일, 4일 및 7일에 i.p.를 통해 식염수 200 μl 중의 야생형(WT) 또는 비푸코실화(Afuc) 5F2-mIgG2c 200 μg으로 처리하였다. 마우스는 대조군으로 사용되는 식염수 200 μl를 투여받았다. 수직 종양 직경은 종양이 감지될 수 있을 때 직접 측정되었고 그 후 디지털 캘리퍼를 사용하여 주당 2회 내지 3회 측정되었다. 종양 용적은 적분법: Σt1+t2+....tn(t = t = a2 × b × 0.52; a = 더 작은 종양 직경, b = 더 큰 종양 직경)에 의해 결정되었다. 임의의 종양 용적이 대략 4000 mm3에 도달하면 연구가 종결되었다. 그룹당 n = 5 내지 7.
야생형(WT) 5F2- mIgG1은 생체내 에서 B16/F10 종양 성장을 차단하지 못한다. 0일에 1.8x105 luc-B16/F10 세포를 C57BL/6 마우스(8주령의 수컷; 타코닉에서 입수됨)의 오른쪽 아래 옆구리에 피하로 이식한 후 1일, 4일 및 7일에 야생형(WT) 5F2-mIgG1(i.p.를 통해 식염수 200 ml 중 200 mg)로 처리하였다. 식염수 처리된 마우스는 대조 그룹으로 간주되었다. 종양 용적은 상기와 같이 결정되었다. 연구는 18일에 종결되었다. 그룹당 n=6.
비푸코실화 5F2- mIgG2c는 임의의 다른 유형의 5F2 mAb에 비해 확립된 B16/F10 흑색종에 대해 우수한 생체내 종양-억제 활성을 나타낸다. 0일에 1.0x105 luc-B16/F10 세포를 C57BL/6 마우스(10주령의 수컷; 더 잭슨 래보러토리(The Jackson Laboratory)에서 입수됨)의 오른쪽 아래 옆구리에 주사하였다(피하). 종양의 평균 용적이 50 mm3 내지 100 mm3에 도달하면 항체 처리(i.p.를 통해 식염수 200 ml 중 각각의 mAb 200 mg)를 시작했다. 마우스를 종양 용적에 따라 4개의 그룹으로 무작위로 배정하였다. 구체적으로, 11일, 14일 및 17일에 3개의 용량이 제공되었다. 종양 용적은 상기 기재된 바와 같이 측정되었다. 종양 용적이 대략 3500 mm3 내지 4000 mm3에 도달하면 동물을 안락사시켰다. 종양 궤양이 발생하면 조기 안락사를 실시하였다. 그룹당 n=7.
비푸코실화 5F2- mIgG2c로 처리하면 B16/F10-보유 야생형 FoxP3 - GFP 녹인 마우스에서 종양이 퇴행되고 생존이 연장된다. 0일에 1.0x105 luc-B16/F10 세포를 C57BL/6 균주(리포터 마우스 균주는 FoxP3+ Treg 세포에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현시킴); 12주 내지 16주령의 수컷; 인하우스)의 야생형 FoxP3-GFP 녹인 마우스의 오른쪽 아래 옆구리에 주사하였다(피하). 11일, 14일 및 17일에 Afuc 5F2-mIgG2c mAb(i.p.를 통해 식염수 200 ml 중 200 mg)를 종양-보유 마우스에 제공하였다(마우스는 종양 용적에 따라 2개의 그룹으로 무작위로 배정되었음). 식염수 200 ml를 투여받은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 종양 용적은 상기 기재된 바와 같이 측정되었다. 종양 용적이 대략 3500 mm3 내지 4000 mm3에 도달하면 동물을 안락사시켰다. 그룹당 n=4 내지 5.
비푸코실화 5F2- mIgG2c mAb 처리 전략의 최적화. 2회 용량의 Afuc 5F2- mIgG2c 는 야생형 FoxP3 - GFP 녹인 마우스에서 B16/F10 종양 퇴행을 유도할 수 있다.
도 12a. Afuc 5F2-mIgG2c mAb로 3회 처리된 B16/F10-보유 마우스의 평균 종양 용적. 0일에 1.6x105 luc-B16/F10 세포를 야생형 FoxP3-GFP 녹인 리포터 마우스(16주령 내지 18주령의 암컷; 인하우스)의 오른쪽 아래 옆구리에 주사하였다(피하). 9일, 13일 및 16일에 Afuc 5F2-mIgG2c mAb(i.p.를 통해 식염수 200 ml 중 200 mg)를 종양-보유 마우스에 제공하였다(마우스는 종양 용적에 따라 2개의 그룹으로 무작위로 배정되었음). 식염수 200 ml를 투여받은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 종양 용적은 상기 기재된 바와 같이 측정되었고, 연구는 17일에 종결되었다. 그룹당 n=3.
도 12b. Afuc 5F2-mIgG2c mAb로 2회 처리된 B16/F10-보유 마우스의 평균 종양 용적. 0일에 1.0x105 luc-B16/F10 세포를 야생형 FoxP3-GFP 녹인 리포터 마우스(8주령의 암컷; 인하우스)의 오른쪽 아래 옆구리에 주사하였다(피하). 13일 및 16일에 Afuc 5F2-mIgG2c mAb(i.p.를 통해 식염수 200 ml 중 200 mg)를 종양-보유 마우스에 제공하였다(마우스는 종양 용적에 따라 2개의 그룹으로 무작위로 배정되었음). 식염수 200 ml를 투여받은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 종양 용적은 상기 기재된 바와 같이 측정되었고, 연구는 17일에 종결되었다. 그룹당 n=4 내지 5.
도 13a 내지 도 13d & 도 14a 및 도 14b; BT271-308
비푸코실화 항-CD39 모노클로날 항체( mAb ) 5F2- mIgG2c는 생체내 에서 확립된 MC38 결장직장암에 대한 항-종양 활성을 입증한다. 0일에 1.0x105 MC38 세포를 야생형 FoxP3-GFP 녹인 리포터 마우스(9주 내지 12주령의 수컷 및 암컷 모두)의 오른쪽 아래 옆구리에 피하로(s.c.) 주사하였다. 7일, 10일, 14일 및 21일에 Afuc 5F2-mIgG2c mAb(i.p.를 통해 식염수 200 ml 중 200 mg)를 종양-보유 마우스에 제공하였다(마우스는 성별당 종양 용적에 따라 2개의 그룹으로 무작위로 배정되었음). 식염수 200 ml를 투여받은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 종양 용적을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 임의의 종양 용적이 대략 4000 mm3에 도달하면 연구가 종결되었다. 수컷의 경우 그룹당 n=6, 암컷의 경우 그룹당 n=8.
도 15 내지 도 23c; BT391-409.
비푸코실화 5F2- mIgG2c mAb에 의한 MC38 성장의 억제는 주요 면역 세포 구획에서 감소된 CD39 발현 및 선택된 면역 세포 아형에서 CTLA -4의 동시 감소와 관련이 있다. 0일에 1.0x105 MC38 세포를 야생형 FoxP3-GFP 녹인 리포터 마우스(10주 내지 12주령의 수컷; 인하우스)의 오른쪽 아래 옆구리에 피하로(s.c.) 주사하였다. 10일, 13일 및 16일에 Afuc 5F2-mIgG2c mAb(i.p.를 통해 식염수 200 ml 중 200 mg)를 종양-보유 마우스에 제공하였다(마우스는 종양 용적에 따라 2개의 그룹으로 무작위로 배정되었음). 식염수 200 ml를 투여받은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 종양 용적은 상기 기재된 바와 같이 측정되었고, 연구는 18일에 종결되었다. 혈장을 수집하였다. 비장, 오른쪽 서혜부 림프절(배수 림프절(DLN)로 간주됨 및 전체 종양(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec)의 마우스 종양 분리 키트 및 gentleMACS 분리기(Dissociator)를 사용함)으로부터 단일-세포 현탁액을 준비하고, CytoFLEX 유세포 분석기를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다. CD45는 모든 림프구를 게이팅하기 위한 표면 마커로 사용되었다. 5F2와 완전히 다른 에피토프를 인식하는 랫트 항-마우스 CD39 항체인 Duha59(바이오레전드(Biolegend))를 FACS 염색에 사용하였다. 그룹당 n=8.
도 24a 내지 도 27; BT371-386. 건강한 종양이 없는 마우스
비푸코실화 5F2- mIgG2c mAb 처리는 또한 종양이 없는 건강한 야생형 마우스의 주요 면역 세포 구획에서 CD39 발현을 종양-보유 마우스보다 훨씬 적은 정도로 감소시킨다. 1일 및 4일에 건강한 야생형 FoxP3-GFP 녹인 리포터 마우스(8주 내지 10주령의 수컷; 인하우스)에게 2회 용량의 Afuc 5F2-mIgG2c mAb(i.p.를 통해 식염수 200 ml 중 200 mg)를 투여하였다. 식염수 200 ml를 투여받은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 연구는 5일에 종결되었다. 혈장을 수집하였다. 비장, 양쪽 다리의 서혜부 림프절 및 간으로부터 단일-세포 현탁액을 준비하고, CytoFLEX 유세포 분석기를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다. CD45는 모든 림프구를 게이팅하기 위한 표면 마커로 사용되었다. 5F2와 완전히 다른 에피토프를 인식하는 항-마우스 CD39 항체인 Duha59를 FACS 염색에 사용하였다. 그룹당 n=6.
도 28; CTX1 -10. 간 및 신장 세포독성을 위한 건강한 종양이 없는 마우스
건강한 야생형 마우스에서 비푸코실화 5F2- mIgG2c mAb의 안전성 평가 1일, 4일 및 7일에 건강한 야생형 C57BL/6 마우스(8주 내지 12주령의 수컷; 타코닉)에게 두 상이한 농도(100 mg(CTX5 -7) 또는 1000 mg(CTX8 -10))로 3회 용량의 Afuc 5F2-mIgG2c mAb를 i.p.를 통해 투여하였다. 식염수 200 ml(CTX1) 또는 IgG2c 이소형 대조 항체(제품 번호 PZMU007; 에이비 바이오사이언시즈(AB Biosciences), 매사추세츠주 콩코드 소재)(CTX2 -4) 100 mg을 투여받은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 연구는 8일에 종결되었다. 자동화된 자동분석기(ABL80 FLEX CO-OX; 라디오미터 아메리카 인코포레이티드(Radiometer America Inc.), 캘리포니아주 브레아 소재)를 사용하여 혈장 ALT, AST 및 BUN 농도를 측정하였다.
도 29a 내지 도 34c; BT431-445. 4개의 다양한 5F2 mAb를 투여받은 건강한 종양이 없는 마우스
종양이 없는 건강한 야생형 마우스에서, 비푸코실화 5F2- mIgG2c mAb 처리는 임의의 다른 유형의 5F2 mAb와 비교하여 모든 주요 면역 세포 구획에서 CD39 발현을 가장 극적으로 감소시킨다. 1일 및 4일에 건강한 야생형 FoxP3-GFP 녹인 리포터 마우스(15주 내지 16주령의 암컷; 인하우스)를 다양한 5F2 mAb(i.p.를 통해 식염수 200 ml 중 각각의 mAb 200 mg)로 처리하였다. 식염수 200 ml를 투여받은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 연구는 6일에 종결되었다. 비장, 양쪽 다리의 서혜부 림프절 및 혈액으로부터 단일-세포 현탁액을 준비하고, CytoFLEX 유세포 분석기를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다. CD45는 모든 림프구를 게이팅하기 위한 표면 마커로 사용되었다. 5F2와 완전히 다른 에피토프를 인식하는 랫트 항-마우스 CD39 항체인 Duha59를 FACS 염색에 사용하였다. 그룹당 n=3.
도 35a 및 35b & 36; BT471-485. Afuc 5F2- mIgG2c를 투여받은 LysMCre /CD39 KO MC38 종양-보유 마우스
비푸코실화 5F2- mIgG2c mAb는 단핵구 및 대식세포( LysMCre / CD39KO )에서 CD39의 조건부 결실로 마우스에서 MC38 종양 성장을 차단하지 못한다. 0일에 1.0x105 MC38 세포를 LysMCre/CD39KO 마우스(10주 내지 16주령의 암컷; 인하우스)의 오른쪽 아래 옆구리에 주사하였다(피하). 8일, 11일 및 14일에 Afuc 5F2-mIgG2c mAb(i.p.를 통해 식염수 200 ml 중 200 mg)를 종양-보유 마우스에 제공하였다(마우스는 종양 용적에 따라 2개의 그룹으로 무작위로 배정되었음). 식염수 200 ml를 투여받은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 종양 용적을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 연구는 27일에 종결되었다(임의의 종양 용적이 대략 4000 mm3에 도달함). 그룹당 n=5.
도 37a 내지 도 46d; BT541-584. 4개의 다양한 5F2 mAb를 투여받은 MC38 종양-보유 마우스
비푸코실화 5F2- mIgG2c는 다른 유형의 5F2 mAb보다 확립된 MC38 결장직장암 에 대해 우수한 생체내 종양-억제 활성을 나타낸다. 0일에 1.0x105 MC38 세포를 야생형 FoxP3-GFP 녹인 리포터 마우스(8주 내지 16주령의 수컷; 인하우스)의 오른쪽 아래 옆구리에 주사하였다(피하). 9일, 12일 및 15일에 다양한 5F2 mAb(i.p.를 통해 식염수 200 ml 중 각각의 mAb 200 mg)를 종양-보유 마우스에 제공하였다(마우스는 5개의 그룹으로 무작위로 배정되었음). 종양 용적을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 연구는 17일에 종결되었다. 식염수 200 ml를 투여받은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 비장, 오른쪽 서혜부 림프절(배수 림프절(DLN)로서), 혈액뿐만 아니라 종양으로부터 단일-세포 현탁액을 준비하고, CytoFLEX 유세포 분석기를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다. CD45는 모든 림프구를 게이팅하기 위한 표면 마커로 사용되었다. 5F2와 완전히 다른 에피토프를 인식하는 항-마우스 CD39 항체인 Duha59를 FACS 염색에 사용하였다. 식염수 그룹에서 n=7, mAb 처리된 마우스에서 그룹당 n=4 내지 5.
도 47a 및 47b; 항-PD-1 Ab를 투여받은 흑색종-보유 wt 또는 CD39 눌 마우스
흑색종-보유 wt 마우스를 항-PD-1로 처리하였다. 항-PD-1은 wt 마우스에서만 항종양 효과를 나타냈지만 CD39 눌 마우스에서는 나타나지 않았다. 이것은 PD-1이 적어도 부분적으로 퓨린성 시그널링 경로와 공통된 경로를 이용하여 기능할 수 있음을 시사한다.
도 48a 내지 도 48e 및 49a 내지 도 49d; CD39 발현 및 고갈
PB1(도 48a), PB2(도 48b), PB3(도 48c), PB4(도 48d) 및 PB5(도 48e)로 지정된 항-hCD39 항체는 적어도 부분적으로 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 통해 매개된 그 밖에 CD39-양성 인간 B 림프모구 세포에서 CD39를 고갈시킬 수 있다. CD39-발현 HCC1739BL 세포를 인간 Fc(IgG1)(4 μg/ml) 또는 인간 IgG1 이소형 대조군(4 μg/ml)으로 키메라화된 토끼 항-hCD39 항체의 존재 하에 THP-1 단핵 세포(THP-1:HCC1739BL = 3:2)와 함께 또는 없이 43시간 또는 2시간 동안 공동 배양하였다. HCC1739BL 세포에서 CD39 발현은 이 키메라 항체와 다른 에피토프를 인식하는 염색 항체에 의해 검출되었다. THP-1 및 HCC1739BL 세포는 CytoFlexLX 유세포 분석기를 사용하여 CD20 염색에 의해 개별적으로 게이팅되었다. 각 도면의 첫 번째 패널은 인간 IgG1 이소형 대조군으로 처리된 세포와 대조적으로 키메라 항체로 처리된 세포의 상대적 강도로 공동 배양 내에서 표현되는 데이터이다. 각 도면의 두 번째 패널은 HCC1739BL 세포 단독과 비교하여 공동 배양된 세포의 상대적 강도로 표현되는 데이터이다.
항-hCD39 항체는 메커니즘을 통해 CD39의 고갈을 유발하고, HCC1739BL 세포에서 쉐딩 및/또는 내재화를 또한 포함할 수 있다. CD39-발현 HCC1739BL 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 지정된 시간 동안 인간 Fc(IgG1)(2 μg/ml)로 키메라화된 토끼 항-hCD39 항체와 인큐베이션하였다. 항체 인큐베이션 후, 세포를 2번 세척하고 이차 항체(AF488과 접합된 당나귀 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 항체)로 염색한 다음 CytoFlexLX 기계에서 유세포 분석하였다. 도 49a는 PB1을 도시하고, 도 49b는 PB3을 도시하고, 도 49c는 PB4를 도시하고, 도 49d는 PB5를 도시한다.
IHC 데이터 설명:
MC38-보유 마우스로부터 얻은 s.c. 종양 절편의 면역조직화학 염색은 CD39의 단백질 발현이 종양-침윤 림프구와 종양 혈관계 모두에서 식염수-처리된 대조군 마우스의 종양 부위 내에서 강하게 유도됨을 보여주었다(CD31에 대해 염색됨). 흥미롭게도 Afuc 5F2-mIgG2c mAb 처리시, 두 종양 세포 구획에서 이러한 높은 수준의 CD39가 현저하게 감소되었다. 이들 데이터는 Afuc 5F2-mIgG2c mAb를 단독으로(단일요법으로서) 사용하는 CD39의 차단이 이들 2개의 주요 종양 세포 구획 내에서 CD39 기능의 동시 억제, 예를 들어, 항암 면역 증강 및 종양 혈관신생 제한에 의해 향상된 항암 활성을 달성할 수 있음을 나타낸다.
재료 및 방법
동물:
7주령 수컷 또는 암컷 야생형 C57BL/6 마우스는 타코닉(매사추세츠주) 또는 더 잭슨 래보러토리(메인주 바하버)에서 구입하여, 실험 전 적어도 1주 내지 2주 동안 베스 이스라엘 디코니스 메디컬 센터(Beth Israel Deaconess Medical Center; BIDMC)의 동물 연구 시설에 호스팅되었다. C57BL/6 균주(리포터 마우스 균주는 FoxP3+ Treg 세포에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현시킴)의 8주 내지 18주령 수컷 또는 암컷 야생형 FoxP3-GFP 녹인 마우스를 이전에 설명한 대로 생성하였다(Deaglio et al. J. Exp Med (2007) 204:1257; and Sun et al. Gastroenterology (2010) 139:1030). CD39flox 대립유전자를 함유하는 마우스를 골수 계통-특이적 프로모터인 리소좀 M(LysM)(더 잭슨 래보러토리의 재고 번호 004781)의 제어 하에 Cre 리콤비나아제를 발현시키는 마우스와 교배하여 단핵구, 성숙한 대식세포 및 과립구에서 CD39가 결실된 마우스(LysMCre/CD39KO)를 생성하였다. 동물 실험 프로토콜은 BIDMC의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committees; IACUC)에 의해 검토되고 승인되었다.
세포주:
전장 마우스 CD39 cDNA 유전자(AF037366)를 MluI 및 XhoI 부위에서 pTOG3 벡터(안타젠(Antagen), 매사추세츠주 보스톤 소재)에 클로닝하였다. pTOG3-mCD39 1.0 μg을 제조업체의 지침에 따라 푸젠(FuGene) 6 시약을 사용하여 Cre-발현 플라스미드 pOG231(애드진(Addgene))과 함께 CHO-E 세포(안타젠)에 공동 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 5% FBS, 2 mM L-글루타민 및 100 유닛/mL 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 10 cm 조직 배양 플레이트에서 하이그로마이신 B(800 μg/mL)로 세포를 선택하였다. 또 다른 10일 후, 현미경 하에 약물-내성 단일 콜로니를 제거하고 200 μL 피펫 팁을 사용하여 48-웰 플레이트로 옮겼다. FACS 염색으로 식별 된 양성 클론을 확장시키고, 형태 및 성장 측면에서 가장 좋은 클론을 선택하여 mCD39.CHO 세포주를 확립하였다.
전장 인간 CD39 cDNA 유전자(동형 2, P49961-2)를 NotI 및 BamHI 부위에서 pLentiTdT 벡터(안타젠)에 클로닝하였다. pLentiTdT-hCD39 2.0 μg을 제조업체의 지침에 따라 푸젠 6 시약을 사용하여 Env, Gag 및 Pol을 발현시키는 패키징 플라스미드와 함께 HEK293 세포에 공동 형질감염시켰다. 3일 후 렌티바이러스-함유 상청액을 수집하고, Raji 세포를 감염시키는 데 사용하였다. TdTomato-양성 Raji 세포를 FACS로 분류하여 hCD39.Raji 세포주를 확립하였다.
NFAT 반응 요소의 제어 하에 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 인코딩하는 플라스미드 및 인간 FcRγ 공통 사슬 유전자를 인코딩하는 또 다른 플라스미드로 공동 형질감염된 Jurkat 세포는 ADCC 바이오어세이 코어 키트(ADCC Bioassay Core Kit; 제품 번호 G7010)의 일부로 프로메가에서 구입하였다. 이 세포를 항-hFcγRIIIA로 염색하고, FACS로 분류하여 hFcγRIIIA-음성 집단을 얻은 다음 pLentiTdT-mFcγRIV로 추가 감염시켰다. TdTomato 양성 Jurkat 세포를 FACS로 분류하고, 마우스 항체의 ADCC를 측정하기 위한 이펙터 세포로 사용하였다.
종양 세포주 루시퍼라제-발현 B16/F10(luc-B16/F10) 및 MC38 결장직장암 세포는 이전에 기재된 바와 같이, 각각 DMEM(10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 유닛/mL 페니실린 및 스트렙토마이신 및 15 μg/mL 퓨로마이신으로 보충됨) 및 RPMI 1640(10% FBS, 2 mM L-글루타민 및 100 유닛/mL 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충됨)에서 유지되었다(Sun et al. Gastroenterology (2010) 139:1030; and Feng et al. Neoplasia (2011) 13:206).
종양 세포 접종:
Luc-B16/F10 또는 MC38 세포를 트립신 처리에 의해 수거하고, 주사를 위해 2% FBS를 함유하는 HBSS로 재현탁시켰다. 1.0 내지 2.0 × 105 암 세포를 마우스의 오른쪽 아래 옆구리에 피하로(s.c.) 주사하였다. 수직 종양 직경은 종양이 감지될 수 있을 때 디지털 캘리퍼를 사용하여 지정된 시점에 직접 측정되었다. 종양 용적은 적분법: Σt1+t2+....tn(t = t = a2 × b × 0.52; a = 더 작은 종양 직경, b = 더 큰 종양 직경)에 의해 결정되었다. 종양 궤양이 발생하면 조기 안락사를 실시하였다.
항체 및 시약:
모든 화학 물질은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich; 미주리주 세인트 루이스 소재)에서 입수하였다. 생체내 처리를 위한 InVivoMab 항-마우스 PD-1(CD279; 클론 J43)은 바이오엑스셀(BioXCell; 제품 번호 BE0033-2; 뉴햄프셔주 웨스트 라바넌 소재)에서 구입하였다. FACS 분석에 사용된 항체는 바이오레전드(캘리포니아주 샌디에이고 소재), 이바이오사이언스(eBioscience)/써포피셔 사이언티픽(Thermofisher Scientific), 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)(캘리포니아주 새너제이 소재), 및 알앤디 시스템즈(R&D Systems)(미네소타주 미니애폴리스 소재)에서 입수하였다. FACS 항체의 자세한 목록은 표 1에 첨부되었다. 면역조직화학에 사용된 폴리클로날 항체는 토끼 항-마우스 CD31(제품 번호 GWB-330879; 젠웨이 바이오테크 인코포레이티드(Genway Biotech Inc.), 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 및 폴리클로날 양 항-마우스 CD39(제품 번호 AF4398; 알앤디 시스템즈)였다.
ADCC 검정:
검정 하루 전에, 표적 세포를 배지 100 μL 중 10,000개 세포/웰로 낮은 증발 뚜껑이 있는 평평한 바닥의 흰색 불투명 조직 배양 96-웰 플레이트(팔콘(Falcon), 제품 번호 353296)에 시딩하였다. 다음 날, 총 75 μL 배지에 Jurkat 이펙터 세포(200,000개 세포/웰) 및 적정 용량의 항체를 표적 세포에 추가로 첨가하고, 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 실온에서 15분 동안 냉각시키고, 바이오 글로(Bio Glo; 프로메가, 제품 번호 G719A) 75 μL를 각각의 웰에 첨가하였다. 30분 후 글로우형(glow-type) 발광 판독 기능이 있는 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 발광에 대해 판독하였다. 배경에 대한 배수 증가로의 루시퍼라제 활성이 ADCC 활성으로 사용되었다.
혈액, 비장, 림프절(들), 간 또는 종양으로부터 단일-세포 현탁액의 준비:
헤파린화된 혈액을 마우스의 하대정맥에서 채혈하고, 제조업체의 지침에 따라 1X BD RBC 용해 완충액(제품 번호 555899; 비디 바이오사이언시즈) 6 mL를 사용하여 혈액 300 μL를 용해시켰다.
비장세포는 25.5G 바늘이 달린 주사기를 사용하여 비장을 플러싱하고 70 μM 세포 스트레이너로 후속 여과하여 준비되었다. 혈액 세포는 1X BD RBC 용해 완충액(제품 번호 555899; 비디 바이오사이언시즈) 3 mL를 사용하여 가볍게 와동시키고 짧게 원심분리하여 제거되었다.
림프절(들)은 70 μM 세포 스트레이너를 통해 간단히 메쉬(mesh)되었다.
안락사된 마우스에서 간 및/또는 종양을 제거하고, 스캘펄(scalpel)을 사용하여 작은 조각으로 자르고, 제조업체의 지침에 따라 gentleMACS 분리기(밀테니 바이오텍 인코포레이티드, 캘리포니아주 오번 소재)에서 각각 마우스 간 분리 키트(제품 번호 130-105-807) 및 마우스 종양 분리 키트(제품 번호 130-096-730)를 사용하여 효소적 및 물리적 분리를 수행하였다.
유세포 분석:
FACS 연구는 CytoFLEX 유세포 분석기(벡크만 쿨터(Beckman Coulter), 캘리포니아주 브레아 소재)에서 마우스 CD45, CD3, CD4, CD8, CD11b, Gr1, Ly6C, Ly6G, F4/80, B220, CTLA4, PD-1, 및 PD-L1(표 1에 표시됨)에 접합된 항체를 사용하여 수행되었다. FACS 데이터는 CytExpert 2.0(벡크만 쿨터)을 사용하여 분석되었다.
조직학 및 면역조직화학:
s.c. 종양의 파라핀-포매된 또는 동결된 절편은 CD31에 대한 토끼 항-마우스 항체 또는 양 항-마우스 CD39 항체를 사용하여 약간 수정하여 설명된 바와 같은 면역조직화학 염색(IHC)에 의해 분석되었다(Sun et al. Gastroenterology (2010) 139:1030; and Sun et al. Hepatology (2013) 57:205).
통계 분석:
결과는 평균 ± SEM 값으로 표현된다. 통계 분석을 위해, 양측 스튜던츠 t- 검정(two-tailed Students t-test)(두 그룹 간) 또는 터키 사후 검정(Turkey post-test)(3개 이상의 그룹 간)를 사용한 ANOVA가 사용되었다. 동물 생존률(안락사까지의 시간)은 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 분석되고, 로그-순위 검정(log-rank test)(프래프패드 프리즘(GraphPad Prism), 캘리포니아주 라호이아 소재)을 사용하여 비교되었다. 유의성은 P < 0.05로 정의되었다.
표 1. 항체
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
기타 구현예
본 발명이 이의 특정 구현예와 관련하여 설명되었지만, 추가 변경이 가능하며, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고, 본 발명이 속하는 기술 내에서 공지되거나 관례적인 관행에 속하는 본 발명의 그러한 시도를 포함하고, 전술된 본질적인 특징에 적용될 수 있고, 청구범위의 범위를 따르는 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 적응을 포함하도록 의도되는 것으로 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Antagen Institute for Biomedical Research <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR PREVENTING OR REVERSING T-CELL EXHAUSTION THROUGH ECTONUCLEOTIDASE INHIBITION AND ANTIBODY-MEDIATED TARGET CYTOSIS <130> 01948-260WO2 <150> US 62/685,176 <151> 2018-06-14 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Val Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Glu Gly Asp Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Met Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly 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24 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60 gagcagctgg tggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc 120 tgcacagctt ctggattctc cttcagtagc agctactaca tgtgctgggt ccgccaggct 180 ccagggaagg ggctggagtg gatcggatgc atttatattg gtagttctac cacttactac 240 gcgacctggg cgaaaggccg attcaccatc tccaaaacct cgtcgaccgc ggtgactctg 300 caaatgaccg gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag agatcaatat 360 gatgatagtg gtaatttgtg gggcccaggc accctggtca ccgtctcctc agggcaacct 420 aaggctccat cagtcttccc actggccccc tgctgcgggg acacacccag ctccacggtg 480 accctgggct gcctggtcaa aggctacctc ccggagccag tgaccgtgac ctggaactcg 540 ggcaccctca ccaatggggt acgcaccttc ccgtccgtcc ggcagtcctc aggcctctac 600 tcgctgagca gcgtggtgag cgtgacctca agcagccagc ccgtcacctg caacgtggcc 660 cacccagcca ccaacaccaa agtggacaag accgttgcgc cctcgacatg cagcaagccc 720 atgtgcccac cccctgaact cccgggggga ccgtctgtct tcatcttccc cccaaaaccc 780 aaggacaccc tcatgatctc acgcaccccc gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 840 caggatgacc ccgaggtgca gttcacatgg tacataaaca acgagcaggt gcgcaccgcc 900 cggccgccgc tacgggagca gcagttcaac agcacgatcc gcgtggtcag caccctcccc 960 atcgcgcacc aggactggct gaggggcaag gagttcaagt gcaaagtcca caacaaggca 1020 ctcccggccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccagag ggcagcccct ggagccgaag 1080 gtctacacca tgggccctcc ccgggaggag ctgagcagca ggtcggtcag cctgacctgc 1140 atgatcaacg gcttctaccc ttccgacatc tcggtggagt gggagaagaa cgggaaggca 1200 gaggacaact acaagaccac gccgaccgtg ctggacagcg acggctccta cttcctctac 1260 agcaagctct cagtgcccac gagtgagtgg cagcggggcg acgtcttcac ctgctccgtg 1320 atgcacgagg ccttgcacaa ccactacacg cagaagtcca tctcccgctc tccgggtaaa 1380 tag 1383 <210> 25 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60 agatgtgccg atgttgtgat gacccagact ccagcctccg tgtctgaacc tgtgggaggc 120 acagtcacca tcaagtgcca ggccagtcag agcatttaca 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Claims (153)

  1. T-세포 고갈의 감소를 필요로 하는 대상체에서 T-세포 고갈을 감소시키는 방법으로서, 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1("CD39")에 결합하는 항원 결합 도메인 및 FcγRIIIa에 결합하는 FcγRIIIa 결합 모이어티를 포함하는 항-CD39 제제의 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 이 항체의 투여가 CD45+ 면역 세포에서 검출 가능한 CD39의 수준을 감소시키는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, FcγRIIIa 결합 모이어티는 Fc 도메인, FcγRIIIa에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 FcγRIIIa 결합 펩티드로부터 선택되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv(scFv)인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 제제는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하고, (선택적으로) 종양 혈관 내피 파괴로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하거나 종양의 혈관계 네트워크를 붕괴시키는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 3, 5, 7, 9 또는 11의 가변 영역과 적어도 60% 동일한 중쇄 가변 영역, 및 가변 영역 서열 번호: 4, 6, 8, 10 또는 12와 적어도 60% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 이 항체는 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 3, 5, 7, 9 또는 11의 CDR과 적어도 60% 동일한 CDR을 갖는 중쇄, 및 서열 번호: 4, 6, 8, 10 또는 12의 CDR과 적어도 60% 동일한 CDR을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 이 항체는 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 3의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 4의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 5의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 6의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 7의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 8의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체인, 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 9의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 10의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체인, 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 11의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 12의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 제제는 항종양 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 제제는 항바이러스 요법(HIV 및 HBV 감염 치료 포함), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 내장 리슈만편모증 치료와 같은 항-감염 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  14. 항종양 면역 반응을 촉진하는 방법으로서, 종양을 갖는 인간 환자에게 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1("CD39")에 결합하는 항-CD39 항체를 투여하는 것을 포함하고, 이 항체는 FcγRIIIa에 결합하고, 항체-의존적 세포독성(ADCC)을 유지하며, 인간 환자에게 항체를 투여하면 종양의 면역 세포에서 CD39 발현을 감소시키는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 항-CD39 항체는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하고, (선택적으로) 종양 혈관 내피 파괴로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하거나 종양의 혈관계 네트워크를 붕괴시키는, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 항-CD39 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소형인, 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 저푸코실화되거나 비푸코실화되는, 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체인, 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 항원, 면역 체크포인트 또는 공동 자극 수용체에 대한 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이며, 여기서 추가 항원 결합 부위가 면역 체크포인트에 대한 것이라면 체크포인트 억제제로 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동 자극 수용체에 대한 것이라면 공동 자극 작용제로 기능하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 PD-1, PD-L1, CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 및 TIGIT로 이루어진 군으로부터 선택된 체크포인트 단백질에 결합하는, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 T-세포에서 상향조절되고 T-세포 고갈과 관련된 체크포인트 단백질에 결합하는, 방법.
  22. 제19항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 MHCI 분자, BTLA 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a / CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 공동 자극 수용체에 결합하는, 방법.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 고형 종양, 예컨대 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신장암, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 또는 신경교종을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 백혈병과 같은 액체 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  25. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 하나 이상의 화합요법제, 항-혈관신생제, 면역-종양학 제제 및/또는 방사선을 포함하는 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 요법은 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG-3 길항제, TIM-3 길항제 및/또는 TIGIT 길항제와 같은 체크포인트 분자의 하나 이상의 억제제(길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 요법은 GITR 작용제, CD27 작용제, 4-1BB 작용제, OX40 작용제, CD137 작용제, ICOS 작용제 또는 CD28 작용제와 같은 공동 자극 분자의 하나 이상의 활성화제(작용제)를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 요법은 VEGFR 또는 VEGF 길항제, EGFR 또는 EGF 길항제, IDO 억제제, IDO1 억제제, HDAC 억제제, PI3K 델타 억제제, IL-15 작용제, CXCR4 길항제, CXCL12 길항제, DNMT 억제제, 인터류킨-21, 항-KIR 항체, 항-CSF-1R 항체, 항-CCR4 항체, GMCSF, 항-PS 항체, 항-CD30 항체-오르스타틴 E 접합체, 항-CD19 항체, 항-CEA IL-2 항체, 항-NY-ESO-1 항체, 항-NKG2A 항체, STING 작용제, TRL7/8 작용제, RIG-1 작용제 및/또는 NRLP3 억제제, 또는 항-CD73 항체(예컨대 MEDI9447) 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  29. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 백신, 입양 세포 요법, 항종양 유전자 요법, 또는 종양 용해 바이러스 요법을 포함하는 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  30. T-세포 고갈을 예방하거나 역전시키고 종양에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법으로서,
    (i) T-세포 고갈의 하나 이상의 마커가 미리 결정된 역치 이상으로 발현되는 종양 침윤 림프구의 정도를 갖는 암 환자를 식별하는 단계; 및
    (ii) 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1("CD39") 및 FcγRIIIa에 결합하고, 종양 침윤 림프구에서 검출 가능한 CD39 수준을 감소시켜 T-세포 고갈을 역전시키는 항-CD39 항체를 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 항-CD39 항체는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하고, (선택적으로) 종양 혈관 내피 파괴로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하거나 종양의 혈관계 네트워크를 붕괴시키는, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 항-CD39 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소형인, 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 저푸코실화되거나 비푸코실화되는, 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하는, 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 항원, 면역 체크포인트 또는 공동 자극 수용체에 대한 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이며, 여기서 추가 항원 결합 부위가 면역 체크포인트에 대한 것이라면 체크포인트 억제제로 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동 자극 수용체에 대한 것이라면 공동 자극 작용제로 기능하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 PD-1, PD-L1, CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 및 TIGIT로 이루어진 군으로부터 선택된 체크포인트 단백질에 결합하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 T-세포에서 상향조절되고 T-세포 고갈과 관련된 체크포인트 단백질에 결합하는, 방법.
  38. 제36항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 MHCI 분자, BTLA 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a / CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 공동 자극 수용체에 결합하는, 방법.
  39. 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 고형 종양, 예컨대 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신장암, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 또는 신경교종을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  40. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 백혈병과 같은 액체 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  41. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 하나 이상의 화합요법제, 항-혈관신생제, 면역-종양학 제제, 저체온 요법 및/또는 방사선을 포함하는 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 요법은 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG-3 길항제, TIM-3 길항제 및/또는 TIGIT 길항제와 같은 체크포인트 분자의 하나 이상의 억제제(길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 요법은 GITR 작용제, CD27 작용제, 4-1BB 작용제, OX40 작용제, CD137 작용제, ICOS 작용제 또는 CD28 작용제와 같은 공동 자극 분자의 하나 이상의 활성화제(작용제)를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 요법은 VEGFR 또는 VEGF 길항제, EGFR 또는 EGF 길항제, IDO 억제제, IDO1 억제제, HDAC 억제제, PI3K 델타 억제제, IL-15 작용제, CXCR4 길항제, CXCL12 길항제, DNMT 억제제, 인터류킨-21, 항-KIR 항체, 항-CSF-1R 항체, 항-CCR4 항체, GMCSF, 항-PS 항체, 항-CD30 항체-오르스타틴 E 접합체, 항-CD19 항체, 항-CEA IL-2 항체, 항-NY-ESO-1 항체, 항-NKG2A 항체, STING 작용제, TRL7/8 작용제, RIG-1 작용제, P2X7 길항제, 항-CD73 항체(예컨대 MEDI9447) 및/또는 아데노신 A2a 수용체 길항제 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  45. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 백신, 입양 세포 요법, 항종양 유전자 요법, 또는 종양 용해 바이러스 요법을 포함하는 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  46. 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)은 종양 침윤 림프구에서 CD39, PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, CD160, BTLA, 또는 2B4 중 하나 이상의 상향조절의 정도를 나타내는 세포의 수 또는 백분율 또는 항체 염색 강도를 검출하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  47. 제30항 또는 제46항에 있어서, 항-CD39 항체는 T-세포 고갈의 하나 이상의 마커가 미리 결정된 역치 이상으로 발현되는 종양 침윤 림프구의 정도를 갖는 환자에게 투여되고, 이 환자는 비-소세포 폐 암종(NSCLC), 결장직장암, 진행 흑색종, 신세포 암종(RCC), 유방암(삼중 음성 유방암 포함, 위암, 식도암, 요로상피세포 암종(UC), 또는 간세포 암종(HCC)을 갖는, 방법.
  48. T-세포 고갈의 감소를 필요로 하는 대상체에서 T-세포 고갈을 감소시키기 위한 약제학적 제제로서, 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1("CD39")에 결합하고 FcγRIIIa에 결합하는 항체의 치료적 유효량을 포함하고, 이는 투여될 때 CD45+ 면역 세포에서 검출 가능한 CD39 수준을 감소시키고, T-세포 고갈 또는 T-세포 아네르기(anergy)를 나타내는 T-세포에서 T-세포 기능을 회복하는 데 효과적인, 약제학적 제제.
  49. 제48항에 있어서, 항-CD39 항체는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하고, (선택적으로) 종양 혈관 내피 파괴로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하거나 종양의 혈관계 네트워크를 붕괴시키는, 약제학적 제제.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 항-CD39 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소형인, 약제학적 제제.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 저푸코실화되거나 비푸코실화되는, 약제학적 제제.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체인, 약제학적 제제.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 항원, 면역 체크포인트 또는 공동 자극 수용체에 대한 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이며, 여기서 추가 항원 결합 부위가 면역 체크포인트에 대한 것이라면 체크포인트 억제제로 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동 자극 수용체에 대한 것이라면 공동 자극 작용제로 기능하는, 약제학적 제제.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 고형 또는 액체 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 환자에게 투여하기 위해 제형화되는, 약제학적 제제.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 하나 이상의 화합요법제, 항-혈관신생제, 및/또는 면역-종양학 제제와 함께 제형화되는, 약제학적 제제.
  56. 제48항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD39 항체는 인간 CD39에 대한 결합에 대해 모노클로날 항체 5F2와 경쟁하는, 약제학적 제제.
  57. T-세포 고갈의 감소를 필요로 하는 대상체에서 T-세포 고갈을 감소시키기 위한 약제학적 제제로서, 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1("CD39")에 결합하고 FcγRIIIa에 결합하는 항체의 치료적 유효량을 포함하고, 이는 투여될 때 CD45+ 면역 세포에서 검출 가능한 CD39 수준을 감소시키고, T-세포 고갈 또는 T-세포 아네르기를 나타내는 T-세포에서 T-세포 기능을 회복하는 데 효과적이며, 여기서 항체는
    a) 서열 번호: 3의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 4의 CDR을 갖는 경쇄
    b) 서열 번호: 5의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 6의 CDR을 갖는 경쇄,
    c) 서열 번호: 7의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 8의 CDR을 갖는 경쇄,
    d) 서열 번호: 9의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 10의 CDR을 갖는 경쇄, 또는
    e) 서열 번호: 11의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 12의 CDR을 갖는 경쇄
    를 포함하고, 중쇄 및 경쇄에는 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열이 추가로 포함되는, 약제학적 제제.
  58. 인간 CD39에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부분, 및 종양 항원, 면역 체크포인트 또는 공동 자극 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부분을 포함하는 이중특이적 항체로서, 추가 항원 결합 부위가 면역 체크포인트에 대한 것이라면 체크포인트 억제제로 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동 자극 수용체에 대한 것이라면 공동 자극 작용제로 기능하며, 여기서 이중특이적 항체는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하고, (선택적으로) 종양 혈관 내피 파괴로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하거나 종양의 혈관계 네트워크를 붕괴시키는, 이중특이적 항체.
  59. T-세포 고갈의 감소를 필요로 하는 대상체에서 T-세포 고갈을 감소시키기 위한 약제의 제조에 있어서 항-CD39 제제의 약제학적 조성물의 유효량의 용도로서, 상기 조성물은 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1("CD39")에 결합하는 항원 결합 도메인 및 FcγRIIIa에 결합하는 FcγRIIIa 결합 모이어티를 포함하고, 항체를 투여하면 CD45+ 면역 세포에서 검출 가능한 CD39 수준이 감소하는, 용도.
  60. 제59항에 있어서, FcγRIIIa 결합 모이어티는 Fc 도메인, FcγRIIIa에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 FcγRIIIa 결합 펩티드로부터 선택되는, 용도.
  61. 제59항에 있어서, 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv(scFv)인, 용도.
  62. 제59항에 있어서, 항-CD39 제제는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하고, (선택적으로) 종양 혈관 내피 파괴로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하거나 종양의 혈관계 네트워크를 붕괴시키는, 용도.
  63. 제59항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 3, 5, 7, 9 또는 11의 가변 영역과 적어도 60% 동일한 중쇄 가변 영역, 및 가변 영역 서열 번호: 4, 6, 8, 10 또는 12와 적어도 60% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 이 항체는 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는, 용도.
  64. 제59항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 3, 5, 7, 9 또는 11의 CDR과 적어도 60% 동일한 CDR을 갖는 중쇄, 및 서열 번호: 4, 6, 8, 10 또는 12의 CDR과 적어도 60% 동일한 CDR을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 이 항체는 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는, 용도.
  65. 제59항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 3의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 4의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 용도.
  66. 제59항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 5의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 6의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 용도.
  67. 제59항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 7의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 8의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체인, 용도.
  68. 제59항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 9의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 10의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체인, 용도.
  69. 제59항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 11의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 12의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체인, 용도.
  70. 제59항에 있어서, 항-CD39 제제는 항종양 요법의 일부로 투여되는, 용도.
  71. 제59항에 있어서, 항-CD39 제제는 항바이러스 요법(HIV 및 HBV 감염 치료 포함), 마이코박테리움 투버쿨로시스 및 내장 리슈만편모증 치료와 같은 항-감염 요법의 일부로 투여되는, 용도.
  72. 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1(“CD39”)에 결합하는 항-CD39 항체의 용도로서, 항체는 종양을 갖는 인간 환자에서 항종양 면역 반응을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 FcγRIIIa에 결합하며, 여기서 항체는 항체-의존적 세포독성(ADCC)을 유지하고 인간 환자에게 항체를 투여하면 종양의 면역 세포에서 CD39 발현을 감소시키는, 용도.
  73. 제72항에 있어서, 항-CD39 항체는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하고, (선택적으로) 종양 혈관 내피 파괴로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하거나 종양의 혈관계 네트워크를 붕괴시키는, 용도.
  74. 제72항에 있어서, 항-CD39 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소형인, 용도.
  75. 제72항에 있어서, 항-CD39 항체는 저푸코실화되거나 비푸코실화되는, 용도.
  76. 제72항에 있어서, 항-CD39 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체인, 용도.
  77. 제72항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 항원, 면역 체크포인트 또는 공동 자극 수용체에 대한 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이며, 여기서 추가 항원 결합 부위가 면역 체크포인트에 대한 것이라면 체크포인트 억제제로 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동 자극 수용체에 대한 것이라면 공동 자극 작용제로 기능하는, 용도.
  78. 제77항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 PD-1, PD-L1, CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 및 TIGIT로 이루어진 군으로부터 선택된 체크포인트 단백질에 결합하는, 용도.
  79. 제77항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 T-세포에서 상향조절되고 T-세포 고갈과 관련된 체크포인트 단백질에 결합하는, 용도.
  80. 제77항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 MHCI 분자, BTLA 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a / CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 공동 자극 수용체에 결합하는, 용도.
  81. 제72항에 있어서, 항-CD39 항체는 고형 종양, 예컨대 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신장암, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 또는 신경교종을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여되는, 용도.
  82. 제72항에 있어서, 항-CD39 항체는 백혈병과 같은 액체 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여되는, 용도.
  83. 제72항에 있어서, 항-CD39 항체는 하나 이상의 화합요법제, 항-혈관신생제, 면역-종양학 제제 및/또는 방사선을 포함하는 요법의 일부로 투여되는, 용도.
  84. 제83항에 있어서, 상기 요법은 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG-3 길항제, TIM-3 길항제 및/또는 TIGIT 길항제와 같은 체크포인트 분자의 하나 이상의 억제제(길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 용도.
  85. 제83항에 있어서, 상기 요법은 GITR 작용제, CD27 작용제, 4-1BB 작용제, OX40 작용제, CD137 작용제, ICOS 작용제 또는 CD28 작용제와 같은 공동 자극 분자의 하나 이상의 활성화제(작용제)를 투여하는 것을 포함하는, 용도.
  86. 제83항에 있어서, 상기 요법은 VEGFR 또는 VEGF 길항제, EGFR 또는 EGF 길항제, IDO 억제제, IDO1 억제제, HDAC 억제제, PI3K 델타 억제제, IL-15 작용제, CXCR4 길항제, CXCL12 길항제, DNMT 억제제, 인터류킨-21, 항-KIR 항체, 항-CSF-1R 항체, 항-CCR4 항체, GMCSF, 항-PS 항체, 항-CD30 항체-오르스타틴 E 접합체, 항-CD19 항체, 항-CEA IL-2 항체, 항-NY-ESO-1 항체, 항-NKG2A 항체, STING 작용제, TRL7/8 작용제, RIG-1 작용제 및/또는 NRLP3 억제제, 또는 항-CD73 항체(예컨대 MEDI9447) 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하는, 용도.
  87. 제72항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 백신, 입양 세포 요법, 항종양 유전자 요법, 또는 종양 용해 바이러스 요법을 포함하는 요법의 일부로 투여되는, 용도.
  88. T-세포 고갈을 예방하거나 역전시키고 종양에 대한 면역 반응을 향상시키기 위한 약제의 제조에 있어서 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1("CD39") 및 FcγRIIIa에 결합하는 항-CD39 항체의 용도로서,
    (i) T-세포 고갈의 하나 이상의 마커가 미리 결정된 역치 이상으로 발현되는 종양 침윤 림프구의 정도를 갖는 암 환자를 식별하는 단계; 및
    (ii) 종양 침윤 림프구에서 검출 가능한 CD39 수준을 감소시켜 T-세포 고갈을 역전시키는 항-CD39 항체를 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 용도.
  89. 제88항에 있어서, 항-CD39 항체는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하고, (선택적으로) 종양 혈관 내피 파괴로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하거나 종양의 혈관계 네트워크를 붕괴시키는, 용도.
  90. 제88항에 있어서, 항-CD39 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소형인, 용도.
  91. 제88항에 있어서, 항-CD39 항체는 저푸코실화되거나 비푸코실화되는, 용도.
  92. 제88항에 있어서, 항-CD39 항체는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하는, 용도.
  93. 제88항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 항원, 면역 체크포인트 또는 공동 자극 수용체에 대한 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이며, 여기서 추가 항원 결합 부위가 면역 체크포인트에 대한 것이라면 체크포인트 억제제로 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동 자극 수용체에 대한 것이라면 공동 자극 작용제로 기능하는, 용도.
  94. 제93항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 PD-1, PD-L1, CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 및 TIGIT로 이루어진 군으로부터 선택된 체크포인트 단백질에 결합하는, 용도.
  95. 제94항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 T-세포에서 상향조절되고 T-세포 고갈과 관련된 체크포인트 단백질에 결합하는, 용도.
  96. 제94항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 MHCI 분자, BTLA 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a / CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 공동 자극 수용체에 결합하는, 용도.
  97. 제88항에 있어서, 항-CD39 항체는 고형 종양, 예컨대 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신장암, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 또는 신경교종을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여되는, 용도.
  98. 제88항에 있어서, 항-CD39 항체는 백혈병과 같은 액체 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여되는, 용도.
  99. 제88항에 있어서, 항-CD39 항체는 하나 이상의 화합요법제, 항-혈관신생제, 면역-종양학 제제, 저체온 요법 및/또는 방사선을 포함하는 요법의 일부로 투여되는, 용도.
  100. 제99항에 있어서, 상기 요법은 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG-3 길항제, TIM-3 길항제 및/또는 TIGIT 길항제와 같은 체크포인트 분자의 하나 이상의 억제제(길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 용도.
  101. 제99항에 있어서, 상기 요법은 GITR 작용제, CD27 작용제, 4-1BB 작용제, OX40 작용제, CD137 작용제, ICOS 작용제 또는 CD28 작용제와 같은 공동 자극 분자의 하나 이상의 활성화제(작용제)를 투여하는 것을 포함하는, 용도.
  102. 제99항에 있어서, 상기 요법은 VEGFR 또는 VEGF 길항제, EGFR 또는 EGF 길항제, IDO 억제제, IDO1 억제제, HDAC 억제제, PI3K 델타 억제제, IL-15 작용제, CXCR4 길항제, CXCL12 길항제, DNMT 억제제, 인터류킨-21, 항-KIR 항체, 항-CSF-1R 항체, 항-CCR4 항체, GMCSF, 항-PS 항체, 항-CD30 항체-오르스타틴 E 접합체, 항-CD19 항체, 항-CEA IL-2 항체, 항-NY-ESO-1 항체, 항-NKG2A 항체, STING 작용제, TRL7/8 작용제, RIG-1 작용제, P2X7 길항제, 항-CD73 항체(예컨대 MEDI9447) 및/또는 아데노신 A2a 수용체 길항제 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하는, 용도.
  103. 제88항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 백신, 입양 세포 요법, 항종양 유전자 요법, 또는 종양 용해 바이러스 요법을 포함하는 요법의 일부로 투여되는, 용도.
  104. 제88항에 있어서, 단계 (i)은 종양 침윤 림프구에서 CD39, PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, CD160, BTLA, 또는 2B4 중 하나 이상의 상향조절의 정도를 나타내는 세포의 수 또는 백분율 또는 항체 염색 강도를 검출하는 것을 추가로 포함하는, 용도.
  105. 제88항에 있어서, 항-CD39 항체는 T-세포 고갈의 하나 이상의 마커가 미리 결정된 역치 이상으로 발현되는 종양 침윤 림프구의 정도를 갖는 환자에게 투여되고, 이 환자는 비-소세포 폐 암종(NSCLC), 결장직장암, 진행 흑색종, 신세포 암종(RCC), 유방암(삼중 음성 유방암 포함, 위암, 식도암, 요로상피세포 암종(UC), 또는 간세포 암종(HCC)을 갖는, 용도.
  106. 제1항에 있어서, 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv(scFv)인, 방법.
  107. 제1항에 있어서, 항-CD39 제제는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하고, (선택적으로) 종양 혈관 내피 파괴로부터 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하거나 종양의 혈관계 네트워크를 붕괴시키는, 방법.
  108. 제1항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 3, 5, 7, 9 또는 11의 가변 영역과 적어도 60% 동일한 중쇄 가변 영역, 및 가변 영역 서열 번호: 4, 6, 8, 10 또는 12와 적어도 60% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 이 항체는 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  109. 제1항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 3, 5, 7, 9 또는 11의 CDR과 적어도 60% 동일한 CDR을 갖는 중쇄, 및 서열 번호: 4, 6, 8, 10 또는 12의 CDR과 적어도 60% 동일한 CDR을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 이 항체는 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  110. 제1항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 3의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 4의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
  111. 제1항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 5의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 6의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
  112. 제1항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 7의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 8의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체인, 방법.
  113. 제1항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 9의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 10의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체인, 방법.
  114. 제1항에 있어서, 항-CD39 제제는 서열 번호: 11의 CDR을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 12의 CDR을 갖는 경쇄, 및 인간 CD39에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 인간화된 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위한 인간 프레임워크 서열을 포함하는 항체인, 방법.
  115. 제1항에 있어서, 항-CD39 제제는 항종양 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  116. 제1항에 있어서, 항-CD39 제제는 항바이러스 요법(HIV 및 HBV 감염 치료 포함), 마이코박테리움 투버쿨로시스 및 내장 리슈만편모증 치료와 같은 항-감염 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  117. 제14항에 있어서, 항-CD39 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소형인, 방법.
  118. 제14항에 있어서, 항-CD39 항체는 저푸코실화되거나 비푸코실화되는, 방법.
  119. 제14항에 있어서, 항-CD39 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체인, 방법.
  120. 제14항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 항원, 면역 체크포인트 또는 공동 자극 수용체에 대한 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이며, 여기서 추가 항원 결합 부위가 면역 체크포인트에 대한 것이라면 체크포인트 억제제로 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동 자극 수용체에 대한 것이라면 공동 자극 작용제로 기능하는, 방법.
  121. 제120항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 PD-1, PD-L1, CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 및 TIGIT로 이루어진 군으로부터 선택된 체크포인트 단백질에 결합하는, 방법.
  122. 제120항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 T-세포에서 상향조절되고 T-세포 고갈과 관련된 체크포인트 단백질에 결합하는, 방법.
  123. 제120항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 MHCI 분자, BTLA 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a / CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 공동 자극 수용체에 결합하는, 방법.
  124. 제14항에 있어서, 항-CD39 항체는 고형 종양, 예컨대 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신장암, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 또는 신경교종을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  125. 제14항에 있어서, 항-CD39 항체는 백혈병과 같은 액체 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  126. 제14항에 있어서, 항-CD39 항체는 하나 이상의 화합요법제, 항-혈관신생제, 면역-종양학 제제 및/또는 방사선을 포함하는 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 요법은 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG-3 길항제, TIM-3 길항제 및/또는 TIGIT 길항제와 같은 체크포인트 분자의 하나 이상의 억제제(길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  128. 제126항에 있어서, 상기 요법은 GITR 작용제, CD27 작용제, 4-1BB 작용제, OX40 작용제, CD137 작용제, ICOS 작용제 또는 CD28 작용제와 같은 공동 자극 분자의 하나 이상의 활성화제(작용제)를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  129. 제126항에 있어서, 상기 요법은 VEGFR 또는 VEGF 길항제, EGFR 또는 EGF 길항제, IDO 억제제, IDO1 억제제, HDAC 억제제, PI3K 델타 억제제, IL-15 작용제, CXCR4 길항제, CXCL12 길항제, DNMT 억제제, 인터류킨-21, 항-KIR 항체, 항-CSF-1R 항체, 항-CCR4 항체, GMCSF, 항-PS 항체, 항-CD30 항체-오르스타틴 E 접합체, 항-CD19 항체, 항-CEA IL-2 항체, 항-NY-ESO-1 항체, 항-NKG2A 항체, STING 작용제, TRL7/8 작용제, RIG-1 작용제 및/또는 NRLP3 억제제, 또는 항-CD73 항체(예컨대 MEDI9447) 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  130. 제14항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 백신, 입양 세포 요법, 항종양 유전자 요법, 또는 종양 용해 바이러스 요법을 포함하는 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  131. 제30항에 있어서, 항-CD39 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소형인, 방법.
  132. 제30항에 있어서, 항-CD39 항체는 저푸코실화되거나 비푸코실화되는, 방법.
  133. 제30항에 있어서, 항-CD39 항체는 CD45+ 면역 세포에서 CD39의 항체-매개된 표적 사이토시스를 유발하는, 방법.
  134. 제30항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 항원, 면역 체크포인트 또는 공동 자극 수용체에 대한 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이며, 여기서 추가 항원 결합 부위가 면역 체크포인트에 대한 것이라면 체크포인트 억제제로 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동 자극 수용체에 대한 것이라면 공동 자극 작용제로 기능하는, 방법.
  135. 제134항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 PD-1, PD-L1, CTLA-4/B7-1/B7-2, PD-L2, NKG2A, KIR, LAG-3, TIM-3, CD96, VISTA 및 TIGIT로 이루어진 군으로부터 선택된 체크포인트 단백질에 결합하는, 방법.
  136. 제135항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 T-세포에서 상향조절되고 T-세포 고갈과 관련된 체크포인트 단백질에 결합하는, 방법.
  137. 제135항에 있어서, 추가 항원 결합 부위는 MHCI 분자, BTLA 수용체, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a / CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 공동 자극 수용체에 결합하는, 방법.
  138. 제30항에 있어서, 항-CD39 항체는 고형 종양, 예컨대 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신장암, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암 또는 신경교종을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  139. 제30항에 있어서, 항-CD39 항체는 백혈병과 같은 액체 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  140. 제30항에 있어서, 항-CD39 항체는 하나 이상의 화합요법제, 항-혈관신생제, 면역-종양학 제제, 저체온 요법 및/또는 방사선을 포함하는 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  141. 제140항에 있어서, 상기 요법은 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG-3 길항제, TIM-3 길항제 및/또는 TIGIT 길항제와 같은 체크포인트 분자의 하나 이상의 억제제(길항제)를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  142. 제140항에 있어서, 상기 요법은 GITR 작용제, CD27 작용제, 4-1BB 작용제, OX40 작용제, CD137 작용제, ICOS 작용제 또는 CD28 작용제와 같은 공동 자극 분자의 하나 이상의 활성화제(작용제)를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  143. 제140항에 있어서, 상기 요법은 VEGFR 또는 VEGF 길항제, EGFR 또는 EGF 길항제, IDO 억제제, IDO1 억제제, HDAC 억제제, PI3K 델타 억제제, IL-15 작용제, CXCR4 길항제, CXCL12 길항제, DNMT 억제제, 인터류킨-21, 항-KIR 항체, 항-CSF-1R 항체, 항-CCR4 항체, GMCSF, 항-PS 항체, 항-CD30 항체-오르스타틴 E 접합체, 항-CD19 항체, 항-CEA IL-2 항체, 항-NY-ESO-1 항체, 항-NKG2A 항체, STING 작용제, TRL7/8 작용제, RIG-1 작용제, P2X7 길항제, 항-CD73 항체(예컨대 MEDI9447) 및/또는 아데노신 A2a 수용체 길항제 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  144. 제30항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 백신, 입양 세포 요법, 항종양 유전자 요법, 또는 종양 용해 바이러스 요법을 포함하는 요법의 일부로 투여되는, 방법.
  145. 제30항에 있어서, 단계 (i)은 종양 침윤 림프구에서 CD39, PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, CD160, BTLA, 또는 2B4 중 하나 이상의 상향조절의 정도를 나타내는 세포의 수 또는 백분율 또는 항체 염색 강도를 검출하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  146. 제30항에 있어서, 항-CD39 항체는 T-세포 고갈의 하나 이상의 마커가 미리 결정된 역치 이상으로 발현되는 종양 침윤 림프구의 정도를 갖는 환자에게 투여되고, 이 환자는 비-소세포 폐 암종(NSCLC), 결장직장암, 진행 흑색종, 신세포 암종(RCC), 유방암(삼중 음성 유방암 포함, 위암, 식도암, 요로상피세포 암종(UC), 또는 간세포 암종(HCC)을 갖는, 방법.
  147. 제48항에 있어서, 항-CD39 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소형인, 약제학적 제제.
  148. 제48항에 있어서, 항-CD39 항체는 저푸코실화되거나 비푸코실화되는, 약제학적 제제.
  149. 제48항에 있어서, 항-CD39 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체인, 약제학적 제제.
  150. 제48항에 있어서, 항-CD39 항체는 종양 항원, 면역 체크포인트 또는 공동 자극 수용체에 대한 적어도 하나의 추가 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이고, 여기서 추가 항원 결합 부위가 면역 체크포인트에 대한 것이라면 체크포인트 억제제로 기능하고, 추가 항원 결합 부위가 공동 자극 수용체에 대한 것이라면 공동 자극 작용제로 기능하는, 약제학적 제제.
  151. 제48항에 있어서, 항-CD39 항체는 고형 또는 액체 종양을 치료하기 위한 항종양 요법의 일부로 환자에게 투여하기 위해 제형화되는, 약제학적 제제.
  152. 제48항에 있어서, 항-CD39 항체는 하나 이상의 화합요법제, 항-혈관신생제, 및/또는 면역-종양학 제제와 함께 제형화되는, 약제학적 제제.
  153. 제48항에 있어서, 항-CD39 항체는 인간 CD39에 대한 결합에 대해 모노클로날 항체 5F2와 경쟁하는, 약제학적 제제.
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