KR20210025930A

KR20210025930A - 애플망고 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20210025930A
Application number: KR1020190105979A
Authority: KR
Inventors: 이인철
Original assignee: 서원대학교산학협력단
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2021-03-10
Also published as: AU2019236633B2; AU2019236633A1; KR102359223B1

Abstract

본 발명은 애플망고 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 애플망고 종자 추출물은 피부 상재균에 대한 항균 활성, 항염증 활성 및 항산화 활성을 가지므로, 항노화 또는 피부 염증 개선을 위한 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물로 활용하여, 효과적으로 피부 염증을 개선하고 노화를 방지할 수 있다.

Description

애플망고 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING MANGIFERA INDICA IRWIN SEED EXTRACT}

본 기술은 애플망고 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 많은 사람들이 다양한 환경에 지속적으로 노출되면서 건강에 대해 관심이 높아졌다. 합성 항산화제를 첨가한 제품보다 천연물을 이용한 천연 항산화 물질에 대한 소비가 증가하고, 화장품 천연원료 소재에 대한 관심이 높아짐에 따라 천연물을 이용한 화장품에 대한 개발도 증가하고 있으며, 산화적 스트레스와 노화된 피부에 효과적으로 대응할 수 있는 신소재로 자연주의 및 다양한 생물 공학 소재가 주목받고 있다.

우리 몸에서 주로 일어나는 산화작용은 대사과정에 따른 다량의 활성산소가 발생하는 것으로, 이러한 활성산소는 체내에서 대부분 분해된다. 하지만 방어 체계의 균형이 깨지면 활성산소가 분해되지 않고 체내에 축적되어 산화적 스트레스에 의한 세포 조직 손상이 발생하고 이는 각종 질병의 원인이 될 수 있다. 활성산소는 세포 생장에 필요한 물질이지만, 환경오염이나 화학 물질에 대한 노출, 스트레스, 비만 등에 의하여 생성량이 증가하거나 제거 시스템의 기능이 약화되는 경우, 산화적 손상을 야기해 여러 가지 질병을 유발한다. 또한, 외부적 영향으로 피부에서 분비되는 피지들이 모여 피부 염증을 유발하는 피부 상재균의 활성이 높아져 피부에 염증 유발과 노화를 가속화한다.

염증 반응은 체내의 세포가 물리적 충격이나 세균 감염 등의 자극에 의한 피부 손상으로부터 인체를 보호하기 위한 생체 방어 기전이다. 체내에서 염증 반응의 조절은 비정상적인 자극에 대하여 다양한 면역세포가 관여하지만 그중 대식세포는 선천적 면역뿐만 아니라 다양한 숙주 반응에 관여하여 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히 산화질소 합성효소(Nitric Oxide Synthase, NOS) 및 프로스타글라딘(prostaglandin, PG)의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 산화질소(NO)를 생성시키는 효소인 NOS와 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 프로스타글라딘류를 합성하는데 관련된 효소인 고리형 산화효소(cyclooxygenase, COX)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 목표가 되고 있다.

망고(Mango, Mangifera indica)는 옻나무과(Anacardiaceae) 망고 속(Mangifera)으로 분류되며, 학명은 Mangifera indica이다. 망고는 쌍떡잎식물 무환자나무목 옻나무과의 상록교목으로 높이가 15~18 m 정도에 이르며, 잎은 창처럼 생겼으며 길이가 30 cm 정도이다. 계 30대 작물 중 하나로 세계적으로 열대 지역과 아열대 지역에서 재배되는 주요 작물이며, 현재 제주도에서는 최근 지구 온난화에 따른 기후변화 대응으로 비닐하우스를 이용한 새로운 고소득 작물인 열대 과수 재배에 대한 관심이 높아짐에 따라 망고가 재배되고 있다.

망고의 품종은 2,000 여종으로 매우 다양하며 품종에 따라 과일의 색상, 향, 섬유질 등에서 많은 차이를 보인다는 연구 결과가 보고되어 있으며, 망고 내에는 다양한 폴리페놀(polyphenol) 화합물이 존재한다. 현재 망고 껍질과 잎에 관한 생리 활성 연구는 많이 입증되어 있으나, 많은 양으로 버려지고 있는 망고씨를 활용한 생리 활성 연구는 미비한 실정이다.

한국등록특허 제10-1872458호 (2018.06.22 등록)

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명은 천연 소재인 애플망고(Mangifera indica irwin) 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 애플망고 종자 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 애플망고 종자 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 피부 상재균 생장 억제용 조성물은 애플망고 종자 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 애플망고(Mangifera indica irwin) 종자 추출물은 피부 염증 질환을 유발하는 피부 상재균에 대한 항균 활성, 항염증 활성 및 항산화 활성을 가지므로, 항노화 또는 피부 염증 개선을 위한 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물로 활용할 수 있고, 이를 활용하여 효과적으로 피부 염증을 개선하고 노화를 방지할 수 있다.

또한, 천연 소재를 활용한 추출물로써 부작용이 적어 안전하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실험예에 따른 애플망고 종자 추출물 농도별 전자공여능을 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른 애플망고 종자 추출물의 항균력 측정 결과를 나타낸 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 세포 생존율(cell viability)을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른 산화질소(NO) 생성률을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실험예에 따른 전염증성 인자 발현 여부를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자는 천연 소재인 애플망고(Mangifera indica irwin) 종자 추출물에서 항산화, 함염증 활성 등의 다양한 생리활성 특징들을 발견하여 애플망고 종자 추출물의 화장품 천연 소재로서의 가능성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서, "추출물"이란, 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고 천연물의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 의미하는 것으로, 천연물의 성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함할 수 있다.

본 명세서에서, "화장료"란, 피부 노화 등의 예방 또는 개선의 효과를 가지는 기능성 화장료를 포함할 수 있고, 상기 기능성 화장료는 일반 화장료와 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 것으로, 화장품법에 정의된 바에 따라 피부 미백, 피부 주름 개선 등 특정 효능과 효과가 강조된 화장료를 의미한다.

본 발명은 애플망고(Mangifera indica irwin) 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 애플망고 종자는 애플망고에서 과육을 제거한 씨앗부분으로, 바람직하게는 제주도 자생의 애플망고(Irwin)의 종자일 수 있다. 상기 제주도 자생의 애플망고는 아열대에서 생산되고 있는 애플망고를 품종 개량한 것으로 국내 토양에 대한 적응력이 높다. 섬유질이 많고 껍질이 두꺼우며 씨가 큰 외국산에 비해, 개량된 제주도 망고는 껍질이 얇고 씨가 작은 편이며, 당도가 높고 향이 뛰어나다. 상기 애플망고 종자는 자연에서 채취 또는 재배된 애플망고에서 수득한 것일 수 있고, 상업적으로 판매되는 것을 구입한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 애플망고 종자 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출된 것일 수 있고, 바람직하게는 열수 추출물 또는 60 내지 80 중량% 에탄올 수용액 추출물, 보다 바람직하게는 70 중량% 에탄올 수용액 추출물일 수 있다.

상기 애플망고 종자 추출물은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출될 수 있고, 예를 들어, 열수 추출, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등이 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 애플망고 종자 추출물은 항균 활성을 가질 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 애플망고 종자 추출물은 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli; 이하, E.coli), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus; 이하, S.aureus) 및 스테필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis; 이하, S.epidermidis)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 피부 상재균에 대해 항균 활성을 가질 수 있다.

본 명세서에서, "항균" 또는 "항균 활성"이란, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물에 대해 저항하는 성질로, 보다 상세하게는 항생 물질 등이 상기 미생물의 성장 또는 증식을 억제하는 특징을 의미한다.

본 명세서에서, "피부 상재균"이란, 피부와 같은 생체의 특정 조직과 밀접한 관계를 유지해온 미생물로, 유해균으로부터 피부를 보호하고 유익한 작용을 하기도 하나, 과잉 증식되거나 유해물질을 생성하는 경우, 저항력이 약한 사람에게는 기회감염균이 되어, 피부 염증 질환 등을 유발할 수 있다.

본 발명의 일 실험예에 따르면, 애플망고 종자 에탄올 추출물의 농도에 따라 항균 활성이 증가하는 것으로 나타났고, E.coli, S.aureus 및 S.epidermidis의 모든 균주에서 비교적 높은 항균 활성이 나타났으며, 특히 E.coli에서 가장 높은 항균 활성이 나타났다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 애플망고 종자 추출물은 항염증 활성을 가질 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 애플망고 종자 추출물은 산화질소(NO) 생성을 감소시키거나 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현을 억제할 수 있다.

본 명세서에서, "항염증"은 염증을 억제하는 것을 의미하는 것으로, 상기 염증은 상처나 질병에 반응하는 인체의 면역 반응으로, 자외선이나 활성산소, 자유라디칼 등의 산화적 스트레스 등이 염증성 인자를 활성화시켜 각종 질병 및 피부의 노화를 일으킨다.

본 발명의 일 실험예에 따르면, 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide; 이하, LPS)에 의해 세포의 NO 생성이 급격히 증가하였으나, 애플망고 종자 열수 추출물 또는 애플망고 종자 에탄올 추출물을 처리한 경우, 농도 의존적으로 NO 생성률이 감소하는 것으로 나타났다.

또한, COX-2 단백질의 발현량을 측정하였을 때, LPS 처리에 의해 증가한 COX-2 단백질의 발현량이 상기 추출물을 처리한 경우, 농도 의존적으로 COX-2 단백질 발현이 감소하는 것으로 나타났다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 애플망고 종자 추출물은 항산화 활성을 가질 수 있다.

본 명세서에서, "항산화"란, 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 생체 내 산화적 스트레스로 인해 세포 손상 및 병리적 질환이 유발되며, 노화의 직접적인 원인이 되기도 한다.

본 발명의 일 실험예에 따르면, 애플망고 종자 추출물은 항산화 물질인 폴리페놀의 높은 함량을 가지는 것으로 나타났고, 자유라디칼 소거 활성을 측정하였을 때, 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타나, 우수한 항산화 효과를 가짐을 확인하였다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상술한 바와 같이 항균 활성, 항염증 활성 및 항산화 활성을 가지므로, 항노화 또는 피부 염증 개선용 화장료 조성물로 활용할 수 있다.

본 명세서에서, "항노화"란, 노화를 억제하거나 노화에 역행하도록 하는 것으로, 노화가 진행될수록 피부 구성 물질이 변하거나 감소되며 자유라디칼 및 활성 유해 산소 등에 의한 산화적 스트레스를 받게 되고, 피부 주름이 증가하거나 탄력이 감소하는 변화가 나타난다.

본 발명의 일 실험예를 통해 애플망고 종자 추출물에서 피부 염증 질환을 유발하는 피부 상재균에 대한 항균 효과를 확인하였고, 피부 염증 개선 및 피부 노화 방지에도 효과적임을 확인함으로써, 상기 애플망고 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 항노화 또는 피부 염증 개선용으로 활용할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 애플망고 종자 추출물은 전체 화장료 100 중량부에 대하여 0.001 내지 50 중량부로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 식품 의약품 안전청에 등록된 화장품 원료 리스트 및 ICID(국제화장품 원료집)에 등재되어 있는 성분 중에서 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 방향제, 계면활성제, 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제, 방부제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 염료 및 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 하나 이상 더 포함할 수 있다.

상기 비타민은 수용성 또는 유용성 비타민을 포함할 수 있고, 상기 수용성 비타민은 수용성 비타민으로서 화장품에 배합 가능한 것으로, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 콜라겐 합성이 도움을 주는 비타민 C를 포함할 수 있다. 또한, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 포함될 수 있고, 상기 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 화장수, 유액, 로션, 크림, 페이스트, 젤, 용액, 현탁액, 오일, 왁스, 팩, 파우더, 파운데이션, 스프레이, 계면활성제-함유 클렌징 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 수렴 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 밀크 로션, 파우더, 에센스, 아이 크림, 선로션, 선크림, 메이크업 프라이머, 메이크업 베이스, 비비크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 비누, 팩, 스틱상 제품, 밤(Balm) 타입 제품, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물이 크림 또는 젤 제형인 경우에는 담체 성분으로 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등을 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물이 용액 또는 유탁액 제형인 경우에는 용매, 용매화제 또는 유탁화제로, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등을 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물이 현탁액 제형인 경우에는 담체 성분으로 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등을 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물이 파우더 또는 스프레이 제형인 경우에는 담체 성분으로 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더를 더 포함할 수 있고, 특히 스프레이 제형인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물이 계면활성제-함유 클렌징 제형인 경우에는 담체 성분으로 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 단독 또는 중복으로 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

본 발명은 애플망고(Mangifera indica irwin) 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 또는 피부 염증 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

상기 애플망고 종자 추출물은 상술한 바와 같이 피부 염증 질환을 유발하는 피부 상재균에 대한 항균 활성, 항염증 활성 및 항산화 활성을 가지므로, 항노화 또는 피부 염증 개선을 위한 피부 외용제 조성물로 활용할 수 있다.

본 명세서에서, "피부 외용제"란, 피부 외부에 직접 적용할 수 있는 제제로, 화장료 조성물을 포함할 수 있고, 그 제형은 연고제, 경고제, 패치, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 애플망고(Mangifera indica irwin) 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 상재균 생장 억제용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 애플망고(Mangifera indica irwin) 종자 추출물 제조

본 발명에 따른 일 실험예에 사용한 애플망고 종자는 제주도 자생의 애플망고 과육을 제거한 후, 실온에 건조시키고 4℃에서 저장하여 이용하였다. 시료의 중량의 약 10배의 물을 가하여 100℃에서 9시간 동안 추출하였고(Heating Mantle, MS-DM608, MTOP6, Korea), 70% 에탄올을 가하여 상온에서 24시간 교반(shaking)하여 추출하였으며, 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 물과 에탄올 추출액은 필터 페이퍼(filter paper, Whatman) NO.4, NO.2를 차례대로 이용하여 여과(진공펌프, DOA-P704-AC, GAST, USA)한 후, 감압 농축기(Rotary Vacuum Evaporator, N-100, EYELA, Tokyo Japan)로 농축(40℃, speed 4~5)하였으며, 이를 동결 건조시켜 냉동실에 보관하면서 하기 실험의 시료로 사용하였다.

하기 실험 결과는 Mean±SD(Standard diviation)로 나타내었고, 분석된 실험 데이터는 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 NOVA를 실시하여 유의성이 있을 경우에 사후검정(post-hoc test)으로 터키검정(Tukey range test)을 실시하여 95% 수준에서 유의성을 검증하였다.

<실험예 1> 총 폴리페놀(Total polyphennols) 함량 확인

본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 애플망고 종자 추출물의 총 폴리페놀 함량은 폴린-데니스법(Folin-Denis, 1912)을 변형하여 측정하였다. 증류수에 10배 희석한 애플망고 종자 추출물 2 ml와 50% 폴린-시오칼테우 시약(Folin-ciocalteu reagent) 2 ml를 혼합한 후, 실온에 3분간 방치하였다. 여기에 10% CaCO₂2 ml를 가하여 혼합한 후, 상온에서 1시간 동안 더 방치하였다가 흡광도 700 nm에서 측정하였다.

하기 표 1은 추출 방법에 따른 애플망고 종자 추출물의 총 폴리페놀 함량을 나타낸 것이다.

	애플망고 종자 열수 추출물(TMD)	애플망고 종자 에탄올 추출물(TME)
총 폴리페놀 (Total polyphennols) (mg/g dry)	214.65 ± 0.67	380.09 ± 0.75

상기 표 1을 참조하면, 각 추출물 분말(powder) 당 함유되어 있는 폴리페놀 함량을 측정한 결과, 애플망고 종자 열수 추출물(TMD)은 214.65±0.67 mg/g, 애플망고 종자 에탄올(70% 에탄올) 추출물(TME)은 380.09±0.75 mg/g으로 높은 함량을 나타났다. 표준 물질인 탄닌산(tannic acid)과 비교하였을 때도 높은 폴리페놀 함량을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 2> 전자공여능(Electron donation ability) 확인

1,1-디페닐-2-피크릴 하이드라질(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl; 이하, DPPH)에 대한 라디칼 소거활성은 Blois(1958)법을 변형하여 측정하였다. 희석한 농도별(5, 10, 25, 50, 100, 500, 1,000μg/ml) 시료 0.5 ml에 60μM DPPH(Sigma, USA) 3 ml를 넣고 5초간 볼텍싱(vortexing)한 다음, 15분 동안 방치한 후 흡광도 517 nm에서 측정하였다.

도 1은 본 발명의 일 실험예에 따른 애플망고 종자 추출물 농도별 전자공여능을 측정한 그래프이다. 전자공여능은 인체 내에서 활성 라디칼에 의한 활성산소 작용의 척도로 사용되는 실험으로, 소거율을 백분율로 환산하여 상기 그래프로 작성하였다. 여기서, Vit-C(vitamin C)는 대조군, TMD는 애플망고 종자 열수 추출물, TME는 애플망고 종자 에탄올 추출물을 의미하며, 그래프의 값은 세번 측정한 값의 평균을 나타낸다.

도 1을 참조하면, 초기 5μg/ml 농도의 각 시료의 전자공여능 측정 결과, 열수 추출물(TMD)은 7.45±0.62 %, 에탄올 추출물(TME)은 16.40±0.88 %로 나타났고, 100μg/ml 농도에서는 90% 이상의 효과를 보였다. 대조군인 Vit-C와 비교하였을 때, 각 추출물 모두 유의한 경향을 보였으며, 농도 의존적으로 모든 추출물에서 증가하는 것으로 나타났다.

<실험예 3> 항균 활성(Antibacterial activity) 확인

본 발명에 따른 항균 활성 실험에 사용한 공시 균주는 피부 상재균으로서 대장균 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli; 이하, E.coli, KCTC 1039), 황색포도상구균 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus; 이하, S.aureus, KCTC 1621), 표피포도상구균 스테필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis; 이하, S.epidermidis, KCTC 1917)는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다. 배양조건은 37℃, 영양 배지(nutrient broth, DB, USA)에 배양하였고 각 균주는 7 ml 액체배지에 접종하여 일정한 시간 간격을 주어 계대배양하면서 활성시켰다.

상기 실시예 1에 따라 제조된 추출물의 항균력을 측정하기 위하여 항균 억제력을 뚜렷하게 확인할 수 있는 여과지원반법(paper disc method)을 이용하여 실시하였다. 평판 배지에 배양된 각 균주를 1 백금이량 취해서 액체배지 7 ml에서 18 ~ 24시간 배양하여 활성화시킨 후, 다시 액체배지 10 ml에 균액을 0.1 ml 접종하여 3 ~ 6시간 배양하고, 평판 배지 1개량 균수를 약 107 cells 되게 접종하여 균일하게 도말하였다. 멸균된 여과지 디스크(filter paper disc, Tokyo, 8 mm, Japan)를 고체 평판 배지에 올려놓은 다음 0.05 ml/disc가 되도록 추출물 시료를 농도별로 흡수시켜 37℃에서 18 ~ 24시간 배양한 뒤, 디스크(disc) 주위의 클리어 존(clear zone, mm)의 직경을 측정하였다.

도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른 애플망고 종자 추출물의 항균력 측정 결과를 나타낸 이미지이고, 하기 표 2는 애플망고 종자 추출물 처리 농도에 따른 각 균주별 클리어 존(clear zone) 직경 측정 결과로, 세번의 측정 값의 평균±SD로 나타내었다.

균주 (strain)	농도 (mg/ml)	클리어 존(clear zone) 직경(mm)
균주 (strain)	농도 (mg/ml)	열수 추출물(WE)	에탄올 추출물(EE)
E.coli	1	- (no clear zone)	9.0±0.0
	5	-	10.0±0.0
	10	-	11.0±0.9
	20	-	13.0±1.1
S.epidermidis	1	-	8.0±0.0
	5	-	9.0±0.7
	10	-	9.5±11
	20	-	11.5±0.8
S.aureus	1	-	8.0±0.0
	5	-	10.0±0.3
	10	-	11.0±0.2
	20	-	13.0±1.0

도 2 및 표 2를 참조하면, 열수 추출물(WE)에서는 활성을 보이지 않았지만, 70% 에탄올 추출물(EE)에서는 추출물의 처리 농도가 증가함에 따라 항균 활성이 증가하는 경향을 나타내었다. 모든 균주에서 대부분 비교적 높은 항균 활성이 확인되었고, 특히 E. Coli에서 9.0~13.0 mm의 높은 저해환을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 애플망고 종자 추출물은 피부 염증 질환을 유발하는 피부 상재균에 대한 항균 소재로서 가능성이 높음을 확인할 수 있었다.

<실험예 4> 세포 독성(cell viability) 확인

마우스 대식세포주인 RAW264.7세포는 한국세포주은행에서 분양받아 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; 이하, FBS, HyClone, USA), 100U/ml 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, HyClone, USA)을 함유한 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco’s Modified Eagle Medium; 이하, DMEM, HyClone, USA) 배양액에서 37℃, 5% CO₂조건으로 배양기에서 배양하였다. 세포의 양은 80~90%정도 자라도록 배양하였다.

상기 실시예 1에 따라 제조된 추출물이 세포에 노출되었을 때 세포에 미치는 생존율을 확인하기 위하여 MTT assay를 진행하였다. 먼저 96 웰 플레이트(well plate)에는 1×10⁵ cells/well이 되도록 분주한 후, 24시간 뒤에 각 농도에 맞도록 배지(media)에 녹인 추출물 시료를 첨가하였다. 3-(4,5-디메틸치아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움브로미드[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT] 2.5mg/ml를 웰에 40μl씩 가하고 배양기(incubator)에 4시간 동안 반응시킨 후 상층액을 제거하였다. 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 섞어 100μl씩 분주하여 완전히 녹인 후, 분광광도계(Benchmark PLUS Bio-Rad)를 이용하여 540 nm에서 측정하였다.

도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 세포 생존율(cell viability)을 측정한 그래프이다. TMD는 애플망고 종자 열수 추출물, TME는 애플망고 종자 에탄올 추출물을 의미하며, 그래프의 값은 세번 측정한 값의 평균을 나타낸다(***p<0.001).

도 3을 참조하면, 애플망고 종자 추출물 농도 100μg/ml에서 95% 이상의 생존율을 나타내었고, 농도 500μg/ml부터 50% 이하의 세포 생존율을 나타내었다. 이에 따라, 이후 실험에는 5, 10, 50, 100μg/ml 농도에서 실험을 진행하였다.

<실험예 5> 산화질소(Nitric Oxide, NO) 저해 활성 확인

산화질소(이하, NO) 측정은 세포의 상층액(supernatant)에서의 NO의 양을 아질산염(nitrite)과 질산염(nitrate)으로서 측정하였다. 아질산염에 대한 질산염으로 환원된 후의 안전한 형태인 그리스 시약(griess reagent)을 사용하였으며, 96 웰 플레이트(5×10⁴cells/well)에 RAW264.7 세포의 밀집도(confluence)가 80%일 때, 인산완충용액(phosphate buffer saline; 이하, PBS)으로 2번 세척한 후에 무혈청 배지를 사용하여 18시간 이상 배양시켰다. 이후, 추출물 시료를 농도별로 처리하여 1시간 동안 배양한 후, 리포폴리사카라이드(lipopolysacchride; 이하, LPS) 1μg/ml를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양액의 상층액을 취하여 그리스 시약과 반응시킨 후, ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성률을 백분율로 표시하였다.

도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른 산화질소(NO) 생성률을 측정한 그래프이다. TMD는 애플망고 종자 열수 추출물, TME는 애플망고 종자 에탄올 추출물을 의미하며, 그래프의 값은 세번 측정한 값의 평균을 나타낸다(***p<0.001).

도 4를 참조하면, LPS 처리한 경우 세포의 NO 생성률이 6.758 ± 0.18 mM/ml까지 급격하게 증가하였으나, 애플망고 종자 추출물 시료를 처리한 경우 농도 의존적으로 NO 생성률이 감소하는 것으로 나타났으며, 특히, 100μg/ml에서 열수 추출물은 4.65 ± 0.29 mM/ml, 에탄올 추출물은 4.32 ± 1.03 mM/ml로 가장 많이 감소하는 것으로 나타났다.

<실험예 6> 전염증성 인자 발현 확인

RAW264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후, 6 웰 플레이트에 2×10⁶ cells/well의 세포수가 되도록 3 ml 씩 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 2시간 동안 자극제인 LPS를 처리하여 배양한 다음, 추출물을 농도별로 세포에 처리하여 배양하였다. 24시간 후 단백질 발현을 측정하기 위하여 배지를 제거하고 차가운 PBS로 세척한 후, 세포 용해물(cell lysates)은 리파 버퍼(RIPA buffer)에 Protease&Phosphatase Single-Use inhibitor Cocktail 100X를 첨가하여 단백질을 추출하였다. 단백질을 정량(BCA protein kit)하여, 10% SDS-PAGE에 전기영동한 후, 멤브레인(membrane)으로 트렌스퍼(transfer)하여 5% 스킴 밀크(skim milk)에 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다.

COX-2의 단백질 발현은 강화 화학발광(enhanced chemiluminescence, ECL) 용액(Thermo, USA)을 이용하여 확인하였다. 내부 대조군(Internal control)으로써 1:1000으로 희석한 베타-액틴(β-actin, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA)을 사용하였다.

도 5는 본 발명의 일 실험예에 따른 전염증성 인자 발현 여부를 확인한 결과이다.

도 5를 참조하면, RAW264.7세포에 애플망고 종자 추출물을 5~100μg/ml 농도로 처리하고 COX-2 단백질의 발현량을 측정한 결과, LPS 무처리군에 비해 LPS 단독 처리군과 각 농도별 처리군의 단백질의 발현량이 증가하였으며, 추출물을 처리하였을 때, COX-2 발현량이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

애플망고(Mangifera indica irwin) 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 추출물은,
물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 추출물은,
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli, E.coli), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus, S.aureus) 및 스테필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis, S.epidermidis)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 피부 상재균에 대해 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 추출물은,
산화질소(NO) 생성을 감소시키거나 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현을 억제하여 항염증 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 추출물은,
항산화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은,
항노화 또는 피부 염증 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 추출물은,
전체 화장료 100 중량부에 대하여 0.001 내지 50 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은,
유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 에센스 또는 팩의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
애플망고(Mangifera indica irwin) 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 또는 피부 염증 개선용 피부 외용제 조성물.
애플망고(Mangifera indica irwin) 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 상재균 생장 억제용 조성물.