KR20210023902A - Jak3 선택적 억제제 - Google Patents

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페킹 유니버시티 센젠 그래쥬에이트 스쿨
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Abstract

본 발명은 화학식 (I)/(II)로 나타내어지는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다. 화학식 (I)에서, Rh, Rg, Rf, m, Re, Rd, Ra, Rb, 및 Rc는 상기 설명에서 정의된 바와 같다. 본 발명은 추가로 화학식 (I)/(II)로 나타내어지는 화합물 또는 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이고, 염증, 예컨대 류마티스 관절염 치료를 위한 약물의 제조에서의 화학식 (I)/(II)로 나타내어지는 화합물 또는 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
Figure pct00025

Description

JAK3 선택적 억제제
본 발명은 JAK3 선택적 억제제에 관한 것이다.
JAK 키나제 (JAK) 및 그의 하류 이펙터, 신호 전달자 및 전사의 활성화제 (STAT)는 T 세포 신호 전달에 필수적이다. JAK 패밀리는 4개의 구성원, JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2를 가지며, 이들은 시토카인 수용체에 쌍으로 결합하고 시토카인-매개 신호 경로의 조절에 참여한다. JAK1과 쌍을 형성한 JAK3은 γ-공통 쇄를 함유하는 시토카인 수용체에 결합하고, 인터류킨 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21 등의 신호 전달에 관여한다. 광범위하게 발현되는 다른 JAK와는 달리, JAK3은 조혈 계에서만 발현된다. 따라서, JAK3의 선택적 억제는 안전하고 효과적인 면역 효과를 달성할 수 있을 것으로 일반적으로 여겨졌다.
화이자(Pfizer)가 개발한 승인된 약물인 토파시티닙은 처음에는 선택적 JAK3 억제제로서 개발되었으나, 토파시티닙이 또한 JAK1에 대해 높은 억제 활성을 가지며 실제로 비선택적 JAK 억제제임이 나중에 밝혀졌다.
Figure pct00001
비록 효소 활성의 수준에서 토파시티닙과 유사한 억제 활성을 갖고 있었긴 하지만, 노바티스(Novartis)가 개발한 고도로 선택적인 JAK3 억제제 NIBR3049는 하류 기질 STAT5의 인산화에 대한 세포내 억제 활성의 측면에서 토파시티닙보다 상당히 덜 강력하였다.
Figure pct00002
최근 몇년 동안, 현재 임상 II상 연구 중인 화이자가 개발한 PF-06651600을 포함한, JAK3의 특유한 시스테인 잔기인 Cys909를 공유적으로 표적화함으로써 고도로 선택적인 JAK3 억제제를 수득하였다.
Figure pct00003
높은 효소 활성 및 세포 활성을 가진 JAK3 선택적 억제제에 대한 관련 기술분야의 긴급한 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명의 목적 중 하나는 생물학적 활성을 가진 JAK3 선택적 억제제를 제공하는 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 (그의 안정한 동위원소 대체물 포함) 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
Figure pct00004
여기서,
Rh는 H 또는 메틸, 바람직하게는 H이고;
Rg는 CH, -C-Rf 또는 N, 바람직하게는 CH이고;
Rf는, 바람직하게는 메틸 또는 할로겐 (예컨대 F, Cl, Br 또는 I)으로부터 선택된 치환기이고;
m은 0, 1, 2 또는 3, 바람직하게는 0 또는 1, 보다 바람직하게는 0이고;
Re는 3급 아민 양이온 (-N+R'3, 여기서 R'는 H 및 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택됨), 니트로 (-NO2), 트리할로메틸 (-CX3, X=F, Cl, Br 또는 I), 할로겐 (예컨대 F, Cl, Br 및 I), 포르밀 (-CHO), 아실 (-CO-C1-4 알킬), 카르복실 (-COOH), 시아노 (-CN), 술폰산 기 (-SO3H)로 이루어진 군으로부터 선택된 전자-구인성 기이고;
Rd는, 예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는, 알케닐 또는 알키닐이고;
Ra, Rb 및 Rc는 하기 조합으로부터 선택된다:
(1) Rb는 C1-C4 알킬렌 (예를 들어 C1-C3 알킬렌, 예컨대 메틸렌, 에틸리덴, 1,3-프로필리덴)이고,
Ra 및 Rc는 수소 또는 C1-C6 알킬 (예를 들어 C1-C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸)임;
(2) Rb는 C1-C4 알킬렌 (예를 들어 C1-C3 알킬렌, 예컨대 메틸렌, 에틸리덴, 1,3-프로필리덴)이고,
Ra 및 Rc는 함께 부착되어 C2-C4 알킬렌 (예를 들어 C2-C3 알킬렌, 예컨대 에틸리덴, 1,3-프로필리덴)을 형성함;
(3) Ra는 수소 또는 C1-C6 알킬 (예를 들어 C1-C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸)이고,
Rb 및 Rc는 이들이 부착되는 N 원자와 함께 N 원자 함유 5- 또는 6-원 포화 헤테로시클릭 고리를 형성함;
(4) Rc는 수소 또는 C1-C6 알킬 (예를 들어 C1-C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸)이고,
Ra 및 Rb는 이들이 부착되는 N 원자와 함께 N 원자 함유 5- 또는 6-원 포화 헤테로시클릭 고리를 형성함.
한 측면에서, 본 발명은 화학식 II의 화합물 (그의 안정한 동위원소 대체물 포함) 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
Figure pct00005
한 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 (그의 안정한 동위원소 대체물 포함) 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화학식 II의 화합물 (그의 안정한 동위원소 대체물 포함) 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약상 허용되는 담체는 불활성 고체 충전제 또는 부형제 및 멸균 수용액 또는 유기 용액을 포함한다. 화합물은 원하는 투여량을 제공하기에 충분한 양으로 제약 조성물에 존재하여야 한다. 본 발명에 개시된 화합물을 제제화하고 투여하는 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Mack Publishing Company, Easton, PA (1995)]에서 찾을 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 염증, 예컨대 류마티스 관절염 치료를 위한 의약의 제조에서의, 화학식 I의 화합물 (그의 안정한 동위원소 대체물 포함) 또는 그의 제약상 허용되는 염, 화학식 II의 화합물 (그의 안정한 동위원소 대체물 포함) 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 본 발명의 제약 조성물의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 JAK3 선택적 억제제로서 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물 (그의 안정한 동위원소 대체물 포함)을 제공한다.
도 1: 키나제 패널에 대한 화합물의 선택성 검정 결과;
도 2 내지 도 5: 화합물의 세포 활성 검정 결과;
도 6 내지 도 8: 세포 내에서 화합물의 선택성 검정 결과;
도 9: 세포 워시아웃(washout) 실험에서 화합물의 평가 결과; 및
도 10 내지 도 12: 자극된 염증성 시토카인의 방출 억제에 있어서 화합물의 검정 결과
약어의 정의:
Ala: 알라닌
ATP: 아데노신 트리포스페이트
AUC: 곡선하 면적
Boc: tert-부톡시카르보닐
BTK: 브루턴(Bruton's) 티로신 키나제
CDI: 1,1'-카르보닐디이미다졸
Cys: 시스테인
DCM: 디클로로메탄
DIEA: N,N-디이소프로필에틸아민
DMF: 디메틸 포름아미드
DMSO: 디메틸 술폭시드
EGFR: 표피 성장 인자 수용체
GSK3β: 글리코겐 신타제 키나제 3-β
HTRF: 균일 시간-분해 형광
IL-2: 인터류킨-2
IL-6: 인터류킨-6
IL-15: 인터류킨-15
IFN-α: 인터페론-α
ITK: 인터류킨-2 유도성 T 세포 키나제
JAK: 야누스 키나제
JAK3: 야누스 키나제 3
Leu: 류신
LPS: 리포폴리사카라이드
Lys: 리신
MCP-1: 단핵세포 화학주성 단백질 1
Met: 메티오닌
PBMC: 말초 혈액 단핵 세포
PBS: 인산염-완충 식염수
PE: 석유 에테르
PK: 약물동태학
PKC: 단백질 키나제 C
RA: 류마티스 관절염
RT (또는 rt): 실온
STAT: 신호 전달자 및 전사의 활성화제
TFA: 트리플루오로아세트산
THF: 테트라히드로푸란
Val: 발린
HATU: 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트
Pd2(dba)3: 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)
JohnPhos: 2-(디-tert-부틸포스피노)비페닐
RuPhos: 2-디시클로헥실포스피노-2',6'-디이소프로폭시비페닐.
화합물은 다음과 같이 반응식 I, II, III 또는 IV에 따라 제조하였다.
<반응식 I>
Figure pct00006
여기서,
R1은 CF3 및 NO2로부터 선택되고;
R2는
Figure pct00007
로부터 선택되고;
R3은
Figure pct00008
로부터 선택된다;
반응 시약 및 주요 조건:
(a) i) CDI, DMF, rt, 약 0.5시간;
ii) MeOH 중 NH3 (7N), rt, 약 1시간;
(b) t BuOK, THF, 0℃ 내지 10℃, 약 45분;
(c) Boc-보호 피페라진 또는 아민, DMSO, 150℃, 밤새;
(d) i) TFA/DCM, rt, 약 15분;
ii) 아크릴로일 클로라이드/DIEA, THF, H2O, 0℃ 내지 rt, 약 10분, 또는
카르복실산, HATU, DIEA, DMF.
<반응식 II>
Figure pct00009
반응 시약 및 주요 조건:
(a) 에틸 2-클로로-2-옥소아세테이트, Et2AlCl, DCM, 약 2시간, 0℃;
(b) i) CDI, DMF, rt, 약 0.5시간;
ii) MeOH 중 NH3 (7N), rt, 약 1시간;
(c) t BuOK, THF, 0℃ 내지 10℃, 약 45분;
(d) Boc-보호 피페라진, DMSO, 150℃, 밤새;
(e) i) TFA/DCM, rt, 약 15분,
ii) 아크릴로일 클로라이드/DIEA, THF, H2O, 0℃ 내지 rt, 약 10분.
<반응식 III>
Figure pct00010
반응 시약 및 주요 조건:
(a) JohnPhos 또는 RuPhos 시약, Boc-보호 피페라진, Pd2(dba)3, NaO t Bu, PhMe 또는 DMF, 마이크로파, 110℃, 1시간;
(b) i) CDI, DMF, rt, 약 0.5시간;
ii) MeOH 중 NH3 (7N), rt, 약 1시간;
(c) t BuOK, THF, 0℃ 내지 10℃, 약 45분 (60-70%);
(d) TFA/DCM, rt, 약 15분;
(e) 아크릴로일 클로라이드/DIEA, THF, H2O, 0℃ 내지 rt, 약 10분.
<반응식 IV>
Figure pct00011
반응 시약 및 주요 조건:
(a) 인돌, Et2O 중 EtMgBr, THF, 환류, 약 1시간;
(b) Boc-보호 아민, DIEA, DMSO, 100℃;
(c) (i) TFA/DCM, rt, 약 15분;
(ii) 아크릴로일 클로라이드/DIEA, THF, H2O, 0℃ 내지 rt, 약 10분.
표: 화합물 구조 및 IC 50 값
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
화합물의 합성 공정은 상기 반응식 I 내지 IV를 참조하고 화합물 5, 20, 28, 32, 34를 예로서 취함으로써 하기에 상세히 기재된다. 다른 화합물은 상기 반응식 I 내지 IV를 참조하여 유사한 방식으로 제조할 수 있으며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 이해될 수 있다.
모든 시약은 상업적으로 구입하였으며 달리 명시하지 않는 한 추가 정제없 이 사용하였다. 용매를 사용 전에 재-증발시켰다. 반응은 박층 실리카겔 플레이트 (TLC, GF254, 60-F250, 0.2 mm, 옌타이 장유(Yantai Jiangyou) 실리카겔 박층 크로마토그래피)에 의해 모니터링하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피는 퓨크(Puke) 실리카겔 (ZCX-II, 200-300 메시)을 사용하여 수행하였다. NMR 스펙트럼은 브루커(Bruker) 어드밴스(ADVANCE) 400 (1H: 400 MHz; 13C: 100 MHz) 또는 브루커 어드밴스 500 (1H: 500 MHz; 13C: 125 MHz) 핵 자기 공명 기기 상에서 기록하였다. TMS를 내부 표준으로서 사용하였으며, 피크 형상은 s (단일선), d (이중선), t (삼중선) 및 m (다중선)으로서 기재하였다. 고-해상도 질량 분석법 (HRMS)은 ABI Q-스타 엘리트(star Elite) 고-해상도 질량 분석기를 사용하여 수행하였으며; 최종 제품의 순도는 고성능 액체 (HPLC) 애질런트(Agilent) 1260 시리즈 크로마토그래프 (애질런트 PN959990-902 이클립스(Eclipse) 플러스(Plus) C18 (250 mm*4.6 mm) 크로마토그래피 컬럼)에 의해 검출하였으며, 검출은 254 nm에서 측정하였다.
화합물 5의 제법
3-(5-(4-아크릴로일피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메틸)페닐)-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 5)의 합성
단계 1: 2-(5-플루오로-2-(트리플루오로메틸)페닐)아세트아미드 (화합물 38a)
CDI (1.0 g, 4.5 mmol)를 배치식으로 4 mL의 DMF 중 (5-플루오로-2-(트리플루오로메틸)페닐)아세트산의 용액에 첨가하였다. 실온 (rt)에서 0.5h 동안 교반한 후, NH3 (3.6 mL, 메탄올 용액 중 7 N)을 적가하고, 실온에서 또 다른 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 물 및 에틸 아세테이트 (2 x 120 mL)를 사용하여 생성물을 추출하였다. 유기 상을 포화 염수 (2 x 40 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 백색 고체 (0.73 g)를 73%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.75 (dd, J = 8.7, 5.6 Hz, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.32 (m, 2H), 7.03 (s, 1H), 3.66 (s, 2H); MS (ESI) m/z 222.0 (M+H)+.
단계 2: 3-(5-플루오로-2-(트리플루오로메틸)페닐)-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 40a)
0℃에서, t BuOK (5.5 mL, THF 중 1 M)를 무수 THF (8.0 mL) 중 화합물 38a (0.30 g, 1.3 mmol) 및 화합물 39 (0.41 g, 2.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 용액을 10℃에서 45분 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), HCl (5N)을 첨가하여 pH를 6으로 조정하고, 용매를 제거하고, 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 120 mL)로 추출하고, 유기 상을 포화 염수 (2 x 40 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 황색 고체 (0.35 g)를 66%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.99 (s, 1H), 11.23 (s, 1H), 8.02 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.97 (dd, J = 8.9, 5.4 Hz, 1H), 7.60-7.52 (m, 1H), 7.49-7.38 (m, 2H), 7.07 (ddd, J = 8.1, 7.0, 1.1 Hz, 1H), 6.75 (ddd, J = 8.2, 7.1, 1.1 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 8.3 Hz, 1H).
13CNMR (101 MHz, DMSO) δ 172.48, 172.01, 165.30, 162.80, 137.08, 136.25, 132.67, 126.18, 125.48, 125.25, 122.91, 120.95, 120.56, 120.19, 119.96, 117.31, 117.09, 112.94, 105.14.
MS (ESI) m/z 375.1 (M+H)+.
단계 3: Tert-부틸 4-(3-(4-(1H-인돌-3-일)-2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-3-일)-4-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카르복실레이트 (화합물 41a)
1-Boc-피페라진 (0.44 g, 2.4 mmol)을 DMSO (2.0 mL) 중 화합물 40a (0.3 g, 0.55 mmol)의 용액에 첨가하고 혼합물을 150℃에서 밤새 환류시켰다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 에틸 아세테이트 (2 x 120 mL)로 추출하고, 유기 상을 포화 염수 (2 x 40 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 황색 고체 (0.35 g)를 66%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.88 (s, 1H), 11.10 (s, 1H), 7.95 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.18-7.10 (m, 1H), 7.09-6.99 (m, 1H), 6.92 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.72 (dd, J = 8.2, 7.0 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.34-3.22 (m, 5H), 3.24-3.09 (m, 4H), 1.38 (s, 9H).
13CNMR (101 MHz, DMSO) δ 172.85, 172.40, 154.34, 152.82, 136.97, 135.64, 132.09, 131.86, 131.85, 128.70, 128.42, 126.50, 126.50, 125.39, 125.38, 122.69, 121.37, 120.70, 117.97, 114.87, 112.64, 105.55, 79.57, 49.00, 47.32, 30.63, 29.52, 28.55.
MS (ESI) m/z 541.2 (M+H)+.
단계 4: 3-(5-(4-아크릴로일피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메틸)-페닐)-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 5)
트리플루오로아세트산 (TFA) (2.0 mL)을 DCM (2.0 mL) 중 화합물 41a (0.10 g, 0.18 mmol)의 용액에 첨가하고 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), TFA 및 DCM을 증발시키고, 잔류물을 건조시켜 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 잔류물을 THF (2.0 mL)와 물 (1 방울)의 혼합물에 용해시킨 후, DIEA (0.10 mL, 0.36 mmol) 및 아크릴로일 클로라이드 (24 μL, 0.27 mmol)를 첨가하였다. 빙조를 제거하고 생성된 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 120 mL)로 추출하고, 유기 상을 포화 염수 (2 x 40 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 황색 고체 (73 mg)를 82%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.88 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 11.11 (s, 1H), 7.96 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.18-7.10 (m, 1H), 7.08-7.00 (m, 1H), 6.96 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (m, 2H), 6.65 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.11 (dd, J = 16.6, 2.4 Hz, 1H), 5.68 (dd, J = 10.4, 2.4 Hz, 1H), 3.66-3.46 (m, 4H), 3.23 (m, 4H).
13CNMR (101 MHz, DMSO) δ 172.64, 172.20, 164.62, 152.49, 136.73, 135.43, 131.85, 131.65, 128.49, 128.34, 127.86, 126.28, 125.18, 123.57, 122.50, 121.15, 120.51, 117.67, 114.54, 112.42, 105.35, 47.58, 47.01, 44.37, 40.90.
C26H21F3N4O3 [M+H]+에 대한 HRMS (ESI) m/z 계산치: 495.1566; 실측치, 495.1578.
화합물 20의 제법
3-(5-(4-아크릴로일피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메틸)페닐)-4-(6-플루오로-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 20)의 합성
단계 1: 에틸 2-(6-플루오로-1H-인돌-3-일)-2-옥소아세테이트 (화합물 43a)
DCM (40 mL) 중 화합물 42a (0.50 g, 3.7 mmol)의 용액에 5.6 mL의 Et2AlCl (헥산 중 1 M)을 빙조 하에 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 에틸 옥살릴 모노클로라이드 (0.61 mL, 5.5 mmol)를 0℃에서 적가하였다. 생성된 용액을 0℃에서 2 h 동안 교반한 다음에, 반응이 완료된 후 (TLC에 의해 검출) 빙수를 첨가하여 반응물을 켄칭하였다. 용매를 증발시키고, 물 및 에틸 아세테이트 (3 × 50 mL)를 사용하여 생성물을 추출하였다. 유기 상을 포화 염수 (2 x 30 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 회백색 고체 (0.38 g)를 50%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.41 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.14 (dd, J = 8.7, 5.5 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 9.5, 2.4 Hz, 1H), 7.13 (ddd, J = 9.8, 8.7, 2.4 Hz, 1H), 4.35 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.33 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
MS (ESI) m/z 236.1 (M+H)+.
단계 2: 3-(6-플루오로-1H-인돌-3-일)-4-(5-플루오로-2-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 44a)
0℃에서, t BuOK (4.0 mL, THF 중 1 M)를 무수 THF (4.0 mL) 중 화합물 38a (0.19 g, 0.85 mmol) 및 화합물 43a (0.30 g, 1.3 mmol)의 용액에 첨가하였다. 용액을 10℃에서 1 h 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), HCl (5N)을 첨가하여 pH를 6으로 조정하고, 용매를 제거하고, 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 x 50 mL)로 추출하고, 유기 상을 포화 염수 (2 x 20 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 황색 고체 (0.25 g)를 75%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.06 (s, 1H), 11.26 (s, 1H), 8.03 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 8.00 (dd, J = 8.9, 5.4 Hz, 1H), 7.60 (m, 1H), 7.49 (dd, J = 9.2, 2.7 Hz, 1H), 7.42 (dd, J = 8.9, 4.8 Hz, 1H), 6.94 (m, 1H), 6.14 (dd, J = 11.1, 2.5 Hz, 1H).
MS (ESI) m/z 393.0 (M+H)+.
단계 3: tert-부틸 4-(3-(4-(6-플루오로-1H-인돌-3-일)-2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-3-일)-4-(트리플루오로메틸)페닐)피페라진-1-카르복실레이트 (화합물 45a)
1-Boc-피페라진 (0.44 g, 2.4 mmol)을 DMSO (2.0 mL) 중 화합물 44a (0.3 g, 0.55 mmol)의 용액에 첨가하고 혼합물을 150℃에서 밤새 환류시켰다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 에틸 아세테이트 (2 x 120 mL)로 추출하고, 유기 상을 포화 염수 (2 x 40 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 황색 고체 (0.35 g)를 30%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.87 (s, 1H), 11.13 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.64 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.17 (dd, J = 9.5, 2.3 Hz, 1H), 7.13 (dd, J = 8.8, 2.6 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.70-6.57 (m, 2H), 3.33-3.25 (m, 4H), 3.22 (m, 4H), 1.39 (s, 9H).
MS (ESI) m/z 559.2 (M+H)+.
단계 4: 3-(5-(4-아크릴로일피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메틸)-페닐)-4-(6-플루오로-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 20)
트리플루오로아세트산 (TFA) (2.0 mL)을 DCM (2.0 mL) 중 화합물 45a (0.10 g, 0.18 mmol)의 용액에 첨가하고 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), TFA 및 DCM을 증발시키고, 잔류물을 건조시켜 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 잔류물을 THF (2.0 mL)와 물 (1 방울)의 혼합물에 용해시킨 후, DIEA (0.10 mL, 0.36 mmol) 및 아크릴로일 클로라이드 (24 μL, 0.27 mmol)를 첨가하였다. 빙조를 제거하고 생성된 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 120 mL)로 추출하고, 유기 상을 포화 염수 (2 x 40 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 황색 고체 (73 mg)를 80%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.86 (s, 1H), 11.12 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.64 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.21-7.08 (m, 2H), 6.97 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.78 (m, 1H), 6.69 (m, 1H), 6.62 (m, 1H), 6.11 (dd, J = 16.7, 2.3 Hz, 1H), 5.68 (dd, J = 10.4, 2.3 Hz, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.24 (m, 4H).
13CNMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 172.70, 172.30, 164.88, 158.20, 152.82, 137.14, 137.02, 135.41, 132.57, 129.48, 128.63, 128.05, 122.60, 122.51, 122.17, 117.72, 114.79, 109.16, 108.92, 105.65, 98.84, 98.59, 47.75, 47.16, 44.65, 41.14.
C26H20F4N4O3 [M+H]+에 대한 HRMS (ESI) m/z 계산치: 513.1472; 실측치, 513.1479. 순도: 99.2%.
화합물 28의 제법
3-(5-(4-아크릴로일피페라진-1-일)-2-메톡시페닐)-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 28)의 합성
단계 1: 2-(5-(4-(tert-부톡시카르보닐)피페라진-1-일)-2-메톡시페닐)아세트산 (화합물 47d)
화합물 46d (0.52 g, 2.0 mmol), 1-Boc-피페라진 (0.49 g, 2.6 mmol), 소듐 tert-부톡시드 (0.59 g, 2.6 mmol), 2-(디tert-부틸포스피노)비페닐 (JohnPhos, 0.16 g, 0.41 mmol), 및 Pd2(dba)3 (0.19 g, 0.20 mmol)을 마이크로파 바이알 중의 무수 PhMe (15 mL)에 용해시키고 아르곤 가스로 퍼징하여 산소를 제거하였다. 바이알의 뚜껑을 닫고 110℃로 1시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시키고 반응이 완료된 후 (TLC에 의해 검출), 혼합물을 규조토를 통해 여과하고, 여액을 pH 5로 조정하고 에틸 아세테이트 (3 x 100 mL)로 추출하였다. 유기 상을 포화 염수 (2 x 40 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 백색 고체 (0.35 g)를 49%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 6.87-6.84 (m, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.82 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 3.68 (s, 3H), 3.45 (s, 2H), 3.45-3.41 (m, 4H), 2.95-2.93 (m, 4H), 1.42 (s, 9H).
13CNMR (126 MHz, DMSO) δ 173.04, 154.32, 152.01, 145.32, 124.49, 121.12, 116.45, 111.74, 79.40, 56.13, 50.34, 36.23, 28.53.
MS/ESI 351.2 (M+1)+.
단계 2: tert-부틸 4-(3-(2-아미노-2-옥소에틸)-4-메톡시페닐)피페라진-1-카르복실레이트 (화합물 48d)
CDI (0.29 g, 1.29 mmol)를 배치식으로 4.0 mL의 DMF 중 화합물 47d (0.30 g, 0.86 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 0.5 h 동안 교반한 후, NH3 (0.6 mL, 메탄올 용액 중 7 N)을 첨가하고 실온에서 또 다른 1 h 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 물 및 에틸 아세테이트 (2 × 120 mL)를 사용하여 생성물을 추출하였다. 유기 상을 포화 염수 (2 x 40 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 백색 고체 (0.73 g)를 73%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.75 (dd, J = 8.7, 5.6 Hz, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.32 (m, 2H), 7.03 (s, 1H), 3.66 (s, 2H);
MS (ESI) m/z 222.0 (M+H)+.
단계 3: tert-부틸 4-(3-(4-(1H-인돌-3-일)-2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-3-일)-4-메톡시페닐)피페라진-1-카르복실레이트 (화합물 49d)
0℃에서, t BuOK (2.2 mL, THF 중 1 M)를 무수 THF (4.0 mL) 중 화합물 48d (0.2 g, 0.57 mmol) 및 화합물 38a (0.17 g, 0.85 mmol)의 용액에 서서히 첨가하였다. 용액을 10℃에서 1 h 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), HCl (5N)을 첨가하여 pH를 5로 조정하고, 용매를 제거하고, 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 x 40 mL)로 추출하고, 유기 상을 포화 염수 (2 x 20 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축하여 중간 화합물 49d를 수득하였다.
MS (ESI) m/z 503.2 (M+H)+.
단계 4: 3-(1H-인돌-3-일)-4-(2-메톡시-5-(피페라진-1-일)페닐)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 50d)
트리플루오로아세트산 (TFA) (2.0 mL)을 DCM (2.0 mL) 중 화합물 49d (0.12 g, 0.24 mmol)의 용액에 첨가하고 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), TFA 및 DCM을 증발시키고, 혼합물을 물 및 에틸 아세테이트 (2 x 60 mL)로 추출하고, 유기 상을 포화 염수 (2 x 30 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 황색 고체 (0.15 g)를 52%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.80 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.37 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.02 (ddd, J = 8.2, 7.0, 1.1 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 9.0, 3.0 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 6.65 (ddd, J = 8.2, 7.0, 1.1 Hz, 1H), 6.51-6.41 (m, 1H), 3.26 (s, 3H), 2.89-2.81 (m, 4H), 2.80-2.78 (m, 4H).
13CNMR (101 MHz, DMSO) δ 173.08, 172.67, 152.06, 145.93, 136.87, 134.69, 130.87, 128.29, 125.38, 122.39, 121.29, 121.12, 120.23, 119.96, 118.58, 113.08, 112.38, 106.29, 55.97, 50.91, 45.78.
MS/ESI 503.2 (M+1)+.
단계 5: 3-(5-(4-아크릴로일피페라진-1-일)-2-메톡시페닐)-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 28)
화합물 50d (0.12 g, 0.24 mmol)를 THF (2.0 mL)와 물 (1 방울)의 혼합물에 용해시킨 후, DIEA (0.16 mL, 0.96 mmol) 및 아크릴로일 클로라이드 (30 μL, 0.36 mmol)를 첨가하였다. 빙조를 제거하고, 생성된 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 60 mL)로 추출하였다. 유기 상을 포화 염수 (2 x 30 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 황색 고체 (90 mg)를 82%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.81 (s, 1H), 10.93 (s, 1H), 7.93 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.07-6.98 (m, 2H), 6.92 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 6.80 (dd, J = 16.7, 10.5 Hz, 1H), 6.66 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.10 (dd, J = 16.7, 2.4 Hz, 1H), 5.68 (dd, J = 10.4, 2.4 Hz, 1H), 3.59 (m, 4H), 3.29 (s, 3H), 2.91 (m, 4H).
13CNMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 173.05, 172.62, 164.74, 152.47, 144.97, 136.88, 134.75, 130.96, 128.69, 128.10, 127.93, 125.33, 122.42, 121.25, 121.20, 120.60, 120.26, 119.13, 113.12, 112.42, 106.23, 55.98, 50.83, 50.22, 45.27, 41.73.
C26H24N4O4 [M+H]+에 대한 HRMS (ESI) m/z 계산치: 457.1798; 실측치, 457.1794.
화합물 32의 제법
단계 1: 2-(5-플루오로-2-(니트로)페닐)아세트아미드 (화합물 38b)
CDI (1.2 g, 7.5 mmol)를 배치식으로 4.0 mL의 DMF 중 5-플루오로-2-(니트로)페닐아세트산 (1.0 g, 5.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 0.5 h 동안 교반한 후, NH3 (3.5 mL, 메탄올 용액 중 7 N)을 적가하고 실온에서 또 다른 1 h 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 물 및 에틸 아세테이트 (2 x 120 mL)를 사용하여 생성물을 추출하였다. 유기 상을 포화 염수 (2 x 40 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 백색 고체 (0.70 g)를 70%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.11 (dd, J = 9.0, 5.2 Hz, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.46-7.29 (m, 2H), 7.02 (s, 1H), 3.88 (s, 2H).
MS (ESI) m/z 199.1 (M+H)+.
단계 2: 3-(5-플루오로-2-(니트로)페닐)-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 40b)
Figure pct00017
0℃에서, t BuOK (7.5 mL, THF 중 1 M)를 무수 THF (15 mL) 중 화합물 38b (0.30 g, 1.5 mmol) 및 화합물 39 (0.45 g, 2.2 mmol)의 용액에 서서히 첨가하였다. 용액을 10℃에서 45분 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), HCl (5N)을 첨가하여 pH를 6으로 조정하고, 용매를 제거하고, 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 120 mL)로 추출하고, 유기 상을 포화 염수 (2 x 40 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축하여 황색 고체 0.30 g을 72%의 수율로 수득하였다.
MS (ESI) m/z 352.2 (M+H)+.
단계 3: Tert-부틸 4-(3-(4-(1H-인돌-3-일)-2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-3-일)-4-(니트로)페닐)피페라진-1-카르복실레이트 (화합물 41b)
Figure pct00018
1-Boc-피페라진 (0.64 g, 3.4 mmol)을 DMSO (2.0 mL) 중 화합물 40b (0.3 g, 0.85 mmol)의 용액에 첨가하고 혼합물을 150℃에서 밤새 환류시켰다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 에틸 아세테이트 (2 x 120 mL)로 추출하고, 유기 상을 포화 염수 (2 x 40 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 황색 고체 (0.27 g)를 62%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.94 (s, 1H), 11.12 (s, 1H), 8.17 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.42 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.16-6.94 (m, 2H), 6.74 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.65-6.49 (m, 2H), 3.14 (d, J = 48.7 Hz, 4H), 2.97 (s, 4H), 1.37 (s, 9H).
13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 172.88, 171.47, 154.25, 153.43, 137.86, 137.08, 132.84, 131.86, 129.73, 129.47, 127.83, 124.65, 122.61, 121.04, 120.56, 116.08, 114.18, 112.80, 104.45, 79.61, 60.29, 57.90, 46.77, 28.52.
MS (ESI) m/z 518.4 (M+H)+.
단계 4: 3-(5-(4-아크릴로일피페라진-1-일)-2-(니트로)페닐)-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 32)
Figure pct00019
트리플루오로아세트산 (TFA) (2.0 mL)을 DCM (2.0 mL) 중 화합물 41b (0.10 g, 0.19 mmol)의 용액에 첨가하고 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), TFA 및 DCM을 증발시키고, 잔류물을 건조시켜 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 잔류물을 THF (2.0 mL)와 물 (1 방울)의 혼합물에 용해시키고, DIEA (70 μL, 0.38 mmol) 및 아크릴로일 클로라이드 (26 μL, 0.28 mmol)를 첨가하였다. 빙조를 제거하고 생성된 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 120 mL)로 추출하고, 유기 상을 포화 염수 (2 x 40 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 황색 고체 (70 mg)를 78%의 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.96 (s, 1H), 11.14 (s, 1H), 8.18 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.41 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.82-6.71 (m, 1H), 6.70-6.62 (m, 1H), 6.60-6.50 (m, 2H), 6.08 (d, J = 16.6 Hz, 1H), 5.66 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 3.26 (m, 4H), 3.10 (m, 4H).
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 173.17, 171.51, 164.85, 153.40, 138.29, 137.06, 133.13, 131.87, 129.76, 128.52, 128.09, 127.85, 124.69, 122.67, 121.05, 120.60, 115.95, 114.10, 112.83, 104.46, 80.45, 47.53, 46.29, 44.15, 43.52.
C25H21N5O5 [M+H]+에 대한 HRMS (ESI) m/z 계산치: 472.1543; 실측치, 472.1539.
화합물 34의 제법
3-((1-아크릴로일피페리딘-4-일)아미노)-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 34)의 합성
단계 1: 3-브로모-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 52)
아르곤 하에 적하 깔대기가 장착된 2-구 플라스크에서, 인돌 (0.3 g, 1.2 mmol)을 무수 THF (8.0 mL)에 용해시켰다. Et2O (1.57 mL, 4.7 mmol) 중 에틸 마그네슘 브로마이드의 용액을 상기 혼합물에 적가한 다음에, 이를 2시간 동안 환류 하에 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, THF 중 3,4-디브로모-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 51, 0.55 g, 4.7 mmol)의 용액을 약 1 h에 걸쳐서 적가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 1 h 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), 이어서 혼합물을 HCl 수용액으로 pH = 9로 가수분해하였다. 포화 수성 NH4Cl 용액을 첨가한 후, 수성 상을 에틸 아세테이트 (2 x 60 mL)로 추출하였다. 유기 상을 포화 염수 (2 x 30 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 황색 고체 (0.28 g)를 82%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.10 (s, 1H), 11.35 (s, 1H), 8.03 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.89 (dt, J = 8.1, 1.0 Hz, 1H), 7.51 (dt, J = 8.1, 1.0 Hz, 1H), 7.22 (ddd, J = 8.1, 7.0, 1.2 Hz, 1H), 7.14 (ddd, J = 8.1, 7.1, 1.2 Hz, 1H).
13CNMR (101 MHz, DMSO) δ 170.75, 167.99, 138.54, 137.01, 131.54, 125.05, 122.95, 122.77, 120.92, 115.13, 112.84, 104.25.
MS/ESI 291.0 (M+1)+.
단계 2: tert-부틸 4-((4-(1H-인돌-3-일)-2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-3-일)아미노)피페리딘-1-카르복실레이트 (화합물 53)
화합물 52 (0.13 g, 0.45 mmol) 및 Boc 보호된 피페리딘-4-아민 (0.18 g, 0.89 mmol)을 DMSO (1.5 mL)에 용해시킨 후, DIEA (0.15 mL, 0.89 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 126℃에서 밤새 가열하였다. 실온으로 냉각시키고 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), 물 및 에틸 아세테이트를 사용하여 혼합물을 추출하였다. 유기 상을 포화 염수 (2 x 20 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 황색 고체 (0.11 g)를 60%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.21 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 10.34 (s, 1H), 7.40 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.37-7.27 (m, 2H), 7.14-7.06 (m, 1H), 7.04-6.95 (m, 1H), 6.86 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 3.67 (m, 2H), 3.43 (m, 1H), 1.97 (m, 2H), 1.47 (m, 2H), 1.31 (s, 9H), 1.26 (m, 2H). 13CNMR (101 MHz, DMSO).
13CNMR (101 MHz, DMSO) δ 173.82, 169.57, 154.19, 143.23, 136.10, 128.71, 126.48, 121.70, 119.91, 119.37, 112.05, 104.59, 100.05, 93.48, 79.22, 50.31, 32.01, 28.52.
MS/ESI 410.1 (M+1)+.
단계 3: 3-((1-아크릴로일피페리딘-4-일)아미노)-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (화합물 34)
TFA (2.0 mL)을 DCM (2.0 mL) 중 화합물 53 (0.10 g, 0.18 mmol)의 용액에 첨가하고 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), TFA 및 DCM을 증발시키고, 잔류물을 건조시켜 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 잔류물을 THF (2.0 mL)와 물 (1 방울)의 혼합물에 용해시킨 후, DIEA (0.10 mL, 0.36 mmol) 및 아크릴로일 클로라이드 (24 μL, 0.27 mmol)를 첨가하였다. 빙조를 제거하고 생성된 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응의 완료 후 (TLC에 의해 검출), 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 120 mL)로 추출하고, 유기 상을 포화 염수 (2 x 40 mL)로 세척하고, 수집하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축한 다음에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하고 정제하여 황색 고체 (80 mg)를 90%의 수율로 수득하였다.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.23 (s, 1H), 10.43 (s, 1H), 7.54-7.20 (m, 3 H), 7.09 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.01 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 6.64 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 5.75 (t, J = 14.6 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 3.87 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 2.93 (m, 1H), 2.82 (m, 1H), 2.56 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.57 (m, 2 H), 0.84 (m, 1H).
13CNMR (101 MHz, DMSO) δ 173.79, 169.60, 164.78, 142.34, 136.13, 128.48, 128.46, 127.84, 127.35, 126.68, 121.84, 119.96, 119.59, 112.24, 104.14, 50.10, 49.39, 41.81, 30.50, 28.52.
C20H20N4O3 [M+H]+에 대한 HRMS (ESI) m/z 계산치: 365.1535; 실측치, 365.1541. 순도: 99.3%.
생물학적 활성 시험
(1) 시험관내 효소 검정
시험관내 효소 검정을 Km ATP (0.6 마이크로몰) 및 고농도 ATP (1 밀리몰)의 조건 하에 수행하였다. 시험관내 효소 검정의 결과를 상기 표에 열거하였다.
시험관내 효소 검정의 절차는 다음과 같다: 키나제를 카르나 바이오사이언시즈(Carna Biosciences)로부터 입수하였다. JAK3의 효소 활성은 HTRF® KinEase™ 검정을 사용하여 Km 및 1 mM에서 ATP 농도를 별도로 사용하여 평가하였다. ATP 키나제 효소학 검정은 HTRF® KinEase™ 검정 지침 (시스비오 바이오어세이즈(Cisbio Bioassays))에 의해 특정된 프로토콜에 따라 수행하였다.
(2) 선택성 검정
키나제 패널에 대한 화합물 32의 선택성을 평가하기 위해, 50종의 대표적 키나제를 예비 선택성 검정을 위해 선택하고, 결과는 도 1에 나타냈다.
화합물 32는 높은 선택성을 갖는 것으로 나타났다. 키나제 패널에 대해 1 μM에서 시험한 결과, 대부분의 키나제는 50% 이하의 억제를 나타냈고, 단지 3개의 키나제 PKCα, PKCγ 및 GSK3β만이 50% 초과의 억제를 나타내어, NIBR3049의 선택성 결과와 일치하였다. 화합물 32는 또한 JAK 패밀리 내에서 그리고 Cys909와 필적하는 위치에 시스테인을 가진 다른 10종 키나제 중에서 높은 선택성을 나타냈으며, 이는 화합물 32가 소분자 프로브로서 JAK3 기능 및 JAK-STAT 신호 경로에 대한 연구에 사용될 수 있음을 나타낸다.
(3) 세포 활성 검정
화합물 32의 세포 활성을 평가하기 위해, 세포에서 하류 기질 STAT5의 인산화를 억제하는 화합물 32의 능력을 검출하였다.
마우스 T 세포 (CTLL-2 세포)는 성장 인자를 제거하고 밤새 기아 상태를 유지하였다. 이어서, 특정된 농도의 화합물 (JAK3 억제제 또는 DMSO)과 함께 37℃에서 2시간 동안 세포를 인큐베이션하였다. 500 ng/mL IL-2 또는 500 ng/mL IL-5 (알앤드디 시스템즈(R&D Systems))로 30분 동안 자극한 후, 세포를 수집하고 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 세포 용해 완충제에 용해시켰다. 이어서 SDS/PAGE 전기영동에 의해 분리하고 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 후 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다. 포스포-STAT5, STAT5 및 β-액틴 (모든 항체는 셀 시그널링 테크놀로지즈(Cell Signaling Technologies)로부터의 것임)을 특이적 항체로 별도로 블롯팅하였다. 결과는 도 2 및 도 3에 나타냈다. EC50 값은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 정량적 스트라이프 그레이 분석에 의해 계산하였다.
CTLL-2에서, IL-2-유도 STAT5 인산화는 화합물 32의 600 나노몰 (EC50=305 나노몰)에 의해 거의 완전히 억제되었다. 이와 비교하여, STAT5 활성화를 완전히 억제하기 위해 화합물 NIBR3049 처리된 세포에서 6000 나노몰이 필요하였다 (EC50=1999 나노몰). 화합물 32는 IL-15-유도 STAT5 인산화를 억제하는 데 더 민감하였다 (EC50=141 나노몰).
유사하게, 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서, NIBR3049와 비교하여, 화합물 32는 또한 IL-2 및 IL-15-유도 STAT5 인산화에 대해 더 높은 억제 활성을 나타냈다. 결과는 도 4 및 도 5에 나타냈다.
방법: 해동 후, PBMC (올셀즈(AllCells)로부터 구입)를 10% FBS를 함유하는 RPMI-1640에 밤새 재현탁한 다음에 특정된 농도의 JAK3 억제제 또는 DMSO와 함께 2 h 동안 인큐베이션하였다. IL-2 (500 ng/mL, 알앤드디 시스템즈), IL-15 (500 ng/mL, 알앤드디 시스템즈), IL-6 (600 ng/mL, 알앤드디 시스템즈), 또는 IFN-α (400 ng/mL, 알앤드디 시스템즈)로 30분 동안 자극 후, 세포를 수집하고 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 세포 용해 완충제에 용해시켰다. 이어서 SDS/PAGE 전기영동에 의해 분리하고 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 후 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다. 포스포-STAT5, 포스포-STAT3, 및 포스포-STAT1 (모두 셀 시그널링 테크놀로지즈로부터의 것임)을 특이적 항체로 별도로 블롯팅하였다. β-액틴은 동일한 로딩으로 블롯팅하였다. EC50 값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 정량적 스트라이프 그레이 분석에 의해 계산하였다.
(4) 세포 선택성 검정
본 발명자들은 JAK의 하류 기질의 인산화에 대한 화합물의 억제 효과를 검출함으로써 상이한 시토카인 (IL-15, IL-6 또는 IFN-α)으로 자극 직후 PBMC에서 화합물 32의 세포 선택성을 추가로 특성화하였다. 방법은 섹션 (4)에 기재된 바와 같으며, 결과는 도 6, 도 7 및 도 8에 나타냈다.
이들 시토카인 중에서, IL-15를 통한 신호전달만이 JAK3에 의존한다. IL-6을 통한 신호전달은 JAK1, JAK2 및 TYK2에 의존하며, IFN-α를 통한 신호전달은 JAK1 및 TYK2와 독점적으로 관련된다. 화합물 32는 300 nM의 농도에서 STAT5의 인산화를 효과적으로 제거하였다. 이와 비교하여, I-6 및 IFN-α 신호 경로에서, 10μM 만큼의 높은 용량에서도, STAT3 인산화 및 STAT1 인산화에 대해 부분적인 억제만 관찰되었다. 화합물 NIBR3049와 비교하여, 화합물 32는 향상된 세포 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 고농도 ATP를 가진 세포 환경에서 다른 JAK에 대한 향상된 선택성도 나타냈다. 대조적으로, 비선택적 토파시티닙은 3개의 시토카인에 의해 자극된 하류 기질의 인산화를 억제하는 데 명백한 선택성을 나타내지 않았다.
(5) 세포 워시아웃 실험
화합물 32가 세포에서 JAK3에 공유 결합되어 있음을 추가로 증명하기 위해, 세포 워시아웃 실험을 수행하였다.
워시아웃 절차는 다음과 같다: CTLL-2 세포를 화합물로 2시간 동안 처리하였다. 이어서, 워시아웃 군의 경우, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 비-워시아웃 군은 일정하게 유지되었다. 이어서 세포를 IL-15로 30분 동안 자극하고, 용해시키고, 표준 웨스턴 블롯을 수행하였다. 결과는 도 9에 나타냈다. 화합물로 처리된 세포는, PBS로 광범위하게 세척하였다. 화합물 32 (이는 세포에서 JAK3에 공유 결합됨)로 처리된 세포는 STAT5 인산화의 억제를 지속시켰다. 이와 비교하여, 가역적 억제제인 토파시티닙 및 화합물 NIBR3049의 억제 활성은 워시 아웃 후 거의 손실되었다. JAK1은 JAK3에서 Cys909와 동일한 위치에 시스테인을 갖지 않기 때문에, 화합물 32는 PBS로 워시 아웃 후 JAK1 활성을 방해할 가능성이 거의 없을 것이다. 따라서, 이 워시아웃 실험은 JAK1의 영향을 완화시켰고 JAK3 단독의 특이적 억제가 IL-15-매개 γc 시토카인 수용체 신호 경로를 효과적으로 억제하기에 충분함을 입증하였다.
(6) LPS-자극된 염증성 시토카인 방출의 억제
류마티스 관절염 (RA) 환자에서, 관절 미란은 IL-6, IL-1β, TNF-α, 및 MCP-1을 포함한, 염증성 시토카인의 증가와 일치한다. IL-6, IL-1β, TNF-α 및 MCP-1의 방출은 IL-10-JAKs-STAT3 신호 경로의 음성 피드백에 의해 조절되었다.
LPS-유도 IL-6 및 TNF-α 방출 검정은 다음과 같이 수행되었다: 동결된 PBMC (올셀즈로부터)를 10% FBS를 함유하는 RPMI1640 (써모 피셔(Thermo Fisher))에서 해동하고 37℃에서 밤새 회수하였다. 다음 날, 세포를 1 × 106 세포/mL로 희석하고 6-웰 플레이트에 시딩 (500 μL)하였다. 화합물 또는 DMSO (5 μL, DMSO에 연속 희석)를 플레이트에 첨가하고 37℃에서 2 h 동안 세포와 함께 인큐베이션한 후, LPS (5 μL, 1 μg/mL)로 자극하고 37℃에서 5% CO2에서 24 h 동안 인큐베이션하였다. 제조업체의 지침에 따라 인간 IL-6 또는 인간 THF-α 듀오세트(DuoSet) ELISA 키트 (알앤드디 시스템즈)를 사용하여 IL-6 및 TNF-α 수준을 결정하기 위해 상청액을 수집하였다.
IL-6 자극된 염증성 시토카인 MCP-1 방출 검정을 유사한 방식으로 수행하였다. 실험 결과는 도 10 내지 도 12에 나타낸 바와 같다.
LPS-시험감염된 PBMC에서, IL-6 및 TNF-α의 방출은 화합물 32에 의해 상당히 억제되었다. 대조적으로, 비선택적 억제제 토파시티닙은, JAK1에 대한 토파시티닙의 억제로 인한 IL-10-JAKs-STAT3 음성 피드백 신호전달의 억제 때문에, 상이한 정도로 시토카인 생산을 증가시켰다. 화합물 32는 JAK3에 대한 그의 선택적 억제로 인해 IL-10 신호 경로 기능을 지속시켰다. 화합물 32 및 토파시티닙 둘 다는 IL-6 유도 MCP-1 방출 (이는 JAK에 의해 매개되지 않음)을 억제하지 않았으며, 이는 이들 두 화합물이 JAK-STAT 신호 경로를 통해 염증성 시토카인의 방출을 조정함을 나타내는 것이다. 이들 결과는 화합물 32가 JAK3을 선택적으로 억제하고, JAK3-STAT 신호 경로를 억제함으로써 염증성 시토카인 방출을 조정하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 입증하였다.
(7) 약물동태학 평가
마우스에서 화합물 32의 약물동태학 (PK) 특성을 정맥 및 경구 투여 후 평가하였다.
생체내 PK 연구를 위해, 수컷 ICR 마우스 (n = 3)를 밤새 단식시키고 화합물 32를 정맥내 용량 (2 mg/kg)으로서 또는 경구 위관영양 (5 mg/kg)을 통해 받았다. 혈액 샘플을 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 및 24 h (iv) 및 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 및 24 h (po)에 수집하였다. 혈장 샘플을 내부 표준 물질을 함유하는 아세토니트릴로 탈단백질화시켰다. 4℃에서 원심분리 후, LC/MS/MS 분석을 위해 상청액을 수집하였다.
PK는 명시된 시점에서 혈장 농도의 분석에 의해 측정하였다. 결과는 하기 표에 나타냈다. 데이터는, 단일 2.0 mg/kg 정맥 투여 및 5 mg/kg 경구 투여 후, 혈장내 평균 농도 (n=3)를 나타낸다.
표: ICR 마우스에서 화합물 32의 PK 연구
Figure pct00020
5 mg/kg 경구 전달 직후, 화합물 32는 1.66 h의 반감기 (t1/2), 608 ng·hr/mL의 곡선하 면적 (AUC), 및 24.4%의 중등도의 경구 생체이용률을 가진 PK 프로파일을 나타냈다. 이들 강력한 PK 특성은 화합물 32가 동물에서 추가 약물동태학 연구 및 생물학적 기능 탐색을 위한 경구 억제제 또는 프로브일 수 있음을 시사하였다.
상기 실시양태는 단지 예시를 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위에 대한 어떠한 제한도 구성하지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명의 보호 범위는 청구범위에 있는 기술적 해결책의 문자적 해석 뿐만 아니라, 청구범위에 있는 기술적 해결책의 등가물도 포함하는 첨부된 청구범위에 의해 결정된다. 예를 들어, 화합물의 안정한 동위원소 대체물도 본 발명의 보호 범위에 포함된다.

Claims (8)

  1. 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00021

    여기서,
    Rh는 H 또는 메틸, 바람직하게는 H이고;
    Rg는 CH, -C-Rf 또는 N, 바람직하게는 CH이고;
    Rf는, 바람직하게는 메틸 또는 할로겐 (예컨대 F, Cl, Br 또는 I)으로부터 선택된 치환기이고;
    m은 0, 1, 2 또는 3, 바람직하게는 0 또는 1, 보다 바람직하게는 0이고;
    Re는 3급 아민 양이온 (-N+R'3, 여기서 R'는 H 및 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택됨), 니트로 (-NO2), 트리할로메틸 (-CX3, X=F, Cl, Br 또는 I), 할로겐 (예컨대 F, Cl, Br 및 I), 포르밀 (-CHO), 아실 (-CO-C1-4 알킬), 카르복실 (-COOH), 시아노 (-CN), 및 술폰산 기 (-SO3H)로 이루어진 군으로부터 선택된 전자-구인성 기이고;
    Rd는, 예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는, 알케닐 또는 알키닐이고;
    Ra, Rb 및 Rc는 하기 조합으로부터 선택된다:
    (1) Rb는 C1-C4 알킬렌 (예를 들어 C1-C3 알킬렌, 예컨대 메틸렌, 에틸리덴, 1,3-프로필리덴)이고,
    Ra 및 Rc는 수소 또는 C1-C6 알킬 (예를 들어 C1-C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸)임;
    (2) Rb는 C1-C4 알킬렌 (예를 들어 C1-C3 알킬렌, 예컨대 메틸렌, 에틸리덴, 1,3-프로필리덴)이고,
    Ra 및 Rc는 함께 부착되어 C2-C4 알킬렌 (예를 들어 C2-C3 알킬렌, 예컨대 에틸리덴, 1,3-프로필리덴)을 형성함;
    (3) Ra는 수소 또는 C1-C6 알킬 (예를 들어 C1-C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸)이고,
    Rb 및 Rc는 이들이 부착되는 N 원자와 함께 N 원자 함유 5- 또는 6-원 포화 헤테로시클릭 고리를 형성함;
    (4) Rc는 수소 또는 C1-C6 알킬 (예를 들어 C1-C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸)이고,
    Ra 및 Rb는 이들이 부착되는 N 원자와 함께 N 원자 함유 5- 또는 6-원 포화 헤테로시클릭 고리를 형성함.
  2. 제1항에 있어서, -N(Ra)-Rb-N(Rc)-가
    Figure pct00022
    을 형성하는 것인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00023
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Rh가 H이고, Rg가 CH이고, m이 0인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Re가 -NO2인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Rd가 비닐인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  6. 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    Figure pct00024
    .
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 제6항에 따른 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  8. 염증, 예컨대 류마티스 관절염 치료를 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 제6항에 따른 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 제3항에 따른 제약 조성물의 용도.
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