KR20210021021A - 세포 배양 시스템 및 세포 배양 방법 - Google Patents

세포 배양 시스템 및 세포 배양 방법 Download PDF

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Abstract

세포 배양 시스템은, 배양되는 세포를 포함하는 액체 배지를 수용하는 배양조와, 배양조로부터 공급되는 액체 배지를, 상대적으로 세포 밀도가 높은 부세포 분획과, 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포 분획으로 분리하는 유체력 분리 장치와, 유체력 분리 장치에 의해 분리되는 빈세포 분획으로부터 세포를 제거하여 액체 배지를 회수하는 여과 분리 장치를 가진다. 유체력 분리 장치는, 직사각형 단면을 가지는 만곡 유로를 흐르는 것에 의해 생기는 와류를 이용하여 액체 배지를 분리한다. 또는, 유체력 분리 장치로부터 빈세포 분획을 배양조에 공급하여 배양조의 액체 배지의 세포 밀도를 저하시켜, 이 액체 배지를 여과 분리 장치에 공급하여 세포를 제거하여 액체 배지를 회수하도록 구성된다.

Description

세포 배양 시스템 및 세포 배양 방법
본 개시는, 세포 배양을 통해 유용한 물질을 효율적으로 입수하기 위한 세포 배양 시스템 및 세포 배양 방법에 관한 것이다.
최근, 의약품 업계를 비롯하는 폭넓은 분야에 있어서, 동물 세포가 생산하는 항체 물질이나 기능성 물질 등의 유용한 물질을 이용하는 것이 주목되고 있다. 유용 물질의 시장 공급을 실현하기 위해, 세포 배양에서의 조건의 호적화(好適化; optimization) 및 효율화, 생성되는 유용 물질의 단리(單離) 정제 방법 등에 있어서 다양한 연구나 개량이 행해지고 있다.
세포의 배양 방법은, 대체로, 배치식(batch type) 및 연속식의 2가지로 분류로 된다. 배치식 배양 방법에서는, 소정량의 액체 배지(liquid medium) 및 세포를 배양조에 투입하고, 어느 정도의 밀도까지 세포가 증식하면, 영양소의 부족 또는 대사물에 의한 피독(被毒; poisoning)에 의해 증식은 정지하므로, 그 시점에서 배양을 종료한다. 연속식 배양 방법에서는, 소정량의 액체 배지 및 세포를 배양조에 투입하여 세포를 증식시키는 동시에, 액체 배지의 일부를 추출하여 새로운 액체 배지와 교환하여 투입하고, 보충한 영양소를 이용하여 세포 배양을 계속한다. 추출한 액체 배지에는, 세포가 생성된 유용 물질이 포함되므로, 액체 배지로부터 세포를 제거한 후에 정제 처리를 적절히 행함으로써 유용 물질이 회수된다.
액체 배지로부터 세포를 제거하는 고액 분리 수단으로서, 분리막에 의한 여과 분리나 원심(遠心) 분리가 이용 가능하다. 원심 분리는, 분리에 시간이 필요하며, 실험 레벨의 소량의 분리는 양호해도, 실용에 대한 적용성은 결코 높지 않다. 그러므로, 여과 분리를 이용하여 액체 배지로부터 배양 세포를 제거하는 것이 일반적이다.
일본 특표 2017-502666호 공보(특허문헌 1)는, 세포 배양을 위한 장치에 관한 것이며, 바이오리액터의 출구에 유통(流通)하는 음향 정재파(定在波) 세포 분리기가 기재되어 있다. 음향 정재파에 의한 분리에 있어서는, 상이한 방향으로부터 높은 주파수의 파동을 작용시켜 정재파를 생성시키면, 정재파(standing wave)의 노드(nodes)에 입자가 집중된다. 이 현상을 이용하여, 정재파의 노드에 세포를 집중시켜 액체 배지로부터 세포가 분리된다.
한편, 유체(流體)에 포함되는 입자의 분리에 관한 문헌으로서, 일본 특표 2016-526479호 공보(특허문헌 2)가 있고, 만곡 채널을 구비하는 유체 역학적 분리 디바이스가 기재되어 있다. 이 디바이스에서는, 입자를 포함하는 유체를 만곡 채널에 공급하여, 만곡 채널을 흐르는 유체에 작용하는 힘을 이용하여 입자를 분리할 수 있다.
추출한 액체 배지로부터 세포를 분리할 때의 작업 효율에 의해, 세포 배양의 경제 합리성은 변화되어, 실용화의 여부가 좌우된다. 그러나, 세포의 여과 분리는, 분리막의 눈막힘(clogging)이 생기기 쉬워, 세포가 손상되기 쉽다. 분리막의 눈막힘은, 액체 배지에 포함되는 배양 세포의 밀도가 낮으면 회피 가능하므로, 배양조에서의 액체 배지의 세포 밀도를 분리막의 눈막힘을 회피 가능한 밀도로 유지한다는 방법이 취해진다. 그러나, 이 방법에서는, 연속 배양의 장점인 고밀도에서의 세포 배양에 의한 생산성의 향상은 어려워진다. 따라서, 채산성을 확보하기 위해서는, 액체 배지의 배양 세포 밀도를 극히 고정밀도로 제어할 필요가 있어, 배양조에서의 배양 조건의 관리가 엄격하게 된다.
또한, 연속하여 배양을 행하는 동안에, 증식에 의해 생세포가 증가할뿐 아니라 사세포(死細; dead cell)도 증가한다. 일반적으로, 배양조에서의 배양 세포의 밀도가 적정 범위를 넘으면, 배양조 내의 액체 배지의 일부를 그대로 배출하여, 새로운 액체 배지의 투입에 의해 세포의 밀도가 조정된다. 이 배출되는 액체 배지는, 「블리드(bleed)」라고 하고, 블리드에 포함되는 유용 물질은, 세포를 제거하면, 회수 및 정제할 수 있다. 시험 규모에서는, 데프스 필터(depth filter)를 통해 블리드로부터 세포를 제거하는 것이 가능하지만, 실용화에 있어서는, 세포의 밀도가 높은 블리드에 대응할 수 있는 분리막의 규모 및 비용이 문제로 되어, 블리드는 폐기하는 것이 실정이다.
전술한 점에 관한 것으로서, 상기 특허문헌 1에 기재되는 장치에 있어서는, 높은 주파수의 파동이 작용하는 것에 의한 세포에 대한 물리적 영향이 크다. 세포의 파손에 의해 미세한 세포편(cell fragments)이 생기면, 분리가 더 어려워져, 회수되는 액체 배지로부터 유용 물질을 정제하는 작업에 영향을 주거나, 또는 정제 효율을 저하시킬 가능성이 있다.
특허문헌 2에 기재된 분리 기술은, 고체 입자의 분리에 관한 것으로서, 세포 배양에 적용하는 경우에는, 세포에 대한 영향을 검토할 필요가 있다.
이와 같이, 액체 배지로부터 배양 세포를 분리 제거하는 기술은, 세포 배양에 의한 유용 물질의 생산을 실용화하는 데 있어서 중요하다. 세포를 포함하는 액체 배지로부터 효율적으로 세포를 분리 제거할 수 있으면, 연속 배양에서의 생산성 및 작업성이 향상되어, 세포가 생산하는 물질의 공급 및 이용을 넓히는 것이 가능하다.
본 개시는, 액체 배지로부터의 세포의 분리 기술을 통해 세포의 연속 배양의 실용화에 기여하고, 세포가 생산하는 유용 물질을 효율적으로 얻는 것이 가능한 세포 배양 시스템 및 세포 배양 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
일본 특표 2017-502666호 공보 일본 특표 2016-526479호
상기 문제점을 해결하기 위해, 분리막의 눈막힘에 의한 작업성의 문제를 해소 가능한 방법에 대하여 검토하고, 유체력(流體力) 분리 기술을 이용하여 연속 배양에서의 효율 및 작업성을 개선할 수 있는 것을 발견하였다.
본 발명의 일 태양(態樣)에 의하면, 세포 배양 시스템은, 배양되는 세포를 포함하는 액체 배지(培地)를 수용하는 배양조와, 직사각형 단면(斷面)을 가지는 만곡 유로(curved flow channel)를 구비하고, 상기 만곡 유로를 흐르는 것에 의해 생기는 와류를 이용하여, 상기 배양조로부터 공급되는 액체 배지를, 상대적으로 세포 밀도가 높은 부세포(富細胞; cell- rich) 분획(畵分; fraction)과, 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포(貧細胞; cell- poor) 분획으로 분리하는 유체력 분리 장치와, 상기 유체력 분리 장치에 의해 분리되는 빈세포 분획으로부터 세포를 제거하여 액체 배지를 회수하는 필터를 구비하는 여과 분리 장치를 구비하는 것을 요지로 한다.
세포 배양 시스템은, 또한 상기 유체력 분리 장치와 상기 배양조를 접속하고, 상기 부세포 분획을 상기 배양조에 공급하는 제1 리턴로(return path)와, 상기 여과 분리 장치와 상기 배양조를 접속하고, 상기 빈세포 분획으로부터 제거되는 세포를 상기 배양조에 공급하는 제2 리턴로를 가지도록 구성하면 된다. 또한, 세포를 포함하는 액체 배지의 일부를 블리드(bleed)로서 외부로 배출하는 배출로를 구비하고, 상기 배출로는, 상기 제1 리턴로로부터 분기(branch)되어 설치되고, 상기 부세포 분획의 일부 또는 전부(全部)를 폐기하도록 구성할 수 있다.
또한, 세포 배양 시스템의 여과 분리 장치의 필터는, 데프스 필터(depth filter)라도 되고, 또한 상기 부세포 분획을 블리드로서 외부로 폐기하는 배출로를 가지도록 구성할 수 있다. 그리고, 또한 새로운 액체 배지를 상기 배양조에 공급하는 배지 보급로와, 상기 배양조로부터 공급되는 액체 배지로부터 세포를 제거하여 액체 배지를 회수하는 필터를 구비하는 추가의 여과 분리 장치를 가지도록 구성할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 태양에 의하면, 세포 배양 시스템은, 배양되는 세포를 포함하는 액체 배지를 수용하는 배양조와, 직사각형 단면을 가지는 만곡 유로를 구비하고, 상기 만곡 유로를 흐르는 것에 의해 생기는 와류를 이용하여, 상기 배양조로부터 공급되는 액체 배지를, 상대적으로 세포 밀도가 높은 부세포 분획과 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포 분획으로 분리하는 유체력 분리 장치와, 상기 유체력 분리 장치와 상기 배양조를 접속하고, 상기 빈세포 분획을 상기 배양조에 공급함으로써, 상기 배양조의 액체 배지의 세포 밀도를 저하시키는 배지 리턴로와, 상기 배양조로부터 공급되는 액체 배지로부터 세포를 제거하여 액체 배지를 회수하는 필터를 구비하는 여과 분리 장치를 구비하는 것을 요지로 한다.
상기 세포 배양 시스템은, 또한 상기 여과 분리 장치와 상기 배양조를 접속하고, 상기 여과 분리 장치에 의해 제거된 세포를 포함하는 잔부(殘部)의 액체 배지를 상기 배양조에 공급하는 리턴로를 가져도 된다. 상기 유체력 분리 장치는, 상기 액체 배지를 입수하는 단일의 도입구(導入口)와, 분리한 액체 배지를 배출하는 적어도 2개의 도출구(導出口)를 구비하고, 상기 도출구의 하나로부터 상기 부세포 분획이 배출되고, 또한 하나의 도출구로부터 상기 빈세포 분획이 배출된다. 세포 배양 시스템은, 또한 상기 유체력 분리 장치에 액체 배지를 공급하기 위한 유동압(流動壓)을 액체 배지에 가압하는 가압(付勢) 장치와, 상기 유체력 분리 장치에 도입되는 액체 배지와, 상기 유체력 분리 장치로부터 도출되는 액체 배지와의 압력차가 소정값 이하로 되도록 압력 환경을 제어하는 압력 제어 기구를 가지도록 구성할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 태양에 의하면, 세포 배양 방법은, 액체 배지로 세포를 배양하는 세포 배양과, 직사각형 단면을 가지는 만곡 유로를 흐르는 것에 의해 생기는 와류를 이용하여, 상기 세포 배양로부터 공급되는 액체 배지를, 상대적으로 세포 밀도가 높은 부세포 분획과 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포 분획으로 분리하는 유체력 분리와, 상기 유체력 분리에 의해 분리되는 빈세포 분획으로부터, 필터를 사용하여 세포를 제거하여 액체 배지를 회수하는 여과 분리를 구비하는 것을 요지로 한다.
또한, 본 발명의 다른 태양에 의하면, 세포 배양 방법은, 액체 배지로 세포를 배양하는 세포 배양과, 직사각형 단면을 가지는 만곡 유로를 흐르는 것에 의해 생기는 와류를 이용하여, 상기 세포 배양로부터 공급되는 액체 배지를, 상대적으로 세포 밀도가 높은 부세포 분획과 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포 분획으로 분리하는 유체력 분리와, 상기 빈세포 분획을 상기 세포 배양에 공급함으로써, 상기 세포 배양의 액체 배지의 세포 밀도를 저하시키는 배지 리턴과, 상기 세포 배양로부터 공급되는 액체 배지로부터, 필터를 사용하여 세포를 제거하여 액체 배지를 회수하는 여과 분리 장치를 구비하는 것을 요지로 한다.
본 개시에 의하면, 배양 세포를 포함하는 액체 배지로부터 효율적으로 세포를 분리 제거하여 액체 배지를 회수할 수 있고, 연속 배양의 장점을 살려 효율적으로 세포 배양을 실시 가능한 세포 배양 시스템 및 세포 배양 방법이 제공되어, 세포가 생산하는 유용 물질을 효율적으로 얻는 것이 가능하다.
도 1은 세포 배양 시스템의 제1 실시형태를 나타낸 개략적인 구성도이다.
도 2는 세포 배양 시스템의 제2 실시형태를 나타낸 개략적인 구성도이다.
도 3은 세포 배양 시스템의 제3 실시형태를 나타낸 개략적인 구성도이다.
도 4는 세포 배양 시스템의 제4 실시형태를 나타낸 개략적인 구성도이다.
도 5는 유체력 분리 장치에 의한 세포 분리에서의 De수와 분리 효율과의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 6은 세포 분리에 있어서 사용하는 펌프와 세포의 생존률의 관계를 나타낸 그래프이다.
본 발명의 실시형태에 대하여, 도면을 참조하여, 이하에 상세하게 설명한다.
그리고, 실시형태에 있어서 나타내는 치수, 재료, 그 외의 구체적인 수치 등은, 내용의 이해를 용이하게 하기 위한 기재로서, 특별히 한정하는 경우를 제외하고, 본 개시를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 명세서 및 도면에 있어서, 실질적으로 동일한 기능 및 구성을 구비하는 요소에 대해서는, 동일한 부호를 부여함으로써 중복 설명을 생략하고, 본 개시에 직접 관계가 없는 요소(要素)는, 도시를 생략한다.
액체 중에 포함되는 입자를 분리하는 분리 기술의 하나로, 유체에 발생하는 딘와류(dean vortex)의 작용을 이용하는 것이 있다(상기 특허문헌 2 참조. 이하, 이 기술을 유체력 분리라고 한다). 이것은, 흐름 방향에 수직인 단면이 직사각형이며 일측으로 만곡된 만곡 유로를 흐르는 액체에 딘와류가 발생함으로써, 액체 중의 입자의 분포에 치우침이 생기는 것을 이용한 분리 기술이다. 만곡 유로를 흐르는 입자는, 그 크기에 따라 유로에서의 분포가 상이한 변화를 한다(상기 특허문헌 2 참조). 구체적으로는, 만곡 유로의 단면에 있어서 링(ring)을 그리는 것과 같은 입자 분포가 형성되어, 입자는 나선형으로 유로를 흐르고, 이 때, 상대적으로 큰 입자가 링의 외측에, 상대적으로 작은 입자가 내측에 위치한다. 또한, 소정의 분리 조건으로 설정함으로써, 입자의 분포 형태는 더 변화하고, 일정한 크기를 초과하는 입자가 유로의 외주측으로 수속한다. 따라서, 유체를 외주측의 분획과 내주측의 분획으로 분할하면, 2개의 분획에는, 포함되는 입자의 크기나 밀도에 차이가 생긴다. 즉, 외주측의 분획은 상대적으로 큰 입자를 포함하고, 또한 입자의 밀도가 상대적으로 높아진다. 내주측의 분획은 상대적으로 작은 입자를 포함하고, 또한 입자의 밀도가 상대적으로 낮아진다.
만곡 유로의 외주측에 수속하는 고체 입자의 크기는, 유체의 공급 유속[유량(流量)], 및 만곡 유로의 치수의 설정에 의해 조정 가능하므로, 유체력 분리는, 고체 입자의 크기에 의한 분별(分別)로 이용할 수 있거나, 또는 고체 입자의 분리 또는 농축에 이용할 수 있다. 따라서, 배양 세포를 포함한 액체 배지에 유체력 분리를 적용하면, 세포의 크기에 의한 분별, 및 세포의 농축이 실시 가능하며, 어느 쪽을 실시할 것인지는, 액체 배지를 유통시키는 조건 설정에 의해 결정할 수 있다. 분리 조건의 설정에 의해, 액체 배지에 포함되는 세포의 대부분을 외주측의 분획으로 농축할 수 있다.
본 개시에 있어서는, 유체력 분리를 적용할 때 비교적 높은 유속(流速; flow rate)으로 액체 배지를 만곡 유로에 공급하고, 액체 배지에 포함되는 세포가 만곡 유로의 외주측에 편재하기 쉬워지는 현상을 이용하여, 액체 배지에 포함되는 배양 세포를 농축해 분리한다. 공급되는 액체 배지가 만곡 유로를 흐르는 동안에 상대적으로 큰 세포는 만곡 유로의 외주측에 편재한다. 따라서, 유로의 외주측에는, 상대적으로 세포 밀도(용적 당의 세포수)가 높은 부세포 분획이 생기고, 내주측에는, 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포 분획이 생긴다. 즉, 액체 배지는, 부세포 분획과 빈세포 분획으로 분리되고, 부세포 분획에 있어서 세포가 농축되어, 빈세포 분획에 있어서 세포의 밀도가 저하된다. 따라서, 만곡 유로의 출구에 있어서 부세포 분획과 빈세포 분획으로 분할하여 각각 분취(分取)하면, 빈세포 분획은, 세포 밀도가 낮으므로, 눈막힘을 회피하면서 여과 분리를 행하는 것이 가능하며, 빈세포 분획으로부터 액체 배지를 효율적으로 회수할 수 있다. 유체력 분리에서의 세포의 침습(侵襲)은 적기 때문에, 부세포 분획에 포함되는 세포는, 배양조에 리턴하여 배양을 계속할 수 있다. 빈세포 분획의 여과 분리에 대해서도, 저밀도로 여과 분리를 행함으로써 세포 침습을 경감할 수 있어, 분리 후의 잔부에 포함되는 세포는 배양조에서 배양할 수 있다.
전술한 바와 같이, 유체력 분리를 이용하여, 액체 배지로부터 배양 세포를 제거하는 여과 분리에서의 눈막힘이 해소되어, 액체 배지에 포함되는 유용 물질의 효율적인 회수가 가능하게 된다. 또한, 유체력 분리를 이용하여, 블리드의 농축 폐기도 가능하다. 즉, 배양조의 액체 배지에서의 세포 밀도가 소정량을 초과한 경우에, 블리드로서 배출하는 액체 배지를 추출하여 유체력 분리를 행하면, 세포는 부세포 분획으로 농축된다. 따라서, 세포와 함께 폐기되는 액체 배지를 감량할 수 있다. 빈세포 분획을 배양조에 반송(返送)함으로써, 배양조에서의 세포 밀도를 소정량으로 저하시킬 수 있다. 또는, 빈세포 분획은, 여과 분리의 적용이 가능한 세포 밀도로 얻을 수 있으므로, 데프스 필터의 적용이 용이해져, 액체 배지를 필터링함으로써 유용 물질을 회수할 수 있다.
이하에, 세포 배양 시스템의 구성에 대하여, 도 1에 나타낸 제1 실시형태를 참조하여 설명한다. 도 1의 세포 배양 시스템(1)은, 배양되는 세포를 포함하는 액체 배지를 수용하는 배양조(2)와, 유체력 분리 장치(3)와, 여과 분리 장치(4)를 구비한다. 배양조(2)의 액체 배지(C)는, 송액부(送液部)(5)를 통해 유체력 분리 장치(3)에 공급된다.
유체력 분리 장치(3)는, 흐름 방향에 수직인 일정한 직사각형 단면을 가지는 만곡 유로를 내부에 가지고, 만곡 유로의 일단(一端)에 있어서 액체 배지(C)를 입수하는 단일의 도입구(31)와, 만곡 유로의 타단에 있어서 액체 배지를 분리하여 배출하는 2개 이상의 도출구(32, 33)를 구비한다. 유체력 분리 장치(3)는, 만곡 유로를 흐르는 것에 의해 일방향으로 선회(旋回)하는 액체에 생기는 와류를 이용하여, 액체 배지(C)에 포함되는 세포를 유로의 외측(외주측)에 편재시킨다. 따라서, 만곡 유로로부터 배출되는 액체 배지를, 외주측의 분획과 내주측의 분획으로 분할함으로써, 상대적으로 세포 밀도가 높은 부세포 분획과, 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포 분획으로 분리된다. 하나의 도출구(32)로부터 상대적으로 세포 밀도가 높은 액체 배지가 배출되고, 또한 하나의 도출구(33)로부터 상대적으로 세포 밀도가 낮은 액체 배지가 배출된다.
유체력 분리 장치(3)의 만곡 유로의 만곡 형상은, 대략 원주형, 대략 원호(부분 원주)형, 나선형 등을 들 수 있고, 이들 형상 중 어느 것이라도 된다. 유체력 분리 장치(3)는, 1개의 만곡 유로를 구비하는 유로 유닛을 구성 단위로 하여 설계할 수 있다. 구체적으로는, 유로 유닛으로서, 내부에 1개의 만곡 유로가 형성된 평층형(平層狀)의 성형체를 플라스틱 등으로 형성하고, 이 때, 만곡 유로의 양 말단이 성형체의 단면(端面)으로 개구되어 1개의 도입구와 2개 이상의 도출구를 가지도록 구성한다. 이와 같은 성형체를 유로 유닛으로서 사용하여, 1개의 유로 유닛, 또는 복수의 유로 유닛의 조합에 의해 유체력 분리 장치를 구성할 수 있다. 복수의 유로 유닛을 적층하여 병렬형의 유로를 구성함으로써, 액체 배지의 처리 유량을 높일 수 있다.
송액부(5)는, 배양조(2)와 유체력 분리 장치(3)를 접속하는 배관으로 구성되는 공급로(6)를 구비하고, 배양조(2)의 세포를 포함하는 액체 배지(C)는, 공급로(6)를 통해 유체력 분리 장치(3)에 보내진다. 도 1의 세포 배양 시스템(1)은, 유체력 분리 장치(3)의 도출구(32)와 배양조(2)를 접속하는 배관을 가지고, 이로써, 부세포 분획을 배양조(2)로 반송하는 제1 리턴로(7)가 구성된다. 공급로(6)와 제1 리턴로(7)에 의해, 배양조(2)와 유체력 분리 장치(3)와의 사이에서 액체 배지를 순환 가능한 순환 시스템이 형성된다.
유체력 분리 장치(3)에 의해 분리되는 부세포 분획은, 제1 리턴로(7)를 통해 배양조(2)에 리턴되고, 또한 세포 배양이 계속된다. 빈세포 분획(내주측의 분획)는, 유체력 분리 장치(3)로부터 공급로(8)를 통해 여과 분리 장치(4)에 공급된다.
여과 분리 장치(4)는, 액체 배지를 입수하는 단일의 도입구(41)와, 액체 배지를 분리하여 배출하는 2개 이상의 도출구(42, 43)를 구비하고, 액체 배지로부터 세포를 분리 가능한 필터를 내부에 가진다. 공급로(8)는, 도입구(41)에 접속되고, 유체력 분리 장치(3)로부터 빈세포 분획이 공급된다. 빈세포 분획은, 필터를 투과하는 액체 배지(C1)와, 잔부의 액체 배지로 분리되고, 필터에 의해 제거된 세포는, 잔부의 액체 배지에 농축되어, 세포 밀도가 증가한다. 필터를 투과한 액체 배지(C1)는, 도출구(42)로부터 배출되고, 잔부의 액체 배지는, 도출구(43)로부터 배출된다. 액체 배지는, 배양 세포가 생성된 유용 물질을 포함하므로, 도출구(42)로부터 배출되는 액체 배지(C1)는, 유용 물질을 회수하기 위한 분리 처리 및 정제 처리가 필요에 따라 행해진다.
본 개시에 있어서는, 유체력 분리 장치에 의해 세포 밀도가 저하된 액체 배지가 여과 분리 장치(4)에 공급된다. 따라서, 여과 분리 장치(4)로서, 일반적으로 배양 세포의 분리에 이용되는 여과 분리 장치를 바람직하게 사용할 수 있어, 눈막힘을 회피하면서, 양호하게 액체 배지를 회수할 수 있다. 세포 침습의 방지의 관점에서, 크로스 플로우(cross flow) 여과 방식의 여과 분리 장치가 적합하고, 필터 모듈의 구조로서, 다층 플레이트 구조, 나선형 시트 구조, 중공사 번들 구조(hollow fiber bundle structure) 등을 들 수 있다. 세포를 분리하는 필터로서는, 적절한 구멍 직경을 가지고, 세포의 처리에 적절한 소재의 각종 필터로부터 선택하여 사용할 수 있고, 필터의 종류로서, 정밀 여과막, 한외 여과막(ultrafiltration membrane) 등의 분리막을 들 수 있다. 구멍 직경이 0.01∼10㎛ 정도의 정밀 여과막은, 세포의 제거에 매우 적합하고, 구멍 직경이 0.2∼0.45㎛ 정도의 정밀 여과막을 필터로서 사용하면, 효율적으로 세포를 분리할 수 있다. 표면에 친수화 처리를 행한 필터를 사용하면, 세포의 손상이나 눈막힘을 억제하기 쉽다. 필요에 따라, 구멍 직경이 상이한 복수의 필터를 사용해도 되고, 다단층(多段層)의 분리로 구성된 것이라도 된다. 이 때, 세포 배양에 의해 생기는 대사물, 노폐물의 미소(微小) 응축물, 사세포(dead cell) 편[데브리(debris)] 등을 액체 배지로부터 제거하는 것도 가능하며, 제거 대상에 따라, 예를 들면, 정밀 여과막, 한외 여과막 등으로부터 적절한 구멍 직경의 것을 선택할 수 있다.
세포 배양 시스템(1)은, 여과 분리 장치(4)의 도출구(43)와 배양조(2)를 접속하는 배관을 가지고, 이로써, 빈세포 분획으로부터 제거되는 세포를 배양조(2)에 공급하는 제2 리턴로(9)가 구성된다. 이 실시형태에 있어서, 제2 리턴로(9)는, 제1 리턴로(7)와 합류(merging)하여 순환 시스템의 일부를 구성하지만, 제1 리턴로(7)는 합류하지 않고 단독으로 배양조(2)에 공급하도록 구성해도 된다.
또한, 여과 분리 장치(4)로부터 배출되는 액체 배지(C1)의 양에 대응하는 새로운 액체 배지(C0)를 배양조(2)에 보충하기 위해, 배지 보충부(10)가 구비되어 있고, 배양조(2) 내의 액체 배지(C)는, 새로운 액체 배지(C0)의 보충에 의해, 일정량으로 유지된다.
유체력 분리 장치(3)에서의 세포의 분리 효율은, 만곡 유로에 공급되는 액체에서의 De수 및 압력에 따라 변화되어, 바람직한 분리가 가능한 De수 및 압력의 적정한 범위가 존재한다. 딘수 De는, 식: De=Re(D/2 Rc)1/2, 로 표현된다[Re: 레이놀드수(-), D: 대표 길이(m), Rc: 유로의 선회 반경(m)]. De수는, 액체의 유속(flow rate)에 비례하므로, 유체력 분리 장치에 공급되는 액체의 유속(flow rate) 및 압력을 적절하게 제어함으로써, 바람직한 세포 분리가 실시된다. 대체로, De수가 30 이상 또한 100 이하인 것이 바람직하고, 50∼80 정도이면 더욱 바람직하다. 따라서, 이와 같은 범위의 De수로 되도록 액체 배지의 유속(flow rate)(유량)이 설정된다.
세포 배양 시스템(1)의 송액부(5)는, 유체력 분리 장치(3)에 액체 배지(C)를 공급하기 위한 유동압을 액체 배지(C)에 가압하는 가압 장치, 구체적으로는, 펌프(11)를 구비한다. 펌프(11)가 부여하는 유동압에 의해, 액체 배지(C)가 유체력 분리 장치(3)에 공급되는 유량 및 유압(流壓)은 변화한다. 분리된 세포를 배양조(2)에 리턴하여 세포 배양을 계속하는 데 있어서, 세포의 생존률은 중요하다. 이 점에 관하여, 세포의 생존률은, 유체력 분리 장치(3)에서의 분리의 사이의 압력 변동의 크기에 따라 변화한다. 즉, 생존률의 저하를 방지하기 위해서는, 세포 분리에서의 압력 변동을 적게 하는 것이 유효하다. 따라서, 이 점에 기초하여, 송액부(5)가 액체 배지(C)를 유체력 분리 장치(3)에 유통시키는 압력 환경은, 유체력 분리 장치(3)를 유통하는 사이의 액체 배지에서의 압력 변동에 의한 세포 생존률의 저하가 억제되도록 제어된다.
따라서, 송액부(5)는, 압력 제어 기구(機構)를 구비하고, 이로써, 유체력 분리 장치(3)에 도입되는 액체 배지와, 유체력 분리 장치(3)로부터 도출되는 액체 배지와의 압력차가 소정값 이하로 되도록 압력 환경을 제어한다. 압력 제어 기구는, 압력계 및 압력 조정 밸브를 사용하여 구성할 수 있다. 구체적으로는, 도 1의 세포 배양 시스템(1)에 있어서는, 압력계(12) 및 압력 조정 밸브(13)가 공급로(6) 상에 설치된다.
동물 세포는, 비교적 고압 하에서도 내성(耐性)을 가지고, 예를 들면, 1 MPa 정도의 가압 공급에 있어서도 세포의 생존률은 유지된다. 그러나, 압력 변동이 크면, 0.6 MPa 정도의 압력(입구 압력)에서도, 세포의 손상이 크고, 생존률이 저하된다. 따라서, 유체력 분리 중에 세포에 가해지는 압력의 변동(입구 압력과 출구 압력과의 차)이 소정값 이하로 되도록 액체 배지의 공급을 제어하면 된다. 구체적으로는, 압력 변동(압력차)이 0.60 MPa 미만으로 되도록 제어되고, 바람직하게는 0.45 MPa 이하, 더욱 바람직하게는 0.40 MPa 이하로 되도록 설정된다. 상기한 바와 같이 압력 변동이 억제된 분리 조건에 있어서는, 세포의 생존률은 98% 정도 이상으로 유지할 수 있으므로, 농축 분리된 세포를 배양조에 리턴하여 증식 효율을 유지할 수 있다.
세포 배양 시스템(1)에 있어서, 유체력 분리 장치(3)의 도출구(32, 33)에서의 도출 측 압력은 대기압에 개방되므로, 도입되는 액체 배지와 도출되는 액체 배지와의 압력차는, 압력계(12)에 의해 측정되는 압력(게이지압)과 같다. 따라서, 이 측정값에 기초하여 압력 제어를 행할 수 있다. 분리 중인 세포에서의 생존률의 저하를 방지하기 위해, 압력차가 0.60 MPa 미만으로 되도록 압력 환경은 제어되고, 바람직하게는, 0.45 MPa 이하, 더욱 바람직하게는 0.40 MPa 이하로 되도록 제어된다.
유체력 분리 장치(3)로부터 배출되는 액체 배지에서의 압력이 높으면, 유체력 분리 장치(3)에 도입되는 액체 배지에 적용 가능한 압력 범위의 상한은 높아진다. 따라서, 유체력 분리 장치(3)에 도입되는 액체 배지에 가해지는 압력이 0.6 MPa 이상으로 되는 조건 설정에 대해서도, 액체 배지의 도입 시와 배출 시의 압력차를 감소시켜 대응할 수 있다. 즉, 제1 리턴로(7) 및 공급로(8)에 압력 조정 밸브를 설치하고, 유체력 분리 장치(3)의 도출구(32, 33)로부터 배출되는 액체 배지에서의 출구 압력을 증가시켜, 압력차를 감소시키면 된다. 이 경우, 제1 리턴로(7) 및 공급로(8)에 압력계를 설치하여, 적절한 압력차로 되도록 배출 압력을 감시하는 것이 바람직하다. 또한, 제1 리턴로(7)를 흐르는 액체 배지에 대해서도 급격한 압력 변동이 생기지 않도록 압력 환경을 확인하면 된다. 단, 제1 리턴로(7) 및 공급로(8)에서의 압력은, 여과 분리 장치(4)의 분리 처리에 적절한 범위를 고려하여 설정된다.
전술한 바와 같이, 유체력 분리 장치(3)에서의 분리 효율은, 만곡 유로(curved flow channel)를 유통하는 액체 배지의 유속(flow rate)에 의존한다. 따라서, 송액부(5)는, 또한 유체력 분리 장치(3)에 공급되는 액체 배지의 유량을 제어하는 유량 제어 기구를 구비하고, 유체력 분리 장치(3)의 만곡 유로를 유통하는 액체 배지가 적정한 유속으로 되도록, 공급로(6)를 유통하는 액체 배지의 유량이 제어된다. 유량 제어 기구는, 유량계(14)와, 유량 조정 밸브(15)에 의해 구성된다. 유량계(14)는, 유체력 분리 장치(3)에 공급되는 액체 배지(C)의 유량을 감시하고, 유량 조정 밸브(15)는, 유량계(14)에 의해 감시되는 유량에 기초하여, 유체력 분리 장치(3)에 공급되는 액체 배지(C)의 유량을 조정한다. 여과 분리에 적절한 세포 밀도의 액체 배지가 여과 분리 장치에 공급되도록, 유체력 분리 장치(3)에 공급되는 액체 배지의 유량이 조정된다.
세포 배양 시스템(1)에 있어서, 유체력 분리 장치(3)에 공급하는 액체 배지의 유량을 펌프(11)의 구동 제어에 의해 적절하게 조정 가능한 경우, 유량 조정 밸브(15)를 생략할 수 있다. 또한, 유체력 분리 장치(3)에 공급하는 액체 배지의 압력을 펌프(11)의 구동 제어에 의해 적절하게 조정 가능한 경우, 압력 조정 밸브(13)를 생략 가능하다. 따라서, 유체력 분리 장치(3)에서의 처리 능력(유로 단면의 크기 및 유로 수)에 기초하여, 공급로(6) 및 제1 리턴로(7)의 치수를 적절하게 설계함으로써, 세포 배양 시스템의 구성을 간략화할 수 있다.
세포 배양 시스템(1)의 배지 보충부(10)는, 새로운 액체 배지(C0)를 수용하는 배지 탱크16, 및 배지 탱크(16)와 배양조(2)를 접속하는 배지 보급로(17)를 구비한다. 배지 탱크(16)의 새로운 액체 배지(C0)를 배양조(2)에 보충하여, 배양조(2) 내의 액체 배지를 일정량에 유지한다. 즉, 여과 분리 장치(4)로부터 회수되는 액체 배지(C1)의 양에 대응하는 양의 새로운 액체 배지(C0)가, 배지 탱크(16)로부터 배지 보급로(17)를 통해 보충된다. 이 때문에, 도 1의 세포 배양 시스템(1)에 있어서는, 배지 보충부(10)는, 배양조(2)에 설치되는 액면계(18)와, 배지 보급로(17)에 설치되는 유량 조정 밸브(19)를 구비한다. 액면계(18)가 검출하는 액면 레벨에 따라, 유량 조정 밸브(19)가 제어되고, 배양조(2)의 액체 배지의 액면이 일정하게 유지되도록, 배지 탱크(16)에 부설(付設)되는 롤러 펌프(20)에 의해 공급되는 액체 배지(C0)의 양이 조정된다. 유체력 분리 장치(3) 및 여과 분리 장치(4)로부터 배양조(2)에 리턴되는 액체 배지의 양은, 여과 분리 장치(4)로부터 회수되는 액체 배지(C1)의 분만큼 감소하고 있으므로, 배양조(2) 내의 액면을 유지함으로써, 회수한 액체 배지(C1)에 대응한 보충이 행해진다.
액면계 대신에, 배양조(2)의 중량을 측정하는 중량계를 사용해도, 이와 같은 보충을 행할 수 있고, 중량이 일정하게 유지되도록 새로운 액체 배지를 보충하면 된다. 또는, 여과 분리 장치(4)로부터 회수되는 액체 배지의 중량 또는 유량을 측정하는 계측기를 사용해도 된다. 또는, 배양조(2)에 리턴되는 제1 리턴로(7)의 부세포 분획의 양, 및 여과 분리 장치(4)로부터 리턴되는 제2 리턴로(9)의 액체 배지의 양을 측정하는 계측기(유량계)를 사용하여 이와 같은 보충을 행해도 된다.
배양조(2) 및 배지 탱크(16)는, 미생물 오염을 방지할 수 있는 용기이다. 이들은, 각각, 히터 또는 냉각기, 및 온도 조절 기능이 장비된 것이 사용되고, 내부의 액체 배지는, 세포 배양 또는 보관에 적절한 온도로 유지된다. 배양조(2)는, 세포를 손상시키지 않는 적절한 속도로 교반 가능한 교반 장치를 구비하고, 액체 배지를 균일화한다. 또한, 필요에 따라, 배양하는 세포에 적절한 배양 환경에 조정 가능하도록, 산소/이산화탄소/공기의 양, pH, 도전율(導電率), 광량 등을 조정하는 기능을 구비한 것을 적절히 이용하면 된다.
배양조(2)에는, 증식한 세포를 포함하는 액체 배지를 블리드로서 외부로 배출하는 배출로(21)가 접속되고, 배양조(2)의 액체 배지에 있어서 세포가 과도하게 증식한 경우에, 액체 배지의 일부를 배출로(21)로부터 외부로 배출한다. 이 배출량에 대응하여 새로운 액체 배지(C0)를 배지 탱크(16)로부터 공급하고, 배양조(2) 내의 액체 배지의 양을 소정량으로 유지함으로써, 액체 배지의 세포 밀도는 저하된다. 배출로(21)에는 개폐 밸브(22)가 설치되고, 이 개폐에 의해 블리드의 배출량을 조정할 수 있으므로, 배양조(2)에서의 액체 배지의 세포 밀도를 적정량에 조절할 수 있다. 세포 배양 시스템(1)에 있어서는, 여과 분리 장치(4)에 있어서 분리 처리를 행하는 액체 배지는, 유체력 분리 장치(3)에 있어서 세포 밀도가 저하된 빈세포 분획이므로, 배양조(2)에서의 액체 배지의 세포 밀도는, 여과 분리에 적절한 액체 배지의 세포 밀도보다 높아도 된다. 즉, 유체력 분리 장치에 있어서의 분리 효율을 감안하여, 배양조(2)에서의 액체 배지의 세포 밀도의 상한을 높게 설정할 수 있다. 따라서, 블리드로서 배출되는 액체 배지의 세포 밀도도 높아지고, 블리드의 폐기에 의한 액체 배지의 손실은 적어지게 된다. 블리드의 추출은, 세포의 생존률이 저하된 시에 정기적으로 행함으로써 생존률의 개선이 가능하므로, 블리드로서 배출되는 액체 배지의 감량은, 매우 유용하다.
전술한 바와 같이, 세포 배양 시스템에 있어서는, 세포의 생존률을 바람직하게 유지하기 위해, 유체력 분리 장치(3)에 공급되는 액체 배지의 압력 환경이 제어된다. 세포의 생존률은, 세포를 포함한 액체 배지에 유동압을 공급하는 펌프(11)에 의한 영향도 받으므로, 세포의 생존률을 유지하는 데 있어서 바람직한 송액(送液) 수단을 펌프(11)로서 선택하는 것이 바람직하다. 세포의 생존률에 대한 영향을 억제하기 위해서는, 세포에 전단(剪斷) 응력을 가하지 않는 방식의 펌프인 것이 바람직하고, 구체적으로는, 왕복동(reciprocating) 또는 회전 이동에 의한 용적 변화를 이용하여 일정 용적의 액을 압출(押出)하는 용적식(容積式) 펌프를 사용하면 된다. 용적식 펌프로서, 예를 들면, 피스톤 펌프, 플런저(plunger) 펌프, 다이어프램 펌프, 윙 펌프(wing pump) 등의 왕복 펌프, 기어 펌프, 베인 펌프, 스크루 펌프 등의 회전 펌프를 들 수 있다. 일 실시 형태로서, 압축기를 부설한 가압 탱크를 이용하는 것을 들 수 있고, 가압 탱크에 수용한 액체 배지에 압축기로 가압함으로써, 가압 탱크로부터 유체력 분리 장치에 액체 배지를 압송(壓送)할 수 있다.
유체력 분리 장치에 있어서의 세포의 농축 상태 및 분취 비율은, 출구에서의 도출구의 분할 위치에 따라서 상이하다. 즉, 만곡 유로의 말단 출구에서의 도출구의 분할 위치의 설계에 의해, 외주측의 분획과 내주측의 분획과의 분할 비율을 조정할 수 있다. 도 1의 세포 배양 시스템에 있어서, 유체력 분리 장치는, 만곡 유로의 출구로서, 2개의 도출구를 가지지만, 3개 이상의 도출구로 분할해도 된다. 말단 출구를 3개 이상의 도출구로 분할한 경우, 배양조로 반송하는 분획의 양, 및 여과 분리 장치에 공급하는 분획의 양을 상황에 따라서 변경할 수 있다.
전술한 바와 같은 세포 배양 시스템(1)에 있어서 실시 가능한 세포 배양 방법에 대하여, 이하에 기재한다. 세포 배양 방법은, 액체 배지로 세포를 배양하는 세포 배양 단계와, 만곡 유로를 이용하는 유체력 분리 단계와, 필터를 이용하는 여과 분리 단계를 포함한다. 세포 배양 단계는, 배양조(2)에 있어서 행해지고, 유체력 분리 단계는, 유체력 분리 장치(3)에 있어서 실시된다. 여과 분리 단계는, 여과 분리 장치(4)에 의해 실시된다. 유체력 분리 단계에 있어서는, 직사각형 단면을 가지는 만곡 유로를 흐르는 것에 의해 생기는 와류를 이용하여, 세포 배양 단계로부터 공급되는 액체 배지를 부세포 분획과 빈세포 분획으로 분리한다. 부세포 분획은, 상대적으로 세포 밀도가 높고, 빈세포 분획은, 상대적으로 세포 밀도가 낮다. 여과 분리 단계에 있어서는, 유체력 분리 단계에 의해 분리되는 빈세포 분획으로부터, 세포를 제거하여 액체 배지를 회수한다.
세포 배양 단계에서는, 배양 세포에 적절한 환경에 조정된 액체 배지 중에서 세포 배양을 개시하고, 배양 중, 액체 배지의 글루코스 농도 및 세포 밀도를 감시한다. 배양이 진행함에 따라, 글루코스가 소비되고, 세포가 증식하여 세포 밀도가 증가한다. 그에 따라, 세포가 생산하는 항체 등의 유용 물질은 증가한다. 세포 배양 단계에서의 글루코스 농도가 소정 농도, 예를 들면, 1 g/L을 하회(下回)하기 시작하면, 새로운 액체 배지를 연속하여 공급한다. 이 때, 글루코스의 고갈 및 과잉으로 되지 않는 소정 농도 이하의 범위에 수용되도록 공급을 조절한다. 이와 동시에, 펌프(11)를 작동시켜, 유체력 분리 단계 및 후속의 여과 분리 단계로의 액체 배지의 공급을 개시하면, 세포 밀도가 증가한 액체 배지가 유체력 분리 단계 및 여과 분리 단계로부터 리턴된다. 여과 분리 단계로부터 회수되는 액체 배지(C1)가 원하는 농도의 유용 물질을 포함하고 있는 경우에는, 회수하여 유용 물질의 분리 정제가 행해진다. 이 동안에, 여과 분리 단계로부터 회수되는 액체 배지(C1)의 양과, 배양 단계에 공급되는 새로운 액체 배지(C0)의 양이 대응하도록, 유체력 분리 단계로의 공급이 제어된다.
여과 단계로부터 회수되는 액체 배지의 유용 물질의 농도가 낮은 경우에는, 그 글루코스 농도 등을 고려하여, 폐기, 또는 배양조(2)에 공급하여 재이용 해도 된다. 예를 들면, 배양조에 필요한 새로운 액체 배지의 공급 유량이 낮고, 유체력 분리 단계에서의 정격 유량을 유지하여 연속 처리하면 배양조에서의 액체 배지의 양을 일정하게 유지할 수 없는 경우에는, 유체력 분리 단계로의 공급을 간헐적으로 행해도 된다. 이로써, 유체력 분리 단계에서의 정격 유량을 유지하여 바람직하게 분리를 행하면서, 배양조의 액체 배지의 양을 유지할 수 있다. 간헐적인 유체력 분리를 행하는 경우, 유체력 분리 단계로의 공급의 전환 빈도를 높여 단속(斷續)을 미세하게 행하면, 배양조의 액체 배지에서의 농도 변동을 억제하는 데 있어서 유효하다.
세포 배양 단계에서의 액체 배지가 소정의 세포 밀도에 도달하였으면, 증식에 의한 세포 밀도의 증가 예측에 기초하여, 여분량의 세포를 블리드로서 배출하고, 또한 새로운 액체 배지의 공급량을 조정하여, 배양조 내의 액체 배지의 액량 및 세포 밀도를 소정량으로 유지한다.
세포 밀도의 계측은, 액체 배지의 샘플링에 의한 계측이라도, 세포 계측 장치의 검출기에 의한 직접 계측이라도 된다. 세포 배양 시스템(1)에 있어서는, 여과 분리 단계에 공급되는 액체 배지는, 유체력 분리에 의해 얻어지는 빈세포 분획이므로, 세포 배양 단계에서의 액체 배지의 세포 밀도는, 여과 분리에 적절한 액체 배지의 세포 밀도보다 높게 설정할 수 있다. 여과 분리에 적절한 세포 밀도는, 사용하는 필터 등에 따라서도 상이하지만, 대체로, 5×107 세포/mL 정도라도 되고, 유체력 분리에서의 분리를 고려하여, 이보다 높은 세포 밀도를 세포 배양 단계에서의 소정량으로서 설정할 수 있다. 그러므로, 블리드로서 배출되는 액체 배지의 양을 삭감할 수 있다.
그리고, 만곡 유로를 유통하는 사이의 액체 배지에서의 압력 변동에 의해 세포 생존률이 저하되지 않도록, 압력계(12) 및 압력 조정 밸브(13)를 사용하여 액체 배지의 압력이 제어된다. 이 때, 유체력 분리에서의 압력 변동(압력차)이 0.60 MPa 미만, 바람직하게는 0.45 MPa 이하, 더욱 바람직하게는 0.40 MPa 이하로 되도록 조절된다.
유체력 분리 단계에 있어서, 세포를 포함하는 액체 배지는, 직사각형 단면을 가지는 만곡 유로에 단일의 도입구로부터 도입되고, 균일한 상태로 만곡 유로에 공급된다. 유체력 분리 장치의 만곡 유로는, 흐름 방향에 수직인 단면(직경 방향 단면)이 직사각형의 유로이다. 균일한 액체 배지가 만곡 유로를 흐르는 동안에, 상대적으로 작은 세포 및 미세 입자는, 딘와류에 실려, 직사각형 단면에 있어서 링을 그리도록 분포가 변화하는 한편, 상대적으로 큰 세포는, 유로의 외주측에 체류하는 양력(揚力)이 비교적 강하게 작용하여, 분포가 외주측에 집중된다. 이 작용이 강해지면, 세포의 외주측으로의 편재 경향이 커지게 된다. 만곡 유로의 말단에 있어서, 외주측의 도출구(32)로부터 상대적으로 세포 밀도가 높은 부세포 분획, 즉, 세포가 농축된 액체 배지가 배출된다. 내주측의 도출구(33)로부터는, 잔부의 액체 배지, 즉, 세포가 감소하여 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포 분획이 배출된다.
전술한 식에서 나타낸 바와 같이, De수는, 만곡 유로의 선회 반경 Rc 및 유로의 단면 치수에 따라 변화한다(전술한 식에서의 대표 길이 D는, 만곡 유로의 폭이라고 볼 수가 있다). 따라서, 만곡 유로의 설계에 기초하여 De수가 바람직한 값으로 되도록 조정할 수 있고, 그에 따라, 유체력 분리 장치는, 세포의 농축 분리를 양호한 분리 효율로 실시할 수 있다. 또한, 유체의 유량은, 만곡 유로의 단면의 폭(직경 방향) 및 높이 중 어느 하나의 설정에 의해 조절 가능하므로, 만곡 유로의 설계에 기초하여, 적정한 압력 및 원하는 유량으로 세포의 분리 처리를 실시 가능하도록 유체력 분리 장치를 구성할 수 있다. 따라서, 만곡 유로의 설계는, 분리 대상의 조건(세포의 치수 분포, 배지의 점도 등)에 따라 바람직한 분리가 가능하도록 적절히 변경할 수 있다. 세포의 분리 효율의 관점에서, 어스펙트비(폭/높이)가 10 이상의 직사각형의 단면을 가지는 만곡 유로인 것이 바람직하다. 이와 같은 만곡 유로에, 액체 배지를 100∼500 mL/분 정도의 유량으로 공급함으로써, 세포가 양호하게 편재하고, 50억∼250억 세포/분 정도의 효율로 세포의 농축 분리를 행할 수 있다. 이와 같은 유체력 분리를, 예를 들면, 5×107 세포/mL 정도의 액체 배지에 적용하면, 세포 밀도가 7×107 세포/mL 정도 이상의 부세포 분획과, 1×107 세포/mL 정도 이하의 빈세포 분획으로 분리할 수 있다.
유체력 분리 장치의 만곡 유로의 말단 출구에서의 도출구의 분할 위치에 따라서, 외주측의 부세포 분획과 내주측의 빈세포 분획과의 분할 비율을 조정할 수 있고, 이에 기초하여 세포의 농축 분리의 정도를 조정할 수 있다. 대체로, 외주측 분획/내주측 분획의 분할 비율(용적비)이, 90/10∼50/50 정도로 되도록 유로 출구에서의 단면적비(斷面績比)를 설계하면, 전술한 바와 같은 세포의 농축 분리에 매우 적합하고, 세포의 95% 정도 이상을 부세포 분획으로 농축하도록 한 분리가 가능하다. 유체력 분리 단계로부터 배출되는 부세포 분획은, 배양조에서의 세포 배양 단계로 리턴되고, 빈세포 분획은, 여과 분리 단계에 공급된다. 큰 세포는, 작은 세포에 비해 생존률 및 활성이 높고, 부세포 분획은 큰 세포를 상대적으로 많고 포함한다. 따라서, 부세포 분획을 세포 배양 단계로 리턴하여 세포 배양 단계와 유체력 분리 단계와의 사이에서 액체 배지가 순환하면, 세포의 배양 효율이 높아진다.
여과 분리 단계에 있어서는, 세포를 투과시키지 않는 구멍 직경의 필터가 사용되고, 필터를 투과한 액체 배지(C1)가 회수된다. 정밀 여과막은, 대체로, 구멍 직경이 0.01∼10㎛ 정도이며, 세포의 분리 제거에 적합하다. 구멍 직경이 0.2∼0.45㎛ 정도이면, 세포와, 단백질이나 다당류 등의 물질과의 분리가 된다. 세포의 여과 분리에서는, 막면에 평행하게 액체 배지를 유통시키는 크로스 플로우 여과 방식의 적용이 바람직하다. 액체 배지(C1)를 회수한 잔부의 액체 배지에는, 필터에 의해 제거된 세포가 농축되므로, 잔부의 액체 배지에서의 세포 밀도는, 빈세포 분획 더욱 높아진다. 잔부의 액체 배지는, 세포 배양 단계로 리턴되어 배양이 계속된다. 여과 분리에 있어서는, 여과 압력 및 전단 응력에 의한 세포 손상을 고려하여, 빈세포 분획의 공급 유량 및 압력이 적절하게 조정된다. 빈세포 분획의 세포 밀도는 낮으므로, 여과에서의 부하가 작아, 눈막힘은 해소된다.
필터를 투과하여 회수되는 액체 배지(C1)는, 유용 물질의 분리 정제를 위한 처리가 필요에 따라 행해진다. 이로써, 세포 배양에 의해 생기는 대사물, 노폐물의 미소 응축물, 사세포편(데브리) 등이 액체 배지로부터 제거된다. 이와 같은 분리 정제의 일부를 행할 목적으로, 구멍 직경이 상이한 복수의 필터를 사용하는 다단층의 분리에 여과 분리 단계를 구성해도 된다. 예를 들면, 구멍 직경이 0.001∼0.01㎛ 정도의 한외 여과막은, 아미노산, 펩티드, 당류, 항생 물질 등을 투과시키고, 고분자, 단백질, 다당류 등을 제거할 수 있다.
여과 분리 단계에 있어서 투과액으로서 회수되는 액체 배지의 분만큼, 유체력 분리 단계 및 여과 분리 단계로부터 배양 단계로 리턴되는 액체 배지의 총량이 감소한다. 따라서, 이 양에 대응하는 새로운 액체 배지(C0)가 배양 단계에 보충되도록 액체 배지(C0)의 공급량을 조정한다. 이로써, 세포가 사용하는 영양소가 계속적으로 보충되어 대사물의 농도가 희석되어, 연속하여 배양을 행할 수 있다.
유체력 분리 단계 및 여과 분리 단계로부터 세포 배양 단계에 세포가 리턴되고, 세포 배양이 계속된다. 배양조 내의 액체 배지의 세포 밀도는 감시 되고, 액체 배지의 세포 밀도가 소정량으로 유지되고 있는 상태에서는, 배지 탱크로부터 공급되는 새로운 액체 배지(C0)의 양은, 여과 분리 단계로부터 회수되는 액체 배지의 양에 상당한다. 세포가 과도하게 증식하여 세포 밀도가 소정량을 초과하는 상태에서는, 세포 밀도의 조정을 위해 액체 배지(C)의 일부가 블리드로서 배출되므로, 이에 대응하여 새로운 액체 배지(C0)의 공급량이 증가한다. 이와 같이 하여, 배양조(2) 내의 액체 배지의 양은 일정하게 유지되고, 액체 배지의 세포 밀도는 소정량으로 저하된다. 블리드의 배출량은, 세포의 증가 예측에 기초하여 결정할 수 있고, 세포 밀도의 감시 결과에 기초하여, 세포 밀도가 소정량으로 유지되도록 배출량을 적절히 수정하면 된다. 배양조(2)에서의 액체 배지의 세포 밀도는, 여과 분리에 적절한 액체 배지의 세포 밀도보다 높게 설정할 수 있고, 유체력 분리에서의 분리 정도를 고려하여, 배양조에서의 세포 밀도의 소정량을 결정하면 된다. 따라서, 블리드로서 배출되는 액체 배지의 세포 밀도도 높아지고, 블리드의 폐기에 의한 액체 배지의 손실은 적어지게 된다. 원하는 배양 시간이 경과했으면, 적절히 배양을 정지하여 되고, 통상, 10∼30일 정도 배양을 계속할 수 있다.
유체력 분리에 의해 얻어지는 부세포 분획에서의 세포 밀도는, 배양조에서의 액체 배지의 세포 밀도보다 높다. 따라서, 부세포 분획은, 블리드로서 폐기하는 것으로서 바람직하다. 세포 배양 시스템의 제2 실시형태로서, 부세포 분획을 블리드로서 배출하도록 구성한 세포 배양 시스템을 도 2에 나타낸다.
도 2의 세포 배양 시스템(50)에 있어서는, 블리드를 배출하기 위한 배출로(21a)는, 배양조(2)는 아니고, 유체력 분리 장치(3)로부터 부세포 분획을 배출하는 제1 리턴로(7)로부터 분기하도록 설치된다. 배출로(21a)에는 개폐 밸브(22a)가 설치되고, 배양조(2)에서의 액체 배지의 세포 밀도가 소정량을 초과했을 때 부세포 분획을 폐기하도록 개폐 밸브(22a)가 제어된다. 또는, 개폐 밸브(22a) 대신에 유량 조정 밸브를 설치하여, 블리드로서 배출하는 부세포 분획의 비율의 조절 및 변경이 가능하도록 구성해도 된다. 이와 같이 하여, 유체력 분리 장치로부터 배출되는 부세포 분획의 일부 또는 전부를 블리드로서 배출로(21a)로부터 배출할 수 있다.
유체력 분리 장치(3)에서는, 분리 효율이 최대로 되도록 한 최적인 작동 유량(정격 유량)이 존재한다. 따라서, 블리드로서 배출해야 할 유량이 적을 경우, 배출로(21a)로부터의 부세포 분획의 배출을 간헐적으로 행하도록 개폐 밸브(22a)를 제어함으로써 대응할 수 있다. 또는, 유체력 분리 장치(3)의 작동 자체를 간헐적으로 행하는 것도 가능하다. 블리드의 배출에 대응하여 새로운 액체 배지가 배양조(2)에 공급되므로, 배양조(2)에서의 액체 배지의 액질(液質)이 변동된다. 따라서, 간헐적인 블리드 배출의 경우, 배양조(2)의 액체 배지의 액질의 변동이 가능한 한 적어지도록, 전환 빈도를 높게 하여 미세하게 조절하면 된다. 세포 배양 시스템(50)은, 블리드를 배출하기 위한 구성 이외에는, 도 1의 세포 배양 시스템(1)과 같으므로, 동일한 장치 및 부재에 관한 설명은 생략한다.
도 1 및 도 2의 실시형태는, 유용 물질을 포함하는 액체 배지를 회수하는 여과 분리에 유체력 분리를 조합하도록 구성되어 있고, 여과 분리에서의 부하가 경감된다. 유체력 분리는, 폐기되는 블리드에 관한 여과 분리와 조합시켜도 유효하고, 여과 분리에서의 부하가 마찬가지로 경감되고, 액체 배지의 회수에 필요로 하는 비용 삭감이 가능하다. 세포 배양 시스템의 제3 실시형태로서, 블리드의 배출에 있어서 유체력 분리를 이용하도록 구성한 세포 배양 시스템을 도 3에 나타낸다. 이 실시형태에서는, 여과 분리 장치의 필터로서 데프스 필터를 이용하여, 블리드로부터 액체 배지를 회수하고, 배양 중의 세포를 포함하는 액체 배지로부터 세포를 제거하여 액체 배지를 회수하기 위해 추가의 여과 분리 장치가 사용된다.
상세하게는, 도 3의 세포 배양 시스템(51)은, 배양조(2), 유체력 분리 장치(3), 여과 분리 장치(4), 배지 보충부(10) 및 데프스 필터(52)를 구비한다. 세포 배양 시스템(51)은, 유체력 분리 장치(3)가 블리드를 배출하는 배출로(21b)에 설치되어 데프스 필터(52)에 접속되는 점에 있어서, 도 1의 세포 배양 시스템(1)과 다르다. 여과 분리 장치(4)는, 배양조(2)와 직접 접속된다.
배양조(2)에서의 액체 배지의 세포 밀도가 소정량을 초과할 때, 블리드로서 배출되는 액체 배지(C)가, 펌프(11)의 작동에 의해, 배양조(2)로부터 배출로(21b)를 통해 유체력 분리 장치(3)의 도입구(31)에 공급된다. 블리드의 배출은, 세포의 증가 예측에 기초하여 설정할 수 있어, 배양조(2)에서의 세포 밀도의 감시에 의해 적절히 수정 가능하다. 유체력 분리 장치로의 액체 배지의 공급은, 도 1, 도 2의 세포 배양 시스템과 마찬가지로, 압력 조정 밸브(13) 및 유량 조정 밸브(15)에 의해 제어되고, 압력계(12) 및 유량계(14)를 사용하여 적정한 유량(정격 유량) 및 압력으로 조정할 수 있다. 적정한 유량으로 블리드를 공급하기 위해, 상황에 따라서 연속 공급 또는 간헐 공급이 행해진다. 유체력 분리 장치(3)에 있어서, 액체 배지(C)는, 부세포 분획과 빈세포 분획으로 분리된다. 유체력 분리 장치(3)의 도출구(33)는, 공급로(53)를 통해 데프스 필터(52)에 접속되고, 빈세포 분획이 데프스 필터(52)에 공급된다. 그리고, 이 실시형태에 있어서는, 일시적으로 빈세포 분획 C＇를 저류하기 위해, 미생물 오염을 방지할 수 있는 용기(54)가 공급로(53)에 설치되고, 데프스 필터(52)에 대한 공급을 조정 가능하게 구성되어 있다. 그러나, 용기(54)는 생략해도 된다.
데프스 필터(52)는, 세포 밀도가 낮은 빈세포 분획 C＇를 여과하므로, 눈막힘이 쉽게 생기지 않아, 필터의 처리 용량에 대해서도 대응하기 쉽다. 따라서, 배양조(2)로부터 공급되는 액체 배지의 빈세포 분획 C＇로부터 세포를 제거하여 효율적으로 액체 배지를 회수할 수 있다. 유체력 분리 장치(3)는, 도출구(32)에 접속되는 배출로(55)를 구비하고, 부세포 분획은, 블리드로서 배출로(55)로부터 외부로 폐기된다. 세포는 부세포 분획 측에 농축되므로, 블리드로서 폐기되는 액체 배지의 양은 삭감된다.
한편, 여과 분리 장치(4)의 도입구(41) 및 도출구(43)는, 공급로(56) 및 리턴로(57)에 의해 배양조(2)와 직접 접속된다. 배양조(2) 내의 액체 배지(C)는, 펌프(58)의 작동에 의해 여과 분리 장치(4)에 연속하여 공급되고, 필터를 투과한 액체 배지(C1)가 도출구(42)로부터 회수된다. 세포 밀도가 증가한 액체 배지가, 도출구(43)로부터 리턴로(57)를 통해 배양조(2)로 리턴된다. 액체 배지(C)가 배양조(2)와 여과 분리 장치(4)를 순환함으로써, 액체 배지의 세포 밀도 및 유용 물질의 농도는, 배양 개시 시의 값보다 증가한다. 배양 초기에 있어서는, 액체 배지(C)의 유용 물질의 농도가 낮고, 글루코스 등의 영양소가 고갈되고 있지 않기 때문에, 여과 분리 장치(4)로부터 회수되는 액체 배지(C1)는, 배양조(2)에 공급하여 재이용 해도 된다. 이로써, 액체 배지의 소비를 억제할 수 있다.
세포 배양 시스템(51)에 있어서는, 배양조(2) 내의 액체 배지(C)는, 여과 분리 장치(4)에 직접 공급된다. 따라서, 여과 분리에 적절한 세포 밀도의 액체 배지(C)를 공급하기 위해, 배양조(2)에서의 액체 배지(C)의 세포 밀도는, 여과 분리에 적절한 세포 밀도가 적정량으로 되고, 이것을 소정량으로 하여 배양조(2)의 액체 배지가 감시된다. 따라서, 배양조(2)로부터 블리드로서 배출되는 액체 배지를, 그대로 폐기하지 않고, 유체력 분리 및 데프스 필터(52)를 통해 회수하는 구성은, 액체 배지가 불필요하게 폐기되는 것을 억제하는 데 있어서 유용하다. 데프스 필터는, 표면만아니라 내부에서도 필터 대상을 포착하는 필터이지만, 구조적으로는, 구멍 직경이 상이한 복수 종류의 필터 또는 분리막의 조합이라고 볼 수가 있다.
도 3의 세포 배양 시스템(51)에 있어서는, 여과 분리 장치(4)의 도출구(42)로부터 액체 배지(C1)가 연속하여 회수되고, 블리드 배출의 처리로서, 데프스 필터(52)로부터 액체 배지(C2)가 단속적(斷續的)으로 회수된다. 액체 배지(C1)의 회수량 및 블리드 배출량에 대응하여, 배지 보충부(10)의 배지 탱크(16)로부터 새로운 액체 배지(C0)가 배지 보급로(17)를 통해 보충되고, 배양조(2)의 액체 배지 양이 유지된다. 잉여의 세포는, 유체력 분리에 의한 부세포 분획 및 데프스 필터(52)의 여과물로서 얻어진다. 배양조(2)의 세포 증식이 번성한 상태로 배출되는 블리드는, 유용 물질을 풍부하게 포함하므로, 데프스 필터(52)에 의한 액체 배지(C2)의 회수는, 유용 물질의 회수율을 높이는 상에서 유용하다. 이 점에 관하여, 도 1의 세포 배양 시스템(1)에서는, 배양조(2)에서의 액체 배지의 세포 밀도가 높게 설정할 수 있으므로, 세포 배양 시스템(1)에 있어서 블리드로부터 액체 배지를 회수하면, 유용 물질의 회수 효율의 향상에 유리하다. 따라서, 유체력 분리와 여과를 이용하여 블리드로부터 액체 배지를 회수하는 도 3의 구성을, 도 1의 세포 배양 시스템(1)에 내장하면, 액체 배지의 폐기량 삭감 및 유용 물질의 회수 효율의 향상의 점에 있어서 매우 유효하다.
도 4에, 세포 배양 시스템의 제4 실시형태를 나타낸다. 이 실시형태에 있어서도, 블리드의 배출에 있어서 유체력 분리를 이용한다. 단, 도 4의 세포 배양 시스템(60)에 있어서는, 유체력 분리에 의해 얻어지는 빈세포 분획을 배양조(2)로 반송하는 배지 리턴로가 설치된다. 즉, 빈세포 분획의 여과 분리는 행하지 않고, 빈세포 분획을 사용하여 배양조의 액체 배지의 세포 밀도를 저하시킨다.
상세하게는, 도 4의 세포 배양 시스템(60)은, 배양조(2), 유체력 분리 장치(3), 여과 분리 장치(4), 및 배지 보충부(10)를 구비한다. 배양조(2)는, 배양되는 세포를 포함하는 액체 배지를 수용하고, 유체력 분리 장치(3)는, 전술한 바와 마찬가지로, 직사각형 단면을 가지는 만곡 유로를 흐르는 것에 의해 생기는 와류를 이용하여, 액체 배지의 분리 처리를 행한다. 즉, 배양조(2)로부터 블리드로서 공급되는 액체 배지를, 상대적으로 세포 밀도가 높은 부세포 분획과, 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포 분획으로 분리한다. 유체력 분리 장치(3)에 대한 액체 배지의 공급은, 도 1∼도 3의 세포 배양 시스템과 마찬가지로, 압력 조정 밸브(13) 및 유량 조정 밸브(15)에 의해 제어되고, 압력계(12) 및 유량계(14)를 사용하여 적정한 유량(정격 유량)으로 조정할 수 있다.
여과 분리 장치(4)는, 세포 배양 시스템(51)과 마찬가지로, 공급로(56) 및 리턴로(57)에 의해 배양조(2)와 직접 접속되고, 배양조(2)로부터 연속하여 공급되는 액체 배지로부터 세포를 제거하여, 필터를 투과하는 액체 배지(C1)를 회수한다. 필터에 의해 제거된 세포를 포함하는 잔부의 액체 배지는, 배양조(2)로 리턴된다. 따라서, 도 3의 경우와 마찬가지로, 배양조(2)에서의 액체 배지의 세포 밀도는, 여과 분리에 적절한 범위로 조정된다.
유체력 분리 장치(3)는, 블리드를 배출하는 배출로(21b)에 설치되고, 배양조(2)에서의 세포의 증식 상황에 따라서, 블리드로서 배출되는 액체 배지가, 펌프(11)의 작동에 의해 유체력 분리 장치(3)에 공급된다. 유체력 분리 장치로의 액체 배지의 공급은, 도 1∼도 3의 세포 배양 시스템과 마찬가지로, 압력 조정 밸브(13) 및 유량 조정 밸브(15)에 의해 제어되고, 압력계(12) 및 유량계(14)를 사용하여 적정한 유량(정격 유량) 및 압력으로 조정할 수 있다. 유체력 분리 장치(3)에 있어서 분리되는 액체 배지의 부세포 분획은, 도출구(32)에 접속되는 배출로(55)로부터 폐기된다. 다른 한편, 유체력 분리 장치의 도출구(33)는, 리턴로(61)에 의해 배양조(2)와 접속되고, 빈세포 분획은, 리턴로(61)를 통해 배양조(2)에 공급된다. 이로써, 배양조(2)의 액체 배지의 세포 밀도는 저하된다. 이 구성에 있어서, 블리드 배출에 따른 액체 배지의 감량은, 배출로(55)로부터 폐기되는 부세포 분획의 양에 상당한다. 따라서, 배양조(2)의 액체 배지의 양을 유지하기 위해 필요한 새로운 액체 배지(C0)의 보충량은, 도 3의 세포 배양 시스템(51)에 비해 감소하고, 그 감소분은, 빈세포 분획의 양에 상당한다. 따라서, 세포 배양에 소비되는 액체 배지의 양이 함부로 증가하는 것을 억제할 수 있는 구성이다. 또한, 새로운 액체 배지 대신에 빈세포 분획을 배양조(2)에 공급함으로써, 배양조(2)에서의 유용 물질의 농도 저하를 억제하면서, 액체 배지의 세포 밀도를 소정량으로 유지할 수 있다. 따라서, 여과 분리 장치(4)로부터 회수되는 액체 배지는, 유용 물질을 분리 정제하는 효율 등의 점에서 유리하게 된다.
전술한 실시형태의 구성은, 복수의 유체력 분리 장치를 사용하도록 변경해도 된다. 복수의 유체력 분리 장치를 직렬로 배치하면, 다단층으로 액체 배지를 분리할 수 있다. 예를 들면, 2개의 유체력 분리 장치를 직렬로 배치하여, 1단째의 유체력 분리 장치로부터 배출되는 부세포 분획을 2단째의 유체력 분리 장치에 공급하면, 더욱 고밀도로 세포가 농축된 부세포 분획을 얻을 수 있다. 이것은, 블리드의 배출에 적용하면 유용성이 높고, 보다 고밀도로 농축된 세포를 폐기할 수 있다. 또한, 2단째의 유체력 분리 장치에 빈세포 분획을 공급하면, 더욱 세포 밀도가 저하된 빈세포 분획을 얻을 수 있으므로, 여과 분리의 효율을 높일 수 있다. 2 단계의 유체력 분리에 의해, 액체 배지는 3개의 분획으로 분리되므로, 각각의 단(段; stage)에서의 분할 비율을 적절히 조절함으로써, 각각의 분획의 목적을, 폐기, 재이용 또는 액체 배지의 회수에 특화한 분리를 실시할 수 있다. 또한, 복수의 유체력 분리 장치를 병렬로 배치하면, 액체 배지의 처리 유량을 증가시킬 수 있으므로, 정격 유량을 초과한 유량에서의 처리가 가능하다.
세포는, 활성이 높은 상태에 있어서는 크게 생육하지만, 활성이 저하되면, 비교적 작은 상태로 사멸해 분해된다. 상대적으로 작은 세포의 상당수는, 사세포 또는 사세포편(데브리)이며, DNA 합성 도중의 활성인 세포가 포함되는 비율은 적다. 유체력 분리는, 액체 배지를 유통시키는 조건에 따라 상대적으로 큰 입자와 작은 입자를 분별할 수 있다. 따라서, 단일의 처리에 의해, 활성이 높은 세포와, 사세포 또는 사세포편으로로 분리 가능하지만, 전술한 다단층에 구성한 유체력 분리를 이용하면, 분리가 용이하게 된다. 따라서, 사세포 및 사세포편이나, 대사물의 응축물이 농축된 분획을 분취하여 블리드로서 폐기할 수도 있다. 공급하는 액체 배지의 유속(유량), 및 만곡 유로에서의 단면의 크기의 설정에 의해, 분리 상태를 조정할 수 있다.
세포 배양 시스템의 시스템 설계에 있어서는, 유체력 분리 장치에 있어서의 적정한 처리 유량(정격 유량)이 기본이 되므로, 배양조(2)의 용량과 유체력 분리 장치의 처리 유량과의 밸런스가 적절하게 되도록 세포 배양 시스템을 구성하면 된다. 배양조(2)의 액체 배지의 용량이 비교적 적고, 유체력 분리 장치에 있어서의 처리를 연속하여 행하면 적정한 배지 교환율을 초과하도록 한 경우에는, 간헐 처리가 행해진다. 즉, 배양조에서의 배지 교환율이 적정한 값으로 되도록 유체력 분리 장치에 있어서의 처리량을 설정하고, 정격 유량에 기초하여 처리 시간을 계산하여, 분리 처리를 복수회로 나누어 일정 시간 걸러서 단속적으로 실시하면 된다.
전술한 바와 같은 세포 배양 시스템을 사용하여, 다양한 세포에 대하여 세포 배양 방법을 행할 수 있고, 배양 세포가 생산하는 단백질이나 효소 등의 각종 유용 물질을 회수하여 의약품 등의 제조에 이용할 수 있다. 구체적으로는, 동물 세포(포유류, 조류 또는 곤충의 세포)와 같은 진핵(眞核) 세포, 및 진균류 세포(대장균등의 균류 또는 효모의 세포)의 배양에 적용할 수 있다. 예를 들면, 차이니즈 햄스터의 난소 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, PER. C.6 세포, 골수종 세포, HER 세포 등을 들 수 있다. 이와 같은 세포 배양에 의해 얻어지는 유용 물질로서, 예를 들면, 면역 글로블린(단일 클론 항체 또는 항체 플래그먼트), 융합 단백질, 인슐린류, 성장 호르몬류, 사이트 카인류, 인터페론류, 글루카곤(glucagon), 알부민, 리소좀 효소, 인간 혈청알부민, HPV 백신, 혈액 응고 인자, 에리스로포이에틴(erythropoietin)류, NS0나 SP2/0등의 항체 등을 들 수 있다. 세포 배양은, 각 세포에 대하여 판명되어 있는 배양 조건에 기초하여, 상법(常法)에 따라 배양을 행하면 된다. 세포 배양에 사용하는 액체 배지에 대해서도, 합성 배지, 반합성 배지, 천연 배지 중 어느 쪽의 액체 배지라도 되고, 배양하는 세포에 적절한 것을 적절히 선택하여 사용하면 된다. 대체로, 특정한 균종을 증식시키도록 처방된 선택 증균 배지나 선택 분리 배지가 바람직하게 사용된다. 시판 중인 액체 배지로부터 적절히 선택하여 사용해도, 또는 기지(旣知)의 처방에 따라 영양소 및 정제수(精製水) 등을 사용하여 조제해도 된다. 검사를 목적으로 하는 감별제(pH 지시약, 효소 기질, 당류 등)나, 목적외 미생물의 발육을 억제하는 선택제 등을 필요에 따라 첨가하여 이루어진다. 유체력 분리를 효율적으로 진행시키기 위해, 점성(粘性)이 너무 높지 않은 액체 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
배양 세포가 발생하여 액체 배지에 포함되는 유용 물질은, 유체력 분리 및 여과 분리에 의해 회수되는 내주측 분획의 액체 배지를 정제함으로써 회수할 수 있다. 생산하는 유용 물질이 배양 세포 내에도 있는 경우에는, 블리드를 폐기하지 않고, 세포로부터 유용 물질을 회수하면 된다. 도 2∼도 4의 세포 배양 시스템은, 유체력 분리 장치로부터 배출되는 부세포 분획의 농축된 세포로부터 유용 물질을 회수 할 수 있어, 세포로부터의 회수에 있어서 효율적인 구성이다.
도 5는, 유체력 분리 장치에 있어서의 분리 효율과 De수와의 관계를 조사한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 5에 있어서는, 유로의 치수가 상이한 5종류의 유체력 분리 장치[장치(A1)∼(A5)] 중 어느 하나를 사용하여 유체력 분리를 행하고 있다. 분리 대상으로서, 폴리머 입자(스티렌-디비닐 벤젠 공중합체) 또는 CHO 세포(차이니즈 햄스터의 난소 세포) 중 어느 하나를 사용하여 분리를 행한 결과를 나타내고 있다. 어느 쪽의 분리 대상도 평균 입자 직경이 14∼18㎛의 범위에 있다. 분리 효율은, [1-(x/X)]×100(%)로서 계산한 값이며, 계산식 중의 X는, 분리 전방의 액체에 포함되는 분리 대상의 농도, x는, 분리 후의 내주측의 분획에 포함되는 분리 대상의 농도를 나타낸다. 어느 쪽의 분리 대상도 입경(粒徑) 분포가 좁으므로, 입자 또는 세포의 전량이 외주측의 분획으로 농축되는 상태의 분리 효율을 100%로 본 평가이다. 그래프로부터 이해할 수 있는 바와 같이, 폴리머 입자 및 동물 세포의 어느 쪽에서도, De수가 70 전후에 있어서 가장 분리 효율이 높아지고, 대체로, De수가 50∼80의 범위가 되는 조건에 있어서 높은 효율을 달성할 수 있다. 따라서, 유체력 분리 장치로부터 얻어지는 내주측의 빈세포 분획은, 여과 분리에 바람직한 것을 이해할 수 있다.
도 6은, 유체력 분리 장치에 액체 배지를 보내는 펌프의 종류에 의한 세포의 생존률에 대한 영향을 조사한 결과를 나타낸다. 세포를 배양한 액체 배지를, 펌프를 사용하여 0.3 MPa의 토출압으로 유체력 분리 장치에 공급하고, 분리 장치로부터 배출되는 액체 배지의 2개의 분획을 모아 회수한다. 회수한 액체 배지로부터 소량을 샘플링하여 세포 계측 장치(베크맨 콜터사 제조, 제품명: Vi-Cell)에 의해 세포의 생존률(%, 전세포 중의 생세포의 비율)을 계측한 결과가 도 6의 그래프이다. 그래프 중의 「가스 압송」은, 압축기가 접속된 가압 탱크로부터 액체 배지를 압축 공기로 압송하는 형태이며, 용적식 펌프로서 분류할 수 있다. 도 6으로부터, 원심 펌프에 있어서는 세포에서의 손상이 커서, 용적식 펌프로 분류되는 다른 펌프에서는, 생존률의 저하가 방지되는 것을 알 수 있다.
유체력 분리는, 원심 분리보다 극히 효율적으로 세포의 농축 분리를 진행시킬 수 있고, 여과 분리 등에 비교하여, 세포를 손상시키지 않고 높은 생존률로 농축 분리할 수 있다. 전술한 바와 같이, 유체력 분리 기술을 이용하여, 배양 중의 액체 배지를, 상대적으로 세포 밀도가 높은 부세포 분획과, 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포 분획으로 분리할 수 있다. 따라서, 빈세포 분획을 사용하여, 여과 분리에 의해 액체 배지를 효율적으로 회수하는 것이 가능하게 된다. 회수되는 액체 배지를 정제함으로써, 유용 성분을 회수할 수 있다. 또한, 블리드의 처리에 있어서 도, 빈세포 분획을 이용함으로써, 데프스 필터의 적용이 가능해져, 유용 물질의 농도가 높은 액체 배지를 회수할 수 있다. 따라서, 유용 물질의 생산 효율을 개선할 수 있다. 또한, 세포가 농축된 부세포 분획을 폐기함으로써, 불필요하게 폐기되는 액체 배지를 삭감할 수 있다. 본 발명의 세포 배양 시스템에 있어서는, 유체력 분리에 있어서, 액체 배지를 비교적 높은 속도로 만곡 유로에 공급하므로, 세포의 농축 분리를 행하는 처리 능력이 높아, 실용 규모의 세포 배양에 충분히 적용할 수 있다. 유체력 분리는, 높은 생존률로 세포를 회수할 수 있으므로, 회수한 세포와 함께 새로운 액체 배지를 배양조에 공급함으로써, 증식력을 높게 유지한 채 세포 배양을 계속할 수 있다.
[산업 상의 이용 가능성]
세포를 배양한 액체 배지로부터 세포를 제거하는 여과 분리에서의 눈막힘을 해소하여, 효율적인 액체 배지의 회수 및 유용 물질의 생산을 실현할 수 있다. 바이오 기술을 이용한 의약품의 제조에 이용하여, 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 백신 등의 제품의 제공에 있어서, 경제성, 품질의 향상에 기여하고, 현 실정에 있어서 희소 또는 고가의 의약품의 보급, 범용화를 진행시키는 것이 가능하게 된다.
1, 50, 51,60: 세포 배양 시스템
2: 배양조
3: 유체력 분리 장치
4: 여과 분리 장치
5: 송액부
6, 8, 53, 56: 공급로
7: 제1 리턴로
9: 제2 리턴로
10: 배지 보충부
11, 58: 펌프
12: 압력계
13: 압력 조정 밸브
14: 유량계
15, 19: 유량 조정 밸브
16: 배지 탱크
17: 배지 보급로
18: 액면계
20: 롤러 펌프
21, 21a, 55: 배출로
22, 22a: 개폐 밸브
31, 41: 도입구
32, 33, 42, 43: 도출구
52: 데프스 필터
54: 용기
57, 61: 리턴로
C, C0, C1, C2: 액체 배지
C＇: 빈세포 분획

Claims (12)

  1. 배양되는 세포를 포함하는 액체 배지(liquid medium)를 수용하는 배양조;
    직사각형 단면(斷面)을 가지는 만곡 유로(curved flow channel)를 구비하고, 상기 만곡 유로를 흐르는 것에 의해 생기는 와류를 이용하여, 상기 배양조로부터 공급되는 액체 배지를, 상대적으로 세포 밀도가 높은 부세포(富細胞; cell-rich) 분획(畵分; fraction)과, 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포(貧細胞; cell-poor) 분획으로 분리하는 유체력(流體力) 분리 장치; 및
    상기 유체력 분리 장치에 의해 분리되는 빈세포 분획으로부터 세포를 제거하여 액체 배지를 회수하는 필터를 구비하는 여과 분리 장치;
    를 포함하는, 세포 배양 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유체력 분리 장치와 상기 배양조를 접속하고, 상기 부세포 분획을 상기 배양조에 공급하는 제1 리턴로(return path); 및
    상기 여과 분리 장치와 상기 배양조를 접속하고, 상기 빈세포 분획으로부터 제거되는 세포를 상기 배양조에 공급하는 제2 리턴로;를 더 포함하는, 세포 배양 시스템.
  3. 제2항에 있어서,
    세포를 포함하는 액체 배지의 일부를 블리드(bleed)로서 외부로 배출하는 배출로를 더 포함하는, 세포 배양 시스템.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 배출로는, 상기 제1 리턴로로부터 분기되어 설치되고, 상기 부세포 분획의 일부 또는 전부(全部)를 폐기하는, 세포 배양 시스템.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 여과 분리 장치의 필터는 데프스 필터(depth filter)이며,
    상기 부세포 분획을 블리드로서 외부로 폐기하는 배출로를 더 포함하는, 세포 배양 시스템.
  6. 제5항에 있어서,
    새로운 액체 배지를 상기 배양조에 공급하는 배지 보급로; 및
    상기 배양조로부터 공급되는 액체 배지로부터 세포를 제거하여 액체 배지를 회수하는 필터를 구비하는 추가의 여과 분리 장치;를 더 포함하는, 세포 배양 시스템.
  7. 배양되는 세포를 포함하는 액체 배지를 수용하는 배양조;
    직사각형 단면을 가지는 만곡 유로를 구비하고, 상기 만곡 유로를 흐르는 것에 의해 생기는 와류를 이용하여, 상기 배양조로부터 공급되는 액체 배지를, 상대적으로 세포 밀도가 높은 부세포 분획과, 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포 분획으로 분리하는 유체력 분리 장치와, 상기 유체력 분리 장치와 상기 배양조를 접속하고, 상기 빈세포 분획을 상기 배양조에 공급함으로써, 상기 배양조의 액체 배지의 세포 밀도를 저하시키는 배지 리턴로; 및
    상기 배양조로부터 공급되는 액체 배지로부터 세포를 제거하여 액체 배지를 회수하는 필터를 구비하는 여과 분리 장치;
    를 포함하는, 세포 배양 시스템.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 여과 분리 장치와 상기 배양조를 접속하고, 상기 여과 분리 장치에 의해 제거된 세포를 포함하는 잔부(殘部)의 액체 배지를 상기 배양조에 공급하는 리턴로를 더 포함하는, 세포 배양 시스템.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유체력 분리 장치는, 상기 액체 배지를 입수하는 단일의 도입구(導入口)와, 분리한 액체 배지를 배출하는 2개 이상의 도출구(導出口)를 구비하고, 상기 도출구의 하나로부터 상기 부세포 분획이 배출되고, 또한 하나의 도출구로부터 상기 빈세포 분획이 배출되는, 세포 배양 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유체력 분리 장치에 액체 배지를 공급하기 위한 유동압(流動壓)을 액체 배지에 가압하는 가압(付勢) 장치; 및
    상기 유체력 분리 장치에 도입되는 액체 배지와, 상기 유체력 분리 장치로부터 도출되는 액체 배지와의 압력차가 소정값 이하로 되도록 압력 환경을 제어하는 압력 제어 기구;를 더 포함하는, 세포 배양 시스템.
  11. 액체 배지로 세포를 배양하는 세포 배양 단계;
    직사각형 단면을 가지는 만곡 유로를 흐르는 것에 의해 생기는 와류를 이용하여, 상기 세포 배양으로부터 공급되는 액체 배지를, 상대적으로 세포 밀도가 높은 부세포 분획과, 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포 분획으로 분리하는 유체력 분리 단계; 및
    상기 유체력 분리에 의해 분리되는 빈세포 분획으로부터, 필터를 사용하여 세포를 제거하여 액체 배지를 회수하는 여과 분리 단계;
    를 포함하는, 세포 배양 방법.
  12. 액체 배지로 세포를 배양하는 세포 배양 단계; 및
    직사각형 단면을 가지는 만곡 유로를 흐르는 것에 의해 생기는 와류를 이용하여, 상기 세포 배양으로부터 공급되는 액체 배지를, 상대적으로 세포 밀도가 높은 부세포 분획과, 상대적으로 세포 밀도가 낮은 빈세포 분획으로 분리하는 유체력 분리 단계;
    상기 빈세포 분획을 상기 세포 배양에 공급함으로써, 상기 세포 배양의 액체 배지의 세포 밀도를 저하시키는 배지 리턴 단계; 및
    상기 세포 배양으로부터 공급되는 액체 배지로부터, 필터를 사용하여 세포를 제거하여 액체 배지를 회수하는 여과 분리 장치;
    를 포함하는, 세포 배양 방법.
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