KR20210015816A - 용액-상 펩티드의 합성 방법 및 그에 따른 보호 전략 - Google Patents
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Abstract
개시된 발명은 일반적으로 펩티드 합성 분야에 관한 것이다. 펩티드를 합성 적으로 제조하기 위한 효율적이고, 확장가능한 화학을 용이하게 하기 위해 신규한 그룹-지원 정제 보호기를 활용하는 신규한 용액-상 펩티드 합성 방법이 개시된다. 개시된 발명은 폐기물을 대폭 감소시키고, 확장성을 증가시키며, 높은 미정제 순도를 제공하여 합성-후 정제를 대체로 피함으로써 본 기술분야의 실패를 해결한다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 다음을 상호-참조한다: i) 2016년 12월 21일에 제출된 WO 출원번호 PCT/US2016/068112 및 WO 공개번호 WO2017112809A1, "용액 상 GAP 펩티드 합성을 위한 시스템 및 방법"; ii) 2019년 4월 29일에 제출되고, 2019년 11월 14일에 WO2019217116으로 공개된, WO 출원번호 PCT/US19/29569, "용액-상 펩티드 합성 방법"; 및 iii) 2018년 5월 31일에 제출된 미국 가출원번호 62/678,564, "GAP 펩티드 합성을 위한 보호 전략"; 이들 출원 및 공개본은 본 명세서에 예로서 참조로서 통합된다.
연방 지원 연구 또는 개발에 대한 진술
없음.
서열 목록, 표, 또는 컴퓨터 목록 컴팩트 디스크 부록에 대한 참조
없음.
최근의 연구 노력은 컬럼 크로마토그래피 및 재결정화를 피하는 데 특히 초점을 맞추면서, 정제 화학 분야에서 상당한 발전을 이루었다. 이런 연구는 출발 물질 또는 새로 생성된 생성물에 잘-작용화된 기를 의도적으로 도입함으로써 크로마토그래피 및/또는 재결정화와 같은 전통적인 정제 방법을 피하는 유기 합성을 위한 화학으로서 그룹-지원 정제(Group-Assisted Purification, GAP) 화학/기술로 정의되었다. 이들 GAP 기는 표적 분자의 합성 동안 원하지 않는 부반응을 방지하기 위한 보호기로도 종종 사용될 수 있다. 이러한 연구는 합성 유기 화학의 전체 분야를 망라하는 가능성을 가지고 있다.
보호기는 다수의 작용기가 존재하는 거의 모든 복합 합성에서 발견된다. GAP 화학과 관련하여, 이상적인 예는 GAP에 필요한 용해도 특징이 도입된 반-영구적 보호기일 것이다. 그러나 대부분의 전통적인 보호기는 비극성이므로, 대부분의 기질에 요구되는 GAP 용해도를 생성하지는 않는다. 적절한 용해도 제어가 생성된 보호기를 개발할 수 있다면, GAP 화학은 잠재적으로 해당 보호기의 사용을 필요로 하는 모든 합성으로 확장될 수 있다. 몇 가지 접근법이 활용되었다. 공개 특허출원 WO 2014093723 A2는, GAP이 구비된 키랄 보조제로 이민을 보호한 후, 비대칭 붕소 첨가 반응에서 이들 키랄, N-포스포닐 이민을 친전자체로서 사용하는 것을 교시한다. 정제는 GAP 공정을 통해 수행되었다. 이 연구는 잠재적으로 신규한 펩티드 표적으로 통합될 수 있는, 신규한 아미노산 유도체를 합성하는 데 잠재적으로 사용될 수 있는, 키랄, α-보론산 아민에 대한 용이한 접근을 제공하는 점에서 가치가 있다.
효과적인 보호기는 매우 다양한 조건에서 견고해야 하고 높은 수율로 첨가 및 제거되어야 한다. 보호기는 고체 또는 용액 상 접근법에 있어서, 펩티드 합성에서 광범위하게 사용된다. 전통적인 펩티드 합성 보호 전략의 경우, 가장 일반적으로 사용되는 전략 중 하나는 Fmoc/tBu이다. 미국 특허번호 8,383,770 B2는 고체-상 펩티드 합성(Solid-Phase Peptide Synthesis, SPPS)에서 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 및 tert-부틸옥시카르보닐(Boc) N-말단 보호기의 사용을 교시한다. 이 기술은 산업에서 잘 알려져 있으며 널리 적용되고 있다. Fmoc 기는 성장하는 펩티드에 첨가될 아미노산의 N-말단을 보호하고, tert-부틸(tBu) 기반 기는 동일한 아미노산의 측쇄를 보호한다. Fmoc 기는 적절한 탈보호 염기로 제거될 수 있는 한편, tBu 기는 합성이 종료될 때의 산-기반 글로벌(global) 탈보호까지 남아있다. Boc 및 Fmoc 기는 펩티드 화학의 모든 영역에서 수십년 동안 사용되었으며, 상기 바람직한 Fmoc 기는 거의 전적으로 SPPS로 제한된다.
1960년대에 메리필드(Merrifield)에 의해 개발된 SPPS는 연구 및 제조를 위해 여러 과학 분야에서 사용되는 표준 프로토콜이 되었다(도 1a 참조). 중합체 지지체 또는 수지의 장점은 각각의 커플링/탈보호 단계 후 성장하는 펩티드를 쉽게 정제할 수 있는 능력에 있으며, 이는 컬럼 크로마토그래피의 사용을 면한다. SPPS의 주요 단점은 스케일-업이 어렵다는 점에 있다: 많은 중합체 지지체가 비싸고 함께 작업되는 재료의 질량의 대부분을 차지한다. SPPS의 커플링 반응은 반응이 고체-액체 계면에서 발생하기 때문에 비효율적이기도 하다. 또한, 각각의 탈보호 및 커플링 반응 후, 이전 반응에서 생성된 임의의 불순물을 제거하기 위해 수지를 용매로 세척해야 하는데, 이는 상당한 용매 폐기물을 생성하며 이는 대규모에서 극심한 문제가 될 수 있다.
그러나, 용액-상 펩티드 합성(SolPPS)을 위한 경제적으로 실현가능한 Fmoc 보호 체계의 예는 드물고, 문헌에서 예가 거의 없다. 미국 특허번호 5,516,891 A는 Fmoc-기반 SolPPS의 몇몇 예 중 하나를 제공한다. 다시 말해, Fmoc 펩티드 합성은 탈보호 동안 부산물로서 N-플루오레닐메틸피페리딘(NFMP)의 형성으로 인해, 거의 전적으로 SPPS로 제한되며, NFMP는 중합체 지지체 없이 제거가 어렵다. Fmoc 탈보호를 위한 표준 프로토콜은 디메틸포름아마이드(DMF) 또는 디클로로메탄(DCM)의 용액에서 Fmoc-펩티드를 과량의 피페리딘과 함께 교반하는 것이고, 상기 공정에서 Fmoc 기가 탈보호되고 NFMP가 형성된다. 상기 '891 특허는 피페리딘 대신 4-아미노메틸피페리딘(4AMP)으로 탈보호함으로써 이 불순물을 제거하는 것을 교시한다. 이는 NFMP 대신 NFMP-CH2NH2를 형성하고, 이는 여분의 아미노기의 존재로 인해, 물로 추출될 수 있다. 이 방법의 문제점은 4AMP 사용에 따른 높은 비용에 있다. 이는 이 방법이 비경제적인 이유이며, 산업에 받아들여지지 않은 이유이다.
Fmoc-기반 SolPPS의 또 다른 예는 공개 특허 출원 WO2017112809A1에서 볼 수 있다. 이 공개물은 C-말단 GAP 보호기, 벤질 디페닐포스핀 옥사이드(HOBnDpp)를 사용하여, 표적 펩티드의 용해도를 제어함으로써 각각의 연속적인 커플링 반응 후 선택적으로 침전되도록 하는 것을 교시한다(도 1b 참조). 성장하는 펩티드가 에틸 아세테이트 또는 DCM과 같은 유기 용매에 남아있도록 용해도가 제어되고, 수성 세척이 수행하여 불순물을 제거한다; 유기 용매의 후속 농축 이후에 알칸 용매 중 혼합물은 펩티드 생성물을 선택적으로 침전시킨다. 이 기술은 '891 특허보다 훨씬 더 경제적으로 실현가능한 방식으로 Fmoc/tBu 화학을 용액-상에 적용하였지만, 이 방법에는 내재된 잠재적 한계가 있다. 첫 번째, GAP 기는 산에 불안정하지 않으므로, 일반적으로 사용되는 트리플루오로아세트산-기반(TFA-기반) 또는 기타 산성 칵테일을 이용한 편리한 원스텝 글로벌 탈보호를 방해한다; 펩티드의 C-말단에서 HOBnDpp를 제거하기 위해 수소화 또는 가수분해가 필요하다. 추가로, 펩티드가 계속해서 성장하고 서열이 변함에 따라, 사슬이 더 길어지거나, 또는 서열이 펩티드에 상이한 용해도 특징을 부여하므로, HOBnDpp는 사슬에 대해 점점 더 적은 용해도 제어를 유지한다. 또한 HOBnDpp는 합성 중에 가수분해되거나 우발적으로 절단되기 쉽다. 예를 들어, 펩티드 서열에서 제2 아미노산의 Fmoc 탈보호 동안, 디케토피페라진(DKP)의 형성은 C-말단에서 HOBnDpp의 손실을 용이하게 한다. 이 절단된 HOBnDpp는 반응 용액에 남아 있으며, 커플링 반응 중에 활성화된 아미노산과 반응하여 제거하기 어렵거나 또는 제거가 불가능한 불순물을 생성할 수 있다. 또한, 보호된 펩티드가 합성된 후 C-말단의 탈보호를 위한 현재의 절단 기술(가수분해 또는 수소화)에서, 최종 펩티드 생성물의 C-말단은 카르복실산이다. 반대로 많은 치료적 펩티드는 이 카르복실산 대신에, 아마이드, 시클릭 펩티드, 티오에스테르 등과 같은 것으로 변형된 C-말단을 필요로 하므로, GAP 펩티드 합성 방법의 적용을 더욱 제한한다. 또한, C-말단에서 HOBnDpp를 제거하기 위한 이들 절단 반응은 글로벌 탈보호와 완전히 별개의 반응이다; 반응에는 특정 조건과 작업이 요구되며, 즉 시간과 비용 모두가 소요되는 불편함이 있다.
SPPS의 스케일 업과 관련된 이러한 이슈와, 기존의 GAP 펩티드 합성 보호 전략의 한계로 인해, 산업에서는 스케일 업이 가능한 SolPPS 방법뿐만 아니라, (i) 다양한 절단 조건, (ii) (용해도 관점에서) 더 길거나 더 어려운 서열, 및 (iii) C-말단 변형을 수용할 수 있는 SolPPS 방법을 필요로 한다.
제1 구현예에서, 본 명세서에 개시된 발명은 용액-상 펩티드 합성용 보호기를 포함하고, 상기 보호기는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 및 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는다;
화학식 1은:
화학식 2는:
화학식 3은:
화학식 4는:
화학식 5는:
화학식 6은:
화학식 7은:
화학식 8은:
Z는 -H, 메틸기(-Me), 및 메톡시기(-OMe)로 이루어진 군으로부터 선택된다. Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택된다. X는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택된다. R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택된다. L은 4-(히드록시메틸)페녹시아세틸("HMPA"), 4-(히드록시메틸)페녹시부타노일("HMPB"), 4-(히드록시메틸)벤조일("HMB"), 4-(머캅토메틸)벤조일("MMB"), 4-(머캅토메틸)페녹시아세틸("MMPA"), 4-(아미노메틸)페녹시아세틸("AMPA"), 4-(3,3-디메틸-3-히드록시프로필)페녹시아세틸("DMPPA"), 2-(4-(아미노(2,4-디메톡시페닐)메틸)페녹시)아세틸("링크 아마이드"), 4-((9-아미노-9H-크산텐-3-일)옥시)부타노일("크산테닐"), 5-(5-아미노-10,11-디히드로-5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-3-일)펜타노일("TCA"), 및 3-(4-(클로로(2-클로로페닐)(페닐)메틸)페닐)프로파노일("2-클로로트리틸")로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제2 구현예에서, 개시된 발명은 용액-상 펩티드 합성의 수행 방법을 포함하고, 상기 방법은 여러 단계를 포함한다. 초기 단계는 제1 아미노산에 제1 보호기를 부착하여 제1 보호된 아미노산을 제공하는 단계를 포함한다. 후속 단계는 제1 보호된 아미노산 또는 제1 아미노산을 다른 분자에 연결하여 형성된 펩티드에 대해 커플링 반응을 수행하는 단계를 포함한다. 제1 보호기는 청구항 1의 보호기이다.
제3 구현예에서, 개시된 발명은 용액-상 펩티드 합성용 보호기의 형성 방법을 포함한다. 상기 방법은 벤질 디페닐포스핀 옥사이드(HOBnDpp), 아닐린 디페닐포스핀 옥사이드(NH2PhDpp), 또는 이의 유도체를 (i) 링커 분자에 직접적으로, (ii) 아미노산을 통해 링커 분자에, 또는 (iii) 아미노산 유도체를 통해 링커 분자에 커플링하는 단계를 포함한다.
본 개시의 전술한 및 다른 목적, 특징 및 이점은 첨부된 도면에 설명된 바와 같이 실시양태에 대한 이하의 설명으로부터 명백해질 것이며, 여기서 참조 문자는 다양한 도면에 걸쳐 동일한 부분을 지칭한다. 도면은 반드시 축척일 필요는 없으며, 대신 본 개시의 원리를 설명할 때 강조된다. 도면은 비제한적인 예로서 사용되며, 본 개시의 범위를 제한하지 않고 바람직한 실시양태를 묘사하기 위한 것일 뿐이다:
도 1a는 고체 상 펩티드 합성(SPPS)의 선행기술의 공정을 묘사한다.
도 1b는 GAP 펩티드 합성(GAP-PS) 공정의 단계, 특히 C-말단 보호를 위한 HOBnDpp의 사용을 묘사한다.
도 2는 아미노산 잔기, 특히 이 비제한적인 실시양태에서 세린의 측쇄에 도 1b의 보호기를 부착하고, 이어서 GAP-PS의 공정을 묘사한다.
도 3은 예로서, 신규한 GAP 분자를 합성하고 이를 펩티드에 부착하기 위한 도식을 묘사하며, 여기서 HOBnDpp는 보호된 링크 아마이드(Rink Amide)-OH와 반응하며 생성된 신규한 화학 개체인 링크 아마이드-GAP(RAG)은 아미노산의 C-말단에 부착된다.
도 4는 아미노산의 측쇄에 신규한 GAP 분자가 부착되는 것을 묘사한다. 이 비제한적인 예에서, 아스파르트 산의 측쇄를 보호하기 위해 GAP 분자 RAG가 사용되고, RAG-보호된 아스파라긴이 합성된다. 구체적으로, 커플링 반응이 수행되어 RAG 분자의 유리 아민과 아스파라긴의 카르보닐 탄소 사이에 아마이드 결합을 형성한다.
도 5는 신규한 GAP 분자 합성의 비제한적인 예를 묘사한다. 이 비제한적인 예에서, 보호된 HMPA-OH에 HOBnDpp가 직접 연결되어 HMPA-GAP(HG)을 형성할 뿐만 아니라, 중간체(일 실시양태에서 페닐알라닌)를 통해 GAP 분자, HMPA-페닐알라닌-GAP(HPG)을 형성한다.
구체적으로, 보호된 HMPA-OH의 카르복실산 모이어티에 HOBnDpp가 커플링될 수 있거나, 또는 처음에 HOBnDpp가 아미노산에 커플링된 후 HMPA에 커플링되어 GAP 분자 HPG를 생성할 수 있다.
도 6은 도 5의 HPG가 일반적인 아미노산의 C-말단, 뿐만 아니라, 본 개시의 바람직한 실시양태에서, 아스파르트산의 측쇄에 부착되는 것을 묘사한다. 구체적으로, 이 반응은 다수의 상이한 커플링제를 사용하여 달성될 수 있는 커플링 반응이고, 여기서 HPG의 유리 알코올이 활성화된 카르복실산의 카르보닐기에 커플링한다.
도 7은 신규한 GAP 분자, 아닐린 디페닐포스핀 옥사이드("NH2PhDpp") 합성의 비제한적인 예를 묘사한다.
도 8은 신규한 GAP 분자의 합성의 비제한적인 예를 묘사하고, 여기서 NH2PhDpp는 보호된 링크 아마이드-OH와 반응하여 표적 개체를 달성한다.
구체적으로, NH2PhDpp는 다수의 커플링제를 통해 보호된 링크 아마이드-OH의 카르복실산 모이어티에 커플링될 수 있다.
도 9는 신규한 GAP 분자의 합성의 비제한적인 예를 묘사하며, 여기서 NH2PhDpp는 직접 또는 중간체를 통해, 보호된 HMPA-OH와 반응하여 표적 분자를 형성한다. 이들 반응을 용이하게 하기 위해 다수의 상이한 커플링제가 사용될 수 있다.
도 10은 비제한적인 예로서, HPG GAP 분자가 Fmoc-보호된 류신의 C-말단에 부착되어 생성된 화합물을 보여준다.
도 11은 비제한적인 예로서, HPG에 의한 글루탐산의 측쇄 보호로부터 생성되는 화합물을 묘사하며, 여기서 글루탐산의 C-말단은 가능한 C-말단 보호 전략의 비제한적인 예로서 알릴기로 보호된다.
도 12는 비제한적인 예로서, 본 명세서에 개시된 신규한 SolPPS 방법으로부터 생성된, 테트라-펩티드, Fmoc-Glu(HPG)-Glu(HPG)-Tyr(tBu)-Leu-HPG를 보여준다.
도 13은 아미노산, 특히 이 비제한적인 예에서 아스파르트 산의 측쇄에 RAG가 부착되어 생성되는 화합물을 묘사하고, 여기서 아스파르트 산의 C-말단은 C-말단 보호 전략의 비제한적인 예로서 알릴기로 보호된다.
도 14는 비제한적인 예로서, 본 명세서에 개시된 SolPPS 방법으로부터 생성된 보호된 펩티드를 보여준다.
도 15는 비제한적인 예로서, 신규한 GAP 분자로 완전히 보호된 펩티드 비발리루딘을 묘사한다.
도 16은 Fmoc-탈보호 이후 모든 측쇄 및 C-말단 보호기를 제거하는 원스텝 글로벌 탈보호를 통해 획득된, 완전히 탈보호된 비발리루딘을 묘사한다.
도 17은 신규한 GAP 분자로 아민을 보호하기 위한 일반적인 방법론을 보여준다. 이 특정 비제한적인 실시양태에서, HPG가 사용된다.
도 18은 비제한적인 예로서, 본 명세서에 개시된 신규한 GAP 분자의 합성을 위한 시약으로서 작용할 수 있는 무수한 분자를 보여준다.
도 19는 본 명세서에 개시된 신규한 GAP 분자를 합성하기 위한 무수한 대표적인 커플링 반응을 보여준다.
도 1a는 고체 상 펩티드 합성(SPPS)의 선행기술의 공정을 묘사한다.
도 1b는 GAP 펩티드 합성(GAP-PS) 공정의 단계, 특히 C-말단 보호를 위한 HOBnDpp의 사용을 묘사한다.
도 2는 아미노산 잔기, 특히 이 비제한적인 실시양태에서 세린의 측쇄에 도 1b의 보호기를 부착하고, 이어서 GAP-PS의 공정을 묘사한다.
도 3은 예로서, 신규한 GAP 분자를 합성하고 이를 펩티드에 부착하기 위한 도식을 묘사하며, 여기서 HOBnDpp는 보호된 링크 아마이드(Rink Amide)-OH와 반응하며 생성된 신규한 화학 개체인 링크 아마이드-GAP(RAG)은 아미노산의 C-말단에 부착된다.
도 4는 아미노산의 측쇄에 신규한 GAP 분자가 부착되는 것을 묘사한다. 이 비제한적인 예에서, 아스파르트 산의 측쇄를 보호하기 위해 GAP 분자 RAG가 사용되고, RAG-보호된 아스파라긴이 합성된다. 구체적으로, 커플링 반응이 수행되어 RAG 분자의 유리 아민과 아스파라긴의 카르보닐 탄소 사이에 아마이드 결합을 형성한다.
도 5는 신규한 GAP 분자 합성의 비제한적인 예를 묘사한다. 이 비제한적인 예에서, 보호된 HMPA-OH에 HOBnDpp가 직접 연결되어 HMPA-GAP(HG)을 형성할 뿐만 아니라, 중간체(일 실시양태에서 페닐알라닌)를 통해 GAP 분자, HMPA-페닐알라닌-GAP(HPG)을 형성한다.
구체적으로, 보호된 HMPA-OH의 카르복실산 모이어티에 HOBnDpp가 커플링될 수 있거나, 또는 처음에 HOBnDpp가 아미노산에 커플링된 후 HMPA에 커플링되어 GAP 분자 HPG를 생성할 수 있다.
도 6은 도 5의 HPG가 일반적인 아미노산의 C-말단, 뿐만 아니라, 본 개시의 바람직한 실시양태에서, 아스파르트산의 측쇄에 부착되는 것을 묘사한다. 구체적으로, 이 반응은 다수의 상이한 커플링제를 사용하여 달성될 수 있는 커플링 반응이고, 여기서 HPG의 유리 알코올이 활성화된 카르복실산의 카르보닐기에 커플링한다.
도 7은 신규한 GAP 분자, 아닐린 디페닐포스핀 옥사이드("NH2PhDpp") 합성의 비제한적인 예를 묘사한다.
도 8은 신규한 GAP 분자의 합성의 비제한적인 예를 묘사하고, 여기서 NH2PhDpp는 보호된 링크 아마이드-OH와 반응하여 표적 개체를 달성한다.
구체적으로, NH2PhDpp는 다수의 커플링제를 통해 보호된 링크 아마이드-OH의 카르복실산 모이어티에 커플링될 수 있다.
도 9는 신규한 GAP 분자의 합성의 비제한적인 예를 묘사하며, 여기서 NH2PhDpp는 직접 또는 중간체를 통해, 보호된 HMPA-OH와 반응하여 표적 분자를 형성한다. 이들 반응을 용이하게 하기 위해 다수의 상이한 커플링제가 사용될 수 있다.
도 10은 비제한적인 예로서, HPG GAP 분자가 Fmoc-보호된 류신의 C-말단에 부착되어 생성된 화합물을 보여준다.
도 11은 비제한적인 예로서, HPG에 의한 글루탐산의 측쇄 보호로부터 생성되는 화합물을 묘사하며, 여기서 글루탐산의 C-말단은 가능한 C-말단 보호 전략의 비제한적인 예로서 알릴기로 보호된다.
도 12는 비제한적인 예로서, 본 명세서에 개시된 신규한 SolPPS 방법으로부터 생성된, 테트라-펩티드, Fmoc-Glu(HPG)-Glu(HPG)-Tyr(tBu)-Leu-HPG를 보여준다.
도 13은 아미노산, 특히 이 비제한적인 예에서 아스파르트 산의 측쇄에 RAG가 부착되어 생성되는 화합물을 묘사하고, 여기서 아스파르트 산의 C-말단은 C-말단 보호 전략의 비제한적인 예로서 알릴기로 보호된다.
도 14는 비제한적인 예로서, 본 명세서에 개시된 SolPPS 방법으로부터 생성된 보호된 펩티드를 보여준다.
도 15는 비제한적인 예로서, 신규한 GAP 분자로 완전히 보호된 펩티드 비발리루딘을 묘사한다.
도 16은 Fmoc-탈보호 이후 모든 측쇄 및 C-말단 보호기를 제거하는 원스텝 글로벌 탈보호를 통해 획득된, 완전히 탈보호된 비발리루딘을 묘사한다.
도 17은 신규한 GAP 분자로 아민을 보호하기 위한 일반적인 방법론을 보여준다. 이 특정 비제한적인 실시양태에서, HPG가 사용된다.
도 18은 비제한적인 예로서, 본 명세서에 개시된 신규한 GAP 분자의 합성을 위한 시약으로서 작용할 수 있는 무수한 분자를 보여준다.
도 19는 본 명세서에 개시된 신규한 GAP 분자를 합성하기 위한 무수한 대표적인 커플링 반응을 보여준다.
본 발명의 요약 및 발명의 상세한 설명, 및 하기 청구범위, 및 첨부된 도면에서, 본 발명의 특정 특징이 참조된다. 본 명세서에서 본 발명의 개시는 이러한 특정 특징의 모든 가능한 조합을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 특징이 본 발명의 특정 구현예 또는 실시양태, 또는 특정 청구범위의 맥락에서 개시되는 경우, 그 특징은 또한 가능한 범위 내에서, 발명의 다른 특정 구현예 및 실시양태와 함께 및/또는 그 맥락에서, 그리고 본 발명에서 일반적으로, 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 개시에 비추어 과도한 실험없이 제조 및 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시양태의 관점에서 설명되었지만, 본 발명의 개념, 사상, 및 범위를 벗어나지 않고, 본 명세서에 서술된 조성물 및/또는 방법 및 방법의 단계에 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 모든 이러한 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 사상, 범위, 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
용어 "포함한다" 및 이의 문법적 등가물은 본 명세서에서 다른 구성요소, 성분, 단계 등이 선택적으로 존재함을 의미하기 위해 사용된다. 예를 들어, 구성요소 A, B, 및 C를 "포함하는"(또는 "포함하고 있는") 물품은 구성요소 A, B, 및 C로 구성될 수 있거나(즉, A, B, 및 C만을 함유함), 또는 구성요소 A, B, 및 C뿐만 아니라 하나 이상의 다른 구성요소를 함유할 수 있다.
본 명세서에서 2 이상의 정의된 단계를 포함하는 방법을 참조하는 경우, (문맥이 그러한 가능성을 배제하는 경우를 제외하고) 상기 정의된 단계는 임의의 순서로 또는 동시에 수행될 수 있으며, (문맥이 그러한 가능성을 배제하는 경우를 제외하고) 상기 방법은 임의의 정의된 단계 전에, 정의된 두 단계 사이에, 또는 정의된 모든 단계 이후에 수행되는 하나 이상의 다른 단계를 포함할 수 있다.
뒤에 숫자가 있는 용어 "적어도"는 본 명세서에서 (정의되는 변수에 따라 상한을 갖거나 상한이 없는 범위일 수 있는) 그 숫자로 시작하는 범위의 시작을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, "적어도 1"은 1 또는 1 초과를 의미한다. 뒤에 숫자가 있는 용어 "최대"는 본 명세서에서 (정의되는 변수에 따라, 그 하한으로서 1 또는 0을 갖는 범위이거나, 또는 하한이 없는 범위일 수 있는) 해당 숫자로 끝나는 범위의 끝을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, "최대 4"는 4 또는 4 미만을 의미하고, "최대 40%"는 40% 또는 40% 미만을 의미한다. 본 명세서에서, "(초기 숫자) 내지 (후속 숫자)" 또는 "(초기 숫자)-(후속 숫자)"로 범위가 주어지면, 이는 하한이 초기 숫자이고 상한이 후속 숫자인 범위를 의미한다. 예를 들어, 25 내지 100㎜는 하한이 25㎜이고 상한이 100㎜인 범위를 의미한다.
용어 "제1"은 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해 사용되며 상기 요소가 임의의 주어진 서열의 요소에서 주된 또는 초기 요소라는 것을 의미하지는 않는다. 예를 들어, "제1 아미노산"은 상기 아미노산이 아미노산 서열에서 첫 번째이거나 또는 반응할 첫 번째 아미노산임을 의미하지 않는다. 대신에, "제1 아미노산"은 상기 아미노산이 "제2 아미노산"과 같은 다른 아미노산과 분리되고 구별될 수 있음을 나타낼 뿐이다.
용어 "커플링 반응"은 일반적으로 "커플링제"에 의해 촉진된 2개의 구성 분자 사이의 결합의 형성을 지칭하기 위해 사용된다. 펩티드 화학에서, 이들 커플링 반응은 사용된 커플링제에 따라 완전히 달라질 수 있는 다양한 반응 조건 하에서 다양한 상이한 메커니즘을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, 커플링제는 구성 분자의 카르복실산을 "활성화"하여 카르보닐 탄소가 친핵성 공격을 받기 더 쉽도록 할 수 있다. 커플링 반응은 두 구성 분자 사이에 결합이 형성되는 동안 물 분자의 손실을 초래할 수 있다(Chandrudu 2013, Mollica 2013, Shelton 2013, Amblard 2006, Bachem 2016 참조).
펩티드 합성을 위한 많은 유형의 보호 체계에서, 유사한 반응이 반복적으로 발생하여 펩티드 사슬을 성장시킨다. 일반적으로, 사슬에 첨가된 각각의 아미노산의 N- 또는 C-말단이 처음에 보호되고, 아미노산의 다른 말단은 커플링 반응에 자유롭게 참여한다. 처음에-유리 말단을 통해 사슬에 첨가된 후, 탈보호 반응이 실행되고, 보호된 N- 또는 C-말단이 유리화되어 후속 커플링 반응에 참여하여 그 다음의 아미노산과 펩티드 결합을 생성한다. 예를 들어, Fmoc/tBu-기반 펩티드 합성에서, Fmoc 기는 아미노산의 N-말단을 보호하고, 아미노산의 측쇄는 비제한적으로 부틸, 트리틸(트리페닐메틸), Boc(부틸옥시카르보닐), Pbf(2,2,4,6,7-펜타메틸-2,3-디히드로벤조푸란-5-술포닐), Pmc(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐), 및 Acm(아세트아미도메틸)을 포함하는 tBu-기반 보호기로 보호된다(일부 아미노산은 측쇄가 커플링 및 탈보호 조건에 본래 불활성이기 때문에 측쇄 보호를 필요로 하지 않는다). 펩티드 서열에서 1차(primary) 아미노산의 C-말단은 SPPS의 수지 또는 중합체, 및 SolPPS의 보호기에, 연결되고 보호된다. 아미노산의 N-말단에 있는 Fmoc 기가 염기-불안정이고, 적절한 탈보호 염기로 처리하면 임의의 C-말단 연결 또는 측쇄 보호를 방해하지 않고 N-말단에서 Fmoc 기가 제거되도록, Fmoc/tBu 펩티드 합성 체계가 설계된다. 탈보호 반응이 수행되면, 1차 아미노산의 N-말단은 자유롭게 되고, C-말단 및 측쇄는 보호되거나 그렇지 않으면 불활성이다. 이후, N-말단이 Fmoc-보호되고 측쇄가 보호되거나 본래 불활성인 그 다음의 아미노산은 유리 C-말단이 커플링제로 활성화되고, 이러한 활성화는 1차 아민의 유리 N-말단이 활성화된 카르보닐을 친핵성 공격하여 1차 아미노산과 그 다음의 아미노산 사이에 펩티드 결합을 형성하는 것을 용이하게 한다. 이 과정은 적절한 펩티드 서열이 달성될 때까지 반복된다. 최종 아미노산의 Fmoc 탈보호 후에, 펩티드의 C-말단과 측쇄는 여전히 보호되어 있다. 이후 TFA-기반 칵테일과 같은 강산성 칵테일로 글로벌 탈보호가 수행되어 모든 측쇄 보호기를 제거한다; 어떠한 경우에는, C-말단 수지 또는 보호기가 절단될 수도 있다.
본 개시는 다양한 글로벌 탈보호 전략, (용해도-면에서) 더 길거나 더 어려운 펩티드 서열의 합성, 및 표적 펩티드의 C-말단 변형을 가능하게 하면서 표적 펩티드의 용해도 제어 및 전반적인 합성 공정을 유지하는 용액-상 펩티드의 합성 방법을 제공함으로써 본 기술분야의 실패를 해결한다. 성장하는 펩티드의 C-말단 및 측쇄에 대한 신규한 보호 전략을 활용함으로써, 경제적으로 실현가능하고 펩티드의 상업적 생산에 유용한 SolPPS 전략이 제시된다.
따라서, 본 개시의 비제한적인 목적은 신규한 SolPPS 방법을 가능하게 하는 것이다. 일 구현예에서, 전통적으로 C-말단 GAP 보호기인 HOBnDpp는 펩티드 사슬의 C-말단을 대신하거나 이에 더하여, 비제한적으로 세린, 트레오닌, 티로신, 또는 시스테인을 포함하는 아미노산 잔기의 측쇄를 직접 보호하는 데 사용된다. 바람직한 펩티드의 다른 아미노산 잔기는, 비제한적으로 Fmoc/tBu, Boc/벤질, Cbz(벤질옥시카르보닐)/tBu, Cbz/벤질 등을 포함하는 다수의 상이한 보호 전략을 사용하여, 보호될 수 있다. 이 향상된 보호 전략은 펩티드 사슬의 용해도 제어를 유지하면서 더 길거나 및/또는 더 어려운 서열의 합성을 가능하게 한다. 또한 이 전략은 용해도, 탈보호, 또는 합성-후 C-말단 변형 목적을 위해서 상이한 C-말단 보호기를 사용하는 것을 가능하게 한다. 또 다른 구현예에서, 특정 아미노산의 C-말단 및/또는 측쇄를 보호하기 위해 하기 논의된 바와 같은 신규한 GAP 분자가 사용됨으로써 C에서 N 방향으로의 용액 내 펩티드 합성이 가능해진다.
또 다른 구현예에서, 신규한 SolPPS 방법은 특별히 설계된 C-말단 보호 전략을 통해 달성되며, 여기서 신규한 GAP 분자 보호기는 원래의 GAP 펩티드 합성(GAP-PS)의 이점을 유지하면서, 더 넓은 범위의 절단 조건, 더 긴 펩티드의 합성, 의도되지 않거나 우발적인 탈보호의 최소화, 및 절단시 C-말단의 변형을 가능하게 한다. 사용되는 GAP 분자에 따라서, C-말단 탈보호는 비제한적으로 트리플루오로아세트산(TFA), 플루오르화 수소산(HF), 톨루엔술폰산(TsOH), 메탄술폰산(MsOH) 또는 기타를 포함하는 산성 조건, 뿐만 아니라 비제한적으로 수성 또는 알코올 시스템에서의 금속 수산화물, 또는 상-전이 촉매를 이용한 2-상 시스템을 포함하는 염기성 가수분해 조건, 뿐만 아니라 비제한적으로 Pd0 또는 Pt0 또는 Ru와 같은 전이 금속 촉매에 따른 분자 수소, 이동 수소화(transfer hydrogenation), 또는 보로히드라이드, 알루미늄 히드라이드, 실란, 암모늄 포르메이트 등과 같은 다른 수소 공급원을 포함하는 환원성 조건 하에서 달성될 수 있다. 또한 특정 GAP 분자에 따라서, C-말단 GAP 분자의 절단 동안 C-말단 아마이드의 형성 또는 다른 합성-후 변형이 달성될 수 있고, 추가적인 합성-후 가공 단계를 피하면서 원하는 펩티드 생성물을 생성할 수 있다. 이러한 신규한 GAP 분자는 산성-촉매화된 탈보호 반응, 뿐만 아니라 수소화-기반 및 가수분해 반응에서도 안정적으로 남아있으므로, GAP 보호기의 펩티드-합성-후 회수율을 증가시킬 수 있다. 또한, 이러한 신규한 GAP 분자에 의해 합성-중간의 C-말단 보호의 손실이 최소화된다.
또 다른 구현예에서, 전술한 임의의 신규한 GAP 분자는 펩티드의 C-말단을 대신하거나 또는 이에 더하여, 비제한적으로 아스파르트산, 시스테인, 세린, 트레오닌, 리신, 글루탐산, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하는 다양한 아미노산의 측쇄를 보호하는 데 사용된다. 이 전략은 표적 펩티드의 용해도를 제어함과 동시에 반응성 측쇄의 보호를 가능하게 한다.
또 다른 구현예에서, 이들 신규한 GAP 분자 및 이의 유도체의 합성 방법이 제시된다. 비제한적인 예로서, HOBnDpp는 직접적으로 또는 중간체를 통해 링커 분자의 카르복실산 모이어티에 부착되고, 그 예를 도 18에서 볼 수 있으며, 생성된 신규한 GAP 보호기는 이후 펩티드의 C-말단에 부착된다. 다른 비제한적인 예로서, 아닐린 디페닐포스핀 옥사이드(즉, NH2PhDpp)가 유사한 방식으로 상이한 링커에 커플링됨으로써, 유사한 방식으로 사용될 수 있는 신규한 GAP 보호기를 달성한다.
또 다른 구현예에서, 위에서 논의된 임의의 이러한 상이한 전략이 상이한 조합으로 활용됨으로써, 주어진 펩티드에 대한 최상의 가능한 합성 전략이 가능해진다. 비제한적인 예로서, 적절하게 사용되면, 이러한 전략은 전적으로 용액에서 더 긴 펩티드의 합성을 가능하게 하고, 원스텝 반응의 측쇄 탈보호와 함께 C-말단 탈보호 및 C-말단 아마이드 형성이 달성된다.
따라서, 본 개시의 비제한적인 목적은 SolPPS를 위한 방법을 제공하는 것이다. 이 방법을 설계할 때, 이 방법은 대규모 생산을 방해하는 힘든 증류 및 정제 전략을 피하는 것과 같은, GAP-PS와 같은 다른 용액-상 방법의 장점을 유지해야함이 분명했다. 표적 펩티드의 용해도 제어를 유지하여, 생성된 아미노산 및 탈보호 프로토콜 불순물으로부터 생성물을 분리할 수 있으며, 본 기술분야의 단점을 해결할 수 있는, 향상된 보호 전략이 설계되어야 한다.
본 개시의 비제한적인 예시적 실시양태에서, 신규한 SolPPS 방법은 주어진 서열의 1차 아미노산의 C-말단에 HOBnDpp이 직접 부착되면서 시작될 수 있다(도 1b 참조). 대안적으로 또는 추가로, 용해도를 더 잘 제어하고 특정 아미노산의 측쇄를 보호하기 위해서, 1차 아미노산의 C-말단을 HOBnDpp로 보호하는 것, 비제한적으로 세린, 트레오닌, 티로신, 및/또는 시스테인과 같은 아미노산 잔기의 측쇄에의 HOBnDpp의 부착, 및 성장하는 펩티드로의 후속적인 혼입이 또한 실행될 수 있다(도 2 참조). HOBnDpp로 측쇄 보호를 달성하기 위해, HOBnDpp는 염기(예를 들어: 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 중탄산 나트륨 등)의 존재 하에 할로겐화제(예를 들어: PBr3, POBr3, (COCl)2, SOCl2 등)와 처음에 반응하여, 사용되는 할로겐화제에 따라, IBnDpp, ClBnDpp 또는 BrBnDpp를 제공한다. 반응에 사용되는 할로겐화제 및 염기에 따라 다양한 조건에서 반응이 발생할 수 있다. 예로서, 반응은 1~100 bar의 압력에서, -78℃~100℃의 온도에서, 및 1-상 또는 2-상 반응 매질에서 수행될 수 있다. 이 할로겐화된 화합물은 이후 N-말단 상의 1차 보호기(Pg) 및 C-말단 상의 2차 보호기(Pg')와 함께 아미노산과 반응하여 아미노산의 측쇄를 효과적으로 보호할 수 있다. 펩티드 서열에 통합되는 하나 또는 다수의 아미노산의 측쇄의 GAP 보호를 대신하거나 또는 이에 더하여 GAP 분자가 펩티드의 C-말단을 보호하면, 이후 C에서 N 방향으로 펩티드 합성이 실행될 수 있다; 대안적으로, HOBnDpp 또는 다른 GAP 분자가 아미노산 측쇄만을 보호하면 N에서 C 방향으로 펩티드 합성이 실행될 수 있다. N-말단 및 측쇄 보호를 위해 무수한 보호 전략이 가능할 수 있다. 잠재적인 N-말단 또는 C-말단 보호기는 비제한적으로 Cbz, Fmoc, Boc, 메틸, Bn(벤질), 또는 본 명세서에 논의된 임의의 GAP 분자를 포함할 수 있으며, 측쇄 보호기는 비제한적으로 tBu, Acm, 트리틸, Boc, Pbf, Pmc, Fm(플루오레닐메틸), 및 본 명세서에 논의된 임의의 GAP 분자를 포함할 수 있다.
또 다른 비제한적인 예시적 실시양태에서, 신규한 SolPPS 방법은 도 3에 나타낸 바와 같이 C-말단 보호를 위해 사용되는 신규한 GAP 분자(여기서, RAG)로 시작될 수 있으며, 이는 펩티드의 산-불안정 C-말단의 보호 및 펩티드로부터 RAG의 절단시 C-말단 아마이드의 형성을 모두 가능하게 한다. RAG로 C-말단 보호가 달성되면, 비제한적으로 Fmoc/tBu 전략과 같은 무수한 N-말단 및 측쇄 보호 전략을 활용하여, C에서 N 방향으로 펩티드 합성이 실행될 수 있다. RAG를 합성하기 위해, 비제한적으로, TFFH("N-((디메틸아미노)플루오로메틸렌)-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트"), TBTU("1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 테트라플루오로보레이트"), HBTU("1-((디메틸아미노)(디메틸이미니오)메틸)-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트"), EDCI("3-(((에틸이미노)메틸렌)아미노)-N,N-디메틸프로판-1-아민"), 또는 COMU("(1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄 헥사플루오로포스페이트")와 같은 다수의 커플링제를 통해, 보호된 링크 아마이드-OH에 HOBnDpp가 커플링되어, GAP 분자 RAG를 제공할 수 있다. 커플링 반응은 사용되는 특정 커플링제에 따라 다양한 조건에서 발생할 수 있다. 예로서, TBTU로 가볍게 교반하면서 실온에서 대기압에서 반응이 수행될 수 있다. 보호된 RAG 분자가 합성되면, 탈보호 반응(예를 들어: Fmoc 탈보호 반응)이 발생하여 링크 아마이드에서 아민이 유리화되어, 아미노산의 C-말단에서 발견될 수 있는 것과 같은, 카르복실산으로의 커플링 반응에 참여할 수 있다. 비제한적으로, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하는 아미노산 잔기의 측쇄에 대안적으로 또는 추가적으로 RAG가 부착될 수 있고(도 4 참조) 이는 성장하는 서열에 이들 아미노산이 첨가될 때 향상된 보호 또는 용해도 제어를 가능하게 한다. 아미노산의 측쇄로부터 RAG가 절단될 때, 이들 측쇄의 아마이드 형태(여기서, 각각 아스파라긴 및 글루타민)가 생성될 수 있다(도 4 참조).
또 다른 비제한적인 예시적 실시양태에서, 신규한 SolPPS 방법은 C-말단 보호를 위해 사용되는 신규한 GAP 분자(여기서, (링크 아마이드)-페닐알라닌-GAP, 즉 RPG)로 시작할 수 있다. RPG는 도 5와 유사하게 합성될 수 있다. 구체적으로, HOBnDpp는 Fmoc-보호된 페닐알라닌에 커플링되어 Fmoc-페닐알라닌-GAP(즉, Fmoc-F-GAP)을 형성할 수 있고, Fmoc 탈보호 후에, GAP-보호된 페닐알라닌의 이제-유리된 N-말단은 보호된 링크 아마이드-OH의 카르복실산 모이어티에 커플링될 수 있다(보호된 링크 아마이드-OH의 분자 구조는 도 3에서 볼 수 있다). 생성된 구조는 이후 링크 아마이드 분자의 N-말단에서 탈보호될 수 있으며, 이후 유리 N-말단은 커플링 반응에 참여하여 주어진 펩티드 서열에서 1차 아미노산과 펩티드 결합을 형성할 수 있다. 이후 펩티드 합성은 성장하는 펩티드의 C-말단 보호를 제공하는 RPG와 함께 C에서 N 방향으로 진행할 수 있다. C-말단 보호기로서 RPG는 측쇄 보호를 제공하는 임의의 개시된 GAP 분자와 함께, 또는 N-말단 및 측쇄 보호에 이용가능한 임의의 다른 보호 전략과 함께 사용될 수 있다. 또한 RPG는 C-말단 보호에 더하여 또는 그 대신에, RAG가 사용되는 것처럼 아미노산의 측쇄를 보호하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 비제한적인 예에서, 신규한 SolPPS 방법은 C-말단 보호를 위해, HG 또는 HPG와 같은, 상이한 신규한 GAP 분자를 활용할 수 있다. 이들 GAP 분자의 합성은 도 5에서 볼 수 있으며, 이들 분자는 펩티드의 C-말단에 부착되어 절단시 C-말단 아마이드의 형성없이 산-불안정 C-말단 보호를 가능하게 할 수 있다(도 6 참조). 아미노산의 C-말단 보호를 대신하거나 또는 이에 더하여, HG 및/또는 HPG는 또한 비제한적으로 아스파르트산, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신, 및 글루탐산을 포함하는 아미노산 잔기의 측쇄에 부착되어, 용해도 제어를 도울 수 있다(도 6 참조). 이후 비제한적으로 Fmoc/tBu 전략과 같은 무수한 보호 전략을 활용하여 C에서 N 방향으로 펩티드 합성이 진행할 수 있다.
또 다른 비제한적인 예시적 구현예에서, 신규한 SolPPS 방법은 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이 아닐린 디페닐포스핀 옥사이드(즉, NH2PhDpp)의 합성으로 시작할 수 있다. 구체적으로, NH2PhDpp의 합성은 4-브로모니트로 벤젠으로 시작하며, 이는 초저온(-100~-30℃) 및 실내 압력에서 에테르 용매 중 N-부틸리튬(nBuLi)으로 활성화되어 유기 리튬 시약을 형성할 수 있다. 이 시약은 이후 서서히 첨가한 클로로디페닐 포스핀과 인-시츄 반응할 수 있고, 이는 과산화수소로 포스핀 산화되고 H2 및 10% Pd/C로 니트로기 환원된 후, NH2PhDpp를 제공할 수 있다. 비제한적인 예에서, 이 분자는 이후 링크 아마이드-OH에 부착될 수 있고(도 8, 18 참조), 생성된 GAP 분자는 도 3과 유사하게 펩티드의 C-말단에 및/또는 도 4와 유사하게 (각각 보호된 아스파라긴 또는 글루타민을 생성하는) 아스파르트산 또는 글루탐산의 측쇄에 부착될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 또 다른 신규한 GAP 분자는 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이 직접적으로 또는 아민-기반 중간체를 통해 NH2PhDpp와 링커(여기서, HMPA)의 카르복실산 모이어티의 반응을 통해 합성될 수 있다. 생성된 GAP 분자는 이후 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 펩티드의 C-말단 및/또는 아스파르트산, 시스테인, 세린, 트레오닌, 및 글루탐산의 측쇄에 부착될 수 있다. 이후, 비제한적으로 Fmoc/tBu 전략과 같은 무수한 보호 전략을 활용하여 C에서 N 방향으로 펩티드 합성이 진행될 수 있다.
상기 모든 비제한적인 예에 대해, HOBnDpp, NH2PhDpp, 또는 임의의 다른 GAP 분자는 비제한적으로 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 메틸테트라히드로푸란, 테트라히드로푸란, 및 프로필렌 카르보네이트를 포함하는 다수의 상이한 용매에서 아미노산 잔기의 C-말단 또는 측쇄에 부착될 수 있다. 본 명세서에서 서술된 임의의 커플링 반응에 대해, GAP 분자 합성 또는 합성될 펩티드의 초기 아미노산에 대한 GAP 분자의 부착을 위해, 비제한적으로 TFFH, TBTU, HBTU, COMU, 또는 EDCI를 포함하는 무수한 상이한 커플링제가 사용될 수 있다.
비제한적인 예시적 실시양태로서, 그리고 상기 논의된 임의의 예 또는 이의 임의의 조합으로, 이후 SolPPS는 Fmoc/tBu 화학에서와 같이, C에서 N 방향으로 달성될 수 있다. 1차 및 후속 아미노산에 대한 Fmoc 기의 탈보호는 디에틸아민, DBU(디아자비시클로운데센), 피페리딘, 3차 부틸아민, 및 기타 알킬 아민을 포함하는 무수한 탈보호 시약으로 수행될 수 있으며, 추가적인 커플링 반응이 수행되어 펩티드 사슬을 성장시킬 수 있다. 각각의 커플링 반응 후, 과잉 활성화된 아미노산을 무효화하고 생성된 분자에 원하는 용해도 특성을 제공하기 위해 상이한 켄칭 시약이 사용될 수 있다. 비제한적인 예에서, 활성화된 아미노산을 켄칭하고 알칸 용매 중의 생성된 분자의 용해도를 증가시키기 위해 데실아민이 사용될 수 있다. 이어서, 반응 용매에 따라, 액체-액체 추출 기술 또는 선택적 침전이 수행되어 반응 혼합물을 정제할 수 있다. 본 명세서에 개시된 신규한 GAP 분자는 용해도 제어를 허용하고 신규한 SolPPS 방법을 가능하게 하는데, 여기서 선택적 침전 또는 추출로 아미노산 및 풀벤 불순물(즉, NFMP)을 효과적으로 제거한다. 비제한적인 예에서, 원하는 펩티드 서열의 마지막 아미노산이 커플링된 후, 적절한 TFA 칵테일을 이용한 글로벌 탈보호가 수행되어 C-말단 및 적절한 측쇄로부터 산-불안정 GAP 분자를 제거할 수 있다; 그러한 탈보호는 tBu-기반 측쇄 보호기와 같은 다른 산-불안정 측쇄 보호기를 제거할 수도 있다. 이 신규한 SolPPS 방법은 원스텝 글로벌 탈보호를 통한 네이티브(native) 펩티드 서열을 생성하며, C-말단 보호기를 제거하기 위한 수소화 또는 가수분해와 같은 추가적인 반응을 피할 수 있다. 또한, RAG와 같은 GAP 분자가 사용되는 경우, TFA 절단 동안 C-말단 아마이드가 형성될 수 있으며, 이러한 변형에 일반적으로 요구되는 합성-후 반응을 성공적으로 피할 수 있다. 본 명세서에 개시된 이러한 신규한 GAP 분자는 추가로 펩티드 합성 동안 안정하게 유지되며, DKP 형성으로 인한 우발적인 가수분해 또는 제거가 없다.
비제한적인 일 실시양태에서, 이들 신규한 GAP 분자는 임의의 주어진 펩티드의 N-말단, 뿐만 아니라 비제한적으로 리신을 포함하는 특정 아미노산 잔기의 아민-기반 측쇄를 보호하기 위해 사용될 수 있다. 비제한적인 예에서, HPG 및 디이미다졸 카르보닐은 DCM과 같은 적절한 반응 용매에 용해되고, 실내 온도 및 압력에서 1시간 이상 동안 가볍게 교반된다. 이후 실내 온도 및 압력에서 반응 혼합물에 아민이 첨가되어 HPG-보호된 카르바메이트 생성물을 생성한다(도 17 참조).
또 다른 비제한적인 실시양태에서, 신규한 SolPPS 방법은 신규한 GAP 분자 보호기의 합성으로 시작할 수 있고, 여기서 HOBnDpp, NH2PhDpp, 또는 이의 유도체는 임의의 주어진 링커 분자의 카르복실산 모이어티와 직접 반응할 수 있으며, 그 예는 도 18 및 아래 표에서 볼 수 있다.
이러한 반응의 예는 도 3, 8, 9에서 볼 수 있다. 이들 생성된 GAP 분자는 이후 임의의 주어진 아미노산에 부착되어 (도 3에서와 같이) C 말단 보호, (도 4에서와 같이) 측쇄 보호, 또는 N-말단 보호(도 17에 나타낸 것과 유사한 반응)를 용이하게 할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 도 5 및 9에서 볼 수 있는 바와 같이, HOBnDpp 또는 이의 유도체를 임의의 주어진 아미노산과 반응시킨 다음, 카르복실산 모이어티에서 임의의 주어진 링커 분자와 반응시킴으로써, 신규한 GAP 분자가 합성될 수 있다. 생성된 GAP 분자는 (도 3에서와 같이) C 말단 보호, (도 4에서와 같이) 측쇄 보호, 또는 (도 17과 유사하게) N-말단 보호에 사용될 수 있다.
약물학적으로 흥미로운, 생물학적으로 활성 펩티드인 비발리루딘의 합성 전략이 본 명세서에 개시된 SolPPS의 신규한 방법의 비제한적인 바람직한 실시양태로서 제시된다. 도 6은 신규 GAP 분자 HPG를 불특정 아미노산의 C-말단에 부착하기 위한 도식을 묘사하고, 이 도식 이후 Fmoc-류신-OH의 C-말단 보호에 의해 도 10에 나타낸 화합물을 형성한다. 이 특정 실시양태에서, C-말단 보호기로서 HPG가 선택되어, 합성-후 산-불안정 C-말단 탈보호를 가능하게 하면서, C-말단 아마이드 형성은 용이하게 하지 않는다. 이 초기 단계에 따라, 표준 Fmoc/tBu 화학이 실행되어 Fmoc-Tyr(tBu)-OH를 커플링하고 Fmoc-보호된 디펩티드를 형성한다. 이어서, 아미노산 측쇄 보호를 위한 도 6에 나타낸 도식 이후 HPG로 Fmoc-Glu-O알릴의 측쇄를 보호한 다음, 성장하는 펩티드에 혼입시켜, 도 11에 나타낸 화합물을 생성한다. Fmoc-Glu(HPG)-0알릴의 C-말단의 알릴 탈보호는 Pd(PPh3)4 및 트리이소프로필 또는 페닐 실란으로 처리(Isidro-Llobet 2009 참조)한 다음, 생성된 분자를 활성화하고 펩티드에 커플링하여 수행된다. 이 공정을 한 번 더 반복하여 그 다음의 HPG-보호된 글루탐산 잔기를 부착하여, 도 12에 나타낸 Fmoc-보호된 테트라-펩티드를 생성한다. 표준 Fmoc/tBu 펩티드 합성을 수행하여 프롤린과 이소류신을 첨가하고, 위에서 논의된 절차를 수행하여 그 다음의 2개의 글루탐산 잔기를 첨가하고, 이어서 페닐알라닌을 첨가한다. 아스파르트산 잔기는 HPG로 보호되고 도 6에 나타낸 도식에 따라 글루탐산과 마찬가지로 첨가되고, 그 후 글리신 잔기가 첨가된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 신규한 GAP 분자 RAG는 Fmoc-Asp-0알릴과 반응하여 도 13에 나타낸 화합물, Fmoc-Asp(RAG)-O알릴을 생성한다. 해당 화합물의 알릴 탈보호가 수행되고, 이는 후속적으로 활성화되고 펩티드 사슬에 커플링되어 도 14에 나타낸 Fmoc-보호된 펩티드를 생성한다. 이어서, 표준 Fmoc/tBu 펩티드 합성을 수행하여 4개의 글리신, 프롤린, 아르기닌, 또 다른 프롤린, 및 D-페닐알라닌을 첨가하여 도 15에 나타낸 바와 같이 완전히 보호된 비발리루딘 펩티드를 획득한다.
이 특정 실시양태에서, 완전히 보호된 비발리루딘의 Fmoc-탈보호 후, TFA 칵테일(즉, 90% TFA, 5% H20, 5% 트리이소프로필실란(TIPS))로 원스텝 글로벌 탈보호를 수행하여 (신규한 GAP 분자를 포함하는) 모든 측쇄 보호기, 뿐만 아니라 HPG C-말단 보호기를 절단한다(도 16 참조). 이 글로벌 탈보호 동안, RAG-보호된 아스파르트산도 탈보호된 아스파라긴으로 전환된다. TFA 칵테일을 이용한 글로벌 탈보호로부터 생성된 분자는 네이티브 비발리루딘이다.
Fmoc 탈보호 및 커플링에 대한 일반 절차: 프로필렌 카르보네이트(PC)에서 실행되는 신규한 SolPPS 방법의 경우: 프로필렌 카르보네이트(200mM)에 미리-용해된 Fmoc-(AA)n-OBnDpp, Fmoc-(AA)n-HPG, Fmoc-(AA)n-RAG, 또는 GAP 보호기로 C-말단이 보호된 임의의 아미노산에 탈보호 염기와 옥탄 티올을 첨가한 후, 알칸 이중층으로 실온에서 15분 동안 교반한다. 이후 반응 혼합물을 새로운 알칸 용매로 2회(X2) 세척한 후, 포화 염화 암모늄 수용액으로 3회 세척한 후, 건조시킨다. 별도의 프로필렌 카르보네이트 용액에 3.0 당량(eq.)의 TBTU 또는 TFFH, 3.0 당량의 Fmoc-AA-OH, 및 3.0 당량의 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 첨가하고 반응을 7분 동안 교반한다. 이후 이 용액을 H-(AA)n-(GAP 분자)를 함유하는 미리 건조된 PC 용액에 첨가하고 10~60분 동안 교반하면서 커플링되도록 한다. 이후, (직선으로 연결된 10~18개 탄소를 갖는, 즉 C10-C18) 장쇄 지방족 티올, 장쇄(C10-18) 지방족 알코올, 장쇄(C10-18) 지방족 아민, 장쇄(C10-C18) 지방족 셀레놀, 지방족 폴리아민, 또는 지방족 폴리알코올과 같은 켄칭 시약을 과량 첨가한다. 이후, 반응 혼합물을 포화 염화 암모늄 수용액으로 3회 세척한 후 건조하여 PC 용액 중의 연장된 펩티드를 제공한다. 이 공정은 원하는 서열과 길이를 가진 펩티드를 생성하기 위해 필요에 따라 반복된다. 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트에서 실행되는 신규한 SolPPS 방법의 경우: DCM 또는 에틸 아세테이트(100mM)에 미리-용해된 Fmoc-(AA)n-OBnDpp, Fmoc-(AA)n-HPG, Fmoc-(AA)n-RAG, 또는 임의의 GAP 보호기로 C-말단이 보호된 임의의 아미노산에 탈보호 염기를 첨가한 후, 실온에서 10분 동안 교반한다. 이후 반응 혼합물을 포화 염화 암모늄 수용액으로 3회, 포화 중탄산 나트륨 수용액으로 3회 세척한 후, 건조시킨다. 별도의 DCM 또는 에틸 아세테이트 용액에 2.0 당량의 TBTU 또는 TFFH, 2.0 당량의 Fmoc-AA-OH, 및 5.0 당량의 DIPEA를 첨가하고 반응을 7분 동안 교반한다. 이후 이 용액을 H-(AA)n-(GAP 분자)를 함유하는 미리 건조된 DCM 또는 에틸 아세테이트 용액에 첨가하고 10~60분 동안 교반하면서 커플링되도록 한다. 이후 장쇄(C10-C18) 지방족 티올, 장쇄(C10-18) 지방족 알코올, 장쇄(C10-18) 지방족 아민, 장쇄(C10-C18) 지방족 셀레놀, 지방족 폴리아민, 또는 지방족 폴리알코올과 같은 켄칭 시약을 과량 첨가한다. 이후, 반응 혼합물을 포화 염화 암모늄 수용액으로 3회 세척한 후 건조하여 DCM 또는 에틸 아세테이트 용액 중의 연장된 펩티드를 제공한다. 이 공정은 원하는 서열과 길이를 가진 펩티드를 생성하기 위해 필요에 따라 반복된다.
EDCI 커플링에 대한 일반적인 절차: 아미노산 또는 펩티드의 탈보호된 N-말단을 함유하는 반응 혼합물을 빙조에서 냉각시킨다. 이러한 유리 N-말단에 커플링될 아미노산 2 당량을 후속적으로 반응 혼합물에 첨가한 후, 2 당량의 EDCI를 첨가한다. 생성된 혼합물을 빙조에서 제거하고 1시간 동안 교반한 후, 장쇄(C10-C18) 지방족 티올, 장쇄(C10-18) 지방족 알코올, 장쇄(C10-18) 지방족 아민, 장쇄(C10-C18) 지방족 셀레놀, 지방족 폴리아민, 또는 지방족 폴리알코올과 같은 켄칭 시약을 과량 첨가한다. 이후 반응 혼합물을 포화 염화 암모늄 수용액으로 3회, 포화 중탄산 나트륨 수용액으로 3회 세척한 후, 건조시킨다.
또한 기능은, 전체적으로 또는 부분적으로, 현재 알려져 있거나 알려지게 될 방식으로, 다수의 구성요소에 분배될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 서술된 기능, 특징, 및 선호도를 달성하는 데 무수한 조합이 가능하다. 또한, 본 개시의 범위는 서술된 특징뿐만 아니라 현재 그리고 그 이후 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 본 명세서에 서술된 공정, 조성물, 또는 화합물에 대해 이루어질 수 있는 변형 및 수정을 수행하기 위해 통상적으로 공지된 방식을 포함한다.
또한, 본 개시에서 (도면과 같이) 다이어그램, 도식 또는 흐름도로서 제시되고 서술된 방법의 실시양태는 기술에 대한 보다 완전한 이해를 제공하기 위해 예로서 제공된다. 개시된 방법은 본 명세서에 제시된 동작 및 논리적 흐름에 제한되지 않는다. 다양한 동작의 순서가 변경되고 더 큰 동작의 일부인 것으로 서술된 하위-동작이 독립적으로 수행되는 대안적인 실시양태가 고려된다. 본 개시의 목적을 위해 다양한 실시양태가 서술되었지만, 이러한 실시양태는 본 개시의 교시를 이들 실시양태로 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 전술한 요소 및 동작에 대해 다양한 변경 및 수정이 이루어져 본 개시에 서술된 시스템 및 공정의 범위 내에 유지되는 결과를 얻을 수 있다.
추가의 실시양태
청구되는 발명의 추가의 실시양태는 다음을 포함한다:
1. 용액-상 펩티드 합성용 보호기로서, 상기 보호기는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 및 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 보호기;
여기서 화학식 1은:
여기서 화학식 2는:
여기서 화학식 3은:
여기서 화학식 4는:
여기서 화학식 5는:
여기서 화학식 6은:
여기서 화학식 7은:
여기서 화학식 8은:
여기서:
Z는 -H, 메틸기(-Me), 및 메톡시기(-OMe)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 4-(히드록시메틸)페녹시아세틸("HMPA"), 4-(히드록시메틸)페녹시부타노일("HMPB"), 4-(히드록시메틸)벤조일("HMB"), 4-(머캅토메틸)벤조일("MMB"), 4-(머캅토메틸)페녹시아세틸("MMPA"), 4-(아미노메틸)페녹시아세틸("AMPA"), 4-(3,3-디메틸-3-히드록시프로필)페녹시아세틸("DMPPA"), 2-(4-(아미노(2,4-디메톡시페닐)메틸)페녹시)아세틸("링크 아마이드"), 4-((9-아미노-9H-크산텐-3-일)옥시)부타노일("크산테닐"), 5-(5-아미노-10,11-디히드로-5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-3-일)펜타노일("TCA"), 및 3-(4-(클로로(2-클로로페닐)(페닐)메틸)페닐)프로파노일("2-클로로트리틸")로 이루어진 군으로부터 선택된다.
2. 상기 1항의 보호기로서, 상기 보호기는 화학식 1, 화학식 4, 화학식 5, 및 화학식 7로 이루어진 군으로부터 선택되고; R은 아미노산의 측쇄인 보호기.
3. 상기 1항의 보호기로서, R은 -H, 메틸, -CH2SH, -CH2CH2COOH, -CH2COOH, 벤질, 4-(lH-이미다졸릴)메틸, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NH2, 이소부틸, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2CH2CONH2, 프로필기의 1-위치가 R기와 동일한 위치에 부착되고 프로필기의 3-위치가 질소에 부착된 프로필기, -CH2CH2CH2N=C(NH2)2, -CH2OH, 1-히드록시에틸, 이소프로필, 4-히드록시벤질, 및 3-(1H-인돌릴)메틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기.
4. 용액-상 펩티드 합성의 수행 방법으로서, 상기 방법은:
제1 아미노산에 제1 보호기를 부착하여 제1 보호된 아미노산을 제공하는 단계로서, 여기서 제1 보호기는 청구항 1의 보호기인 단계; 및
제1 보호된 아미노산 또는 제1 아미노산을 다른 분자에 연결하여 형성된 펩티드에 대해 커플링 반응을 수행하는 단계;를 포함하는 방법.
5. 상기 4항의 방법으로서, 상기 제1 보호기는 제1 아미노산의 C-말단에 부착되는 방법.
6. 상기 4항의 방법으로서, 상기 제1 보호기는 제1 아미노산의 측쇄에 부착되는 방법.
7. 상기 4항의 방법으로서, 상기 제1 보호기는 제1 아미노산의 N-말단에 부착되는 방법.
8. 상기 4항의 방법으로서, 상기 방법은:
제1 보호된 아미노산에 제2 보호된 아미노산을 커플링하는 단계;를 포함하고,
여기서 제2 보호된 아미노산은 제2 보호기 및 제2 아미노산을 포함하고, 제2 아미노산은 측쇄를 포함하고, 제2 보호기는 제2 아미노산의 측쇄에 부착되고; 제2 보호기는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 및 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 방법.
9. 상기 8항의 방법으로서, 상기 제1 보호기를 부착하는 단계는 제1 아미노산의 C-말단, 제1 아미노산의 N-말단, 또는 제1 아미노의 측쇄에 제1 보호기를 부착하는 단계를 포함하는 방법.
10. 용액-상 펩티드 합성을 위한 보호기의 형성 방법으로서, 상기 방법은:
벤질 디페닐포스핀 옥사이드(HOBnDpp), 아닐린 디페닐포스핀 옥사이드(NH2PhDpp), 또는 이의 유도체를 (i) 링커 분자에 직접적으로, (ii) 아미노산을 통해 링커 분자에, 또는 (iii) 아미노산 유도체를 통해 링커 분자에 커플링하는 단계를 포함하는 방법.
11. 상기 10항의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 1에 의해 정의되는 방법:
여기서:
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
12. 상기 10항의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 2에 의해 정의되는 방법:
여기서:
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
13. 상기 10항의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 3에 의해 정의되는 방법:
여기서:
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
14. 상기 10항의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 4에 의해 정의되는 방법:
여기서:
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
15. 상기 10항의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 5에 의해 정의되는 방법:
여기서:
Z는 -H, -Me, 및 -OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
16. 상기 10항의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 6에 의해 정의되는 방법:
여기서:
Z는 -H, -Me, 및 -OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
17. 상기 10항의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 7에 의해 정의되는 방법:
여기서:
Z는 -H, -Me, 및 -OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
18. 상기 10항의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 8에 의해 정의되는 방법:
여기서:
Z는 -H, -Me, 및 -OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
19. 용액-상 펩티드 합성용 보호기로서, 상기 보호기는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 및 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 보호기;
여기서 화학식 1은:
여기서 화학식 2는:
여기서 화학식 3은:
여기서 화학식 4는:
여기서 화학식 5는:
여기서 화학식 6은:
여기서 화학식 7은:
여기서 화학식 8은:
여기서:
Z는 -H, 메틸기(-Me), 및 메톡시기(-OMe)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 4-(히드록시메틸)페녹시아세틸("HMPA"), 4-(히드록시메틸)페녹시부타노일("HMPB"), 4-(히드록시메틸)벤조일("HMB"), 4-(머캅토메틸)벤조일("MMB"), 4-(머캅토메틸)페녹시아세틸("MMPA"), 4-(아미노메틸)페녹시아세틸("AMPA"), 4-(3,3-디메틸-3-히드록시프로필)페녹시아세틸("DMPPA"), 2-(4-(아미노(2,4-디메톡시페닐)메틸)페녹시)아세틸("링크 아마이드"), 4-((9-아미노-9H-크산텐-3-일)옥시)부타노일("크산테닐"), 5-(5-아미노-10,11-디히드로-5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-3-일)펜타노일("TCA"), 및 3-(4-(클로로(2-클로로페닐)(페닐)메틸)페닐)프로파노일("2-클로로트리틸")로 이루어진 군으로부터 선택된다.
20. 상기 19항의 보호기로서, 상기 보호기는 화학식 1, 화학식 4, 화학식 5, 및 화학식 7로 이루어진 군으로부터 선택되고; R은 아미노산의 측쇄인 보호기.
21. 상기 19항 또는 20항의 보호기로서, R은 -H, 메틸, -CH2SH, -CH2CH2COOH, -CH2COOH, 벤질, 4-(lH-이미다졸릴)메틸, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NH2, 이소부틸, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2CH2CONH2, 프로필기의 1-위치가 R기와 동일한 위치에 부착되고 프로필기의 3-위치가 질소에 부착된 프로필기, -CH2CH2CH2N=C(NH2)2, -CH2OH, 1-히드록시에틸, 이소프로필, 4-히드록시벤질, 및 3-(1H-인돌릴)메틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기.
22. 용액-상 펩티드 합성의 수행 방법으로서, 상기 방법은:
제1 아미노산에 제1 보호기를 부착하여 제1 보호된 아미노산을 제공하는 단계로서, 여기서 제1 보호기는 청구항 1의 보호기인 단계; 및
제1 보호된 아미노산 또는 제1 아미노산을 다른 분자에 연결하여 형성된 펩티드에 대해 커플링 반응을 수행하는 단계;를 포함하는 방법.
23. 상기 22항의 방법으로서, 상기 제1 보호기는 제1 아미노산의 C-말단에 부착되는 방법.
24. 상기 22항 또는 23항의 방법으로서, 상기 제1 보호기는 제1 아미노산의 측쇄에 부착되는 방법.
25. 상기 22항, 23항, 및 24항 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 제1 보호기는 제1 아미노산의 N-말단에 부착되는 방법.
26. 상기 22항, 23항, 24항, 및 25항 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 방법은:
제1 보호된 아미노산에 제2 보호된 아미노산을 커플링하는 단계;를 포함하고,
여기서 제2 보호된 아미노산은 제2 보호기 및 제2 아미노산을 포함하고, 제2 아미노산은 측쇄를 포함하고, 제2 보호기는 제2 아미노산의 측쇄에 부착되고; 제2 보호기는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 및 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 방법.
27. 상기 22항, 23항, 24항, 25항, 및 26항 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 제1 보호기를 부착하는 단계는 제1 아미노산의 C-말단, 제1 아미노산의 N-말단, 또는 제1 아미노의 측쇄에 제1 보호기를 부착하는 단계를 포함하는 방법.
28. 용액-상 펩티드 합성을 위한 보호기의 형성 방법으로서, 상기 방법은:
벤질 디페닐포스핀 옥사이드(HOBnDpp), 아닐린 디페닐포스핀 옥사이드(NH2PhDpp), 또는 이의 유도체를 (i) 직접적으로 링커 분자에, (ii) 아미노산을 통해 링커 분자에, 또는 (iii) 아미노산 유도체를 통해 링커 분자에 커플링하는 단계를 포함하는 방법.
29. 상기 28항의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 1에 의해 정의되는 방법:
여기서:
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
30. 상기 28항 또는 29항의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 2에 의해 정의되는 방법:
여기서:
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
31. 상기 28항, 29항, 및 30항 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 3에 의해 정의되는 방법:
여기서:
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
32. 상기 28항, 29항, 30항, 및 31항 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 4에 의해 정의되는 방법:
여기서:
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
33. 상기 28항, 29항, 30항, 31항, 및 32항 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 5에 의해 정의되는 방법:
여기서:
Z는 -H, -Me, 및 -OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
34. 상기 28항, 29항, 30항, 31항, 32항, 및 33항 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 6에 의해 정의되는 방법:
여기서:
Z는 -H, -Me, 및 -OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
35. 상기 28항, 29항, 30항, 31항, 32항, 33항, 및 34항 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 7에 의해 정의되는 방법:
여기서:
Z는 -H, -Me, 및 -OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
36. 상기 28항, 29항, 30항, 31항, 32항, 33항, 34항, 및 35항 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 8에 의해 정의되는 방법:
여기서:
Z는 -H, -Me, 및 -OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
관련 참조문헌
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Claims (18)
- 용액-상 펩티드 합성용 보호기로서, 상기 보호기는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 및 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 보호기:
여기서 화학식 1은
;
여기서 화학식 2는
;
여기서 화학식 3은
;
여기서 화학식 4는
;
여기서 화학식 5는
;
여기서 화학식 6은
;
여기서 화학식 7은
;
여기서 화학식 8은
;
여기서,
Z는 -H, 메틸기(-Me), 및 메톡시기(-OMe)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 4-(히드록시메틸)페녹시아세틸("HMPA"), 4-(히드록시메틸)페녹시부타노일("HMPB"), 4-(히드록시메틸)벤조일("HMB"), 4-(머캅토메틸)벤조일("MMB"), 4-(머캅토메틸)페녹시아세틸("MMPA"), 4-(아미노메틸)페녹시아세틸("AMPA"), 4-(3,3-디메틸-3-히드록시프로필)페녹시아세틸("DMPPA"), 2-(4-(아미노(2,4-디메톡시페닐)메틸)페녹시)아세틸("링크 아마이드"), 4-((9-아미노-9H-크산텐-3-일)옥시)부타노일("크산테닐"), 5-(5-아미노-10,11-디히드로-5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-3-일)펜타노일("TCA"), 및 3-(4-(클로로(2-클로로페닐)(페닐)메틸)페닐)프로파노일("2-클로로트리틸")로 이루어진 군으로부터 선택된다. - 청구항 1에 있어서,
상기 보호기는 화학식 1, 화학식 4, 화학식 5, 및 화학식 7로 이루어진 군으로부터 선택되고; R은 아미노산의 측쇄인 보호기. - 청구항 1에 있어서,
R은 -H, 메틸, -CH2SH, -CH2CH2COOH, -CH2COOH, 벤질, 4-(lH-이미다졸릴)메틸, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NH2, 이소부틸, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2CH2CONH2, 프로필기의 1-위치가 R기와 동일한 위치에 부착되고 프로필기의 3-위치가 질소에 부착된 프로필기, -CH2CH2CH2N=C(NH2)2, -CH2OH, 1-히드록시에틸, 이소프로필, 4-히드록시벤질, 및 3-(1H-인돌릴)메틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기. - 제1 아미노산에 제1 보호기를 부착하여 제1 보호된 아미노산을 제공하는 단계로서, 여기서 제1 보호기는 청구항 1의 보호기인 단계; 및
제1 보호된 아미노산 또는 제1 아미노산을 다른 분자에 연결하여 형성된 펩티드에 대해 커플링 반응을 수행하는 단계;를 포함하는 용액-상 펩티드 합성의 수행 방법. - 청구항 4에 있어서,
상기 제1 보호기는 제1 아미노산의 C-말단에 부착되는 방법. - 청구항 4에 있어서,
상기 제1 보호기는 제1 아미노산의 측쇄에 부착되는 방법. - 청구항 4에 있어서,
상기 제1 보호기는 제1 아미노산의 N-말단에 부착되는 방법. - 청구항 4에 있어서,
제1 보호된 아미노산에 제2 보호된 아미노산을 커플링하는 단계를 포함하고,
여기서 제2 보호된 아미노산은 제2 보호기 및 제2 아미노산을 포함하고, 제2 아미노산은 측쇄를 포함하고, 제2 보호기는 제2 아미노산의 측쇄에 부착되고; 제2 보호기는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 및 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 방법. - 청구항 8에 있어서,
상기 제1 보호기를 부착하는 단계는 제1 아미노산의 C-말단, 제1 아미노산의 N-말단, 또는 제1 아미노의 측쇄에 제1 보호기를 부착하는 단계를 포함하는 방법. - 벤질 디페닐포스핀 옥사이드(HOBnDpp), 아닐린 디페닐포스핀 옥사이드(NH2PhDpp), 또는 이의 유도체를 (i) 링커 분자에 직접적으로, (ii) 아미노산을 통해 링커 분자에, 또는 (iii) 아미노산 유도체를 통해 링커 분자에 커플링하는 단계를 포함하는 용액-상 펩티드 합성을 위한 보호기의 형성 방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 1에 의해 정의되는 방법:
;
여기서,
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. - 청구항 10에 있어서,
상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 2에 의해 정의되는 방법:
;
여기서,
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. - 청구항 10에 있어서,
상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 3에 의해 정의되는 방법:
;
여기서,
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. - 청구항 10에 있어서,
상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 4에 의해 정의되는 방법:
;
여기서,
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. - 청구항 10에 있어서,
상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 5에 의해 정의되는 방법:
;
여기서,
Z는 -H, -Me, 및 -OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. - 청구항 10에 있어서,
상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 6에 의해 정의되는 방법:
;
여기서,
Z는 -H, -Me, 및 -OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. - 청구항 10에 있어서,
상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 7에 의해 정의되는 방법:
;
여기서,
Z는 -H, -Me, 및 -OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 보호된 아미노산의 알려진 측쇄 및 보호되지 않은 아미노산의 알려진 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. - 청구항 10에 있어서,
상기 커플링 단계는 L-OH에
를 커플링하여 보호기를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 보호기는 다음의 화학식 8에 의해 정의되는 방법:
;
여기서,
Z는 -H, -Me, 및 -OMe로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X는 -0-, -S-, 및 -NH-로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
L은 HMPA, HMPB, HMB, MMB, MMPA, AMPA, DMPPA, 링크 아마이드, 크산테닐, TCA, 및 2-클로로트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
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