KR20210013077A - Cas9 리보핵단백질을 사용하는 녹아웃 일차 및 확장된 인간 nk 세포의 생성 - Google Patents

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KR20210013077A
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KR1020207035445A
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딘 앤소니 리
카라로우디 메이삼 나에이미
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더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈
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Abstract

NK 세포를 유전자 조작하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다.

Description

CAS9 리보핵단백질을 사용하는 녹아웃 일차 및 확장된 인간 NK 세포의 생성
I. 배경
1. 암 면역요법은 최근에 발전되었다. 유전적으로-변형된 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포는 암 면역요법에서 성공적으로 활용되는 조작된 면역 세포의 탁월한 예이다. 이들 세포는 CD19 + B 세포 악성종양에 대한 치료를 위해 FDA에 의해 최근 승인되었지만, 지금까지 성공은 몇 개의 표적화가능한 항원을 보유하는 질환으로 제한되었고, 그리고 그와 같은 제한된 항원성 레퍼토리의 표적화는 면역 회피(immune escape)에 의해 실패하기 쉽다. 또한, CAR T 세포는 동종이계 T 세포에 의해 야기된 이식편 대 숙주 질환의 위험 때문에 자가 T 세포의 사용에 중점을 두었다. 그에 반해서, NK 세포는 항원-독립 방식으로 종양 표적을 사멸시킬 수 있고 GvHD를 야기하지 않아, 암 면역요법에 적합한 후보가 된다.
2. CRISPR/Cas9 기술은 최근에 면역 세포를 조작하는데 사용되어 왔지만, NK 세포를 플라스미드로 유전적으로 재프로그래밍하는 것은 항상 도전적인 일이었다. 이는 실질적인 절차-관련된 NK 세포 아폽토시스 및 유전자 조작된 NK 세포의 제한된 생산을 유발하는 렌티바이러스 및 레트로바이러스 형질도입과 같은 DNA 의존 방식으로 전이유전자 전달의 어려움으로 인한 것이었다. 필요한 것은 NK 세포를 유전자 조작하는 신규 방법이다.
II. 요약
3. 유전자 변형된 NK 세포와 관련된 방법 및 조성물이 개시되어 있다.
4. 일 측면에서, NK 세포(예를 들어 일차 또는 확장된 NK 세포)를 유전자 변형시키는 방법이 본원에 개시되어 있고, 상기 방법은 상기 NK 세포 (예컨대, 형질전환 성장 인자―β 수용체 2 (TGFBR2) 또는 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1 (HPRT1)에서 표적 DNA 서열에 대해 특이적인 가이드 RNA (gRNA)를 얻는 단계; 및 b) NK 세포의 게놈 DNA 내의 표적 서열에 혼성화되는 상응하는 CRISPR/Cas 가이드 RNA와 복합체화된 부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 (Cas9)를 포함하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체를, 표적 NK 세포에 전기천공을 통해 도입하는 단계를 포함한다.
5. 또한, NK 세포의 게놈이 하나 이상의 염기쌍의 삽입 또는 결실에 의해, 이종성 DNA 단편 (예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오타이드)의 삽입에 의해, 내인성 DNA 단편의 결실에 의해, 내인성 DNA 단편의 역전 또는 전좌에 의해, 또는 이들의 조합에 의해 변형되는 임의의 이전의 측면의 방법이 본원에 개시되어 있다.
6. 일 측면에서, 임의의 이전의 측면의 NK 세포를 유전자 변형시키는 방법이 본원에 개시되어 있되, 상기 NK 세포 (예를 들어, 일차 또는 확장된 NK 세포)는 형질도입 (예컨대, 전기천공) 전에 4, 5, 6, 또는 7일 동안 IL-2 및/또는 조사된 피더(feeder) 세포의 존재에서 인큐베이션된다.
7. 또한 임의의 이전의 측면의 NK 세포를 유전자 변형시키는 방법이 본원에 개시되어 있되, 상기 방법은 전기천공 다음에 변형된 NK 세포를 조사된 멤브레인 결합된 인터류킨-21 (mbIL-21) 발현 피더 세포로 확장시키는 것을 추가로 포함한다.
8. 일 측면에서, 임의의 이전의 측면의 방법으로 만들어진 변형된 NK 세포가 본원에 개시되어 있다. 일 측면에서, 변형된 NK 세포는 형질전환 성장 인자―β 수용체 2 (TGFBR2) 또는 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1 (HPRT1)을 암호화하는 유전자의 녹아웃을 포함할 수 있다.
9. 또한 암을 치료하는 방법이 본원에 개시되어 있되, 상기 방법은 임의의 이전의 측면의 변형된 NK 세포를 암을 가지고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
10. 일 측면에서, 필요로 하는 대상체에게 조작된 NK 세포를 양자 전이시키는 방법이 본원에 개시되어 있되, 상기 방법은 a) 변형될 표적 NK 세포 (예컨대 일차 NK 세포 또는 확장된 NK 세포)를 얻는 단계; b) 표적 DNA 서열에 대해 특이적인 gRNA를 얻는 단계; c) 조작된 NK 세포를 생성하는 표적 NK 세포의 게놈 DNA 내의 표적 서열에 혼성화되는 상응하는 CRISPR/Cas gRNA와 복합체화된 부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 (Cas9)를 포함하는 RNP 복합체를, 상기 표적 NK 세포에 전기천공을 통해 도입하는 단계; 및 d) 상기 조작된 NK 세포를 상기 대상체로 전이시키는 단계를 포함한다.
11. 또한 조작된 NK 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 양자 전이시키는 방법이 본원에 개시되어 있되, 상기 NK 세포는 생체외에서 변형되고 변형 후에 상기 대상체에게 이식된 일차 NK 세포 (예컨대, 동종이계 공여자 공급원으로부터의 자가 NK 세포, 또는 NK 세포)이다.
12. 일 측면에서, 조작된 NK 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 양자 전이시키는 임의의 이전의 측면의 방법이 본원에 개시되어 있되, 상기 NK 세포는 조사된 mbIL-21 발현 피더 세포 또는 대상체에게 변형된 NK 세포의 투여 전에, 함께, 또는 그 다음 IL-21의 투여로 확장된다.
13. 일 측면에서, 조작된 NK 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 양자 전이시키는 방법이 본원에 개시되어 있되, 양자 이식된 변형된 NK 세포를 받은 대상체는 암을 가지고 있다.
III. 도면의 간단한 설명
14. 본원에 편입되고 그 일부를 구성하는 첨부 도면은 몇 개의 구현예를 예시하고, 상기 설명과 함께 개시된 조성물 및 방법을 예시한다.
15. 도 1은 EN-138 프로그램을 사용하여 NK 세포에서 siRNA 및 플라스미드 DNA 발현 GFP의 전기천공 효율을 도시한다. 본원에서 볼 수 있는 바와 같이, NK 세포 생존력은 77.5%이고, 그리고 생존 세포의 35%는 GFP 양성이었다.
16. 도 2는 전기천공 최적화를 위해 시험된 16개의 프로그램 (DN-100) 중 또 다른 것의 생존력 및 효율을 도시한다.
17. 도 3은 (b) T7E1 돌연변이 검정에 의해 측정된 소모된 (a) 일차 NK 세포에서 Cas9/RNP-매개된 TGFBR2 녹아웃을 도시한다. T7E1 효소는 미스매치된 DNA를 인식하고 절단한다. 각 작은 밴드 (청색 화살표)는 인델을 운반하는 소화된 DNA 단편을 나타낸다.
18. 도 4는 T7E1 돌연변이 검정에 의해 측정된 확장 NK 세포에서 Cas9/RNP - 매개된 HPRT 파괴를 도시한다.
19. 도 5는 RT-PCR을 사용하여 Cas9/RNP (gRNA1+gRNA2)에 의해 도입된 CRISPR 변형된 NK 세포에서 TGFBR2 엑토도메인의 mRNA 발현 수준을 도시한다. GAPDH는 내인성 대조군 유전자로서 사용되었다. RNA 수준의 감소는 TGFBR2 유전자의 파괴를 나타낸다.
20. 도 6a는 Cas9/RNP 변형된 (gRNA1+gRNA2, gRNA2 및 gRNA3) 세포의 세포독성 검정을 도시하고, 세포를 TGFB와 함께 밤새 인큐베이션하는 것이 DAOY 세포를 용해시키는 그것의 능력을 유의하게 감소시키지 않음을 도시한다.
21. 도 6b는, 비-변형된 NK 세포와 비교할 때, Cas9/RNP 변형 세포 (gRNA2 및 gRNA3)가 TGFB에 덜 민감함을 도시한다.
22. 도 7은 SOCS3 유전자의 엑손 2 및 SOCS3 유전자의 엑손 2를 표적화하기 위해 사용된 gRNA를 도시한다.
23. 도 8은 야생형 NK와 비교하여, 녹아웃된 NK 세포에서 Socs3의 상대 정규화된 발현 수준을 도시한다.
24. 도 9a, 9b, 9c, 및 9d는 SOCS3-KO NK 세포의 더 나은 확장 및 세포독성을 도시한다. 도 9a는 AML에 대한 SOCS3-KO NK 세포의 인큐사이트(Incucyte) 결과를 도시한다. 도 9b 및 9c는 DAOY 세포 (9b) 및 신경교세포종 세포주 NB1643 (9c)에 대한 3명의 공여자로부터 세포독성 결과를 도시한다. 도 9d는 도 9b 및 9c에서 각 세포주 및 처리 조건에 대한 사멸 세포의 실제 수를 도시한다.
25. 도 10은 NK 세포 확장에 대한 SOCS3 KO 효과를 보여주는 증식 분석을 도시한다.
26. 도 11은 야생형 및 CD38-녹아웃 NK 세포에 대한 CD38 발현을 도시한다.
27. 도 12는 다라투무맙-매개된 동족살해(fratricide)에 대한 내성을 도시한다.
28. 도 13은, Cas9/RNP 플랫폼이 NK 세포에서 AAVS1 유전자좌를 성공적으로 표적화하고 있음을 도시한다.
29. 도 14는, mCherry 리포터 유전자의 인간 일차 NK 세포의 AAVS1 유전자좌로의 통합이 PCR을 사용하여 평가되었음을 도시한다.
30. 도 15는, 확장 및 분류 후의 mCherry의 안정한 유전자 발현이 유세포측정 및 형광 현미경검사를 사용하여 연구되었음을 도시한다. *결과는 12개의 설계된 AAV 작제물 중 2개를 나타낸다.
31. 도 16은, 상이한 배양 조건을 사용하는 인간 일차 NK 세포의 확장 및 분류 후의 mCherry의 안정한 유전자 발현이 유세포측정을 사용하여 평가되었음을 도시한다. 일차 NK 세포는 CAS9/RNP로 전기천공되었고, AAV6 SS800-mCherry의 300K MOI로 형질도입되었고, 그리고 RPMI 배지 + 우태 혈청 (FBS) 또는 무혈청 AIMV 배지에서 배양되었다.
IV. 상세한 설명
32. 본 화합물, 조성물, 물품, 장치, 및/또는 방법이 개시되고 기재되기 전에, 달리 구체화되지 않는 한 특정 합성 방법 또는 특정 재조합 생명공학 방법, 또는 달리 구체화되지 않는 한 특정 시약에 제한되지 않으며, 물론 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 설명하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
A. 정의
33. 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명확히 명시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "약제학적 담체"에 대한 언급은 2종 이상의 상기 담체, 등의 혼합물을 포함한다.
34. 범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값으로부터, 및/또는 "약" 또 다른 특정 값까지 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 또 다른 구현예는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 선행된 "약"의 사용에 의해 근사치로 표현될 때, 특정 값은 또 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 각각의 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여 그리고 다른 종점에 독립적으로 모두 중요한 것으로 추가로 이해될 것이다. 또한, 본원에 개시된 다수의 값이 존재하며, 각 값은 또한 값 자체에 추가하여 "약" 그 특정 값으로 본원에 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되는 경우, "약 10"이 또한 개시된다. 또한, 값이 개시되는 경우, 값 "이하", "값 이상" 및 값 사이의 가능한 범위가 당업자에 의해 적절하게 이해되는 바와 같이 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되는 경우, "10 이하"뿐만 아니라 "10 이상"이 또한 개시된다. 또한, 본원 전체에 걸쳐, 데이터는 다수의 상이한 포맷으로 제공되고, 이 데이터는 종점 및 시작점, 및 데이터 포인트의 임의의 조합에 대한 범위를 나타내는 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정 데이터 포인트 "10" 및 특정 데이터 포인트 15가 개시되는 경우, 10 및 15 초과, 이상, 미만, 이하, 및 그 값이 개시될뿐만 아니라 10 내지 15인 것으로 간주되는 것으로 이해된다. 또한 2개의 특정 단위 사이의 각 단위가 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 개시되는 경우, 11, 12, 13, 및 14는 또한 개시된다.
35. 본원 및 하기 청구범위에서, 하기 의미를 갖는 것으로 정의되는 다수의 용어들을 참조할 것이다:
36. "선택적인" 또는 "선택적으로"는, 후속으로 기재된 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있고, 상기 설명이 상기 사건 또는 상황들이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
37. "프라이머"는 일부 유형의 효소적 조작을 지지할 수 있고 효소적 조작이 일어날 수 있을 정도로 표적 핵산과 혼성화할 수 있는 프로브의 하위세트이다. 프라이머는 효소적 조작을 방해하지 않는, 당업계에서 이용가능한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체 또는 유사체의 임의의 조합으로부터 만들어질 수 있다.
38. "프로브"는 예를 들어 혼성화를 통해 전형적으로 서열 특이적 방식으로 표적 핵산과 상호작용할 수 있는 분자이다. 핵산의 혼성화는 당업계에서 잘 이해되고, 본원에서 논의될 것이다. 전형적으로 프로브는 당업계에서 이용가능한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체 또는 유사체의 임의의 조합으로부터 만들어질 수 있다.
39. 특정 RNA를 "암호화하는" DNA 서열은 RNA로 전사된 DNA 핵산 서열이다. DNA 폴리뉴클레오타이드는 단백질로 번역된 RNA (mRNA)를 암호화할 수 있고 (그리고 따라서 DNA 및 mRNA 둘 모두는 단백질을 암호화하거나), 또는 DNA 폴리뉴클레오타이드는 단백질로 번역되지 않은 RNA (예를 들어 tRNA, rRNA, microRNA (miRNA), "비-코딩" RNA (ncRNA), 가이드 RNA, 등)를 암호화할 수 있다.
40. "단백질 코딩 서열" 또는 특정 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은, mRNA (DNA의 경우)로 전사되고 적절한 조절 서열의 통제 하에 놓일 때 시험관내에서 또는 생체내에서 폴리펩타이드로 (mRNA의 경우에) 번역되는 핵산 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5' 말단 (N-말단)의 시작 코돈 및 3' 말단 (C -말단)의 번역 정지 넌센스 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은, 비제한적으로, 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 원핵 또는 진핵 DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 합성 핵산을 포함할 수 있다. 전사 종결 서열은 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다.
41. 핵산, 폴리펩타이드, 세포, 또는 유기체에 적용되는 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "자연 발생" 또는 "비변형된" 또는 "야생형"은, 자연에서 발견되는 핵산, 폴리펩타이드, 세포, 또는 유기체를 지칭한다. 예를 들어, 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 유기체 (바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 야생형 (및 자연 발생)이다.
42. 대상체에 대한 투여"는 대상체에게 제제를 도입하거나 전달하는 임의의 경로를 포함한다. 투여는 경구, 국소, 정맥내, 피하, 경피, 경피, 근육내, 관절내, 비경구, 세동맥내, 진피내, 심실내, 두개내, 복강내, 병소내, 비강내, 직장, 질, 흡입에 의해, 주입(implanted) 저장소를 통해, 비경구 (예를 들어, 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 복강내, 간내, 병소내, 및 두개내 주사 또는 인퓨전 기술) 등을 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "동반 투여", "조합 투여", "동시 투여" 또는 "동시에 투여된"은, 화합물이, 동일한 시점에 또는 본질적으로 서로 즉시 투여됨을 의미한다. 후자의 경우에, 2종의 화합물은, 관측된 결과가 화합물이 동일한 시점에 투여될 때 달성된 것과 구별할 수 없을 정도로 충분히 가까운 시간에 투여된다. "전신 투여"는 예를 들어 순환계 또는 림프계로의 진입을 통해 대상체의 신체의 광범위한 영역 (예를 들어 신체의 50% 초과)에 제제를 도입하거나 전달하는 경로를 통해 제제를 대상체에게 도입하거나 전달하는 것을 지칭한다. 반대로, "국소 투여"는 투여 지점에 바로 인접한 영역 또는 영역에 제제를 도입하거나 전달하고 치료적으로 상당한 양으로 제제를 전신으로 도입하지 않는 경로를 통해 제제를 대상체에게 도입하거나 전달하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 국소적으로 투여된 제제는 투여 지점의 국소 부근에서 용이하게 검출가능하지만, 대상체의 신체의 원위부에서 검출불가능하거나 무시할만한 양으로 검출가능하다. 투여는 자가-투여 및 다른 것에 의한 투여를 포함한다.
43. 제제의 "유효량"은 원하는 효과를 제공하기 위한 제제의 충분한 양을 지칭한다. "효과적인" 제제의 양은 많은 인자 예컨대 대상체의 연령 및 일반적인 병태, 특정 제제 또는 제제, 등에 따라 대상체마다 다를 것이다. 따라서, 정량화된 "유효량"을 항상 지정할 수 있는 것은 아니다. 그러나, 임의의 대상체 경우에서 적절한 "유효량"은 통상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, 그리고 이와 달리 구체적으로 언급되지 않으면, 제제의 "유효량"은 또한 치료적 유효량 및 예방적 유효량 둘 모두를 포괄하는 양을 지칭할 수 있다. 치료 효과를 달성하는데 필요한 제제의 "유효량"은 인자 예컨대 대상체의 연령, 성별, 및 체중에 따라 변할 수 있다. 투약 레지멘은 최적의 치료적 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 몇 개의 분할 용량은 매일 투여될 수 있거나 용량은 치료적 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례하여 감소될 수 있다.
44. "약제학적으로 허용가능한" 성분은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 성분을 지칭할 수 있고, 즉, 성분은 본 발명의 약제학적 제형에 혼입되고 상당한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않거나 함유된 제형의 다른 성분 중 임의의 것과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 본원에서 기재된 바와 같이 대상체에게 투여될 수 있다. 인간에게 투여하는 것과 관련하여 사용될 때, 상기 용어는, 성분이 독성 및 제조 시험의 필수 표분을 충족했거나 미국 식약청(U.S. Food and Drug Administration)에 의해 준비된 불활성 성분 가이드에 포함되어 있음을 일반적으로 암시한다.
45. "약제학적으로 허용가능한 담체" (때때로 "담체"로 칭함)는 일반적으로 안전하고 무독성인 약제학적 또는 치료적 조성물을 제조하는데 유용한 담체 또는 부형체를 의미하고, 수의과 및/또는 인간 약제학적 또는 치료 용도로 허용가능한 담체를 포함한다. 용어들 "담체" 또는 "약제학적으로 허용가능한 담체"는, 비제한적으로, 포스페이트 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼 (예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀젼) 및/또는 다양한 유형의 습윤제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "담체"는, 비제한적으로, 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충액, 안정화제, 가용화제, 지질, 안정화제, 또는 약제학적 제형에서 사용하기 위해 당해 분야에서 잘 알려져 있고 본원에 추가로 기재된 바와 같은 다른 물질을 포괄한다.
46. "약리적 활성" 유도체 또는 유사체에서와 같이 "약리적 활성" (또는 간단히 "활성")은 모 화합물과 동일한 유형의 약리학적 활성을 가지며 정도가 거의 동등한 유도체 또는 유사체 (예를 들어, 염, 에스테르, 아미드, 콘주게이트, 대사물, 이성질체, 단편, 등)를 지칭할 수 있다.
47. "치료제"는 유익한 생물학적 효과를 갖는 임의의 조성물을 지칭한다. 유익한 생물학적 효과는 치료 효과, 예를 들어, 장애 또는 다른 바람직하지 않은 생리 상태의 치료, 및 예방 효과, 예를 들어, 장애 또는 다른 바람직하지 않은 생리 상태 (예를 들어, 비-면역원성 암)의 예방 둘 모두를 포함한다. 상기 용어들은 또한 염, 에스테르, 아미드, 프로에이전트(proagent), 활성 대사물, 이성질체, 단편, 유사체, 등을 비제한적으로 포함하는 본원에 구체적으로 언급된 유익한 제제의 약제학적으로 허용가능한, 약리적 활성 유도체를 포괄한다. 용어 "치료제"가 사용되는 경우 또는 특정 제제가 구체적으로 확인되는 경우, 용어가 제제 자체뿐만 아니라 약제학적으로 허용가능한, 약리적으로 활성 염, 에스테르, 아미드, 프로에이전트, 콘주게이트, 활성 대사물, 이성질체, 단편, 유사체, 등을 포함하는 것으로 이해해야 한다.
48. 조성물 (예를 들어 제제를 포함하는 조성물)의 "치료 유효량" 또는 "치료적으로 효과적인 용량"은 원하는 치료 결과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 원하는 치료 결과는 I형 당뇨병의 통제이다. 일부 구현예에서, 원하는 치료 결과는 비만의 통제이다. 주어진 치료제의 치료 유효량은 전형적으로 치료되고 있는 장애 또는 질환의 유형 및 중증도 및 대상체의 연령, 성별, 및 체중과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 상기 용어는 또한 원하는 치료 효과, 예컨대 통증 완화를 촉진하는데 효과적인 치료제의 양, 또는 치료제의 전달 속도 (예를 들어, 경시적인 양)을 지칭할 수 있다. 정확한 원하는 치료 효과는 치료될 병태, 대상체의 내성, 투여될 제제 및/또는 제제 제형 (예를 들어, 치료제의 효력, 제형 중 제제의 농도, 등), 및 당업자에게 인정되는 다양한 다른 인자에 따라 달라질 것이다. 일부 사례에서, 원하는 생물학적 또는 의료 반응은 수일, 수주, 또는 수년의 기간에 걸쳐 대상체에게 조성물의 다중 투약량의 투여 다음에 달성된다.
49. 본원 전체에 걸쳐, 다양한 공보가 언급된다. 전체에서 이들 공보의 개시내용은 본원이 속하는 기술의 상태를 더 충분히 설명하기 위해 본원에 참고로 편입되어 있다. 개시된 참조문헌은, 또한 참조문헌이 의존하는 문장에서 논의되는 그 안에 포함된 자료에 대해 개별적으로 그리고 구체적으로 본원에 참고로 편입되어 있다.
B. NK 세포를 유전자 변형시키는 방법
50. NK 세포를 플라스미드로 유전적으로 재프로그래밍하는 것은 실질적인 절차-관련된 NK 세포 아폽토시스 및 유전자 조작된 NK 세포의 제한된 생성을 유발하는 렌티바이러스 및 레트로바이러스 형질도입과 같은 DNA 의존 방식으로 전이유전자 전달의 어려움으로 인해 항상 도적적이었다. NK 세포를 재프로그래밍하기 위해 (즉, 조작하거나 변형시키기 위해) 엔도뉴클레아제 리보핵단백질 복합체 (예컨대, Cas9/RNP)를 이용하여 일차 및 확장된 인간 NK 세포의 DNA 없는 게놈 편집을 사용하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
51. 엔도뉴클레아제/RNP (예를 들어, Cas9/RNP)는, CRISPR 유전자좌와 복합체화된 재조합 엔도뉴클레아제 단백질 (예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제)의 3가지 성분이 포함된다. CRISPR 유전자좌에 복합체화된 엔도뉴클레아제는 CRISPR/Cas 가이드 RNA로 칭할 수 있다. CRISPR 유전자좌는 표적 서열 복합체화된 상보적 반복 RNA (crRNA) 및 트랜스 상보적 반복 RNA (tracrRNA)와 복합체화된 표적 서열에 혼성화할 수 있는 RNA가 포함된 합성 단일-가이드 RNA (gRNA)을 포함한다. 따라서 CRISPR/Cas 가이드 RNA는 세포의 게놈 DNA 내의 표적 서열에 혼성화된다. 일부 경우에, 부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제는 유형 II CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 경우에, 부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 폴리펩타이드이고, 그리고 상응하는 CRISPR/Cas 가이드 RNA는 Cas9 가이드 RNA이다. 이들 Cas9/RNP는 기능성 복합체로서 전달되기 때문에 외부 DNA-의존적 접근법에 비해 더 높은 효율로 게놈 표적을 절단할 수 있다. 추가로, 세포로부터 Cas9/RNP의 신속한 청소능은 표적외 효과 예컨대 아폽토시스의 유도를 감소시킬 수 있다. 따라서, 일 측면에서, NK 세포를 유전자 변형시키는 방법이 본원에 개시되어 있되, 상기 방법은 상기 NK 세포에서 표적 DNA 서열에 대해 특이적인 가이드 RNA (gRNA)를 얻는 단계; 및 b) 상기 표적 NK 세포에, NK 세포의 게놈 DNA 내의 표적 서열에 혼성화되는 상응하는 CRISPR/Cas 가이드 RNA와 복합체화된 부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 (Cas9)를 포함하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 형질도입하는 단계 (예를 들어, 전기천공을 통해 도입하는 단계)를 포함한다.
52. Cas9 뉴클레아제 활성을 표적 부위로 표적화하고 또한 공여자 플라스미드 공여자 전이유전자의 숙주 DNA로의 재조합을 허용하기 위해, crispr RNA (crRNA)가 사용되는 것으로 이해되고 본원에서 고려된다. 일부 경우에 crRNA는 tracrRNA와 조합되어 가이드 RNA (gRNA)를 형성한다. 개시된 플라스미드는 전이유전자의 통합을 위한 표적 부위로서 AAVS1로 지칭되는 인간 염색체 19 상의 AAV 통합, 단백질 포스파타제 1의 인트론 1, 조절 서브유닛 12C (PPP1R12C) 유전자를 사용한다. 상기 유전자좌는 "세이프 하버 유전자(safe harbor gene)"이고, 그리고 많은 세포 유형에서 안정한, 장기간 전이유전자 발현을 허용한다. PPP1R12C의 파괴는 임의의 알려진 질환과 관련이 없기 때문에, AAVS1 유전자좌는 전이유전자 표적화를 위한 안전한-하버로 종종 간주된다. AAVS1 부위는 표적 위치로서 사용되고 있기 때문에, CRSPR RNA (crRNA)는 상기 DNA를 표적으로 해야 한다. 여기서, 개시된 플라스미드에 사용된 가이드 RNA는 GGGGCCACTAGGGACAGGAT (서열번호: 9) 또는 임의의 10개의 뉴클레오타이드 센스 또는 이의 안티센스 인접 단편을 포함한다. AAVS1이 본원에서 예시적인 목적을 위해 사용되지만, 다른 "세이프 하버 유전자"는 동등한 결과로 사용될 수 있고 형질감염되고 있는 특정 세포 유형 또는 전이유전자가 주어지면 더 적절하다면 AAVS1로 대체될 수 있는 것으로 이해되고 본원에서 고려된다. 다른 세이프 하버 유전자의 예는, 비제한적으로 C-C 케모카인 수용체 유형 5 (CCR5), ROSA26 유전자좌, 및 TRAC를 포함한다.
53. 상기 표적 게놈에 전달되는 공여자 전이유전자 작제물 크기에 대한 크기 제한이 있을 수 있는 것으로 이해되고 본원에서 고려된다. 전이유전자의 허용가능한 크기를 증가시키는 하나의 방법은 합성 Cas9, 또는 상이한 박테리아 공급원으로부터의 Cas9에 전형적으로 사용된 스트렙토코쿠스 파이오제네스의 Cas9 (SpCas9)를 교환하여 추가 공간을 만드는 것이다. Cas9의 치환은 또한 표적화 특이성을 증가시키기 위해 사용될 수 있어서, 더 적은 gRNA가 사용될 필요가 있다. 따라서, 예를 들어, Cas9는 스타필로코쿠스 아우레스 (SaCas9), 악시다미노코쿠스 종 (AsCpf1), 라크노스피라카세 박테리움 (LbCpf1), 나이세리아 메닌기티디스 (NmCas9), 스트렙토코쿠스 써모필루스 (StCas9), 캄필로박터 제주니 (CjCas9), 향상된 SpCas9 (eSpCas9), SpCas9-HF1, Fokl-융합된 dCas9, 확장된 Cas9 (xCas9), 및/또는 촉매적으로 죽은 Cas9 (dCas9)로부터 유래될 수 있다.
54. 특정 Cas9의 사용은, Cas9 엔도뉴클레아제 (또는 대안)이 표적을 스크리닝하기 위해 사용되는 PAM 서열을 변화시킬 수 있는 것이 이해되고 본원에서 고려된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 적합한 PAM 서열은 NGG (SpCas9 PAM) NNGRRT (SaCas9 PAM) NNNNGATT (NmCAs9 PAM), NNNNRYAC (CjCas9 PAM), NNAGAAW (St), TTTV (LbCpf1 PAM 및 AsCpf1 PAM); TYCV (LbCpf1 PAM 변이체 및 AsCpf1 PAM 변이체)을 포함하되; N은 임의의 뉴클레오타이드일 수 있고; V = A, C, 또는 G; Y = C 또는 T; W = A 또는 T; 및 R = A 또는 G.
55. RNP 복합체를 만들기 위해, crRNA 및 tracrRNA는 5분 동안 95C에서 약 50 μM 내지 약 500μM (예를 들어, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 35, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500μM), 바람직하게는 100 μM 내지 약 300 μM, 가장 바람직하게는 약 200 μM의 1:1, 2:1, 또는 1:2 비의 농도로 혼합되어 crRNA:tracrRNA 복합체 (즉, 가이드 RNA)를 형성할 수 있다. crRNA:tracrRNA 복합체는 그 다음 약 20μM 내지 약 50μM (예를 들어 21, 22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 48, 49, 또는 50μM) 최종 희석의 Cas 엔도뉴클레아제 (예컨대, Cas9)와 혼합될 수 있다.
56. 표적 세포의 표적 서열에 결합되면, CRISPR 유전자좌는 이종성 DNA 단편 (예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오타이드)의 삽입에 의해, 내인성 DNA 단편의 결실에 의해, 내인성 DNA 단편의 역전 또는 전좌에 의해, 또는 이들의 조합에 의해 하나 이상의 염기쌍의 표적 DNA 삽입 또는 결실에 도입함으로써 게놈을 변형시킬 수 있다. 따라서, 개시된 방법은 상동성 재조합을 위해 DNA와 조합될 때 녹아웃(knock-out) 또는 녹인(knock-in)을 생성하는데 사용될 수 있다. Cas9/RNP의 전기 천공을 통한 형질 도입은 NK 세포에서 유전자 변형의 이전 제약을 극복하는 쉽고 상대적으로 효율적인 방법이라는 것이 본원에서 보여진다.
57. 개시된 방법은 천연 살해 세포 (NK 세포), T 세포, B 세포, 대식세포, 섬유모세포, 골모세포, 간세포, 신경 세포, 상피 세포, 및/또는 근육 세포를 포함하는 임의의 세포 유형과 함께 이용될 수 있음이 이해되고 본원에서 고려된다. 인간 NK 세포는 CD56 또는 CD16의 발현 및 T 세포 수용체 (CD3)의 부재에 의해 정의되는 말초 혈액 림프구의 하위세트이다. NK 세포는 주요 조직호환성 복합체 (MHC)-부류 I 분자가 결여된 표적 세포를 감지하고 사멸시킨다. NK 세포 활성화 수용체는, 그 중에서도, 천연 세포독성 수용체 (NKp30, NKp44 및 NKp46), 및 렉틴-유사 수용체 NKG2D 및 DNAM-1을 포함한다. 그것의 리간드는 스트레스 받은, 형질전환된, 또는 감염된 세포 상에서 발현되지만, 정상 세포에서는 발현되지 않아, 정상 세포가 NK 세포 사멸에 내성이 있게 한다. NK 세포 활성화는 억제 수용체, 예컨대 살해 면역글로불린 (Ig)―유사 수용체 (KIR), NKG2A /CD94, TGFβ, 및 백혈구 Ig-유사 수용체-1 (LIR-1)를 통해 음성적으로 조절된다. 일 측면에서, 표적 세포는 공여자 공급원 (예컨대, 양자 전이(adoptive transfer) 요법을 위한 동종이계 공여자 공급원 또는 자가 공여자 공급원 (즉, 변형된 NK 세포의 최종 수령자), NK 세포주 (NK RPMI8866; HFWT, K562, 및 EBV-LCL을 비제한적으로 포함)로부터, 또는 일차 NK 세포 공급원 또는 NK 세포주로부터 유래된 확장된 NK 세포의 공급원으로부터 일차 NK 세포일 수 있다.
58. NK 세포의 형질도입 전에, NK 세포는 NK 세포의 증식에 적합한 배지에서 인큐베이션될 수 있다. 배양 조건은 사이토카인, 항체, 및/또는 피더 세포의 첨가를 포함할 수 있는 것으로 이해되고 본원에서 고려된다. 따라서, 일 측면에서, NK 세포를 유전자 변형시키는 방법이 개시되어 있되, 상기 방법은 NK 세포의 증식을 지지하는 배지에서 세포를 배양하기 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 동안에 NK 세포를 인큐베이팅하는 것을 추가로 포함하되; 상기 배지는 사이토카인, 항체, 및/또는 피더 세포를 추가로 포함한다. 예를 들어, 배지는 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, 및/또는 IL-21을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 배지는 또한 항-CD3 항체를 포함할 수 있다. 일 측면에서, 피더 세포는 NK 세포를 자극하는 피더 세포로부터 정제될 수 있다. 본원에 개시된, 청구된 발명에서 사용하기 위한 NK 세포 자극 피더 세포는, 조사된 자가 또는 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 비조사된 자가 또는 PBMC; RPMI8866; HFWT, K562; 멤브레인 결합된 IL-15, 및 41BBL, 또는 IL-21 또는 이들의 임의의 조합으로 형질감염된 K562 세포; 또는 EBV-LCL일 수 있다. 일부 측면에서, NK 세포는 IL-21, IL-15, 및/또는 41BBL의 용액과 조합하여 제공된 피더 세포이다. 피더 세포는 1:2, 1:1, 또는 2:1 비로 NK 세포의 배양물에서 씨딩될 수 있다. 배양 기간은 전기청공 후 1 내지 14 일 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14 일), 바람직하게는 3 내지 7 일, 가장 바람직하게는 4 내지 6 일일 수 있는 것으로 이해되고 본원에서 고려된다.
59. 일차 NK 세포 및 확장된 NK 세포에 대한 인큐베이션 조건은 상이할 수 있는 것으로 이해되고 본원에서 고려된다. 일 측면에서, 전기천공 전의 일차 NK 세포의 배양은 5일 미만 (예를 들어 1, 2, 3, 또는 4일) 동안 배지 및 사이토카인 (예컨대, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, 및/또는 IL-21) 및/또는 항-CD3 항체를 포함한다. 확장된 NK 세포에 대해, 배양은 사이토카인 (예컨대, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, 및/또는 IL-21) 및/또는 항-CD3 항체에 추가하여 또는 그 대신에 (예를 들어, 1:1 비로) NK 피더 세포의 존재에서 일어날 수 있다. 확장된 NK 세포의 배양은 형질도입 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 동안 일어날 수 있다. 따라서, 일 측면에서, NK 세포를 유전자 변형시키는 방법이 개시되어 있되, 상기 방법은 전기천공 전 IL-2의 존재에서 4일 동안 일차 NK 세포를 인큐베이팅하거나, 또는 전기천공 전 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60 시간, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 동안 피더 세포의 존재에서 확장된 NK 세포를 인큐베이팅하는 것을 포함한다.
60. 개시된 방법에서 NK 세포를 변형시키기 위한 형질도입 방법이 제한되는 것으로 이해되고 본원에서 고려된다. 그것의 면역 기능으로 인해, NK 세포는 바이러스 및 박테리아 벡터 및 상기 벡터에 의한 NK 세포 아폽토시스의 유도에 내성이다. 따라서, 본 발명 이전에 NK 세포의 CRISPR/Cas 변형은 성공적이지 못하였다. 바이러스 벡터의 문제를 피하기 위해, 개시된 방법은 전기천공을 사용하여 표적 NK 세포를 형질전환시킨다. 전기천공은 전기장이 세포에 인가되어 세포막의 투과성을 증가시키는 기술이다. 전기 파일의 적용은 세포막을 가로질러 하전된 분자, 예컨대 핵산을 끌어당기는 멤브레인을 가로질러 전하 구배를 유발한다. 따라서, 일 측면에서, NK 세포를 유전자 변형시키는 방법이 개시되어 있되, 상기 방법은 상기 NK 세포에서 표적 DNA 서열에 대해 특이적인 가이드 RNA (gRNA)를 얻는 단계; 및 b) NK 세포의 게놈 DNA 내의 표적 서열에 혼성화되는 상응하는 CRISPR/Cas 가이드 RNA와 복합체화된 부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 (Cas9)를 포함하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체를, 표적 NK 세포에 전기천공을 통해 도입하는 단계를 포함한다.
61. NK 세포의 형질도입 (예를 들어, 전기천공) 다음에, 현재 변형된 NK 세포는 변형된 NK 세포를 자극하는 피더 세포를 포함하는 배지에서 증식될 수 있다. 따라서, 변형 세포는 생존력 및 증식 잠재력을 보유하는데, 그 이유는 조사된 피더 세포를 사용하여 전기천공 후 확장될 수 있기 때문이다. 본원에 개시된, 청구된 발명에서 사용하기 위한 NK 세포 자극 피더 세포는 조사된 자가 또는 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 비조사된 자가 또는 PBMC; RPMI8866; HFWT, K562; 멤브레인 결합된 IL-15, 및 41BBL, 또는 IL-21 또는 이들의 임의의 조합으로 형질감염된 K562 세포; 또는 EBV-LCL일 수 있다. 일부 측면에서, NK 세포는 IL-21, IL-15, 및/또는 41BBL의 용액과 조합하여 제공된 피더 세포이다. 피더 세포는 1:2, 1:1, 또는 2:1 비로 NK 세포의 배양물에서 씨딩될 수 있다. 배양 기간은 전기천공 후 1 내지 14 일 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14 일), 바람직하게는 3 내지 7 일, 가장 바람직하게는 4 내지 6 일일 수 있는 것으로 이해되고 본원에서 고려된다. 일부 측면에서, 변형된 NK 세포를 배양하기 위한 배지는 사이토카인 예컨대, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, 및/또는 IL-21을 추가로 포함할 수 있다.
62. 일 측면에서, NK 세포를 유전자 변형시키는 개시된 방법의 하나의 목표는 변형된 NK 세포를 생산하는 것으로 이해되고 본원에서 고려된다. 따라서, 개시된 방법에 의해 제조된 변형된 NK 세포가 본원에 개시된다.
63. 전술한 바와 같이, NK 세포 활성화는 억제 수용체, 예컨대 살해 면역글로불린 (Ig)―유사 수용체 (KIR), NKG2A /CD94, TGFβ, 및 백혈구 Ig-유사 수용체-1 (LIR-1)를 통해 음성적으로 조절된다. 하나의 억제 수용체의 결합은 표적 용해를 방지하기에 충분할 수 있다. 따라서 NK 세포는 많은 스트레스-유도된 리간드, 및 몇 개의 MHC 부류 I 리간드를 발현시키는 표적 세포를 효율적으로 표적화한다. TGFβ는 NK 세포의 활성화 및 기능을 억제하는 주요 면역억제 사이토카인이다. 따라서, 유리한 NK 세포의 한 변형은 억제 수용체, 예컨대 살해 면역글로불린 (Ig)―유사 수용체 (KIR), NKG2A /CD94, TGFβ, 및 백혈구 Ig-유사 수용체-1 (LIR-1)의 억제이고, 따라서 NK 세포의 음성 조절이 억제될 것으로 이해되고 본원에서 고려된다. 그와 같은 변형 세포는 NK 세포의 첨가로 치료될 수 있는 임의의 질환 또는 병태의 면역요법에 매우 유용할 것이다. 따라서, 일 측면에서, 형질전환 성장 인자―β 수용체 2 (TGFBR2) 또는 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1 (HPRT1)을 암호화하는 유전자의 녹아웃을 포함하는 유전자 변형된 NK 세포가 본원에 개시되어 있다.
64. 본 개시내용 전반에 걸쳐 언급된 바와 같이, 개시된 변형된 NK 세포는 변형된 (즉, 조작된 NK 세포를 필요로 하는 대상체로의 양자 전이와 같은 면역요법에서 사용하기에 이상적으로 적합하다. 따라서, 일 측면에서, 필요로 하는 대상체에게 조작된 NK 세포를 양자 전이시키는 방법이 본원에 개시되어 있되, 상기 방법은 a) 변형될 표적 NK 세포를 얻는 단계; b) 표적 DNA 서열에 대해 특이적인 gRNA를 얻는 단계; c) 상기 조작된 NK 세포를 생성하는 표적 NK 세포의 게놈 DNA 내의 표적 서열에 혼성화되는 상응하는 CRISPR/Cas gRNA와 복합체화된 부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 (Cas9)를 포함하는 RNP 복합체를, 상기 표적 NK 세포에 전기천공을 통해 도입하는 단계; 및 d) 상기 조작된 NK 세포를 상기 대상체로 전이시키는 단계를 포함한다.
65. 일 측면에서, 개시된 면역요법 방법에 사용된 변형된 NK 세포는 공여자 공급원 (예컨대, 양자 전달 요법을 위한 동종이계 공여자 공급원 또는 자가 공여자 공급원 (즉, 변형된 NK 세포의 최종 수령자), NK 세포주 (NK RPMI8866; HFWT, K562, 및 EBV-LCL을 비제한적으로 포함), 또는 일차 NK 세포 공급원 또는 NK 세포주로부터 유래된 확장된 NK 세포의 공급원으로부터 일차 NK 세포일 수 있다. 일차 NK 세포가 사용될 수 있기 때문에, NK 세포의 개시된 변형은 생체외 또는 시험관내 일어날 수 있는 것으로 이해되고 본원에서 고려된다.
66. NK 세포의 형질도입 다음에, 변형된 NK 세포는 변형된 (즉, 조작된) NK 세포를 대상체에게 투여하기 전에 확장되고 자극될 수 있다. 예를 들어, NK 세포를 필요로 하는 대상체에게 양자 전이시키는 방법이 본원에 개시되어 있되, 상기 NK 세포는 상기 대상체에게 투여하기 전에 조사된 mbIL-21 발현 피더 세포로 확장된다. 일부 측면에서, 변형된 (즉, 조작된) NK 세포의 자극 및 확장은 상기 대상체에게 변형된 NK 세포를 투여하기 전에 또는 투여함과 동시에 생체내에서 생길 수 있는 것으로 이해되고 본원에서 고려된다. 따라서 면역요법 방법이 본원에 개시되어 있되, 상기 NK 세포는 IL-21 또는 조사된 mbIL-21 발현 피더 세포의 투여를 통해 상기 대상체로 NK 세포의 이식 다음에 대상체에서 확장된다.
67. TGFβ 경로를 표적화하는 것이 면역 세포 기능을 증가시킬 수 있는 것으로 지적되어 왔다. TGFβ에 결합하는 TGBR2 엑토도메인을 암호화하는 영역이 표적화되었다. 대표적인 결과는 이 유전자의 mRNA 발현 수준의 상당한 감소를 보여주고, 그리고 변형된 NK 세포가 TGFβ에 내성을 갖게 됨을 추가로 입증한다. 따라서, RNP 복합체가 TGFRB2 또는 HPRT1 유전자를 표적화하는 면역요법 방법이 본원에 개시되어 있다.
68. 개시된 변형된 NK 세포 및 변형된 NK 세포의 양자 전달 방법이 암에 대한 효과적인 면역요법일 수 있는 것으로 이해되고 본원에서 고려된다. 개시된 방법 및 조성물은 통제되지 않는 세포 증식이 일어나는 임의의 질환 예컨대 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상이한 유형의 암의 비제한적인 목록은 일반적으로 아래와 같다: 림프종 (호지킨 및 비-호지킨), 백혈병, 암종, 고형 조직의 암종, 편평 세포 암종, 선암종, 육종, 신경아교종, 고등급 신경아교종, 모세포종, 신경교세포종, 형질세포종, 조직구종, 흑색종, 샘종, 저산소성 종양, 골수종, AIDS-관련된 림프종 또는 육종, 전이암, 또는 암.
69. 개시된 조성물이 치료하기 위해 사용될 수 있는 암의 대표적이지만 비제한적인 목록은 다음과 같다: 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 균상식육종, 호지킨 질환, 골수성 백혈병, 방광암, 뇌암, 신경계 암, 두경부 암, 부경부의 편평 세포 암종, 폐암 예컨대 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암, 신경교세포종/교모세포종, 난소암, 피부암, 간암, 흑색종, 입, 목, 후두, 및 폐의 편평 세포 암종, 자궁경부암, 자궁경부 암종, 유방암, 및 상피 암, 신장암, 비뇨생식 암, 폐암, 식도 암종, 두경부 암종, 대장암, 조혈 암; 고환암; 결장암, 직장암, 전립선 암, 또는 췌장 암. 따라서, 일 측면에서, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 개시되어 있되, 상기 방법은 TGFBR2 유전자의 녹아웃을 포함하도록 변형된 NK 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
70. 본원에서 사용된 바와 같은 "치료하다", "치료하는", "치료" 및 이의 문법적 변동은, 하나 이상의 질환 또는 병태의 강도 또는 빈도, 질환 또는 병태의 증상, 또는 질환 또는 병태의 근본적인 원인을 부분적으로 또는 완전히 예방하고(preventing), 지연시키고(delaying), 치료하고(curing), 치유하고(healing), 완화시키고(alleviating), 경감시키고(relieving), 변경시키고(altering), 구제하고(remedying), 개선하는(ameliorating), 향상시키고(improving), 안정화시키고(stabilizing), 경감(mitigating)시키고/거나 감소시키는 의도 또는 목적을 갖는 조성물의 투여를 포함한다. 본 발명에 따른 치료는 방지하여, 예방적으로, 완화적으로 또는 치료적으로 적용될 수 있다. 예방적 치료는 발병 전 (예를 들어, 암의 명백한 징후 전), 조기 발병 동안에 (예를 들어, 암의 초기 징후 및 증상에 따라), 또는 확립된 암 발달 후 대상체에게 투여된다. 예방적 투여는 감염 증상의 징후 전 며칠 내지 몇 년 동안 일어날 수 있다.
1. 혼성화/선택적 혼성화
71. 용어 혼성화는 전형적으로 적어도 2개의 핵산 분자, 예컨대 프라이머 또는 프로브와 유전자 사이의 서열 유도 상호작용을 의미한다. 서열 유도된 상호작용은 뉴클레오타이드 특이적 방식으로 2개의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 또는 뉴클레오타이드 유도체 사이에서 일어나는 상호작용을 의미한다. 예를 들어, C와 또는 T와 상호작용하는 G는 서열 유도된 상호작용이다. 전형적으로 서열 유도된 상호작용은 뉴클레오타이드의 산-크릭 면 또는 후그스트 면 상에서 일어난다. 2개의 핵산의 혼성화는 당업자에게 공지된 다수의 조건 및 파라미터에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 반응의 염 농도, pH, 및 온도는 모두 2개의 핵산 분자가 혼성화되는지에 영향을 미친다.
72. 2개의 핵산 분자 사이의 선택적 혼성화에 대한 파라미터는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 선택적 혼성화 조건은 엄격한 혼성화 조건으로서 정의될 수 있다. 예를 들어, 혼성화의 엄격성은 혼성화 및 세정 단계 중 하나 또는 둘 모두의 온도 및 염 농도 둘 다에 의해 제어된다. 예를 들어, 선택적 혼성화를 달성하기 위한 혼성화 조건은 Tm (분자의 절반이 혼성화 파트너로부터 해리되는 용융 온도)보다 약 12 내지 25 ℃ 낮은 온도에서 높은 이온 강도 용액 (6X SSC 또는 6X SSPE) 중에서의 혼성화 후, 세정 온도가 Tm보다 약 5 ℃ 내지 20 ℃ 낮도록 선택된 온도 및 염 농도의 조합으로 세정하는 것을 수반할 수 있다. 온도 및 염 조건은 필터 상에 고정된 참조 DNA의 샘플이 관심 있는 표지된 핵산에 혼성화되고, 다른 엄격성의 조건 하에 세정되는 예비 실험에서 경험적으로 쉽게 결정된다. 혼성화 온도는 전형적으로 DNA-RNA 및 RNA-RNA 혼성화의 경우 더 높다. 조건은 엄격성을 달성하기 위해 상기 기재된 바와 같이, 또는 당업계에 알려져 있는 바와 같이 사용될 수 있다. DNA:DNA 혼성화에 대한 바람직한 엄격한 혼성화 조건은 6X SSC 또는 6X SSPE에서 (수용액 중에서) 약 68℃일 수 있고, 이어서 68℃에서 세정할 수 있다. 혼성화 및 세정의 엄격성은, 원한다면, 원하는 상보성의 정도가 감소함에 따라, 그리고 추가로, 가변성이 검색되는 임의의 영역의 G-C 또는 A-T 농도에 따라, 감소될 수 있다. 마찬가지로, 혼성화 및 세정의 엄격성은, 원한다면, 원하는 상동성이 증가함에 따라, 그리고 추가로, 높은 상동성이 요구되는 임의의 영역의 G-C 또는 A-T 농도에 따라, 이에 따라 증가될 수 있으며, 이들 모두는 당업계에 알려져 있다.
73. 선택적 혼성화를 정의하는 다른 방법은 다른 핵산에 결합된 핵산 중 하나의 양(백분율)을 찾는 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 선택적 혼성화 조건은, 제한 핵산의 적어도 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 퍼센트가 비제한적 핵산에 결합될 때일 것이다. 전형적으로, 비제한적 프라이머는 예를 들어, 10 또는 100 또는 1000 배 과잉이다. 이러한 유형의 검정은, 제한 및 비제한 프라이머 둘 모두가 예를 들어, 그것의 kd보다 10 배 또는 100 배 또는 1000 배 낮거나, 또는 핵산 분자 중 하나만 10 배 또는 100 배 또는 1000 배이거나 또는 하나 또는 둘 모두의 핵산 분자는 그것의 kd 초과인 조건 하에서 수행될 수 있다.
74. 선택적 혼성화를 정의하는 또 다른 방법은, 혼성화가 원하는 효소 조작을 촉진하기 위해 요구되는 조건 하에서 효소적으로 조작되는 프라이머의 백분율을 찾는 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 선택적 혼성화 조건은, 프라이머의 적어도 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 퍼센트가 효소적 조작을 촉진하는 조건 하에서 효소적으로 조작되는 경우일 것이며, 예를 들어 효소적 조작이 DNA 연장인 경우, 선택적 혼성화 조건은, 프라이머 분자의 적어도 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 퍼센트가 연장되는 경우일 것이다. 바람직한 조건은 또한 제조자에 의해 제안되거나 또는 조작을 수행하는 효소에 적합한 것으로 당업계에 지시된 것을 포함한다.
75. 상동성과 같이, 2개의 핵산 분자 사이의 혼성화 수준을 결정하기 위한 본원에 개시된 다양한 방법이 존재하는 것으로 이해된다. 이들 방법 및 조건은 2개의 핵산 분자 사이에 상이한 백분율의 혼성화를 제공할 수 있지만, 임의의 방법의 파라미터를 충족시키는 것으로 달리 나타내지 않는 한 충분할 것으로 이해된다. 예를 들어, 80% 혼성화가 필요한 경우 그리고 혼성화가 이들 방법 중 어느 하나에서 필요한 파라미터 내에서 일어나는 한, 본원에 개시된 것으로 간주된다.
76. 당업자는 조성물 또는 방법이 총괄적으로 또는 단독으로 혼성화를 결정하기 위한 이들 기준 중 임의의 하나를 충족시킨다면 본원에 개시된 조성물 또는 방법이라는 것을 이해하는 것으로 이해된다.
2. 핵산
77. 예를 들어 TGFβR2를 암호화하는 핵산, 또는 TGFRβ2 녹아웃을 제조하기 위한 본원에 개시된 임의의 핵산 또는 그의 단편뿐만 아니라 다양한 기능성 핵산을 비롯한, 핵산 기재인 본원에 개시된 다양한 분자가 존재한다. 개시된 핵산은 예를 들어, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체 또는 뉴클레오타이드 대체물로 구성된다. 이들 및 다른 분자의 비-제한적인 예가 본원에서 논의된다. 예를 들어, 벡터가 세포에서 발현되는 경우, 발현된 mRNA는 전형적으로 A, C, G, 및 U로 구성될 것으로 이해된다. 마찬가지로, 예를 들어 안티센스 분자가 예를 들어 외인성 전달을 통해 세포 또는 세포 환경에 도입되는 경우, 안티센스 분자가 세포 환경에서 안티센스 분자의 분해를 감소시키는 뉴클레오타이드 유사체로 구성되는 것이 유리한 것으로 이해된다.
a) 뉴클레오타이드 및 관련 분자
78. 뉴클레오타이드는 염기 모이어티, 당 모이어티 및 포스페이트 모이어티를 함유하는 분자이다. 뉴클레오타이드는 그것의 포스페이트 모이어티 및 당 모이어티를 통해 함께 연결되어 뉴클레오사이드간 연결을 생성할 수 있다. 뉴클레오타이드의 염기 모이어티는 아데닌-9-일 (A), 시토신-1-일 (C), 구아닌-9-일 (G), 우라실-1-일 (U), 및 티민-1-일 (T)일 수 있다. 뉴클레오타이드의 당 모이어티는 리보오스 또는 데옥시리보스이다. 뉴클레오타이드의 포스페이트 모이어티는 5가 포스페이트이다. 뉴클레오타이드의 비-제한적인 예는 3'-AMP (3'-아데노신 일인산염) 또는 5'-GMP (5'-구아노신 일인산염)이다. 당해 분야에서 이용가능하고 본원에서 이용가능한 다양한 유형의 분자가 존재한다.
79. 뉴클레오타이드 유사체는 염기, 당, 또는 포스페이트 모이어티에 대한 일부 유형의 변형을 함유하는 뉴클레오타이드이다. 뉴클레오타이드에 대한 변형은 당해 분야에서 잘 알려져 있고 예를 들어, 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 및 2-아미노아데닌 뿐만 아니라 당 또는 포스페이트 모이어티에서의 변형을 포함한다. 당해 분야에서 이용가능하고 본원에서 이용가능한 다양한 유형의 분자가 존재한다.
80. 뉴클레오타이드 대체물은 뉴클레오타이드와 유사한 기능적 특성을 갖지만, 포스페이트 모이어티, 예컨대 펩타이드 핵산 (PNA)를 함유하지 않는 분자이다. 뉴클레오타이드 대체물은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 휴그스틴(Hoogsteen) 방식으로 핵산을 인식하지만, 포스페이트 모이어티 이외의 모이어티를 통해 함께 연결된 분자이다. 뉴클레오타이드 대체물은 적절한 표적 핵산과 상호작용할 때 이중 나선 유형 구조를 따를 수 있다. 당해 분야에서 이용가능하고 본원에서 이용가능한 다양한 유형의 분자가 존재한다.
81. 예를 들어, 세포 흡수를 향상시키기 위해 다른 유형의 분자(컨쥬게이트)를 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체에 연결시키는 것이 또한 가능하다. 콘주게이트는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체에 화학적으로 연결될 수 있다. 그와 같은 콘주게이트 지질 모이어티 예컨대 콜레스테롤 모이어티를 비제한적으로 포함한다. (Letsinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556). 당해 분야에서 이용가능하고 본원에서 이용가능한 다양한 유형의 분자가 존재한다.
82. 왓슨-크릭 상호작용은 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 또는 뉴클레오타이드 대체물의 왓슨-크릭 면과의 적어도 하나의 상호작용이다. 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 또는 뉴클레오타이드 대체물의 왓슨-크릭 면은 퓨린 기반 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 또는 뉴클레오타이드 대체물의 C2, N1, 및 C6 위치 및 피리미딘 기반 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 또는 뉴클레오타이드 대체물의 C2, N3, C4 위치를 포함한다.
83. 휴그스틴 상호작용은 이중체 DNA의 주요 홈에서 노출되는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 휴그스틴 표에서 일어나는 상호 작용이다. 휴그스틴 면은 퓨린 뉴클레오타이드의 N7 위치 및 C6 위치에서 반응성 기 (NH2 또는 O)를 포함한다.
b) 서열
84. 본원에 개시된 신호전달 경로에 관여된 단백질 분자와 관련된 다양한 서열, 예를 들어 TGFβR2가 존재하며, 이들 모두는 핵산에 의해 코딩되거나 핵산이다. 이들 유전자의 인간 유사체, 뿐만 아니라 다른 유사체, 및 이들 유전자의 대립유전자, 및 스플라이스 변이체 및 다른 유형의 변이체에 대한 서열은, 유전자은행을 비롯한 다양한 단백질 및 유전자 데이터베이스에서 이용가능하다. 당업자는 서열 미스매치 및 차이를 해결하고 특정 서열과 관련된 조성물 및 방법을 다른 관련 서열로 조정하는 방법을 이해한다. 프라이머 및/또는 프로브는 본원에 개시되고 당업계에서 알려진 정보가 주어진 임의의 주어진 서열에 대해 설계될 수 있다.
c) 프라이머 및 프로브
85. 개시된 핵산, 예컨대 본원에서 개시된 바와 같은 TGFβR2 및/또는 HPRT1과 상호작용할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서 프라이머는 DNA 증폭 반응을 지지하는데 사용된다. 전형적으로, 프라이머는 서열 특이적 방식으로 연장될 수 있을 것이다. 서열 특이적 방식의 프라이머 확장은 프라이머가 혼성화되거나 달리 회합된 핵산 분자의 서열 및/또는 조성물이 프라이머의 확장에 의해 생성된 생성물의 조성물 또는 서열을 지시하거나 영향을 미치는 임의의 방법을 포함한다. 따라서 서열 특이적 방식의 프라미어 확장은 PCR, DNA 서열분석, DNA 확장, DNA 중합, RNA 전사, 또는 역전사를 비제한적으로 포함한다. 서열 특이적 방식으로 프라이머를 증폭하는 기술 및 조건이 바람직하다. 특정 구현예에서 프라이머는 DNA 증폭 반응, 예컨대 PCR 또는 직접적인 서열분석에 사용된다. 특정 구현예에서 프라이머는 또한 비-효소적 기술을 사용하여 연장될 수 있는 것으로 이해되고, 예를 들어, 프라이머를 연장시키는데 사용되는 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드는, 서열 특이적 방식으로 프라이머를 연장하도록 화학적으로 반응하도록 변형되는 것으로 이해된다. 전형적으로 개시된 프라이머는 개시된 핵산 또는 핵산의 영역과 혼성화되거나, 또는 상기 프라이머는 핵산의 보체 또는 핵산 영역의 보체와 혼성화된다.
86. 특정 구현예에서 핵산과의 상호작용을 위한 프라이머 또는 프로브의 크기는 프라이머의 원하는 효소적 조작, 예컨대 DNA 증폭 또는 프로브 또는 프라이머의 단순 혼성화를 지지하는 임의의 크기일 수 있다. 전형적인 프라이머 또는 프로브는 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 또는 4000개의 뉴클레오타이드 길이일 것이다.
87. 다른 구현예에서 프라이머 또는 프로브는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 또는 4000개 이하의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
88. TGFβR2 및 HPRT1 유전자에 대한 프라이머는 전형적으로 TGFβR2 및 HPRT1 유전자 또는 완전한 유전자의 영역을 함유하는 증폭된 DNA 생성물을 생산하기 위해 사용될 것이다. 일반적으로, 전형적으로 생성물의 크기는 3, 또는 2 또는 1개의 뉴클레오타이드 내에서 정확하게 결정될 수 있는 크기이다.
89. 특정 구현예에서 이 생성물은 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 또는 4000개의 뉴클레오타이드 길이이다.
90. 다른 구현예에서 생성물은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 또는 4000개 이하의 뉴클레오타이드 길이이다.
3. 발현 시스템
91. 세포에 전달되는 핵산은 전형적으로 발현 조절 시스템을 함유한다. 예를 들어, 바이러스 및 레트로바이러스 시스템 중 삽입된 유전자는 일반적으로 원하는 유전자 산물의 발현을 조절하는데 도움이 되는 프로모터, 및/또는 인핸서를 함유한다. 프로모터는 일반적으로 전사 개시 부위와 관련하여 상대적으로 고정된 위치에 있을 때 기능하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 중합효소 및 전사 인자의 기본적인 상호작용에 필요한 핵심 요소를 함유하고, 그리고 업스트림 요소 및 반응 인자를 함유할 수 있다.
a) 바이러스 프로모터 및 인핸서
92. 포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터 전사를 조절하는 바람직한 프로모터는 다양한 공급원, 예를 들어, 폴리오마, 유인원 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스 및 가장 바람직하게는 사이토메갈로바이러스와 같은 바이러스의 게놈으로부터, 또는 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어 베타 액틴 프로모터로부터 수득될 수 있다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 복제의 SV40 바이러스 기원을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로 편리하게 수득된다 (Fiers 등, Nature, 273: 113 (1978)). 인간 사이토메갈로바이러스의 즉각적인 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로 편리하게 수득된다 (Greenway, P.J. 등, Gene 18: 355-360 (1982)). 물론, 숙주 세포 또는 관련 종으로부터의 프로모터는 또한 본원에서 유용하다.
93. 인핸서는 일반적으로 전사 개시 부위로부터 고정된 거리없이 기능하는 DNA의 서열을 지칭하며 전사 단위에 대해 5' (Laimins, L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)) 또는 3' (Lusky, M.L., 등, Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983))일 수 있다. 또한, 인핸서는 인트론 내에 (Banerji, J.L. 등, Cell 33: 729 (1983)) 뿐만 아니라 코딩 서열 자체 내에 (Osborne, T.F., 등, Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984)) 있을 수 있다. 이들은 일반적으로 그 길이가 10 내지 300 bp이고, 그리고 시스에서 기능한다. 인핸서는 프로모터 근처로부터 전사를 증가시키는 기능을 한다. 인핸서는 또한 종종 전사의 조절을 매개하는 반응 인자를 함유한다. 프로모터는 또한 전사의 조절을 매개하는 반응 인자를 함유할 수 있다. 인핸서는 종종 유전자의 발현 조절을 결정한다. 많은 인핸서 서열이 이제 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, -태아단백 및 인슐린)로부터 알려져 있지만, 전형적으로 일반적인 발현을 위해 진핵 세포 바이러스 로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 바람직한 예는 복제 기원의 후반에 있는 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후반에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서이다.
94. 프로모터 및/또는 인핸서는 광 또는 더 기능을 촉발하는 특정 화학적 사건에 의해 특이적으로 활성화될 수 있다. 시스템은 시약 예컨대 테트라사이클린 및 덱사메타손과 같은 시약에 의해 조절될 수 있다. 또한, 조사, 예컨대 감마 조사, 또는 알킬화 화학요법 약물과 같은 조사에의 노출에 의해 바이러스 벡터 유전자 발현을 향상시키는 방법이 있다.
95. 특정 구현예에서 프로모터 및/또는 인핸서 영역은 전사될 전사 단위의 영역의 발현을 최대화하기 위한 구성적 프로모터 및(또는) 인핸서로서 작용할 수 있다. 특정 작제물에서, 프로모터 및/또는 인핸서 영역은 특정 시간에 특정 유형의 세포에서만 발현되더라도 모든 진핵 세포 유형에서 활성화된다. 이러한 유형의 바람직한 프로모터는 CMV 프로모터 (650개의 염기)이다. 다른 바람직한 프로모터는 SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (전장 프로모터), 및 레트로바이러스 벡터 LTR이다.
96. 모든 특이적 조절 인자가 클로닝되어 흑색종 세포와 같은 특이적 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 발현 벡터를 구축하는데 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 신경교 원섬유성 아세트산 단백질 (GFAP) 프로모터는 신경교 기원의 세포에서 유전자를 선택적으로 발현시키는데 사용되어 왔다.
97. 진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 유핵 세포)에서 사용된 발현 벡터는 mRNA 발현에 영향을 미칠 수 있는 전사의 종결에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 이들 영역은 mRNA 코딩 조직 인자 단백질의 미번역된 부분에서 폴리아데닐레이트화된 분절로서 전사된다. 3' 미번역된 영역 또한 전사 말단 부위. 바람직하게는, 전사 단위는 또한 폴리아데닐화 영역을 함유한다. 이 영역의 하나의 이점은, 전사된 단위가 mRNA처럼 가공되고 수송될 가능성을 증가시킨다는 것이다. 발현 작제물의 폴리아데닐화 신호의 확인 및 사용은 잘 확립되어 있다. 바람직하게는, 상동성 폴리아데닐화 신호는 전이유전자 작제물에서 사용된다. 특정 전사 단위에서, 폴리아데닐화 영역은 SV40 초기 폴리아데닐화 신호로부터 유래되고 약 400개의 염기로 구성된다. 또한 바람직하게는, 전사된 단위는 다른 표준 서열을 단독으로 함유하거나 상기 서열과 조합하여 작제물로부터의 발현 또는 그 안정성을 개선하다.
b) 마커
98. 바이러스 벡터는 마커 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 마커 생성물은 유전자가 세포에 전달되었는지 및 일단 전달되면 발현되는지를 결정하는데 사용된다. 바람직한 마커 유전자는 β-갈락토시다아제를 암호화하는 E. 콜리(E. Coli) lacZ 유전자, 및 녹색 형광 단백질이다.
99. 일부 구현예에서 마커는 선택가능한 마커일 수 있다. 포유동물 세포에 대한 적합한 선택가능한 마커의 예는 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나제, 네오마이신, 네오마이신 유사체 G418, 하이드로마이신, 및 퓨로마이신이다. 그와 같은 선택가능한 마커가 포유동물 숙주 세포로 성공적으로 이식될 때, 형질전환된 포유동물 숙주 세포는 선택적 압력 하에 놓이면 생존할 수 있다. 선택적 레짐(regime)의 2개의 널리 사용된 뚜렷한 범주가 있다. 첫 번째 범주는 세포의 대사, 및 보충 배지와 독립적으로 성장할 수 있는 능력이 부족한 돌연변이체 세포주의 사용을 기반으로 한다. 2개의 예는 다음과 같다: CHO DHFR- 세포 및 마우스 LTK-세포. 이들 세포는 티미딘 또는 하이포잔틴과 같은 영양소의 첨가 없이 성장하는 능력이 결여되어 있다. 이들 세포는 완전한 뉴클레오타이드 합성 경로에 필요한 특정 유전자가 없기 때문에, 누락된 뉴클레오타이드가 보충된 배지에서 제공되지 않으면 생존할 수 없다. 배지를 보충하는 것에 대한 대안은 온전한 DHFR 또는 TK 유전자를 각각의 유전자가 결여된 세포 내로 도입하여, 그것의 성장 요건을 변경하는 것이다. DHFR 또는 TK 유전자로 형질전환되지 않은 개별 세포는 보충되지 않은 배지에서 생존할 수 없을 것이다.
100. 두 번째 범주는 임의의 세포 유형에서 사용되는 선택 체계를 의미하며 돌연변이체 세포주를 사용할 필요가 없는 우성 선택이다. 이들 체계는 전형적으로 숙주 세포의 성장을 억제하기 위해 약물을 사용한다. 신규한 유전자를 갖는 세포는 약물 내성을 운반하는 단백질을 발혀시킬 것이고 선택에서 살아남는다. 그와 같은 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신, (Southern P. 및 Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)), 마이코페놀산, (Mulligan, R.C. 및 Berg, P. Science 209: 1422 (1980)) 또는 하이그로마이신, (Sugden, B. 등, Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985))을 사용한다. 3개의 예는 적절한 약물 G418 또는 네오마이신 (게네티신), xgpt (마이코페놀산) 또는 하이그로마이신, 각각에 대한 내성을 전달하기 위해 진핵생물 제어 하에 박테리아 유전자를 이용한다. 기타는 네오마이신 유사체 G418 및 퓨라마이신을 포함한다.
4. 펩타이드
a) 단백질 변이체
101. 단백질 변이체 및 유도체는 당업자에게 잘 이해되며, 아미노산 서열 변형을 수반할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 변형은 전형적으로 3가지 부류 중 하나 이상에 속한다: 치환형, 삽입 또는 결실 변이체. 삽입은 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 삽입은 통상적으로 아미노 또는 카복실 말단 융합의 삽입보다 더 작은 삽입, 예를 들어, 1 내지 4개의 잔기 정도일 것이다. 실시예에 기재된 것들과 같은 면역원성 융합 단백질 유도체는 시험관내에서 가교결합에 의해 또는 융합을 암호솨하는 DNA로 형질전환된 재조합 세포 배양에 의해 표적 서열에 면역원성을 부여하기에 충분히 큰 폴리펩티드를 융합함으로써 만들어진다. 결실은 단백질 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 특징으로 한다. 전형적으로, 2 내지 6개 이하의 잔기는 단백질 분자 내의 임의의 한 부위에서 결실된다. 이들 변이체는 통상적으로 단백질을 암호화하는 DNA 내의 뉴클레오타이드의 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 제조되어, 변이체를 암호화하는 DNA를 생성시킨 후, 재조합 세포 배양물에서 DNA를 발현시킨다. 알려진 서열을 갖는 DNA내의 사절결정된 부위에서 치환 돌연변이를 제조하기 위한 기술은 잘 알려져 있고, 그 예는 M13 프라이머 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발이다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기이지만, 수많은 상이한 위치에서 한번에 일어날 수 있고; 삽입은 일반적으로 약 1 내지 10개 아미노산 잔기 정도일 것이고; 그리고 결실은 약 1 내지 30개 잔기의 범위일 것이다. 결실 또는 삽입은 바람직하게는 인접한 쌍, 즉 2개의 잔기의 결실 또는 2개의 잔기의 삽입으로 이루어진다. 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 조합은 조합되어 최종 작제물에 도달할 수 있다. 돌연변이는 해독틀 밖으로 서열을 배치해서는 안 되고, 바람직하게는 이차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 만들지 않을 것이다. 치환형 변이체는, 적어도 하나의 잔기가 제거되었고 상이한 잔기가 그 자리에 삽입되는 것이다. 그와 같은 치환은 일반적으로 다음의 표 1 및 2에 따라 행해지고 보존적 치환이라 칭한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
102. 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변화는 표 2의 치환보다 덜 보존적 치환을 선택함으로써, 즉, (a) 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 치환 영역에서 폴리펩타이드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 효과가 더 상당히 상이한 잔기를 선택함으로써 행해진다. 단백질 특성에서 가장 큰 변화를 일으킬 것으로 일반적으로 예상되는 치환은 (a) 친수성 잔기, 예를 들어 세릴 또는 트레오닐이, 소수성 잔기, 예를 들어 류실, 이소류실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐을 위해 (그것에 의해) 치환되거나; (b) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기를 위해 (그것에 의해) 치환되거나; (c) 양전기 측쇄, 예를 들어, 라이실, 아르기닐, 또는 히스티딜을 갖는 잔기가 음전기 잔기, 예를 들어, 글루타밀 또는 아스파르틸을 위해 (그것에 의해) 치환되거나; 또는 (d) 큰 부피의 측쇄, 예를 들어, 페닐알라닌을 갖는 잔기가 측쇄, 예를 들어, 글리신을 갖지 않는 것을 위해 (그것에 의해) 치환되거나, 이 경우에, (e) 황산화 및/또는 당화를 위한 부위의 수를 증가시킴으로써 치환되는 것일 것이다.
103. 예를 들어, 하나의 아미노산 잔기를 생물학적으로 및/또는 화학적으로 유사한 것으로 대체하는 것은 보존적 치환으로서 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 하나의 소수성 잔기를 또 다른 것으로, 또는 하나의 극성 잔기를 또 다른 것으로 대체하는 것이다. 치환은 예컨대, Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr와 같은 조합을 포함한다. 각각의 명시적으로 개시된 서열의 이러한 보존적으로 치환된 변동은 본원에 제공된 모자이크 폴리펩타이드 내에 포함된다.
104. 치환형 또는 결실형 돌연변이유발은 N-당화 (Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-당화 (Ser 또는 Thr)를 위한 부위를 삽입하기 위해 이용될 수 있다. 시스테인 또는 다른 불안정한 잔기의 결실이 또한 바람직할 수 있다. 잠재적인 단백질분해 부위, 예를 들어 Arg의 결실 또는 치환은 예를 들어 염기성 잔기 중 하나를 결실시키거나 또는 하나를 글루타미닐 또는 히스티딜 잔기로 치환시킴으로써 달성된다.
105. 특정 번역후 유도체화는 발현된 폴리펩타이드에 대한 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타미닐 및 아스파르기닐 잔기는 흔히 상응하는 글루타밀 및 아스파릴 잔기로 번역후에 탈아미드화된다. 대안적으로, 이들 잔기는 온화한 산성 조건 하에서 탈아미드화된다. 다른 번역후 변형은 프롤린 및 라이신의 하이드독실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 기의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 o-아미노 기의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]), N-말단 아민의 아세틸화, 그리고 일부 사례에서, C-말단 카복실의 아미드화를 포함한다.
106. 본원에 개시된 단백질의 변이체 및 유도체를 정의하는 한 방법은 특정 공지된 서열에 대한 상동성/동일성의 관점에서 변이체 및 유도체의 정의를 통하는 것으로 이해된다. 언급된 서열에 대해 적어도, 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 상동성을 갖는 본원에 개시된 이들 및 다른 단백질의 변이체가 구체적으로 개시된다. 당업자는 두 단백질의 상동성을 결정하는 방법을 쉽게 이해한다. 예를 들어, 상동성은, 상동성이 가장 높은 수준에 있도록 2개의 서열을 정렬한 후에 계산될 수 있다.
107. 상동성을 계산하는 또 다른 방법은 공개 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 Smith 및 Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)의 로컬 상동성 알고리즘에 의해, Needleman 및 Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)의 유사성 방법 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해 (GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package 내, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 검사에 의해 수행된다.
108. 동일한 유형의 상동성은 예를 들어 Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger 등 Methods Enzymol. 183:281-306, 1989에 개시된 알고리즘에 의해 핵산에 대해 수득될 수 있다.
109. 보존적 돌연변이 및 상동성의 설명이 변이체가 보존적인 돌연변이인 특정 서열에 대해 적어도 70% 상동성을 갖는 구현예와 같은 임의의 조합으로 함께 조합될 수 있는 것으로 이해된다.
110. 본원이 다양한 단백질 및 단백질 서열을 논의함에 따라 이들 단백질 서열을 암호화할 수 있는 핵산이 또한 개시되어 있는 것으로 이해된다. 이는 특정 단백질 서열과 관련된 모든 축퇴 서열, 즉 하나의 특정 단백질 서열을 암호화하는 서열을 갖는 모든 핵산 뿐만 아니라 단백질 서열의 개시된 변이체 및 유도체를 암호화하는 축퇴 핵산을 비롯한 모든 핵산을 포함할 것이다. 따라서, 각각의 특정 핵산 서열이 본원에 기재되지 않을 수 있지만, 각각의 모든 서열이 개시된 단백질 서열을 통해 본원에 사실상 개시되고 기재되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열은 특정 DNA 서열이 유기체 내에서 단백질을 암호화하는 것을 나타내지 않지만, 개시된 단백질의 특정 변이체가 본원에 개시된 경우, 단백질을 암호화하는 알려진 핵산 서열이 또한 알려져 있고 본원에 개시 및 기재된 것으로 또한 이해된다.
111. 개시된 조성물에 혼입될 수 있는 수많은 아미노산 및 펩티드 유사체가 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 표 1 및 표 2에 나타낸 아미노산과 상이한 기능성 치환체를 갖는 수많은 D개 아미노산 또는 아미노산이 있다. 자연 발생 펩타이드의 반대편 입체 이성질체뿐만 아니라 펩타이드 유사체의 입체 이성질체가 개시된다. 이들 아미노산은 tRNA 분자를 선택한 아미노산으로 충전하고, 그리고 부위 특이적 방식으로 유사체 아미노산을 펩타이드 사슬에 삽입하기 위해 예를 들어, 앰버 코돈을 이용하는 유전적 작제물을 조작함으로써 폴리펩타이드 사슬에 용이하게 혼입될 수 있다.
112. 펩타이드와 유사하지만, 천연 펩타이드 연결을 통해 연결되지 않는 분자가 생성될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 또는 아미노산 유사체에 대한 연결기는 CH2NH--, --CH2S--, --CH2--CH2 --, --CH=CH-- (시스 및 트랜스), --COCH2--, --CH(OH)CH2--, 및 --CHH2SO―을 포함할 수 있다(이들 및 기타는 Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468; Hudson, D. 등, Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (--CH2NH--, CH2CH2--); Spatola 등 Life Sci 38:1243-1249 (1986) (--CH H2--S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (--CH--CH--, 시스 및 트랜스); Almquist 등 J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (--COCH2--); Jennings-White 등 Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (--COCH2--); Szelke 등 유럽 출원, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (--CH(OH)CH2--); Holladay 등 Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (--C(OH)CH2--); 및 Hruby Life Sci 31:189-199 (1982) (--CH2--S--)에서 발견될 수 있고; 이들 각각은 본원에 참고로 편입되어 있다. 특히 바람직한 비-펩타이드 연결기는 --CH2NH--이다. 펩타이드 유사체가 b-알라닌, g-아미노부티르산, 등과 같은 결합 원자 사이의 1초과 개의 원자를 가질 수 있는 것으로 이해된다.
113. 아미노산 유사체 및 유사체 및 펩타이드 유사체는 종종 향상되거나 바람직한 특성, 예컨대, 더 많은 경제적 생산, 더 큰 화학 안정성, 향상된 약리학적 특성 (반감기, 흡수, 효력, 효능, 등), 변경된 특이성 (예를 들어, 생물학적 활성의 넓은-스펙트럼), 감소된 항원성, 및 기타를 갖는다.
114. D-아미노산은 더 안정한 펩티드를 생성하는데 사용될 수 있는데, 이는 D 아미노산이 펩티다제 등에 의해 인식되지 않기 때문이다. 공통 서열의 하나 이상의 아미노산을 동일한 유형의 D-아미노산 (예를 들어, L-라이신 대신에 D-라이신)으로 체계적으로 치환하는 것이 더 안정한 펩타이드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 잔기는 2개 이상의 펩타이드를 함께 고리화하거나 부착시키기 위해 사용될 수 있다. 이는 펩타이드를 특정 형태로 구속하는데 유익할 수 있다.
5. 약제학적 담체/ 의약품의 전달
115. 상기에 기재된 바와 같이, 조성물은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체에서 생체내에서 투여될 수 있다. "약제학적으로 허용가능한"이란, 생물학적으로 또는 다르게 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미하고, 즉, 물질은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 함유된 약제학적 조성물의 다른 성분 중 임의의 것과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 핵산 또는 벡터와 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 담체는 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서 임의의 유해한 부작용을 최소화하도록 자연적으로 선택될 것이다.
116. 조성물은 국소 비강내 투여 또는 흡입제에 의한 투여를 비롯하여, 경구로, 비경구로 (예를 들어, 정맥내로), 근육내 주사에 의해, 복강내 주사에 의해, 경피로, 체외로, 국소적으로 등으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "국소 비강내 투여"는 콧구멍의 하나 또는 둘 모두를 통한 코 및 비강으로의 조성물의 전달을 의미하고, 분무 기전 또는 액적 기전에 의해, 또는 핵산 또는 벡터의 에어로졸화를 통한 전달을 포함할 수 있다. 흡입제에 의한 조성물의 투여는 분무 또는 액적 기전에 의한 전달을 통해 코 또는 입을 통해 이루어질 수 있다. 전달은 또한 삽관을 통해 호흡계 (예를 들어, 폐)의 임의의 영역으로의 직접적인 전달일 수 있다. 필요한 조성물의 정확한 양은 대상의 종, 연령, 체중 및 일반적인 상태, 치료되고 있는 알러지성 장애의 중증도, 사용되는 특정 핵산 또는 벡터, 그의 투여 방식 등에 따라 대상체 별로 달라질 것이다. 따라서, 모든 조성물에 대한 정확한 양을 특정하는 것은 가능하지 않다. 그러나, 적절한 양은 본원의 교시에 주어진 통상적인 실험만을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
117. 조성물의 비경구 투여는, 사용되는 경우, 일반적으로 주사를 특징으로 한다. 주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액체 중의 현탁액의 용액에 적합한 고체 형태로서, 또는 에멀젼으로서 종래의 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위한 더욱 최근에 개정된 접근법은 일정한 투약량이 유지되도록 서방형 또는 지속 방출 시스템의 사용을 수반한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 3,610,795를 참고하고, 이는 본원에 참고로 편입되어 있다.
118. 물질은 (예를 들어, 극미립자, 리포좀, 또는 세포에 혼입된) 용액, 현탁액 일 수 있다. 이들은 항체, 수용체, 또는 수용체 리간드를 통해 특정 세포 유형에 표적화될 수 있다. 다음의 참조문헌은 특정 단백질을 종양 조직에 표적화하기 위한 상기 기술의 사용 예이다 (Senter, 등, Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, 등, Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, 등, Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, 등, Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); 및 Roffler, 등, Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). 비히클 예컨대 "스텔스(stealth)" 및 다른 항체 접합된 리포좀 (결장 암종에 대한 지질 매개 약물 표적화 포함), 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 매개 표적화, 림프구 지향된 종양 표적화, 및 생체내 쥣과 신경아교종 세포 고도 특이적 치료적 레트로바이러스 표적화. 다음의 참조문헌은 특정 단백질을 종양 조직에 표적화하기 위한 상기 기술의 사용 예이다 (Hughes 등, Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); 및 Litzinger 및 Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). 일반적으로, 수용체는 구성적 또는 리간드 유도된 세포내이입의 경로에 관여된다. 이들 수용체는 클라트린-코팅된 피트(pit)에 모여있고, 클라트린-코팅된 소포를 통해 세포에 들어가고, 수용체가 분류된 산성화된 엔도좀을 통과하고, 그리고 그 다음 세포 표면으로 재순회되거나, 세포내에서 저장되거나, 또는 리소좀에서 분해된다. 내재화 경로는 다양한 기능, 예컨대 영양소 흡수, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 청소능, 바이러스 및 독소의 기회적 유입, 리간드의 해리 및 분해, 및 수용체-수준 조절을 제공한다. 많은 수용체는 세포 유형, 수용체 농도, 리간드의 유형, 리간드 원자가, 및 리간드 농도에 따라 하나 초과의 세포내 경로를 따른다. 수용체-매개된 세포내이입의 분자 및 세포 기전이 검토되었다 (Brown 및 Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).
C. 실시예
119. 하기 실시예는 본원에 청구된 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법이 어떻게 제조되고 평가되는 지에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 순수하게 예시적인 것으로 의도되며, 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 수치 (예를 들어, 양, 온도 등)에 대한 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 오류와 편차를 설명해야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 온도는 ℃이거나, 주위 온도이고, 그리고 압력은 대기압이거나 그 근처이다.
1. 실시예 1
a) 방법
(1) 인간 NK 세포 정제 및 확장
120. 건강한 공여자 버피 코트를 the Central Ohio Region American Red Cross로부터 원료 물질로서 수득하였다. 이 연구는 the Institutional Review Board of Nationwide Children's Hospital에 의해 면제 연구인 것으로 결정되었다.
121. 버피 코트로부터 PBMC를 단리한다. 간단히, 15 ml Ficol-Paque 상에 35 mL의 버피 코트 샘플을 층상화한다. 브레이크 없이 20분 동안 400 x g에서 원심분리한다. 회수된 PBMC를 PBS로 3회 세정한다. NK 세포는 RosettesSep에 의해 이 단계에서 단리될 수 있다.
122. 0, 7, 및 14일째에 조사된 10 x 106 mbIL21-발현 피더 세포로 자극하여 NK 세포를 확장시킨다. 격일로 전체 배지 부피에 대해 10% FBS, 1% 글루타민, 1% 페니실린 스트렙토마이신 및 100 IU/mL의 IL-2를 함유하는 신선한 AIMV 또는 RPMI 로 배지를 교체한다.
(2) gRNA 설계 및 선택
123. 온라인 도구 예를 들어 NCBI, Ensemble을 사용하여 특정 유전자 좌위를 표적화하는 것을 선택한다. 예로써, 형질전환 성장 인자 베타 수용체 2 (TGFBRR2) 엑토도메인을 사용한다. 뷰(View) 기록: PF08917; 뷰 InterPro: IPR015013; 위치: 49-157 aa. 표적화된 서열: TGFBR2 유전자의 엑손 4 (ENSG00000163513)
124. gRNA를 설계하기 위해, CRISPR 설계 웹 도구 예컨대 http://crispr.mit.edu 및 'Benchling.com'을 사용한다. 단계 2.1에서 선택된 DNA 서열을 입력한다. 인간 (hg 19)을 표적 게놈으로 선택한다. CRISPR 가이드 (20개의 뉴클레오타이드 다음에 PAM 서열: NGG)는 이전에 입력된 서열에서 스캐닝된다. 이는 또한 선택된 게놈 전체에 걸쳐 가능한 표적외 매치를 나타낸다. 표적내 및 표적외 속도에 기초하여 최고 점수를 갖는 최상의 3개의 gRNA를 선택한다.
125. 표 1은, CRISPR 설계 웹 도구에 의해 표시된 TGFBR2 유전자의 엑손 4를 표적화하기 위한 설계된 CRISPR RNA를 보여준다.
Figure pct00003
126. CRISPR RNA을 합성 서열-특이적 crRNA로서 주문하고 보존된, 전사활성화 RNA (tracrRNA)을 주문하여 부분 상동성을 통해 crRNA와 상호작용시킨다.
(3) 결실 스크리닝 프라이머의 설계
127. T7E1 돌연변이 검정을 위해 gRNA 절단 부위에 걸치는 플라이머를 설계한다. sgRNA 표적 부위에서 작은 삽입-결실 (인델)이 돌연변이 검정 다음에 1.5% 아가로스 겔에 나타나는 지를 보장하기 위해 예상된 절단 부위에서 적어도 100 bp 떨어진 프라이머를 사용한다. 표 2는 TGFBR2 엑토도메인을 증폭시키는데 사용되는 프라이머를 나타낸다.
Figure pct00004
(4) 인간 일차 및 확장된 NK 세포의 형질도입
128. Cas9/RNP 요소의 NK로의 형질도입을 하기와 같은 4D-Nucleofector System을 사용하는 전기천공으로 수행했다:
(5) 세포 준비
129. 일차 NK 세포에 대해, 4일 동안 100 IU/mL의 IL-2의 존재에서 RPMI 또는 AIMV 배지에서 새롭게 단리된 NK 세포를 인큐베이팅하고 5일째에 전기천공을 수행한다 (이전에 기재된 바와 같이 격일로 그리고 형질도입 전날 배지를 교체한다). 이는 확장된 NK 세포에 대해 변형될 수 있다. 확장된 NK 세포에 대해, 1:1의 비로 조사된 피더 세포로 0일째에 세포를 자극하고 5 또는 6 또는 7일째에 전기천공을 수행한다. (이전에 기재된 바와 같이 격일로 그리고 형질도입 전날 배지를 교체한다). 전기천공 당일에 전기천공된 세포에 100 IU/mL의 IL-2를 함유하는8 ml의 신선한 RPMI로 채워진 T25 플라스크를 준비하고 가습된 37℃ / 5 % CO2 인큐베이터에서 플라스크를 사전-인큐베이팅한다. 해동된 세포 또는 두 번째 또는 세 번째 자극받은 세포는 기재된 바와 같이 그것의 회수후 언제든지 전기천공될 수 있다. Nucleofector Solution 중 NK 세포의 초고농도는 형질도입 속도를 높이기 때문에 26μL 형질도입 혼합물에 대해 조건당 3-4 × 106개의 세포를 취한다. 상기 세포를 PBS로 3회 세정하여 RNase 활성을 통상적으로 함유하는 모든 FBS를 제거할 수 있다. 8분 동안 300g에서 매번 회전시킨다. 단일 gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) 및 2개의 gRNA (gRNA1+gRNA2, gRNA1+gRNA3, gRNA2+gRNA3)의 조합 및 Cas9/RNP가 없는 1개의 대조군으로서 Cas/RNP에 대한 7개의 전기천공 조건을 고려한다.
(6) crRNA:TracerRNA/복합체의 형성
130. 1X TE 용액에서 crRNA (gRNA1, gRNA2 및 gRNA3) 및 TracerRNA를 200μM의 최종 농도로 재현탁시킨다. 표 3에서 나타낸 바와 같이 2.2μl의 각 200μM gRNA를 200μM TracerRNA와 혼합한다. 5분 동안 95℃에서 샘플을 가열하고 벤치 탑에서 실온 (15-25℃)으로 냉각되도록 한다. 나중 사용을 위해 재현탁된 RNA 및 crRNA: TracerRNA/복합체를 -20℃에서 보관한다.
Figure pct00005
(7) RNP 복합체의 형성
131. 시간을 절약하기 위해, 세정 단계 동안 RNP 복합체를 형성한다. 단일 crRNA:tracrRNA 이중체 반응의 경우, 표 4에 언급된 바와 같이, Cas9 엔도뉴클레아제를 36 μM로 희석한다.
Figure pct00006
132. crRNA:tracrRNA 이중체의 조합 형질도입을 위해 표 5에서 나타낸 바와 같이 Cas9 엔도뉴클레아제를 36 μM로 희석한다.
Figure pct00007
133. 30초 내지 1분에 걸쳐, 피펫 팁을 소용돌이치게 하면서 Cas9 엔도뉴클레아제를 crRNA:tracrRNA 이중체에 천천히 첨가한다. 15 내지 20분 동안 실온에서 혼합물을 인큐베이팅한다. 인큐베이션 후 혼합물을 사용할 준비가 되어 있지 않은 경우, 사용할 때까지 혼합물을 얼음 상에 유지시킨다.
(8) 전기천공
134. 전체 보충물을 Nucleofector Solution P3에 첨가하고 실온에서 유지시킨다. 20μl의 P3 일차 4D Nucleofector Solution에서 세포 펠릿 (3-4 × 106개의 세포)를 재현탁시킨다. 피펫팅 동인 기포를 피한다. 세포는 P3 용액에서 장시간 방치해서는 안된다. 즉시 5μL의 RNP 복합체를 상기 세포 현탁액에 첨가한다. 1μl의 100μM Cas9 전기천공 인핸서를 Cas9/RNP/세포 혼합물에 첨가한다. Cas9/RNP/세포 혼합물 20μl Nucleocuvette 스트립으로 이식한다. 상기 Nucleocuvette 스트립을 살짝 두드려서 샘플이 스트립의 최하부를 덮고 있는 지를 확인한다. 4D-Nucleofector System을 시작하고 EN-138 프로그램을 선택한다.
(9) 형질도입후
135. 세포를 스트립에서 3분 동안 방치한다. 80 μL의 사전-평형화된 배양 배지를 큐벳에 첨가하고 샘플을 플라스크로 부드럽게 이식한다. 형질도입 48시간 후, 유전자 결실 스크리닝을 위해 5 × 105개의 세포에서 게놈 DNA를 추출한다. 단계 3.2에서 설계된 프라이머를 Taq DNA 중합효소 키트와 함께 사용하여 관심 유전자를 증폭시킨다. T7EI 소화를 위해 PCR 앰플리콘 이종이중체를 형성하고 37℃에서 30 내지 60분 동안 생성물을 T7EI 효소와 함께 인큐베이팅한다. T7EI 검정는 Surveyor 검정을 사용하는 것에 비해 빠르고 간단하며 깨끗한 전기영동 결과를 제공하므로 스크리닝에 선호된다. 그러나, 이 방법은 Cas9 RNP 실험에서 비-상동성 말단 연결 (NHEJ) 활성에 의해 생성된 ≤2 염기의 삽입 및 결실을 검출할 수 없다.
136. 30 내지 45분 동안 110 V에서 소화된 DNA를 1.5 % 아가로스 겔 상에서 실행하고, 15분마다 겔을 시각화한다. 1:1의 비로 mbIL21-발현 피더 세포로 세포의 나머지를 자극한다. 자극 5일 후 qPCR을 사용하여 유전자 발현 수준에 대해 RNA를 추출한다.
137. 이전에 보고된 바와 같이 칼세인 검정을 수행한다. 간단히, 칼세인 AM를 갖는 표적 세포를 로딩(loading)한다 (보여진 예에서, 3 μg/mL/1,000,000 DAOY 세포가 사용되었다). IL2 (100 IU/mL) 플러스 또는 마이너스 10 ng/mL의 가용성 TGFβ에서 밤새 정치시킴으써 세포독성 검정을 위해 NK 세포를 준비한다. NK 세포를 밤새 정치시킨 것과 동일한 사이토카인에서 칼세인 검정을 수행한다.
b) 결과:
(1) 전기천공 효율:
138. Cas9/RNP 전기천공의 4D-뉴클레오펙티온을 최적화하기 위해, GFP 비-표적화 siRNA 및 DNA 플라스미드의 NK 세포로의 형질도입으로 16개의 상이한 프로그램을 시험하였다. 유세포측정 검정은, EN-138가 두 입자 모두에 대해 최고 백분율의 세포 생존력 및 형질도입 효율 (35 % 살아있는 GFP 양성 세포)을 가짐을 나타내었다. (도 1 및 2). 흥미롭게도, Cas9/RNP 전기천공을 위해 이 프로그램을 사용하는 효율은 TGFBR2 mRNA 발현 수준의 60% 감소 (도 5)가 관측됨에 따라 더 높았다.
(2) 돌연변이 검정
139. gRNA2, gRNA1+gRNA2 및 gRNA3을 함유하는 Cas/RNP는 성공적인 TGFBR의 엑토도메인 유전자 녹아웃을 가졌으나, gRNA 단독은 어떠한 T7E1 검출가능 인델도 만들지 않았다 (도 3). 추가로, 도 4는 상업적으로 제공된 gRNA를 사용하여 확장된 인간 NK 세포에서 인간 HPRT1 (하이포잔틴 포스포리보실트랜서퍼라제 1))의 성공적인 녹아웃을 나타낸다.
(3) 유전자 발현 수준 검정
140. 결과를 대표하는 것으로서, 도 5는 RT-PCR에 의해 분석된 TGFBR2 엑토도메인의 mRNA 생산 수준에 대한 Cas9/RNPs(gRNA1+gRNA2)의 효과를 도시한다. 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, 표적화된 유전자의 mRNA 발현 수준은 상당히 감소하였다.
(4) 세포독성
141. 도 6에서 나타낸 바와 같이, gRNA1+gRNA2, gRNA2 및 gRNA3 Cas9/RNP 변형 세포를 DAOY 세포와 공배양된 TGFB와 함께 인큐베이션한 후, 변형 세포는 배지 중 IL-21를 밤새 가졌던 대조군 그룹과 비교하여 세포독성 수준의 임의의 상당한 감소를 보이지 않았다. 이 결과는 Cas9/RNPs 변형된 세포가 TGFB의 존재 하에 세포독성 기능을 보유한다는 것을 입증하고, 변형된 세포가 TGFB 내성임을 보여준다.
(5) RNAeq 분석
142. 미접촉 및 확장된 NK 세포에서의 RNAeq 분석은 IL-21 확장된 NK 세포의 활성 DNA 복구 및 복제 기구를 강조하였다. 이는, 소모된 NK 세포가 Cas9/RNPs 시스템을 사용하여 유전자 조작으로 더 개방될 수 있음을 나타낸다.
c) 논의:
143. Cas9-매개된 게놈 조작은 실험 및 임상 의약에 혁신을 일으켰다. T-세포에서 이러한 기술의 사용은 성공적이었지만, NK 세포의 DNA-의존성 변형은 도전적이었다. CRISPR/Cas9 시스템에서, sgRNA에 대한 코딩 서열을 운반하는 DNA 벡터는 U6 또는 H1 프로모터의 제어 하에 놓이며, 이는 수득한 전사 과정이 필요하거나 바람직하지 않기 때문이다. DNA 의존성 전이유전자 전달, 예컨대, 렌티바이러스 및 레트로바이러스 형질감염은 실질적인 절차-연관된 NK 세포 아폽토시스로 인해 불량하며, 이는 유전자 조작된 NK 세포의 효율적인 생산을 제한한다.
144. 따라서 합성으로 사전형성된 리보핵단백질 (RNP) 복합체 및 Cas9 단백질을 정제된 단백질로서 일차 및 확장된 NK 세포 내에 도입하였다.
145. 이 방법은 DNA-의존성 형질도입 방법에서 발생하는 것으로 여겨지는 바와 같이 실질적인 절차-관련 NK 세포 아폽토시스를 유발할 수 있는 RNA 중합효소 II에 의해 개시되는 캡핑(capping), 테일링(tailing) 및 다른 전사 및 번역 과정의 제거를 가능하게 하였다. 또한, 본원에 보고된 방법은 정제된 Cas9 단백질을 사용하여, Cas9/RNP가 전기천공 직후에 활성이고 또한 신속하게 분해되므로, 표적내 효과를 증가시키고 표적외 충격을 감소시켜, 현재의 프로토콜에 대한 개선을 제공한다.
146. 요약하면, Cas9/RNP는 상기 기재된 방법을 이용하는 암 면역요법을 위해 인간 일차 및 확장된 NK 세포를 유전자 변형시키는데 사용될 수 있다. 결과는 또한 TGFBR2 엑토도메인 유전자의 성공적인 녹아웃이 TGFB 내성에 이르는 이들 변형 NK 세포를 유도한다는 것을 입증하였다.
147. RNP 전달을 주형 DNA의 공급원 (예컨대 자연적으로 재조합유전성 아데노-관련된 바이러스 (AAV) 공여자 벡터)과 조합시키면 상동성 재조합에 의한 부위-특이적 유전자 삽입을 가능하게 할 수 있다.
2. 실시예 2: 사이토카인 신호전달 3의 억제인자 (SOCS3)
148. 암 면역요법을 향상시키기 위한 NK 세포의 유전자 변형은 광범위한 암을 치료하는 데 적용된다. 최근에, CRISPR/Cas9 요소가 전기천공을 통해 리보핵산단백질(RNP)로서 NK 세포 내로 도입된 후, 4-1BBL 및 막-결합 IL-21을 발현시키는 피더 세포 상에서 확장하여 다수의 유전적으로 변형 NK 세포를 생성하는 새로운 전략이 개발되었다. 이 방법을 사용하여 사이토카인 신호전달 3의 억제인자(SOCS3)를 포함하는 일차 및 확장된 NK 세포에서 여러 유전자를 유전적으로 변형시켰다. SOCS3은 JAK/STAT 경로를 통한 사이토카인 신호전달을 음성적으로 조절한다. Cas9/RNP를 사용하는 일차 NK 세포에서의 SOCS3의 파괴가 STAT3 신호전달 수준을 유지할 수 있고, 후속적으로 증식 및 세포독성 기능을 증가시킬 수 있다는 가설을 제기하였다.
149. gRNA를 설계하여 SOCS3 유전자의 엑손 2 (도 7)를 표적화하고, Lonza 4D 전기천공기를 사용하여 일차 NK 세포로 Cas9/RNP로서 Cas9 단백질과 함께 전기천공했다. gRNA의 6개의 상이한 조건을 단독으로 또는 조합하여 시험하였다. 대조군 내의 NK 세포를 Cas9/RNP 없이 전기천공했다. 전기천공 후, 세포를 100 IU의 인간 IL-2가 보충된 배양 배지에서 48시간 동안 방치하고, 조사된 피더 세포를 사용하여 확장시켰다. 7일째에, 동일한 수의 세포를 조사된 피더 세포로 재자극하여 증식에 대한 SOCS3 KO의 효과를 시험하였다. 웨스턴 블랏을 사용하여 단백질 수준에서 녹아웃 효능을 검정했다. 칼세인 검정 및 IncuCyte Zoom (Essen)을 수행하여 2개의 암 세포주, 즉 K562 및 Daoy에 대한 세포독성을 측정하였다.
150. 결과는 대조군과 비교하여 3개의 조건 (gRNA1, gRNA3 및 gRNA1+ gRNA3)에서 SOCS3 단백질 수준의 유의한 감소를 나타내었다. SOCS3의 상대 정규화된 발현은 도 8에 도시되어 있다. 칼세인 검정 및 IncuCyte 줌(zoom)은, 변형된 SOCS3 KO NK 세포가 AML 및 Daoy 암 세포주에서의 대조군과 비교하여 종양을 더욱 효율적으로 사멸시킬 수 있음을 나타내었다 (도 9a, 9b, 9c, 및 9d). gRNA 1 (G1)은 음성 대조군 (NC)의 사멸의 2배를 나타내었다. 특히, NC은 10:1에서 80% 사멸을 나타내는 반면, G1은 5:1에서 80% 사멸을 나타낸다 (도 9b 및 9d). 신경교세포종 세포는 SOCS3 녹아웃에서 더 빠른 속도로 사멸되지 않았다 (도 9c 및 9d). 증식 데이터는, SOCS3 KO 세포가 대조군 그룹보다 더 빠르게 성장할 수 있음을 나타내었다 (도 10).
151. 결론적으로, 데이터는 NK 세포 기능에서 SOCS3 및 JAK/STAT 경로의 역할을 입증하고, SOCS3이 NK 세포를 사용한 암 면역요법을 개선하기 위해 유전자 변형에 대한 양호한 표적임을 나타낸다.
3. 실시예 3: 동족살해를 극복하고 ADCC를 향상시키기 위한 CD38-KO NK 세포의 생성
152. 천연 살해 세포는 항-CD38 단클론성 항체, 즉 다라투맘브 (DARA)에 의해 CD38-발현 다발성 골수종 (MM)을 표적화하는데 중요한 역할을 한다. DARA 요법에서 NK 세포의 동족살해를 극복하기 위해, Cas9/RNP를 사용한 녹아웃 NK 세포가 생성되었다. DARA를 이용한 생체외-확장된 녹아웃 NK 세포의 병용 요법은 DARA 유도된 종양 세포 사멸에서 상당한 개선을 보였다 (도 11 및 12).
4. 실시예 4: AAVS1
153. 이 방법론은 CAR 및 리포터 유전자를 포함하는 임의의 관심 유전자에 대한 통합 부위로서 사용될 세이프 하버로서 AAVS1 유전자를 일차 NK 세포의 게놈 내로 표적화하는데 사용되었다.
154. ICE (CRISPR 편집의 간섭)는 Cas9/RNP를 사용하여 관심 유전자를 표적화하는 높은 효율을 나타내었다. AAVS1를 표적화하는 것은 일차 NK 세포의 세포독성 효과를 변화시키지 않는다 (도 13).
사용된 gRNA: GGGGCCACTAGGGACAGGAT (서열번호: 9)
5. 실시예 5: Cas9/RNP 공여자를 사용한 CAR-NK 생산에 대한 개념증명으로서 mCherry 양성 일차 NK 세포의 생성
155. mCherry 발현 인간 일차 NK 세포를 이러한 접근법을 사용하여 생성하였다. 또한, 조사된 mbIL21-발현 피더 세포로 자극함으로써 이들 변형된 1차 NK 세포를 확장시키고, 리포터 유전자의 안정한 발현을 입증하였다 (도 14, 15, 및 16). 이는 일차 및 확장된 CAR-NK 세포의 생성을 확인한다.
사용된 gRNA: GGGGCCACTAGGGACAGGAT (서열번호: 9)
6. 실시예 6: 표적외 효과의 시험
156. NK 세포에서 Cas9/RNP를 사용한 후 표적외 효과를 확인하기 위해, 정상 및 변형된 NK 세포 (CD38-KO)의 전체 게놈 서열분석을 수행하였다. WGS는 후보 유전자를 예측하기 위해 사용된 알고리즘에 기초하여 표적외를 나타내지 않거나 매우 낮은 (2개의 유전자)를 나타내었다.
157. Benching.com에 의해 생성된 표적외 후보 유전자의 목록은 CD-38. (5' ― CTGAACTCGCAGTTGGCCAT ― 3' (서열번호: 11))을 표적화하기 위해 사용된 gRNA에 대해 조사되었고 임의의 표적외를 나타내지 않았다. (표 6에 나타낸 바와 같은 표적외 후보 유전자의 목록)
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
D. 참조문헌
Figure pct00012
Figure pct00013

Claims (18)

  1. NK 세포를 유전자 변형시키는 방법으로서,
    a) 표적 DNA 서열에 대해 특이적인 가이드 RNA (gRNA)를 얻는 단계; 및
    b) 전기천공을 통해 표적 NK 세포에, 상기 NK 세포의 게놈 DNA 내의 표적 서열에 혼성화되는 상응하는 CRISPR/Cas 가이드 RNA와 복합체화된 부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 (Cas9)를 포함하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 도입하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 NK 세포의 게놈은 하나 이상의 염기쌍의 삽입 또는 결실에 의해, 이종성 DNA 단편 (예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오타이드)의 삽입에 의해, 내인성 DNA 단편의 결실에 의해, 내인성 DNA 단편의 역전 또는 전좌에 의해, 또는 이들의 조합에 의해 변형되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 NK 세포는 일차 또는 확장된 NK 세포인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 일차 NK 세포는 전기천공 전에 IL-2의 존재에서 2, 3, 또는 4일 동안 인큐베이팅되는, 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 일차 NK 세포는 전기천공 전에 조사된 피더 세포(feeder cell)의 존재에서 4일 동안 확장되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 전기천공 다음에 상기 변형된 NK 세포를 조사된 mbIL-21 발현 피더 세포로 확장시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 36μM cas9를 200μM crRNA 및 TracerRNA의 용액으로 희석하여 상기 RNP 복합체를 형성하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제1항의 방법에 의해 변형된 NK 세포.
  9. 유전자 변형된 NK 세포로서, 형질전환 성장 인자-β 수용체 2 (TGFBR2) 또는 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1 (HPRT1)을 암호화하는 유전자의 녹아웃을 포함하는, 유전자 변형된 NK 세포.
  10. 조작된 NK 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 양자 전이시키는 방법으로서,
    a) 변형될 표적 NK 세포를 얻는 단계;
    b) 상기 표적 DNA 서열에 대해 특이적인 gRNA를 얻는 단계;
    c) 전기천공을 통해 상기 표적 NK 세포에, 조작된 NK 세포를 생성하는 상기 표적 NK 세포의 게놈 DNA 내의 표적 서열에 혼성화되는 상응하는 CRISPR/Cas 가이드 RNA와 복합체화된 부류 2 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 (Cas9)를 포함하는 RNP 복합체를 도입하는 단계; 및
    d) 상기 조작된 NK 세포를 상기 대상체로 전이시키는 단계
    를 포함하는, 방법
  11. 제10항에 있어서, 상기 대상체는 암을 가지고 있는, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 NK 세포는 생체외에서 변형되었고 변형 후에 상기 대상체에게 이식되는 일차 NK 세포인, 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 NK 세포는 자가 NK 세포인, 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 NK 세포는 동종이계 공여자 공급원으로부터의 것인, 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 NK 세포는 상기 대상체에게 투여하기 전에 조사된 mbIL-21 발현 피더 세포로 확장되는, 방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 NK 세포는 IL-21 또는 조사된 mbIL-21 발현 피더 세포의 투여를 통해 상기 대상체로 상기 NK 세포의 이식 다음에 상기 대상체에서 확장되는, 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 RNP 복합체는 TGFRB2 또는 HPRT1 유전자를 표적화하는, 방법.
  18. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, TGFBR2 유전자의 녹아웃을 포함하도록 변형된 NK 세포를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
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