KR20210006394A - Dha가 풍부한 다중불포화된 지방산 조성물 - Google Patents

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Abstract

특정 비율로 DHA, ALA 및 올레산 (전형적으로 지방산 에스테르로서)을 포함하는 식물성-기반 지질 조성물이 제공된다. 본 조성물은 또한 낮은 수준의 EPA와 팔미트산을 함유한다. 본 조성물은 통상적인 가공 방법에 의해 단일 공급원으로부터 획득가능하고, 개선된 안정성 특성을 갖는다.

Description

DHA가 풍부한 다중불포화된 지방산 조성물
본원에 개시된 실시형태는 도코사헥사엔산이 풍부한 새로운 지질 조성물에 관한 것이다. 본 조성물은 다수의 건강상 이점을 갖는 다중불포화된 지방산의 혼합물을 포함한다. 본 조성물은 영양학상 이점을 제공할 수 있고 잠재적으로 단일 공급원으로부터 획득가능하여, 확장가능하고 지속가능하다. 그것은 또한 산화에 대해 향상된 안정성을 갖는다.
오메가-3 장쇄 다중불포화된 지방산 (LC-PUFA)은 인간과 동물의 건강에 중요한 화합물로 널리 인식되어져 있다. 이들 지방산은 식이 공급원으로부터 얻거나 보다 적은 정도로 리놀레산 (LA, 18:2ω-6) 또는 α-리놀렌산 (ALA, 18:3ω-3) 지방산의 전환에 의해 얻어질 수 있으며, 그 모두는 인간 식이에서 필수 지방산으로 간주된다.
영양학상의 관점에서, 가장 중요한 오메가-3 지방산은 아마도 α-리놀렌산, 에이코사펜타엔산 ("EPA"; 20:5n-3) 및 도코사헥사엔산 ("DHA"; 22:6n-3)일 것이다. DHA는 뇌 및 눈 발달에 중요한 LC-PUFA이다. 오메가-3 PUFA의 섭취는 관상동맥 질환을 예방하는 데 또한 도움이 될 수 있다. 의학적 연구는 이들 지방산이 개선된 심혈관 및 면역 기능과 암, 당뇨병 및 고혈압의 감소와 같은 유익한 건강상 측면을 가진다는 것을 명확하게 나타낸다. 임상 결과는 주당 5.5 g의 오메가-3 PUFA의 식이 섭취는 1차 심장 마비의 위험에서 50% 감소와 연관될 수 있다는 것을 입증하였다. 결과적으로, 오메가-3 PUFA를 함유하는 오일은 약학적 및 식이 목적에 대해 높은 수요가 있었다.
일반적으로, 지방산의 산화 안정성은 탄소-탄소 이중 결합의 수 또는 불포화도가 증가함에 따라 현저하게 감소한다. 불행히도, ALA, EPA 및 DHA는 모두 쉽게 산화되는 경향이 있는 다중불포화된 지방이다. EPA (5개 탄소-탄소 이중 결합을 가짐)는 ALA보다 상당하게 산화에 더 취약하다: DHA (6개 탄소-탄소 이중 결합을 가짐)는 EPA보다 훨씬 더 산화에 취약하다. 결과적으로, 오메가-3 함량을 증가시키는 것은 많은 제품의 유통 기한을 단축시키는 경향이 있다. 이들 문제는 상당한 양의 EPA 또는 DHA를 포함하는 오일에서 특히 심각하다.
미국 특허출원공개 US 2015/223483호는 개선된 산화 안정성을 갖는 카놀라 오일-기반 블렌드를 개시한다. 안정성은 하나 이상의 첨가제의 첨가에 의하여 달성된다.
미국 특허출원공개 US 2011/0027443호는 개선된 향미 프로필을 갖는 올레산, 리놀레산, 알파 리놀렌산 및 LC-PUFA의 특정 블렌드를 함유하는 지방 및 오일 조성물을 개시한다. 미국 특허출원공개 US 2004/209953호는 주로 LC-PUFA의 모노글리세라이드 및 디글리세라이드를 함유하는 영양 제품을 개시한다. 미국 특허 US 5,130,061호는 조 오일로부터 DHA를 추출하기 위한 에스테르 교환반응 및 증류 공정의 사용을 기술한다. 미국 특허 US 9,040,730호는 조성물에서 원하지 않는 스테롤의 양을 감소시키기 위해 PUFA를 함유하는 지질 혼합물의 정제를 기술한다. 이들 각각의 경우에서, 특정 블렌드가 얻어지는 원료로 어류 또는 미생물 오일이 사용된다.
국제 특허출원 WO 2013/185184호는 다중불포화된 지방산의 에틸 에스테르를 생산하는 공정을 개시한다.
국제 특허출원 WO 2015/089587호 및 미국 특허출원공개 US 2015/0166928호는 오메가-3 및 오메가-6 지방산의 혼합물을 포함하는 식물 지질 조성물을 개시한다. 유전자적으로 변형된 카놀라가 WO 2017/218969호 및 WO 2017/219006호에 기술되어 있다.
본 명세서에서 명백하게 이전에 공개된 문서의 목록 또는 논의는 문서가 최신 기술의 일부분이거나 통상적인 일반 지식라는 인정으로 반드시 간주되지 않아야 한다.
본 발명의 제1 양태에 따르면,
(i) 조성물의 총 지방산 함량의 약 15 중량% 내지 약 35 중량%의 양으로 도코사헥사엔산 (22:6n-3);
(ii) 조성물의 총 지방산 함량의 최대 약 5 중량%의 양으로 에이코사펜타엔산 (20:5n-3);
(iii) 조성물의 총 지방산 함량의 약 10 중량% 내지 약 20 중량%의 양으로 α-리놀렌산 (18:3n-3);
(iv) 조성물의 총 지방산 함량의 약 20 중량% 내지 약 40 중량%의 양으로 올레산 (18:1n-9); 및
(v) 조성물의 총 지방산 함량의 최대 약 1.5 중량%의 양으로 팔미트산;을 포함하고,
여기서 성분 (i) 내지 (v)는 각각 독립적으로 지방산, 지방산 염, 지방산 에스테르 또는 지방산 에스테르의 염의 형태로 제공되는, 식물성-기반 지질 조성물이 제공된다.
상기 지질 조성물은 본원에서 "본 발명의 조성물"로서 지칭된다.
본 발명은 유리 지방산, 염, 에스테르 또는 에스테르의 염의 형태로 높은 수준의 도코사헥사엔산 (DHA) 및 α-리놀렌산 (ALA)을 동시에 함유하는 지질 조성물에 관한 것이다. 이들 조성물은 식물 공급원과 같은 지속가능한 공급원으로부터 획득될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그것들은 또한 저장 동안 산화에 의한 분해에서 감소로 입증되는 향상된 저장 안정성 프로필을 갖는 것으로 밝혀졌다. 특히, DHA는 인간과 동물 건강에 중요한 화합물로 인식되고 있다. 이들 조성물은 사료, 기능식품, 화장품 및 기타 화학 조성물에 사용될 수 있다. 그것들은 또한 중간체 및 활성 약학적 성분으로 유용할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 지방산 수준은 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 실시예에 개시된 방법에 따라 참조 표준과 함께 가스 크로마토그래피 (GC)를 포함한다. 특정 방법에서, 지방산은 GC 분석 전에 메틸 또는 에틸 에스테르로 전환된다. 이러한 기술은 실시예에 기재되어 있다. 크로마토그램에서 피크 위치를 사용하여 각각의 특정 지방산을 식별할 수 있고, 각각의 피크 아래 영역을 적분하여 양을 결정할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 반대로 언급되지 않는 한, 샘플에서 특정 지방산의 백분율은 그 지방산에 대한 크로마토그램의 곡선 아래 면적을 크로마토그램에서 지방산에 대한 전체 면적의 백분율로 계산함에 의해 결정된다. 이것은 본질적으로 중량 백분율 (w/w)에 해당한다. 지방산의 동정은 GC-MS에 의해 확인될 수 있다.
이 문맥에서 도코사헥사엔산 및 "DHA"에 대한 언급은 달리 명시하지 않는 한 ω3 형태의 도코사헥사엔산, 즉 지방산의 메틸 말단으로부터의 제3 탄소-탄소 결합에 불포화 (탄소-탄소 이중 결합)를 갖는 도코사헥사엔산에 대한 언급이다. 상호교환적으로 사용될 수 있는 약어 형태는 "22:6n-3" 및 "22:6ω-3"을 포함한다.
보다 일반적으로, 용어 "다중불포화된 지방산" 및 "PUFA"는 적어도 2개 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 지방산을 지칭한다. 용어 "장쇄 다중불포화된 지방산" 및 "LC-PUFA"는 적어도 20개 탄소 원자와 적어도 2개 탄소-탄소 이중 결합을 그것의 탄소 사슬에 포함하고 따라서 VLC-PUFA를 포함하는 지방산을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "극히 장쇄 다중불포화된 지방산" 및 "VLC-PUFA"는 그것의 탄소 사슬에 적어도 22개 탄소 원자와 적어도 3개 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 지방산을 지칭한다. 통상적으로, 지방산의 탄소 사슬에서 탄소 원자의 수는 비분지형 탄소 사슬을 지칭한다. 탄소 사슬이 분지형이면, 탄소 원자의 수는 측기의 것들을 제외한다.
장쇄 다중불포화된 지방산은 ω3 ("오메가-3") 지방산, 즉 지방산의 메틸 말단으로부터 제3 탄소-탄소 결합에 불포화 (탄소-탄소 이중 결합)를 갖는 지방산일 수 있다. 그것들은 대안적으로 ω6 ("오메가-6") 지방산, 즉 지방산의 메틸 말단으로부터 제6 탄소-탄소 결합에 불포화 (탄소-탄소 이중 결합)를 갖는 지방산일 수 있다. 다른 불포화 패턴이 존재할 수 있지만, ω6 및 특히 ω3 형태는 본 발명의 맥락에서 특히 관련이 있다.
본 발명의 조성물은 DHA 및 α-리놀렌산 (ALA, 18:3n-3)을 포함하는 적어도 2개의 상이한 다중불포화된 지방산을 포함한다. 일 실시형태에서, DHA 또는 ALA는 조성물에 존재하는 가장 풍부한 지방산이다 (조성물의 총 지방산 함량에 대한 중량 기준). 또 다른 실시형태에서, DHA 및 ALA는 조성물에 존재하는 2가지 가장 풍부한 지방산이다.
본 발명의 조성물에서 성분 (i) 내지 (v)는 각각 지방산, 지방산 염, 지방산 에스테르 또는 지방산 에스테르의 염의 형태로 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지방산"은 종종 포화 또는 불포화의 긴 지방족 꼬리를 갖는 카복실산 (또는 유기산)을 지칭한다. 전형적으로, 지방산은 길이가 8개 탄소 원자, 보다 특히 길이가 적어도 12개 탄소의 탄소-탄소 결합 사슬을 갖는다. 대부분 자연적으로 발생하는 지방산은 이들의 생합성이 2개 탄소 원자를 가진 아세테이트를 포함하기 때문에 탄소 원자의 수가 짝수이다. 지방산은 본원에서 "유리 지방산"으로 지칭되는 유리 상태 (비-에스테르화됨), 또는 알킬 에스테르, 트리글리세라이드의 일부, 디아실글리세라이드의 일부, 모노아실글리세라이드의 일부, 아실-CoA (티오-에스테르) 결합 또는 기타 결합 형태, 또는 이들의 혼합물과 같은 에스테르화된 형태일 수 있다. 지방산은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 또는 디포스파티딜글리세롤 형태와 같은 인지질로서 에스테르화될 수 있지만, 바람직하게는 알킬 에스테르, 특히 에틸 에스테르로서 에스테르화된다. 의심의 여지를 없애기 위해, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "지방산"은 유리 지방산, 지방산 에스테르 및 이들 중 어느 하나의 염을 포괄한다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 지방산과 관련된 정량적 값은 그것이 존재하는 형태 (예를 들어, 유리 산 또는 에스테르)에 무관하게, 존재하는 지방산의 양 (중량을 기준으로 계산됨)을 지칭한다.
조성물에서 각각의 지방산은 또한 지방산의 염, 예를 들어 알칼리 염 또는 알칼리 토 염의 형태로 제공될 수 있다. 언급될 수 있는 특정 염은 리튬 염 및 칼슘 염을 포함한다. 이러한 염은 잠재적인 추가적인 의학적 이점이 있거나 가공성 향상을 제공한다. 유사하게, 지방산 에스테르는 지방산 에스테르의 염의 형태로 제공될 수 있다. 유리 지방산, 염, 에스테르 또는 에스테르의 염의 형태에서의 지방산의 임의의 조합이 본 발명의 조성물에 존재할 수 있다. 이에 의해, 본 발명자들은 예를 들어 DHA가 현저하게는 에틸 에스테르로 존재할 수 있고, ALA가 현저하게는 메틸 에스테르의 칼슘 염으로 존재할 수 있고, 올레산이 현저하게는 유리 지방산으로 존재할 수 있다는 것을 의미한다.
"포화 지방산"은 사슬을 따라 어떤 이중 결합이나 다른 작용기도 함유하지 않는다. 용어 "포화된"은 모든 탄소 (카복실산 [-COOH] 기 제외)가 가능한 한 많은 수소를 함유한다는 점에서 수소를 지칭한다. 달리 말하면, 오메가 (ω) 말단은 3개 수소 원자에 부착되고 (CH3-) 사슬 내의 각 탄소는 2개 수소 원자에 부착된다 (-CH2-). 용어 "총 지방산"은 포화 또는 불포화된 모든 형태에서의 지방산, 유리 산, 에스테르 및/또는 염을 포함한다.
화합물의 양, 중량, 시간, 온도 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 지정된 양의20%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 또는 0.1%의 변화를 지칭한다.
언급될 수 있는 본 발명의 조성물은 고농도의 오메가-3 지방산을 함유하는 것들을 포함하며, 이들 중 다수는 인간 건강에 특히 중요한 것으로 간주되는 소위 "필수 지방"이다. 오메가-3 지방산은 HDL 콜레스테롤 수치에 유익한 영향을 미칠 수 있고, 청소년의 두뇌 발달을 지지하고, 정신 건강에 유익한 것으로 나타났다. 이들 지방산은 일반적으로 항-염증 특성을 가진 에이코사노이드에 대한 전구체인 것으로 간주된다. 언급될 수 있는 본 발명의 특정 조성물은 지질 조성물에서 오메가-3 다중불포화된 지방산의 총량이 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 적어도 약 30%, 예컨대 적어도 약 35%인 것들을 포함한다. 특정 실시형태에서, 지질 조성물 중 오메가-3 다중불포화된 지방산의 총량은 조성물의 총 지방산 함량의 적어도 약 40 중량%이다.
오메가-6 지방산은 또한 인간 건강에 중요한 것으로 간주된다. 특히, 특정 오메가-6 지방산은 양호한 건강에 필요한 "필수 지방"이지만 신체는 이를 합성할 수 없다. 그러나, 오메가-6 지방은 더 많은 향-염증성의 성질을 가진 에이코사노이드에 대한 전구체인 것으로 나타났고, 그래서 이들 에이코사노이드가 너무 많이 생성되면 염증과 염증성 질환을 증가시킬 수 있다. 따라서, 지질 조성물에서 이러한 지방산의 양을 최소화하는 것이 바람직할 수 있다. 식단에서 오메가-6 지방산 대 오메가-3 지방산의 비율은 4:1 이하이어야 한다는 것이 일반적으로 인정된다. 그러나, 정상적인 서양식 식단은 전형적으로 오메가-6 지방산의 더 높은 비율을 함유한다. 본 발명의 지질 조성물은 유리하게는 비교적 적은 양의 오메가-6 지방산을 함유하는 한편, 동시에 비교적 많은 양의 보다 유익한 오메가-3 지방산을 함유한다. 일 실시형태에서, 조성물 중 오메가-6 다중불포화된 지방산의 총량은 조성물의 총 지방산 함량의 최대 약 8 중량%이다. 다른 실시형태에서, 조성물 중 오메가-6 다중불포화된 지방산의 총 중량에 대한 오메가-3 다중불포화된 지방산의 총 중량의 비는 적어도 약 6:1이다. 추가의 실시형태에서, 조성물 중 오메가-6 다중불포화된 지방산의 총 중량에 대한 오메가-3 다중불포화된 지방산의 총 중량의 비는 적어도 약 8:1이다.
오메가-9 지방산은 신체에서 생성될 수 있는 단일불포화된 지방이다. 다른 유형의 지방 대신 오메가-9 지방산이 풍부한 식품의 섭취는 당뇨병이 있는 환자에서 혈장 트리글리세라이드와 "나쁜" 극-저-밀도-지질 단백질 (VLDL) 콜레스테롤을 감소하는 것, 염증을 감소하는 것 및 인슐린 민감성을 개선하는 것을 포함하여 건강에 유익한 다수의 효과가 있을 수 있다. 일 실시형태에서, 지질 조성물 중 오메가-3 및 오메가-9 다중불포화된 지방산의 총량은 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 60% 또는 적어도 약 70%이다. 추가의 실시형태에서, 조성물 중 오메가-6 다중불포화된 지방산의 총 중량에 대한 오메가-3 및 오메가-9 다중불포화된 지방산의 총 중량의 비는 적어도 약 5:1, 예를 들어, 적어도 약 10:1이다.
장쇄 다중불포화된 지방산을 함유하는 지질 조성물은 전형적으로 해양 공급원 (예를 들어, 어류, 갑각류), 조류 공급원 또는 식물 공급원 (예를 들어, 아마 또는 에슘)으로부터 획득된다. 출발 유기물은 그 안에 함유된 오일 (일반적으로 "조" 오일로 언급됨)을 추출하기 위해 먼저 처리된다. 예를 들어, 식물 종자의 경우, 종자를 분쇄하여 오일을 방출한 다음 여과 및/또는 디캔팅에 의해 고형물로부터 분리한다. 조 오일은 종종 이용하기에는 너무 낮은 (예를 들어, 영양 제품) 다중불포화된 지방산의 수준을 함유하고 따라서 농축이 요구된다. 조 오일이 하나 이상의 필수 성분을 결여하는 경우, 원하는 조성물을 얻기 위해 다수의 공급원 (예를 들어, 어류 및 조류)으로부터의 조 오일 또는 농축 오일을 함께 혼합하는 것이 종종 일반적이다. 대안적으로, 농축은 조 오일을 가공하여 원하지 않는 성분 (예를 들어, 제품의 색상, 냄새 또는 안정성에 해로운 영향을 미치는 성분 또는 원하지 않는 지방산)을 제거하는 반면, 원하는 지방산 성분의 수준을 최대화함에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 조성물은 유리하게는 단일 공급원으로부터 획득가능하다. 단일 공급원의 사용은 조 오일의 효율적이고 경제적인 가공 및 본 발명의 지질 조성물의 제조를 용이하게 한다. 문구 "단일 공급원으로부터 획득가능" (또는 "단일 공급원으로부터 획득된")은 지질 조성물이 단일 분류학 부류의 하나 이상의 유기체로부터 획득가능함을 의미한다. 특정 실시형태에서, 지질 조성물은 상이한 분류학 부류에 걸쳐 다수의 유기체로부터 유래되지 않는다. 예를 들어, 지질 조성물은 어류와 조류의 조합 또는 어류와 식물의 조합에서 얻은 오일의 블렌드가 아닐 수 있다. 대신, 본 발명의 지질 조성물 (또는 에스테르 교환반응 및 증류와 같은 농축 기술에 의해 조성물이 획득될 수 있는 "조" 오일)은 유기체의 단일 모집단, 예를 들어 식물 물질 또는 초목의 단일 공급원으로부터 획득될 수 있다. 의심의 여지를 없애기 위해, 문구 "단일 공급원으로부터 획득가능한"은 동일한 종의 다수의 유기체를 지질 조성물 또는 "조" 오일의 공급원으로 사용하는 것, 즉, 다수의 어류, 조류 계통, 식물, 또는 같은 종의 것인 식물 종자의 사용을 배제하지 않는다. 상기 다수의 유기체는 바람직하게는 모두 동일한 종, 또는 동일한 육종 계통, 또는 동일한 식물 품종, 또는 동일한 생성 계통 또는 배치로부터의 것이다.
특히 본 발명의 지질 조성물에서, DHA는 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 약 20% 내지 약 35% (예컨대 약 22% 내지 약 33%)의 양으로 존재한다.
본 발명의 지질 조성물은 유리하게는 존재하는 EPA의 양에 비해 높은 수준의 DHA를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일 실시형태에서, 지질 조성물에서 도코사헥사엔산 대 에이코사펜타엔산의 중량비는 적어도 약 20:1이다. 추가 실시형태에서, 지질 조성물에서 도코사헥사엔산 대 에이코사펜타엔산의 중량비는 약 25:1 초과, 예컨대 약 30:1 초과, 가장 특히 약 35:1 초과일 수 있다.
바람직하게는, 조성물에서 EPA의 양은 상대적으로 적을 수 있다. 본 발명의 조성물은 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 최대 약 5% EPA를 함유한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 최대 약 3%, 보다 특별하게 최대 약 1% EPA를 함유한다.
본 발명의 조성물은 조성물의 총 지방산 함량의 약 10 중량% 내지 약 20 중량%의 양으로 α-리놀렌산 (ALA)을 함유한다. ALA는 적절한 인간 또는 동물 건강에 중요한 필수 지방이다. 특정 실시형태에서, 조성물은 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 약 12% 내지 약 20%, 보다 특별하게 약 12% 내지 약 18%의 양으로 ALA를 함유한다.
올레산은 본 발명의 조성물의 성분으로서, 조성물의 총 지방산 함량의 약 20 중량% 내지 약 40 중량%의 양으로 존재한다. 올레산은 인간의 식단에서 일반적인 단일불포화된 지방이다. 단일불포화된 지방 소비는 감소된 저-밀도 지단백 (LDL) 콜레스테롤 및 가능하기로는 증가된 고-밀도 지단백 (HDL) 콜레스테롤과 관련되어 있다. 일 실시형태에서, 올레산은 조성물의 총 지방산 함량의 약 20 중량% 내지 약 35 중량%의 양으로 존재한다. 추가 실시형태에서, 올레산은 조성물의 총 지방산 함량의 약 22 중량% 내지 약 33 중량%의 양으로 존재한다.
본 발명의 조성물은 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 최대 약 1.5% 팔미트산 (16:0)을 함유한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 최대 약 1.0%, 보다 특별하게 최대 약 0.7% 팔미트산을 함유한다.
본 발명의 조성물은 또한 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 적어도 약 0.5% 에이코사테트라엔산 (ETA, 20:4n-3)을 함유한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 적어도 약 1.0%, 보다 특별하게 적어도 약 1.5% ETA를 함유한다.
본 발명의 주어진 양상, 특징 또는 실시형태에 대한 선호 및 옵션은, 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 본 발명의 모든 다른 양태, 특징 및 실시형태에 대한 임의의 및 모든 선호도 및 옵션과 함께 개시된 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 선행하는 구절에 표시된 DHA, EPA, ALA, 올레산 및 팔미트산의 특정 양은 모든 조합으로 개시된다.
따라서 언급될 수 있는 특정 지질 조성물은 다음을 포함하는 것이다:
(i) 조성물의 총 지방산 함량의 약 20 중량% 내지 약 35 중량%의 양으로 도코사헥사엔산 (22:6n-3);
(ii) 조성물의 총 지방산 함량의 최대 약 3 중량%의 양으로 에이코사펜타엔산 (20:5n-3);
(iii) 조성물의 총 지방산 함량의 약 12 중량% 내지 약 20 중량%의 양으로 α-리놀렌산 (18:3n-3);
(iv) 조성물의 총 지방산 함량의 약 20 중량% 내지 약 35 중량%의 양으로 올레산 (18:1n-9); 및
(v) 조성물의 총 지방산 함량의 최대 약 1.0 중량%의 양으로 팔미트산;
여기서 성분 (i) 내지 (v)는 각각 독립적으로 지방산, 지방산 염, 지방산 에스테르 또는 지방산 에스테르의 염의 형태로 제공된다.
본 발명의 조성물에서, 성분 (i) 내지 (v)는 각각 지방산, 지방산 염, 지방산 에스테르 또는 지방산 에스테르의 염의 형태로 존재할 수 있는 지방산이다. 특정 실시형태에서, 이들 성분은 각각 동일한 형태를 취하며, 예를 들어, 그것들은 모두 지방산의 형태, 모두 지방산 염의 형태, 모두 지방산 에스테르의 형태 또는 모두 지방산 에스테르의 염의 형태일 수 있다. 성분이 지방산 염, 에스테르 또는 에스테르의 염의 형태인 경우, 성분은 동일한 염, 에스테르 또는 에스테르의 염의 형태일 수 있다. 예를 들어, 성분 (i) 내지 (v) 각각은 지방산의 에틸 에스테르의 형태로 제공될 수 있다.
특정 실시형태에서, 성분 (i) 내지 (v)는 지방산 에스테르의 염의 형태로, 또는 가장 특별하게 지방산 에스테르의 형태로 제공된다. 적합한 지방산 에스테르 형태는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 영양학적으로 허용가능한 및/또는 약학적으로 허용가능한 지방산 에스테르 형태는 지방산의 에틸 에스테르, 메틸 에스테르, 인지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드 및 트리글리세라이드를 포함한다. 지질 조성물의 의도된 사용에 따라 다른 에스테르 형태가 요구될 수 있다. 예를 들어, 트리글리세라이드는 부분적으로 열 처리에 대한 이들 에스테르 형태의 맛과 안정성 (이러한 식품에 대해 필요할 수 있음)으로 인해 인간 소비, 특히 유아 소비용 식품에 사용하기에 특히 적합하다. 에틸 에스테르는 이들 에스테르 형태가 효율적이고 용이하게 제조될 수 있고 트리글리세라이드 형태로의 전환이 필요하지 않기 때문에 식이 보충제에 사용하기에 특히 적합하다. 따라서, 추가 실시형태에서, 성분 (i) 내지 (v)는 각각 독립적으로 지방산 에틸 에스테르의 형태로 또는 트리글리세라이드의 일부로서 제공된다.
트리글리세라이드는 글리세롤과 3개 지방산으로부터 유래된 에스테르이다. 본 발명은 지방산의 블렌드에 관한 것이므로, 이러한 트리글리세라이드의 지방산 성분은 상응하는 비율로 혼합될 수 있다. 즉, 상이한 트리글리세라이드 분자의 혼합물이 조성물에 존재할 수 있지만, 조성물에서 전반적인 지방산 프로필은 청구범위에 정의된 바와 같다.
지방산 성분은 대안적으로 "유리" 지방산의 형태, 즉 지방산의 -COOH 형태로 존재할 수 있다. 그러나, 본 발명의 특정 조성물에서, 조성물은 그것들이 불쾌한 (종종 "비누같은") 맛과 연관되고 에스테르화된 형태로 되는 지방산보다 덜 안정하기 때문에 이 형태에서 지방산의 상대적으로 낮은 수준을 함유한다. 유리 지방산은 전형적으로, 예를 들어, 본원에 다른 곳에서 논의된 과정에 따라 알칼리 또는 물리적 정제의 방식에 의해 오일 및 지질 조성물에서 제거된다. 따라서, 일 실시형태에서, 지질 조성물에서 총 유리 지방산 함량은 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 5% 미만 (예컨대 3% 미만, 특별하게 2% 미만)이다.
본 발명의 지질 조성물에서 지방산은 전형적으로 선형 (즉, 분지되지 않은) 사슬 지방산 (예컨대, DHA, ALA 등)이다. 언급될 수 있는 본 발명의 조성물은 조성물이 본질적으로 분지된 사슬 지방산 및 분지된 사슬 지방산 에스테르가 없도록 매우 낮은 수준의 분지된 사슬 지방산 및 이들의 에스테르를 함유하는 것들을 포함한다. 용어 "낮은 수준"은 조성물이 조성물의 총 지방산의 최대 약 0.1 중량%의 양으로 분지된 사슬 지방산 및 지방산 에스테르를 함유한다는 것을 의미한다.
본 발명의 지질 조성물은 또한 원료 물질로부터 유래되고 추출 및 농축 과정 동안 완전히 제거되지 않는 다른 성분 (예를 들어, 지방산 이외)을 함유할 수 있다. 이들 다른 성분들의 정확한 동정은 원료 물질에 따라 크게 다를 것이다. 이러한 다른 성분의 예는 유리 스테롤 또는 스테롤 에스테르로 존재하는 피토스테롤 (즉, 식물 스테롤 및 식물 스타놀)을 포함한다 (예컨대, β-시토스테롤, β-시토스타놀, Δ5-아베나스테롤, 캄페스테롤, Δ5-스티그마스테롤, Δ7-스티그마스테롤 및 Δ7-아베나스테롤, 콜레스테롤, 브라시카스테롤, 찰리나스테롤, 캄페스테롤, 캄페스타놀 및 에부리콜). 다른 예는 토코페롤 및 토코트리에놀과 같은 항산화 제를 포함한다. 따라서, 언급될 수 있는 본 발명의 특정 지질 조성물은 검출가능한 양의 하나 이상의 피토스테롤 (예컨대, β-시토스테롤)을 함유하는 것들을 포함한다. 이러한 스테롤은 지질 조성물의 중량을 기준으로 적어도 약 0.01%, 전형적으로 약 1% 이하로 존재할 수 있다.
본 발명의 조성물은 유리하게는 식물 공급원 ("식물성" 공급원)으로부터 획득가능하다. 용어 "식물성-기반"은 본 발명의 조성물에 존재하는 지질의 적어도 70 중량%가 식물성 공급원으로부터 획득된다는 것을 의미한다. 식물성 공급원은 식물 공급원, 특히 곡물과 같은 작물을 포함한다. 적어도 하나의 실시형태에서, 지질은 브라시카(Brassica), 예를 들어 브라시카 나푸스(Brassica napus) 또는 브라시카 준세아(Brassica juncea)와 같은 종자오일 작물로부터 획득된다. 그러나, 의심의 여지를 없애기 위해, 조성물이 이러한 공급원으로부터만 얻어지는 것이 필수적인 것은 아니며, 즉, 본 발명의 조성물에서 지질의 비율 (예를 들어, 최대 30 중량%)는 해양 (예를 들어, 어류 또는 갑각류) 오일, 조류 오일 및 이들의 조합을 포함한 공급원으로부터 획득될 수 있다. 일 예에서, 존재하는 지질의 중량을 기준으로 적어도 80%, 예를 들어 적어도 90%는 식물성 공급원으로부터 획득된다. 본 발명의 특정 조성물에서, 본질적으로 모든 지질 (즉, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 약 100%)은 식물성 공급원으로부터 획득된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물 (및 이후에 정의된 사료 및 약학적 조성물)은 동물 (예를 들어, 해양 동물) 기원이 아니다. 즉, 그러한 실시형태에서 지질 조성물은 어류 및 갑각류와 같은 동물로부터 공급되는 어떠한 성분도 함유하지 않는다. 동물로부터 어떠한 성분도 획득되지 않는 지질 조성물은 표준 정제 및/또는 농축 절차에 따라 달성될 수 있는 지질 함량 및 안정성 프로필 측면에서 유리한 것으로 여겨진다.
지질 또는 지방산 공급원으로 식물의 사용은 다수의 이점을 제공한다. 예를 들어, 오일의 해양 공급원은 식물 재료에서 발견되지 않는 상대적으로 높은 수준의 오염 물질 (예컨대, 수은, PCB 및 어류 알레르겐 (예를 들어, 파브알부민))을 함유하는 것으로 알려져 있다. 역사적인 남획은 또한 어류와 갑각류 (예를 들어, 크릴)의 재고를 고갈시켜 그것들은 더 이상 지속가능하지 않다. 따라서 본 발명은 상대적으로 낮은 수준의 원치 않는 오염물을 함유하는 지속가능하게-공급되는 다중불포화된 지방산 오일 조성물을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 식물로부터 유래된다. 오일이 획득되는 식물은 전형적으로 코프라, 목화씨, 아마, 야자 씨, 땅콩, 유채씨, 대두 및 해바라기 씨와 같은 지방종자 작물이다. 식물로부터 독점적으로 획득된 조성물은 따라서 "식물성" 오일 또는 "식물성 지질 조성물"로 지칭될 수 있다. 본 발명의 지질 조성물이 획득될 수 있는 적합한 식물은 당업자에게 공지되어 있고, 브라시카 종 (Brassica sp.), 고시피움 히르수툼 (Gossypium hirsutum), 리눔 유시타티시뭄 (Linum usitatissimum), 헬리안투스 종 (Helianthus sp.), 카르타무스 틴크토리우스 (Carthamus tinctorius), 글리신 맥스 (Glycine max), 제아 메이스 (Zea mays), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 소르굼 비콜로르 (Sorghum bicolor), 소르굼 벌가레 (Sorghum vulgare), 아베나 사티바 (Avena sativa), 트리폴폴리움 종 (Trifolium sp.), 엘래시스 귀넨니스 (Elaesis guineenis), 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana), 호르데움 벌가레 (Hordeum vulgare), 루피누스 안구스티폴리우스 (Lupinus angustifolius), 오리자 사티바 (Oryza sativa), 오리자 글라베리마 (Oryza glaberrima), 카멜리나 사티바 (Camelina sativa), 또는 크람베 아비시니카 (Crambe abyssinica)를 포함한다. 이와 관련하여 언급될 수 있는 특정 식물 공급원은 브라시카 종 (Brassica sp.)이다.
적절한 공급원 (해양, 조류 및 식물 공급원을 포함함)은 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 장쇄 다중불포화된 지방산을 생산하는 이들의 능력을 증진시키기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 이 목적을 위해 유전적으로 변형된, 즉 재조합 식물 세포로부터 유래된 식물 공급원의 예는 당업자에게 공지되어 있으며 하기 국제 특허 출원 번호들에 개시되어 있다. PCT/AU2013/000639호 (WO 2013/185184호로 공개), PCT/AU2014/050433호 (WO 2015/089587호로 공개) 및 PCT/AU2015/050340호 (WO 2015/196250호로 공개). 유전자적으로 변형된 카놀라는 WO 2017/218969호 및 WO 2017/219006호에 기술되어 있다. 본원에 언급된 모든 간행물에서의 개시내용은 그 전체 내용이 인용되어 포함된다.
본 발명의 지질 조성물은 자연 발생 공급원 (예를 들어, 동물, 조류 및/또는 식물)으로부터 직접적으로 획득될 수 있다. 그러나, 자연적으로 발생하는 공급원에서 획득한 오일을 풍부하게 하기 위해 이들을 처리해는 것이 전형적으로 필요하다. 적합한 풍부화 공정은 실시예에서 예시된다.
본 발명의 지질 조성물, 또는 이들 조성물을 생산하기 위해 혼합되거나 풍부화될 수 있는 "조" 오일의 적절한 공급원은 해양 종(marine species), 조류 및 식물을 포함한다. 해양 공급원으로부터 오일을 획득하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
식물 공급원 (예컨대 유지종자 공급원)은 상기에서 설명된 바와 같이, 특정 오염물질의 낮은 수준 및 월등한 지속가능성 때문에 특히 적합하다. 브라시카 종 (Brassica sp.)과 같은 식물 (예를 들어, 카놀라)는 기름을 획득하기 위해 가공될 수 있는 종자를 생산하다.
오일/지질의 추출
식물 및 종자에 의해 생산된 오일을 추출, 가공 및 분석하기 위해 당업계에서 일상적으로 실행되는 기술이 사용될 수 있다. 전형적으로 식물 종자는 요리되고, 압축되고, 오일 추출되어 조 오일을 생산하다. 그 오일은 차례로 탈검, 정제, 표백 및/또는 탈취될 수 있다. 탈검, 정제, 표백 및 탈취의 조합은 DHA-풍부화된 지질 혼합물을 제조하는 데 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일 실시형태에서, 지질 조성물은 탈검, 정제, 표백 및/또는 탈취된 종자 오일로부터 획득된다. 그러나, 이 방식으로 오일을 처리할 필요는 없고 이들 방법 없이 적절한 정제 및 풍부화가 달성될 수 있다.
일반적으로, 종자를 분쇄하는 기술은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 유지종자는 수분 함량을, 예를 들어, 8.5%로 높이기 위해 물을 분사함에 의해 템퍼링되고 0.23mm에서 0.27mm의 간격 설정을 갖는 부드러운 롤러를 사용함에 의해 플레이크될 수 있다. 종자의 유형에 따라, 파쇄 이전에 물이 첨가되지 않을 수 있다. 추출은 또한 압출 공정을 사용하여 달성될 수 있다. 압출 공정은 플레이킹 대신에 사용되거나 사용되지 않을 수 있고, 때때로 스크류를 가압하기 전이나 후에 부가적(add-on) 공정으로 사용된다.
일 실시형태에서, 대부분의 종자 오일은 스크류 프레스를 사용하여 분쇄함에 의해 방출된다. 스크류 프레스에서 배출된 고체 물질은 그 다음 용매, 예를 들어 헥산으로, 히트 트레이스드 칼럼을 사용하여 추출되고, 그 후 용매는 추출된 오일에서 제거된다. 대안적으로, 압착 작업에 의해 생성된 조 오일은 슬롯된 와이어 배수 상단을 갖는 침전 탱크를 통과하여 압착 작업 동안에 오일로 발현된 고형물을 제거할 수 있다. 정화된 오일은 임의의 남아있는 미세한 고체 입자를 제거하기 위해 플레이트와 프레임 필터를 통과할 수 있다. 원하는 경우 추출 공정에서 회수된 오일을 정화된 오일과 조합하여 혼합된 조 오일을 생성할 수 있다. 용매가 조 오일에서 제거되면, 압축 및 추출된 부분을 조합하고 통상적인 오일 가공 절차를 거친다.
정화 및 정제
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "정제된"은 본 발명의 지질 또는 오일과 관련하여 사용될 때 전형적으로 추출된 지질 또는 오일이 지질/오일 성분의 순도를 증가시키기 위해 하나 이상의 가공 단계를 거쳤음을 의미한다. 예를 들어, 정제 단계는 추출된 오일을 탈검, 탈취, 탈색 또는 건조 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "정제된"은 총 지방산 함량의 백분율로서 DHA 함량을 증가시키기 위해 본 발명의 지질 또는 오일의 지방산 조성을 변경하는 에스테르 교환반응 공정 또는 다른 공정을 포함하지 않는다. 달리 표현하면, 정제된 지질 또는 오일의 지방산 조성은 본질적으로 정제되지 않은 지질 또는 오일의 지방산 조성과 동일하다.
식물 오일은 일단 식물 공급원에서 추출된 후 다음 공정 중 하나 이상을 사용하고, 특히 탈검, 알칼리 정화, 표백 및 탈취의 조합을 사용하여 정화 (정제)될 수 있다. 적합한 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, WO 2013/185184에 개시된 방법).
탈검은 오일 정제의 초기 단계이고 그것의 주요 목적은 오일에서 대부분의 인지질의 제거이다. 조 오일에 70 내지 80℃에서, 전형적으로 인산을 함유하는 약 2%의 물의 첨가는 미량 금속 및 안료와 함께 대부분의 인지질의 분리를 초래한다. 제거되는 불용성 물질은 주로 인지질과 트리아실글리세롤의 혼합물이다. 탈검은 진한 인산을 조 종자오일에 첨가하여 수화 불가능한 인산염을 수화가능한 형태로 전환하고 존재하는 소량의 금속을 킬레이트화함에 의해 수행될 수 있다. 검은 원심분리에 의해 종자오일에서 분리된다.
알칼리 정화는 조 오일을 처리하기 위한 정화 공정 중 하나이며, 때로는 중화로도 지칭된다. 그것은 일반적으로 탈검 후이고 표백에 선행한다. 탈검 후, 종자오일은 모든 유리 지방산과 인산을 적정하기 위해 충분한 양의 알칼리 용액의 첨가와, 이렇게 형성된 비누를 제거함에 의해 처리될 수 있다. 적합한 알칼리성 물질은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 수산화리튬, 수산화칼슘, 탄산칼슘 및 수산화암모늄을 포함한다. 알칼리 정화는 전형적으로 실온에서 수행되고 유리 지방산 분획을 제거한다. 비누는 원심분리 또는 비누용 용매 안으로 추출에 의하여 제거되고 중화된 오일은 물로 세정된다. 필요한 경우, 오일에서의 과도한 알칼리는 염산 또는 황산과 같은 적절한 산으로 중화될 수 있다.
표백은 표백 토 (0.2 내지 2.0%)의 존재 및 질소 또는 증기로 작동함에 의해 또는 진공에서 산소의 부재에서 오일을 90 내지 120℃에서 10 내지 30분 동안 가열하는 정화 공정이다. 표백은 원치 않는 색소 (카로티노이드, 엽록소, 등)를 제거하도록 설계되고, 본 공정은 또한 산화 생성물, 미량 금속, 황 화합물 및 미량의 비누를 제거한다.
탈취는 고온 (예를 들어, 약 180℃) 및 저압 (0.1 내지 1 mmHg)에서 오일 및 지방의 처리이다. 이는 전형적으로 약 0.1 ml/분/100 ml의 종자오일의 속도로 종자오일 안으로 증기를 도입함에 의해 달성된다. 약 30분의 살포 후, 종자오일은 진공 하에서 냉각된다. 이 처리는 종자오일의 색상을 개선하고 임의의 남아있는 유리 지방산, 모노아실글리세롤 및 산화 생성물을 포함한 대부분의 휘발성 물질 또는 악취 화합물을 제거한다.
겨울화 (Winterisation)는 주변-이하 온도에서 결정화에 의해 오일과 지방을 고체 (스테아린) 및 액체 (올레인) 분획으로 분리를 위한 오일의 상업적 생산에 때때로 사용되는 공정이다. 원래는 면실유에 적용되어 고체-없는 생성물을 생산했다. 그것은 전형적으로 오일의 포화 지방산 함량을 줄이기 위해 사용된다.
에스테르 교환반응
조 오일은 일반적으로 트리아실글리세롤 (TAG)의 형태로 원하는 지방산을 함유한다. 에스테르 교환반응은 TAG 내부 및 그 사이에서 지방산을 교환하거나 지방산을 다른 알코올로 전이하여 에스테르 (예컨대 에틸 에스테르 또는 메틸 에스테르)를 형성하기 위해 사용될 수 있는 공정이다. 본 발명의 실시형태에서, 에스테르 교환반응은 전형적으로 촉매로서 강산 또는 염기를 포함하는 화학적 수단을 사용하여 달성된다. 에톡사이드 나트륨 (에탄올 내)은 에스테르 교환반응을 통해 지방산 에틸 에스테르를 형성하는데 사용되는 강염기의 예이다. 공정은 주변 온도 또는 상승된 온도 (예를 들어, 최대 약 80℃)에서 수행될 수 있다.
증류
분자 증류는 조 오일로부터 포화된 지방산과 같은 보다 휘발성 성분의 상당한 양을 제거하는 효과적인 방법이다. 증류는 전형적으로 감압, 예를 들어 약 1 mbar 이하에서 수행된다. 그 다음 온도 및 시간은 얼마간 (예를 들어, 1 내지 10) 시간의 증류 시간 후에 증류물과 잔류물 사이에 대략적으로 50:50 분할을 달성하도록 선택될 수 있다. 본 발명의 지질 조성물의 생산에 사용되는 전형적인 증류 온도는 120℃ 내지 180℃, 특히 145℃ 내지 160℃이다.
다수의 증류가 수행될 수 있으며, 각 증류는 증류물과 잔류물 사이에 대략적으로 50:50 분할이 달성될 때 완료된 것으로 간주된다. 연속 증류의 사용은 전체 수율을 감소시키지만, 두 번의 증류는 최적의 결과를 산출할 수 있다.
따라서 본 발명의 제2 양태에 따르면, 본 발명의 지질 조성물을 제조하는 방법이 따라서 제공되며, 이 방법은 지방산 에틸 에스테르의 혼합물을 제공하는 단계; 그 혼합물을 제1 분자 증류 단계에 적용하여 제1 잔류물을 획득하는 단계; 및 제1 잔류물을 제2 분자 증류 단계에 적용하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 증류 공정에 의해 획득가능한 지질 조성물에 관한 것이다. 적합한 증류 조건은 본원에 기재된 것들을 포함한다. 예를 들어, 제1 및 제2 분자 증류 단계에서 사용될 수 있는 특정 증류 온도는 120℃ 내지 180℃의 영역 내, 예컨대 145℃와 160℃ 사이이다. 온도 및 시간은 전형적으로 약 1시간 내지 약 10시간의 증류 시간 후에 증류물과 잔류물 사이에 대략적으로 50:50 분할을 달성하도록 선택된다. 놀랍게도 식물성-기반 에스테르 교환된 오일의 증류는 분리 공정에 대한 효율성의 손실없이 다른 근원 (특히 상당한 양 (예를 들어, 30 중량% 이상)의 해양 근원의 오일을 갖는 것들)의 에스테르 교환된 오일과 동일하거나 그 보다 약간 낮은 (예를 들어, 3℃ 낮음) 온도에서 달성될 수 있다는 것이 발견되었다. 즉, 증류 시간을 늘릴 필요는 없지만, 합리적인 시간틀 내에 동일한 분리 정도 (예를 들어, 중량으로 50:50 분리)를 유지하면서 실제로는 줄일 수 있다.
일 실시형태에서, 조 오일은 제1 증류 단계에서 4 내지 8시간, 예컨대 4 내지 6시간 동안 가열된다. 동일하거나 다른 실시형태에서, 조 오일은 0.5 내지 4시간, 예컨대 1 내지 2시간 동안 제2 증류 단계에서 가열된다.
본 발명의 제2 양태의 실시형태에서, 지방산 에틸 에스테르의 혼합물은, 예를 들어 본원에서 이전에 기술된 공정 중 어느 하나에 따라 식물성-기반 지질 오일의 에스테르 교환반응에 의해 획득된다. 식물성-기반 지질 오일은 본원에 개시되거나 달리는 당업계에 공지된 임의의 식물, 특히 오일 종자로부터 획득될 수 있다.
기타 풍부화 방법
본 발명의 지질 조성물은 활성 약학적 성분 (API) 또는 API에 대한 전구체 (또는 "중간체")로서 유용하며, 이는 추가 풍부화의 방식에 의해 이로부터 획득될 수 있다. 이러한 조성물은 DHA 및/또는 ALA와 같은 유익한 PUFA의 수준이 더욱 풍부해질 것이다.
오일 내 다중불포화된 지방산의 농도는 예를 들어 동결 결정화, 요소를 사용한 복합체 형성, 초임계 유체 추출 및 은 이온 복합체화와 같은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 증가될 수 있다. 요소로 복합체 형성은 오일 내 포화 및 단일불포화된 지방산의 수준을 감소시키는 간단하고 효율적인 방법이다. 초기에, 오일의 TAG는 종종 지방산 에스테르의 형태에서의 이들의 구성 지방산으로 분할된다. 일반적으로 처리에 의해 지방산 조성이 변경되지 않는 이들 유리 지방산 또는 지방산 에스테르는 그 다음 복합체 형성을 위해 요소의 에탄올 용액과 혼합될 수 있다. 포화 및 단일불포화된 지방산은 요소와 쉽게 복합체를 형성하고 냉각시 결정 석출하고 이어서 여과에 의해 제거될 수 있다. 비-우레아 복합체화된 분획은 이에 따라 장쇄 다중불포화된 지방산이 풍부하게 된다.
생성물
본 발명의 지질 조성물은 벌크 오일이다. 즉, 지질 조성물은 지질의 일부 또는 전부가 획득된 공급원 물질 (예를 들어, 식물 종자)로부터 분리되었다.
본 발명의 지질 조성물은 사료로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 경구로 이용가능한 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, "사료"는 체내로 섭취될 때 영양을 공급하거나 조직을 형성하거나 에너지를 공급하는 작용을 하고; 및/또는 적절한 영양 상태 또는 대사적 기능을 유지, 복원 또는 지원하는 인간 또는 동물 소비를 위한 모든 음식 또는 제제를 포함하다. 사료는, 예를 들어, 유아용 조제분유와 같은 영아 및/또는 유아용 영양 조성물을 포함한다. 사료의 경우에 있어, 임의의 불쾌한 맛을 더욱 최소화하고 안정성을 극대화하기 위해 지방산이 트리글리세라이드의 형태로 제공될 수 있다.
사료는 선택적으로 적합한 담체와 함께 본 발명의 지질 조성물을 포함한다. 용어 "담체"는 영양적 가치를 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있는 임의의 성분을 포괄하기 위해 가장 넓은 의미로 사용된다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 담체는 사료를 소비하는 유기체에 해로운 영향을 미치지 않도록 사료에 사용하기에 적합해야 한다 (또는 충분히 낮은 농도로 사용되어야 한다).
사료 조성물은 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 추가로, 조성물은 식용 다량영양소, 단백질, 탄수화물, 비타민 및/또는 미네랄을 당업계에 잘-알려진 바와 같이 특정 용도에 바람직한 양으로 포함할 수 있다. 이들 성분의 양은 조성물이 정상적인 개체에게 사용하기 위한 것인지 또는 대사 장애 등을 앓고 있는 개체와 같은 특화된 요구를 가진 개체에게 사용하기 위한 것인지에 따라 달라질 것이다.
영양적 가치가 있는 적절한 담체의 예는 식용 지방 (예를 들어, 코코넛 오일, 보리지 오일, 곰팡이 오일, 블랙 커렌트 오일, 대두유, 및 모노- 및 디글리세리드), 탄수화물 (예를 들어, 포도당, 식용 락토스 및 가수분해 전분) 및 단백질 (예를 들어, 대두 단백질, 전기투석 유청, 전기투석 탈지유, 우유 유청 또는 이들 단백질의 가수분해물)과 같은 다량영양소를 포함한다.
본원에 개시된 사료에 첨가될 수 있는 비타민 및 미네랄은 예를 들어 칼슘, 인, 칼륨, 나트륨, 염화물, 마그네슘, 망간, 철, 구리, 아연, 셀레늄, 요오드 및 비타민 A, E, D, C 및 B 복합체를 포함한다.
본 발명의 지질 조성물은 약학적 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 선택적으로 당업자에게 공지된 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 지질 조성물을 포함한다. 적합한 부형제, 희석제 또는 담체는 인산염-완충 식염수, 물, 에탄올, 폴리올, 습윤제 또는 에멀젼 예컨대 물/오일 에멀젼을 포함한다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 오일 또는 분말을 포함하는 액체 또는 고체 형태로 될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 정제, 캡슐, 캡슐화된 겔, 섭취가능한 액체 (오일 또는 용액 포함) 또는 분말, 또는 국소 연고 또는 크림의 형태로 될 수 있다. 약학적 조성물은 또한 정맥내 제제로 제공될 수 있다.
사료 및 약학적 조성물에 적합한 특정 형태는 액체-함유 캡슐 및 캡슐화된 겔을 포함한다.
본 발명의 지질 조성물은 사용 이전에 다른 지질 또는 지질 혼합물 (특히 식물성-기반 지방산 에스테르 및 지방산 에스테르 혼합물)과 혼합될 수 있다. 본 발명의 지질 조성물은 항산화제 (예를 들어, 토코페롤 (예컨대 알파-토코페롤 또는 감마-토코페롤) 또는 토코트리에놀), 안정화제 및 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 성분과 함께 제공될 수 있다. 알파-토코페롤과 감마-토코페롤은 둘 모두 카놀라유를 포함한 다양한 식물 종자 오일에서 자연적으로 발생하는 성분이다.
예를 들어, 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이러한 불활성 희석제 외에, 조성물은 또한 습윤제, 유화 및 현탁제, 감미제, 향미제 및 방향제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 본 발명의 지질 조성물에 부가하여, 현탁제는 에톡실화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정질 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가, 및 트라가칸트 또는 이들 물질의 혼합물과 같은 현탁 제제를 포함할 수 있다.
정제 및 캡슐과 같은 고체 복용 형태는 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 생성된 지방산은 아카시아, 옥수수전분 또는 젤라틴과 같은 결합제, 감자전분 또는 알긴산과 같은 붕해제 및 스테아르 산 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제와 조합하여 락토오스, 수크로스 및 옥수수전분과 같은 통상적인 정제 베이스로 정제화될 수 있다. 캡슐은 관련 지질 조성물 및 선택적으로 하나 이상의 항산화제와 함께 이들 부형제를 젤라틴 캡슐에 혼입시킴에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 가능한 투여 경로는, 예를 들어, 장내 (예를 들어, 경구 및 직장) 및 비경구를 포함한다. 예를 들어, 액체 제제는 경구 또는 직장으로 투여될 수 있다. 추가로, 균질한 혼합물은 물에 완전하게 분산되고, 멸균 조건 하에서 생리학적으로 허용가능한 희석제, 방부제, 완충액 또는 추진제와 혼합되어 스프레이 또는 흡입제를 형성할 수 있다.
본 발명의 지질 조성물은 의약품으로 표시된다. 본 발명의 추가의 양태에 따르면, 약제로서 사용하기 위해 본원에서 상기에 기재된 임의의 약학적 조성물을 포함하는 본 발명의 조성물이 제공된다.
본 발명의 지질 조성물은 전형적으로 장쇄 다중불포화된 지방산과 관련된 다수의 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 지질 조성물 및 본원에서 상기에 기재된 약학적 조성물은, 당업자에게 잘-알려진 테스트를 사용하여 결정될 수 있는 바와 같이, 심혈관 질환의 치료 또는 예방, 심혈관 질환이 있는 환자의 사망에 대한 보호, 전체 혈청 콜레스테롤 수준의 감소, 높은 BP에서의 감소, HDL:LDL 비율의 증가, 트리글리세라이드의 감소 또는 아포지단백-B 수준의 감소에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 지질 조성물을 사용하여 상기 열거된 질병 및 상태를 치료 (또는 예방)하는 방법이 또한 개시된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은, 취해진 조치가 없을 때 발생할 수 있는 것과 비교하여, 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애의 진행을 역전, 완화, 억제하거나, 또는 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애의 발생 또는 발현을 지연, 제거 또는 감소시키는 것을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "예방하다", "예방" 및 "예방하는"은 주어진 병태를 획득하거나 발전시킬 위험의 감소, 또는 병들지 않은 대상체에서 상기 병태 또는 재발의 감소 또는 억제를 지칭한다.
특정 지방산의 전형적인 복용량은 0.1 mg 내지 20 g으로, 하루에 1 내지 5회 (매일 최대 100 g) 섭취되고, 특히 매일 약 10 mg 내지 약 1, 2, 5 또는 10 g (한 번 또는 다수의 복용)의 범위 내에 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 지방산, 특히 LC-PUFA의 최소 약 300 mg/일이 바람직하다. 그러나, 임의의 양의 지방산이 대상체에게 유익할 것임을 인식할 것이다.
약학적 조성물로 사용될 때, 환자에게 투여되어 지는 지질 조성물의 복용량은 당업자에 의해 결정될 수 있고 환자의 체중, 환자의 연령, 환자의 전반적인 건강, 환자의 과거 이력, 환자의 면역 상태 등과 같은 다양한 요인에 의존할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개선된 안정성 프로필을 가질 수 있고 오메가-3, 오메가-6 및/또는 오메가-9 지방산의 상대적 비율이 특히 인간의 건강에 유익한 지방산의 혼합물을 함유할 수 있는 쉽게 획득가능한 조성물이다. 안정성은 당업자에게 알려진 다양한 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 방법은 Rancimat 방법, 프로파날 형성의 평가 (특히 오메가-3 지방산에 적합), 헥사날 형성의 평가 (특히 오메가-6 지방산에 적합), "과산화물 값" 방법 (예를 들어, AOCS 공식 사용 방법 Cd 8-53 사용) 및 "p-아니시딘 값" 방법 (예를 들어, AOCS 공식 방법 Cd 18-90 사용)을 포함한다. 본 발명의 조성물은 참조 블렌드 (주요 LC-PUFA의 관점에서 유사한 조성을 갖지만 상당한 양의 동물 (어류) 근원의 지질을 함유하는 참조 블렌드)와 비교하여 향상된 안정성 프로필을 나타내지 않는 출발 혼합물로부터 획득가능하다는 것이 실시예에 나타나 있다.
본 발명의 조성물은 이들이 선행 기술에서 공지된 지질 조성물보다 효과적이며, 독성이 덜하고, 더 오래 작용하며, 더 강력하고, 더 적은 부작용을 초래하며, 더 쉽게 흡수될 수 있으며, 및/또는 더 양호한 약물동력학적 프로파일(예를 들어 더 높은 경구 생체이용률 및/또는 더 낮은 청소율)을 가지며, 및/또는 다른 유용한 약물학적, 물리적 또는 화학적 특성을 가질 수 있다는 이점을 또한 가질 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되고, 여기서:
도 1은 본원에서 기술된 카놀라유의 개선된 안정성을 입증하는, 카놀라유 및 참조 오일에 대한 프로파날 방출 데이터 (에스테르 교환반응 및 증류 후)를 도시하고; 그리고
도 2는 본원에서 기술된 카놀라유의 개선된 안정성을 입증하는, 카놀라유 및 참조 오일에 대한 프로파날 방출 데이터 (RBD 정화, 에스테르 교환반응 및 증류 후)를 도시한다.
일반적인 방법:
GC 샘플 제조 및 GC 매개변수
순수 지방산 에틸 에스테르는 50:50 클로로포름:메탄올 및 0.01% BHT에서 0.25% (v/v)로 희석되었다. 에틸 에스테르 용액은 클로로포름:메탄올에서 2.5 mg/mL로 희석되었다.
대조 검사는 카놀라유, 참치유 및 3 x 카놀라-DHA 오일에 대한 지방산 메틸 에스테르로 제조되었다. 이들은 GC 수행성을 확인하고 GC 시스템에서의 활성에 기인한 DHA 분해를 모니터링하기 위해 모든 샘플의 배치로 분석되었다.
메틸 에스테르는 다음과 같이 제조되었다:
순수 오일은 50:50 클로로포름:메탄올 & 0.01% BHT (부틸화된 하이드록시톨루엔)에서 0.33% (v/v)로 희석되었다. 50 μL의 0.05N Meth-Prep II 용액 (m-트리플루오로메틸페닐 트리메틸암모늄 하이드록사이드의 0.2N 메탄올 용액)을 첨가하고, 용액을 볼텍싱하고 40℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 최종 용액은 0.25% (v/v)의 오일에 동등하였다.
에틸 에스테르 (샘플) 및 메틸 에스테르 (검사)는 불꽃 이온화 검출기 (FID) 및 다음 매개변수를 사용하여 분할 주입으로 Shimadzu GC-2010 Plus 상에서 실행되었다.
칼럼: 30 m BPX-70, 0.32 mm 내경, 0.25 pm 필름 두께. 주입 부피: 0.5 μL
결과는 정규화된 영역으로 계산되었다 (즉, 지방산 피크가 식별되고 비-지방산 피크가 모든 피크 영역의 합계에서 제외된 후 영역 %).
에틸 에스테르 피크의 동정은 지방산 에틸 에스테르 크로마토그램을 지방산 메틸 에스테르 크로마토그램과 비교함에 의해 결정되었다. 상대적 용출 순서는 거의 동일했으나, 에틸 에스테르는 지방산 메틸 에스테르와 비교하여 나중에 그룹으로 용출되었다. 지방산 메틸 에스테르의 용출 순서는 참조 표준 및 GC-MS를 사용하여 이전에 확인되었다.
실시예
실시예 1 - 종자로부터 DHA 카놀라유 추출
미국 특허 공보 US 2018/0016590 A1호에 개시된 품종의 카놀라가 여름 작물로 재배되었다. 종자를 수확하고 분쇄하기 전에 실온에서 저장하였다.
272 kg의 종자를 분쇄하여 Kern Kraft KK80 스크류 프레스를 사용하여 DHA 오일을 생산했다. 착유기 칼라 히터 온도가 자동온도조절기 상의 최대 설정 온도로 설정되었다. 초기 주변 및 초크 온도는 20℃이고 초크 거리는 73.92 mm로 설정되었다. 모든 종자가 분쇄될 때까지 착유기를 멈춤이 없이 계속적인 오일과 가루 수집으로 종자가 공급되었다.
오거의 회전 속도, 가루의 온도 및 배출된 오일은 프레싱 전반에 걸쳐 모니터링되었다. 분쇄 시간은 270 kg의 경우 4시간으로 이것은 67.5 kg/hr의 처리 속도이다. 87.2 kg (32%) 조 오일의 수율이 얻어졌다. 미분을 제거하기 위해 여과한 후, 수율은 77.2 kg (28%)이었다.
실시예 2 - 참조 블렌드 오일
순수한 어유는 낮은 수준의 ALA 지방산과 상당히 높은 수준의 EPA 및 DHA를 함유한다. 참조 오일 블렌드 (본원에서 "조 트리글리세라이드 참조 블렌드 오일" 또는 이와 유사한 것으로 지칭됨)는 실시예 1에서 수득된 여과된 DHA 카놀라유에 조성이 가능한 유사하도록 설계되었다. 이것은 (a) 총 DHA의 수준을 DHA 카놀라유에서의 것과 일치시키고 (b) DHA/(ALA+EPA)의 비율을 일치시킴에 의해 수행되었다. 이것은 DHA가 풍부한 생선 오일 (참치), ALA가 풍부한 오일 (아마씨 오일) 및 표준 카놀라유를 블렌딩함에 의하여 달성되었다. 생성된 참조 블렌드 오일은 또한 DHA 카놀라유와 유사한 총 오메가-3 함량을 갖는다.
실시예 3 - 조 DHA 카놀라유 및 참조 블렌드의 지방산 조성
여과된 조 오일 및 참조 블렌드 오일의 지방산 조성을 분석하였다. 결과는 아래에 도시되어 있다.
Figure pct00001
실시예 4 - 오일 안정성 평가
Rancimat 안정성 연구는 각각 실시예 1 및 2에 기술된 조 DHA 카놀라유 및 참조 블렌드를 사용하여 수행되었다. 이 방법은 90℃에서 Metrohm 743 Rancimat의 표준 절차를 사용하여 약 2.5 g의 시험 재료를 시험하는 것을 포함하였다.
아래 표는 90℃에서 이들 오일로부터 얻어진 결과를 요약한다. 실험은 중복하여 수행되었다.
Figure pct00002
DHA 카놀라유는 참조 오일보다 지속적으로 열악한 안정성을 나타냈다.
실시예 5 - 조 카놀라-DHA 오일의 화학적 에스테르 교환반응
기계적 교반기가 장착된 건조된, 질소 플러시된 Buchi CR101 화학반응기에 무수 에탄올 (12.5 L) 및 실시예 1에서 수득된 조 트리글리세라이드 카놀라유 ("DHA 카놀라유") (5.00 kg)를 첨가하고 혼합물을 교반 하였다.
상기 혼합물에 소디움 에톡사이드 (150 g)를 첨가하고 이를 추가의 무수 에탄올 (2.5 L)로 반응기 안으로 흘려 넣고 주위 온도에서 16시간 동안 계속 교반하였다. 혼합물로부터 취한 샘플의 기록된 1H NMR 스펙트럼은 반응이 완료되었음을 나타냈다.
에스테르 교환반응 절차가 5.22 kg의 조 카놀라-DHA 오일에 대해 수행되었다. 생성된 조 반응 혼합물에 40 내지 60℃ 비등점 석유 주정 (pet. 주정, 10 L) 및 물 (10 L)을 첨가하고 혼합물을 철저히 혼합하면서 10% 염산 (총 870 mL 필요, Merck Universal Indicator 스트립, pH 0-14)으로 pH 7로 조심스럽게 산성화했다.
생성된 혼합물을 반응기에 정치하고, 그 후 2개의 상이 형성되었다. pet. 주정 층을 제거하고 수성 층을 pet. 주정으로 추가로 추출했다 (3x5 L). 조합된 pet. 주정 층을 반응기에 다시 복귀시키고 진공에서 적은 부피 (약 10 L)로 증발시켰다. 생성된 농축 용액을 반응기에서 배출하고 무수 황산 마그네슘 (대략 1 kg)으로 건조하고 여과하고 진공에서 농축하여 황색 오일 (5.13 kg)을 얻었다.
실시예 6 - 조 참조 블렌드 오일의 화학적 에스테르 교환반응
기계적 교반기가 장착된 건조 질소 플러시 Buchi CR101 화학 반응기에 무수 에탄올 (12.5L) 및 실시예 2에 따라 수득된 조 트리글리세라이드 참조 블렌드 오일 (5.00 kg)을 첨가하고 혼합물을 교반하였다.
상기 혼합물에 소디움 에톡사이드 (150 g)를 첨가하고 이를 추가의 무수 에탄올 (2.5 L)로 반응기 안으로 흘려 넣고 주위 온도에서 16시간 동안 계속 교반하였다. 샘플의 기록된 1H NMR 스펙트럼은 반응이 거의 또는 전혀 발생하지 않았음을 나타냈다. 추가의 소디움 에톡사이드 (57 g)를 혼합물에 첨가하고 계속 교반하였다.
추가 5시간 후, 샘플의 1H NMR 스펙트럼은 반응이 75% 완료되었음을 나타냈다. 추가로 소디움 에톡사이드 (에탄올 내 21% 용액 60 mL)를 혼합물에 첨가하고 3일 동안 계속 교반하고, 그 후 반응이 완료되었다.
조 참조 블렌드 화학적 에스테르 교환반응으로부터 실시예 생성물 분리
트랜스-에스테르 교환반응 절차가 5.17 kg의 조 참조 블렌드 오일에 대해 수행되었다. 생성된 조 반응 혼합물에 pet. 주정 (15 L)와 물 (3.3 L)을 첨가하고 혼합물을 철저히 혼합하면서 10% 염산 (총 910 mL 필요)으로 pH 7로 조심스럽게 산성화했다.
생성된 혼합물을 반응기에 정치하고, 그 후 2개의 상이 형성되었다. pet. 주정 층을 제거하고 수성 층을 pet. 주정으로 추가로 추출했다 (2x7.5 L). 조합된 pet. 주정 층을 반응기에 다시 복귀시키고 진공에서 적은 부피 (약 10 L)로 증발시켰다. 생성된 농축 용액을 반응기에서 배출하고 무수 황산 마그네슘 (대략 1 kg)으로 건조하고 여과하고 진공에서 농축하여 황색 오일 (5.39 kg)을 얻었다.
실시예 7 - 에스테르 교환된 오일의 지방산 조성 분석
실시예 5 및 6에서 수득된 에스테르 교환된 생성물의 지방산 조성을 분석하였다. 결과는 아래에 도시되어 있다.
Figure pct00003
실시예 8 - 에스테르 교환된 카놀라유의 증류
진공 증류에 의해 지방산 에틸 에스테르 (FAEE) 혼합물의 더 휘발성 성분의 제거를 위한 표준 절차
조 카놀라-DHA (실시예 5에서 수득됨)로부터의 조 지방산 에틸 에스테르 (FAEE)를 다음 조건 하에서 증류시켰다. 증류에 의한 분리는 증류물 및 잔류물을 수집하는 2 x 1000 ml 수집 플라스크가 장착된 진공 하에 있는 Pope 2 인치 (50 mm) 와이핑된 필름 스틸(still)을 통해 에스테르 교환된 조 오일을 통과시킴에 의해 달성되었다. 각각을 지방산 조성에 대해 분석했다.
진공은 Edwards 3 로터리 펌프에 의해 공급되었고 진공은 에브로 진공계 VM2000으로 측정되었다.
오일을 Cole-Palmer Instrument Company의 이지-로드 II 연동 펌프에 의해 4 mL/분으로 스틸에 공급하였고, 스틸 모터는 325 rpm으로 설정되었고, 물 응축기를 사용하여 증류물을 응축하였다. 하나 또는 다른 리시버 플라스크가 가득 찰 때까지 공급을 계속하였다.
조 카놀라-DHA FAEE는 초기에 147℃로 설정된 히터 밴드로 이들 조건 하에서 증류하였다. 목적은 50:50 분할의 증류물:잔류물을 수득하는 것이었다. 실험의 처음 30 내지 45분 동안, 히터 밴드의 온도를 154℃로 증가시켜 증류된 오일의 비율을 증가시키고 그런 다음 스틸이 평형을 유지하도록 했다. 반 시간 후, 히터 밴드의 온도를 반 시간에 걸쳐 149℃로 낮게 조정하였다. 나머지의 증류가 149℃에서 이루어졌다. 총 증류 시간은 350분이었다. 상기 증류로부터 잔류물의 일부는 다시 149℃로 설정된 히터 밴드의 온도로 표준 조건 하에서 증류에 의해 더 많은 휘발성 성분이 제거되었다. 총 증류 시간은 95분이었다.
Figure pct00004
실시예 9 - 에스테르 교환된 조 참조 블렌드-유래 FAEE의 증류
조 참조 블렌드 (실시예 6에서 수득됨)로부터의 조 지방산 에틸 에스테르 (FAEE)를 선행하는 실시예에서 나타난 바와 같은 조건 하에서 증류시켰다.
조 참조 블렌드 FAEE는 초기에 152℃로 설정된 히터 밴드로 이들 표준 조건 하에서 증류하였다. 목적은 50:50 분할의 증류물:잔류물을 수득하는 것이었다. 20분 후 히터 밴드의 온도를 154℃로 설정하여 증류물의 유동을 증가시켰다. 추가의 시간 후 히터 밴드 온도를 153℃로 조정하고 그 다음, 다음 시간에 걸쳐 152℃로 조정했다. 마지막 증류 시간 동안 히터 밴드 온도는 153℃로 설정하였다. 총 증류 시간은 380분이었다. 상기 증류로부터 잔류물은 다시 표준 조건 하에서 증류에 의해 더 많은 휘발성 성분이 제거되었다. 목적은 50:50 분할의 증류물:잔류물을 수득하는 것이었다. 증류는 대부분 150 내지 151℃로 설정된 히터 밴드로 수행되었다. 총 증류 시간은 195분이었다.
Figure pct00005
실시예 10 - 증류된 오일에 대한 지방산 조성 분석
실시예 8 및 9에서 수득된 이중-증류된 생성물의 지방산 조성을 분석하였다. 결과는 아래에 도시되어 있다.
Figure pct00006
실시예 11 - 오일 안정성 평가
헤드스페이스 (Headspace) GC-MS 안정성 시험
특정 조건 하에서 방출되는 프로파날의 양을 평가하기 위해 상기에서 기술된 풍부화 생성물에 대해 헤드스페이스 분석을 수행했다. 증가된 프로파날 방출 수준은 시험 재료에 대한 감소된 안정성을 입증한다.
SPME (고상 미세추출) 방법:
선택된 65 μm PDMS/DVB StableFlex 섬유 (Supelco 섬유 키트 57284-u)
섬유는 Triplus RSH 컨디셔닝 스테이션에서 250℃에서 사용하기 이전 10분 동안 컨디셔닝되었다.
샘플은 추출 이전 40℃에서 1분간 인큐베이션하였다.
헤드스페이스 바이알로부터 1분 동안 추출됨
광범위한 휘발성 성분을 포획할 수 있는 양호한 일반적인 방법인 것으로 예상됨.
GC 방법:
Thermo Scientific TRACE 1310 GC
Thermo Scientific TR-DIOXIN 5MS 칼럼, 0.25 mm 내부 직경, 30 m 필름 0.1 μm
분할 주입 250℃ 분할 83, 1.2 ml He/분
GC 램프: 5℃/분에서 40℃ 1분에서 100, 그 다음 50℃/분에서 300℃까지
헤드스페이스 분석을 위한 양호한 시너지를 갖는 일반 MS 특정 칼럼이 사용되었다. 칼럼 성능을 유지하기 위해 최대까지 램핑하기 전에 휘발성물질의 분리를 최대화하기 위해 느린 초기 온도 램프를 이용하였다. 주입구의 극저온 냉각에 대한 요구사항을 방지하고 칼럼 분리능을 증진시키기 위해 분할 주입을 이용하였다.
표준물질의 분리는 일부 피크 중첩에 의해 방해를 받았지만 여전히 정량화에 수용할 수 있었다. 3개 표준 교정 결과 (0.1, 0.01 및 0.01%)인, 분자 이온 m/z 56이 프로파날의 검출에 이용되었다. m/z 58에서 베이스 피크는 헥사날을 검출하기 위해 사용된다.
MS 방법:
Thermo Scientific DFS 고해상도 GC-MS
저해상도 (1000), 0.5s/스캔에서 전체 스캔 35-350Da
표준: - 프로파날 및 헥사날 표준 희석은 공급된 DHA 카놀라 에틸 에스테르로 만들어졌다. 이들 표준 혼합물을 그 다음 20 ml 헤드스페이스 바이알에 540 μl의 부피로 첨가했다.
전체 스캔을 이용하여, 특정 분자이외의 모든 전개된 생성물을 모니터링할 수 있었다.
헤드스페이스 안정성 결과:
하기 표는 실시예 8에서 수득된 이중-증류된 카놀라유와 실시예 9에서 수득된 이중-증류된 참조 오일로부터 얻은 결과를 T=0에서 4일까지 요약한다. 시험 샘플은 이 기간 동안 라이트 박스 상의 주변 온도와 형광 튜브 조명 아래에서 유지했다. m/z 58 분자 이온이 분석되었고, 질량 크로마토그램은 RT 1.37분에서 프로파날의 출현을 명확하게 나타낸다. 프로파날 전개는 아래 표에 정량화되어 있고, 데이터는 도 1에 도시되어 있다. DHA 카놀라유는 참조에 비해 카놀라유의 향상된 안정성을 입증하는 실질적으로 더 적은 양의 프로파날을 방출했다.
Figure pct00007
DHA 카놀라유는 참조 오일에 비해 산화에 대한 월등한 안정성을 나타낸다.
실시예 12 - DHA 카놀라유의 정화
실시예 1에서 수득된 카놀라유의 일부는 추가의 풍부화를 거치기 전에 정화되었다. 정화 공정은 탈검, 알칼리 정화, 표백 및 탈취를 포함한다.
산 탈검
탈검은 오일로부터 비-수화성 및 수화성 인지질의 제거이다. 실시예 1에서 수득된 건조된 조 오일을 53 ± 2℃로 가열하고 0.2%의 50% 시트르산 용액을 첨가하였다. 대략 30분의 혼합을 한 후, 2.0%의 가열된 (53 ± 2℃) 연수를 첨가하고 대략 30분 동안 혼합하였다. 유지하는 동안 오일을 67 ± 3℃로 가열한 다음 원심분리했다.
산 전처리/정제
정화는 이들을 수용성으로 만들고 원심분리에 의해 이들의 연속적 제거를 위해 가성으로 이들의 비누화 후 유리 지방산의 제거이다. 산 전처리 단계를 사용하여 인지질의 수화를 계속했다. 탈검된 오일을 65 ± 5℃로 가열하고 0.1%의 85% 인산을 첨가하고, 총 30분 동안 혼합하였다. 산 첨가 및 유지 시간 후, 20 Be' (Baume; 14.4%, w/w) 수산화나트륨을 첨가하여 유리 지방산 플러스 0.05% (w/w) 과잉을 중화시켰다. 그런 다음 가성 및 오일을 추가 15분 동안 혼합했다. 15분 유지하는 동안 오일을 62 ± 2℃로 가열하고, 그 다음 오일을 원심분리했다.
트리실 실리카 처리
표백에 적합한 수준으로 비누의 추가의 제거를 위해 트리실 실리카 처리를 수행했다. 트리실 전처리는 표백 단계와 조합하였다. 정화된 오일을 68 ± 5℃로 가열하고 0.3%의 트리실 300으로 처리하였다. 오일/트리실을 대략 15분 동안 혼합하고, 그 다음 표백을 계속하였다.
표백
정화된 오일은 과산화물, 인지질, 착색제 및 미량의 비누의 제거를 위해 흡착성 클레이로 처리하였다. 산 전처리 단계를 사용하여 인지질의 수화를 계속했다. 트리실 전처리된 오일을 0.2% (w/w)의 50% 시트르산 용액과 혼합했다. 15분의 혼합 후, Tonsil Supreme 126 FF 표백 클레이 2% (w/w)를 첨가했다. 그 다음 혼합물을 진공 하에서 90 ± 2℃로 가열하고 대략 30분 동안 유지하였다. 오일을 60 ± 2℃로 냉각시키고, 질소로 진공 파괴하고 1.0 kg의 여과 보조제를 첨가하고 여과하였다. 압력 용기: 500 L Cherry-Burrell 압력 용기, 증기 또는 냉각수 재킷, 혼합용 임펠러 및 배플이 있는 전 316 스테인리스 구조, 제조 일련 #E-227-94. 필터 프레스: 24" 폴리프로필렌 스페리 (Sperry) 필터 프레스, 용량 4.8 cu ft 필터, 종이 및 천 지지체가 사용되었다.
탈취
표백된 오일을 고온 및 저압에서 증기로 살포하여 악취 성분, 향미 성분 및 추가의 유리 지방산을 제거했다. 색상은 또한 상승된 온도에서 열 표백에 의해 감소된다. 표백된 오일의 절반을 1% 살포 스팀으로 180 ± 2℃에서 60분 동안 탈취하고 지방산 조성 (FAC)을 모니터링했다. 탈취 용기 (OD4): 400 L 구리세공 진공 등급 용기, 증기 또는 냉각수 재킷, 전 316 스테인리스 구조. 60분 유지 동안 180℃에서 약간의 DHA 수준의 감소가 관찰되었다. 그런 다음 180℃에서 30분 유지 동안 또 다른 시험을 수행했다. 생성물을 20-L 플라스틱 HDPE 통에 질소 하에서 포장하고 4℃에서 냉각기에 보관했다.
실시 예 13 - 원 참조 블렌드 오일의 정화
실시예 2에서 기술된 참조 블렌드의 일부는 추가의 풍부화를 거치기 전에 정화되었다. 정화 공정에서 참조 블렌드는 선행하는 실시예에서 나타난 바와 동일한 조건 하에서 정화시켰다.
실시예 14 - RBD DHA 카놀라유 및 RBD 참조 블렌드의 지방산 조성
RBD DHA 카놀라유 (실시예 12의 것) 및 RBD 참조 블렌드 오일 (실시예 13의 것)의 지방산 조성을 분석하였다. 결과는 아래에 도시되어 있다.
Figure pct00008
실시예 (및 첨부 도면)와 관련하여 "RBD"에 대한 언급은 해당 생성물이 실시예 12 (카놀라유의 경우) 및 실시예 13 (참조 블렌드의 경우)의 "정화된" 생성물로부터 직접적으로 또는 간접적으로 획득되었음을 의미한다.
실시예 15 - RBD 카놀라-DHA 오일의 화학적 에스테르 교환반응
기계적 교반기가 장착된 건조, 질소 플러시된 Buchi CR101 화학반응기에 무수 에탄올 (12.5 L) 및 실시예 12에서 수득된 정화된 ("RBD") 트리글리세라이드 카놀라-DHA 오일 (5.00 kg)를 첨가하고 혼합물을 교반 하였다.
상기 혼합물에 소디움 에톡사이드 (150 g)를 첨가하고 이를 추가의 무수 에탄올 (2.5 L)로 반응기 안으로 흘려 넣고 주위 온도에서 16시간 동안 계속 교반하였다. 혼합물로부터 취한 샘플의 기록된 1H NMR 스펙트럼은 반응이 완료되었음을 나타냈다.
에스테르 교환반응 절차가 대략 5 kg의 RBD 카놀라-DHA 오일에 대해 수행되었다. 생성된 조 반응 혼합물에 40 내지 60℃ 비등점 석유 주정 (pet. 주정, 10 L) 및 물 (10 L)을 첨가하고 혼합물을 철저히 혼합하면서 10% 염산 (총 870 mL 필요, Merck Universal Indicator 스트립, pH 0-14)으로 pH 7로 조심스럽게 산성화했다.
생성된 혼합물을 반응기에 정치하고, 그 후 2개의 상이 형성되었다. pet. 주정 층을 제거하고 수성 층을 pet. 주정으로 추가로 추출했다 (3x5 L). 조합된 pet. 주정 층을 반응기에 다시 복귀시키고 진공에서 적은 부피 (약 10 L)로 증발시켰다. 생성된 농축 용액을 반응기에서 배출하고 무수 황산 마그네슘 (대략 1 kg)으로 건조하고 여과하고 진공에서 농축하여 밝은 옅은 황색 오일 (수율: 99%)을 얻었다.
실시예 16 - RBD 참조 블렌드 오일의 화학적 에스테르 교환반응
기계적 교반기가 장착된 건조 질소 플러시 Buchi CR101 화학 반응기에 무수 에탄올 (12.5L) 및 실시예 13에 따라 수득된 RBD 트리글리세라이드 참조 블렌드 오일 (대략 5 kg)을 첨가하고 혼합물을 교반하였다.
상기 혼합물에 소디움 에톡사이드 (150 g)를 첨가하고 이를 추가의 무수 에탄올 (2.5 L)로 반응기 안으로 흘려 넣고 주위 온도에서 16시간 동안 계속 교반하였다. 샘플의 기록된 1H NMR 스펙트럼은 반응이 거의 또는 전혀 발생하지 않았음을 나타냈다. 추가의 소디움 에톡사이드 (57 g)를 혼합물에 첨가하고 계속 교반하였다.
추가 5시간 후, 샘플의 1H NMR 스펙트럼은 반응이 75% 완료되었음을 나타냈다. 추가로 소디움 에톡사이드 (에탄올 내 21% 용액 60 mL)를 혼합물에 첨가하고 3일 동안 계속 교반하고, 그 후 반응이 완료되었다.
RBD 참조 블렌드 화학적 에스테르 교환반응으로부터 실시예 생성물 분리
에스테르 교환반응 절차가 대략 5 kg의 RBD 참조 블렌드 오일에 대해 수행되었다. 생성된 조 반응 혼합물에 pet. 주정 (15 L)와 물 (3.3 L)을 첨가하고 혼합물을 철저히 혼합하면서 10% 염산 (총 910 mL 필요)으로 pH 7로 조심스럽게 산성화했다.
생성된 혼합물을 반응기에 정치하고, 그 후 2개의 상이 형성되었다. pet. 주정 층을 제거하고 수성 층을 pet. 주정으로 추가로 추출했다 (2x7.5 L). 조합된 pet. 주정 층을 반응기에 다시 복귀시키고 진공에서 적은 부피 (약 10 L)로 증발시켰다. 생성된 농축 용액을 반응기에서 배출하고 무수 황산 마그네슘 (대략 1 kg)으로 건조하고 여과하고 진공에서 농축하여 밝은 옅은 황색 오일 (수율: 99%)을 얻었다.
실시예 17 - 에스테르 교환된 RBD 카놀라유의 증류
진공 증류에 의해 지방산 에틸 에스테르 (FAEE) 혼합물의 더 휘발성 성분의 제거를 위한 표준 절차
RBD 카놀라-DHA (실시예 15에서 수득됨)로부터의 지방산 에틸 에스테르 (FAEE)를 다음 조건 하에서 증류시켰다. 증류에 의한 분리는 증류물 및 잔류물을 수집하는 2 x 1000 ml 수집 플라스크가 장착된 진공 하에 있는 Pope 2 인치 (50 mm) 와이핑된 필름 스틸을 통해 에스테르 교환된 오일을 통과시킴에 의해 달성되었다. 각각을 지방산 조성에 대해 분석했다.
진공은 Edwards 3 로터리 펌프에 의해 공급되었고 진공은 에브로 진공계 VM2000으로 측정되었다.
오일을 Cole-Palmer Instrument Company의 이지-로드 II 연동 펌프에 의해 4 mL/분으로 스틸에 공급하였고, 스틸 모터는 325 rpm으로 설정되었고, 물 응축기를 사용하여 증류물을 응축하였다. 하나 또는 다른 리시버 플라스크가 가득 찰 때까지 공급을 계속하였다.
RBD 카놀라-DHA FAEE는 초기에 152℃로 설정된 히터 밴드로 이들 조건 하에서 증류하여 50:50 분할의 증류물:잔류물을 수득하였다. 이 증류로부터 잔류물의 일부는 다시 152℃로 설정된 히터 밴드의 온도로 표준 조건 하에서 증류에 의해 더 많은 휘발성 성분이 제거되었다. 총 증류 시간은 90분이었다.
Figure pct00009
실시예 18 - 에스테르 교환된 RBD 참조 블렌드-유래 FAEE의 증류
RBD 참조 블렌드 (실시예 16에서 수득됨)로부터의 지방산 에틸 에스테르 (FAEE)를 선행하는 실시예에서 나타난 바와 같은 조건 하에서 증류시켰다.
RBD 참조 블렌드 FAEE는 초기에 152℃로 설정된 히터 밴드로 이들 표준 조건 하에서 증류하여 50:50 분할의 증류물:잔류물을 수득하였다. 이 증류로부터 잔류물은 다시 표준 조건 하에서 증류에 의해 더 많은 휘발성 성분이 제거되었다. 목적은 50:50 분할의 증류물:잔류물을 수득하는 것이었다. 증류는 대부분 152℃로 설정된 히터 밴드로 수행되었다. 총 증류 시간은 200분이었다.
Figure pct00010
실시예 19 - 풍부화된 RBD 오일에 대한 지방산 조성 분석
실시예 17 및 18에서 수득된 생성물의 지방산 조성을 분석하였다. 결과는 아래에 도시되어 있다.
Figure pct00011
실시예 20 - 오일 안정성 평가
실시예 11에 기술된 방법에 따라 실시예 17 및 18에 기술된 풍부화된 생성물에 대해 헤드스페이스 분석을 수행하였다.
하기 표는 실시예 17에서 수득된 RBD 카놀라유와 실시예 18에서 수득된 RBD 참조 오일로부터 얻은 결과를 T=0에서 3일까지 요약한다. 시험 샘플은 이 기간 동안 라이트 박스 상의 주변 온도와 형광 튜브 조명 아래에서 유지했다. m/z 58 분자 이온이 분석되었고, 질량 크로마토그램은 RT 1.37분에서 프로파날의 출현을 명확하게 나타낸다. 프로파날 전개는 아래 표에 정량화되어 있고, 데이터는 도 2에 도시되어 있다. DHA 카놀라유는 참조에 비해 카놀라유의 향상된 안정성을 입증하는 실질적으로 더 적은 양의 프로파날을 방출했다.
Figure pct00012
DHA 카놀라유는 참조 오일에 비해 산화에 대한 월등한 안정성을 나타냈다.

Claims (15)

  1. 식물성-기반 지질 조성물로서, 상기 조성물은:
    (i) 조성물의 총 지방산 함량의 약 15 중량% 내지 약 35 중량%의 양으로 도코사헥사엔산 (22:6n-3);
    (ii) 조성물의 총 지방산 함량의 최대 약 5 중량%의 양으로 에이코사펜타엔산 (20:5n-3);
    (iii) 조성물의 총 지방산 함량의 약 10 중량% 내지 약 20 중량%의 양으로 α-리놀렌산 (18:3n-3);
    (iv) 조성물의 총 지방산 함량의 약 20 중량% 내지 약 40 중량%의 양으로 올레산 (18:1n-9); 및
    (v) 조성물의 총 지방산 함량의 최대 약 1.5 중량%의 양으로 팔미트산을 포함하고;
    여기서 성분 (i) 내지 (v)는 각각 독립적으로 지방산, 지방산 염, 지방산 에스테르 또는 지방산 에스테르의 염의 형태로 제공되는, 지질 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 도코사헥사엔산 (22:6n-3)은 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 약 20% 내지 약 35% (특히 약 22% 내지 약 33%)의 양으로 존재하는, 지질 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 에이코사펜타엔산은 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 최대 약 3% (특히 최대 약 1%)의 양으로 존재하는, 지질 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 α-리놀렌산은 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 약 12% 내지 약 20% (특히 약 12% 내지 약 18%)의 양으로 존재하는, 지질 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올레산은 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 약 20% 내지 약 35% (특히 약 22% 내지 약 33%)의 양으로 존재하는, 지질 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 팔미트산 (16:0)은 조성물의 총 지방산 함량의 중량을 기준으로 최대 약 1.0% (특히 최대 약 0.7%)의 양으로 존재하는, 지질 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 성분 (i) 내지 (v)는 각각 독립적으로 지방산 에스테르 또는 지방산 에스테르의 염의 형태로 제공되는, 지질 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 성분 (i) 내지 (v)는 각각 독립적으로 지방산 에틸 에스테르의 형태로 또는 트리글리세라이드의 일부로 제공되는, 지질 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 단일 공급원으로부터 유래되는, 지질 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 식물로부터 유래되는, 지질 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 식물은 오일종자, 특히 브라시카 종 (Brassica sp.), 고시피움 히르수툼 (Gossypium hirsutum), 리눔 유시타티시뭄 (Linum usitatissimum), 헬리안투스 종 (Helianthus sp.), 카르타무스 틴크토리우스 (Carthamus tinctorius), 글리신 맥스 (Glycine max), 제아 메이스 (Zea mays), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 소르굼 비콜로르 (Sorghum bicolor), 소르굼 벌가레 (Sorghum vulgare), 아베나 사티바 (Avena sativa), 트리폴폴리움 종 (Trifolium sp.), 엘래시스 귀넨니스 (Elaesis guineenis), 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana), 호르데움 벌가레 (Hordeum vulgare), 루피누스 안구스티폴리우스 (Lupinus angustifolius), 오리자 사티바 (Oryza sativa), 오리자 글라베리마 (Oryza glaberrima), 카멜리나 사티바 (Camelina sativa), 또는 크람베 아비시니카 (Crambe abyssinica)인, 지질 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 정제, 캡슐, 캡슐화된 겔, 섭취가능한 액체 또는 분말, 또는 국소 연고 또는 크림의 형태로 제공되는, 지질 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화제, 안정화제 및 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 성분을 더 포함하는, 지질 조성물.
  14. 심혈관 질환의 치료 또는 예방, 심혈관 질환이 있는 환자의 사망에 대한 보호, 전체 혈청 콜레스테롤 수준의 감소, 높은 BP에서의 감소, HDL:LDL 비율의 증가, 트리글리세라이드의 감소 또는 아포지단백-B 수준의 감소에 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 지질 조성물.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 지질 조성물을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 지방산 에틸 에스테르의 혼합물을 제공하는 단계; 그 혼합물을 제1 분자 증류 단계에 적용하여 제1 잔류물을 획득하는 단계; 및 제1 잔류물을 제2 분자 증류 단계에 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
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