BR112020021662A2 - composição lipídica de base vegetal, e, processo para a produção de uma composição lipídica. - Google Patents

composição lipídica de base vegetal, e, processo para a produção de uma composição lipídica. Download PDF

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Abstract

É fornecida uma composição lipídica de base vegetal que compreende DHA, ALA e ácido oleico (tipicamente como um éster de ácido graxo) em proporções particulares. A composição também contém baixos níveis de EPA e ácido palmítico. A composição pode ser obtida de uma única fonte por métodos de processamento convencionais e tem propriedades de estabilidade aprimoradas.

Description

1 / 46 COMPOSIÇÃO LIPÍDICA DE BASE VEGETAL, E, PROCESSO PARA A
PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO LIPÍDICA CAMPO DA INVENÇÃO
[001] As modalidades aqui divulgadas se referem a novas composições lipídicas que são enriquecidas com ácido docosa-hexaenoico. As composições compreendem uma mistura de ácidos graxos poli-insaturados que têm vários benefícios para a saúde. As composições podem fornecer benefícios nutricionais e são potencialmente obtidas de uma única fonte, que é escalonável e sustentável. As mesmas também têm uma estabilidade aprimorada à oxidação.
ANTECEDENTES
[002] Os ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa ômega-3 (LC-PUFAs) são amplamente reconhecidos como compostos importantes para a saúde humana e animal. Esses ácidos graxos podem ser obtidos de fontes dietéticas ou, em menor grau, pela conversão de ácidos graxos linoleico (LA, 18:2ω-6) ou α-linolênico (ALA, 18:3ω-3), todos considerados ácidos graxos essenciais na dieta humana.
[003] Do ponto de vista nutricional, os ácidos graxos ômega-3 mais importantes são provavelmente o ácido α-linolênico, ácido eicosapentaenoico ("EPA"; 20:5n-3) e ácido docosa-hexaenoico ("DHA"; 22:6n-3). O DHA é um LC-PUFA, que é importante para o desenvolvimento do cérebro e dos olhos. A ingestão de PUFAs ômega-3 também pode ajudar a prevenir doenças coronárias. Estudos médicos indicam claramente que esses ácidos graxos têm aspectos benéficos à saúde, como funções cardiovasculares e imunológicas aprimoradas e redução do câncer, diabetes e pressão alta. Os resultados clínicos demonstraram que uma ingestão dietética de 5,5 g de PUFAs ômega-3 por semana pode estar associada a uma redução de 50% no risco de parada cardíaca primária. Consequentemente, o óleo que contém PUFAs ômega-3 tem tido alta demanda para fins farmacêuticos e dietéticos.
2 / 46
[004] Geralmente, a estabilidade oxidativa de um ácido graxo diminui notavelmente conforme o número de ligações duplas carbono-carbono, ou o grau de insaturação, aumenta. Infelizmente, ALA, EPA e DHA são gorduras poli-insaturadas que tendem a oxidar facilmente. O EPA (com 5 ligações duplas carbono-carbono) é significativamente mais sujeito à oxidação do que o ALA; O DHA (com 6 ligações duplas carbono-carbono) é ainda mais sujeito à oxidação do que o EPA. Como consequência, aumentar o teor de ômega-3 tende a reduzir a vida útil de muitos produtos. Esses problemas se tornam particularmente agudos com óleos, incluindo quantidades significativas de EPA ou DHA.
[005] O documento US 2015/223483 divulga misturas à base de óleo de canola que têm estabilidade oxidativa melhorada. A estabilidade é alcançada pela adição de um ou mais aditivos.
[006] O documento US 2011/0027443 divulga composições de gordura e óleo contendo mesclas particulares de ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa linolênico e LC-PUFAs com um perfil de sabor melhorado. O documento US 2004/209953 divulga produtos nutricionais contendo predominantemente monoglicerídeos e diglicerídeos de LC-PUFAs. O documento US 5.130.061 descreve o uso de processos de transesterificação e destilação para extrair DHA de óleos crus. O documento US 9.040.730 descreve a purificação de misturas de lipídios contendo PUFAs para reduzir a quantidade de esteróis indesejáveis na composição. Em cada um desses casos, peixes ou óleos microbianos são usados como a matéria-prima a partir da qual misturas específicas são obtidas.
[007] O pedido de patente internacional no WO 2013/185184 divulga processos para a produção de ésteres etílicos de ácidos graxos poli-insaturados.
[008] O pedido de patente internacional no WO 2015/089587 e o pedido de patente no US 2015/0166928 divulga composições de lipídios de plantas que compreendem uma mistura de ácidos graxos ômega-3 e ômega-6.
3 / 46 A canola geneticamente modificada é descrita no documento WO 2017/218969 e no documento WO 2017/219006.
[009] A listagem ou discussão de um documento aparentemente publicado anteriormente neste relatório descritivo não deve ser necessariamente interpretada como um reconhecimento de que o documento faz parte do estado da técnica ou que é de conhecimento geral comum.
DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO
[0010] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecida uma composição lipídica de base vegetal que compreende: ácido docosa-hexaenoico (22:6n-3) em uma quantidade de cerca de 15% a cerca de 35% em peso do teor total de ácido graxo da composição; ácido eicosapentaenoico (20:5n-3) em uma quantidade de até cerca de 5% em peso do teor total de ácido graxo da composição; ácido α-linolênico (18:3n-3) em uma quantidade de cerca de 10% a cerca de 20% em peso do teor total de ácido graxo da composição; ácido oleico (18:1n-9) em uma quantidade de cerca de 20% a cerca de 40% em peso do teor total de ácido graxo da composição; e ácido palmítico em uma quantidade de até cerca de 1,5% em peso do teor total de ácido graxo da composição; em que os componentes (i) a (v) são, cada um, independentemente fornecidos na forma de um ácido graxo, um sal de ácido graxo, um éster de ácido graxo ou um sal de um éster de ácido graxo.
[0011] As ditas composições lipídicas são aqui referidas como as "composições da invenção".
[0012] A presente invenção se refere a composições lipídicas contendo simultaneamente níveis elevados de ácido docosahexaenoico (DHA) e ácido α- linolênico (ALA), na forma de um ácido graxo livre, um sal, um éster ou um sal de um éster. Essas composições podem ser obtidas de fontes sustentáveis, como fontes vegetais. Também foi constatado que as mesmas têm um perfil de
4 / 46 estabilidade de armazenamento melhorado que é evidenciado por uma redução na degradação por oxidação durante o armazenamento. O DHA, em particular, é reconhecido como um composto importante para a saúde humana e animal. Essas composições podem ser usadas em alimentos, nutracêuticos, cosméticos e outras composições químicas. As mesmas também podem ser úteis como intermediários e ingredientes farmacêuticos ativos.
[0013] Os níveis de ácido graxo nas composições da invenção podem ser determinados usando métodos de rotina conhecidos dos versados na técnica. Tais métodos incluem cromatografia gasosa (GC) em conjunto com padrões de referência, por exemplo, de acordo com os métodos divulgados nos exemplos. Em um método particular, os ácidos graxos são convertidos em metil ou etil ésteres antes da análise de GC. Essas técnicas são descritas nos Exemplos. A posição do pico no cromatograma pode ser usada para identificar cada ácido graxo específico e a área sob cada pico integrada para determinar a quantidade. Tal como aqui utilizado, a menos que indicado o contrário, a porcentagem de ácido graxo particular em uma amostra é determinada calculando a área sob a curva no cromatograma para esse ácido graxo como uma porcentagem da área total para ácidos graxos no cromatograma. Isso corresponde essencialmente a uma porcentagem em peso (p/p). A identidade dos ácidos graxos pode ser confirmada por GC-MS.
[0014] As referências ao ácido docosahexaenóico e "DHA" nesse contexto são, salvo indicação ao contrário, referências a forma ω3 de ácido docosahexaenoico, que é o ácido docosahexaenoico tendo uma dessaturação (ligação dupla carbono-carbono) na terceira ligação carbono-carbono da extremidade metil do ácido graxo. As formas abreviadas que podem ser usadas alternadamente incluem “22:6n-3” e “22:6ω-3”.
[0015] De forma geral, os termos "ácido graxo poli-insaturado" e "PUFA" se referem a um ácido graxo que compreende pelo menos duas ligações duplas carbono-carbono. Os termos "ácido graxo poli-insaturado de
5 / 46 cadeia longa" e "LC-PUFA" se referem a um ácido graxo que compreende pelo menos 20 átomos de carbono e pelo menos duas ligações duplas carbono- carbono em sua cadeia de carbono e, portanto, incluem VLC-PUFAs. Tal como aqui utilizado, os termos "ácido graxo poli-insaturado de cadeia muito longa" e "VLC-PUFA" se referem a um ácido graxo que compreende pelo menos 22 átomos de carbono e pelo menos três ligações duplas carbono-carbono em sua cadeia de carbono. Normalmente, o número de átomos de carbono na cadeia de carbono do ácido graxo se refere a uma cadeia de carbono não ramificada. Se a cadeia de carbono for ramificada, o número de átomos de carbono exclui aqueles nos grupos laterais.
[0016] Os ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa podem ser ácidos graxos ω3 ("ômega-3"), ou seja, ácidos graxos com uma dessaturação (ligação dupla carbono-carbono) na terceira ligação carbono-carbono da extremidade metil do ácido graxo. Os mesmos podem, alternativamente, ser ácidos graxos ω6 ("ômega-6"), ou seja, ácidos graxos com uma dessaturação (ligação dupla carbono-carbono) na sexta ligação carbono-carbono da extremidade metil do ácido graxo. Embora outros padrões de insaturação possam estar presentes, as formas ω6 e particularmente ω3 são particularmente relevantes no contexto da presente invenção.
[0017] As composições da invenção compreendem pelo menos dois ácidos graxos poli-insaturados diferentes, incluindo DHA e ácido α-linolênico (ALA, 18:3n-3). Em uma modalidade, DHA ou ALA é o ácido graxo mais abundante presente na composição (em peso em relação ao teor de ácido graxo total da composição). Em outra modalidade, DHA e ALA são os dois ácidos graxos mais abundantes presentes na composição.
[0018] Os componentes (i) a (v) nas composições da invenção podem, cada um, estar presentes na forma de um ácido graxo, um sal de ácido graxo, um éster de ácido graxo ou um sal de um éster de ácido graxo.
[0019] Conforme usado aqui, o termo "ácido graxo" se refere a um
6 / 46 ácido carboxílico (ou ácido orgânico), muitas vezes com uma longa cauda alifática, saturada ou insaturada. Normalmente, os ácidos graxos têm uma cadeia ligada de carbono-carbono de pelo menos 8 átomos de carbono de comprimento, mais particularmente pelo menos 12 carbonos de comprimento. A maioria dos ácidos graxos de ocorrência natural tem um número par de átomos de carbono porque sua biossíntese envolve acetato, que tem dois átomos de carbono. Os ácidos graxos podem estar em um estado livre (não esterificado), referido aqui como um "ácido graxo livre", ou em uma forma esterificada, como um alquil éster, parte de um triglicerídeo, parte de um diacilglicerídeo, parte de um monoacilglicerídeo, acil-CoA (tio-éster) ligado ou outra forma ligada, ou uma mistura dos mesmos. O ácido graxo pode ser esterificado como um fosfolipídeo, tais como as formas de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol ou difosfatidilglicerol, embora preferencialmente seja esterificado como um éster de alquila, especialmente como um éster etílico. Para evitar dúvidas, salvo indicação ao contrário, o termo "ácido graxo" abrange ácidos graxos livres, ésteres de ácidos graxos e sais de qualquer um dos mesmos. Salvo indicação ao contrário, os valores quantitativos associados a ácidos graxos específicos se referem à quantidade (calculada com base no peso) desse ácido graxo que está presente, independentemente da forma (por exemplo, ácido livre ou éster) em que está presente.
[0020] Cada ácido graxo na composição também pode ser fornecido na forma de um sal de um ácido graxo, por exemplo, um sal alcalino ou sal alcalino-terroso. Os sais particulares que podem ser mencionados incluem sais de lítio e sais de cálcio. Esses sais têm potenciais benefícios medicinais adicionais ou oferecem melhorias na capacidade de processamento. Da mesma forma, um éster de ácido graxo pode ser fornecido na forma de um sal de um éster de ácido graxo. Qualquer combinação de ácidos graxos na forma de ácidos graxos livres, sais, ésteres ou sais de ésteres pode estar presente nas
7 / 46 composições da invenção. Com isso, queremos dizer que, a título de exemplo, o DHA pode estar presente predominantemente como um éster etílico, o ALA pode estar presente predominantemente como um sal de cálcio de um éster metílico e o ácido oleico pode estar presente predominantemente como um ácido graxo livre.
[0021] Os "ácidos graxos saturados" não contêm ligações duplas ou outros grupos funcionais ao longo da cadeia. O termo "saturado" se refere a hidrogênio, em que todos os carbonos (exceto o grupo ácido carboxílico [- COOH]) contêm tantos hidrogênios quanto possível. Em outras palavras, a extremidade ômega (ω) está ligada a três átomos de hidrogênio (CH3-) e cada carbono da cadeia está ligado a dois átomos de hidrogênio (-CH2-). O termo "ácido graxo total" inclui ácidos graxos em todas as formas, sejam eles saturados ou insaturados, ácidos livres, ésteres e/ou sais.
[0022] O termo "cerca de", tal como aqui utilizado quando se refere a um valor mensurável, tal como uma quantidade de um composto, peso, tempo, temperatura e semelhantes, refere-se a variações de 20%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, ou mesmo 0,1% da quantidade especificada.
[0023] As composições da invenção que podem ser mencionadas incluem aquelas que contêm uma alta concentração de ácidos graxos ômega-3, muitos dos quais são as denominadas “gorduras essenciais” que são consideradas particularmente importantes para a saúde humana. Os ácidos graxos ômega-3 podem ter efeitos benéficos sobre os níveis de colesterol HDL, apoiar o desenvolvimento do cérebro em jovens e, comprovadamente, beneficiar a saúde mental. Esses ácidos graxos são geralmente considerados precursores de eicosanoides com propriedades anti-inflamatórias. Composições particulares da invenção que podem ser mencionadas incluem aquelas em que a quantidade total de ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 na composição lipídica é pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 35%, em peso do teor total de ácido graxo da composição. Em uma
8 / 46 modalidade particular, a quantidade total de ácido graxo poli-insaturado ômega-3 na composição lipídica é pelo menos cerca de 40% em peso do teor total de ácido graxo da composição.
[0024] Os ácidos graxos ômega-6 também são considerados importantes para a saúde humana. Em particular, certos ácidos graxos ômega- 6 são “gorduras essenciais” necessárias para uma boa saúde, mas o corpo é incapaz de sintetizá-los. No entanto, foi demonstrado que as gorduras ômega-6 são precursoras dos eicosanoides com mais propriedades pró-inflamatórias, e, portanto, quando muitos desses eicosanoides são produzidos, eles podem aumentar a inflamação e as doenças inflamatórias. Assim, pode ser desejável minimizar a quantidade de tais ácidos graxos nas composições lipídicas. É geralmente aceito que a razão de ácidos graxos ômega-6 para ômega-3 na dieta deve ser de 4:1 ou menos. No entanto, a dieta ocidental normal geralmente contém uma proporção maior de ácidos graxos ômega-6. As composições lipídicas da presente invenção contêm vantajosamente quantidades relativamente baixas de ácidos graxos ômega-6, enquanto simultaneamente contêm quantidades relativamente elevadas dos ácidos graxos ômega-3 mais benéficos. Em uma modalidade, a quantidade total de ácidos graxos poli- insaturados ômega-6 na composição é no máximo cerca de 8% em peso do teor total de ácidos graxos da composição. Em outra modalidade, a razão entre o peso total de ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 e o peso total de ácidos graxos poli-insaturados ômega-6 na composição é de pelo menos cerca de 6:1. Em uma outra modalidade, a razão do peso total de ácidos graxos poli- insaturados ômega-3 para o peso total de ácidos graxos poli-insaturados ômega- 6 na composição é de pelo menos cerca de 8:1.
[0025] Os ácidos graxos ômega-9 são gorduras monoinsaturadas que podem ser produzidas pelo corpo. O consumo de alimentos ricos em ácidos graxos ômega-9 em vez de outros tipos de gordura pode ter vários efeitos benéficos à saúde, incluindo a redução dos triglicerídeos plasmáticos e
9 / 46 colesterol "ruim" de lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL) em pacientes com diabetes, reduzindo a inflamação e melhorando a sensibilidade à insulina. Em uma modalidade, a quantidade total de ácidos graxos poli- insaturados ômega-3 e ômega-9 na composição lipídica é de pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60% ou pelo menos cerca de 70%, em peso do teor total de ácidos graxos da composição. Em uma outra modalidade, a razão do peso total de ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 e ômega-9 para o peso total de ácidos graxos poli-insaturados ômega-6 na composição é de pelo menos cerca de 5:1, por exemplo pelo menos cerca de 10:1.
[0026] As composições lipídicas contendo ácidos graxos poli- insaturados de cadeia longa são normalmente obtidas de fontes marinhas (por exemplo peixes, crustáceos), fontes de algas ou plantas (por exemplo linho ou echium). A matéria orgânica inicial é primeiro processada para extrair o óleo (geralmente referido como o óleo “bruto”) contido na mesma. No caso de sementes de plantas, por exemplo, as sementes são trituradas para liberar o óleo que é então separado do sólido por filtração e/ou decantação. Os óleos crus geralmente contêm níveis de ácidos graxos poli-insaturados que são muito baixos para serem úteis (por exemplo como produtos nutricionais), portanto, o enriquecimento é necessário. Quando o óleo cru está faltando em um ou mais componentes essenciais, é frequentemente comum misturar óleos brutos ou enriquecidos de fontes múltiplas (por exemplo de peixes e algas) para obter a composição desejada. Alternativamente, o enriquecimento pode ser alcançado pelo processamento do óleo bruto para remover componentes indesejados (por exemplo componentes que afetam deleteriamente a cor, odor ou estabilidade do produto, ou ácidos graxos indesejados), enquanto maximiza os níveis dos componentes de ácido graxo desejados.
[0027] As composições da presente invenção são vantajosamente obtidas de uma única fonte. O uso de uma única fonte facilita o processamento eficiente e econômico do petróleo bruto e a fabricação das composições
10 / 46 lipídicas da invenção. Pela frase "obtido de uma única fonte" (ou "obtido de uma única fonte"), queremos dizer que a composição lipídica pode ser obtida de um ou mais organismos de uma única classe taxonômica. Em uma modalidade particular, a composição lipídica não é derivada de múltiplos organismos em diferentes classes taxonômicas. Por exemplo, as composições lipídicas podem não ser misturas de óleos obtidos a partir de uma combinação de peixes e algas, ou uma combinação de peixes e plantas. Em vez disso, as composições lipídicas da invenção (ou os óleos "brutos" a partir dos quais as composições podem ser obtidas por técnicas de enriquecimento, como transesterificação e destilação) são obtidas a partir de uma única população de organismos, por exemplo, uma única fonte de matéria vegetal ou vegetação. Para evitar dúvidas, a frase "obtido de uma única fonte" não exclui o uso de vários organismos da mesma espécie como fonte da composição lipídica ou óleo "bruto", ou seja, o uso de vários peixes, estoques de algas, plantas ou sementes de plantas que são da mesma espécie. Os ditos organismos múltiplos são, de preferência, todos da mesma espécie, ou da mesma linha de reprodução, ou da mesma variedade de planta, ou do mesmo estoque ou lote de produção.
[0028] Em composições lipídicas particulares da invenção, o DHA está presente em uma quantidade de cerca de 20% a cerca de 35% (tal como de cerca de 22% a cerca de 33%) em peso do teor de ácido graxo total da composição.
[0029] Verificou-se, vantajosamente, que as composições lipídicas da invenção contêm um alto nível de DHA em relação à quantidade de EPA presente. Portanto, em uma modalidade, a razão em peso de ácido docosahexaenoico para ácido eicosapentaenoico nas composições lipídicas é de pelo menos cerca de 20:1. Em outras modalidades, a razão em peso de ácido docosahexaenoico para ácido eicosapentaenoico nas composições lipídicas pode ser superior a cerca de 25:1, tal como superior a cerca de 30:1 e, mais particularmente, superior a cerca de 35:1.
[0030] Favoravelmente, a quantidade de EPA nas composições pode
11 / 46 ser relativamente baixa. As composições da invenção contêm até cerca de 5% de EPA em peso do teor total de ácidos graxos da composição. Em modalidades particulares, as composições contêm até cerca de 3% de, mais particularmente até cerca de 1%, EPA em peso do teor total de ácidos graxos da composição.
[0031] As composições da invenção contêm ácido α-linolênico (ALA) em uma quantidade de cerca de 10% a cerca de 20% em peso do teor total de ácido graxo da composição. O ALA é uma gordura essencial importante para a saúde humana ou animal adequada. Em modalidades particulares, as composições contêm ALA em uma quantidade de cerca de 12% a cerca de 20%, mais particularmente de cerca de 12% a cerca de 18%, em peso do teor total de ácidos graxos da composição.
[0032] O ácido oleico é um componente das composições da invenção, estando presente em uma quantidade de cerca de 20% a cerca de 40% em peso do teor total de ácido graxo da composição. O ácido oleico é uma gordura monoinsaturada comum na dieta humana. O consumo de gordura monoinsaturada tem sido associado à diminuição do colesterol da lipoproteína de baixa densidade (LDL) e, possivelmente, ao aumento do colesterol da lipoproteína de alta densidade (HDL). Em uma modalidade, o ácido oleico está presente em uma quantidade de cerca de 20% a cerca de 35% em peso do teor de ácido graxo total da composição. Em uma outra modalidade, o ácido oleico está presente em uma quantidade de cerca de 22% a cerca de 33% em peso do teor de ácido graxo total da composição.
[0033] As composições da invenção contêm até cerca de 1,5% de ácido palmítico (16:0) em peso do teor total de ácidos graxos da composição. Em modalidades particulares, as composições contêm até cerca de 1,0%, mais particularmente até cerca de 0,7%, ácido palmítico em peso do teor de ácido graxo total da composição.
[0034] As composições da invenção também contêm pelo menos cerca de 0,5% de ácido eicosatetraenoico (ETA, 20:4n-3) em peso do teor total de
12 / 46 ácidos graxos da composição. Em modalidades particulares, as composições contêm pelo menos cerca de 1,0%, mais particularmente pelo menos cerca de 1,5%, de ETA em peso do teor total de ácidos graxos da composição.
[0035] Preferências e opções para um determinado aspecto, recurso ou parâmetro da invenção devem, a menos que o contexto indique de outra forma, ser consideradas como revelados em combinação com qualquer e todas as preferências e opções para todos os outros aspectos, recursos e parâmetros da invenção. Por exemplo, as quantidades particulares de DHA, EPA, ALA, ácido oleico e ácido palmítico indicadas nas passagens anteriores são divulgadas em todas as combinações.
[0036] Uma composição lipídica particular que pode, portanto, ser mencionada é aquela que compreende: ácido docosahexaenoico (22:6n-3) em uma quantidade de cerca de 20% a cerca de 35% em peso do teor total de ácido graxo da composição; ácido eicosapentaenoico (20:5n-3) em uma quantidade de até cerca de 3% em peso do teor total de ácido graxo da composição; ácido α-linolênico (18:3n-3) em uma quantidade de cerca de 12% a cerca de 20% em peso do teor total de ácido graxo da composição; ácido oleico (18:1n-9) em uma quantidade de cerca de 20% a cerca de 35% em peso do teor total de ácido graxo da composição; e ácido palmítico em uma quantidade de até cerca de 1,0% em peso do teor total de ácido graxo da composição; em que os componentes (i) a (v) são, cada um, independentemente fornecidos na forma de um ácido graxo, um sal de ácido graxo, um éster de ácido graxo ou um sal de um éster de ácido graxo.
[0037] Nas composições da invenção, cada um dos componentes (i) a (v) é um ácido graxo que pode estar independentemente presente na forma de um ácido graxo, um sal de ácido graxo, um éster de ácido graxo ou um sal de um éster de ácido graxo. Em uma modalidade específica, esses componentes
13 / 46 tomam, cada um, a mesma forma, por exemplo, eles podem estar todos na forma de um ácido graxo, todos na forma de um sal de ácido graxo, todos na forma de um éster de ácido graxo ou todos no forma de um sal de um éster de ácido graxo. Quando os componentes estão na forma de um sal de ácido graxo, éster ou sal de um éster, então os componentes podem estar na forma do mesmo sal, éster ou sal do éster. Por exemplo, cada um dos componentes (i) a (v) pode ser fornecido na forma de um éster etílico do ácido graxo.
[0038] Em uma modalidade particular, os componentes (i) a (v) são fornecidos na forma de um sal de um éster de ácido graxo ou, mais particularmente, na forma de um éster de ácido graxo. As formas de ésteres de ácido graxo adequadas são conhecidas pelo versado na técnica. Por exemplo, as formas de éster de ácido graxo que são nutricionalmente aceitáveis e/ou farmaceuticamente aceitáveis incluem ésteres etílicos, ésteres metílicos, fosfolipídeos, monoglicerídeos, diglicerídeos e triglicerídeos de ácidos graxos. Podem ser necessárias diferentes formas de éster, dependendo do uso pretendido da composição lipídica. Por exemplo, os triglicerídeos são particularmente adequados para uso em alimentos destinados ao consumo humano, especialmente consumo infantil, devido em parte ao sabor e à estabilidade dessas formas de éster ao tratamento térmico (que pode ser necessário para tais produtos alimentares). Os ésteres etílicos são particularmente adequados para uso em suplementos dietéticos, uma vez que essas formas de éster podem ser fabricadas com eficiência e facilidade, e a conversão para uma forma de triglicerídeo não é necessária. Assim, em uma outra modalidade, os componentes (i) a (v) são, cada um, independentemente fornecidos na forma de um éster etílico de ácido graxo ou como parte de um triglicerídeo.
[0039] Os triglicerídeos são ésteres derivados do glicerol e três ácidos graxos. Como a presente invenção diz respeito a mesclas de ácidos graxos, os componentes de ácidos graxos em tais triglicerídeos podem ser misturados nas
14 / 46 razões correspondentes. Isto é, embora uma mistura de diferentes moléculas de triglicerídeos possa estar presente em uma composição, o perfil geral de ácidos graxos na composição é conforme definido nas reivindicações.
[0040] Os componentes de ácidos graxos podem, alternativamente, estar presentes na forma de ácidos graxos "livres", ou seja, a forma -COOH do ácido graxo. No entanto, em composições específicas da invenção, as composições contêm níveis relativamente baixos de ácidos graxos nesta forma porque estão associados a um sabor desagradável (muitas vezes "ensaboado") e são menos estáveis do que os ácidos graxos que estão em uma forma esterificada. Os ácidos graxos livres são tipicamente removidos de óleos e composições lipídicas por meio de refinação alcalina ou física, por exemplo de acordo com processos discutidos em outro lugar aqui. Assim, em uma modalidade, o teor total de ácidos graxos livres nas composições lipídicas é inferior a 5% (tal como menos do que 3%, particularmente menos do que 2%) em peso do teor total de ácidos graxos da composição.
[0041] Os ácidos graxos nas composições lipídicas da invenção são ácidos graxos de cadeia tipicamente linear (isto é, não ramificada) (tais como DHA, ALA e semelhantes). As composições da invenção que podem ser mencionadas incluem aquelas que contêm níveis muito baixos de ácidos graxos de cadeia ramificada e seus ésteres de modo que a composição seja essencialmente isenta de ácidos graxos de cadeia ramificada e ésteres de ácidos graxos de cadeia ramificada. Pelos termos "níveis baixos", queremos dizer que a composição contém ácidos graxos de cadeia ramificada e ésteres de ácidos graxos em uma quantidade de no máximo cerca de 0,1% em peso do total de ácidos graxos da composição.
[0042] As composições lipídicas da invenção também podem conter outros componentes (por exemplo que não ácidos graxos) que se originam do material de origem e que não são totalmente removidos durante o processo de extração e enriquecimento. As identidades precisas desses outros componentes
15 / 46 variam muito, dependendo do material de origem. Exemplos de outros componentes incluem fitoesteróis (ou seja, esteróis vegetais e estanóis vegetais) presentes como um esterol livre ou como um éster de esterol (como β-sitosterol, β-sitostanol, Δ5-avenasterol, campesterol, Δ5-estigmasterol, Δ7-estigmasterol e Δ7-avenasterol, colesterol, brassicasterol, chalinasterol, campesterol, campestanol e eburicol). Outros exemplos incluem antioxidantes, como tocoferóis e tocotrienóis. Assim, as composições lipídicas particulares da invenção que podem ser mencionadas incluem aquelas que contêm quantidades detectáveis de um ou mais fitoesteróis (tais como β-sitosterol). Esses esteróis podem estar presentes em pelo menos cerca de 0,01%, mas normalmente não mais do que cerca de 1%, em peso da composição lipídica.
[0043] As composições da presente invenção são vantajosamente obtidas a partir de plantas (fontes "vegetais"). Pelo termo “à base de vegetais”, queremos dizer que pelo menos 70% em peso dos lipídios que estão presentes nas composições da invenção são obtidos de fontes vegetais. As fontes vegetais incluem plantas, particularmente colheitas como cereais. Em pelo menos uma modalidade, os lipídios são obtidos a partir de uma colheita de óleo de semente, como Brassica, por exemplo, Brassica napus ou Brassica juncea. Para evitar dúvidas, no entanto, não é essencial que as composições sejam obtidas exclusivamente de tais fontes, isto é, uma proporção (por exemplo no máximo 30% em peso) dos lipídios nas composições da invenção pode ser obtida de outras fontes, incluindo óleos marinhos (por exemplo, peixes ou crustáceos), óleos de algas e suas combinações. Em um exemplo, pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, em peso dos lipídios que estão presentes são obtidos de fontes vegetais. Em composições particulares da invenção, essencialmente todos (isto é, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou cerca de 100%) dos lipídios são obtidos de fontes vegetais.
[0044] Em uma modalidade, as composições da invenção (e os alimentos e composições farmacêuticas definidas a seguir) não são de origem
16 / 46 animal (por exemplo, animal marinho). Ou seja, em tais modalidades, as composições lipídicas não contêm quaisquer componentes provenientes de animais, como peixes e crustáceos. As composições lipídicas nas quais nenhum componente é obtido de um animal são consideradas vantajosas em termos de teor lipídico e um perfil de estabilidade que pode ser alcançado seguindo procedimentos de refinamento e/ou enriquecimento padrão.
[0045] O uso de plantas como fonte de lipídios ou ácidos graxos oferece uma série de vantagens. Por exemplo, as fontes marinhas de óleos são conhecidas por conter níveis relativamente altos de contaminantes (como mercúrio, PCBs e alérgenos de peixes (por exemplo parvalbuminas)) que não são encontrados em materiais vegetais. A sobrepesca histórica também esgotou os estoques de peixes e crustáceos (por exemplo krill) de tal forma que os mesmos não são mais sustentáveis. A presente invenção, portanto, oferece uma composição de óleo de ácido graxo poli-insaturado de origem sustentável contendo níveis relativamente baixos de contaminantes indesejados.
[0046] Em uma modalidade particular, a composição da invenção é derivada de uma planta. As plantas das quais os óleos são obtidos são tipicamente culturas oleaginosas, como copra, caroço de algodão, linho, palmiste, amendoim, colza, semente de soja e girassol. As composições obtidas exclusivamente de plantas, portanto, podem ser referidas como óleos "vegetais" ou "composições de lipídios vegetais". As plantas adequadas a partir das quais as composições lipídicas da invenção podem ser obtidas são conhecidas do indivíduo versado e incluem Brassica sp., Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, Helianthus sp., Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Arabidopsis thaliana, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Avena sativa, Trifolium sp., Elaesis guineenis, Nicotiana benthamiana, Hordeum vulgare, Lupinus angustifolius, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Camelina sativa ou Crambe abyssinica. Uma fonte vegetal particular que pode ser mencionada a este respeito é a Brassica sp.
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[0047] Fontes adequadas (incluindo fontes marinhas, de algas e vegetais) podem ocorrer naturalmente ou podem ser geneticamente modificadas para aumentar sua capacidade de produzir ácidos graxos poli- insaturados de cadeia longa. Exemplos de fontes vegetais que foram geneticamente modificadas para este propósito, isto é, que se originam de células vegetais recombinantes, são conhecidos pelo indivíduo versado e são divulgados nos pedidos de patente internacional nos. PCT/AU2013/000639 (publicado como WO 2013/185184), PCT/AU2014/050433 (publicado como WO 2015/089587) e PCT/AU2015/050340 (publicado como WO 2015/196250). A canola geneticamente modificada é descrita no documento WO 2017/218969 e no documento WO 2017/219006. As divulgações em todas as publicações mencionadas neste documento são incorporadas a título de referência em sua totalidade.
[0048] As composições lipídicas da invenção podem ser obtidas diretamente de uma fonte de ocorrência natural (por exemplo, um animal, algas e/ou uma planta). No entanto, normalmente é necessário processar os óleos obtidos de fontes naturais para enriquecê-los. Os processos de enriquecimento adequados são exemplificados nos Exemplos.
[0049] Fontes adequadas de composições lipídicas da invenção, ou óleos "brutos" que podem ser mesclados ou enriquecidos para produzir essas composições, incluem espécies marinhas, algas e plantas. Os processos para a obtenção de óleos de fontes marinhas são bem conhecidos na técnica.
[0050] Fontes vegetais (como fontes de sementes oleaginosas) são particularmente adequadas devido aos baixos níveis de certos contaminantes e sustentabilidade superior, como discutido acima. Plantas como a Brassica sp. (por exemplo canola) produzem sementes que podem ser processadas para obter óleo. Extração de óleos/lipídios
[0051] As técnicas que são praticadas rotineiramente na técnica podem
18 / 46 ser usadas para extrair, processar e analisar óleos produzidos por plantas e sementes. Normalmente, as sementes das plantas são cozidas, prensadas e o óleo extraído para produzir óleo cru. Esse óleo pode, por sua vez, ser degomado, refinado, branqueado e/ou desodorizado. Verificou-se que uma combinação de desgomagem, refinação, branqueamento e desodorização é particularmente eficaz para a preparação de misturas de lipídios enriquecidas com DHA. Assim, em uma modalidade, a composição lipídica é obtida a partir de um óleo de semente que foi degomado, refinado, branqueado e/ou desodorizado. No entanto, não é necessário que os óleos sejam processados dessa forma e a purificação e o enriquecimento adequados podem ser obtidos sem esses métodos.
[0052] Geralmente, as técnicas para triturar sementes são conhecidas na técnica. Por exemplo, as sementes oleaginosas podem ser temperadas borrifando-as com água para aumentar o teor de umidade para, por exemplo, 8,5%, e lascando-se usando um rolo liso com um ajuste de intervalo de 0,23 mm a 0,27 mm. Dependendo do tipo de semente, a água não pode ser adicionada antes do esmagamento. A extração também pode ser alcançada usando um processo de extrusão. O processo de extrusão pode ou não ser usado no lugar da escamação e às vezes é usado como um processo complementar antes ou depois da prensagem do parafuso.
[0053] Em uma modalidade, a maior parte do óleo de semente é liberada por esmagamento usando uma prensa de parafuso. O material sólido expelido da prensa de parafuso é então extraído com um solvente, por exemplo hexano, usando uma coluna rastreada por calor, após o que o solvente é removido do óleo extraído. Alternativamente, o óleo cru produzido pela operação de prensagem pode ser passado por um tanque de decantação com um topo de drenagem de arame ranhurado para remover os sólidos que são expressos com o óleo durante a operação de prensagem. O óleo clarificado pode ser passado por um filtro de placa e estrutura para remover quaisquer partículas
19 / 46 sólidas finas restantes. Se desejado, o óleo recuperado do processo de extração pode ser combinado com o óleo clarificado para produzir um óleo cru misturado. Uma vez que o solvente é removido do petróleo bruto, as porções prensadas e extraídas são combinadas e submetidas aos procedimentos normais de processamento de óleo.
REFINAMENTO E PURIFICAÇÃO
[0054] Conforme usado neste documento, o termo "purificado" quando usado em conexão com lipídeo ou óleo da invenção normalmente significa que o lipídeo ou óleo extraído foi submetido a uma ou mais etapas de processamento para aumentar a pureza do componente lipídeo/óleo. Por exemplo, as etapas de purificação podem compreender um ou mais dentre: desgomagem, desodorização, descoloração ou secagem do óleo extraído. No entanto, tal como aqui utilizado, o termo "purificado" não inclui um processo de transesterificação ou outro processo que altera a composição de ácido graxo do lipídeo ou óleo da invenção de modo a aumentar o teor de DHA como uma porcentagem do teor de ácido graxo total. Expresso em outras palavras, a composição de ácido graxo do lipídio ou óleo purificado é essencialmente a mesma do lipídio ou óleo não purificado.
[0055] Os óleos vegetais podem ser refinados (purificados) uma vez extraídos da fonte vegetal, usando um ou mais dos seguintes processos e, particularmente, usando uma combinação de degomagem, refinação alcalina, branqueamento e desodorização. Os métodos adequados são conhecidos dos indivíduos versados na técnica (por exemplo, aqueles divulgados no documento WO 2013/185184).
[0056] A desgomagem é uma etapa inicial no refinamento de óleos e seu objetivo principal é a remoção da maioria dos fosfolipídios do óleo. Adição de ca. 2% de água, tipicamente contendo ácido fosfórico, de 70 a 80 °C para o óleo bruto resulta na separação da maioria dos fosfolipídios acompanhados por vestígios de metais e pigmentos. O material insolúvel removido é
20 / 46 principalmente uma mistura de fosfolipídios e triacilgliceróis. A desgomagem pode ser realizada pela adição de ácido fosfórico concentrado ao óleo de semente em bruto para converter fosfatídeos não hidratáveis em uma forma hidratável e para quelar metais menores que estão presentes. A goma é separada do óleo de semente por centrifugação.
[0057] O refinamento de alcalino é um dos processos de refinamento para o tratamento do petróleo bruto, às vezes também conhecido como neutralização. Geralmente ocorre após a desgomagem e antes do clareamento. Após a desgomagem, o óleo de semente pode ser tratado pela adição de uma quantidade suficiente de uma solução alcalina para titular todos os ácidos graxos livres e ácido fosfórico, e removendo os sabões assim formados. Os materiais alcalinos adequados incluem hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio, hidróxido de lítio, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio e hidróxido de amônio. O refinamento de alcalino é normalmente realizado à temperatura ambiente e remove a fração de ácido graxo livre. O sabão é removido por centrifugação ou por extração em um solvente para o sabão e o óleo neutralizado é lavado com água. Se necessário, qualquer excesso de alcalino no óleo pode ser neutralizado com um ácido adequado, como ácido clorídrico ou ácido sulfúrico.
[0058] O branqueamento é um processo de refinamento no qual os óleos são aquecidos de 90 a 120 °C por 10 a 30 minutos na presença de uma terra branqueadora (0,2 a 2,0%) e na ausência de oxigênio, operando com nitrogênio ou vapor ou em vácuo. O branqueamento é projetado para remover pigmentos indesejados (carotenoides, clorofila, etc.), e o processo também remove produtos de oxidação, traços de metais, compostos de enxofre e traços de sabão.
[0059] A desodorização é um tratamento de óleos e gorduras a alta temperatura (por exemplo, ca. 180 °C) e baixa pressão (0,1 a 1 mm Hg). Isto é tipicamente alcançado pela introdução de vapor no óleo de semente a uma taxa
21 / 46 de cerca de 0,1 ml/minuto/100 ml de óleo de óleo. Após cerca de 30 minutos de pulverização, o óleo de semente é deixado esfriar sob vácuo. Este tratamento melhora a cor do óleo de semente e remove a maioria das substâncias voláteis ou compostos odoríferos, incluindo quaisquer ácidos graxos livres remanescentes, monoacilgliceróis e produtos de oxidação.
[0060] A preparação para o inverno é um processo às vezes usado na produção comercial de óleos para a separação de óleos e gorduras em frações sólidas (estearina) e líquidas (oleína) por cristalização em temperaturas subambientes. Foi aplicado originalmente ao óleo de semente de algodão para produzir um produto sem sólidos. É normalmente usado para diminuir o teor de ácidos graxos saturados dos óleos.
TRANSESTERIFICAÇÃO
[0061] Os óleos crus geralmente contêm os ácidos graxos desejados na forma de triacilgliceróis (TAGs). A transesterificação é um processo que pode ser usado para trocar os ácidos graxos dentro e entre os TAGs ou para transferir os ácidos graxos para outro álcool para formar um éster (como um éster etílico ou um éster metílico). Em modalidades da invenção, a transesterificação é alcançada usando meios químicos, tipicamente envolvendo um ácido ou base forte como um catalisador. O etóxido de sódio (em etanol) é um exemplo de uma base forte usada para formar ésteres etílicos de ácidos graxos por meio da transesterificação. O processo pode ser realizado à temperatura ambiente ou a temperatura elevada (por exemplo, até cerca de 80 °C).
DESTILAÇÃO
[0062] A destilação molecular é um método eficaz para remover quantidades significativas dos componentes mais voláteis, como os ácidos graxos saturados, dos óleos crus. A destilação é tipicamente realizada sob pressão reduzida, por exemplo, abaixo de cerca de 1 mbar. A temperatura e o tempo podem então ser escolhidos para atingir uma divisão de aproximadamente 50:50 entre o destilado e o resíduo após um tempo de
22 / 46 destilação de algumas (por exemplo, 1 a 10) horas. As temperaturas de destilação típicas usadas na produção das composições lipídicas da presente invenção estão na região de 120 °C a 180 °C, particularmente entre 145 °C e 160 °C.
[0063] Múltiplas destilações podem ser realizadas, com cada destilação sendo considerada completa quando uma divisão de aproximadamente 50:50 entre o destilado e o resíduo foi alcançada. O uso de destilações sucessivas reduz o rendimento geral, no entanto, duas destilações podem produzir resultados ideais.
[0064] De acordo com um segundo aspecto da invenção, é portanto fornecido um processo para a produção de uma composição lipídica da invenção, cujo processo compreende o fornecimento de uma mistura de ésteres etílicos de ácidos graxos; submeter essa mistura a uma primeira etapa de destilação molecular para obter um primeiro resíduo; e submeter o primeiro resíduo a uma segunda etapa de destilação molecular. A presente invenção também se refere a composições lipídicas que podem ser obtidas por tais processos de destilação. As condições de destilação adequadas incluem aquelas aqui descritas. Por exemplo, temperaturas de destilação particulares que podem ser usadas na primeira e na segunda etapas de destilação molecular estão na região de 120 °C a 180 °C, tal como entre 145 °C e 160 °C. A temperatura e o tempo são escolhidos para atingir uma divisão de aproximadamente 50:50 entre o destilado e o resíduo após um tempo de destilação tipicamente de cerca de 1 hora a cerca de 10 horas. Foi surpreendentemente constatado que a destilação de óleos transesterificados à base de vegetais pode ser alcançada na mesma ou a uma temperatura ligeiramente mais baixa (por exemplo, 3 °C mais baixa) do que óleos transesterificados de outra origem (particularmente aqueles com uma quantidade significativa (por exemplo, mais de 30% por peso) do óleo de origem marinha) sem perda de eficiência do processo de separação. Ou seja, o tempo de destilação não precisa ser aumentado, mas pode de fato ser diminuído,
23 / 46 mantendo o mesmo grau de separação (por exemplo, separação 50:50 por peso) em um período de tempo razoável.
[0065] Em uma modalidade, o óleo bruto é aquecido na primeira etapa de destilação por 4 a 8 horas, tal como de 4 a 6 horas. Na mesma ou em outra modalidade, o óleo bruto é aquecido na segunda etapa de destilação por 0,5 a 4 horas, tal como 1 a 2 horas.
[0066] Em uma modalidade do segundo aspecto da invenção, a mistura de ésteres etílicos de ácidos graxos é obtida por transesterificação de um óleo lipídico de base vegetal, por exemplo, de acordo com qualquer um dos processos descritos anteriormente. O óleo lipídico de base vegetal pode ser obtido a partir de qualquer uma das plantas, particularmente as sementes oleaginosas, aqui divulgadas ou de outra forma conhecidas na técnica.
OUTROS MÉTODOS DE ENRIQUECIMENTO
[0067] As composições lipídicas da presente invenção são úteis como ingredientes farmacêuticos ativos (APIs) ou como precursores (ou "intermediários") para APIs que podem ser obtidos a partir dos mesmos por meio de enriquecimento adicional. Essas composições seriam ainda mais enriquecidas nos níveis de PUFAs benéficos, como DHA e/ou ALA.
[0068] A concentração de ácidos graxos poli-insaturados em um óleo pode ser aumentada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, como, por exemplo, cristalização por congelamento, formação de complexos usando ureia, extração de fluido supercrítico e complexação de íons de prata. A formação de complexos com ureia é um método simples e eficiente para reduzir o nível de ácidos graxos saturados e monoinsaturados no óleo. Inicialmente, os TAGs do óleo são divididos em seus ácidos graxos constituintes, geralmente na forma de ésteres de ácidos graxos. Esses ácidos graxos livres ou ésteres de ácidos graxos, que geralmente não são alterados na composição de ácidos graxos pelo tratamento, podem então ser misturados com uma solução etanólica de ureia para a formação do complexo. Os ácidos graxos
24 / 46 saturados e monoinsaturados facilmente complexam com a ureia e cristalizam no resfriamento e podem ser subsequentemente removidos por filtração. A fração não complexada com ureia é, portanto, enriquecida com ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa.
PRODUTOS
[0069] As composições lipídicas da presente invenção são óleos a granel. Ou seja, a composição lipídica foi separada da matéria-prima (por exemplo, sementes de plantas) da qual parte ou todo o lipídeo foi obtido).
[0070] As composições lipídicas da presente invenção podem ser utilizadas como alimentos. Ou seja, as composições da invenção podem ser fornecidas em uma forma disponível oralmente. Para os fins da presente invenção, "alimentos" incluem qualquer alimento ou preparação para consumo humano ou animal que, quando ingerido pelo corpo, serve para nutrir ou acumular tecidos ou fornecer energia; e/ou mantém, restaura ou apoia o estado nutricional adequado ou a função metabólica. Os alimentos incluem composições nutricionais para bebês e/ou crianças pequenas, como, por exemplo, fórmulas infantis. No caso de alimentos para animais, os ácidos graxos podem ser fornecidos na forma de triglicerídeos a fim de minimizar ainda mais quaisquer sabores desagradáveis e maximizar a estabilidade.
[0071] Os alimentos compreendem uma composição lipídica da invenção opcionalmente em conjunto com um veículo adequado. O termo "veículo" é usado em seu sentido mais amplo para abranger qualquer componente que pode ou não ter valor nutricional. Como o indivíduo versado irá apreciar, o veículo deve ser adequado para uso (ou usado em uma concentração suficientemente baixa) em um alimento de modo que não tenha efeito deletério sobre um organismo que consome o alimento.
[0072] A composição do alimento pode estar na forma sólida ou líquida. Além disso, a composição pode incluir macronutrientes comestíveis, proteínas, carboidratos, vitaminas e/ou minerais em quantidades desejadas para
25 / 46 um uso particular, como são bem conhecidos na técnica. As quantidades destes ingredientes irão variar dependendo se a composição se destina ao uso com indivíduos normais ou para uso com indivíduos com necessidades especializadas, tais como indivíduos que sofrem de distúrbios metabólicos e semelhantes.
[0073] Exemplos de veículos adequados com valor nutricional incluem macronutrientes, tais como gorduras comestíveis (por exemplo óleo de coco, óleo de borragem, óleo fúngico, óleo de corrente negra, óleo de soja e mono- e diglicerídeos), carboidratos (por exemplo glicose, lactose comestível e amido hidrolisado) e proteínas (por exemplo proteínas de soja, soro eletrodialisado, leite desnatado eletrodialisado, soro de leite ou os hidrolisados dessas proteínas).
[0074] Vitaminas e minerais que podem ser adicionados ao ingrediente aqui divulgado incluem, por exemplo, cálcio, fósforo, potássio, sódio, cloreto, magnésio, manganês, ferro, cobre, zinco, selênio, iodo e vitaminas A, E, D, C, e o complexo B.
[0075] As composições lipídicas da presente invenção podem ser utilizadas em composições farmacêuticas. Tais composições farmacêuticas compreendem a composição lipídica da invenção opcionalmente em conjunto com um ou mais excipientes, diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis, que são conhecidos do indivíduo versado. Excipientes, diluentes ou veículos adequados incluem solução salina tamponada com fosfato, água, etanol, polióis, agentes umectantes ou emulsões, tais como uma emulsão de água/óleo. A composição pode estar na forma líquida ou sólida, incluindo uma solução, suspensão, emulsão, óleo ou pó. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um comprimido, cápsula, gel encapsulado, líquido ingerível (incluindo um óleo ou solução) ou pó, ou pomada ou creme tópico. A composição farmacêutica também pode ser fornecida como uma preparação intravenosa.
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[0076] As formas particulares adequadas para alimentos e para composições farmacêuticas incluem cápsulas contendo líquido e géis encapsulados.
[0077] As composições de lipídios da invenção podem ser misturadas com outros lipídios ou misturas de lipídios (particularmente ésteres de ácidos graxos de base vegetal e misturas de ésteres de ácidos graxos) antes do uso. As composições lipídicas da invenção podem ser fornecidas em conjunto com um ou mais componentes adicionais selecionados do grupo que consiste em um antioxidante (por exemplo, um tocoferol (como alfa-tocoferol ou gama- tocoferol) ou um tocotrienol), um estabilizador e um tensoativo. Alfa-tocoferol e gama-tocoferol são ambos componentes de ocorrência natural em vários óleos de sementes de plantas, incluindo óleos de canola.
[0078] Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e semelhantes nas composições. Além de tais diluentes inertes, a composição também pode incluir adjuvantes, tais como agentes umectantes, agentes emulsionantes e de suspensão, agentes adoçantes, agentes aromatizantes e agentes perfumantes. As suspensões, além das composições lipídicas da invenção, podem compreender agentes de suspensão, tais como álcoois isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e tragacanto ou misturas dessas substâncias.
[0079] As formas de dosagem sólidas, tais como comprimidos e cápsulas, podem ser preparadas usando técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, os ácidos graxos produzidos de acordo com os métodos aqui divulgados podem ser comprimidos com bases de comprimidos convencionais, como lactose, sacarose e amido de milho em combinação com ligantes, como acácia, amido de milho ou gelatina, agentes desintegrantes, como amido de batata ou ácido algínico, e um lubrificante como ácido esteárico ou estearato de magnésio. As cápsulas podem ser preparadas incorporando esses excipientes
27 / 46 em uma cápsula de gelatina juntamente com a composição lipídica relevante e, opcionalmente, um ou mais antioxidantes.
[0080] As vias de administração possíveis das composições farmacêuticas da presente invenção incluem, por exemplo, enteral (por exemplo, oral e retal) e parenteral. Por exemplo, uma preparação líquida pode ser administrada por via oral ou retal. Além disso, uma mistura homogênea pode ser completamente dispersa em água, misturada sob condições estéreis com diluentes, conservantes, tampões ou propelentes fisiologicamente aceitáveis para formar um spray ou inalante.
[0081] As composições lipídicas da invenção são indicadas como farmacêuticas. De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição da invenção, incluindo qualquer uma das composições farmacêuticas descritas acima, para uso como produto farmacêutico.
[0082] As composições lipídicas da invenção podem fornecer uma série de benefícios que são tipicamente associados a ácidos graxos poli- insaturados de cadeia longa. Por exemplo, as composições lipídicas da invenção e as composições farmacêuticas descritas acima podem ser utilizadas no tratamento ou prevenção de doenças cardiovasculares, proteção contra morte em pacientes com doenças cardiovasculares, redução dos níveis de colesterol sérico geral, redução da PA elevada, aumento na proporção de HDL:LDL, redução de triglicerídeos ou redução dos níveis de apolipoproteína- B, como pode ser determinado usando testes que são bem conhecidos do indivíduo versado. Consequentemente, métodos de tratamento (ou prevenção) das doenças e condições listadas acima usando as composições lipídicas da invenção também são divulgados.
[0083] Tal como aqui utilizado, os termos "tratamento", "tratar" e "tratando" se referem a reverter, aliviar, inibir o progresso de uma doença ou distúrbio como aqui descrito, ou retardar, eliminar ou reduzir a incidência ou início de um distúrbio ou doença como aqui descrito, em comparação com o
28 / 46 que ocorreria na ausência da medida tomada. Tal como aqui utilizado, os termos "prevenir", "prevenção" e "prevenir" se referem à redução do risco de adquirir ou desenvolver uma determinada condição, ou a redução ou inibição da recorrência ou da dita condição em um sujeito que não está doente.
[0084] Uma dosagem típica de um ácido graxo particular é de 0,1 mg a 20 g, tomada de uma a cinco vezes por dia (até 100 g por dia) e está particularmente na faixa de cerca de 10 mg a cerca de 1, 2, 5, ou 10 g por dia (tomados em uma ou múltiplas doses). Como conhecido na técnica, um mínimo de cerca de 300 mg/dia de ácido graxo, especialmente LC-PUFA, é desejável. No entanto, será apreciado que qualquer quantidade de ácido graxo será benéfica para o sujeito.
[0085] Quando usada como uma composição farmacêutica, a dosagem da composição lipídica a ser administrada ao paciente pode ser determinada por um versado na técnica e depende de vários fatores, tais como peso do paciente, idade do paciente, saúde geral de o paciente, história anterior do paciente, estado imunológico do paciente, etc.
[0086] As composições da invenção são composições prontamente obtidas que podem ter um perfil de estabilidade melhorado e que podem conter uma mistura de ácidos graxos em que as proporções relativas de ácidos graxos ômega-3, ômega-6 e/ou ômega-9 são particularmente benéficas para saúde humana. A estabilidade pode ser avaliada usando uma variedade de métodos conhecidos pelos versados na técnica. Tais métodos incluem o método Rancimat, a avaliação da formação de propanal (particularmente apropriado para ácidos graxos ômega-3), a avaliação da formação de hexanal (particularmente apropriado para ácidos graxos ômega-6), o método de “valor de peróxido” (por exemplo, usando o oficial AOCS método Cd 8-53) e o método do “valor de p-anisidina” (por exemplo, usando o método oficial AOCS Cd 18-90). É mostrado nos Exemplos que as composições da invenção são obtidas a partir de misturas iniciais que não mostram um perfil de estabilidade
29 / 46 aprimorado em comparação com as misturas de referência (as misturas de referência tendo uma composição semelhante em termos dos principais LC- PUFAs, mas contendo um significativo quantidade de lipídio de origem animal (peixe)).
[0087] Os compostos da invenção podem ter a vantagem de poderem ser mais eficazes do que, serem menos tóxicos do que, serem mais duradouros, serem mais potentes do que, produzirem menos efeitos secundários do que, serem mais facilmente absorvidos do que e/ou terem uma melhor farmacocinética perfil (por exemplo, maior biodisponibilidade oral e/ou depuração mais baixa) do que, e/ou têm outras propriedades farmacológicas, físicas ou químicas úteis sobre compostos conhecidos na técnica anterior, quer para uso nas indicações acima indicadas ou de outro modo.
[0088] A invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos nos quais: A Figura 1 mostra dados de liberação de propanal para o óleo de canola e óleo de referência (após a transesterificação e destilação), demonstrando a estabilidade melhorada do óleo de canola aqui descrito; e A Figura 2 mostra os dados de liberação do propanal para o óleo de canola e o óleo de referência (após o refinamento, transesterificação e destilação de RBD), demonstrando a estabilidade melhorada do óleo de canola aqui descrito.
MÉTODOS GERAIS Preparação de amostra de GC e parâmetros de GC
[0089] Ésteres etílicos de ácidos graxos puros foram diluídos a 0,25% (v/v) em 50:50 de clorofórmio:metanol e 0,01% de BHT. As soluções de éster etílico foram diluídas para 2,5 mg/ml em clorofórmio:metanol.
[0090] Os controles foram preparados como ésteres metílicos de ácidos graxos para óleo de canola, óleo de atum e 3 x óleo de canola-DHA. Eles foram analisados com cada lote de amostras para verificar o desempenho do GC e monitorar qualquer degradação do DHA devido à atividade no sistema do GC.
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[0091] Os ésteres metílicos foram preparados da seguinte forma: O óleo puro foi diluído para 0,33% (v/v) em 50:50 Clorofórmio:Metanol e 0,01% BHT (hidroxitolueno butilado). 50 µl de solução Meth-Prep II 0,05N (Solução metanólica 0,2 N de hidróxido de m- trifluorometilfenil trimetilamônio) foi adicionado, a solução agitada em vórtice e deixada incubar a 40 °C por 30 min. A solução final foi equivalente a 0,25% (v/v) de óleo.
[0092] O éster etílico (amostras) e o éster metílico (verificações) foram executados em um Shimadzu GC-2010 Plus, com detector de ionização de chama (FID) e injeção dividida usando os seguintes parâmetros: Coluna: 30m BPX-70, diâmetro interno de 0,32 mm, espessura de filme de 0,25pm. Volume de injeção: 0,5µL
[0093] Os resultados foram calculados como área normalizada (ou seja,% da área depois que os picos de ácidos graxos são identificados e os picos de ácidos não graxos são excluídos da soma das áreas de todos os picos).
[0094] As identidades dos picos de éster etílico foram determinadas comparando um cromatograma de éster etílico de ácido graxo com um cromatograma de éster metílico de ácido graxo. A ordem de eluição relativa foi quase idêntica, no entanto, os ésteres etílicos eluíram mais tarde como um grupo em comparação com os ésteres metílicos de ácidos graxos. A ordem de eluição dos ésteres metílicos de ácidos graxos foi previamente identificada usando padrões de referência e GC-MS.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 - EXTRAÇÃO DE ÓLEO DE CANOLA DHA DE SEMENTES
[0095] Canola de uma variedade divulgada na publicação de patente dos EUA no. US 2018/0016590 A1 foi cultivado como uma safra de verão. A semente foi colhida e armazenada à temperatura ambiente antes do esmagamento.
[0096] 272 kg da semente foram esmagados para produzir óleo DHA
31 / 46 usando uma prensa de parafuso Kern Kraft KK80. A temperatura do aquecedor do colar do expulsor foi definida para a temperatura máxima definida no termostato. A temperatura ambiente inicial e a temperatura de sufocamento eram de 20 °C e a distância de sufocamento foi fixada em 73,92 mm. A semente foi alimentada com óleo contínuo e coleta de farinha sem parar o expelidor até que toda a semente fosse esmagada.
[0097] A velocidade de rotação da broca, a temperatura da farinha e o óleo expelido foram monitorados durante a prensagem. O tempo de esmagamento foi de 4 horas para 270 kg, que é uma taxa de transferência de 67,5 kg/h. Foi obtido um rendimento de 87,2 kg (32%) de petróleo bruto. Após filtrar para remover finos, o rendimento foi de 77,2 kg (28%). EXEMPLO 2 - ÓLEO DE MISTURA DE REFERÊNCIA
[0098] O óleo de peixe puro contém baixos níveis de ácidos graxos ALA e níveis significativamente mais altos de EPA e DHA. Uma mistura de óleo de referência (aqui referida como "óleo de mistura de referência de triglicerídeo bruto" ou semelhante) foi projetada para ser tão semelhante quanto possível em composição ao óleo de canola DHA filtrado obtido no Exemplo 1. Isso foi feito (a) combinando o nível total de DHA com o do óleo de canola DHA e (b) combinando a proporção de DHA/(ALA + EPA). Isso foi conseguido pela mistura de um óleo de peixe rico em DHA (atum), um óleo rico em ALA (óleo de linhaça) e óleo de canola padrão. O óleo de mistura de referência resultante também tem um teor total de ômega-3 semelhante ao óleo de DHA Canola. EXEMPLO 3 - COMPOSIÇÕES DE ÁCIDOS GRAXOS DO ÓLEO DE
CANOLA DHA BRUTO E MISTURA DE REFERÊNCIA
[0099] As composições de ácidos graxos do óleo bruto filtrado e do óleo da mistura de referência foram analisadas. Os resultados são mostrados abaixo.
32 / 46 Óleo de canola Óleo de referência Ácido graxo DHA bruto (% em bruto (% em peso) peso) Palmítico C16:0 4,3 9,6 Esteárico C18:0 1,9 3,8 Oleico C18:1n9c 39,4 30,6 Cis-vacênico C18:1n7c 3,6 2,0 Linoleico C18:2n6c 7,8 11,5 GLA C18:3n6 0,1 0,1 ALA C18:3n3 21,9 21,2 Araquídico C20:0 0,7 0,4 SDA C18:4n3 2,2 0,2 Gondoico C20:1n9c 1,4 0,8 Beênico C22:0 0,3 0,2 ETA C20:4n3 1,0 0,1 Erúcico C22:1n9c 0,0 0,1 EPA C20:5n3 0,4 1,7 DPA3 C22:5n3 0,9 0,4 DHA C22:6n3 10,2 9,8 Outras 4,0 7,6 EXEMPLO 4 - AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DO ÓLEO
[00100] Um estudo de estabilidade Rancimat foi realizado usando o óleo de canola DHA bruto e a mistura de referência descrita nos Exemplos 1 e 2, respectivamente. O método envolveu o teste de cerca de 2,5 g de material de teste usando os procedimentos padrão para um Metrohm 743 Rancimat a 90 °C.
[00101] A tabela abaixo resume os resultados obtidos com esses óleos a 90 °C. Os experimentos foram realizados em duplicata. Óleo Tempo Óleo de canola DHA 7 horas 29 minutos 7 horas 17 minutos Óleo de referência 10 horas 26 minutos 10 horas 11 minutos
[00102] O óleo de canola DHA mostrou estabilidade consistentemente mais pobre do que o óleo de referência. EXEMPLO 5 - TRANSESTERIFICAÇÃO QUÍMICA DE ÓLEO DE CANOLA-DHA BRUTO
[00103] A um reator Buchi CR101 seco com nitrogênio equipado com um agitador mecânico foi adicionado etanol absoluto (12,5 l) e o óleo de canola de triglicerídeo bruto ("óleo de canola DHA") obtido no Exemplo 1 (5,00 kg)
33 / 46 e a mistura agitada.
[00104] À mistura acima foi adicionado etóxido de sódio (150 g) que foi enxaguado no reator com mais etanol absoluto (2,5 l) e a agitação continuou durante 16 horas à temperatura ambiente. Um espectro de 1H RMN registrado de uma amostra retirada da mistura indicou que a reação estava completa.
[00105] O procedimento de transesterificação foi realizado em 5,22 kg de óleo de canola-DHA bruto. À mistura de reação em bruto resultante foi adicionado destilado de petróleo com ponto de ebulição de 40-60 °C (destilado de petróleo, 10 l) e água (10 l) e a mistura cuidadosamente acidificada para pH 7 com ácido clorídrico a 10% (870ml no total necessário, Merck Universal Tiras indicadoras, pH 0 -14) com mistura completa.
[00106] A mistura resultante foi deixada repousar no reator, após o qual 2 fases se formaram. A camada de destilado de petróleo foi removida e a camada aquosa extraída com destilado de petróleo (3x5 l). As camadas de destilado de petróleo combinadas foram devolvidas ao reator e evaporadas in vacuo até um volume baixo (aproximadamente 10 l). A solução concentrada resultante foi drenada do reator, seca sobre sulfato de magnésio anidro (aproximadamente 1 kg), filtrada e concentrada in vacuo para dar um óleo amarelo (5,13 kg). EXEMPLO 6 - TRANSESTERIFICAÇÃO QUÍMICA DE ÓLEO DE
MISTURA DE REFERÊNCIA BRUTO
[00107] A um quimioreactor Buchi CR101 seco, lavado com nitrogênio equipado com um agitador mecânico, foi adicionado etanol absoluto (12,5 l) e o óleo de mistura de referência de triglicerídeo bruto obtido de acordo com o Exemplo 2 (5,00 kg) e a mistura foi agitada.
[00108] À mistura acima foi adicionado etóxido de sódio (150 g) que foi enxaguado no reator com mais etanol absoluto (2,5 l) e a agitação continuou durante 16 horas à temperatura ambiente. Um espectro de 1H RMN registrado de uma amostra indicou que pouca ou nenhuma reação ocorreu. Foi adicionado
34 / 46 mais etóxido de sódio (57 g) à mistura e a agitação continuou.
[00109] Após 5 horas adicionais, um espectro de 1H RMN de uma amostra indicou que a reação estava 75% completa. Foi adicionado mais etóxido de sódio (60 ml de uma solução a 21% em etanol) à mistura e a agitação continuou durante 3 dias, tempo após o qual a reação estava completa.
EXEMPLO DE ISOLAMENTO DE PRODUTO DA TRANSESTERIFICAÇÃO QUÍMICA DA MISTURA DE REFERÊNCIA BRUTA
[00110] O procedimento de transesterificação foi realizado em 5,17 kg de óleo de mistura de referência bruto. À mistura de reação em bruto resultante foi adicionado destilado de petróleo (15 l) e água (3,3l) e a mistura cuidadosamente acidificada a pH 7 com ácido clorídrico a 10% (910ml no total necessário) com mistura completa.
[00111] A mistura resultante foi deixada repousar no reator, após o qual 2 fases se formaram. A camada de destilado de petróleo foi removida e a camada aquosa extraída com destilado de petróleo (2x7,5 l). As camadas de destilado de petróleo combinadas foram devolvidas ao reator e evaporadas in vacuo até um volume baixo (aproximadamente 10 l). A solução concentrada resultante foi drenada do reator, seca sobre sulfato de magnésio anidro (aproximadamente 1 kg), filtrada e concentrada in vacuo para dar um óleo amarelo (5,39 kg). EXEMPLO 7 - ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS DOS
ÓLEOS TRANSESTERIFICADOS
[00112] As composições de ácidos graxos dos produtos transesterificados obtidos nos Exemplos 5 e 6 foram analisadas. Os resultados são mostrados abaixo. Óleo de canola DHA Óleo de referência Ácido graxo (% em peso) (Exemplo 5) (% em peso) (Exemplo 6) Palmítico C16:0 4,3 9,4 Esteárico C18:0 1,9 3,7 Oleico C18:1n9c 39,1 31,2 Cis-vacênico C18:1n7c 3,6 2,0
35 / 46 Linoleico C18:2n6c 7,8 11,9 GLA C18:3n6 0 0 ALA C18:3n3 22,0 22,3 Araquídico C20:0 0,6 0,4 SDA C18:4n3 2,2 0,2 Gondoico C20:1n9c 1,3 0,7 Beênico C22:0 0,3 0,2 ETA C20:4n3 1,0 0,1 Erúcico C22:1n9c 0,0 0,0 EPA C20:5n3 0,4 1,8 DPA3 C22:5n3 0,9 0,4 DHA C22:6n3 10,3 9,7 Outras 4,1 5,9 EXEMPLO 8 - DESTILAÇÃO DE ÓLEOS DE CANOLA
TRANSESTERIFICADOS Procedimento padrão para a remoção de componentes mais voláteis de misturas de ésteres etílicos de ácidos graxos (FAEE) por destilação a vácuo
[00113] Os ésteres etílicos de ácido graxo bruto (FAEE) do canola-DHA bruto (obtido no Exemplo 5) foram submetidos a destilação nas seguintes condições. A separação por destilação foi conseguida passando o óleo cru transesterificado através de uma película limpa Pope de 2 polegadas (50 mm) ainda sob vácuo equipada com 2 x 1000 ml frascos de coleta que coletam o destilado e o resíduo. Cada um foi analisado quanto à composição de ácidos graxos.
[00114] O vácuo foi fornecido por uma bomba rotativa Edwards 3 e o vácuo medido por um vacumeter ebro VM2000.
[00115] O óleo foi alimentado no destilador por uma bomba peristáltica Cole-Palmer Instrument Company easy-load II a 4 ml/min com o motor do destilador ajustado para 325 rpm com condensador de água usado para condensar o destilado. A alimentação continuou até que um ou outro dos frascos receptores estivesse cheio.
[00116] O canola-DHA FAEE bruto foi destilado sob essas condições com as bandas de aquecimento inicialmente definidas para 147 °C. O objetivo era obter uma divisão 50:50 destilado : resíduo. Durante os primeiros 30-45
36 / 46 minutos do experimento, a temperatura das bandas do aquecedor foi aumentada para 154 °C para aumentar a proporção do óleo que destilou e o alambique permitiu o equilíbrio. Depois de meia hora, a temperatura das bandas de aquecimento foi ajustada durante meia hora para 149 °C. O restante da destilação ocorreu a 149 °C. O tempo total de destilação foi de 350 minutos. Uma porção do resíduo da destilação acima foi novamente submetida à remoção de componentes mais voláteis por destilação sob as condições padrão com a temperatura das bandas do aquecedor ajustada para 149 °C. O tempo total de destilação foi de 95 minutos. Destilação Alimentação Destilado Resíduo Primeiro 1395,4g 699,5g 690,5g Segundo 376,3g 211,7g 160,3g EXEMPLO 9 - DESTILAÇÃO DE FAEE DERIVADO DA MISTURA DE
REFERÊNCIA EM BRUTO TRANSESTERIFICADO
[00117] Os ésteres etílicos de ácidos graxos em bruto (FAEE) da mistura de referência em bruto (obtida no Exemplo 6) foram submetidos a destilação nas mesmas condições que as mostradas no Exemplo anterior.
[00118] A mistura de referência bruta FAEE foi destilada sob essas condições padrão com as bandas do aquecedor inicialmente definidas para 152 °C. O objetivo era obter uma divisão 50:50 destilado: resíduo. Após 20 minutos, a temperatura das bandas do aquecedor foi ajustada para 154 °C para aumentar o fluxo de destilado. Após mais uma hora, a temperatura das bandas do aquecedor foi ajustada para 153 °C e depois 152 °C durante a hora seguinte. Para a última hora da destilação, a temperatura das bandas do aquecedor foi ajustada para 153 °C. O tempo total de destilação foi de 380 minutos. O resíduo da destilação anterior foi novamente submetido à remoção de componentes mais voláteis por destilação nas condições padrão. O objetivo era obter uma divisão 50:50 destilado: resíduo. A destilação foi realizada principalmente com as bandas do aquecedor ajustadas para 150-151 °C. O tempo total de destilação foi de 195 minutos. Destilação Alimentação Destilado Resíduo
37 / 46 Primeiro 1515,7g 729,6g 775,1g Segundo 768,5g 399,7g 363,3g EXEMPLO 10 - ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS
PARA OS ÓLEOS DESTILADOS
[00119] As composições de ácidos graxos dos produtos bidestilados obtidos nos Exemplos 8 e 9 foram analisadas. Os resultados são mostrados abaixo. Óleo de canola DHA Óleo de referência Ácido graxo (% em peso) (% em peso) (Exemplo 8) (Exemplo 9) Palmítico C16:0 0,7 1,54 Esteárico C18:0 1,56 3,30 Oleico C18:1n9c 26,15 22,36 Cis-vacênico C18:1n7c 2,52 1,49 Linoleico C18:2n6c 5,07 8,23 GLA C18:3n6 0,00 0,00 ALA C18:3n3 15,04 16,28 Araquídico C20:0 1,44 0,88 SDA C18:4n3 1,41 0,12 Gondoico C20:1n9c 2,63 1,50 Beênico C22:0 1,16 0,84 ETA C20:4n3 1,75 0,21 Erúcico C22:1n9c 0,00 0,10 EPA C20:5n3 0,75 3,33 DPA3 C22:5n3 2,81 1,18 DHA C22:6n3 30,65 30,53 Outras 6,36 8,12 EXEMPLO 11 - AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DO ÓLEO Teste de estabilidade Headspace GC-MS
[00120] A análise do espaço livre foi realizada nos produtos enriquecidos descritos acima para avaliar as quantidades de propanal que são liberadas sob condições específicas. Níveis aumentados de liberação de propanal demonstram estabilidade reduzida para o material de teste. Método SPME (microextração em fase sólida):
[00121] Fibra StableFlex PDMS/DVB de 65 µm selecionada (kit de fibra Supelco 57284-u) As fibras foram condicionadas por 10 minutos antes do uso a 250 °C em uma estação de condicionamento Triplus RSH As amostras foram incubadas a 40 °C durante 1 min antes da
38 / 46 extração Extraído por 1 min do frasco Headspace
[00122] Espera-se que seja um bom método geral capaz de capturar uma ampla gama de componentes voláteis. Método GC:
[00123] Thermo Scientific TRACE 1310 GC Coluna Thermo Scientific TR-DIOXIN 5MS, diâmetro interno de 0,25 mm, filme de 30 m 0,1 µm Injeção dividida 250 °C Split 83, 1,2 ml He/min Rampa GC: 40 °C 1min a 100 a 5 °C/min, depois a 300 °C a 50 °C/min.
[00124] Foi usada uma coluna específica de MS genérica com boa sinergia para análise de headspace. Uma rampa de temperatura inicial lenta foi empregada para maximizar a separação de voláteis antes de aumentar ao máximo para manter o desempenho da coluna. Injeções divididas foram empregadas para evitar a necessidade de resfriamento criogênico da entrada e aumentar a resolução da coluna.
[00125] A separação dos padrões foi dificultada por alguma sobreposição de pico, mas ainda pode ser acomodada na quantificação. 3 resultados de calibração padrão (0,1, 0,01 e 0,01%), o íon molecular m/z 56 foi empregado para a detecção de propanal. O pico base em m/z 58 é usado para detectar hexanal. Método MS:
[00126] Thermo Scientific DFS GC-MS de alta resolução Baixa resolução (1000), varredura completa 35-350Da a 0,5s/varredura Padrões: - As diluições padrão de Propanal e Hexanal foram feitas em ésteres etílicos de DHA Canola fornecidos. Estas misturas padrão foram então adicionadas a um volume de 540 µl a frascos de headspace de 20
39 / 46 ml.
[00127] A varredura completa foi empregada, permitindo o monitoramento de todos os produtos evoluídos, em vez de moléculas específicas. Resultados de estabilidade do headspace: A tabela abaixo resume os resultados obtidos a partir do óleo de canola bidestilado obtido no Exemplo 8 e do óleo de referência bidestilado obtido no Exemplo 9 de T = 0 a 4 dias. As amostras de teste foram mantidas durante este período à temperatura ambiente em uma caixa de luz e sob iluminação de tubo fluorescente. O íon m/z 58 molecular foi analisado, e o cromatograma de massa mostra claramente o surgimento de propanal em RT 1,37 min. O desenvolvimento do propanal é quantificado na tabela abaixo e os dados são mostrados na Figura 1. O óleo de canola DHA liberou quantidades substancialmente menores de propanal demonstrando a estabilidade aprimorada do óleo de canola em comparação com a referência. Ponto de tempo (dias) 0 2 4 Óleo de canola DHA (ppm propanal) 32,000 38,000 185,000 Óleo de referência (ppm propanal) 83,000 294,000 829,000
[00128] O óleo de canola DHA apresenta estabilidade superior à oxidação em comparação com o óleo de referência. EXEMPLO 12 - REFINAMENTO DE ÓLEO DE CANOLA DHA
[00129] Uma porção do óleo de canola obtido no Exemplo 1 foi refinado antes de ser submetido a enriquecimento adicional. O processo de refinamento envolveu degomagem, refinamento de álcali, branqueamento e desodorização. Desgomagem ácida
[00130] A desgomagem é a remoção de fosfatídeos não hidratáveis e hidratáveis do óleo. O óleo bruto seco obtido no Exemplo 1 foi aquecido a 53 ± 2 °C e foi adicionado 0,2% de uma solução de ácido cítrico a 50%. Após aproximadamente 30 minutos de mistura, 2,0% de água amaciada aquecida (53 ± 2 °C) foi adicionada e misturada por aproximadamente 30 minutos. O óleo
40 / 46 foi aquecido a 67 ± 3 °C durante a espera e depois centrifugado. Pré-tratamento/refinamento de ácido
[00131] Refinamento é a remoção de ácidos graxos livres após sua saponificação com soda cáustica para torná-los solúveis em água e sua posterior remoção por centrifugação. Uma etapa de pré-tratamento com ácido foi usada para continuar a hidratação dos fosfatídeos. O óleo degomado foi aquecido a 65 ± 5 °C e 0,1% de ácido fosfórico a 85% adicionado e misturado por um total de 30 minutos. Após a adição de ácido e tempo de espera, hidróxido de sódio 20 Be‘ (Baumé; 14,4%, p/p) foi adicionado para neutralizar os ácidos graxos livres mais um excesso de 0,05% (p/p). A cáustica e o óleo foram então misturados por mais 15 minutos. O óleo foi aquecido a 62 ± 2 ° C durante a espera de 15 minutos e, em seguida, o óleo foi centrifugado. Tratamento Trisil Silica
[00132] Para posterior retirada dos sabonetes, foi realizado tratamento com trisil sílica, em níveis compatíveis com o branqueamento. O pré- tratamento com Trisyl foi combinado com a etapa de branqueamento. O óleo refinado foi aquecido a 68 ± 5 °C e tratado com 0,3% de Trisyl 300. O óleo/Trisil foi misturado durante aproximadamente 15 minutos, e então o branqueamento continuou. Branqueamento
[00133] O óleo refinado foi tratado com argila adsortiva para remoção de peróxidos, fosfatídeos, corpos coloridos e vestígios de sabão. Uma etapa de pré-tratamento com ácido foi usada para continuar a hidratação dos fosfatídeos. O óleo pré-tratado com Trisyl foi misturado com 0,2% (p/p) de uma solução de ácido cítrico a 50%. Após 15 minutos de mistura, foi adicionado 2% (p/p) de argila de branqueamento Tonsil Supreme 126 FF. A mistura foi então aquecida a 90 ± 2 °C sob vácuo e mantida durante aproximadamente 30 minutos. O óleo foi resfriado a 60 ± 2 °C, vácuo quebrado com nitrogênio, 1,0 kg de auxiliar de filtro adicionado e filtrado. Vaso de pressão: Vaso de pressão Cherry-Burrell
41 / 46 de 500 l, camisa de vapor ou água de resfriamento, toda construção em aço inoxidável 316 com impulsor e defletores para mistura, número de série da mfg nº E-227-94. Filtro Prensa: Filtro Prensa de Polipropileno Sperry de 24”, filtro de 4,8 pés cúbicos de capacidade, suportes de papel e tecido foram usados. Desodorizante
[00134] O óleo branqueado foi submetido a aspersão com vapor em alta temperatura e baixa pressão para remover componentes odoríferos, componentes de sabor e ácidos graxos livres adicionais. A cor também é reduzida pelo branqueamento por calor em temperaturas elevadas. A metade do óleo branqueado foi desodorizado a 180 ± 2 °C por 60 min com vapor de pulverização a 1% e a composição de ácidos graxos (FAC) foi monitorada. Recipiente desodorizador (OD4): Recipiente de fabricação de cobre de 400 l classificado a vácuo, camisa de vapor ou água de resfriamento, toda construção 316 inoxidável. Uma ligeira diminuição do nível de DHA foi observada a 180 °C por 60 min de espera. Em seguida, outro ensaio foi conduzido a 180 °C por 30 min de espera. O produto foi embalado sob nitrogênio em baldes de plástico HDPE de 20 l e armazenado em um refrigerador a 4 °C. EXEMPLO 13 - REFINAMENTO DO ÓLEO DE MISTURA DE
REFERÊNCIA ORIGINAL
[00135] Uma porção da mistura de referência descrita no Exemplo 2 foi refinada antes de sofrer enriquecimento adicional. No processo de refinamento, a mistura de referência foi submetida a refinamento nas mesmas condições que as mostradas no Exemplo anterior. EXEMPLO 14 - COMPOSIÇÕES DE ÁCIDOS GRAXOS DO ÓLEO DE
CANOLA RBD DHA E MISTURA DE REFERÊNCIA DE RBD
[00136] As composições de ácidos graxos do óleo de canola RBD DHA (do Exemplo 12) e do óleo de mistura de referência RBD (do Exemplo 13) foram analisadas. Os resultados são mostrados abaixo.
42 / 46 Óleo de canola Óleo de referência Ácido graxo RBD DHA (% em RBD (% em peso) peso) Palmítico C16:0 4,23 9,22 Esteárico C18:0 2,52 3,89 Oleico C18:1n9c 42,90 31,62 Cis-vacênico C18:1n7c 3,01 1,96 Linoleico C18:2n6c 7,15 12,18 GLA C18:3n6 0,54 0,00 ALA C18:3n3 19,95 22,51 Araquídico C20:0 0,72 0,38 DAS C18:4n3 2,25 0,17 Gondoico C20:1n9c 1,28 0,71 Beênico C22:0 0,31 0,22 ETA C20:4n3 1,08 0,00 Erúcico C22:1n9c 0,00 0,00 EPA C20:5n3 0,47 1,67 DPA3 C22:5n3 0,96 0,41 DHA C22:6n3 9,33 9,20 Outras 3,32 5,86
[00137] Referências a "RBD" em conexão com os Exemplos (e as figuras anexas) significam que o produto em questão foi obtido direta ou indiretamente dos produtos "refinados" do Exemplo 12 (para óleos de canola) e Exemplo 13 (para misturas de referência). EXEMPLO 15 - TRANSESTERIFICAÇÃO QUÍMICA DE ÓLEO RBD CANOLA-DHA
[00138] A um reator Buchi CR101 seco com nitrogênio equipado com um agitador mecânico foi adicionado etanol absoluto (12,5 l) e o óleo de canola-DHA triglicerídeo refinado ("RBD") obtido no Exemplo 12 (5,00 kg) e a mistura agitada.
[00139] À mistura acima foi adicionado etóxido de sódio (150 g) que foi enxaguado no reator com mais etanol absoluto (2,5 l) e a agitação continuou durante 16 horas à temperatura ambiente. Um espectro de 1H RMN registrado de uma amostra retirada da mistura indicou que a reação estava completa.
[00140] O procedimento de transesterificação foi realizado em aprox. 5kg de óleo de canola-DHA RBD. À mistura de reação em bruto resultante foi adicionado destilado de petróleo com ponto de ebulição de 40-60 °C (destilado
43 / 46 de petróleo, 10L) e água (10L) e a mistura cuidadosamente acidificada para pH 7 com ácido clorídrico a 10% (870ml no total necessário, Merck Universal Tiras indicadoras, pH 0 -14) com mistura completa.
[00141] A mistura resultante foi deixada repousar no reator, após o qual 2 fases se formaram. A camada de destilado de petróleo foi removida e a camada aquosa extraída com destilado de petróleo (3x5L). As camadas de destilado de petróleo combinadas foram devolvidas ao reator e evaporadas in vacuo até um volume baixo (aproximadamente 10 l). A solução concentrada resultante foi drenada do reator, seca sobre sulfato de magnésio anidro (aproximadamente 1 kg), filtrada e concentrada in vacuo para dar um óleo amarelo pálido claro (rendimento: 99%). EXEMPLO 16 - TRANSESTERIFICAÇÃO QUÍMICA DE ÓLEO DE
MISTURA DE REFERÊNCIA RBD
[00142] A um quimiorreactor Buchi CR101 seco, lavado com nitrogênio, equipado com um agitador mecânico, foi adicionado etanol absoluto (12,5 l) e o óleo de mistura de referência de triglicerídeo RBD obtido de acordo com o Exemplo 13 (aproximadamente 5 kg) e a mistura foi agitada.
[00143] À mistura acima foi adicionado etóxido de sódio (150 g) que foi enxaguado no reator com mais etanol absoluto (2,5 l) e a agitação continuou durante 16 horas à temperatura ambiente. Um espectro de 1H RMN registrado de uma amostra indicou que pouca ou nenhuma reação ocorreu. Foi adicionado mais etóxido de sódio (57 g) à mistura e a agitação continuou.
[00144] Após 5 horas adicionais, um espectro de 1H RMN de uma amostra indicou que a reação estava 75% completa. Foi adicionado mais etóxido de sódio (60 ml de uma solução a 21% em etanol) à mistura e a agitação continuou durante 3 dias, tempo após o qual a reação estava completa. Exemplo de isolamento de produto da transesterificação química da mistura de referência de RBD
[00145] O procedimento de transesterificação foi realizado em aprox. 5
44 / 46 kg de óleo de mistura de referência RBD. À mistura de reação em bruto resultante foi adicionado destilado de petróleo (15 l) e água (3,3l) e a mistura cuidadosamente acidificada a pH 7 com ácido clorídrico a 10% (910ml no total necessário) com mistura completa.
[00146] A mistura resultante foi deixada repousar no reator, após o qual 2 fases se formaram. A camada de destilado de petróleo foi removida e a camada aquosa extraída com destilado de petróleo (2x7,5 l). As camadas de destilado de petróleo combinadas foram devolvidas ao reator e evaporadas in vacuo até um volume baixo (aproximadamente 10 l). A solução concentrada resultante foi drenada do reator, seca sobre sulfato de magnésio anidro (aproximadamente 1 kg), filtrada e concentrada in vacuo para dar um óleo amarelo pálido claro (rendimento: 99%). EXEMPLO 17 - DESTILAÇÃO DE ÓLEOS DE CANOLA RBD
TRANSESTERIFICADOS Procedimento padrão para a remoção de componentes mais voláteis de misturas de ésteres etílicos de ácidos graxos (FAEE) por destilação a vácuo
[00147] Os ésteres etílicos de ácidos graxos (FAEE) do RBD canola- DHA (obtido no Exemplo 15) foram submetidos a destilação nas seguintes condições. A separação por destilação foi conseguida passando o óleo transesterificado através de uma película limpa Pope de 2 polegadas (50 mm) ainda sob vácuo equipada com 2 x 1000 ml frascos de coleta coletando o destilado e o resíduo. Cada um foi analisado quanto à composição de ácidos graxos.
[00148] O vácuo foi fornecido por uma bomba rotativa Edwards 3 e o vácuo medido por um vacumeter ebro VM2000.
[00149] O óleo foi alimentado no destilador por uma bomba peristáltica Cole-Palmer Instrument Company easy-load II a 4 ml/min com o motor do destilador ajustado para 325 rpm com condensador de água usado para condensar o destilado. A alimentação continuou até que um ou outro dos
45 / 46 frascos receptores estivesse cheio.
[00150] RBD canola-DHA FAEE foi destilado sob essas condições com as bandas do aquecedor inicialmente ajustadas para 152 °C para obter uma divisão 50:50 de destilado : resíduo. Uma parte do resíduo desta destilação foi novamente submetida à remoção de componentes mais voláteis por destilação sob as condições padrão com a temperatura das bandas do aquecedor ajustada para 152 °C. O tempo total de destilação foi de aprox. 90 minutos. Destilação Alimentação Destilado Resíduo Primeiro 1.596,6 729,9 855,9 Segundo 851,3 503,5 343,1 EXEMPLO 18 - DESTILAÇÃO DE FAEE DERIVADA DA MISTURA DE
REFERÊNCIA DE RBD TRANSESTERIFICADA
[00151] Os ésteres etílicos de ácidos graxos (FAEE) da mistura de referência RBD (obtida no Exemplo 16) foram submetidos a destilação nas mesmas condições que as mostradas no Exemplo anterior.
[00152] A mistura de referência RBD FAEE foi destilada sob essas condições padrão com as bandas do aquecedor inicialmente ajustadas para 152 °C para obter uma divisão 50:50 de destilado : resíduo. O resíduo desta destilação foi novamente submetido à remoção de componentes mais voláteis por destilação nas condições padrão. O objetivo era obter uma divisão 50:50 destilado : resíduo. A destilação foi realizada principalmente com as bandas do aquecedor ajustadas para 152 °C. O tempo total de destilação foi de aprox. 200 minutos. Destilação Alimentação Destilado Resíduo Primeiro 1.195,1 674,7 504,6 Segundo 496,4 297,2 197,4 EXEMPLO 19 - ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS
PARA OS ÓLEOS RBD ENRIQUECIDOS
[00153] As composições de ácidos graxos dos produtos obtidos nos Exemplos 17 e 18 foram analisadas. Os resultados são mostrados abaixo. Óleo de canola DHA Óleo de referência Ácido graxo (% em peso) (% em peso) (Exemplo 17) (Exemplo 18) Palmítico C16:0 0,78 2,27
46 / 46 Óleo de canola DHA Óleo de referência Ácido graxo (% em peso) (% em peso) (Exemplo 17) (Exemplo 18) Esteárico C18:0 2,09 3,29 Oleico C18:1n9c 29,57 23,52 Cis-vacênico C18:1n7c 2,14 1,50 Linoleico C18:2n6c 4,90 8,80 GLA C18:3n6 0,36 0,00 ALA C18:3n3 14,34 16,87 Araquídico C20:0 1,56 0,83 DAS C18:4n3 1,44 0,00 Gondoico C20:1n9c 2,48 1,40 Beênico C22:0 1,12 0,85 ETA C20:4n3 1,93 0,15 Erúcico C22:1n9c 0,00 0,13 EPA C20:5n3 0,76 2,75 DPA3 C22:5n3 3,02 1,06 DHA C22:6n3 27,93 28,18 Outras 5,58 8,40 EXEMPLO 20 - AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DO ÓLEO
[00154] A análise de espaço livre foi conduzida nos produtos enriquecidos descritos nos Exemplos 17 e 18 de acordo com o método descrito no Exemplo 11.
[00155] A tabela abaixo resume os resultados obtidos a partir do óleo de canola RBD obtido no Exemplo 17 e do óleo de referência RBD obtido no Exemplo 18 de T = 0 a 3 dias. As amostras de teste foram mantidas durante este período à temperatura ambiente em uma caixa de luz e sob iluminação de tubo fluorescente. O íon m/z 58 molecular foi analisado, e o cromatograma de massa mostra claramente o surgimento de propanal em RT 1,37 min. O desenvolvimento propanal é quantificado na tabela abaixo, e os dados são mostrados na Figura 2. O óleo de canola DHA liberou quantidades substancialmente menores de propanal demonstrando a estabilidade aprimorada do óleo de canola em comparação com a referência. Ponto de tempo (dias) 0 3 Óleo de canola DHA (ppm propanal) 17,000 73,000 Óleo de referência (ppm propanal) 31,000 267,000
[00156] O óleo de canola DHA apresentou estabilidade superior à oxidação em comparação com o óleo de referência.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1.Composição lipídica de base vegetal, caracterizada pelo fato de que compreende: ácido docosa-hexaenoico (22:6n-3) em uma quantidade de cerca de 15% a cerca de 35% em peso do teor total de ácidos graxos da composição; ácido eicosapentaenoico (20:5n-3) em uma quantidade de até cerca de 5% em peso do teor total de ácido graxo da composição; ácido α-linolênico (18:3n-3) em uma quantidade de cerca de 10% a cerca de 20% em peso do teor total de ácido graxo da composição; ácido oleico (18:1n-9) em uma quantidade de cerca de 20% a cerca de 40% em peso do teor total de ácido graxo da composição; e ácido palmítico em uma quantidade de até cerca de 1,5% em peso do teor total de ácido graxo da composição; em que os componentes (i) a (v) são, cada um, independentemente fornecidos na forma de um ácido graxo, um sal de ácido graxo, um éster de ácido graxo ou um sal de um éster de ácido graxo.
2.Composição lipídica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ácido docosa-hexaenoico (22:6n-3) está presente em uma quantidade de cerca de 20% a cerca de 35% (particularmente de cerca de 22% a cerca de 33%) em peso do ácido graxo total conteúdo da composição.
3.Composição lipídica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o ácido eicosapentaenoico está presente em uma quantidade de até cerca de 3% (particularmente até cerca de 1%) em peso do teor total de ácido graxo da composição.
4.Composição lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o ácido α-linolênico está presente em uma quantidade de cerca de 12% a cerca de 20% (particularmente de cerca de 12% a cerca de 18%) em peso do ácido graxo total conteúdo da composição.
5.Composição lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o ácido oleico está presente em uma quantidade de cerca de 20% a cerca de 35% (particularmente de cerca de 22% a cerca de 33%) em peso do teor de ácido graxo total de a composição.
6.Composição lipídica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o ácido palmítico (16:0) está presente em uma quantidade de até cerca de 1,0% (particularmente até cerca de 0,7%) em peso do teor total de ácido graxo da composição.
7.Composição lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que os componentes (i) a (v) são cada um independentemente fornecidos na forma de um éster de ácido graxo ou um sal de um éster de ácido graxo.
8.Composição lipídica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que os componentes (i) a (v) são, cada um, independentemente fornecidos na forma de um éster etílico de ácido graxo ou parte de um triglicerídeo.
9.Composição lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a composição lipídica é derivada de uma única fonte.
10.Composição lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a composição lipídica é derivada de uma planta.
11.Composição lipídica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a planta é uma semente oleaginosa, particularmente Brassica sp., Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, Helianthus sp., Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Arabidopsis thaliana, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Avena sativa, Trifolium sp.,
Elaesis guineenis, Nicotiana benthamiana, Hordeum vulgare, Lupinus angustifolius, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Camelina sativa, ou Crambe abyssinica.
12.Composição lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a composição é fornecida na forma de um comprimido, cápsula, gel encapsulado, líquido ou pó ingerível, ou uma pomada ou creme tópico.
13.Composição lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais componentes adicionais selecionados a partir do grupo que consiste em um antioxidante, um estabilizador e um tensoativo.
14.Composição lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de doença cardiovascular, proteção contra morte em pacientes com doença cardiovascular, redução dos níveis gerais de colesterol sérico, redução da pressão arterial elevada, aumento da razão HDL:LDL, redução dos triglicerídeos ou redução dos níveis de apolipoproteína-B.
15.Processo para a produção de uma composição lipídica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o processo é caracterizado pelo fato de que compreende fornecer uma mistura de ésteres etílicos de ácidos graxos; submeter essa mistura a uma primeira etapa de destilação molecular para obter um primeiro resíduo; e submeter o primeiro resíduo a uma segunda etapa de destilação molecular.
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