KR20210005228A - 질량 분석법을 사용한 면역 글로불린의 식별 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 질량 분석법을 사용하여 이온화 및 검출 전에 면역 글로불린의 사전 정제없이 생물학적 샘플로부터 면역 글로불린을 식별 및/또는 정량화하기 위한 재료 및 방법들에 관한 것이다. 예를 들어, 단일 클론 면역 글로불린으로부터 단일 클론 경쇄는 산과 환원제를 포함하는 수성 완충액으로 단일 클론 면역 글로불린을 포함하는 샘플을 희석한 다음 상기 샘플을 알파-시아노-4-하이드록시신나믹산 매트릭스(alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA)와 혼합한 후, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 - 비행 시간(matrix assisted laser desorption ionization - time of flight, MALDI-TOF) 질량 분석법을 사용하여 관찰될 수 있다. 또 다른 예에서, 무손상 단일 클론 면역 글로불린은 상기 단일 클론 면역 글로불린을 포함하는 샘플을 물로 희석한 다음 상기 샘플을 CHCA 매트릭스와 혼합한 후, MALDI-TOF 질량 분석법을 사용하여 샘플에서 관찰될 수 있다.
Description
본 개시는 질량 분석법을 사용하여 이온화 및 검출 전에 면역 글로불린의 사전 정제없이 생물학적 샘플로부터 면역 글로불린을 식별 및/또는 정량화하기 위한 재료 및 방법들에 관한 것이다. 예를 들어, 단일 클론 면역 글로불린으로부터 단일 클론 경쇄는 산과 환원제를 포함하는 수성 완충액으로 단일 클론 면역 글로불린을 포함하는 샘플을 희석한 다음 상기 샘플을 알파-시아노-4-하이드록시신나믹산 매트릭스(alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA)와 혼합한 후, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 - 비행 시간(matrix assisted laser desorption ionization - time of flight, MALDI-TOF) 질량 분석법을 사용하여 관찰될 수 있다. 또 다른 예에서, 무손상 단일 클론 면역 글로불린은 상기 단일 클론 면역 글로불린을 포함하는 샘플을 물로 희석한 다음 상기 샘플을 CHCA 매트릭스와 혼합한 후, MALDI-TOF 질량 분석법을 사용하여 샘플에서 관찰될 수 있다.
인간 면역 글로불린은 이황화 결합에 의해 함께 결합된 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 두가지 다른 경쇄 이소타입(카파 및 람다)과 다섯가지 다른 중쇄 이소타입(IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE)이 있다. 단일 클론 면역 글로불린, 다중 클론 면역 글로불린 및 상기 단일 클론 또는 다중 클론 면역 글로불린의 경쇄 및/또는 중쇄의 임의의 조합은 정확한 분자량(molecular mass)을 통해 질량 분석기를 사용하여 식별될 수 있다.
질량 분석법에 의한 면역 글로불린의 검출 및 모니터링은 일반적으로 당업계에 알려져 있다.
예를 들어, WO2015/154052A 및 WO2014/150170은 액체 크로마토그래피 및 ESI-Q-TOF 4중극자 비행시간 질량분석(ESI-Q-TOF quadrupole time-of-flight mass spectrometry) 전에 멜론 겔(Melon Gel)을 사용하여 혈청 샘플로부터 면역 글로불린을 농축시키는 것을 개시한다. WO2015/154052A는 유사하게 LC-ESI-Q-TOF 질량 분석법을 사용한 멜론 겔 정제를 사용한다. Barnidge D.R. et al (J. Neuroimmunology (2015), 285, 123-126)은 또한 혈청 샘플로부터 면역 글로불린을 농축시키는 것을 기술한다. 그 다음 정제된 혈청의 샘플은 LC-MS에 의한 분석 전에 DTT(dithiothreitol)를 사용하여 환원된다.
Mills et al(Clin. Chem. (2016) 62 (10) 1334-1344)은 MALDI-TOF 전에, 항체를 정제하기 위해 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인의 불변 부위에 대한 카멜리드-유래(camelid-derived) 나노바디를 사용하는 것을 기술한다.
이러한 예들은 질량 분석법에 의한 분석 전에 통상적으로 항체가 정제되거나 농축된다는 것을 보여준다.
질량 분석(mass spectrometry, M.S.) 이전에 면역 글로불린의 복잡한 정제 또는 농축은 샘플내 면역 글로불린을 연구하는 시간을 증가시킨다.
Hortin G.L. 및 Remaley A.T. (Clin. Geonomics (2006) 103-114)는 주요 혈장 단백질의 질량 측정을 기술하고 혈청 샘플이 기술되어 있다. 표본(specimen)은 40% 아크릴로니트릴/10% 에탄올/50% 물/0.1% 트리플루오로아세트산에서 10mmol/L 암모늄 아세테이트 및 10g/L시나피닉산으로 희석되었다.
당단백질(glycoproteins), 트랜스페린(transferrin), 면역 글로불린 G, 아폴리포단백질(apolipoproteins) 및 트랜스티레틴(transthyretin)을 포함하는, 광범위한 정제된 단백질들이 분석되었다.
두 표본에 대한 희석된 혈청 샘플은 IgG, 알부민, 프레 알부민, 트랜스페린 및 아폴리포단백질을 식별할 수 있었다. 상기 논문은 질량이 30,000개 미만인 가장 풍부한 단백질(즉, 예를 들어 질량이 147,000인 IgG 는 제외) 중 몇 가지에 대해, 화학적 변형 및 서열 변형을 감지할 수 있는 충분한 정밀도와 정확도로 질량 측정을 수행할 수 있다고 결론지었다. 이 논문은 또한 분획없은 복잡한 혼합물의 분석은 단점이 있다고 지적하였다. 첫째, 오직 가장 풍부한 성분들만 관찰될 수 있었다. 둘째, 고 단백질과 염분 농도에 의해 신호가 전반적으로 억제되었다. 알부민은 m/z 30,000으로 다른 피크를 검출하는 능력을 방해하는 것으로 관찰되었다. 이 논문은 IgG와 알부민의 선택적 고갈(depletion)이 사용되어야 한다고 결론지었다. 다른 면역 글로불린 또는 실제 경쇄의 식별은 개시되지 않았다.
항체 생산 세포와 관련된 많은 증식성 질환이 있다.
이러한 많은 증식성 질환에서 형질 세포는 증식하여 동일한 형질 세포의 단일 클론 종양을 형성한다. 이는 다량의 동일한 면역 글로불린을 생산하게 하며 단일 클론 감마병증(monoclonal gammopathy)으로 알려져 있다.
골수종(myeloma) 및 원발성 전신 아밀로이드증(primary systemic amyloidosis)(AL 아밀로이드증)과 같은 질환은 영국에서 각각 암 사망의 약 1.5%와 0.3%를 차지한다. 다발성 골수종은 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma) 다음으로 혈액 악성종양(haematological malignancy)의 두 번째로 흔한 형태이다. 백인 인구에서 발생률은 연간 백만명당 약 40명이다. 일반적으로 다발성 골수종의 진단은 골수에 있는 과잉 단일 클론 형질 세포, 혈청 또는 소변에 있는 단일 클론 면역 글로불린, 및 고칼슘혈증(hypercalcaemia), 신장 기능부전(renal insufficiency), 빈혈(anaemia) 또는 골 병변(bone lesions)과 같은 관련 기관 또는 조직 손상의 존재를 기반으로 한다. 골수의 정상 형질 세포 함량은 약 1%인 반면, 다발성 골수종에서는 상기 함량이 일반적으로 10% 초과, 종종 30% 초과이지만 90% 초과일 수 있다.
AL 아밀로이드증(AL amyloidosis)은 아밀로이드 축적물로서 단일 클론 유리 경쇄 단편의 축적을 특징으로 하는 단백질 형태 장애이다. 일반적으로, 이러한 환자들은 심장 또는 신부전이 있지만 말초 신경 및 기타 기관들도 관련될 수 있다.
환자의 혈류 또는 실제 소변 내의 단일 클론 면역 글로불린의 존재에 의해 식별될 수 있는 다른 질환들이 많이 있다. 여기에는 골수 외부에서 발생하고 모든 기관에서 나타날 수 있는 형질 세포 종양인 형질세포종(plasmacytoma)과 골수 외 형질세포종(extramedullary plasmacytoma)이 포함된다. 이 경우, 상기 단일 클론 단백질은 일반적으로 IgA이다. 다발 고립성 형질세포종(multiple solitary plasmacytomas)은 다발성 골수종의 증거와 함께 또는 증거없이 발생할 수 있다. 발덴스트륌 거대 글로불린혈증(Waldenstrφm's macroglobulinaemia)은 단일 클론 IgM의 생성과 관련된 저 등급 림프증식성 장애이다. 매년 미국에서는 약 1,500건, 영국에서는 약 300건의 새로운 사례가 있다. 혈청 IgM 정량화는 진단과 모니터링 모두에 중요하다. B-세포 비호지킨 림프종은 영국에서 모든 암 사망의 약 2.6%를 유발하며 단일 클론 면역 글로불린은 표준 전기영동법을 사용하여 환자의 약 10-15%의 혈청에서 확인된다. 초기 보고서들은 60-70%의 환자의 소변에서 단일 클론 유리 경쇄가 검출될 수 있음을 나타낸다. B-세포에서 만성 림프구 백혈병 단일 클론 단백질이 유리 경쇄 면역 분석에 의해 확인되었다.
또한 소위 MGUS 상태들이 있다. 이들은 비정형 단일 클론 감마병증(monoclonal gammopathy of undetermined significance)이다. 이 용어는 다발성 골수종, AL 아밀로이드증, 발덴스트륌 거대 글로불린혈증 등의 증거가 없는 개인에서 단일 클론 무손상(intact) 면역 글로불린의 예상치 못한 존재를 의미한다. MGUS는 50세 이상 인구의 1%, 70세 이상 인구의 3%, 80세 이상 인구의 10%까지에서 발견될 수 있다. 이들 대부분은 IgG- 또는 IgM-관련이며, IgA-관련 또는 이중-클론은 드물다. MGUS를 가진 대부분의 사람들은 관련없는 질환으로 사망하지만 MGUS는 악성 단일 클론 감마병증으로 변할 수 있다.
위에서 강조한 질환들에 대한 적어도 일부 경우에서 상기 질환은 단일 클론 면역 글로불린 또는 유리 경쇄의 비정상적인 농도를 나타낸다. 질환이 혈장 세포의 비정상적인 복제를 생성하는 경우, "단일 클론(monoclone)"이 증식하여 혈액에 나타날 때 해당 세포의 유형에 의한 더 많은 면역 글로불린의 생성이 흔히 나타난다.
Barnidge D.R. et al (J. Neuroimmunology (2015), 285, 123-126)
Mills et al(Clin. Chem. (2016) 62 (10) 1334-1344)
Hortin G.L. 및 Remaley A.T. (Clin. Geonomics (2006) 103-114)
본 개시는 질량 분석법을 사용하여 이온화 및 검출 전에 면역 글로불린의 사전 정제없이 생물학적 샘플로부터 면역 글로불린을 식별 및/또는 정량화하기 위한 재료 및 방법들에 관한 것이다. 일부 예들에서, 질량 분석 기술은 샘플로부터 다른 비-면역 글로불린 단백질의 면역정제 또는 제거 모두에 의한 면역 글로불린의 추가적 정제의 필요없이 생물학적 샘플에서 면역 글로불린을 식별 및/또는 정량화하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 입증된 바와 같이, 단일 클론 면역 글로불린 또는 다중 클론 면역 글로불린, 및 단일 클론 또는 다중 클론 면역 글로불린으로부터의 경쇄 및/또는 중쇄의 임의의 조합은 환원제를 포함하거나 포함하지 않는 완충액에서 샘플을 희석하여 식별될 수 있다. 이 방법론은 질량 분석법을 사용한 이온화 및 검출 전에 정제를 수행하는 다른 방법보다 수행 속도가 빠르며 비용을 절감하고 처리량을 증가시킨다.
본 출원인은 혈액, 혈청, 혈장 또는 뇌척수액과 같은 비교적 복잡한 샘플에서도 물 또는 수성 완충액을 사용하여 샘플을 희석하거나 건조된 샘플을 재구성하여 면역 글로불린을 검출하고 정량화할 수 있음을 예기치 않게 발견했다.
본 발명은 상기 샘플에서 단일 클론 및/또는 다중 클론 면역글로불린을 식별화 및/또는 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 다음의 단계를 포함한다:
(i) 대상체로부터 면역 글로불린을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(ii) 상기 샘플을 물 또는 수성 완충액으로 희석하여 희석된 샘플을 형성하는 단계; 및
(iii) 상기 희석된 샘플을 이온화하고, 질량 분석법에 의해 무손상(intact) 면역 글로불린 또는 상기 면역 글로불린의 경쇄 또는 중쇄를 검출 및 선택적으로 정량화하는 단계.
질량 분석은 잠재적으로 모든 질량 분석 기술일 수 있다. 여기에는 예를 들어 액체 크로마토그래피-전자분무 이온화-질량 분석법(liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry, LC-ESI-MS)과 같은 액체 크로마토그래피가 결합된 4중극자 비행시간 질량 분석법(quadropole time-of-flight mass spectrometry)이 예를 들어 포함된다. 그러나, 보다 일반적으로 상기 질량 분석법은 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 - 비행 시간(MALDI-TOF) 질량 분석법이다. 위에서 설명된 바와 같이, 상기 정제되지 않은 희석된 샘플이 상기 질량 분석 시스템에 도입되는데, 이는 샘플의 모든 성분들이 동시에 상기 시스템에 도입됨을 의미한다. 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)이 사용되는 본 발명의 구현예들에서 상기 액체 크로마토그래피 컬럼은 단순히 샘플의 성분들을 분리하여 상기 액체 크로마토그래피 컬럼과 상호 작용하는 방식에 따라 다른 시간에 질량 분석기에 도달하도록 한다.
상기 질량 분석 기반 기술이 매트릭스의 사용을 포함하는 경우, 상기 희석된 샘플은 이온화되기 전에 적합한 매트릭스와 혼합될 수 있다. 예를 들어, 상기 매트릭스는 트리플루오로아세트산과 같은 산을 포함하는 물 및 아세토니트릴과 혼합된 알파-시아노-4-히드록시신나믹산(alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA) 매트릭스일 수 있다. 다른 매트릭스는, 예를 들어 시나피닉산(sinapinic acid) 또는 2,5-디히드록시벤조익산(2, 5-Dihydroxybenzoic acid)의 혼합물을 포함한다.
상기 샘플 완충액은 임의의 적합한 수성 완충액일 수 있지만, 예를 들어 아세트산과 같은 산과 TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine), TCEP-HCl, 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol, BME) 또는 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)과 같은 환원제의 혼합물을 포함하는 완충액을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예들에서 상기 완충액은 아세트산 및 TCEP-HCl을 포함할 수 있으며, 예를 들어 상기 완충액은 5% 아세트산(v/v) 및 20mM TCEP-HCl을 포함할 수 있다. 또는 상기 샘플은 DTT와 같은 환원제를 사용하여 환원된 다음 산성 수성 용액과 혼합될 수 있다. 예를 들어, 상기 샘플은 10mM DTT로 환원된 다음 산성 수성 용액과 혼합될 수 있다.
경쇄에 부착된 중쇄는 상기 완충액에 환원제를 포함하거나 상기 샘플에 별도의 첨가물을 포함하여 서로 탈착될 수 있다. 상기 환원제는 상기 경쇄로부터 상기 중쇄를 분리하고 상기 분리된 중쇄 및 경쇄가 검출 및/또는 정량화되도록 한다. 적합한 환원제는 예를 들어 200mM의 DTT와 같은 당업계에 일반적으로 알려진 것들을 포함한다. 검출되는 상기 중쇄는 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgM일 수 있다. 상기 경쇄는 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 경쇄일 수 있다.
일반적으로 상기 무손상 면역 글로불린, 무손상 경쇄 또는 무손상 중쇄는 질량 분석 전에 특정 시약을 사용하여 단편화되지 않는다. 예를 들어, 상기 면역 글로불린은 일반적으로 질량 분석 전에 특정 프로테아제로 효소적으로 분해되지 않는다.
상기 면역 글로불린은 일반적으로, 예를 들어 질량 분석 전에 친화성 정제에 의해 농축되거나 정제되지 않는다. 예를 들어, 상기 면역 글로불린은 일반적으로 항-IgG, 항-IgA, 항-IgM 항-카파 또는 항-람다 항체와 같은 항-중형 및/또는 경쇄 유형 항체들을 사용하여 면역정제되지 않는다. 일반적으로 상기 면역 글로불린은, 예를 들어 멜론 겔(Melon Gel), 단백질 A(Protein A) 또는 단백질 G(Protein G)로 정제되지 않는다. 일반적으로 상기 면역 글로불린은, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피에 의해 정제되지 않는다.
혈액 또는 조직 샘플이 제공되는 경우, 적혈구 세포 및/또는 백혈구 세포와 같은 세포들은 희석 전에, 예를 들어 원심 분리에 의해, 제거될 수 있다.
상기 샘플은, 예를 들어 혈청, 혈장, 혈액, 소변 및 뇌척수액, 특히 혈액, 혈장 또는 혈청에서 선택될 수 있다. 상기 샘플은 인간 대상체로부터 유래될 수 있다.
상기 샘플은 대상체, 예를 들어 혈장 생산 세포와 관련된 증식성 질환을 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 의심되는 인간 대상체로부터 유래될 수 있다. 이러한 증식성 질환에는 단일 클론 감마병증과 같은 위에서 설명된 질환이 포함된다. 여기에는, 예를 들어 골수종 및 AL 아밀로이드증 및 위에서 설명된 다른 질환들이 포함된다.
상기 샘플은 물 또는 수성 완충액으로 재수화되는 건조 또는 적어도 부분적으로 건조된 샘플일 수 있다. 이는 상기 샘플을 건조된 상태로 보관하거나 의류와 같은 물품에서 대상자의 건조된 샘플을 회수할 수 있다는 의미를 가질 수 있다. 상기 샘플의 추가 가공은 일반적으로 필요하지 않다.
일반적으로 검출 및/또는 정량화된 상기 면역 글로불린은 단일 클론 면역 글로불린, 단일 클론 중쇄 또는 단일 클론 경쇄이다. 첨부된 도면들에 나타난 바와 같이, 단일 클론 면역 글로불린은 배경 다중 클론 항체 생산보다 뚜렷한 피크를 생성한다. 이는 본 발명의 방법에 의해 쉽게 검출 및/또는 정량화될 수 있다. 또는 다중 클론 중쇄, 다중 클론 경쇄 및 다중 클론 무손상 면역 글로불린이 검출되고 정량화될 수 있다.
또는, 카파 및 람다 경쇄의 상대적 양이 정량화되어 람다 경쇄에 대한 카파 경쇄의 비율을 결정할 수 있다.
일반적으로 상기 경쇄는 유리(free) 경쇄이다.
샘플은 항상 그렇지는 않으나, 보통 질량 분석법에 의한 분석 전에 희석된다. 일반적인 희석은 1 : 1,280이나, 질량 분석법에 의한 검출 전에 1 : 50 내지 1 : 5000, 더 일반적으로 1 : 500 내지 1 : 3000 또는 1 : 1000 내지 1 : 2000의 범위일 수 있다.
본 발명은 샘플의 복잡한 추가 정제 기술의 요구없이, 질량 분석법을 사용하여, 예를 들어 단일 클론 면역 글로불린의 존재 또는 부재를 신속하게 검출하는 방법을 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 적합한 방법 및 재료들이 아래에 기재되나, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료들이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참고로 통합된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 또한 재료, 방법 및 예시들은 오직 설명을 위한 것일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.
본 발명의 하나 이상의 구현예들의 세부 사항은 첨부된 도면 및 아래의 설명에서 설명된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면 및 청구 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 1) 5% 아세트산 및 20mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP)를 포함하는 수성 완충액에서 단일 클론 IgA1 카파 표준물(농도 31g/L)을 연속적으로 희석하는 단계; 2) 상기 희석된 샘플을 CHCA 매트릭스와 혼합하는 단계; 3) 상기 샘플을 MALDI-TOF 질량 분석법을 사용하여 분석하는 단계에 의해 얻은 8개의 질량 스펙트럼을 보여준다. 상기 질량 스펙트럼은 단일 클론 카파 경쇄의 +2 전하 상태를 포함하는 10,500 내지 13,000의 m/z 범위를 포함한다. 상기 경쇄는 도 1에 1 대 1,280 희석(1 to 1,280 dilution)으로 표시되어 있으며, 1 대 160, 1 대 320, 1 대 640 및 1 대 2,560 희석에서도 명확하게 관찰된다.
도 2는 5% 아세트산 및 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 IgA1 카파 표준물의 연속 희석으로부터의 +2 전하 상태의 강도의 플롯을 보여준다. 상기 플롯은 단일 클론 카파 경쇄로부터의 신호 강도가 상기 샘플이 1 대 1,280까지 희석될 때까지 증가한 다음 후속 희석에서 감소함을 보여준다. 상기 샘플이 희석됨에 따라 단일 클론 카파 경쇄의 +2 전하 상태부터의 신호가 증가한다는 관찰은 상기 샘플내 총 단백질에 대한 매트릭스의 비율과 관련이 있다.
도 3은 7,000 내지 25,000의 m/z 범위에 걸쳐 도 1의 1 대 1,280 희석의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 단일 클론 카파 경쇄의 +1, +2 및 +3 전하 상태가 혈청 알부민의 +3, +4, +5 및 +6 전하 상태와 함께 도면에 표시되어 있다. 이 도면은 혈청에서 가장 풍부한 단백질인 혈청 알부민의 존재 하에서 단일 클론 경쇄를 관찰하는 능력을 보여준다.
도 4는 5% 아세트산 및 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 1 대 1,280으로 희석된, IgG 카파 M-단백질(농도 4.0 g/L)을 가진 환자 유래 샘플의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 단일 클론 카파 경쇄의 +2 전하 상태 이온이 11,724.196 m/z에서 관찰된다. 혈청 알부민의 +4 전하 상태 이온도 도면에 표시되어 있다.
도 5는 5% 아세트산 및 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 1 대 1,280으로 희석된, IgG 람다 M-단백질(농도 6.0g/L)을 가진 환자 유래 샘플의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 단일 클론 람다 경쇄의 +2 전하 상태 이온은 11,467.0 m/z에서 관찰된다. 혈청 알부민의 +4 전하 상태 이온과 다중 클론 카파 분자량 분포가 도면에 표시되어 있다.
도 6은 5% 아세트산 및 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 1 대 1,280으로 희석된, IgA 카파 M-단백질(농도 37g/L)을 가진 환자 유래 샘플의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 단일 클론 카파 경쇄의 +2 전하 상태 이온은 11,891.836 m/z에서 관찰된다.
도 7은 5% 아세트산과 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 1 대 1,280으로 희석된, 혈청 단백질 전기 영동으로 정량화되지 않은 IgA 람다 M-단백질을 가진 환자 유래 샘플의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 11,139.298 m/z로 표시된 단일 클론 람다 경쇄의 +2 전하 상태 이온이 도면에 표시되어 있다.
도 8은 5% 아세트산과 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 1 대 1,280으로 희석된, IgM 카파 M-단백질(농도 8.0g/L)을 가진 환자 유래 샘플의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 단일 클론 카파 경쇄의 +2 전하 상태 이온은 11,746.744 m/z에서 관찰된다.
도 9는 5% 아세트산 및 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 1 대 1,280으로 희석된, IgM 람다 M-단백질(농도 7.0g/L)을 가진 환자 유래 샘플의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 단일 클론 람다 경쇄의 +2 전하 상태 이온은 11,350.780 m/z에서 관찰된다.
도 10은 각각 물에 1 대 200로 희석된, IgG 카파 M-단백질을 가진 환자(농도 20g/L) (상단 질량 스펙트럼) 및 정상 인간 혈청 (하단 질량 스펙트럼)의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 각 샘플은 산이나 환원제없이 물에 희석되었으므로, 중쇄 및 경쇄가 여전히 이황화 결합으로 연결된 무손상 단일 클론 IgG 카파의 +3 전하 상태가 51,150.933 m/z (상단 질량 스펙트럼)에서 관찰된다. 이 분자량에서 정상 인간 혈청의 질량 스펙트럼(하단 질량 스펙트럼)에는 피크가 없다.
도 11은 각각 물에 1 대 200로 희석된, IgG 카파 M-단백질을 가진 환자(농도 20g/L) (상단 질량 스펙트럼) 및 정상 인간 혈청 (하단 질량 스펙트럼)의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 각 샘플은 산이나 환원제없이 물에 희석 되었으므로, 중쇄와 경쇄가 여전히 이황화 결합으로 연결된 무손상 단일 클론 IgG 카파의 +3 전하 상태가 49,027.884 m/z에서 관찰된다(상단 질량 스펙트럼). 이 분자량에서 정상 인간 혈청의 질량 스펙트럼(하단 질량 스펙트럼)에는 피크가 없다.
도 12는 단일 하전(+1) 피크(도 12A) 및 이중 하전 피크(도 12B)를 포함하는, 건강한 혈액 및 10 g/L IgG 카파 골수종이 첨가된 혈액의 재구성된 건조 샘플들을 보여준다.
도 2는 5% 아세트산 및 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 IgA1 카파 표준물의 연속 희석으로부터의 +2 전하 상태의 강도의 플롯을 보여준다. 상기 플롯은 단일 클론 카파 경쇄로부터의 신호 강도가 상기 샘플이 1 대 1,280까지 희석될 때까지 증가한 다음 후속 희석에서 감소함을 보여준다. 상기 샘플이 희석됨에 따라 단일 클론 카파 경쇄의 +2 전하 상태부터의 신호가 증가한다는 관찰은 상기 샘플내 총 단백질에 대한 매트릭스의 비율과 관련이 있다.
도 3은 7,000 내지 25,000의 m/z 범위에 걸쳐 도 1의 1 대 1,280 희석의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 단일 클론 카파 경쇄의 +1, +2 및 +3 전하 상태가 혈청 알부민의 +3, +4, +5 및 +6 전하 상태와 함께 도면에 표시되어 있다. 이 도면은 혈청에서 가장 풍부한 단백질인 혈청 알부민의 존재 하에서 단일 클론 경쇄를 관찰하는 능력을 보여준다.
도 4는 5% 아세트산 및 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 1 대 1,280으로 희석된, IgG 카파 M-단백질(농도 4.0 g/L)을 가진 환자 유래 샘플의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 단일 클론 카파 경쇄의 +2 전하 상태 이온이 11,724.196 m/z에서 관찰된다. 혈청 알부민의 +4 전하 상태 이온도 도면에 표시되어 있다.
도 5는 5% 아세트산 및 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 1 대 1,280으로 희석된, IgG 람다 M-단백질(농도 6.0g/L)을 가진 환자 유래 샘플의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 단일 클론 람다 경쇄의 +2 전하 상태 이온은 11,467.0 m/z에서 관찰된다. 혈청 알부민의 +4 전하 상태 이온과 다중 클론 카파 분자량 분포가 도면에 표시되어 있다.
도 6은 5% 아세트산 및 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 1 대 1,280으로 희석된, IgA 카파 M-단백질(농도 37g/L)을 가진 환자 유래 샘플의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 단일 클론 카파 경쇄의 +2 전하 상태 이온은 11,891.836 m/z에서 관찰된다.
도 7은 5% 아세트산과 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 1 대 1,280으로 희석된, 혈청 단백질 전기 영동으로 정량화되지 않은 IgA 람다 M-단백질을 가진 환자 유래 샘플의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 11,139.298 m/z로 표시된 단일 클론 람다 경쇄의 +2 전하 상태 이온이 도면에 표시되어 있다.
도 8은 5% 아세트산과 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 1 대 1,280으로 희석된, IgM 카파 M-단백질(농도 8.0g/L)을 가진 환자 유래 샘플의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 단일 클론 카파 경쇄의 +2 전하 상태 이온은 11,746.744 m/z에서 관찰된다.
도 9는 5% 아세트산 및 20mM TCEP를 포함하는 수성 완충액에서 1 대 1,280으로 희석된, IgM 람다 M-단백질(농도 7.0g/L)을 가진 환자 유래 샘플의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 단일 클론 람다 경쇄의 +2 전하 상태 이온은 11,350.780 m/z에서 관찰된다.
도 10은 각각 물에 1 대 200로 희석된, IgG 카파 M-단백질을 가진 환자(농도 20g/L) (상단 질량 스펙트럼) 및 정상 인간 혈청 (하단 질량 스펙트럼)의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 각 샘플은 산이나 환원제없이 물에 희석되었으므로, 중쇄 및 경쇄가 여전히 이황화 결합으로 연결된 무손상 단일 클론 IgG 카파의 +3 전하 상태가 51,150.933 m/z (상단 질량 스펙트럼)에서 관찰된다. 이 분자량에서 정상 인간 혈청의 질량 스펙트럼(하단 질량 스펙트럼)에는 피크가 없다.
도 11은 각각 물에 1 대 200로 희석된, IgG 카파 M-단백질을 가진 환자(농도 20g/L) (상단 질량 스펙트럼) 및 정상 인간 혈청 (하단 질량 스펙트럼)의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 보여준다. 각 샘플은 산이나 환원제없이 물에 희석 되었으므로, 중쇄와 경쇄가 여전히 이황화 결합으로 연결된 무손상 단일 클론 IgG 카파의 +3 전하 상태가 49,027.884 m/z에서 관찰된다(상단 질량 스펙트럼). 이 분자량에서 정상 인간 혈청의 질량 스펙트럼(하단 질량 스펙트럼)에는 피크가 없다.
도 12는 단일 하전(+1) 피크(도 12A) 및 이중 하전 피크(도 12B)를 포함하는, 건강한 혈액 및 10 g/L IgG 카파 골수종이 첨가된 혈액의 재구성된 건조 샘플들을 보여준다.
샘플 및 샘플 제조
본 명세서에 기재된 바와 같은 단일 클론 면역 글로불린 또는 다중 클론 면역 글로불린을 식별하고 정량화하기 위한 재료 및 방법들은 임의의 적절한 샘플을 포함할 수 있다. 샘플은 조직(예: 지방, 간, 신장, 심장, 근육, 뼈 또는 피부 조직) 또는 생물학적 유체(예: 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 누액 또는 타액)와 같은 임의의 생물학적 샘플일 수 있다. 상기 샘플은 면역 글로불린을 갖는 환자로부터 유래될 수 있고, 포유동물, 예를 들어 인간, 개, 고양이, 영장류, 설치류, 돼지, 양, 소, 말, 새, 파충류 또는 물고기를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 샘플은 또한 알려진 조성물의 혼합물이나 대조 샘플과 같은 인공 시료일 수 있다. 일부 경우들에는 상기 샘플이 인간 환자의 혈청이다.
질량 분석 방법
본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 클론 면역 글로불린 또는 다중 클론 면역 글로불린을 식별하고 정량화하기 위한 재료 및 방법들은 임의의 적절한 질량 분석법(mass spectrometry, MS) 기술을 포함할 수 있다. 일부 경우들에는 매트릭스 보조 레이저 흡착 이온화 (matrix assisted laser adsorption ionization, MALDI) 비행 시간 (Time-of-Flight, TOF) MS가 샘플의 질량 스펙트럼을 분석하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 청구항들에 기술된 본 발명의 범위를 제한하지 않는, 하기 실시 예들에서 추가로 기술될 것이다.
실시예들
실시예 1: 산과 환원제를 포함하는 수성 완충액에 혈청 샘플을 희석한 다음 MALDI-TOF MS를 사용하여 샘플을 분석
단일 클론 및/또는 다중 클론 경쇄는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 - 비행 시간 (MALDI-TOF) 질량 분석법을 사용하여 샘플에서 식별 및/또는 정량화될 수 있으며, 먼저 면역 글로불린(들)을 포함하는 상기 샘플을 산 및 환원제를 포함하는 수성 완충액으로 희석한 다음 상기 샘플을 알파-시아노-4-하이드록시신나믹산 매트릭스 (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix, CHCA)와 같은 MALDI 매트릭스와 혼합함으로써 식별 및/또는 정량화될 수 있다.
실시예 2: 혈청 샘플을 물에 희석한 다음 MALDI-TOF MS를 사용하여 상기 샘플을 분석
무손상 단일 클론 면역 글로불린 및/또는 무손상 다중 클론 면역 글로불린은 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 - 비행 시간(MALDI-TOF) 질량 분석법을 사용하여 샘플에서 식별 및/또는 정량화될 수 있으며, 먼저 상기 면역 글로불린(들)을 포함하는 상기 샘플을 물로 희석한 다음 상기 샘플을 알파-시아노-4-하이드록시신나믹산 매트릭스(CHCA)와 같은 MALDI 매트릭스와 혼합함으로써 식별 및/또는 정량화될 수 있다.
실시예 3 : 건조된 전혈반(whole blood spot) 분석
방법들.
손가락 채혈로부터 채취한 신선한 모세 혈액이 골수종 IgG 카파 파라단백질의 존재 또는 존재없이 탈이온수와 1+1로 혼합되었다. 10μl가 3MM 여과지(Whatman)에 스팟팅되고 15분 동안 공기-건조되었다. 상기 혈반을 포함하는 여과지는 최대 3일 동안 -80℃에서 보관되었다.
추출 전 상기 건조된 혈반을 냉동고에서 꺼내 주변 온도까지 예열시켰다. 상기 건조된 혈반을 여과지에서 잘라내어 조심스럽게 1.5ml 에펜도르프 튜브에 넣은 다음 100μl 환원-용리 완충액 (20mM TCEP를 포함하는 5% 아세트산)으로 30분 동안 추출했다. 상기 추출된 액체 물질은 원심 펄스(centrifugal pulse) 후 제거되었다. 상기 추출물의 스팟팅(spotting)은 반(semi) 습식 샌드위치법을 사용하여 MALDI 스틸 타겟 플레이트에 자동 액체 처리 시스템 (Mosquito)을 사용하여 수행되었다. 매트릭스 용액인 α-시아노-4-하이드록시신나믹산(CHCA, 10mg/ml) 1μl을 먼저 적용하고 건조시켰다. 그 다음, 상기 추출된 샘플 1μl에 이어 (CHCA) 1μl를 함께 적용하고 15분 동안 건조시켰다. 질량 스펙트럼은 5000 내지 32,000 Da의 m/z 범위를 포함하는 양이온 모드의 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석 (MALDI-TOF-MS) 시스템에서 얻었다.
결과.
건강한 전혈 스펙트럼은 베타 사슬에서 발생하는 단일 하전(+1, 15870 m/z) 및 이중 하전(+2, m/z 7940) 이온을 포함하는 헤모글로빈에 대한 강력한 신호를 보여주었다(도 12A). 상기 혈액에 10g/L의 IgGK 파라단백질이 보충되었을 때, 카파 경쇄에서 발생하는 추가 신호들이 단일 하전(+1, m/z 22508) 및 이중 하전 (+2, m/z 11261) 이온을 포함하여 관찰되었다(도 12 A 및 B).
결론.
건조된 전혈반들은 샘플 처리 또는 농축에 대한 요구없이 MALDI-TOF MS를 사용하여 획득, 용출 및 분석될 수 있다.
다른 구체 예들
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 전술한 기재는 첨부된 청구항들의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것이며 제한하지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 다른 측면들에서, 장점 및 변형들은 다음의 청구항들의 범위 내에 있다.
Claims (15)
- (i) 대상체로부터 면역글로불린을 포함하는 혈액, 혈청, 혈장 또는 뇌척수액의 샘플을 제공하는 단계;
(ii) 상기 샘플을 물 또는 수성 완충액으로 희석하여 희석된 샘플을 형성하는 단계; 및
(iii) 상기 희석된 샘플을 이온화하고, 질량 분석법에 의해 무손상(intact) 면역 글로불린 또는 상기 면역 글로불린의 경쇄 또는 중쇄를 검출하거나, 검출 및 정량화하는 단계;
를 포함하는, 샘플에서 단일 클론 및 다중 클론 면역글로불린 중 적어도 하나를 식별화, 정량화, 또는 식별화 및 정량화하기 위한 방법. - 제1항에 있어서, 상기 샘플은 적어도 부분적으로 건조되고 물 또는 수성 완충액으로 재수화(rehydrate)되는 것인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역 글로불린은 질량 분석법에 의해 상기 무손상 면역글로불린 또는 경쇄 또는 중쇄를 검출하거나 검출 및 정량화하기 전에 농축되지 않는 것인, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린은 친화성 정제 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 농축되지 않는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분석법은 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화-질량분석법(liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry, LC-ESI-MS)인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희석된 샘플은 이온화되기 전에 매트릭스와 혼합되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플을 환원제로 처리하여, 질량 분석법에 의한 분리된 중쇄 또는 경쇄의 검출, 정량화, 또는 검출 및 정량화전에 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄를 분리하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄는 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 경쇄인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 또는 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분석법은 매트릭스 보조 레이저 탈착 비행 시간(matrix assisted laser desorption time-of-flight, MALDI-TOF) 질량 분석법인, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무손상 면역 글로불린, 경쇄 또는 중쇄는 질량 분석전에 단편화되지 않은 것인, 방법.
- 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매트릭스는 MALDI 매트릭스인, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 혈장 생산 세포와 관련된 증식성 질환을 앓고 있거나 앓는 것으로 의심되는 대상체로부터 유래된 것인, 방법.
- 제12항에 있어서, 검출, 정량화. 또는 검출 및 정량화된 면역글로불린은 단일 클론 면역글로불린, 단일 클론 중쇄 또는 단일 클론 경쇄인, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 질량 분석법에 의한 검출 전에 1:50 내지 1:5000으로 희석되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법의 사용을 포함하는, 혈장 생산 세포와 관련된 증식성 질환을 진단 또는 예후하는 방법.
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Barnidge D.R. et al (J. Neuroimmunology (2015), 285, 123-126) |
| Hortin G.L. 및 Remaley A.T. (Clin. Geonomics (2006) 103-114) |
| Mills et al(Clin. Chem. (2016) 62 (10) 1334-1344) |
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