KR20200145926A

KR20200145926A - 패션 후르츠 추출물을 포함하는 화장료 또는 식품첨가 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20200145926A
Application number: KR1020190073639A
Authority: KR
Inventors: 조자용; 김영자
Original assignee: 조자용; 김영자
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2020-12-31
Also published as: KR102350617B1

Abstract

본 발명은 패션 후르츠의 잎(leaf), 꽃(flower) 또는 과실(fruits)을 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol), 노말부탄올(n-buthanol) 또는 증류수(water)를 용매로 추출하여 얻어진 패션 후르츠 추출물 중 어느 1종 이상을 포함하여 항산화, 항균, 항염 및 피부미백 효능을 갖는 화장료 또는 식품첨가 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 식품첨가물 또는 화장품에 요구되는 기능에 따라 다양한 패션 후르츠 추출물을 혼합하여 포함할 수 있으며, 식품첨가물 또는 화장품에 요구되는 기능을 세분화하여 특정 효능에 집중된 패션 후르츠 추출물의 조성을 제공할 수 있다.

Description

패션 후르츠 추출물을 포함하는 화장료 또는 식품첨가 조성물 및 이의 제조방법{Cosmetic or food additive composition containing a passion fruits extract and a process for producing the same}

본 발명은 패션 후르츠 추출물을 포함하는 화장료 또는 식품첨가 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 패션 후르츠 추출물을 포함하여 천연 항산화제, 항균제, 항염제 및 피부미백제로 사용 가능한 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

여기서는, 본 개시에 관한 배경기술이 제공되며, 이들이 반드시 공지기술을 의미하는 것은 아니다.

패션 후르츠(passion fruits)는 브라질이 원산지이며 아열대와 열대지역에서 재배되고 있는 다년생 상록덩굴 식물로 시계꽃과(Passifloraceae) 시계꽃속(Passiflora)에 속하고 전 세계적으로 500여 종이 분포하고 그 중 10 여종은 식용, 나머지는 관상용으로 이용되고 있다. 주요 품종으로는 '루비 스타(Rubi star)', '레드 퍼플(Red purple)', '뉴 블랙(New black)', '피치(Peach)', '랙 뷰티(Lack beauty)' 등이 대표적이다. 식용부위는 과일로 탁구공처럼 생겼으며 무게는 40-70 g 이고 풍미와 향기가 좋아 생식하거나 음료수, 가공품, 향수 등을 만들 때 즐겨 사용된다.

한편, 전 세계적으로 체내 병해 예방을 위한 관심이 급증하고 있는 추세이다. 질병 예방을 위한 자유 라디칼(free radicals)과 산화방지제(antioxidants)의 역할이 특별한 주목을 받고 있다.

활성산소(reactive oxygen species, ROS)와 nitric oxide, NO* 등의 활성질소(reactive nitrogen species, RNS)는 인체에 매우 해롭다. 이러한 활성산소와 활성질소는 NO synthase (NOS)와 NAD(P)H oxidase isoforms 등의 조절효소에 의하여 발생한다. Mitochondrial electron-transport chain 또는 과도한 NAD(P)H의 자극으로 인한 산화적 스트레스(oxidative stress)가 지질(lipids), 막(membranes), 단백질(proteins), DNA 등에 피해를 초래한다.

특히, free radicals 때문에 지질(lipids)은 지질 과산화(lipid peroxidation)로 인체에 피해를 받고, 단백질은 효소 활성(enzyme activity)의 손실이 발생되며, DNA는 돌연변이 생성(mutagenesis)과 발암(carcinogenesis) 등으로 변한다.

체내의 활성산소 소거 능력과 면역력은 한계가 있기 때문에 항산화 성분이 함유된 식품의 섭취를 통해 체내 활성산소를 제거하는 것이 필요하다. 이러한 필요성 때문에 인체 질환의 치료와 예방을 위하여 항산화 성분을 함유하는 천연 물질에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

1. 한국등록특허 10-1836171(2018.03.02.)

본 발명은 패션 후르츠 추출물을 포함하여 항산화, 항균, 항염 및 피부미백 효능을 갖는 화장료 또는 식품첨가 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명의 목적들은 상기에 언급된 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 명세서에 사용되는 모든 기술용어 및 과학용어는 다른 언급이 없는 한은 기술적으로 통상의 기술을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 또한 본 명세서 및 청구범위의 전반에 걸쳐, 다른 언급이 없는 한 포함(comprise, comprises, comprising)이라는 용어는 언급된 물건, 단계 또는 일군의 물건, 및 단계를 포함하는 것을 의미하고, 임의의 어떤 다른 물건, 단계 또는 일군의 물건 또는 일군의 단계를 배제하는 의미로 사용된 것은 아니다.

본 발명에 따른 패션 후르츠 추출물을 포함하는 화장료 또는 식품첨가 조성물은 항산화, 항균, 항염 효과 및 멜라닌 생성 억제를 통한 피부 미백 효과를 나타낸다. 더욱 구체적으로는 패션 후르츠의 잎(leaf), 꽃(flower) 또는 과실(fruits)을 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol), 노말부탄올(n-buthanol) 또는 증류수(water)를 용매로 추출하여 얻어진 패션 후르츠 추출물 중 어느 1종 이상을 포함한다.

상기 패션 후르츠 추출물은 패션 후르츠 잎의 에탄올 추출물, 패션 후르츠 잎의 메탄올 추출물, 패션 후르츠 잎의 노말부탄올 추출물, 패션 후르츠 잎의 증류수 추출물, 패션 후르츠 꽃의 에탄올 추출물, 패션 후르츠 꽃의 메탄올 추출물, 패션 후르츠 꽃의 노말부탄올 추출물, 패션 후르츠 꽃의 증류수 추출물, 패션 후르츠 과실의 에탄올 추출물, 패션 후르츠 과실의 메탄올 추출물, 패션 후르츠 과실의 노말부탄올 추출물 및 패션 후르츠 과실의 증류수 추출물로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 1종 이상을 포함한다.

바람직하게는 상기 패션 후르츠 추출물은 패션 후르츠 잎의 에탄올 추출물, 패션 후르츠 과실의 메탄올 추출물, 패션 후르츠 과실의 노말부탄올 추출물, 과실의 에탄올 추출물, 꽃의 메탄올 추출물 및 잎의 증류수 추출물로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 1종 이상을 포함하는 것이 항산화, 항균, 항염 및 미백 효과를 동시에 향상시킬 수 있어 좋다.

본 발명은 식품첨가물 또는 화장품에 요구되는 기능에 따라 다양한 패션 후르츠 추출물을 혼합하여 포함할 수 있다.

예를 들어, 항산화 효과를 더욱 향상시키기 위하여 패션 후르츠 추출물 중 패션 후르츠 잎의 메탄올 추출물, 패션 후르츠 꽃의 메탄올 추출물, 패션 후르츠 과실의 노말부탄올 추출물 및 패션 후르츠 과실의 증류수 추출물을 혼합한 패션 후르츠 추출물을 포함하는 것이 좋다. 이 때 잎의 메탄올 추출물을 가장 다량(50 wt% 이상)으로 포함하는 것이 좋다.

본 발명은 식품첨가물 또는 화장품에 요구되는 기능을 세분화하여 특정 효능에 집중된 조성물을 제공하고자 하는 경우 패션 후르츠 추출물의 조성을 변화시킬 수 있다. 먼저, 폴리페놀의 함량을 증가시키고자 하는 경우 잎의 메탄올 추출물, 잎의 증류수 추출물 및 꽃의 메탄올 추출물로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함하고, 플라보노이드 함량을 증가시키고자 하는 경우 잎의 메탄올 추출물, 꽃의 메탄올 추출물 및 잎의 노말부탄올 추출물로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함하고, DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거활성을 향상시키고자 하는 경우 잎의 메탄올 추출물, 잎의 노말부탄올 추출물 및 잎의 에탄올 추출물로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함하고, ABTS(2,2′-azinobis <3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid> diammonium salt) 라디칼 소거활성을 향상시키고자 하는 경우 꽃의 메탄올 추출물, 잎의 메탄올 추출물 및 꽃의 노말부탄올 추출물로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함하고, 아질산염 소거활성을 향상시키고자 하는 경우 과실의 노말부탄올 추출물, 과실의 에탄올 추출물 및 과실의 메탄올 추출물로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함하고, SOD(Super oxide dismutase) 활성을 향상시키고자 하는 경우 과실의 증류수 추출물, 과실의 노말부탄올 추출물 및 잎의 노말부탄올 추출물로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함하고, CAT(Catalase) 활성을 향상시키고자 하는 경우 과실의 메탄올 추출물, 잎의 증류수 추출물 및 꽃의 증류수 추출물로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함하고, APX(Ascorbate peroxidase) 활성을 향상시키고자 하는 경우 과실의 증류수 추출물, 꽃의 증류수 추출물 및 꽃의 메탄올 추출물로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함하고, POD(Peroxidase) 활성을 향상시키고자 하는 경우 잎의 노말부탄올 추출물, 과실의 노말부탄올 추출물 및 과실의 증류수 추출물로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함한다.

또한 과실의 에탄올 추출물, 과실의 메탄올 추출물 및 과실의 노말부탄올 추출물을 혼합한 패션 후르츠 추출물을 포함하는 경우 식품첨가물 또는 화장품의 항균 효과 및 미백 효과가 뛰어난 효과가 있다. 더욱 구체적으로 항균 효과를 더욱 향상시키기 위하여는 과실의 에탄올 추출물(50~70 wt%) > 과실의 메탄올 추출물(20~30 wt%) > 과실의 노말부탄올 추출물(10~20 wt%) 순서로 다량 혼합한 패션 후르츠 추출물을 포함하는 것이 좋고, 미백 효과를 더욱 향상시키기 위하여는 과실의 메탄올 추출물(50~70 wt%) > 과실의 노말부탄올 추출물(20~30 wt%) > 과실의 에탄올 추출물(10~20 wt%) 순서로 다량 혼합한 패션 후르츠 추출물을 포함하는 것이 좋다.

상기 패션 후르츠 추출물은 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)) 나노입자 내에 유효 성분으로 포함되어 화장품 또는 식품 첨가 조성물에 포함될 수 있다. PLGA는 Poly(lactic acid)(PLA)와 Poly(glycolic acid)(PGA) 단량체를 중합시켜서 얻어지는 공중합체 고분자로서 독성이 없으며 생분해되면서 내부에 담지된 추출물을 방출시킬 수 있다.

본 발명에 따른 패션 후르츠 추출물을 포함하는 PLGA 나노입자는 평균 직경이 200 내지 300nm 의 크기를 가지며, PLA(poly(lactic acid)):PGA(poly(glycolic acid)) 의 몰비가 3:2 내지 4:1 인 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)) 고분자로 형성된 것을 일 특징으로 한다. 이로써 PLGA 나노입자 내부에 담지된 패션 후르츠 추출물이 점진적으로 방출될 수 있다.

더욱 바람직하게는 패션 후르츠 추출물을 포함하는 PLGA 코어 및 상기 PLGA 코어 표면에 패션 후르츠 추출물을 포함하는 PLGA 쉘을 포함하는 형태로서 단계적이고 집약적인 방출 효과를 제공할 수 있다. 이 때, PLGA 코어에 포함되는 패션 후르츠 추출물과 PLGA 쉘에 포함되는 패션 후르츠 추출물은 상이한 성분(부위 및 추출 용매)을 적어도 1종 이상 포함하는 것이 좋다.

또한 PLGA 코어 및 PLGA 쉘의 PLA 및 PGA 단량체 비율을 조절하여 생분해 시간을 조절함으로써 시간에 따라 우수하게 작용하는 효과를 달리할 수 있다. 더욱 구체적으로 코어를 구성하는 PLGA 고분자는 PLA 보다 PGA의 함량이 낮은 공중합체로 구성하고, 쉘을 구성하는 PLGA 고분자는 PLA 보다 PGA의 함량이 높은 공중합체로 구성함으로써 쉘의 분해속도는 상대적으로 빠르고 코어의 분해속도는 상대적으로 느리게 조절한다. 이로써 쉘에 포함된 유효 성분이 충분히 작용한 후에 코어에 포함된 유효 성분이 작용할 수 있도록 한다.

본 발명에 따른 패션 후르츠 추출물이 담지된 PLGA 나노입자는 패션 후르츠 추출물을 함유한 수용액을 PLGA가 함유되어 있는 유기용액에 분산시켜서 1차 에멀젼을 형성한 다음 이를 2차 수상에 분산시킨 후 유기용매를 증발시켜 입자를 제조한다. 이 방법은 유기용매상의 고분자가 수상에 분산된 이후 유기용매가 추출 또는 증발 등의 과정을 통해 고분자의 용해도가 감소됨에 따라 고형화되어 입자가 형성되는 원리이다.

발명의 일실시예에 따른 패션 후르츠 추출물을 포함하는 화장품은 스킨 및 바디 케어 화장품으로서 에센스, 앰플, 비누, 토닉 및 바디 에센스, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 분말 등의 다양한 제형일 수 있고, 상기 패션 후르츠 추출물은 전체 화장품 조성물에 대하여 0.05 내지 100 wt%로 포함되고, 앰플 제형의 경우 상기 패션 후르츠 추출물 100%로 이루어진 것일 수 있다.

화장품은 패션 후르츠 추출물 이외에 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체로서는 알콜, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 방부제, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료, 희석제 등이 예시될 수 있다.

상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 방부제, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료, 희석제 등으로 사용될 수 있는 구체적인 화합물 또는 조성물은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 화합물 또는 조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

여기서 몇 가지를 예시하여 보면, 알콜로서는 고급 알콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 다가 알콜 등을 들 수 있고, 오일로서는 아보가드유, 팜유, 우지, 호호바유 등을 들 수 있고, 방부제로서는 에틸파라벤, 부틸파라벤 등을 들 수 있으며, 보습제로서는 히알론산, 황산콘드로이친(chondroitin sulfate), 피롤리돈카복실산염 등을 들 수 있으며, 희석제로서는 에탄올, 이소프로판올 등을 들 수 있다.

더욱 구체적으로 화장품의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

또한 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산에스테르가 있다.

또한 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다

또한 본 발명의 일실시예에 따른 패션 후르츠 추출물을 포함하는 비누의 경우, 비누 기재에 패션 후르츠 추출물을 포함하여 제조될 수 있으며, 첨가제로서 피부 보습제, 유화제, 경수 연화제 등을 포함하여 제조될 수 있다.

상기 비누 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유, 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등이 사용될 수 있고, 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜, 이소프로필미리스테이트, 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 비누 조성물은 또한 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속이온 봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

발명의 일실시예에 따른 패션 후르츠 추출물을 포함하는 식품은 패션 후르츠 추출물을 추출용제로 포함하는 식품첨가물이나 패션 후르츠 추출물을 기능성 원료로서 포함하는 건강기능식품을 포함한다.

본 발명에 따른 화장료 또는 식품첨가 조성물에 포함되는 패션 후르츠 추출물의 제조방법은 패션 후르츠 건조시료를 얻는 단계, 건조시료에 용매를 첨가하고 마쇄한 후 교반 침출시켜 추출하고 여과하여 추출여액을 얻는 단계 및 추출여액을 수욕 상에서 감압 농축하여 패션 후르츠 추출물을 얻는 단계를 포함한다.

상기 건조시료를 얻는 단계는 패션 후르츠를 증류수를 이용하여 깨끗이 수세한 후 잎(leaf), 꽃(flower) 및 과실(fruits) 등 부위별로 분리한 다음, -50˚C 이하의 동결건조기에서 각각 건조 후 분쇄기로 마쇄하여 건조시료를 얻는다. 건조시료 준비 후 추출단계를 진행하기 이전에 보관이 필요한 경우 ??70˚C 이하 초저온 냉동고에 보관한다.

상기 추출여액을 얻는 단계는 패션 후르츠 건조시료 10g 당 용매 80 내지 120mL을 첨가하고 호모게나이저(homogenizer)를 이용하여 마쇄한 후, 상온(20±5℃)에서 20 내지 30 시간 동안 교반 침출시켜 추출하고 여과한다.

상기 추출물을 얻는 단계는 40 내지 60℃ 의 수욕 상(물중탕)에서 감압(15mmHg 이하) 농축(진공 증발)하여 농축된 추출물을 얻는다.

본 발명은 패션 후르츠의 부위별, 추출 용매별 추출물을 포함하여 항산화, 항균, 항염 및 피부미백 효능을 갖는 화장료 또는 식품첨가 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 식품첨가물 또는 화장품에 요구되는 기능에 따라 다양한 패션 후르츠 추출물을 혼합하여 포함할 수 있으며, 식품첨가물 또는 화장품에 요구되는 기능을 세분화하여 특정 효능에 집중된 패션 후르츠 추출물의 조성을 제공한다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 이용된 패션 후르츠의 채취 과정을 나타낸 것이다.

이하에 본 발명을 상세하게 설명하기에 앞서, 본 명세서에 사용된 용어는 특정의 실시예를 기술하기 위한 것일 뿐 첨부하는 특허청구의 범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아님을 이해하여야 한다.

한편, 본 발명의 여러 가지 실시예들은 명확한 반대의 지적이 없는 한 그 외의 어떤 다른 실시예들과 결합될 수 있다. 특히 바람직하거나 유리하다고 지시하는 어떤 특징도 바람직하거나 유리하다고 지시한 그 외의 어떤 특징 및 특징들과 결합될 수 있다. 이하, 본 발명의 실시예 및 이에 따른 효과를 설명하기로 한다.

<실시예>

1) 재료식물 및 시약

실시예에 사용된 패션 후르츠(Passiflora edulis Sims)는 전남 순천시 외서면 월암리 596-1번지, "선경을 농부이야기" 농가의 400평형 남북동 플라스틱 온실에서 5-30℃의 온도로 4년간 재배하였고, 패션 후르츠의 과실은 2018년 3월 초순경에 채취하였다.(도 1 참고) 증류수를 이용하여 깨끗이 수세하고 정선한 후 잎(leaf), 꽃(flower) 및 과실(fruits) 등 3부위로 분리한 다음, -50˚C 이하의 동결건조기(Ilshin, Korea)에서 건조 후 분쇄기로 마쇄하여 건조시료를 제조하였으며, -70˚C 이하 초저온 냉동고(Operon, Korea)에 보관하면서 제조 및 실험에 사용하였다. 추출 용매인 ethanol, methanol 및 n-buthanol은 J.T.Baker 사(NJ, USA) 시약을 사용하였다.

2) 추출 용매별 제조

(1) Ethanol extracts

각각의 시료 10 g에 ethanol 100 mL을 첨가하여 homogenizer로 마쇄한 다음, 상온에서 24시간 동안 교반 침출시켜 추출한 후 여과 (Whatman No. 2)하였다. 이 추출여액을 rotary vacuum evaporator (Bㆌchi RE 121, Switzerland)로 50℃ 수욕 상에서 감압 농축 후 ethanol 5 mL로 정용하여 냉장실 (4℃)에 보관하면서 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.

(2) Methanol extracts

각각의 시료 10 g에 methanol 100 mL을 첨가하여 homogenizer로 마쇄한 다음, 상온에서 24시간 동안 교반 침출시켜 추출한 후 여과 (Whatman No. 2) 하였다. 이 추출여액을 rotary vacuum evaporator (Bㆌchi RE 121, Meierseggstrasse 40, Postfach, 9230 Flawil, Switzerland)로 50℃ 수욕 상에서 감압 농축 후 methanol 5 mL로 정용하여 냉장실 (4℃)에 보관하면서 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.

(3) n-buthanol extracts

각각의 시료 10 g에 n-buthanol 100 mL을 첨가하여 homogenizer로 마쇄한 다음, 상온에서 24시간 동안 교반 침출시켜 추출한 후 여과 (Whatman No. 2) 하였다. 이 추출여액을 rotary vacuum evaporator (Bㆌchi RE 121, Meierseggstrasse 40, Postfach, 9230 Flawil, Switzerland)로 50℃ 수욕 상에서 감압 농축 후 n-buthanol 5 mL로 정용하여 냉장실 (4℃)에 보관하면서 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.

(4) Water extracts

각각의 시료 10 g에 증류수 100 mL을 첨가하여 homogenizer로 마쇄한 다음, 상온에서 24시간 동안 교반 침출시켜 추출한 후 여과 (Whatman No. 2) 하였다. 이 추출여액을 rotary vacuum evaporator (Bㆌchi RE 121, Meierseggstrasse 40, Postfach, 9230 Flawil, Switzerland)로 50℃ 수욕 상에서 감압 농축 후 증류수 5 mL로 정용하여 냉장실 (4℃)에 보관하면서 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.

	패션후르츠 부위	추출 용매
실시예 1	잎	EtOH
실시예 2	잎	MtOH
실시예 3	잎	n-BuOH
실시예 4	잎	Water
실시예 5	꽃	EtOH
실시예 6	꽃	MtOH
실시예 7	꽃	n-BuOH
실시예 8	꽃	Water
실시예 9	과실	EtOH
실시예 10	과실	MtOH
실시예 11	과실	n-BuOH
실시예 12	과실	Water

<실험예>

(1) 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 측정

1) 총 폴리페놀 함량 측정

패션 후르츠의 부위별 추출물은 메탄올을 이용하여 일정 농도로 녹이고, 0.25 mL씩 test tube에 취한 후, 여기에 10배 희석한 Folin & Ciocalteu's phenol reagent (Sigma, USA) 0.5 mL을 각각 혼합하여, 상온에서 5분간 방치하였다. 7.5% sodium carbonate (Na₂CO₃) 0.5 mL을 혼합하여 30˚C에서 90분간 방치한 후, spectrophotometer(Epoch. Biotek., VT 05404, Winooski, Vermont, US.)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질 chlorogenic acid (Sigma, USA)를 이용하여 총 폴리페놀 함량을 구하기 위한 검량선을 작성하고, 패션 후르츠의 부위별 총 폴리페놀 함량을 정량하여 하기 표 2에 나타내었다.

2) 총 플라보노이드 함량 측정

패션 후르츠의 부위별 추출물을 1 mg/mL의 농도로 80% methanol에 용해한 다음 diethylene glycol 10 mL, 1N-NaOH 0.1 mL을 가한 후, 37˚C incubator에서 1시간 반응시키고, 420 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로는 naringin (Sigma, USA)을 사용하였다. 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

	Total polyphenol contents (mg/g extract)	Total flavonoid contents (mg/g extract)
실시예 1	349.14±10.52	270.23±1.64
실시예 2	624.29±17.05	513.75±5.47
실시예 3	365.14±2.36	290.22±1.62
실시예 4	559.70±6.33	272.50±2.56
실시예 5	302.12±8.32	147.43±2.63
실시예 6	536.38±6.14	462.84±6.18
실시예 7	318.17±3.63	182.16±2.63
실시예 8	511.27±4.83	179.30±5.12
실시예 9	271.95±2.82	64.33±2.45
실시예 10	261.55±5.71	70.52±0.23
실시예 11	258.55±6.27	53.59±049
실시예 12	255.55±2.43	50.19±0.98

총 폴리페놀 함량은 잎의 메탄올 추출물, 잎의 증류수 추출물, 꽃의 메탄올 추출물 순서로 높게 나타났다.

패션 후르츠의 식물체 부위별 총 폴리페놀 화합물 함량은 메탄올 엽 추출물에서 가장 높았으며, 엽의 추출방법별 총 폴리페놀 화합물의 함량은 메탄올 추출 > 열수 추출 > 부탄올 추출 > 에탄올 추출 순이었다. 패션 후르츠 꽃의 추출방법별 총 폴리페놀 화합물의 함량은 메탄올 추출에서, 과실은 에탄올 추출물에서 가장 많았다.

총 플라보노이드 함량은 잎의 메탄올 추출물, 꽃의 메탄올 추출물, 잎의 노말부탄올 추출물 순서로 높게 나타났다.

패션 후르츠 엽의 추출방법별 총 플라보노이드 함량은 메탄올 추출 > 부탄올 추출 열수와 에탄올 추출로 가장 낮았다. 패션 후르츠 꽃의 추출방법별 총 플라보노이드 함량은 메탄올 추출에서 월등하게 우수하였으며, 부탄올 추출, 열수 추출, 에탄올 추출 순이었다. 패션 후르츠 과실의 추출방법별 총 플라보노이드 함량은 메탄올 추출이 가장 높았고, 열수 추출이 가장 낮았다.

전반적으로 패션 후르츠의 식물체 기관 중에서는 엽에서 총 폴리페놀 화합물과 총 플라보노이드 함량이 가장 높았으며, 추출 방법으로는 메탄올로 추출한 경우가 총 폴리페놀 화합물과 총 플라보노이드 함량이 가장 높은 것으로 측정되었다.

2) 항산화 활성능력 측정

(1) DPPH radical 소거활성 측정

패션 후르츠의 부위별 시료는 Blois 방법을 일부 변경하여 DPPH radical 소거활성을 측정하였다. 즉, 칭량한 각 농도의 시료는 메탄올을 용매로 하여 희석시켰으며, 900 μl의 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma, USA) 용액 100 μM과 각 시료 100 μl를 혼합하여 교반하였다. 이 혼합시료를 암소에서 30분간 반응시킨 후 radical이 감소하는 정도를 spectrophotometer의 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 수소전자 공여능은 각 실험을 3회 반복하여 평균을 계산한 후 대조구에 대한 흡광도의 감소 정도를 다음 식에 의하여 백분율로 계산하였다. 패션 후르츠의 부위별 시료에 대한 50%의 DPPH radical 소거 활성력은 IC₅₀ (the half maximal scavenging concentration)으로 나타내었다.

An= (A₀-A) / A₀ × 100

An : DPPH radical 소거 활성력에 대한 항산화 활성(%)

A₀ : 시료가 첨가되지 않은 DPPH 용액의 흡광도

A : 반응 용액 중의 DPPH와 각 시료가 반응한 흡광도

	DPPH radical scavenging activity, % of control
	Concentration (mg/mL)
	0.25	0.5	1.0	2.5	5.0	10.0
실시예 1	15.44±1.13	41.96±1.85	73.75±2.02	86.61±0.13	90.51±1.07	94.43±1.18
실시예 2	33.84±0.43	59.03±0.25	84.61±0.60	87.56±0.14	93.11±1.02	94.30±0.68
실시예 3	26.48±2.34	61.70±1.52	85.80±0.62	87.36±1.32	89.80±1.07	93.43±1.10
실시예 4	20.47±2.44	45.41±2.51	76.33±1.49	86.45±0.48	87.44±0.54	88.83±0.45
실시예 5	3.11±0.13	13.76±0.29	29.21±1.80	58.21±1.75	78.69±0.32	82.54±0.23
실시예 6	10.07±1.39	15.57±0.23	34.04±0.57	64.14±0.85	81.18±0.41	84.68±2.21
실시예 7	2.79±0.42	6.19±2.51	21.23±1.21	43.32±1.21	67.21±1.53	86.51±2.21
실시예 8	4.82±0.38	11.75±1.70	18.79±0.98	42.18±1.08	70.27±1.99	78.08±1.33
실시예 9	5.08±0.16	15.83±0.31	33.18±1.82	61.43±1.99	81.69±0.36	87.45±0.15
실시예 10	12.21±2.33	17.57±0.25	39.07±0.64	70.16±0.58	86.18±0.48	88.86±1.21
실시예 11	3.91±0.37	8.26±2.69	25.32±1.28	47.12±1.32	71.01±2.35	89.65±2.91
실시예 12	6.82±0.42	13.84±1.78	21.79±0.90	45.18±1.11	74.07±1.89	82.08±1.00

추출농도가 증가함에 따라 DPPH radical 소거활성 역시 비례적으로 증가하였으며, 농도와 무관하게는 전반적으로 잎의 메탄올 추출물, 잎의 노말부탄올 추출물 및 잎의 에탄올 추출물 순서로 DPPH 소거 활성이 우수하였다.

10.0 mg/mL의 추출농도에서 꽃 > 엽 > 과실 등의 순으로 DPPH radical 소거활성이 높았다. 0.25~5.0 mg/mL의 추출농도 범위에서는 전반적으로 패션 후르츠의 엽에서 DPPH radical 소거활성이 좋았다.

(2) ABTS radical 소거활성 측정

7 mM ABTS (2,2′-azinobis <3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid> diammonium salt) (Sigma, USA)와 2.45 mM potassium persulfate를 증류수에 용해하고 15시간 동안 암소에 보관하여 ABTS 양이온 radical (ABTS˙+)을 형성 시킨 후, 이 용액을 734 nm에서 흡광도 값이 0.700~0.900이 되도록 methanol로 희석하였다. 희석된 ABTS+ 용액 950 μl에 농도별 추출물 50 μl를 가하여 5분 동안 반응시킨 후, 734 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 시료 첨가 전후의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내어 ABTS radical 소거능을 구하였다. 패션 후르츠의 부위별 시료에 대한 50%의 ABTS radical 소거 활성력은 IC₅₀ (the half maximal scavenging concentration)으로 나타내었다.

An= (A₀-A) / A₀ × 100

An : ABTS radical 소거 활성능에 대한 항산화 활성(%)

A₀ : 시료가 첨가되지 않은 ABTS˙+ 용액의 흡광도

A : 반응 용액 중의 ABTS˙+와 각 시료가 반응한 흡광도

	ABTS radical scavenging activity, % of control
	Concentration (mg/mL)
	0.25	0.5	1.0	2.5	5.0	10.0
실시예 1	11.52±0.53	19.26±1.62	59.89±1.86	88.56±0.11	90.70±0.31	94.00±0.13
실시예 2	26.08±1.48	64.50±1.66	88.78±0.87	90.10±0.49	90.71±1.27	92.29±0.10
실시예 3	12.69±0.91	33.77±0.87	62.02±0.94	87.52±0.40	90.35±0.83	95.01±0.91
실시예 4	14.05±1.54	39.87±1.68	73.98±2.35	75.18±1.16	87.03±1.06	90.83±0.36
실시예 5	13.25±0.35	21.23±1.27	61.76±1.68	90.76±0.14	92.37±0.33	96.31±0.31
실시예 6	28.17±1.26	66.51±1.46	91.36±0.29	92.13±0.52	92.67±1.22	94.17±0.15
실시예 7	14.47±0.81	36.82±0.49	64.12±0.86	89.54±0.46	92.35±0.64	96.19±0.17
실시예 8	16.21±1.45	41.88±1.74	75.87±2.16	77.38±1.52	89.23±1.86	92.44±0.33
실시예 9	18.00±0.94	19.76±1.41	39.37±2.92	73.10±1.35	88.09±0.84	92.18±0.20
실시예 10	4.14±0.96	7.44±0.56	15.09±1.25	74.71±0.92	88.85±0.11	92.16±0.46
실시예 11	46.35±1.86	59.62±1.48	68.49±1.61	79.45±0.30	80.69±0.71	90.58±0.52
실시예 12	16.85±0.37	20.30±1.13	33.70±0.70	61.65±1.11	85.16±0.36	88.38±0.19

추출농도가 증가함에 따라 ABTS 자유 라디칼 소거활 역시 비례적으로 증가하였으며, 농도와 무관하게는 전반적으로 꽃의 메탄올 추출물, 잎의 메탄올 추출물 및 꽃의 노말부탄올 추출물 순서로 높았다.

10 mg/g의 추출농도에서 ABTS 자유 라디칼 소거활성을 보면 과실, 엽 및 꽃 순이었지만 유의적인 차이는 없었다. 0.25~5.0 mg/mL의 추출농도에서는 전반적으로 엽의 ABTS 자유 라디칼 소거활성이 높은 결과를 보여주었다.

1.0~2.5 mg/mL의 추출농도에서 엽의 ABTS radical 소거능이 월등하게 높았지만, 그 이외의 추출농도에서는 엽과 꽃의 추출물에서 ABTS radical 소거능이 높고 과실에서는 낮은 결과를 보였다.

10 mg/mL의 추출농도에서 추출방법별 패션 후르츠 엽의 ABTS radical 소거활성은 부탄올과 에탄올 추출시에 가장 좋았으며, 증류수 추출시에 가장 낮았다. 꽃 추출물도 엽과 비슷하게 에탄올과 부탄올로 추출시에 가장 우수하였다. 그러나 과실은 에탄올과 메탄올로 추출시에 가장 좋았다.

(3) 아질산염 소거활성

패션 후르츠 부위별 시료의 아질산염 소거 활성 측정은 Gray 등의 방법에 준하여 다음과 같이 측정하였다. 즉, 1 mM NaNO₂ 20 μl에 시료 추출액(20 mg/mL) 40 μl와 0.1 N HCl 또는 0.2 M citrate buffer 액을 이용하여 반응 용액의 pH를 각각 1.2, 4.2, 6.0으로 각각 조제한 pH buffer 140 μl과 혼합하여 부피를 200 μl로 정량하여 실험에 사용하였다. 이 반응액을 37℃ water bath에서 50분 동안 반응시켰으며, 2% acetic acid 1,000 μl, griess reagent (30% acetic acid로 조제한 1% sulfanilic acid와 1% naphthylamine을 1:1 비율로 혼합) 80 μl를 첨가하여 잘 혼합시켜 암소에서 15분간 반응시킨 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하여 다음과 같이 아질산염 소거능을 측정하였다.

N(%) = [1 - (A-C) / B] × 100

N : nitrite scavenging ability

A : absorbance of 1 mM NaNO₂ added sample after standing for 50 minute

B : absorbance of 1 mM NaNO₂

C : absorbance of control

	Nitrite scavenging activity(%)
	pH 1.2	pH 4.2	pH 6.0
실시예 1	52.41±1.50	39.74±1.03	ND
실시예 2	54.46±0.09	45.12±0.39	ND
실시예 3	58.59±0.51	51.67±0.79	ND
실시예 4	30.68±0.53	18.70±0.74	ND
실시예 5	48.16±1.49	30.72±1.21	ND
실시예 6	50.65±0.14	41.11±0.28	ND
실시예 7	54.29±0.62	47.77±0.78	ND
실시예 8	28.67±0.51	15.74±0.76	ND
실시예 9	69.91±1.24	54.26±2.26	11.96±0.70
실시예 10	64.27±0.45	50.52±2.05	17.29±0.31
실시예 11	74.73±1.56	58.68±0.59	21.06±1.11
실시예 12	61.09±2.99	45.81±0.88	ND
*ND=not detected.

아질산염 소거능은 pH와 무관하게 전반적으로 과실의 노말부탄올 추출물, 과실의 에탄올 추출물 및 과실의 메탄올 추출물 순으로 높았다. 패션 후르츠 식물체 부위별 아질산염 소거능을 보면 모든 pH 조건에서 과실 추출물에서 가장 높았고, 전반적으로 볼 때, pH 1.2 조건에서 과육 추출물의 아질산염 소거능이 가장 우수하였는데, 특히 부탄올 과육 추출물이 아질산염 소거능에 가장 유효하였다.

pH 1.2와 4.2에서 식물체 부위별 아질산염 소거능은 패션 후르츠 과실에서 현저히 증가한 반면, pH 6.0에서 아질산염 소거능은 검출되지 않았다. 추출방법별 패션 후르츠 엽의 아질산염 소거능은 pH 1.2와 4.2 모두 부탄올로 추출한 경우에 가장 높았다. 패션 후르츠 꽃 역시 부탄올로 추출한 경우에 가장 높았고, 과실도 부탄올로 추출할 경우 가장 우수하였으며, pH 6.2에서는 검출되지 않았다.

3) 항산화 효소활성 측정

(1) 효소액의 조제

효소액의 조제는 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) 용액에 2 mM EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid), 1% PVP (polyvinyl pyrolidone), 1 mM PMSF (phenyl methane sulfonyl fluoride) 등을 첨가하여 균질화 하였으며, 동결 건조한 부위별 패션 후르츠의 분말 시료 0.3 g을 넣어 over night하여 15,000 rpm으로 20분간 원심 분리한 다음, 상층액을 항산화 효소활성 측정에 사용하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford법에 따라 BSA (bovine serum albumin) (Sigma, USA)를 표준물질로 사용하여 측정하였다.

(2) Super oxide dismutase (SOD)의 활성 측정

Super oxide dismutase (SOD) 활성 측정은 분석용 kit (Sigma, 19160, Japan)를 사용하여 측정하였다. SOD 측정을 위한 시료(sample), blank 1, 2 및 3 용액의 양을 하기 표 6에 나타내었다.

(Unit : μl)	Sample	Blank 1	Blank 2	Blank 3
Sample solution	20		20
Distilled water		20		20
WST working solution	200	200	200	200
Enzyme working solution	20	20
Dilution buffer			20	20

즉, SOD 효소활성은 NBT (nitroblue tetrazolium)의 환원 저해능을 측정하는 photochemical NBT method를 이용하였다. 반응액은 50 mM carbonic buffer 액 (pH 10.2), 0.1 mM EDTA, 0.1 mM xanthine, 0.025 mM NBT로 하였으며, spectrophotometer를 이용하여 흡광도 450 nm에서 NBT 환원 저해율을 측정하였다. SOD 효소활성은 아래의 계산식에 의하여 구하였다.

Super oxide dismutase (SOD) 활성 (NBT 환원 저해율, %)　=　

{[(blank 1-blank 3) - (sample-blank 2)] / (blank 1-blank 3)} × 100

(3) Catalase (CAT)의 활성 측정

Catalase (CAT) 활성은 Mishra 등의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 반응액의 최종 농도는 50 mM potassium phosphate buffer 액 (pH 7.0)에 10 mM H₂O₂가 포함되도록 하였다. CAT 활성은 이 반응액에 제조한 효소액을 가한 후 spectrophotometer를 이용하여 240 nm의 흡광도에서 1분간 소거된 H₂O₂ 변화를 측정하였고, 단백질 1 mg 당 소거된 H₂O₂를 ㅅmole로 표시하였다.

(4) Ascorbate peroxidase (APX)의 활성 측정

Ascorbate peroxidase (APX) 활성은 Chen과 Asada의 방법에 따라 측정하였다. 즉, APX의 반응액은 0.5 mM ascorbate와 0.2 mM H₂O₂가 첨가된 100 mM potassium phosphate buffer 액 (pH 7.5)으로 하였다. 이 반응액에 제조한 효소액을 가한 후 ascorbate의 산화 정도를 spectrophotometer로 290 nm에서 1분간의 흡광도 변화로 측정하였으며, 단백질 1 mg 당 산화된 ascorbate를 ㅅmole로 표시하였다.

(5) Peroxidase (POD)의 활성 측정

Peroxidase (POD) 활성은 Chance와 Maehly의 방법에 따라 측정하였다. 즉, POD 반응액은 최종 농도가 1.5 mM guaiacol과 6.5 mM H₂O₂가 포함된 40 mM potassium phosphate buffer 액 (pH 6.9)으로 조제하였다. 이 반응액에 조제한 효소액을 가한 후, tetraguaiacol의 형성 정도를 spectrophotometer로 470 nm에서 1분간의 흡광도 변화로 측정하였고, 단백질 1 mg 당 형성된 tetraguaiacol을 μmole로 표시하였다.

	SOD activity (inhibition rate %)	Catalase activity (mmol H₂O₂ decomposed min/mg/protein)	APX activity (μmol ascorbate oxidized/min/mg protein)	POD Activity (μmol tetraguiacol/min/mg protein)
실시예 1	68.41±0.48	2.49±0.65	60.61±8.01	3.01±0.27
실시예 2	67.43±1.46	2.64±0.61	51.46±1.36	5.04±0.24
실시예 3	72.79±1.21	3.27±0.69	58.33±7.87	8.25±1.64
실시예 4	70.92±1.15	14.24±1.12	131.03±9.30	3.80±0.59
실시예 5	57.73±1.65	1.29±0.25	111.98± 5.47	1.42±0.77
실시예 6	58.71±0.91	1.63±0.42	165.32±14.63	1.56±0.24
실시예 7	65.74±0.75	1.23±0.51	130.18±12.95	3.56±0.75
실시예 8	67.57±0.82	12.11±1.41	180.83±19.92	2.68±0.32
실시예 9	65.22±2.38	6.15±1.45	112.84± 8.33	3.82±0.65
실시예 10	68.46±0.71	14.78±1.85	68.32±15.06	3.02±0.25
실시예 11	74.81±0.81	9.10±0.52	134.99±13.87	7.27±0.97
실시예 12	77.81±0.86	11.54±1.51	184.43±21.88	5.18±0.51

SOD 활성은 과실의 증류수 추출물, 과실의 노말부탄올 추출물 및 잎의 노말부탄올 추출물 순서로 높게 나타났으며, 식물체 부위별 SOD 활성을 보면 과실 > 엽 > 꽃 등의 순으로 보였고, 특히 열수로 과실을 추출한 경우에 SOD 활성이 가장 우수하였다.

CAT 활성은 과실의 메탄올 추출물, 잎의 증류수 추출물 및 꽃의 증류수 추출물 순서로 높게 나타났으며, 추출용매의 종류별로 엽, 꽃 및 과실 등을 추출하여 CAT 활성의 차이를 보면, 엽의 열수 추출물과 과실의 메탄올 추출물의 CAT 활성이 가장 우수하였다.

APX 활성은 과실의 증류수 추출물, 꽃의 증류수 추출물 및 꽃의 메탄올 추출물 순서로 높게 나타났으며, 식물체 부위별 APX 활성을 보면 엽에서 낮고, 꽃과 과실에서는 비교적 높았다. 또한, 추출용매별로 보면 열수로 추출한 엽, 꽃 및 과실 추출물 등에서 APX 활성이 높아졌다.

POD 활성은 잎의 노말부탄올 추출물, 과실의 노말부탄올 추출물 및 과실의 증류수 추출물 순서로 높게 나타났으며, 패션 후르츠 과실 추출물의 POD 활성을 가장 높일 수 있는 추출용매는 부탄올로 추출하는 방법이었다. 또한, 이러한 결과는 패션 후르츠 엽과 과실을 부탄올로 추출한 경우에 추출물의 POD 활성이 가장 높아졌다.

4) 항균 활성 측정

(1) 사용 균주 및 배지

본 실험에서 항균활성을 측정하기 위하여 사용한 균주인 Staphylococcus epidermis KCTC 1917과 Staphylococcus aureus KCTC 1621은 KCCM에서 분양받아 사용하였고, Listeria monocytogenes KCCM 40307, Escherichia coli KCCM 11569, Malassezia furfur KCCM 12679 및 Candida albicans KCCM 50235 등은 KCCM에서 분양받아 사용하였다.

본 실험에서 항균활성 실험에 사용한 각 균종과 균주의 번호 및 배양조건을 하기 표 8에 나타내었다. 균주 배양에 필요한 영양한천 (nutrient agar, NA) 배지의 조성은 표 9에 나타낸 것과 같이 증류수 1 L 당 beef extract 1.0 g, peptone 5.0 g, sodium chloride 5.0 g, yeast extract 2.0 g, agar 15.0 g을 혼합한 후 pH는 6.8±0.2로 조절하였다. Brain heart infusion (BHI) agar 배지는 표 10에 나타낸 것과 같이 물 1 L 당 brain heart infusion 17.5 g, peptone 10.0 g, glucose 2.0 g, sodium chloride 5.0 g, dipotassium phosphate 2.5 g, agar 15.0 g 등을 혼합한 후 pH를 7.4±0.2로 조절하여 사용하였다.

Strains	Strains number	Cultivation condition
Staphylococcus epidermis	KCTC 1917	37℃, nutrient agar medium
Staphylococcus aureus	KCTC 1621	37℃, nutrient agar medium
Listeria monocytogenes	KCCM 40307	37℃, brain heart infusion agar medium
Escherichia coli	KCCM 11569	37℃, nutrient agar medium
Malassezia furfur	KCCM 12679	37℃, nutrient agar medium
Candida albicans	KCCM 50235	37℃, nutrient agar medium

Component	Contents (g/L)
Beef extract	1.0
Peptone	5.0
Sodium chloride	5.0
Yeast extract	2.0
Agar	15.0
pH	6.8±0.2

Component	Contents (g/L)
Brain heart infusion	17.5
Peptone	10.0
Glucose	2.0
Sodium chloride	5.0
Dipotassium phosphate	2.5
Agar	15.0
pH	7.4±0.2

(2) 균주의 배양 및 항균활성 효과 측정

엽, 꽃 및 과실 등 패션 후르츠의 식물체 부위별 추출물의 항균활성 측정은 분양 받은 고체 배지 내의 균주를 적당량 취한 후에 5 mL broth의 균 액체배지에 접종하고, 각각의 배양 조건에서 24시간씩 2∼3회 계대배양한 후에 시험 균주로 사용하였다. 한천배지확산법(disc agar plate diffusion method)을 이용하여 항균 활성 효과를 측정하였다. 즉, 각 시험 균주별로 적합한 배지에 일정한 농도로 균주를 배양한 한천 배지를 petri dish에 분주한 후 20∼25℃로 식혀 굳힌 다음 배지 위에 top agar를 도말하여 멸균된 8 mm paper disc (Adventic, Japan)를 top agar plate 표면에 일정한 간격으로 놓았다. 각 시료 추출물들을 paper disc에 40 μl씩 주입하였다. 이 때 paper disc의 흡수력을 고려하여 20 μl씩 두 번에 나누어서 주입시킨 후, 각 균의 생육 적정 온도에서 24시간 동안 incubator에서 배양하여 paper disc 주위에 저해환의 생성을 관찰하였다. 24시간 이내에 저해환이 생성된 경우 항균활성이 양성인 것으로 판정하였으며, 저해환의 직경을 측정하여 항균 활성 정도를 측정하였다.

	Inhibition zone (mm)
	Staphylococcus epidermidis	Staphylococcus aureus	Listeria monocytogenes	Escherichia coli	Malassezia furfur	Candida albicans
실시예 1	23.7	7.1	8.0	14.6	6.5	12.7
실시예 2	23.4	7.5	12.3	26.7	16.7	7.2
실시예 3	8.4	7.3	ND	15.1	26.4	13.1
실시예 4	8.2	16.4	ND	8.3	15.9	20.3
실시예 5	23.4	16.2	6.4	16.4	8.3	22.7
실시예 6	22.7	16.0	6.1	22.7	14.9	16.3
실시예 7	16.4	7.9	6.8	16.8	15.1	5.4
실시예 8	16.1	7.6	6.3	9.7	8.0	5.1
실시예 9	26.4	22.7	16.7	22.9	16.0	16.4
실시예 10	25.9	22.3	16.0	16.7	22.8	16.2
실시예 11	26.0	15.7	16.5	8.0	15.9	16.7
실시예 12	26.2	15.9	16.2	16.9	8.1	8.3

전반적으로 패션 후르츠 과실의 에탄올 추출물, 과실의 메탄올 추출물, 과실의 노말부탄올 추출물 순서로 항균 효과가 우수한 것으로 나타나 과실의 에탄올 추출물(50~70 wt%) > 과실의 메탄올 추출물(20~30 wt%) > 과실의 노말부탄올 추출물(10~20 wt%) 순서로 다량 혼합할 경우 모든 균주에 대하여 우수한 항균효과를 가질 것으로 예상된다.

세부적으로는 패션 후르츠 엽의 에탄올과 메탄올 추출물은 Staphylococcus epidermidis의 생육억제에 효과적이었고, Staphylococcus aureus의 생육억제에는 열수 추출물이 효과적인 반면, Listeria monocytogenes의 생육억제에는 패션 후르츠의 엽 메탄올 추출물이 가장 효과적이었다.

패션 후르츠의 에탄올과 메탄올 꽃 추출물은 Staphylococcus epidermidis 균에 대하여 약 20~25 mm의 우수한 생장억제환을 보였으며, 부탄올과 열수 꽃 추출물도 10~20 mm의 병원균 생장억제환을 보였다.

5) Tyrosinase 저해 활성 효과 측정

엽, 꽃 및 과실 등 패션 후르츠 추출물의 미백효과를 알아보기 위하여 tyrosinase 저해 활성 효과를 실험하였다. Tyrosinase는 tyrosine을 DOPA로의 전환에 관여하고 DOPA quinone으로 전환시켜 melanin 색소를 생성시키는 반응에 관여한다. 효소액은 mushroom tyrosinase (Sigma, USA)를 100 unit/mL로 희석하여 0.2 mL, 기질로는 10 mM 3,4-dihydroxy-L-henylalanine과 0.1 M의 potassium phosphate buffer 액 (pH 6.8)의 혼합용액 0.6 mL을 이용하였고, 패션 후르츠 식물체 부위별 시료 0.2 mL을 주입 후, 잘 혼합한 다음 37˚C에서 약 20분간 반응한 후, spectrophotometer를 이용하여 흡광도 475 nm에서 측정 후, tyrosinase 활성 저해능을 다음의 식에 의하여 계산하였다.

저해율(%) = ｛1-(무첨가군의 흡광도 / 시료첨가군의 흡광도)｝ × 100

	Tyrosinase inhibition activity (%)
	Concentration (mg/mL)
	0.5	1.0	2.5
실시예 1	46.93±0.72	52.01±1.46	55.36±1.68
실시예 2	49.61±0.22	55.07±0.81	59.39±1.71
실시예 3	24.47±0.25	27.31±0.61	32.44±0.61
실시예 4	13.31±0.67	16.82±1.36	19.15±1.39
실시예 5	65.55±0.40	68.46±0.42	75.09±0.27
실시예 6	68.10±0.39	71.09±0.44	75.24±0.21
실시예 7	67.52±0.22	70.32±0.18	75.18±0.54
실시예 8	64.70±0.23	67.95±0.27	75.10±0.22
실시예 9	81.02±0.62	83.82±0.42	85.59±0.36
실시예 10	82.79±0.28	85.38±0.46	87.01±0.26
실시예 11	83.53±0.41	84.41±0.16	86.34±0.51
실시예 12	78.47±0.16	82.76±0.25	85.69±0.25

전반적으로 패션 후르츠 과실의 메탄올 추출물, 과실의 노말부탄올 추출물, 과실의 에탄올 추출물 순서로 항균 효과가 우수한 것으로 나타나 과실의 메탄올 추출물(50~70 wt%) > 과실의 노말부탄올 추출물(20~30 wt%) > 과실의 에탄올 추출물(10~20 wt%) 순서로 다량 혼합할 경우 농도와 무관하게 우수한 미백효과를 가질 것으로 예상된다.

세무적으로는 2.5 mg/mL의 추출농도에서 패션 후르츠 과실 추출액의 tyrosinase 저해 활성이 가장 높았다. 과실을 메탄올로 추출한 경우에 tyrosinase 저해 활성이 가장 높았으며 특히, 패션 후르츠 과실의 추출물에서 추출용매와 상관없이 tyrosinase 저해 활성이 가장 높은 활성을 갖는 것으로 측정되었다. 패션 후르츠의 식물체 부위별로는 과실 > 꽃 > 엽 등의 순으로 tyrosinase 저해 활성이 증가하는 것을 알 수 있었다.

6) In-vitro test를 통한 항염증 효과

(1) 세포 배양

In vitro test를 통한 패션 후르츠의 식물체 부위별 항염증 효과를 측정하기 위하여 한국세포은행 (KCLB)에서 구입한 RAW 264.7 세포를 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% antibiotics가 첨가된 Dulbeco's Modified Eagle's Medium (DMEN) 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기(ASTEC社,SCA-30D)에서 배양하였다. RAW 264.7 세포는 culture dish에서 80~90% 정도 자랐을 때, 계대배양 하였고, RAW 264.7 세포의 cell passage number는 20을 넘기지 않은 세포로만 실험에 이용하였다.

(2) 세포 독성 측정

패션 후르츠의 엽, 꽃 및 과실 등 식물체 부위별 시료의 세포독성을 측정하기 위해 Green 등의 방법에 따라 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 수행하였다. 즉, MTT assay의 수행은 미토콘드리아 내에 존재하는 탈수소화 효소가 노란색의 수용성 기질인 MTT를 분해하여 불용성의 보라색 formazan을 생성하게 되는데, 이 formazan은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해되며, 흡광도 측정으로 대사가 왕성한 세포 및 살아있는 세포를 측정하였다.

RAW 264.7 cell이 1×10⁵cells/mL의 농도가 되도록 96-well plate에 100 μL씩 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 18시간 동안 RAW 264.7 cell을 배양하였다. Lipopolysaccharide (LPS)와 시료처리는 0.5% FBS가 첨가되어 있는 DMEM에 희석하여 24시간 처리하고, 0.5 mg/mL의 MTT 용액을 포함하는 배지로 교체하여 incubator에서 4시간 배양하였다. 배양 종료 후 상등액을 제거하고 각 well에 150 μL DMSO를 첨가하여 formazan 결정을 용해시켜 microplate reader (BioTek, Winooski, VT, USA)로 흡광도 540 nm에서 측정하였다. 세포독성은 시료 무처리군의 흡광도에 대한 백분율로 계산하였다.

	Cell viability (%)
	Concentration (mg/mL)
	0	0.025	0.05	0.1	0.25	0.5	1
실시예 1	98.1±4.6	98.2±3.8	98.4±6.1	98.6±2.9	105.4±6.0	112.8±3.7	113.4±10.4
실시예 5	97.3±5.1	97.5±6.4	97.6±5.3	97.8±4.9	104.1±4.8	113.4±4.1	111.9±3.7
실시예 9	98.2±3.9	98.5±4.8	98.7±4.7	98.8±5.1	105.9±5.3	112.3±6.8	112.7±4.6

패션 후르츠의 식물체 부위별 모든 에탄올 추출물의 처리농도에서 독성이 나타나지 않음을 확인하였으며, 추출농도와 식물체 부위별로 전체적인 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다.

(3) Nitric oxide (NO) 생성 저해활성 측정

Nitric oxide (NO) 생성 저해활성 측정은 Green 등의 방법을 이용하였다. 즉, RAW 264.7 세포로부터 생성되는 활성 질소종인 nitric oxide (NO)의 량은 세포 배양액 중 존재하는 NO₂ ^-형태를 Griess reagent와 반응시킨 후 측정하였다. 1×10⁵ cells/mL 농도의 RAW 264.7 cell을 96-well plate에 분주하였으며, 패션 후르츠 엽, 꽃 및 과실 등의 식물체 부위별 시료를 추출한 후 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. RAW 264.7 세포를 배양한 상등액 100 μL와 Griess 시약(A reagent : 1% sulfanilamide, B reagent : 0.1% naphthylethylendiamine in 25% phosphoric acid)을 50 μL씩 혼합하여 96-well plate에서 10분간 반응시켰으며, microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO₂ ^- 표준곡선은 NaNO₂를 농도별로 조제하여 사용하였다.

	Nitrite oxide formation (μg/mL)
	0 μg LPS(-)	0 μg LPS(+)	25 μg	50 μg	100 μg	250 μg	500 μg	1000 μg
실시예 1	2.3±2.7	25.9±5.8	25.7±6.7	21.4±6.9	15.8±5.1	13.4±3.9	12.8±2.7	9.7±4.2
실시예 5	2.1±2.4	23.1±4.6	23.0±7.2	19.7±5.0	13.4±4.9	12.1±4.4	10.9±1.9	8.3±4.6
실시예 9	2.4±2.8	25.7±5.9	25.5±5.4	20.8±5.7	15.6±4.3	12.9±2.4	11.7±2.3	10.1±5.1

패션 후르츠의 엽, 꽃 및 과실 등의 에탄올 추출물은 nitric oxide (NO)의 생성 억제에 효과적인 것으로 나타났으며, 농도 의존적으로 패션 후르츠의 식물체 부위별 에탄올 추출물의 고농도에서 nitric oxide의 생성이 적게 생성되는 것으로 확인되었다. 엽, 꽃 및 과실 등 식물체 부위와 추출농도간의 유의적인 차이는 보이지 않았다.

상기와 같이 패션 후르츠의 폴리페놀 화합물과 플라보노이드 등의 생리활성 성분과 항산화작용, 항산화 효소활성, 항균활성, tyrosinase 저해 활성 및 항염증 작용 등의 생리활성에 의해 기능성 식품과 천연 화장품 등의 개발 등에 광역적으로 활용할 수 있다.

전술한 각 실시예에서 예시된 특징, 구조, 효과 등은 실시예들이 속하는 분야의 통상의 지식을 가지는 자에 의하여 다른 실시예들에 대해서도 조합 또는 변형되어 실시 가능하다. 따라서 이러한 조합과 변형에 관계된 내용들은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

패션 후르츠의 잎(leaf), 꽃(flower) 또는 과실(fruits)을 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol), 노말부탄올(n-buthanol) 또는 증류수(water)를 용매로 추출하여 얻어진 패션 후르츠 추출물 중 어느 1종 이상을 포함하는 화장료 또는 식품첨가 조성물.
제1항에 있어서,
상기 패션 후르츠 추출물은 패션 후르츠 잎의 에탄올 추출물, 패션 후르츠 과실의 메탄올 추출물, 패션 후르츠 과실의 노말부탄올 추출물, 과실의 에탄올 추출물, 꽃의 메탄올 추출물 및 잎의 증류수 추출물로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 1종 이상을 포함하여 항산화, 항균, 항염 및 미백 기능성을 갖는 화장료 또는 식품첨가 조성물.
제1항에 있어서,
상기 패션 후르츠 추출물은 패션 후르츠 잎의 메탄올 추출물, 패션 후르츠 꽃의 메탄올 추출물, 패션 후르츠 과실의 노말부탄올 추출물 및 패션 후르츠 과실의 증류수 추출물을 포함하여 항산화 기능성을 갖는 화장료 또는 식품첨가 조성물.
제1항에 있어서,
상기 패션 후르츠 추출물은 과실의 에탄올 추출물, 과실의 메탄올 추출물 및 과실의 노말부탄올 추출물을 포함하여 항균 및 미백 기능성을 갖는 화장료 또는 식품첨가 조성물.
제1항에 있어서,
상기 패션 후르츠 추출물은 과실의 에탄올 추출물, 과실의 메탄올 추출물, 과실의 노말부탄올 추출물 순서로 다량 포함하여 향균 기능성을 갖는 화장료 또는 식품첨가 조성물.
제1항에 있어서,
상기 패션 후르츠 추출물은 과실의 메탄올 추출물, 과실의 노말부탄올 추출물, 과실의 에탄올 추출물 순서로 다량 포함하여 미백 기능성을 갖는 화장료 또는 식품첨가 조성물.
제1항에 있어서,
상기 패션 후르츠 추출물은 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)) 나노입자 내에 담지된 형태로 포함되며,
상기 PLGA 나노입자는 평균 직경이 200 내지 300nm 이고, PLA(poly(lactic acid)):PGA(poly(glycolic acid)) 의 몰비가 3:2 내지 4:1 인 것을 특징으로 하는 화장료 또는 식품첨가 조성물.
잎, 꽃 또는 과일을 포함하는 패션 후르츠의 부위별 건조시료를 얻는 단계;
건조시료에 용매로서 에탄올, 메탄올, 노말부탄올 또는 증류수를 첨가하고 마쇄한 후 교반 침출시켜 추출하고 여과하여 추출여액을 얻는 단계; 및
추출여액을 수욕 상에서 감압 농축하여 패션 후르츠 추출물을 얻는 단계;를 포함하는 화장료 또는 식품첨가 조성물용 패션 후르츠 추출물 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 추출여액을 얻는 단계는 건조시료 10g 당 용매 80 내지 120mL을 첨가하고 마쇄한 후, 상온에서 20 내지 30 시간 동안 교반 침출시켜 추출하고 여과하는 단계인 화장료 또는 식품첨가 조성물용 패션 후르츠 추출물 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 추출물을 얻는 단계는 40 내지 60℃ 의 수욕 상에서 감압 농축하여 농축된 추출물을 얻는 단계인 화장료 또는 식품첨가 조성물용 패션 후르츠 추출물 제조방법.