KR20200126236A - 후박 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 후박 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의후박 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리한 화합물은 염증 매개인자인 염증성 사이토카인, 프로스타글란딘 E2 및 산화질소의 생성을 억제하므로 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 후박 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리한 화합물은 천연물로부터 유래한 것이므로, 염증성 질환의 예방 또는 치료 및 개선에 부작용 없이 안전하게 사용할 수 있다.
본 발명의후박 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리한 화합물은 염증 매개인자인 염증성 사이토카인, 프로스타글란딘 E2 및 산화질소의 생성을 억제하므로 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 후박 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리한 화합물은 천연물로부터 유래한 것이므로, 염증성 질환의 예방 또는 치료 및 개선에 부작용 없이 안전하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 후박 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 후박 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
염증 반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전을 의미한다.
대식세포는 염증반응과 면역기능을 조절하며, 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 그람 음성균의 외막성분인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)는 대식세포의 감염초기에 반응하고 숙주 방어에 중추적인 역할을 하나, 과도한 리포폴리사카라이드 자극에 의해 활성화된 대식세포는 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF)-α, 인터류킨(interleukin, IL)-1β 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인을 분비시키며, 산화질소(NO), 프로스타글란딘 E2(PGE2) 등의 염증 매개 물질을 다량 분비하게 된다(Jenog et al., 2014). NO는 대식세포가 활성화되면 유도형 산화질소 생성 효소(inducible NO synthase, iNOS)로부터 생산되며, 과도한 NO의 생성은 염증을 유발시키게 되며 병리학적 혈관 확장, 세포독성, 조직 손상 등 유해 작용을 일으키는 것으로 알려져 있다(Forstermann and Sessa, 2012). TNF-α, IL-1b 및 IL-6 와 같은 전염증성 사이토카인 및 단백질의 유전자 발현은 유사분열 활성화 단백질 인산화효소 (Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)와 핵 인자 카파 B(nuclear factor kappa B, NF-kB)에 의해 조절된다. 면역과 염증 반응에 관계된 유전자의 발현에 있어서 NF-kB가 활성화되면 NF-kB와 결합해 있던 IkBα(inhibitory kappa B α)가 분해되면서 NF-kB가 세포 원형질에서 핵으로 들어가게 되며 이후 TNF-α, IL-6와 같은 사이토카인 발현의 전사 인자로서 중요한 역할을 한다(Jang et al., 2005, Majdalawieh and Ro, 2010).
힘 옥시게나제(Heme oxygenase, HO)의 대사를 조절하는 효소인 HO-1은 세포의 힘(heme)을 분해하여 일산화탄소(CO), 제1철(ferrous iron) 및 빌리버딘(biliverdin)으로 전환하게 되고, 빌리버딘은 다시 환원효소에 의해 빌리루빈(bilirubin)으로 환원된다(Elbirt and Bonkovsky, 1999). HO-1과 생성된 부산물들은 항염증 및 항세포사멸에 관련된 유전자 발현과 효소의 활성에 영향과 산화적 스트레스로부터 세포와 조직을 보호하는 효소로 인식되고 있다(Gozzelino et al., 2010, Tsan et al., 1989). 빌리루빈은 iNOS와 COX-2의 발현 및 NO의 생성을 억제하며 빌리버딘은 전염증성 사이토카인인 IL-6와 IL-1β의 생성을 억제시키는 것으로 보고 되었다. 특히 리포폴리사카라이드를 처리한 RAW 264.7 대식세포에서 HO-1은 NO의 생성과 iNOS 유전자 발현을 억제함으로써 항염증 작용을 통하여 세포 손상을 억제한다는 연구 결과가 보고 되었다.
후박(Machilus thubergii)의 기원은 한국, 중국, 일본이 있으며 공정서를 비교 한 결과 기원 식물과 라틴명의 차이가 있다. 한국산 후박의 경우, 라틴명은 Magoliage Cortex이며, 마그놀올(magnolol) 및 호노키올(honokiol)의 함량이 1%이상이다. 후박은 한의학적 효능으로 소화 관련, 장관, 평활근, 기타 중추신경 억제, 항진균, 항산화 등으로 사용 되고 있으며, 현재까지도 후박의 기능의 검증하기 위한 다양한 연구들이 수행 되고 있는 실정이다.
본 발명의 하나의 목적은 후박 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 후박 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 후박 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서는, 후박 추출물은 염증성 사이토카인, 프로스타글란딘 E2 및 산화질소와 같은 염증 매개인자의 생성을 억제하는 효과를 나타내어 염증성 질환 치료제의 유효성분으로 사용되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 후박은 시장으로부터 구입하거나 직접 채취한 것일 수 있다. 본 발명의 후박은 한국산 후박(Magoliage Cortex)과 그렇지 않은 후박(Machilus thuberghii)을 모두 포함한다.
발명의 용어, "추출물"은 상기 후박을 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
상기 후박에서 추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 후박 추출물을 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다.
상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 구체적으로 에탄올이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 에탄올은 0.1 내지 99.99%(v/v), 구체적으로 30 내지 90%(v/v), 더욱 구체적으로 80%(v/v) 메탄올일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 후박 추출물은 후박 80%(v/v) 메탄올 추출물 또는 물 추출물일 수 있다.
상기 후박 추출물을 제조하는 일 예로, 후박 추출물을 메탄올로 추출한 뒤, 감압농축하고 동결건조하여 후박 추출물을 제조할 수 있다.
본 발명의 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이들의 조합 등이 있다. 구체적으로, 본 발명의 후박을 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexan), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 등의 비극성 용매; 또는 이들의 혼합용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로, 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올(butanol) 또는 물이 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 추출물 또는 분획물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 후박 추출물 및 이의 분획물은 염증성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 “염증성 질환”은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 용어 “예방”은 상기 조성물의 투여에 의해 염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 “치료”는 상기 조성물의 투여에 의해 염증성 질환을 낫게 하는 행위를 모두 의미하는 것으로, 질환, 질환의 증상, 질병 또는 질환의 2차 질환, 또는 이에 대한 소인(predisposition)을 치료, 경감, 완화, 요법(remedy), 또는 향상하기 위한 목적과 함께 질환, 질환의 증상, 질병 또는 질환의 2차 질환, 또는 이에 대한 소인을 갖는 피험자(인간 또는 동물)에게 후박 추출물을 포함하는 조성물의 적용 또는 투여로 정의된다.
본 발명의 약학적 조성물은 총 조성물의 중량 대비 상기 후박 추출물을 0.0001 내지 80 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 0.01 중량% 내지 40 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한"은 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 후박 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
이때, 상기 후박, 후박 추출물, 분획물, 염증성 질환 및 예방의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어, "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 염증성 질환 개선 효과를 기대할 수 있으므로, 건강 증진 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 '기능(성)'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형은 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 천연물을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 염증성 질환의 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.001 ~ 0.4 g, 구체적으로 약 0.002 ~ 0.3 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.001 ~ 0.10 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 발명의 후박 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리한 화합물은 염증 매개인자인 염증성 사이토카인, 프로스타글란딘 E2 및 산화질소의 생성을 억제하므로 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 후박 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리한 화합물은 천연물로부터 유래한 것이므로, 염증성 질환의 예방 또는 치료 및 개선에 부작용 없이 안전하게 사용할 수 있다.
도 1은 후박추출물을 Raw 264.7세포에 농도별로 처리하여 세포 내 독성 효과 여부를 확인한 것이다.
도 2는 LPS 농도에 따라 LPS에 의한 Raw 264.7 대식세포에서 NO의 산물인 질산화물(nitrate)의 농도 변화를 확인한 것이다.
도 3은 Raw 264.7 세포에 LPS와 후박 추출물을 24시간 처리하여 염증성인자인 iNOS, COX2 및 IL-1b의 mRNA 발현을 억제한 정도를 확인한 것이다.
도 2는 LPS 농도에 따라 LPS에 의한 Raw 264.7 대식세포에서 NO의 산물인 질산화물(nitrate)의 농도 변화를 확인한 것이다.
도 3은 Raw 264.7 세포에 LPS와 후박 추출물을 24시간 처리하여 염증성인자인 iNOS, COX2 및 IL-1b의 mRNA 발현을 억제한 정도를 확인한 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 및 실험예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
후박 추출물의 항염증 실험에 사용된 기법은 RAW 264.7 세포를 LPS 로 유도하여 염증을 강제로 유발시키고, 후박추출물에 대한 세포사멸, NO생성억제, 염증유발인자 억제에 관여하는 실험을 수행하였다.
세포배양
항염증 실험에 사용된 세포는 마크로파지세포 (Raw 264.7)임. RAW 264.7 세포는 한국세포주은행에서 분양 받았으며, 10% fetal bovine serum과 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃ 배양기에서 계대 배양하여 사용하였다.
제조예 1. 후박 열수 추출물의 제조
후박을 물과 함께 환류 냉각기를 부착한 추출기에서 90~100℃로 12~48시간 동안 추출하였다. 이 추출액을 실온(1~30℃)으로 냉각시킨 후 여과액을 취하였다. 이를 건조하여 분말을 제조하였다.
제조예 2. 후박 에탄올 추출물의 제조
후박을 에탄올과 함께 환류 냉각기를 부착한 추출기에서 60~80℃로 12~48시간 동안 추출하였다. 이 추출액을 실온(1~30℃)으로 냉각시킨 후 여과액을 취하였다. 이를 건조하여 분말을 제조하였다.
제조예3. 후박 분획물의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 후박 열수 추출물에 헥산, 클로로포름, 부탄올을 적정량 첨가하여 이들 용매에 대한 가용부를 순차적으로 분획하고 각 분획물들은 감압 농축하여 -30℃에서 얼린 후 동결 건조하여 본 발명의 후박 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 부탄올 분획물을 제조하였다.
실시예 1.
세포 생존 확인
후박 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여, Raw264.7 세포는 96 웰 플레이트에 24 시간 1x104 cells/well로 배양하였음. 이후, 각 실험별 대조 약물과 후박추출물을 24 시간 동안 처리하였다.
2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide 시약을 2시간 동안 처리 후 450nm에서 O.D 값을 측정하였다. 또한, 세포의 사진은 Nikon 현미경을 이용하여 획득하였다.
후박추출물을 Raw 264.7세포에 처리 한 결과, 1,000ug/ml에서 후박추출물을 처리 하지 않은 군에 비해 독성을 보였다. 따라서 이후 결과에서는 독성이 없는 최대치의 농도인 300 ug/ml을 사용하여 실험을 진행함. 1ug/ml의 LPS로 유도된 세포와 후박추출물을 동시에 처리한 세포에서도 세포내의 독성이 보이지 않았다(도 1).
실시예 2. 산화질소(Nitric oxide, NO) 측정
LPS는 박테리아 세포벽을 구성하는 물질로 마크로파지 세포에 처리시 과대 NO를 생성한다. 본 발명에서는 주침액이 RAW 264.7세포에서 LPS로 유도한 NO를 억제하는지 확인하였다. NO의 농도를 세포 배양액에 존재하는 NO2
-를 인지하는 그리스(Greiss) 시약을 이용하여 검출하였다. 이를 위하여 세포는 6 웰 컬쳐 플레이트(culture plate)에 24 시간 동안 배양하였다. 다양한 농도의 추침액을 1시간 처리 후, LPS를 처리하였다. 24 시간 배양한 뒤 세포 배양액을 수거하고 배양액에 동량의 그리스 시약을 넣어 실온에서 반응시킴. 반응액을 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)를 이용하여 540 nm 흡광도에서 측정하였다. 세포로부터 생성된 NO의 양은 NaNO2 표준액의 농도를 기준으로 계산하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
그 결과, 세포내의 여러 요인에 의해 NO가 과도하게 생성되면 만성 염증 유발 등의 문제를 일으켰다. iNOS가 유도되면 NO가 과도하게 생성되고, iNOS의 발현을 증가 시키는 물질로는 LPS가 있다. LPS에 의한 Raw 264.7 대식세포에서 NO의 산물인 nitrate변화를 관찰 하였다. LPS를 처리 한 군은 LPS처리하지 않은 군에 비해 Nitrate의 생성량이 증가하였다. LPS에 의해 증가된 질산화물은 후박 열수 추출물 100, 300 ug/ml에서 유의성 있게 억제 하였다.
실시예 3. RNA 발현 확인
RNA 발현은 트리졸(Trizol) 시약을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA는 1ug으로 정량하여 PreMix RT/PCR 키트를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 때 사용한 프라이머는 하기와 같다: iNOS (forward) 5'-ATG GCTTGCCCCTGGAAGTTTCTC-3'; iNOS (reverse) 5'-CCTCTG ATGGTGCCATCGGGCATCTG-3'; COX2 (forward) 5'-GGAGAG ACTATCAAGATAGTGATC-3'; COX2 (reverse) 5'-ATGGTCAGT AGACTTTTACAGCTC-3'; IL-1β (foward) 5'-CAGGATGAGGAC ATGAGCACC-3'; IL-1β (reverse) 5'-CTCTGCAGACTCAAACTC CAC-3'; GAPDH (sense) 5'-GCCCATCACCATCTTCCAG-3'; GAPDH (antisense) 5'-TGAGCCCTTCCACAATGC C-3'. PCR은 94℃, 5 분 후에 94℃, 45초; 56℃, 45초 ; 72℃, 1 분으로 40 주기 수행하였고 72℃, 10 분간 수행하였다. PCR 산물은 1% 아가로스 겔로 자외선으로 관찰하고 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, 후박추출물의 NO저해 효능의 기전 및 염증성 효능을 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. Raw 264.7 세포에 LPS를 처리 하였을 때 iNOS, COX2, IL-1b등의 mRNA의 발현에 의해 NO의 증가와 염증의 증가가 밀접한 연관이 있음을 확인하였다. Raw 264.7 세포에 LPS와 후박 추출물을 24시간 처리 한 후 iNOS, COX2, IL-1b의 mRNA 발현을 확인하였다. LPS에 의해 유도된 iNOS, COX2, IL-1b는 100 및 300ug/ml의 후박추출물에 의해 유의성 있게 억제함을 확인하였다.
Claims (6)
- 후박 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것인 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 후박 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것인 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 염증성 질환은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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